FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA

GYÓGYSZERÉSZI BIOTECHNOLÓGIA

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA DR. MISKEI GYÖRGY ZSOLT, DR. KVELL KRISZTIÁN, DR. PONGRÁCZ JUDIT ERZSÉBET

„Az élettudományi-klinikai felsőoktatás gyakorlatorientált és hallgatóbarát korszerűsítése a vidéki képzőhelyek nemzetközi versenyképességének erősítésére” TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Pécsi Tudományegyetem Gyógyszerészi Biotechnológia Tanszék – 2015

Kézirat lezárva: 2015. augusztus

A kiadásért felel a: Pécsi Tudományegyetem Felelős szerkesztő: dr. Pongrácz Judit Erzsébet Egyéb fejlesztők: Csöngei Veronika Eszter, dr. Bognár Rita, Kósa Judit Műszaki szerkesztő: Czulák Szilvia, Bencze Zsolt Lektorálta: dr. Sipos Emese, Marosvásárhelyi Orvosi és Gyógyszerészeti Egyetem ISBN 978-963-642-897-6 Terjedelem: 72 oldal

TARTALOMJEGYZÉK 1. Bevezetés a biológiai gyógyszertudományba ..................................................................................... 7 1.1. Háttér és jelentőség ............................................................................................................... 7 1.2. A biotechnológia eredményeinek hasznosítása a biogyógyszerek fejlesztésében ............... 7 1.3. A gyógyszerészi biotechnológia történetének áttekintése ..................................................... 7 1.4. A biológiai és a kismolekulájú gyógyszerek fejlesztése közötti különbségek ........................ 8 2. A kismolekulájú gyógyszerek és a bio-gyógyszerek fejlesztésében rejlő különbségek ...................... 9 2.1. A gyógyszerfejlesztés folyamata ............................................................................................ 9 2.2. A biotechnológiai és kémiai termékek közötti legfontosabb különbségek ............................. 9 3. A biológiai gyógyszerek fejlesztésének finanszírozása .................................................................... 11 4. A biotechnológia alkalmazási lehetőségei a gyógyszerkutatásban .................................................. 13 4.1. Adatbányászat...................................................................................................................... 13 Genomika .......................................................................................................................... 13 Proteomika ........................................................................................................................ 13 Metabolomika .................................................................................................................... 14 4.2. Rekombináns DNS technológia (génsebészet) ................................................................... 14 Kezdetek ........................................................................................................................... 14 A cDNS ............................................................................................................................. 15 A génexpresszió mérése. A PCR. .................................................................................... 15 Expressziós vektorok ........................................................................................................ 16 4.3. Fehérje-tisztítási és fehérjevizsgálati módszerek ................................................................ 17 A fehérjék elválasztása és tisztítása kromatográfiás eljárásokkal .................................... 17 A fehérjék vizsgálata gélelektroforézis segítségével ........................................................ 18 5. Rekombináns fehérjék ipari léptékű előállítása ................................................................................. 21 5.1. Bevezetés ............................................................................................................................. 21 5.2. A rekombináns fehérje termelésének optimalizálása a.gazdasejtekben ............................. 21 5.3. A gazdasejtek nagyléptékű tenyésztése .............................................................................. 21 Különálló adagokban történő fermentáció (batch process) .............................................. 21 Táplált adagokban történő fermentáció (fed-batch process) ............................................ 22 A kemosztát ...................................................................................................................... 22 Perfúziós konfiguráció ....................................................................................................... 22 5.4. A termék feldolgozása, tisztítása ......................................................................................... 22 Szilárd-folyadék szétválasztás .......................................................................................... 22 A termék tisztítás előtti koncentrálása .............................................................................. 23 A termék tisztítása............................................................................................................. 23

4

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA Új megközelítés aggregációra hajlamos rekombináns fehérjék E.coli-ban történő termelésére ....................................................................................................................... 23 6. Antitestek ........................................................................................................................................... 25 6.1. Bevezetés ............................................................................................................................. 25 6.2. Monoklonális ellenanyagok .................................................................................................. 27 A poliklonális ellenagyagok és terápiás alkalmazásuk korlátai ........................................ 27 A monoklonális antitestek és terápiás alkalmazásaik ....................................................... 27 7. Hematopoietikus növekedési és koagulációs faktorok ...................................................................... 31 7.1. Bevezetés ............................................................................................................................. 31 7.2. Hematopoietikus növekedési faktorok ................................................................................. 31 Eritropoietin ....................................................................................................................... 32 Granulocita kolónia-stimuláló faktor (G-CSF) ................................................................... 32 Thrombopoietin ................................................................................................................. 32 Interleukin-11 (IL-11) ......................................................................................................... 33 7.3. Véralvadási (koagulációs) faktorok ...................................................................................... 33 Faktor I. (fibrinogen) .......................................................................................................... 34 Faktor II. (Prothrombin ) .................................................................................................... 34 Faktor III. (thrombokináz, thromboplasztin, „szöveti faktor”) ............................................ 34 Faktor IV. (Calcium) .......................................................................................................... 35 Factor V. (proakcelerin, Owren-faktor).............................................................................. 35 Faktor VII. (szérum protrombin konverzió akcelerátor (SPCA), prokonvertin) ................. 35 Faktor VIII (antihemofíliás faktor A) .................................................................................. 35 Faktor IX (Christmas-faktor, antihemofíliás faktor B, plazmatromboplasztin komponens (PTC)) ............................................................................................................................... 35 Faktor X (Stuart–Prower-faktor) ........................................................................................ 35 Faktor XI (antihemofíliás faktor C) .................................................................................... 35 Faktor XII (Hageman-faktor) ............................................................................................. 36 Faktor XIII (fibrinstabilizáló faktor,transzglutamináz Laki-Lóránt faktor) ........................... 36 A véralvadási folyamatokat szabályozó receptorok kristályszerkezetének azonosítása.. 36 8. Citokinek ............................................................................................................................................ 37 8.1. Bevezetés ............................................................................................................................. 37 8.2. Interleukinek ......................................................................................................................... 37 Az interleukin-1 (IL-1) család ............................................................................................ 37 Iterleukin-2 (IL-2) ............................................................................................................... 38 Interleukin-7 (IL-7) ............................................................................................................. 38 Interleukin-10 (IL-10) ......................................................................................................... 38 Interleukin-11 (IL-11) ......................................................................................................... 39

TARTALOMJEGYZÉK Interleukin-12 (IL-12) ......................................................................................................... 39 Interleukin-15 (IL-15) ......................................................................................................... 39 Interleukin-21 (IL-21) ......................................................................................................... 39 8.3. Interferonok .......................................................................................................................... 40 Interferon-alfa (IFNα) ........................................................................................................ 40 Interferon-béta (IFNβ) ....................................................................................................... 41 Interferon-gamma (IFNγ) .................................................................................................. 41 9. Hormonok .......................................................................................................................................... 43 9.1. Bevezetés ............................................................................................................................. 43 9.2. Peptid hormonok .................................................................................................................. 43 9.3. A rekombináns hormonok terápiás alkalmazása ................................................................. 43 Humán növekedési hormon (human growth hormon, hGH) ............................................. 44 Humán inzulin ................................................................................................................... 44 10. Enzimek ........................................................................................................................................... 45 10.1. Bevezetés ........................................................................................................................... 45 10.2. Enzimpótlás terápia ............................................................................................................ 45 Adenozin deamináz (ADA) ................................................................................................ 46 Glükocerebrozidáz (Glükuronidáz) ................................................................................... 46 Alfa-glükozidáz .................................................................................................................. 47 Alfa-galaktozidáz ............................................................................................................... 47 Urát oxidáz (húgysav hidroxiláz) ....................................................................................... 47 Dezoxyribonukleáz I. (DNNáz I.) ....................................................................................... 48 11. Vakcinák .......................................................................................................................................... 49 11.1. Történeti áttekintés ............................................................................................................. 49 11.2. A vakcinák működésének immunológiai alapjai................................................................. 49 11.3. Konvencionális vakcinák .................................................................................................... 52 Élő, legyengített vakcinák ................................................................................................. 52 Inaktivált vakcinák ............................................................................................................. 53 11.4. Biotechnológiai módszerekkel előállított vakcinák ............................................................. 53 Rekombináns alegység vakcinák...................................................................................... 54 Genetikailag módosított élő, legyengített vakcinák........................................................... 54 Tumor elleni vakcinák ....................................................................................................... 54 12. Gén- és sejtterápia .......................................................................................................................... 57 Definíció ............................................................................................................................ 57 12.1. Csupasz nukleinsav használata ......................................................................................... 57 Plazmid-alapú génterápiás lehetőségek ........................................................................... 57

5

6

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA 12.2. Génterápiás lehetőségek ................................................................................................... 58 Génterápiás lehetőségek általános stratégiái ................................................................... 58 12.3. Ajánlott olvasmányok ......................................................................................................... 60 13. Hatóanyag-bevitel optimalizálása .................................................................................................... 63 13.1. Beviteli útvonalak ............................................................................................................... 63 Tüdőn keresztüli bevitel .................................................................................................... 63 Bőrön keresztüli bevitel ..................................................................................................... 63 Egyenletes hatóanyag-leadás........................................................................................... 64 PLG ................................................................................................................................... 64 Liposzómák ....................................................................................................................... 64 13.2. Hatóanyag ürülésének módosítása ................................................................................... 65 13.3. 'Magic bullet' készítmények ................................................................................................ 65 13.4. Rekombináns fehérjék molekuláris szintű módosításai ..................................................... 65 14. Integrációs törekvések..................................................................................................................... 67 14.1. Üzleti megfontolások .......................................................................................................... 67 14.2. Perspektívák....................................................................................................................... 68 15. Személyre szabott orvoslás ............................................................................................................ 69 Definíció ............................................................................................................................ 69 Egyének közötti különbségek ........................................................................................... 69 A farmakogenetika eredete ............................................................................................... 69 A citokróm P450 rendszer központi szerepe .................................................................... 69 A CYP3A4 farmakológiai jelentősége ............................................................................... 69 A CYP2D6 farmakológiai jelentősége ............................................................................... 69 A CYP2C19 farmakológiai jelentősége ............................................................................. 70 A CYP2C9 farmakológiai jelentősége ............................................................................... 70 Egyéb CYP450 rendszeren kívüli fontos xenobiotikum-metabolizáló elemek .................. 70 15.1. Daganatok kezelése személyre szabott orvoslás szerint .................................................. 70 Genetikai háttér ................................................................................................................. 70 Kemoterápiás rezisztencia és az MDR1 ........................................................................... 71 Genetikai variációk hatása a kemoterápiás válaszra........................................................ 71 A farmakogenomika jelentősége a váralvadásra ható gyógyszerek esetében ................ 71 'A megfelelő gyógyszer a megfelelő betegnek' ................................................................. 72

1. BEVEZETÉS A BIOLÓGIAI GYÓGYSZERTUDOMÁNYBA 1.1. HÁTTÉR ÉS JELENTŐSÉG Manapság a „biotechnológia” szó az élettudományi kutatások csúcsának a szinonimája, azonban biomolekulák terápiás szerként való használata az 1800-as évekik nyúlik vissza. Magát a „biotechnológia” szót 1919-ben írta le először Ereky Károly magyar mezőgazdász kutató. Napjainkban a biotechnológusok által létrehozott terápiás termékek – melyeket biológiai gyógyszereknek, röviden biogyógyszereknek nevezünk – reményt adnak számos betegség leküzdésére. Az alapvető biológiai folyamatok és endogén proteinek biológiai gyógyszerekké (biopharmaceuticals) alakítása megkívánja a tudományos felfedezések integrálását a gyógyszerfejlesztésbe. Proteinek, peptidek és genetikai anyag előállítása terápiás alkalmazásokra alkalmas mennyiségben viszonylag új fejlemény. Az ehhez vezető út legfontosabb mérföldkövei a következők: (1) rekombináns DNS technológia, (2) nagymennyiségű protein előállítására alkalmas fermentációs technológia, (3) monoklonális antitest technológia. A biotechnológia e mérföldkövei lehetővé tették a biomolekulák transzformációját biológiai gyógyszerekké, jelentős hatást gyakorolva az egészségügyre. A biotechnológiai innovációtól a terápiás termékekig vezető út megkívánja, hogy a bio-gyógyszeripari cégek jelentős befektetéseket eszközöljenek a pre-klinikai és a klinikai termékfejlesztés terén. A biotechnológiai cégek árbevételük átlagosan több mint 20 %-át költik kutatás-fejlesztésre. Ez jóval több, mint a nagy gyógyszeripari cégek által átlagosan K+F-re fordított 16 %. Bár számos innovatív biotechnológiai start-up cég dolgozik a gyógyszerfejlesztés korai stádiumában, az úttörő cégek többségét később nagy gyógyszeripari cégek vásárolják meg, mint az például a Genentech és az Immunex esetében történt. A biológiai és genomikai adatok hatalmas mennyiségének és az exponenciálisan növekvő számítástechnikai lehetőségeknek köszönhetően, a potenciális gyógyszerjelölt molekulák száma is ugrásszerűen megnőtt. Lehetőségeink többé nem korlátozódnak a terápiás célmolekulák felfedezésére és makromolekulák klónozására. A hangsúly eltolódott afelé, hogy a makromolekulákat összekapcsoljuk a kórtünetekkel.

