FEHÉRJESZINTÉZIS: a transzláció mechanizmusa és a polipeptidlánc további sorsa Bay Péter
Fehérjeszintézis és poszttranszlációs módosítások A kódszótár A riboszóma szerkezete A fehérjeszintézis (transzláció) lépései i. Iniciáció ii. Peptidkötés képződése; peptidil-transzferáz iii. Elongáció és termináció A fehérjeszintézis gátlószerei Antibiotikumok Poszttranszlációs módosítások i. A fehérjék irányítása (targeting) ii. Foszforiláció, glikolizáció … iii. Proteolízis
A kódszótár • 64 kodont (nukleotidhármast) tartalmaz (A, G, C, U) 43 = 64 A nukleotidok és az aminosavak 1:1 megfelelése esetén az mRNS csak 4 aminosavat kódolhatna, míg 2:1 esetében 42=16 aminosavat. Ez utóbbi sem elégséges a fehérjékben előforduló 20-féle aminosav beépítésére. A nukleotidhármast tartalmazó genetikai kód, amikor az mRNS-ben lévő 4 különböző bázis mindegyike a kodonban 3 lehetséges helyen fordulhat elő pedig 43=64 különböző kodont alakít ki.
• a fehérjeszintézis során mindegyik kodonnak van jelentése • 19 aminosavat 60 kodon határoz meg • AUG (metionin) a startkodon - a láncközi metionint is ez jelöli • 3 stopkodon (nonsense kodon): UAA, UAG, UGA
A kódszótár UUU UUC UUA UUG CUU CUC CUA CUG AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG
Phe Leu
Leu
Ile Met
Val
UCU UCC UCA UCG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACG GCU GCC GCA GCG
Ser
Pro
Thr
Ala
UAU UAC UAA UAG CAU CAC CAA CAG AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG
Tyr Stop His Gln Asn Lys Asp Glu
UGU Cys UGC UGA Stop UGG Trp CGU CGC Arg CGA CGG AGU Ser AGC AGA Arg AGG GGU GGC Gly GGA GGG
A kódszótár • 64 kodont (nukleotidhármast) tartalmaz (A, G, C, U) 43 = 64 • a fehérjeszintézis során mindegyik kodonnak van jelentése • 19 aminosav (60 kodon) • 3 stopkodon (nonsense kodon): UAA, UAG, UGA • AUG (metionin) a startkodon (a láncközi metionint is ez jelöli) • A Met és a Trp kivételével a többi aminosavat egynél több kodon határoz meg: a genetikai kód „degenerált” • 5 aminosavat már az első két nukleotid meghatároz • 3 aminosavnak (Arg, Leu és Ser) hat kodonja van
A kódszótár UUU UUC UUA UUG CUU CUC CUA CUG AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG
Phe Leu
Leu
Ile Met
Val
UCU UCC UCA UCG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACG GCU GCC GCA GCG
Ser
Pro
Thr
Ala
UAU UAC UAA UAG CAU CAC CAA CAG AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG
Tyr Stop His Gln Asn Lys Asp Glu
UGU Cys UGC UGA Stop UGG Trp CGU CGC Arg CGA CGG AGU Ser AGC AGA Arg AGG GGU GGC Gly GGA GGG
A genetikai kód univerzális, néhány kivétel azonban ismert: az E. coliban az UGA szelenociszteint is kódol. A mitokondrium kódszótára is különbözik csekély mértékben.
Transzfer RNS: tRNS A tRNS az adapter szerepét látja el a fehérjeszintézisben: • három jellegzetes hurok • antikodon (7 nukleotidból áll) • D-hurok (dihidrouridint tartalmaz) • T-hurok (timidinpszeudouridin-citidin szekvencia) • CCA-3’ véghez kapcsolódik a szállított aminosav
pszeudouridin: dihidrouridin: D
A tRNS szerkezete
Kodon – antikodon kölcsönhatás
Kodon – antikodon kölcsönhatás • a kodon-antikodon kapcsolat komplementer • a kodon 3. helyén lévő bázisa és az antikodon 1. helyén lévő bázisa közötti kapcsolat nem olyan szigorú: „lötyögős” • ezért az adott tRNS több kodont is felismerhet (nem kell 61 tRNS) • „lötyögési” szabályok • C = G vagy I (inozin) Met tRNS • A = U vagy I 3’ 5’ • G = C vagy U • U = A, G vagy I
UAC AUG 5’
mRNS
egy tRNSLeu két leucin kodont is felismer
5’
mRNS
3’
tRNSLeu
GAU CUA G
3’ 5’ „lötyögős” bázis
3’
Lötyögő bázispárok Inozin = Citidin
Inozin = Uridin
Inozin = Adenozin
Guanozin = Uridin
A lötyögési szabályok figyelembevételével legalább 31 tRNS szükséges a 61 kodon felismeréséhez, ennek ellenére kb. 50 tRNS található a sejtek fehérjeszintetizáló készletében.