1.2. A BIOTECHNOLÓGIA EREDMÉNYEINEK HASZNOSÍTÁSA A BIOGYÓGYSZEREK FEJLESZTÉSÉBEN Széles körben elfogadott definíció szerint a biotechnológia a biológiai molekulákról és folyamatokról szerzett tudományos ismeretek alkalmazása hasznos termékek kifejlesztésére. Az érdeklődésre számot tartó biológiai folyamatok a fehérjeszintézis, a DNS-replikáció, a transzkripció, a poszttranszlációs fehérjemódosítás, a sejtfelszíni ligand-receptor kölcsönhatások, valamint a baktériumélesztő- és emlős sejtekben végbemenő fermentációs folyamatok. A tágabb értelemben vett biotechnológiába beletartozik a sörfőzés, borászat sajtgyártás stb., így a tágabb értelemben vett biotechnológián a biológia ismeretek kereskedelmi hasznosítását értjük. Ennek a jegyzetnek a tárgya azonban ennél természetesen szűkebb: a biotechnológia alkalmazása biogyógyszerek és egyéb biológiai alapú terápiás eszközök kifejlesztésére.

1.3. A GYÓGYSZERÉSZI BIOTECHNOLÓGIA TÖRTÉNETÉNEK ÁTTEKINTÉSE A huszadik század második felében elért tudományos eredmények lehetővé tették fehérjék és peptidek klónozását és expresszióját baktérium sejtekben. Ezek az eredmények: fehérjék szerkezeté-

8

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA nek felderítése, a sejtosztódás és fehérjeszintézis megismerése, DNS-replikáció enzimeinek és a restrikciós enzimek felfedezése, in vitro rekombináns DNS technológia. Ezekkel a kutatásokkal párhuzamosan folyó munkájuk eredményeképpen Köhler és Milstein 1975-ben közölte a hybridóma technikát, mely lehetővé tette monospecifikus, monoklonális antitestek nagyléptékű előállítását. A hybridóma módszer lehetővé tette monoklonális antitestek használatát fehérjék izolálására és karakterizálására. A módszer elengedhetetlen volt a rekombináns úton előállított fehérjék vizsgálatában, így a biogyógyszerek fejlesztésében is. Csaknem az összes jelenleg forgalomban lévő biogyógyszer fehérje vagy peptid. Ezek között is a legtöbb monoklonális antitest, amely a biogyógyszerek leggyorsabban gyarapodó csoportja. Leginkább daganatsejtek ellen vethetők be, mivel ezek sejtfelszíni fehérjemintázata az egészséges sejtekétől különböző, ami lehetővé teszi monoklonális antitestek specifikus kötődését. Egy példa a sikerrel alkalmazott monoklonális antitestekre a Herceptin néven forgalmazott trastuzumab (a –mab végződés arra utal, hogy a szer monoklonális antitest (monoclonal antibody)). A trastuzumab sikeresen használható az emlőrák terápiájában, mert blokkolja a daganatsejtek által nagy mennyiségben expresszált sejtfelszíni tirozin-kináz receptort, a HER2-t.

1.4. A BIOLÓGIAI ÉS A KISMOLEKULÁJÚ GYÓGYSZEREK FEJLESZTÉSE KÖZÖTTI KÜLÖNBSÉGEK A legtöbb kismolekulájú gyógyszer molekulatömege kb. 500 és 1000 dalton közé esik. Kis méretük miatt a molekulák kémiai modifikációja radikálisan megváltoztatja a szer farmakológiai tulajdonságait, általában új szert eredményez a kiindulási molekulától eltérő alkalmazási lehetőségekkel. Példaként említhető a terfenadine nevű antihisztamin, melyről kiderült, hogy bizonyos gyógyszerek gátolják a metabolizmusát, így ezekkel együtt adagolva kardiotoxikus. A terfedadine-t ezért kivonták a forgalomból, és biztonságos, de éppoly hatékony kémiai módosulatával, a fexofenadine-nel helyettesítették. Ezzel ellentétben, a természetes proteineken alapuló bio-gyógyszereket gyakran ugyanúgy nevezik, mint a természetes kiindulási proteint, az aminosav-sorrenden végrehajtott módosítások ellenére. Más szóval, csekély módosítások nem vezetnek új gyógyszerekhez. Például a cukorbetegség kezelésére használt inzulinnak számos módosulata van forgalomban.

2. A KISMOLEKULÁJÚ GYÓGYSZEREK ÉS A BIO-GYÓGYSZEREK FEJLESZTÉSÉBEN REJLŐ KÜLÖNBSÉGEK 2.1. A GYÓGYSZERFEJLESZTÉS FOLYAMATA Mielőtt egy gyógyszer kereskedelmi forgalomba kerülhet, be kell bizonyítani, hogy biztonságos és hatásos annak a betegségnek a kezelésében, amelynek kezelésére kifejlesztették. Habár a gyógyszerjelölt szer felfedezésétől (legyen az kis molekula vagy biológiai makromolekula) a forgalomba hozatali engedélyig vezető út hosszú és göröngyös lehet, a lépések jól definiáltak mindkét fajta gyógyszerjelölt esetében. Szintézisük vagy egyéb előállításuk után a gyógyszer-jelölt molekulák először pre-klinikai vizsgálatok sorozatán esnek át. Ide tartozik a gyógyszer-jelölt fiziko-kémiai és biológiai jellemzése, toxicitásának vizsgálata állatkísérletes és sejtes rendszerekben, eloszlása és farmakokinetikája kísérleti állatokban, valamint a végső formulázásban fontos tulajdonságainak (pl. stabilitás) meghatározása. Az állatkísérletes vizsgálatok előtt ki kell fejleszteni olyan kémiai és bio-analitikai módszereket, melyekkel a gyógyszerjelölt molekula analizálható az in vivo tesztekhez szükséges mennyiség előállítása (scaling-up) folyamán. Végül a nagy mennyiségben előállított gyógyszerjelölt molekula minőségellenőrzéséhez szükséges eljárások kifejlesztése, majd a megbízható és hatékony formulációhoz szükséges vizsgálatok következnek. A pre-klinikai tesztekben ígéretesnek bizonyult gyógyszer-jelölt molekulákkal, ezután- ha az illetékes hatóság engedélyezi - megindulnak az embereken történő, azaz klinikai vizsgálatok. Az I. fázisú kísérletben a gyógyszerjelölt molekulát kisszámú egészséges önkéntesnek adják be. E fázis célja a gyógyszer-jelölt biztonságosságának és farmakokinetikájának (vérplazma-koncentráció időbeli változása) felmérése. Az I. fázisban biztonságosnak bizonyult gyógyszer-jelölt molekulák hatásosságának vizsgálata a II. fázisú klinikai kísérletben zajlik. A gyógyszer-jelöltet a szer által gyógyítani/kezelni remélt betegségben szenvedő embereknek adják be. A II. fázisú klinikai kísérletben több száz beteg és egészséges kontroll személy vesz részt. A fázis célja – a hatásosság bizonyítása mellett – a szer akut mellékhatásainak és kockázatainak kiderítése. A III. fázisú klinikai kísérlet célja a gyógyszerjelölt molekula alapos jellemzése, hatásosságának és mellékhatásainak részletes felderítése, kockázat/nyereség elemzés készítése. A II. és III. fázisú klinikai kísérletekben részt vevő betegek és kontroll személyek szükséges száma statisztikai megfontolásokon alapszik.

2.2. A BIOTECHNOLÓGIAI ÉS KÉMIAI TERMÉKEK KÖZÖTTI LEGFONTOSABB KÜLÖNBSÉGEK A hagyományos hatóanyagoktól eltérően – melyek kémiailag szintetizálhatók és homogenitásig tisztíthatók – a biológiai makromolekulák élő szervezetekből (ember, állat, mikroorganizmus) származnak. Ennélfogva – a kismolekulájú, kémiai úton szintetizált hatóanyagoktól eltérően – a biológiai makromolekulák nehezebben jellemezhetők vagy tisztíthatók.

3. A BIOLÓGIAI GYÓGYSZEREK FEJLESZTÉSÉNEK FINANSZÍROZÁSA Világos, hogy magánbefektetések vagy közösségi (állami, alapítványi) finanszírozás nélkül nem születnek új bio-gyógyszerek. Az egyes cégek céljai komplexek és különböznek egymástól, legyenek azok start-up cégek vagy erős lábakon álló gyógyszeripari óriások. A felhasználható tőke mennyiségének különbsége miatt a start-up cégek leginkább arra fókuszálnak, hogy megerősítsék pozícióikat a szellemi tulajdon terén. A nagy, erős cégek inkább a termék várható piaci potenciálja alapján döntenek. A trend azonban az, hogy a start-up cégekben koncentrálódó tudás és innováció, valamint a nagy gyógyszergyárak preklinikai és klinikai fejlesztés terén szerzett tapasztalata integrálódjon. A nagy gyógyszergyárak megveszik a start-up cégeket vagy stratégiai szövetségre lépnek velük, így a legtöbb nagy gyógyszergyár bio-gyógyszergyárnak tekinthető, és bevételeinek jelentős része a biotechnológiai úton előállított terápiás készítmények forgalmazásából származik. A gyógyszerjelölt molekula felfedezésétől a humán használatra engedélyezett gyógyszerig többéves út vezet, mely komoly magán- és közfinanszírozással van kikövezve. A folyamat jelentős tudományos és anyagi befektetést igényel. Jellemző az állami hivatalok, egyetemek és magáncégek együttműködése. A gyógyszerjelölt hatóanyag útja a betegágyig alapkutatással kezdődik. Ezt jellemzően az állam vagy alapítványok finanszírozzák egyetemeken vagy kutatóintézetekben, bár a magántőke is jelentős részt vállalhat benne. Az alapkutatás eredménye az adott betegség etiológiájának, sejtes és molekuláris mechanizmusának megismerése. Ez a tudás hasznosul a gyógyszerfejlesztés során. A folyamat – amelyet klinikai és pre-klinikai transzlációs kutatásnak neveznek (translational research) - állami hivatalok, egyetemek és magáncégek együttműködését igényli. A transzlációs kutatás lehetővé teszi, hogy a kutatók, befektetők, szponzorok felmérjék egy innovatív gyógyszerjelölt piaci potenciálját. Az ígéretes gyógyszerjelölt készítményeket alkalmazott kutatás során fejlesztik a klinikumban alkalmazható gyógyszerré. Ez a leginkább tőkeigényes fázis, melyet elsődlegesen tőkeerős gyógyszergyárak finanszíroznak. A teljes gyógyszerfejlesztési folyamat sokszereplős, szakemberek, állami szervek és befektetők részvételével zajlik. Becslések szerint egy új gyógyszer piacra vitele 50 millió és 1 milliárd dollár között mozog. Átlagosan minden ötödik klinikai kutatásig jutott gyógyszerjelöltből lesz engedélyezett gyógyszer. A klinikai kutatásig kb. minden ezredik jelölt molekula jut el. Nyilvánvaló, hogy a sikertelen gyógyszerjelöltekre költött pénz is megjelenik a gyógyszerek árában.

4. A BIOTECHNOLÓGIA ALKALMAZÁSI LEHETŐSÉGEI A GYÓGYSZERKUTATÁSBAN E fejezet elsődleges célja a rekombináns proteinek tervezésének, vizsgálatának és előállításának bemutatása. A kismolekulájú gyógyszerekétől egészen eltérő módszerek használatosak a biogyógyszer-jelölt készítmények vizsgálatában és fejlesztésében. Először is a kutatók azonosítják azokat a célmolekulákat és receptorokat, melyek a kérdéses betegséggel kapcsolatosak. Azután elkezdődik az „adatbányászat” (data mining), a kutatók a szakirodalom felhasználásával felvázolják a gyógyszerjelölt előállításához szükséges stratégiát. A biogyógyszer-jelölt endogén proteinek gyakran 200-nál aminosavból állnak. Általában ezek szintézise rekombináns gazdasejtek segítségével történik.

4.1. ADATBÁNYÁSZAT A terápiás célpontok kiválasztását számos tényező befolyásolja, többek között az adott betegség molekuláris és szöveti mechanizmusának ismerete. A klinikai tünetek hozzárendelése bizonyos sejtekhez és szövetekhez felbecsülhetetlen jelentőségű a terápiás célpontok azonosításában. A múltban ez a tudás szabadalmak és közlemények közvetítésével terjedt, ma viszont, a számítástechnika fejlődésével és a kommunikáció felgyorsulásával ez a tudás mindenki számára könnyen elérhető a közfinanszírozott vagy az előfizethető adatbázisokban. A humán genom szekvenciájának meghatározása hatalmas mennyiségű információval gazdagította az adatbázisokat. Itt kell szólnunk a hatalmas mennyiségű adatot termelő, és ezen adatok tudományos elemzésére vállalkozó OMIKA tudományokról. Az omika (angolul: omics) kifejezés olyan tudományterületre utal, ami szokásosan -omika végződésű (pl. genomika, proteomika vagy metabolomika). A kapcsolódó szóvégződés -om (angolul: -ome) utal ezen tudományterületek vizsgálódási tárgyára (genom, proteom, metabolom). Az omikák általános célkitűzése egy szervezet struktúráját, funkcióját és dinamikáját létrehozó biomolekulák halmazainak kollektív jellemzése és számszerűsítése. Az „omikák” új kutatási stratégiát képviselnek, amely nem hipotézisvezérelt, hanem adatbázisokban keres mintázatot, korrelációt és kovarianciát, azt vizsgálva, mi és hogyan változik a szervezetben vagy egy-egy sejtben az idő folyamán. Genomika A genomika a genomot és a gének kölcsönhatásait vizsgáló diszciplina. Az élőlények genomjában rejlő információkat elsősorban a számítógépes biológia alkalmazásával dolgozza fel. Eszköztárát képezi a bioinformatika, génfunkció-vizsgálat, génexpressziós mérések és a genetikai hálózatok elemzése. Proteomika A proteomika a proteom, vagyis az élő szervezetben előforduló összes fehérje megismerét tűzte ki céljául. Meg kívánja ismerni a fehérjék szerkezetét, biológiai funkcióját és ezek térbeli és időbeli változását. Érdeklődési körébe tartozik a fehérje eredetének meghatározása, rendszertani besorolása, a különböző forrásból származó, de azonos biológiai funkciót ellátó proteinek szerkezetének összehasonlítása, a fehérje jelenlétének vagy hiányának igazolása egészséges, illetve patológiás körülmények között. Célja - a korszerű kémiai analitika eszközeit felhasználva - az igen kis mennyiségben előforduló fehérjék kimutatása, azonosítása, szerkezetük meghatározása; a fehérjékkel kapcsolatos ismeretek szerkezeti és funkcionális rendszerezése, valamint az így képződő adathalmazok (adatbázisok) információtartalmának elemzése. A proteomika vizsgálat kísérleti eszközei a nagy érzékenységű tömegspektrométerek, fluoreszcencián alapuló mikroszkópos technikák, DNS-csipek stb.).

14

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA Metabolomika A metabolomika általánosan véve a sejtek, szövetek, szervezetek, biológiai folyadékok teljes metabolit-profiljával foglalkozik. Vizsgáljaa metabolit-profil különféle stimulusokra adott válaszait. E stimulusok lehetnek pl. toxinok, betegségek, genetikai változások, öregedés, gyógyszerhasználat. Ami viszonylag változatlan maradt, az az információ felhasználása terápiás célpontok azonosításában és gyógyszer-jelölt molekulák előállításában. Az alábbiakban erről lesz szó.

4.2. REKOMBINÁNS DNS TECHNOLÓGIA (GÉNSEBÉSZET) Kezdetek A rekombináns DNS technológia módszerek gazdag gyűjteménye, melyet a restrikciós endonukleázok felfedezése indított el az 1970-es évek elején. Az antibiotikumok után a restrikciós enzimek a második felbecsülhetetlen értékű „ajándék”, melyet a prokariótáktól kapott az emberiség. Minden restrikciós enzim egy bizonyos, rá jellemző bázissorrendet ismer fel, mely rendszerint egy rövid palindróma szekvencia. A palindróma azt jelenti, hogy mindkét szál szekvenciája ugyanaz 5’ – 3’ irányban olvasva. Példa:

5’ – ATGCAT – 3’ 3’ – TACGTA – 5’

A génsebészetben azok a restrikciós enzimek használhatók, melyek hasítási helye mindig ugyanaz, tehát egy adott DNS-t mindig ugyanazokra a láncokra darabolnak. Előnyös továbbá, ha a hasítás ún. ragadós véget (sticky end) eredményez, hiszen így különböző eredetű, azonos enzimmel hasított DNS darabok irányítottan összeilleszthetők, és a DNS ligáz enzimmel összekapcsolhatók. Példa ragadós végekre:

5’ – AT GCAT – 3’ 3’ – TACG TA – 5’

A restrikciós enzimek eredeti funkciója a vírusok elleni védekezés. Nevük is innen ered, ugyanis az első létezésükre utaló megfigyelés az volt, hogy bizonyos baktériumtörzsek korlátozzák a más törzsekben gyorsan szaporodó vírusok szaporodását saját sejtjeikben (restriction=korlátozás). Ha a vírus DNS-e bejut a baktériumsejtbe, a restrikciós enzimek egy adott szekvenciához kötődve elvágják a vírus DNS-t, vagy a felismert szekvenciánál, vagy annak közelében. A baktérium saját DNS-ét úgy védi meg, hogy minden restrikciós endonukleáznak megvan a párja, egy metil-transzferáz, mely ugyanazt a szekvencia-motívumot módosítja (metilálja) a gazdasejt genomjában. A restrikciós enzimeket és metil-transzferáz párjukat együtt restrikciós-modifikációs rendszernek nevezzük. Ahhoz, hogy valamit kezdeni tudjunk a kedvenc organizmusunkból izolált DNS szakasszal, analizálható mennyiségűre kell felszaporítanunk. Itt ismét segítségünkre siettek a baktériumok. Plazmidoknak nevezzük a prokariótákban, valamint egyes élesztőgombákban található, az örökítő információk sejtek közötti átadását a kromoszómáktól függetlenül is lehetővé tevő DNS molekulákat. A plazmidok általában gyűrű alakú és kettős szálú DNS-molekulák. A plazmidok a bakteriális kromoszómától függetlenül replikálódnak, nagy kópiaszámot érhetnek el a sejtben, ami mesterségesen is növelhető. Egy baktériumból izolált plazmidot hasítunk egy olyan restrikciós enzimmel, amely csak egy helyen vágja, majd ligáz segítségével beépítjük izolált DNS szakaszunkat, majd az így összeépített konstrukciót visszajuttatjuk a baktériumba. Feltéve, ha baktériumunk generációs ideje 20 perc, ami optimális körülmények között megvalósítható, akkor 24 óra=72x20 perc alatt egyetlen baktéiumsejtből 272= sejt lesz, ami kb., 21 5x10 . Természetesen plazmidunk is felszaporodott, hiszen minden utódsejtbe került legalább egy! -15 Egy E. coli sejt tömege 665 femtogram (10 gramm), tehát a 24 óra alatt képződött baktériumhalmaz 21 -15 6 9 tömege = 5x10 x665x10 = 3325x10 gramm, azaz kb. 3x10 gramm, 3000 tonna! Hát ezért nem

A BIOTECHNOLÓGIA ALKALMAZÁSI LEHETŐSÉGEI A GYÓGYSZERKUTATÁSBAN szaporítjuk a baktériumokat 5-6 óránál tovább. A plazmidok felfedezése óta számos mesterségesen módosított, bizonyos funkcióra optimalizált plazmid vektor van forgalomban.A klónozott szakaszok felszaporítása lehetővé tette szekvencia-analízisüket. A cDNS A biofarmácia gyökerei az 1970-es évek elejéig, a reverz transzkriptáz enzim felfedezéséig nyúlnak nyúlnak. Mint neve is mutatja, az enzim a transzkripció fordítottját katalizálja, RNS templátról DNS-t szintetizál. A reverz transzkriptáz legfontosabb alkalmazási területe a cDNS szintézis. A cDNS (komplementer DNS, complementary DNA) RNS templátról in vitro szintetizált DNS. Ha eukarióta géneket kívánunk baktériumokba juttatni a kódolt fehérje termeltetése céljából, akkor cDNS-t kell használnunk, mert a natív gén fehérjét nem kódoló (intron) szekvenciákat is tartalmaz, melyekkel a baktériumsejt nem tud mit kezdeni, mivel a prokarióta genom nem tartalmaz intronokat. A Reverse transcriptase retrovírusokban fordul elő, melyek genomja RNS-ből áll. Az RNS genomról mint templátról készült DNS képes beépülni a gazdasejt genomjába, és onnan irányítani további vírusgenomok szintézisét. A reverz transzkriptáz inhibitorok a retrovírusok (pl. HIV) elleni gyógyszerek fontos komponensei. A génexpresszió mérése. A PCR. A cDNS további fontos alkalmazási területe a génexpresszió mérése. Génexpresszión azt a folyamatot értjük, mely során a DNS-ben kódolt információ alapján funkcionális géntermék szintetizálódik. A funkcionális géntermék lehet fehérje vagy RNS (tRNS, rRNS stb.). A fehérjét kódoló gének esetében gyakran mRNS-ük mennyiségét mérjük, ami általában korrelál a kódolt fehérje mennyiségével. A génexpresszió mérése úgy kezdődik, hogy cDNS-t szintetizálunk a sejtből izolált RNS-t használva templátként. Az RNS mennyisége közvetlenül is mérhető, de a módszer (Northern blot) munkaigényes és nagy mennyiségű RNS-t igényel. Ezenkívül az RNS igen bomlékony, nehéz vele dolgozni. A cDNS viszont stabil, és megfelelően végrehajtott szintézis esetén az egyes cDNS-ek mennyisége korrelál a templát RNS szintjével. A cDNS-ek mennyisége aztán pontosan mérhető a következő nagy felfedezés, a Polimeráz láncreakció (Polymerase chain reaction, PCR) segítségével. A PCR módszert az 1980-as évek elején találták fel, és hamarosan nélkülözhetetlenné vált az élettudományi kutatásokban. A módszer képes rövid DNS szakaszok exponenciális megsokszorozására (amplifikálás). A PCR-t a DNS-szál egy rövid, jól definiált szakaszának amplifikálására használják. Ez lehet egyetlen gén vagy csak egy génrészlet, vagy – ha a módszert génexpresszió vizsgálatára használjuk – cDNS. A PCR-folyamat viszonylag rövid DNS-szakaszok másolására képes, ezek hossza általában legfeljebb 10 kbp (kbp = kilobázispár = 1000 bázispár). Bizonyos módosításokka a módszer képessé tehető akár 40 kbp méretű szakaszok amplifikációjára. A PCR jelenleg alkalmazott formájában a következő komponenseket igényli: ▪

DNS-templát – ez tartalmazza a DNS-szakasz amplifikálandó régióját

▪

Két primer – amely meghatározza az amplifikálandó szakasz elejét és végét (a primerekről lásd alább)