Az aminosavak aktiválása: aminoacil-tRNS-szintetázok • aminoacil-tRNS-szintetázok kapcsolják az aminosavakat a tRNS molekulákhoz • az mRNS 20 különböző aminosavat kódolhat • mindegyik aminosavnak specifikus aminoacil-tRNS-szintetáza van • egyféle aminosavnak több adapter tRNS molekulája is lehet • azonos aminosavat kódoló tRNS molekulákhoz ugyanaz a specifikus aminoacil-tRNS-szintetáz kapcsolja az aminosavat • mindegyik aminoacil-tRNS-szintetázhoz kapcsolódik: • a megfelelő aminosav • ATP • a megfelelő tRNS molekula vagy molekulák
aminosav
tRNS
- =
RO H2N-C-C-OH
adenilált (aktivált) aminosav
RO H2N-C-C-O-P-O-ribóz-adenin H
AMP
Aminosavak aktiválása: a tRNS „feltöltése”
Indirekt energizálása a peptid kötés kialakulásának
RO H2N-C-C-O - =
PPi
H
- =
ATP
3’
H aminosav- tRNS (feltöltött tRNS)
Hírvivő RNS: mRNS
sapka 5’ m7Gppp
startkodon 5’-nemkódoló régió
AUG
kódoló régió
UGA
3’-nemkódoló régió
AAUAAA
stopkodon
(AAAA)n 3’ poli(A) farok
Olvasási keret • az AUG kodon jelzi az mRNS-en a polipeptidlánc szintézisének startpontját. • az olvasási keret a startkodon első nukleotidjától a stopkodonig tart.
...AGAGCGGA.AUG.GCA.GAG.UGG.CUA.AGC.AUG.UCG.UGA.UCGAAUAAA... MET.ALA.GLU.TRP.LEU.SER.MET.SER „frameshift” - kereteltolódással járó mutáció (példánkban deléció)
...AGAGCGGA.AUG.GCA.GA .UGG.CUA.AGC.AUG.UCG.UGA.UCGAAUAAA... • az új olvasási keret hibás aminosavsorrendet eredményez
...AGAGCGGA.AUG.GCA.GAU.GGC.UAA.GCAUGUCGUGAUCGAAUAAA... MET.ALA.ASP.GLY stopkodon
A transzlációt befolyásoló mutációk • hemoglobin Wayne (a 3’-terminális vég frameshift mutációja) Normális -globin
.ACG.UCU.AAA.UAC.CGU.UAA.GCU GGA GCC UCG GUA .THR.SER.LYS.TYR.ARG
A kékkel jelölt U bázis deléciója miatt: Wayne -globin
stopkodon
.ACG.UCA.AAU.ACC.GUU.AAG.CUG.GAG.CCU.CGG.UAG .THR.SER.ASN.THR.VAL.LYS.LEU.GLU.PRO.ARG mutált régió
stopkodon
• missense mutáció (pl. AGC Ser módosul AGA Arg) • nonsense mutáció (pl. UGG Trp módosul UGA Stop) • sense (továbbolvasó) mutáció (pl. UAA Stop módosul CAA Gln-ra a hemoglobin Constant Spring formában) • néma mutációk (pl. CUA Leu változik CUG Leu) a transzlációt nem befolyásolják
A riboszómák: egy kisebb és egy nagyobb alegységből álló ribonukleoprotein részecskék • prokarióta riboszóma
50S alegység 23S rRNS 5S rRNS 35 különböző fehérje
70S riboszóma
30S alegység 16S rRNS 21 különböző fehérje
• eukarióta riboszóma
60S alegység 28S rRNS 5S rRNS 5.8S rRNS 49 különböző fehérje
80S riboszóma
40S alegység 18S rRNS 33 különböző fehérje
Riboszóma ciklus • a transzláció 5’ → 3’ irányban folyik az mRNS molekulán • az aminosavmaradékok az N-terminálissal kezdődően épülnek be szintetizálódó peptidlánc nagy riboszóma alegység
N
N 5’
UGA
AUG A poliszómát az mRNS-sel összefűzött riboszómák alkotják.