▪

Hőstabil DNS-polimeráz – amely lemásolja az amplifikálandó szakaszt

▪

Nukleotidok – amelyekből a DNS-polimeráz felépíti az új DNS-t

▪

Puffer – amely biztosítja a DNS-polimeráz számára megfelelő kémiai környezetet

15

16

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA A PCR-reakció a PCR-készülékben zajlik le (thermocycler). A készülék a reakciócsöveket ciklikusan felhevíti és lehűti a precízen megállapított hőmérsékletekre, amelyek a reakció egyes lépéseihez szükségesek. A reakcióelegy párolgását megakadályozandó, egy fűtött fedél kerül a reakciócsövek tetejére. Primerek Az amplifikálandó DNS-szakaszt a primerek kiválasztásával határozzák meg. A primerek rövid (18-25 bp), mesterséges DNS-szálak, amelyek komplementerek az amplifikálandó DNS-szakasz elejével és végével. Hozzákapcsolódnak a DNS-templáthoz ezeken a kezdő- és végpontokon, ahová aztán a DNS-polimeráz kötődik, és megkezdi egy új DNS-szál szintetizálását. A primerek hosszát és olvadási hőmérsékletét (Tm) nagy gonddal kell kiválasztani. A primer olvadási hőmérsékletének azt a hőmérséklet nevezzük, amelyen a primer kötőhelyeinek fele foglalt. Az olvadási hőmérséklet nő a primer hosszával. A túl rövid primerek több helyre is kapcsolódhatnának egy hosszú DNS-templáton, amely aspecifikus kópiákat eredményezne. Másfelől a primerek túl magas olvadási hőmérséklete azért jelent gondot, mert a DNS-polimeráz kevésbé aktív magas hőmérsékleten. A primer optimális hossza általában 20-40 nukleotid, 60 °C és 75 °C közötti olvadási hőmérséklettel. A primereket primertervező szoftver segítségével tervezik. A PCR-folyamat húsz-negyven ciklus egymásutánjából áll. Mindegyik ciklus három lépést tartalmaz: (1) A kettős szálú DNS-t kb. 95 °C-ra hevítik, hogy a szálak szétváljanak. Az első ciklus előtt a DNS-t gyakran hosszabb ideig hevítik, hogy a templát DNS és a primerek kettős szálai is teljesen szeparálódjanak. (2) A DNS-szálak szeparálása után a hőmérsékletet csökkentik, úgyhogy a primerek hozzá tudnak kapcsolódni a DNS-szálakhoz. Ezt a lépést annealing vagy kapcsolódási lépésnek nevezik. A hőmérséklet ebben a fázisban függ a primerektől, és általában 5 °C-kal van a primerek olvadási hőmérséklete alatt (45-60 °C). (3) A DNS-polimeráz létrehozza a hiányzó szálat. A munkát a kapcsolódott primernél kezdi, és végigmegy a DNS-szálon. A lépés neve elongáció. A szintetizálás során a szülő nukleinsavszál szolgál templátként a leány lánc szintetizálásához. A meghosszabbítás hőmérséklete a használt DNS-polimeráztól függ. A PCR-termék a mérete alapján azonosítható agaróz gél-elektroforézis segítségével. Expressziós vektorok Prokarióta expressziós vektorok A rekombináns DNS technológia egyik legfontosabb vívmánya, hogy a fehérjéket nagy mennyiségben, viszonylag egyszerűen lehet előállítani géntechnológiai úton. Ehhez expressziós vektorokat kell használni, amely segítségével a vektorba épített DNS szekvencia (inszert) kódolta szekvencia kifejezhető. Az expressziós vektoron olyan DNS elemeknek kell lenniük, amelyeket felismer a gazdasejt transzkripciós és fehérjeszintetizáló apparátusa. Bakteriális gazdasejt esetén ezek a transzkripcióhoz szükséges bakteriális promóter és transzkripciós terminátor szakasz, illetve a transzlációhoz szükséges, az mRNS riboszómához való kötődését biztosító szekvencia. A genetikai kód univerzális volta miatt az intron-mentes eukarióta cDNS-ek is expresszálhatók baktériumban. A rekombináns DNS-ről keletkezett fehérjét (akkor is, ha a szekvenciája megegyezik az eredeti a természetes forrásból kivont fehérje szekvenciájával) rekombináns fehérjének nevezzük.

A BIOTECHNOLÓGIA ALKALMAZÁSI LEHETŐSÉGEI A GYÓGYSZERKUTATÁSBAN Eukarióta expressziós vektorok A gazdasejt eukarióta sejt is lehet. Mindegyik rendszernek vannak előnyei és hátrányai, valamint megvannak a saját expressziós vektorai. Az olcsón és egyszerűen tenyészthető baktériumsejtek helyett a komplikáltabb és drágább eukarióta rendszereket használjuk, ha a termelendő fehérje funkciójához elengedhetetlenek a poszttranszlációs módosulások (például glikoziláció), melyek kivitelezésére a baktériumsejt nem képes. Az is lehet, hogy a fehérje feltekeredése nem lesz megfelelő (például a baktériumból hiányzó eukarióta dajkafehérjék hiányában). Gazdasejtnek szóba jöhetnek élesztő, rovar és emlőssejtek. A rovarsejt-specifikus bakulovírus vektorok segítségével igen hatékony fehérjetermelő rendszereket hoztak létre. Nemcsak sejteket, hanem molylepkék lárváit is lehet velük fertőzni, s a bábokból, mint fehérjegyárból lehet kinyerni a rekombináns fehérjéket A klónozás mindig baktériumban történik, tehát olyan vektorokat használnak, amelyek tartalmaznak bakteriális replikont is. Az inszert expressziójához szükséges promóternek természetesen eukarióta eredetűnek kell lennie. Túltermeltetésre kiválóan alkalmasak az erős vírus promóterek. A vektorok tartalmazhatnak további szabályozó elemeket, így például enhanszer elemet is.

4.3. FEHÉRJE-TISZTÍTÁSI ÉS FEHÉRJEVIZSGÁLATI MÓDSZEREK A fehérjék elválasztása és tisztítása kromatográfiás eljárásokkal A kromatográfiás elválasztásokban az elválasztandó anyagok elegyét folyadékban oldják, ez lesz a mozgó fázis. Az így kapott mintát porózus szilárd mátrixra, az álló fázisra viszik fel. Az álló fázis mátrixa és az oldatban lévő komponensek kölcsönhatásai révén a komponensek áthaladása a mátrixon különböző mértékig lelassul. A kromatográfiás technikákat a mozgó és az álló fázis jellege szerint csoportosítják. Az oszlophoz kikötődött anyagokat megfelelő oldószerrel leoldják/leszorítják, az elválasztott anyagokat pedig frakciókba gyűjtik. Ioncserés kromatográfia Az ioncserés kromatográfia lehet: Anioncserélő kromatográfia, mely során a stacioner fázishoz kötött pozitív töltésű kémiai csoportokhoz negatív töltésű anionok kötődnek, és kationcserélő kromatográfia, amikor negatív töltésű csoportokhoz pozitív töltésű kationok kötődnek. Affinitás kromatográfia Az affinitás kromatográfia specifikus fehérje-ligand kölcsönhatáson alapul és a fehérjék egyedi biológiai tulajdonságait használja ki. Az oszlopon immobilizált ligand (antitest, receptor, ligand, specifikus kötő partner) specifikusan megköti az elegyben levő, tisztítani kívánt anyagot, amelyet a nem kötődött fehérjék lemosása után specifikus elúció során lehet tiszta formában az oszlopról leoldani. Gélszűrés A gélszűrés során a molekulák mérete szerinti elválasztása válik lehetővé. Elsősorban fehérjék sómentesítésére és kis molekuláktól történő elválasztására szolgál. A módszer lényege, hogy a kis molekulák behatolnak a töltetetként alkalmazott gél szemcséibe, emiatt hosszabb utat tesznek meg és később eluálódnak mint a nagyobb molekulák, amelyek a gélszemcsék között vándorolnak és így hamarabb eluálódnak .

17

18

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA A fehérjék vizsgálata gélelektroforézis segítségével SDS-PAGE A fehérjék elválasztása történhet gélelektroforézis segítségével. Az SDS-poliakrilamid gélektroforézis (PAGE) során a fehérjék elválasztása méret szerint történik. A mintához adott SDS (Na-dodecilszulfát) denaturálja és befedi a fehérjéket, így azok mind hasonló alakot vesznek fel. Emiatt a fehérjék vándorlásisebessége a gélben csak a méretüküktől függ az elektromos térben elhelyezett poliakrilamid gélben. Az akrilamid koncentrációjától és a fehérje nagyságától függően változik a futtatás végéig megtett út, és a megtett úthosszból következtetni lehet a fehérje tömegére. Ugyanakkor képet kaphatunk a fehérje tisztaságáról, illetve ellenőrizhetjük a fehérje tisztulását az egyes tisztítási lépések után is. Kétdimenziós elektroforézis A kétdimenziós elektroforézis (2DE) igen hatékony módszer fehérjék elválasztására. A folyamat során alkalmazott első lépés az izoelektromos fókuszálás (első dimenzió) – a fehérjék elválasztása izoelektromos pontjuk (pI) alapján történik. A második dimenzió az SDS-PAGE – melyben a fehérjék elválasztása a méret alapján történik. A gélben levő fehérjék vizualizálása különböző festési eljárások segítségével történik. A leggyakrabban a Coomassie, ezüst vagy fluoreszcens festési eljárásokat használják. A módszer alkalmas teljes proteomok vizsgálatára és a fehérjék kvantitatív és kvalitatív változásainak nyomon követésére. Fehérjevizsgálat Western blot segítségével Az SDS-PAGE géleken levő fehérjéket nitrocellulóz vagy PVDF (polivinil-fluorid) membránra visszük át („blottolás), majd a kimutatandó fehérjére specifikus antitesttel inkubáljuk a membránt. Ha a gélben ott van akeresett fehérje, akkor detektálni tudjuk a kötődött antitestet egy enzimmel jelölt, másodlagos antitest segítségével. A membránon a fehérjék denaturált állapotban vannak, így a megfelelő epitópok hozzáférhetők az antitestek számára. A módszer hátránya, hogy a fehérjék kimutatása csak megfelelő antitest segítségével lehetséges. A gélelektroforézis vagy Western blot segítségével kiválasztott fehérjéket tartalmazó foltok vagy sávok kivágásra kerülhetnek, majd azonosításuk érdekében tömegspektrometriás analízisnek vethetők alá.

ÚJDONSÁG Izomszövet fenntartása és regenerációja – a fő szabályozók azonosítása – rekombináns oxytocin Az izomszövet atrofizál a kor előrehaladtával, miközben minden, köztük az izomszövet regeneratív kapcitása is csökken. A legtöbb molekula azonban, amelyet eddig a szöveti regenerációban azonosítottak, fontos szerepet játszik a rákbetegség kialakulásában is. Épp ezért a kutatók biztonságosabb alternatívák keresésébe fogtak a szövetek indukált regenerációjának elősegítése érdekében. A legutóbbi kutatások kimutatták, hogy az oxytocin hormon szükséges az izomszövet fenntartásához és a homeosztázis megőrzéséhez, de mennyisége csökken az öregedés során. Hogy pontosan feltárják az oxytocin szerepét az izomregenerációban, a kutatók öreg egereknek intradermálisan adagolták a hormont négy napon keresztül először, majd még öt napon keresztül az izomsérülést követően. A kilenc napos kezelést követően egyértelműen azoknak az állatoknak az izmai regenerálódtak jobban, amelyek oxytocin kezelést kaptak. A kontroll csoporté, melyek nem kaptak kezelést, sokkal rosszabbul. Ami különösen fontos megfigyelés volt, hogy fiatal állatok oxytocinnal

A BIOTECHNOLÓGIA ALKALMAZÁSI LEHETŐSÉGEI A GYÓGYSZERKUTATÁSBAN történő kezelése nem okozott változást az izomregenerációs képességükben. Az oxitocin genetikai hiánya nem okozott fejlődési rendellenességet, azonban izomszövet hiányához vezetett. A fenti kísérletekből azt a következtetést szűrték le, hogy az oxytocin kezelés alkalmasabb lehet az öregedés tüneteinek enyhítésére, mint a jelenleg alkalmazott hormon terápia (hormon replacement therapy = HRT). Ajánlott irodalom Elabd C, Cousin W, Upadhyayula P, Chen RY, Chooljian MS, Li J, Kung S, Jiang KP, Conboy IM: Oxytocin is an age-specific circulating hormone that is necessary for muscle maintenance and regeneration. Nat Commun. 2014 Jun 10;5:4082.

19

5. REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK IPARI LÉPTÉKŰ ELŐÁLLÍTÁSA 5.1. BEVEZETÉS Az állatkísérletes teszteléshez a gyógyszerfelfedezés és gyógyszerfejlesztés folyamán azonosított, klinikai potenciállal bíró makromolekulák nagy mennyisége szükséges. Az in vitro teszteléshez elegendő mennyiség 100-1000-szeresére van szükség a gyógyszerjelölt in vivo toxikológiai és farmakokinetikai teszteléséhez kísérleti állatokban. Az in vivo vizsgálatokhoz szükséges mennyiségű gyógyszerjelölt makromolekulát rekombináns sejtekkel termeltetik meg. A rekombináns sejt típusának kiválasztása a termeltetendő fehérjétől és gazdasági megfontolásoktól függ. Ha a fehérje nem kell átmenjen poszt-transzlációs modifikáción, prokarióta sejtet választunk, annál is inkább, mert általában ez a költséghatékonyabb megoldás. Ha a fehérje funkcióképességéhez poszt-transzlációs modifikációra van szükség, kénytelenek vagyunk eukarióta sejtet választani. A legtökéletesebb az emlős sejtek alkalmazása, viszont ennek a költségei is a legmagasabbak. Függetlenül az expressziós vektor és a gazdasejt típusától, nagyon fontos, hogy a gazdasejt a lehető legnagyobb mennyiségben termelje a gyógyszerjelölt fehérjét.

5.2. A REKOMBINÁNS FEHÉRJE TERMELÉSÉNEK OPTIMALIZÁLÁSA A.GAZDASEJTEKBEN A gazdasejt gyógyszerjelölt-termelő képességének optimalizálása folyamatosan történik a pre-klinikai és a klinikai fejlesztés során. Ez nagyon fontos folyamat, ami közvetlen hatással van a költségekre és a gyógyszergyárak haszonkulcsára az esetben, ha a gyógyszer kereskedelmi forgalomba kerül. A plazmid vektorok DNS szekvenciájának optimalizációját a molekuláris biológusok és a gyógyszerfejlesztők kollaborációban végzik. Az első lépés olyan genetikai elemek konstrukciója, melyek növelik a rekombináns fehérje expresszióját és a plazmid vektor stabilitását a gazdasejtben. Miután a rekombináns fehérjét kódoló gént hordozó plazmidot bejuttatták a gazdasejtbe, kiszelektálják a stabilan expresszáló, legjobban termelő sejteket. Akár több ezer sejtklónt letesztelnek, mire az optimálisat megtalálják. Az optimalizálási folyamat részleteit rendszerint üzleti titokként kezelik a gyógyszergyárak.

5.3. A GAZDASEJTEK NAGYLÉPTÉKŰ TENYÉSZTÉSE A gyógyszerfejlesztés során a rekombináns fehérjét laboratóriumi körülmények között termelik. Ez 1-2 liternyi sejttenyészetet és néhány mikrogramm fehérjét jelent. A laboratóriumban alkalmazott tisztítási és analitikai módszerek nem egykönnyen fejleszthetők ipari léptékűvé. A nagyléptékű sejtkultúrákhoz új módszerek és új eszközök kellenek. Azt a folyamatot, melynek során nagy mennyiségű gyógyszert vagy más hasznos anyagot termeltetnek kontrollált körülmények között tenyésztett mikróbák vagy más sejtek nagy tömegével, fermentációnak nevezzük. A fermentációs folyamat optimalizálásához kísérleti fermentorokat építenek. Ezek a fermentorok általában 30 liter körüliek, és mindazzal a technikai felszereltséggel rendelkeznek, amivel majd a nagy kapacitású (akár 100 000 literes) termelő fermentornak rendelkeznie kell. Különálló adagokban történő fermentáció (batch process) Ebben a konfigurációban a sejteket addig tenyésztik, amíg elfogynak a tápanyagok, vagy a keletkező anyagcseretermékek gátolni kezdik a sejtek szaporodását. Ezután a sejteket leválasztják, feltárják és

22

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA a termelt fehérjét izolálják. E módszer alkalmazása esetén különösen ügyelni kell, hogy az egyes adagok (batch-ek) között ne legyen különbség, a termelt fehérje minősége konzisztens legyen. Táplált adagokban történő fermentáció (fed-batch process) Ez a konfiguráció elengedhetetlen olyan fehérjék tömegtermelése esetén, melyek szintézisük után a gazdasejtekben maradnak, izolálásukhoz a sejtek feltárása szükséges. A konfiguráció hasonlít a batch-process-hez, azzal a különbséggel, hogy időről időre pótolják a tápanyagokat és megkötik a káros anyagcseretermékeket, így növelve meg a kultúra élettartamát. A sejtek denzitását így tízszere7 sére lehet növelni a batch-process-hez képest, ami a fed-batch process esetén több mint 10 sejt/ml is lehet. A folyamat végén a sejteket learatják, feltárják, majd a rekomvináns proteint izolálják. A kemosztát A kemosztátban olyan rekombináns mikróbákat szaporítanak, melyek szekretálják a rekombináns fehérjét vagy kismolekulát a tápoldatba, ahonnan az izolálható. A folyamat során rendszeres időközönként friss tápoldatot adnak a tenyészethez, a rekombináns fehérjét tartalmazó elhasznált tápoldatból pedig egy ugyanakkora térfogatot eltávolítanak. Általában ezeknek a mikróbáknak a szaporodása egyetlen tápanyagtól függ, ami könnyen pótolható. Mivel a termék könnyen izolálható a tápoldatból, a tápanyag pedig egyszerűen pótolható, a sejtek folyamatosan tenyészthetők, nem kell őket learatni. A gazdasejtek genetikai és funkcionális stabilitását rendszeresen monitorozni kell, hiszen a kemosztát hónapokig is működhet. Mivel a hosszú működési idő növeli a kontamináció esélyét, a kemosztátot ritkán használják rekombináns fehérjék előállítására Perfúziós konfiguráció A perfúziós konfiguráció lényege, hogy a rekombináns fehérjét tartalmazó elhasznált tápoldatot egy a sejtek számára átjárhatatlan - szűrőrendszeren keresztül távolítják el a fermentorból, miközben friss tápanyagot juttatnak a rendszerbe. A perfúziós fermentor sokáig működhet, viszont ára és komplexitása miatt csak a legdrágább biogyógyszerek előállítására használják.

5.4. A TERMÉK FELDOLGOZÁSA, TISZTÍTÁSA Függetlenül az alkalmazott konfiguráció típusától, a sejtek learatása optimális szaporodási és életképességi stádiumuknál történik. Ez biztosítja, hogy a termék a lehető legnagyobb mennyiségben legyen jelen. A rekombináns fehérjét a learatott biomasszából, legyen az a gazdasejtek tömege vagy a tápoldat, a fermentáció után meg kell tisztítani. A tisztítási folyamatot speciálisan az ipari méretekhez kell kifejleszteni, ugyanis gyakran a laboratóriumban használt módszerek erre nem alkalmasak. Nyilván nem praktikus például 100 000 liter tápoldatot centrifugálni. A parenterális bejuttatásra szánt fehérje megkívánt tisztaságának biztosítása ugyancsak komoly kihívást jelent. A cél az, hogy a fermentáció utáni feldolgozási folyamat minél kevesebb lépésből álljon, és minél egyszerűbb legyen. A feldolgozási folyamat négy lépésre osztható: (1) szilárd-folyadék szétválasztás, (2) koncentrálás, (3) a terméktisztítása, (4) minőség-ellenőrzés. Szilárd-folyadék szétválasztás A fermentációs folyamatban előállított termék vagy a gazdasejtekben, vagy a tápfolyadékban található, tehát a termék kinyerésének első lépése a sejtek és a tápfolyadék szétválasztása. A szétválasz-

REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK IPARI LÉPTÉKŰ ELŐÁLLÍTÁSA tásban általában a sejtek méretét vagy a szilárd és folyadékfázis közötti sűrűségkülönbséget használják ki. Abban az esetben, ha a termék a gazdasejtekben található, a sejteket a tápfolyadéktól történő elválasztás után feltárják, hogy a termék izolálható legyen. A szilárd alkotók és a folyadékfázis közötti sűrűségkülönbséget használja ki a centrifugálás, melyet széleskörűen alkalmaznak a gyógyszerfejlesztés során. Az ultracentrifuga képes a sejtmembrán és a tápfolyadék szeparálására is, a sűrűségük közötti csekély különbség ellenére. A centrifugálás - korlátozott kapacitása, költséges működtetése miatt - a termék ipari előállítása során kevéssé praktikus megoldás. Kifejlesztettek már folyamatosan működő centrifugákat a kis kapacitás okozta nehézségek kiküszöbölésére, azonban ezeknek az eszközöknek is magasak az üzemeltetési költségeik. Alternatív megoldásként a sejteket visszatartó, a folyadékot átengedő szűrő használható. Ez a megoldás kiaknázza a sejtek (1-10 µm) és és a tápoldatban lévő kolloidok (1-500 nm) mérete közötti különbséget. A termék tisztítás előtti koncentrálása Ha termékünk a tápoldatban van, koncentrációja rendszerint 2-15 % közötti. Ebben a koncentrációban nem léphetünk tovább a tisztítási lépésre, például kromatográfiára. A termék bekoncentrálására többféle lehetőség van, például melegítéssel párologtatják el a vizet kis peptidek oldatából, fehérjék precipitációja pedig elterjedt módszer a gyógyszeriparban. A termék tisztítása A koncentrált oldatból tisztítási lépések láncolatán keresztül jutunk el a végtermékhez, melynek tisztasága eléri a terápiás alkalmazásokhoz szükséges mértéket. A legtöbb szennyező fehérje, nukleinsav, endotoxin és vírus eltávolításra kerül. A tisztítás legfőbb eszköze a kromatográfia néven ismert módszercsoport. A kromatográfia során a folyadékfázis áramlik a szilárd mátrix résein keresztül. A leginkább használt módszer az affinitáskromatográfia, mely során a folyadékfázisban lévő analitok különböző affinitással kötődnek a szilárd fázishoz kapcsolt kémiai csoporthoz, ezért egymástól elválasztva jelennek meg a kromatográfiás oszlop végén. A módszerről részletesebben a 4. fejezetben szóltunk.

ÚJDONSÁG

Új megközelítés aggregációra hajlamos rekombináns fehérjék E.coli-ban történő termelésére Fehérje aggregáció igen nagy problémát jelent E. coli-ban történő rekombináns fehérjetermelés esetén. Ennek számos oka van, de a leggyakoribb, hogy amikor egy heterológ gén túlexpressziója történik, akkor oldhatatlan „inclusion bodies” inklúziós testecskék jönnek létre. Amíg számos stratégiát kidolgoztak már arra, hogy megoldják az aggregálódás problémáját, egyik sem tudja garantálni szolubilis, azaz oldható fehérje termelését. Mostanában jelentették azonban, hogy kutatók egy fúzióspartner alapú megközelítést alkalmaztak, amelyben egy aggregációt gátló fúziós protein tag-t (HI18) használtak. A kutatók így rekombináns, oldható Humán Islet Amyloid Polypeptide (IAPP) fehérjét tudtak előállítani, amely a fő komponense a hasnyálmirigy amyloid lerakódásának 2-es típusú diabétesz során. A HI18 védi az IAPP monomerek hidrofób szekvenciáit az expresszió és tisztítás során, ezzel akadályozva meg az aggregációt. A kutatók le is tudták hasítani az IAPP molekulát a fúziós fehérjéről és így homogenitásig sikerült tisztítani. Az eredmények ennek a módszernek az életképességét bizo-

23

24

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA nyítják, és remélhetőleg más aggregálódásra hajlamos fehérje tisztításában is segítséget tud majd nyújtani. Ajánlott irodalom Mirecka EA, Gremer L, Schiefer S, Oesterhelt F, Stoldt M, Willbold D, Hoyer W: Engineered aggregation inhibitor fusion for production of highly amyloidogenic human islet amyloid polypeptide. J Biotechnol. 2014 Dec 10;191:221-7. doi: 10.1016/j.jbiotec.2014.06.006. Epub 2014 Jun 11.