az alegységek disszociálnak
kis riboszóma alegység INICIÁCIÓ
ELONGÁCIÓ
TERMINÁCIÓ
Iniciáció prokariótákban és eukariótákban A prokarióta mRNS egyik belső AUG kodonjánál következik be az iniciáció Az E. coli lac operonját egyetlen policisztronos mRNS kódolja több iniciációs AUG kodonnal lac I
P
O
lac Z AUG
5’
SD
AUG
iniciációs kodon Shine-Dalgarno szekvenciával
AUG
AUG belső Met kodon Shine-Dalgarno szekvencia nélkül
lac Y
lac A
AUG
AUG
SD
AUG
iniciációs kodon Shine-Dalgarno szekvenciával
A szintézis az N-terminális N-formil-metionin (fMet) beépítésével kezdődik. Az mRNS olvasása 5’
3’ irányban.
Elongáció a prokariótákban
mRNS Aminoacil hely Aminoacil tRNS
30S E
50 S
P
A Peptidil hely Peptidil tRNS Üres (empty) hely AA2
Termináció Prokariótákban három terminációs faktor van: • RF1 felismeri az UAG és UAA stopkodonokat. • RF2 felismeri az UGA és UAA stopkodonokat • RF3 a riboszóma szétesését segíti elő Eukariótákban egyetlen terminációs faktor (release factor: eRF) van.
Eukarióta Prokarióta
A fehérjeszintézis iniciációja eukariótákban: az mRNS kötődése Met A tRNSmet kötődik a kis alegységhez az eukarióta iniciációs faktor-2 (eIF-2) segítségével eIF-2 40S alegység
A kis alegység a mRNS 5’-sapka régiója utáni első AUG kodont felismeri (scanning) 5’-sapka
AUG
mRNS
• az AUG iniciációs kodon felismerése • GTP hidrolizál GDP-vé • eIF-2a-GDP disszociál a komplexről (és több más molekula is…) • a nagy riboszóma alegység kötődik
60S alegység
eIF-2a GDP M
5’
AUG 40S alegység
mRNS
A M
AUG GCC
5’
mRNS
M A • aminoacil-tRNS kötődik az A-helyhez • létrejön az első peptidkötés 5’ • az iniciáció befejeződik
AUG GCC
mRNS
P-hely
A peptidkötés kialkulása
NH2 CH3-S-CH2-CH2-CH C O=C O tRNS
A-hely N 2 NH CH3-CH O=C O tRNS
• a peptidkötés kialakulását a peptidil-transzferáz katalizálja •a peptidkötéshez szükséges energiát a tRNS feltöltésével az ATP szolgáltatja • képződött peptid a P-helyről átkerül az A-helyre; az üres tRNS disszociál a P-helyről
NH2 CH3-S-CH2-CH2-CH O=C NH CH3-CH O=C OH O tRNS
tRNS
Nagy riboszóma alegység 23S rRNS (narancs és fehér) alkotja a peptidil-transzferáz egységet
Adenin-2451 vesz részt a sav-bázis katalízisben
Cech (2000) Science 289:878-879 Ban et al. (2000) Science 289:905-920 Nissen et al. (2000) Science 289:920-930
Elongáció P P P P P
• a peptidkötés kialakulása után a szabad tRNS disszociál a P-helyről
UCA GCA GGG UAG
EF-1 EF-2
A P P P P P
UCA GCA GGG UAG
• a riboszóma egy kodonnal továbbcsúszik az mRNS-en, a peptid-tRNS átkerül az A-helyről a P-helyre; a transzlokációt az elongációs faktor EF-2 biztosítja • a következő aminoacil-tRNS kötődik az A-helyhez; ehhez szükséges az EF-1 elongációs faktor • az elongációhoz szükséges energiát két GTP hidrolízise szolgáltatja: • egyik a transzlokációt, • másik az aminoacil-tRNS kötődését biztosítja.