6. ANTITESTEK 6.1. BEVEZETÉS A szervezet védelmi rendszere, az immunrendszer különféle sejttípusok és fehérjemolekulák integrált rendszere. Az immunrendszer funkciója a szervezet védelme mikrobákkal és parazitákkal szemben. Az immunrendszer részletes ismertetése nem lehet célja e jegyzetnek, ezt az immunológia tantárgy keretében tanulják meg a hallgatók. Jelen fejezet tárgya az antitestek biotechnológiája és biofarmáciája, ezért a fejezetet az antitestek struktúrájának és funkciójának ismertetésével kezdjük. Az antitesteket az immunrendszer egyik kulcsfontosságú sejttípusa, a B limfocitából differenciálódott plazmasejt termeli. Az antitestek, más néven immunglobulinok, magas koncentrációban vannak jelen a vérben. Az antitest molekulák négy fehérjeláncból állnak, amelyek diszulfid kötésekkel kapcsolódnak össze (6.1 ábra). Emberben az antitestek, szerkezetük, biológiai funkciójuk és szöveti lokalizációjuk alapján, öt típusba sorolhatók: Immunoglobulin (Ig)G, IgM, IgA, IgD és IgE. Minden immunglobulinnak két antigénkötő helye van. Az IgA molekulák olykor párosával összekapcsolódnak, az így kialakult dimernek tehát négy antigénkötő helye van. Az IgM molekulák ötösével kapcsolódnak össze egy J jelű polipeptid segítségével, tíz antigénkötő helyet biztosítva az így keletkező pentamernek. Típusuktól függetlenül, minden immunglobulin molekula két könnyű láncból (L-lánc) és két nehéz láncból (H-lánc) áll össze négy diszulfid híd közreműködésével. Minkét nehézlánchoz egy-egy könnyűlánc kapcsolódik egy-egy diszulfid híddal, míg a két nehézláncot két diszulfid híd kapcsolja össze (lásd 6.1. ábra). Az antitestek variábilis doménjában mind a könnyűlánchoz, mind a nehézlánchoz tartozó fehérjeszakaszok megtalálhatók. A variábilis domén felépítésében mindkét fehérjelánc N-terminális része vesz részt. A variábilis doménban elhelyezkedő komplementaritás-meghatározó régió szabja meg az antitest antigén-specificitását és affinitását. A H-láncok típusa szabja meg, hogy a plazmasejt által termelt antitest melyik osztályba tartozik. Az IgG γ nehézláncot, az IgM µ nehézláncot, az IgA α nehézláncot, az IgD δ nehézláncot, azIgE pedig ε nehézláncot tartalmaz. Továbbá vannak olyan fehérjeszakaszok mind a H-, mind az L-láncokban, melyek változatlanok egy bizonyos faj egyedeiben. A különböző fajok konstans régióinak a szekvenciája különböző (pl. ember vs. patkány stb). A nehézláncok diszulfid hidakkal összekapcsolt konstans régiói alkotják az antitest molekulának azt a részét, mely az antitestfüggő (Fc mediált) celluláris funkciókat és komplement-indukált citolízist mediálja. Az IgG glikozilációs helyei szintén ezen a részen találhatók. Nyúl immunglobulinnal kísérletezve, mely nagyrészt IgG-ből áll, R. R. Porter 1959-ben megfigyelte, hogy a papaya növényből izolált papain nevű proteáz az antitest molekulát két, nagyjából egyenlő molekulatömegű (kb. 50 kDa) részre képes vágni. Az egyik fragmentum megtartja az antigén-kötés képességét (Fab). A másik, antigénkötésre nem képes, de könnyen kristályosítható fragmentumot Fc-nek nevezték el. Később kiderült, hogy egy másik proteáz, a pepszin, képes az antitestet elvágni a hinge (magyarul talán forgópántnak fordítható, a két molekularész egymáshoz képesti szabad elfordulását lehetővé tevő) régió alatt, a két diszulfid híd között. A kép fragmentum különböző molekulatömeggel rendelkezik, az egyiknek két antigénkötőhelye van, ezt Fab2-nek nevezik, a másik fragmentum neve, noha kissé különbözik a papain által létrehozott Fc fragmentumtól, szintén Fc (6.2. ábra).

26

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA

6.1. ábra: Antitest sematikus ábrázolása. Jelölések: VH-nehézlánc variábilis régiója, CH-nehézlánc konstans régiója, VL-könnyűlánc variábilis régiója, CL- könnyűlánc konstans régiója. A láncokat összekötő sárga szakaszok a diszulfid hidakat jelölik.

6.2.ábra: Antitest-származékok. A jelölések megegyeznek a 6.1. ábra által használt jelölésekkel. Az immunglobulin molekulát a papain a H-láncokat összekötő két diszulfidhíd fölött vágja, 2 Fab és egy Fc molekulát eredményezve. A pepszin a H-láncokat összekötő két diszulfidhíd között hasít, egy darab két antigénkötő hellyel rendelkező Fab2 molekulát eredményezve az Fc fragmentum mellett.

ANTITESTEK

6.2. MONOKLONÁLIS ELLENANYAGOK A poliklonális ellenagyagok és terápiás alkalmazásuk korlátai Egy tipikus fehérje antigén több száz aminosavból áll, amely sok különböző epitópot jelent. Az epitóp an antigén azon része, melyet az antitest (más néven ellenanyag) képes „befogni”, amire a kötődő antitest specifikus. Egy epitóp 6-8 aminosavból áll. Egy epitópot tartalmazó rövid peptiddel immunizálva az állatot, sokféle antitest képződik, melyek mind specifikusak az adott epitópra. Az antitestek sokfélesége abból adódik, hogy sok különböző B-sejt klón termeli őket. Az így termeltetett antitest-koktélt monospecifikus poliklonális antitestnek vagy monospecifikus poliklonális ellenanyagnak nevezzük. Ahhoz, hogy folyamatosan monoklonális antitestet, azaz egyetlen B-sejt klón által termelt (természetesen monospecifikus) antitestet állíthassunk elő, ahhoz folyamatosan osztódó, „örök életű” B-sejt klónokra lenne szükségünk. Sajnos egy B-sejt klón élettartama emberben és más fajokban is mindössze 30-60 nap, ami messze nem elég komolyabb mennyiségű monoklonális antitest előállításához. A probléma megoldása soklépéses folyamat volt. Az első lépést 1975-ben tette meg Köhler és Milstein, akik munkájukért öt évvel később Nobel-díjat kaptak. A monoklonális antitestek és terápiás alkalmazásaik A hibridóma technika Hibridóma technikának nevezzük hibrid sejtvonal előállítását antitest-termelő B-sejt és myeloma (Bsejt daganat) sejt fúziójával. Az így előállított sejtvonalat hibridómának nevezzük. A felhasznált myeloma sejtvonal szelekcióval kifejlesztett tulajdonságai, hogy képes sejt-tenyészetben szaporodni, nem termel antitestet, valamint nincs működő hipoxantin-guanin foszforiboziltranszferáz (HGPRT) génje. Ez utóbbi tulajdonság fontossága a későbbiekben válik érthetővé. A hibridóma által termelt antitestek egyetlen B-sejt klóntól származnak, tehát monoklonális antitesteknek vagy monoklonális ellenagyagoknak nevezzük őket. A monoklonális ellenagyagok nyilvánvalóan monospecifikusak is. A módszer során először a kísérleti állatokat (emlősöket, pl. egereket) immunizáljuk az antigénnel, melyre specifikus monoklonális ellenagyagot kívánunk generálni. Ez általában sorozatos antigéninjekcióval történik. Ezt követően B-sejteket izolálunk az állat lépéből, melyeket fuzionáltatunk az immortalizált myeloma sejtekkel. A kezelés következtében a B-sejtek és a myeloma sejtek egy része fúzióra lép egymással, hibridóma sejteket eredményezve. A fúzió nem 100 %-os hatékonyságú, tehát maradnak B-sejtek és myeloma sejtek is a kultúrában. Kell egy módszer, mellyel megszabadulunk tőlük, és tiszta hibridóma kultúrát nyerünk. A B-sejtek csak néhány osztódásra képesek, aztán a klón kihal. A myeloma sejtek viszont sokkal erőteljesebben osztódnak, mint a hibridóma sejtek, így túlszaporodnák őket a sejtkultúrában. Elpusztításukhoz felhasználjuk azt a már említett tulajdonságukat, hogy nincs bennük hipoxantin-guanin foszforiboziltranszferáz (HGPRT) aktivitás. A szelekció menete a következő: A fúziót indukáló stimuluson átesett sejttenyészetet HAT (hipoxantinaminopterin-timidin) táptalajon inkubáljuk 10-14 napon keresztül. Az aminopterin gátolja a nukleotidszintézist, a myeloma sejtek pedig nem képesek a salvage utat használni, mert hiányzik belőlük az ehhez szükséges enzim (a HGPRT), ezért elpusztulnak. A hibridóma sejtek képesek nukleotide salvage-ra, mert a B-sejtekben van funkcionális HGPRT gén, tehát életben maradnak, és csakis ők maradnak életben. Vég nélkül osztódnak (myeloma tulajdonság), és antitestet termelnek (B-sejt tulajdonság).

27

28

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA Ezután a médiumot kihígítjuk soklyukú plate-re olyan mértékben, hogy mindegyik lyuk csak egy sejtet tartalmazzon. Az egy lyukban levő antitestek egyetlen B-sejt-től származnak, és egyetlen epitópot ismernek fel, tehát monoklonálisak. A hibridómák folyamatosan osztódnak, és ellenanyagot termelnek. Az egyik első terápiás egér monoklonális antitest a muromomab nevő anti-DD3 ellenanyag volt. Alig több mint tíz évvel a hibridóma technika felfedezése után került kereskedelmi forgalomba. Vese transzplantátumok akut kilökődésének kezelésére használták. Sajnos az egér antitestek emberben immunreakciót váltanak ki, komoly gyulladásos mellékhatásokat okozva. A mellékhatások enyhíthetők gyulladáscsökkentő gyógyszerek alkalmazásával. A humán monoklonális antitestek előállíása komoly nehézségekbe ütközött. Habár nincs hiány humán myeloma sejtvonalakban, a felhasználásukkal előállított hibridóma sejtvonalak vagy halhatatlanságukat, vagy antigéntermelő képességüket vesztették el. Az elmúlt negyven évben egy sor sejt- és molekuláris biológiai módszer került alkalmazásra, hogy az egér antitesteket „humanizálni” lehessen. Az immunglobulin gének regulációjának és expressziójának jobb megismerése, valamint a rekombináns DNS technológia fejlődése lehetővé tette antigén-specifikus rekombináns humán IgG molekulák konstrukcióját. Az egér monoklonális antitestek immunogenicitásának csökkentése céljából a kutatók felhasználták az antitestek immunogén régióiról gyűjtött ismereteket. Ezek a régiók elsősorban az IgG molekula konstans régióiban (CH és CL) helyezkednek el. Az egér monoklonális antitestet alkotó aminosavak szisztematikus kicserélése az antigénkötő funkcióhoz nem szükséges régiókban lehetővé teszi kiméra-fehérjék előállítását. Ezek a fehérjék mind egér, mind humán szekvenciákat tartalmaznak, és megmarad antigénkötő képességük, melyért az Fab fragmentum aminoterminális része felelős. Az antigénkötéshez minimálisan elegendő szakaszt Fv-nek nevezzük. Az Fv mérete körülbelül az Fab fragmentum méretének a fele. Az így előállított antitesteket „egér/humán kiméra antitestek”-nek nevezzük. Immunogenicitásuk lényegesen kisebb, mint a teljesen egér antitesteké. Az kiméra antitestek immunogenicitásának további mérséklése céljából a kutatók a molekula csaknem teljes szekvenciáját humán szekvenciára cserélték. Kivétel az antitest antigénkötő képességéhez nélkülözhetetlen hipervariábilis komplementaritás-meghatározó régió (CDR) mely az Fv fragmentum csekély hányada. Az egér CDR beépítése egy egyébként humán IgG-be azonban csökkentette az antitest affinitását az antigénhez. Az affinitás helyreállításához további szekvencia-módosításokat volt szükséges végrehajtani. Az utóbbi néhány évben sikerült megfelelő humán myeloma sejtvonalat előállítani, és a humán hibridóma valósággá vált. Habár a humán immunglobulin gének klónozása antigén-specifikus humán B-sejtekből jórészt feleslegessé tette a humán hibridóma technikát a terápiás felhasználás szempontjából, vannak területek, ahol gyümölcsözően alkalmazható. Például a hibridoma módszerrel termelt humán monoklonális antitestet fel lehet használni annak vizsgálatára, hogy a rekombináns antitest tulajdonságai megegyeznek-e a natív antitestekével. Mint fentebb említettük, a monoklonális antitest technológia legújabb fejleménye a rekombináns antigén-specifikus humán monoklonális antitestek előállítása. A jól ismert CHO sejtvonal (Chinese Hamster Ovary) adaptálása a nagyléptékű fermentálás körülményeihez kulcsfontosságú volt a cél eléréséhez. A CHO alkalmassá vált a szaporodásra szuszpenziós kultúrákban, és megbízhatóan termeli a teljesen funkcionális humán monoklonális antitesteket. Ezek az új eredmények lényegesen csökkentették az antitestek előállítási költségeit, ami elengedhetetlen a széleskörű terápiás felhasználáshoz. Ma már terápiás antitestek egész sora van kereskedelmi forgalomban.

ANTITESTEK

ÚJDONSÁG Bakteriális szekretáló rendszer nagy hozamú és szolubilis scFv termeléshez Egy-láncú variábilis fragmentumok (Single-chain variable fragments avagy scFv-s) számos kutatási feladat ellátása mellett a terápiában és diagnosztikában is széleskörű alkalmazást nyertek az utóbbi időben. scFv-k a monoklonális ellenanyagok (monoclonal antibodies avagy Mabs) kiváló alternatívái. Annál is inkább, mivel megőrzik az eredeti ellenanyag tulajdonságait, miközben könnyebb az előállításuk, kisebb méretüknél fogva könnyebben bejutnak a tumorsejtekbe, gyorsabban kiürülnek a vérből és az antigenitásuk is alacsony. Amíg Mab-k termeltetéséhez emlős sejtekre van szükség, addikg az scFv-k termelése E. coli-ban is elvégeztethető. Mivel scFv-k termelése E. coli-ban nem könnyű feladat, a kutatók kifejlesztettek egy hatékony scFv szekretáló rendszert a bakteriális szekretáló szállító fehérje, az osmY felhasználásával. Az osmY fehérje és a periplasmikus vezérlő szekvencia (pelB) fúzionáltatása az anti-EGFR scFv-vel (Epidermal growth factor receptor) azt eredményezte, hogy hatalmas hozamban, szolubilis és funkcionálisan aktív scFv-t tudtak előállítani. Ajánlott irodalom Ahmad ZA, Yeap SK, Ali AM, Ho WY, Alitheen NB, Hamid M: scFv antibody: principles and clinical application. Clin Dev Immunol. 2012; 2012():980250. Cheng CM, Tzou SC, Zhuang YH, Huang CC, Kao CH, Liao KW, Cheng TC, Chuang CH, Hsieh YC, Tai MH, Cheng TL: Functional production of a soluble and secreted single-chain antibody by a bacterial secretion system. PLoS One. 2014; 9(5): e97367.

29

7. HEMATOPOIETIKUS NÖVEKEDÉSI ÉS KOAGULÁCIÓS FAKTOROK 7.1. BEVEZETÉS A hematopoiezis, azaz a vérképzés – a vérsejtek kialakulása, differenciálódása, fejlődése és fenntartása – a vörös csontvelőben végbemenő, pontosan szabályozott folyamat. Négy fő sejtmegújító rendszerből áll: az eritropoiezisből (vörös vértestek), a mielopoiezisből (makrofág, granulocita), a limfopoiezisből (limfociták, NK sejtek) és a trombopoiezisből (vérlemezke). Valamennyi hematopoietikus sejt egy közös előalakból, a vérképző őssejtből- HSC (hematopoietic stem cell) fejlődik ki. Az őssejtek kétféle módon osztódnak: egyrészt önmagukat replikálják, fenntartva ezzel, az őssejt-populációt, másrészt prekurzor utódsejtek képzésével az elpusztult vérsejtek utánpótlását biztosítják. Ez utóbbi sejtek néhány osztódáson még átesnek, majd osztódási képességüket elvesztve az adott sejttípussá differenciálódnak. Hemosztázisnak nevezzük azt a folyamatot, amely fiziológiás körülmények között folyékony állapotban tartja a vért, de ha az érfal sérül, robbanásszerűen aktiválódva megállítja a vérvesztést és begyógyítja a sérülést. A hemosztatikus rendszer érzékeny egyensúlyának felborulása esetén véralvadási zavarok keletkeznek, vérzékenység vagy trombózis. Az érfal sérülése esetén annak simaizomzata összehúzódik (érspazmus), ez azonban csak apróbb sérülések esetén zárja el a vér útját. Ezzel egy időben megindul a vérlemezkék kitapadása a sérült érfalra, amely vérrög (trombus) képződését eredményezi. Ha ez sem állítja el a vérzést, akkor megindul a véralvadás (koaguláció). A koagulációs kaszkád biokémiai részleteit az 1960-as évek közepén derítették fel. A kaszkád koagulációs faktorok és proteinek összehangolt működésével a vér alvadásához vezet az ér sérülésének helyén. Egy sor proteolitikus és enzimaktivációs lépés végeredményeképpen a trombin nevű enim szabadul fel, amely katazilálja a fibrin fehérje polimerizációját, és a képződött polimer elzárja a sebet. A normál hemosztázis koagulációs és antikoagulációs faktorok egyensúlyának eredménye. A koagulációs és antikoagulációs rendszer egyensúlya felelős azért, hogy kizárólag az érfal sérülése esetén induljon meg a véralvadás, és a vérrögképződés ne legyen kiterjedtebb a szükségesnél. A rekombináns DNS technológia fejlődése lehetővé tette a vérsejt növekedési faktorok és a véralvadási faktorok előállítását, így a hematológiai kórképek kezelhetővé váltak.

7.2. HEMATOPOIETIKUS NÖVEKEDÉSI FAKTOROK A hematopoietikus és hemosztatikus rendszer együttműködésének eredménye a vér tápanyag és oxigéntartalmának, sejtes elemei optimális számának és arányainak fenntartása. A jelenlegi tudományos konszenzus szerint az összes hematopoietikus sejt egy pluripotens prekurzor sejttől származik. A pluripotens prekurzor sejt – önmegújító osztódásai mellett – olyan leánysejteket hoz létre, melyek egy bizonyos hematopoietikus irány felé elkötelezettek. Az elköteleződés korai lépéseit még homály fedi, de a kései szakasz (differenciálódás és érés) lépései jól ismertek. A hematopoietikus sejtek egy része hematopoietikus és koagulációs faktorokat termel, mások differenciálódnak és osztódnak ezeknek a faktoroknak a hatására. Az 1960-as évek elején felismerték, hogy a vérsejtek progenitorai oszódásra késztethetők oldatban levő növekedési faktorokkal. Ezeket a molekulákat kolónia-stimuláló faktoroknak (colony stimulating factor, CSF) nevezték el, mert hatásukra a progenitor sejtekből differenciálódott vérsejtkolóniák alakultak ki félig szilárd táptalajon. Később világossá vált, hogy sokféle CSF létezik, és mindegyik egy bizo-

32

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA nyos vérsejt differenciálódását stimulálja. Ezek a megfigyelések vezettek ahhoz a hipotézishez, hogy a vérsejtek osztódását és differenciálódását specifikus CSF-ok kontrollálják. Sok rekombináns CSF-t előállítottak, és használják őket kutatási és terápiás célokra. Némelyik drámaian javította súlyos hematológiai kórképek kezelhetőségét, és lehetővé tette a neotropéniával asszociált fertőzések megakadályozását. A hematopoiezis zavarai következtében vagy túl kevés, vagy túl sok van a vérben egy adott sejttípusból. Mindkét fajta rendellenesség betegséghez vezethet, a túl kevés sejtet a sejttípus neve után írt – pénia, a túl sokat pedig a -citózis utótag jelenti. Az alábbiakban néhány esettanulmányon keresztül mutatjuk be a hematopoietikus növekedési faktorok terápiás felhasználásának történetét, nehézségeit és jelenlegi helyzetét. Eritropoietin Az eritropoietin a vörös vérsejtek keletkezését serkenti. A vesében termelődik, expresszióját a vér oxigénhiánya indukálja. Az anémiás betegek vérében a normálisnál kevesebb az oxigén, ezért az eritropoietint először anémiás betegek vizeletéből izolálták. A feldolgozott több száz liter vizeletből olyan kevés eritropoietint sikerült kinyerni, hogy a hagyományos aminosavszekvencia-meghatározás lehetetlen volt. Az 1980-as évek elején azonban sikerrel járt az eritropoietint kódoló gén klónozása. Az eritropoetin egy 165 aminosav hosszúságú, 30,4 kDa molekulatömegű glikoprotein. Baktériumokban expresszált formája ugyan képes kötődni receptorához, de nagyon hamar eltűnik a vérplazmából. Ahhoz, hogy terápiásan használható legyen, olyan gazdasejtben kell expresszáltatni, amely képes a normál glikoziláltságot biztosítani. Élesztő vagy rovar gazdasejtek képesek a fehérjék glikozilálására, az általuk szintetizált szénhidrátláncoknak magas a mannóz tartalma, amely a molekula plazmakoncentrációjának gyors csökkenését eredményezi. Az eritropoietin szénhidrát oldalláncának magas sziálsav tartalma kell legyen, ez biztosítja a molekula megfelelő életidejét a vérben. A rekombináns fehérjék termelésében előszeretettel használt CHO (chinese hamster ovary, kínai hörcsög petefészek) sejtek képesek a magas sziálsav tartalom biztosítására, ezért a terápiában használt eritropoietint ezzel a sejttípussal termeltetik. Granulocita kolónia-stimuláló faktor (G-CSF) A G-CSF funkciója a granulociták, elsősorban a neutrofil granulociták termelésének serkentése a szervezetben. A rekombináns G-CSF-t a neutrofil granulociták számának kóros csökkenése, neutropénia kezelésére használják. Neutropénia esetén a szervezet fertőzésekkel szembeni ellenállóképessége vészesen lecsökken. Előfordul veleszületett formája, de gyakoribb a rákbetegek kemoterápiás kezelés hatására bekövetkező neutropéniája. A G-CSF kezelés képes megemelni a neutrofil granulociták számát, így az életveszélyes fertőzések elkerülhetők. Az eritropoietinhez hasonlóan, először a G-CSF-t is betegek vizeletéből izolálták. Az izolált mennyiség elegendő volt az aminosavsorrend egy rövid szakaszának meghatározására, mely alapján oligonukleotid próbát szintetizáltak. Ennek segítségével sikerült a G-CSF génjén azonosítani és klónozni. Thrombopoietin A vese és a máj által termelt thrombopoietin (THPO) a megakariociták termelődését és fejlődését, ezáltal a vérlemezkék képződését szabályozó glikoprotein hormon. A vérlemezkék termelése a normál homeosztázis fenntartásában is fontos, de különösen jelentős megterhelés esetén, például fertőzés, allergiás reakció, vérzés, gyulladás, hipoxia során.

HEMATOPOIETIKUS NÖVEKEDÉSI ÉS KOAGULÁCIÓS FAKTOROK Különféle citosztatikus kezelések (pl. daganatterápiában a kemoterápiás szerek alkalmazása) drasztikusan lecsökkentheti a vér sejtes elemeinek termelését, ezért a kemoterápia alatt a betegek vérlemezke transzfúziót kapnak. Mivel a thrombopoietin fiziológiás körülmények között serkenti a vérlemezkék termelését, intenzív kutatás folyik a thrombocytopenia kezelésére terápiás thrombopoietin készítményekkel. Kezdetben rekombináns humán thrombopoietin (rhTPO) terápia került klinikai kipróbálásra. A rekombináns emberi TPO (rhTPO) ugyanazzal a szerkezettel rendelkezik, mint az endogén fehérje. Sajnos az rhTPO nem váltotta be a hozzá fűzött reményeket, nem növeli szignifikánsan a vérlemezkék számát thrombocitopéniás betegekben, ezért további szerek fejlesztése vált szükségessé. TPO peptid mimetikumok – Jelentős előrelépés 2009-ben történt. Kombinatorikus kémiai módszerekkel random szekvenciájú peptideket szintetizáltak, majd tesztelték, hogy képesek-e az így előállított peptidek aktiválni a thrombopoietin receptort (TPOR). A leghatékonyabbat peptid felhasználásával fúziós fehérjét szintetizáltak, amely a TPOR-aktiváló peptiden kívül antitest Fc fragmentumot is tartalmazott. Az Fc domén funkciója a fúziós fehérje plazma féléletidejének növelése. Az így előállított fehérjének az AMG 531 nevet adták, és klinikai kísérletnek vetették alá. Az AMG 531 hatékonynak bizonyult, káros mellékhatások nélkül serkenti a vérlemezkék termelődését thrombocitopeniás betegekben. TPO nem-peptid mimetikumok - Kismolekulájú TPOR agonistákat is sikerült kifejleszteni, melyek nagy előnye, hogy szájon át szedhetők. Közülük egy, az eltrombopag (rINN, SB-497115-GR) biztonságosnak és hatásosnak bizonyult III. fázisú klinikai kísérletben. TPOR agonista ellenanyagok – Jelenleg intenzív kutatás folyik thrombopoietin receptor agonista monoklonális ellenanyagok és ellenanyag származékok előállítására. Ezek közül az MA01G4G344 jelű ellenanyag a legígéretesebb. Interleukin-11 (IL-11) Az IL-11 multifunkciós citokin, melyet először a csontvelő sztóma-sejtjeiből izoláltak 1990-ben. A hematopoiezis több lépésének kulcsfontosságú regulátora, különösen fontos a megakariociták érésében betöltött szerepe. Terápiás célokra az interleukin-11-et a recombináns DNS technológia alkalmazásával állítják elő. Kereskedelmi forgalomba oprelvekin márkanéven kerül. A készítményt sikerrel alkalmazzák rákos betegek súlyos thrombocitopeniájának kezelésére.