Termináció RF P P P P P
• amikor a transzláció stopkodonhoz ér a terminációs (release) faktor (RF) felismeri a stopkodont és kötődik az A-helyhez
UCA GCA GGG UAG
PPPP
PP
P
P
• az RF katalizálja az elkészült polipeptidlánc hidrolízisét a hordozó tRNS-ről; a riboszóma disszociál UCA GCA GGG UAG
Fehérjeszintézis a mitokondriumokban Eltér az eukarióta sejt citoszoljában lévő transzlációs berendezéstől és a prokarióta riboszómára emlékezetet. A transzláció a mitokondrium matrixban történik. A mitokondriális DNS 2 rRNS-gént 22 tRNS-gént és 13 fehérjét kódol. A többi mitokondriális fehérjét a nukleáris DNS kódolja. Csak 22 tRNS van, több a kodon-antikodon „lötyögés”. Négy eltérés is van az univerzális genetikai kódszótárban, pl. az UGA stopkodon a mitokondriumban triptofánt jelent. Az arginin két kodonja (AGA és AGG) viszont a mitokondriumban stopkodonként szolgál. A mitokondriális mRNS-nek nincs 5’-sapkája, de van 3’-poli-A-farok régiója.
Antibiotikumok és toxinok gátolják a transzlációt (fehérjeszintézist) A fehérjeszintézis mechanizmusában részt vevő komponensek működésének a gátlása az egyik igen gyakran használt fegyver a kórokozó baktériumok ellen. A módszer alapja, hogy a prokarióták és eukarióták ribiszómái és transzlációs faktorai (fehérjéi) különböznek egymástól és így bizonyos vegyületek gátolják a fertőzést okozó baktériumok transzlációját és ezzel szaporodásukat (baktreiosztatikus hatásúak), míg a gazdaszervezet sejtjeiben a fehérjeszintézist nem károsítják. Az antiobiotikumok bizonyos gombák által termelt vegyületek, illetve ezek szintetikus származékai.
Fehérjeszintézis inhibitorok
Inhibitor Kasugamycin Streptomycin Tetracycline Erythromycin Lincomycin Clindamycin Chloramphenicol
Mely szakaszt befolyásolja tRNs kötődés iniciáció, elongáció aminoacil tRNS kötődés peptidil transferáz peptidil transferáz peptidil transferáz peptidil transferáz
Kötőhely 30S subunit 30S subunit A-site 50S subunit 50S subunit 50S subunit 50S subunit
Poszttranszlációs módosítások a polipeptidlánc további sorsa Bay Péter
A transzláció utáni (poszttranszlációs) módosulások - Fehérje érés az ER-ben - Limitált proteolízis - Reverzibilis foszforiláció - Glikoziláció - Glikálás - Fehérje hidroxilálás
A fehérjék sejtorganellumba irányítása: szekréció 3. Az SRP kapcsolódik az SRP-receptorhoz az ER membrán citoszol felőli oldalán, a szignálpeptidet egy pórushoz irányítja 2. A szignál felismerő részecskea (SRP) kötődik a szignálpeptidhezb: a transzláció szünetel
ER lumenc SRP-receptor
SRP
5’
citoszol
AUG A riboszómák kötődése a durva endoplazmás retikulum membránjához 1. A transzláció a citoszolban indul
aszignál
felismerő részecske (signal recognition particle:SRP) fehérjéből és RNS-ből áll; kötődik a szignálpeptidhez, a riboszómához és az ER membrán SRP-receptorához bszignálpeptid kb. 10-40 aminsavból áll a fehérje N-terminális részén (nem mindig) és elsősorban hidrofób, apoláris aminosavakból áll cER = durva endoplazmás retikulum (riboszómákat tartalmaz kötött formában)
4. A transzláció szünetel, a polipeptid az ER lumenjéhez kerül
5. A szignál-peptidáz, amelyik az ER lumenjében van, lehasítja a szignálpeptidet
ER lumen szignál-peptidáz citoszol
5’
6. AZ SRP felszabadul, újabb ciklusban vehet részt
7. A riboszóma kapcsolódik az ER membránhoz; a durva endoplazmás retikulumon poliszóma alakul ki
8. A transzláció folytatódik: a polipeptid az ER lumenjébe kerül 9. A transzláció befejeződik, a kész fehérje az ER-en belül tovább módosul a szekréció előtt
A kész fehérje módosítások után szekretálódik
ER lumen
citoszol
5’
UGA
A transzláció utáni (poszttranszlációs) módosulások - Fehérje érés az ER-ben - Limitált proteolízis - Reverzibilis foszforiláció - Glikoziláció - Glikálás - Fehérje hidroxilálás
A proteolízis fajtái
_
NH2
NH2
COO
_
COO
NH2
_
COO
Limitált proteolízis
Degradáció
A proteolítikus enzimek felosztása Exopeptidázok
Endopeptidázok
NH2
COO
COO
NH2
_
NH2
COO
_
NH2
Aminopeptidases Peptidyl-peptidases NH2
_
COO
_
COO
_
Carboxypeptidases Peptidyl-dipeptidases
A proteolízis biológiai jelentősége - Emésztőenzimek aktiválódása -Sebgyógyulás, csontképződés - Metasztázis képzés, sejtmozgás az extracelluláris mátrixban - Polipeptid hormonok képződése - Virális polipeptidek processzálása - Szignáltranszdukció - Véralvadás
A transzláció utáni (poszttranszlációs) módosulások - Fehérje érés az ER-ben - Limitált proteolízis - Reverzibilis foszforiláció - Glikoziláció - Glikálás - Fehérje hidroxilálás
Fehérje foszforiláció-defoszforiláció ADP- P
ADP
Protein kináz(ok) Protein- P
Protein
Protein foszfatáz(ok) P
H2O
A reverzibilis foszforiláció-defoszforiláció típusai Módosított aminosav szerin
Sejtélettani hatás
foszfo-szerin Pleiotrop hatású foszforiláció
treonin
tirozin
foszfo-treonin
foszfo-tirozin
Általában sejtfelszíni receptorhoz kötött foszforiláció. Általában a sejtproliferációt szabályozza. „proliferáció”
A transzláció utáni (poszttranszlációs) módosulások - Fehérje érés az ER-ben - Limitált proteolízis - Reverzibilis foszforiláció - Glikoziláció - Glikálás - Fehérje hidroxilálás
Az N- és O-glikoziláció összehasonlítása N- linked oligosaccharides akceptor aminosav mikor? kompartment hordozó (carrier)
Asn
Ser, Thr, hydroxylysin
kotranszlációs
poszttranszlációs
ER, Golgi
főleg Golgi (RER is)
dolikol - foszfát
nincs
“en bloc”
egyenként
14 -15 monoszacharid egység
1 - 3 monoszacharid egység
hogyan? a szenhidrat lanc tipusos
O- linked oligosaccharides
hossza
(kivétel: ABO vércsoport antigének)
alcsoportok
mannózban
komplex
gazdag
glikoproteinek
NacGlc, Man
NacGlc, Man Fuc, Gal, sziálsav
N/A
KÖZÖS ALAPVÁZ
1,6 1,2 1,6 1,2
1,3 1,4
1,2
1,4
Asn
1,3
1,2
MANNÓZ GAZDAG TÍPUS
KÖZÖS ALAPVÁZ 2,3
1,6 1,4
1,2 1,4
1,4
1,3 2,6
1,4
1,2
KOMPLEX TÍPUS
Sziálsav (N-Acetil-neuraminsav)
Mannóz
N-Acetil-glükózamin
Galaktóz
Asn
A transzláció utáni (poszttranszlációs) módosulások - Fehérje érés az ER-ben - Limitált proteolízis - Reverzibilis foszforiláció - Glikoziláció - Glikálás - Fehérje hidroxilálás
Nem enzimatikus glikálás Hemoglobin, kollagén, szérum albumin, stb. vércukorszint függő módosítása. Hemoglobin A1c (minor Hgb frakció). C-1 glükóz + hemoglobin N terminusa = stabil kovalens Schiff bázis.
glikált HbA1c: norm: 3-5% (diab.: 8-12%) az előző 3-6 hét vércukor szintjéről informál glikált szérum albumin: norm: 12% (diab.: 16-22%) az előző 1-2 hét vércukor szintjéről informál Az antidiabetikus terápia beállításának ellenőrzésében hasznos.
A transzláció utáni (poszttranszlációs) módosulások - Fehérje érés az ER-ben - Limitált proteolízis - Reverzibilis foszforiláció - Glikoziláció - Glikálás - Fehérje hidroxilálás
Fehérje Hidroxiláció
Kollagén: tripla helix; Hidroxiprolin és hidroxilizin aminosavak felelősek a láncon belüli H-hidak kialakításáért, ami a szerkezeti stabilitás alapja.
Skorbut
1800-as évek— A skorbut problémája megoldódott
Hidroxilálás és a C -Vitamin C Vitamin hiány (Skorbut): kötőszöveti betegség Jellemzői: Fáradtság, depresszió, ínygyulladás (gums), petechiak, csökkent sebgyógyulás Ok: nem képes hidroxiprolint (a kollagénben előforduló módosított aminosav) előállítani A hidroxiprolint a fehérje poszttranszlációs módosítása során a prolil hidroxiláz állítja elő. Az enzim Fe2+ -t igényel a reakcióhoz, ami a reakció során Fe3+-O alakul.. Aszkorbinsav (C Vitamin) antioxidánsként regenerálja a Fe2+ -t.