7.3. VÉRALVADÁSI (KOAGULÁCIÓS) FAKTOROK A véralvadás az a folyamat, melynek eredményeképpen a folyékony vér szilárd halmazállapotúvá válik. Fizikokémiai hatásokra indul el, létrejöhet a szervezeten belül, vagy azon kívül. Élettani szerepe, hogy az ér sérülése esetén a vérvesztést megakadályozza. A véralvadás a sebgyógyulás alapfeltétele. A véralvadás két, egymással kölcsönható részfolyamatból áll. Az első, sejtes szakaszban a sérült érszakasz falának sejtjei és a vérlemezkék, illetve a véredényen kívüli szövetek vesznek részt. A második, plazmatikus szakaszban a laza sejtes lezárás fibrinszálakkal erősödik meg meg. Ezt tizenhárom faktor együttműködése hozza létre. A véralvadást követő sebgyógyulást a trombociták és az érfal sejtjei által kiválasztott növekedési faktorok indítják be. A seb gyógyulását követően a fibrint a vérplazma fibrinolitikus rendszere oldja fel. A véralvadás folyamatát részletesen itt nem ismertetjük, az

33

34

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA olvasó megtalálhatja azt a biokémia és az élettan tankönyvekben. Bármelyik véralvadási faktor hiánya vérzékenységet (hemofília) okoz, mely a hiányzó faktor pótlásával kezelhető. Az alábbi táblázatban mutatjuk be a véralvadási faktorokat és a hiányukban kifejlődő betegségeket a WHO listája szerint. WHO elnevezés

Megnevezés

I.

fibrinogén

II.

protrombin

* *

Hiányállapot (vérzéssel járó betegség) afibrinogenaemia protrombinhiány

**

(III.)

trombokináz, tromboplasztin , avagy “szöveti faktort” (TF)

(IV.)

Kalcium (Ca )

V.

proakcelerin, Owren-faktor

parahemofília, V. faktor hiány

VII.

szérum protrombin konverzió akcelerátor (SPCA), prokonvertin

VII. faktor hiány (SPCA hiány)

VIII.

antihemofíliás faktor A

hemofília A

IX.

Christmas-faktor, antihemofíliás faktor B, plazmatromboplasztin komponens (PTC)

hemofília B (Christmas-betegség)

X.

Stuart–Prower-faktor

X. faktor hiány, (Stuart-faktorbetegség)

XI.

Plazmatromboplasztin antecedens (PTA), antihemofíliás faktor C

hemofília C

XII.

Hageman-faktor

(nincs véralvadási zavar)

XIII.

fibrinstabilizáló faktor, transzglutamináz Laki-Lóránt faktor

XIII. faktor hiány

2+

A következőben az egyes véralvadási faktorok alkalmazását és biotechnológiáját tárgyaljuk. Faktor I. (fibrinogen) A veleszületett afibrinogenemia ritka autoszómális öröklődő betegség, amely recesszíven öröklődik. Körülbelül egymillió élveszületésre esik egy érintett újszülött. A betegséget fibrinogén intravénás pótlásával kezelik, melyet humán vérből vonnak ki. Faktor II. (Prothrombin ) A veleszületett prothrombin deficiencia utosomalis recesszív öröklődést mutató, rendkívül ritka kórkép, eddig kb. 100 esetet írtak le. A prothrombin deficiencia környezeti hatásokra is kialakulhat, például bizonyos gyógyszerek alkalmazása esetén. A betegség kezelésére humán vérből kivont prothrombint használnak. Faktor III. (thrombokináz, thromboplasztin, „szöveti faktor”) A thromboplastin (jelenleg elfogadott elnevezés) a vérplazmában előforduló protein, amely a prothrombin thrombinná alakulásának katalizálásával segíti a véralvadást. A thromboplasztin komplex

HEMATOPOIETIKUS NÖVEKEDÉSI ÉS KOAGULÁCIÓS FAKTOROK enzim, amely megtalálható az agyban, tüdőben, de legnagyobba mennyiségben a vérlemezkékben. Veleszületett hiánya az embrió halálát okozza. Faktor IV. (Calcium) Ahhoz szükséges, hogy a koagulációs faktorok a foszfolipidekhez tudjanak kötődni. Factor V. (proakcelerin, Owren-faktor) Faktor V. deficiencia, (Owren-betegség vagy parahemofília), nagyon ritka véralvadási zavar. A faktor V. májban termelődő protein, részt vesz a prothrombin thrombinná alakításában. Mivel a factor V deficiencia rendszerint enyhe tünetekkel jár, a kezelés abból áll, hogy fogászati beavatkozás vagy műtét előtt a beteg dezmopresszin kezelésben részesül . A dezmopresszin, egy vazopresszin analóg, időlegesen megemeli a faktor V. szintjét. Faktor VII. (szérum protrombin konverzió akcelerátor (SPCA), prokonvertin) A factor VII funkciója a véralvadás iniciációja a factor III-mal karöltve.Deficiency is rare (congenital A faktor VII deficiencia ritkán fordul elő, recesszíven öröklődik. A faktor VII deficienciája hemofília-szerű vérzési rendellenességben nyilvánul meg, amit rekombináns faktor VII adásával kezelnek (NovoSeven vagy AryoSeven). Faktor VIII (antihemofíliás faktor A) A faktor VIII egy glycoprotein procofactor. Szintézisének helye a vaszkuláris, glomeruláris és tubuláris epitélium, valamit a máj szinusz-sejtjei. Az A típusú hemofíliát sikerült máj-transzplantációval gyógyítani. A hepatociták átültetése nem járt eredménnyel, az endotéliális sejtek transzplantációjára van szükség a betegség gyógyításához. A vérkeringésben a faktor VIII a von Willebrand faktorral képzett non-kovalens komplexként van jelen. Miután a thrombin aktiválja, disszociálódik a komplexről, és a faktor IX-cel lép kölcsönhatásba. Az A típusú hemofíliát rekombináns faktor VIII adásával kezelik. Faktor IX (Christmas-faktor, antihemofíliás faktor B, plazmatromboplasztin komponens (PTC)) A faktor IX (Christmas factor) egyike a véralvadási rendszer szerin proteázainak. Hiánya okozza a B típusú hemofíliát. A faktor IX deficienciát rekombináns faktor IX-cel kezelik. Faktor X (Stuart–Prower-faktor) A factor X a májban képződő szerin endopeptidáz, melynek szintéziséhez K vitaminra van szükség. Veleszületett hiánya nagyon ritka, kb. minden 500 000 újszülöttre esik egy érintett. A betegséget humán vérplazmából kivont Faktor X koncentrátummal kezelik. Faktor XI (antihemofíliás faktor C) Sok más koagulációs faktorhoz hasonlóan, a faktor XI szerin proteáz. A májban termelődik, homodimerként található a keringésben inaktív formában.

35

36

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA A faktor XI deficienciája C típusú hemofíliát okoz. A betegség általában nem jár spontán vérzéssel, viszont műtétek előtt profilaktikus faktor XI pótlásra van szükség. Faktor XII (Hageman-faktor) A faktor XII szintén szerin proteáz. Ritkán előforduló deficienciája teljesen aszimptomatikus. Faktor XIII (fibrinstabilizáló faktor,transzglutamináz Laki-Lóránt faktor) A faktorXIII protein stabilizálja az alvadt vért. Hiányában a vér ugyan megalvad, de azután az alvadék felbomlik és a vérzés újra megindul. A köldökzsinór vérzése a faktor XIII hiányának gyakori tünete, az esetek 80%-ában jelentkezik. A betegek 30%-ánál agyvérzés alakul ki, ami a mortalitás leggyakoribb oka a betegségben. A betegséget humán vérplazmából kivont faktor XIII adásával kezelik.

ÚJDONSÁG

A véralvadási folyamatokat szabályozó receptorok kristályszerkezetének azonosítása P2Y receptorok a purinergikus G protein-kapcsolt receptorok családjába tartoznak, amelyek különféle, kritikusan fontos biológia funkciók ellátásában játszanak szerepet. Ilyenek pl a memória, mozgás, alvás, stb. Molekuláris szinten olyan folyamatokat is szabályoznak, mint pl az apoptózis, celluláris proliferáció és citokin szekréció. Egy mostanában publikált közleményben tárták nyílvánosság elé a kutatók a nem-nukleotid reverzibilis antatonistával, az úgynevezett AZD128-cal komplexet alkotó P2Y12 részletes szerkezetét. A receptor szerkezetet kifinomult komputere analitikai rendszerekhez kötött, továbbfejlesztett-röntgen krisztallográfiás technikákkal fejtették meg. A P2Y12 receptor agonista-antagonista funkcióját eddig nem sikerült feltárni, klinikai fontosságához nem férhet kétség. Különösen a vérlemezke aggregáció esetében, mivel a nem kívánatos vérlemezke aktiváció súlyos, potenciálisan az életet veszélyeztető folyamatok kialakulásához vezet, mint pl. stroke vagy szívinfarktus. Ez a kutatás nagy lehetőségeket rejt magában a P2Y12 receptort célzó gyógyszerfejlesztés területén. Ajánlott irodalom Zhang K, Zhang J, Gao ZG, Zhang D, Zhu L, Han GW, Moss SM, Paoletta S, Kiselev E, Lu W, Fenalti G, Zhang W, Müller CE, Yang H, Jiang H, Cherezov V, Katritch V, Jacobson KA, Stevens RC, Wu B, Zhao Q: Structure of the human P2Y12 receptor in complex with an antithrombotic drug. Nature. 2014 May 1;509(7498):115-8.

8. CITOKINEK 8.1. BEVEZETÉS A citokinek (görög cito-, azaz „sejt” és -kinosz, azaz „mozgás”) viszonylag kisméretű (15-20 kDa), a sejtkommunikációban alapvető szerepet játszó glikoprotein jelzőmolekulák, amelyek a az immunválasz szabályozásában töltenek be fontos szerepet. . Az citokineket általában – de nem kizárólagosan - az immunrendszer sejtjei szekretálják, az immunés gyulladásos folyamatok hosszát és intenzitását szabályozzák a célsejtekben. Némely citokinek sejtproliferációt indukálnak, mások növelik a célsejtek patogén-rezisztenciáját, és olyanok is vannak, melyek antivirális vagy tumorellenes aktivitást fejtenek ki. A citokinek abban különböznek a hormonoktól, hogy hatásukat lokálisan fejtik ki. Ennek a lokális hatásnak köszönhetően a citokinek koncentrációja a vérben nagyon kicsi. Ennek következtében terápiára alkalmas mennyiség izolásása szinte reménytelen feladat. A rekombináns DNS technológia fejlődése lehetővé tette a citokin gének azonosítását, klónozását, és rekombináns citokinek termelését terápiás mennyiségekben. A terápiában leggyakrabban alkalmazott citokinek az interleukinek és az interferonok közül kerülnek ki. Eredetileg leukociták közötti jelátviteli molekulákként írták le az interleukineket, innen ered elnevezésük. Azóta kiderült, hogy az interleukinek expressziója nem korlátozódik a leukocitákra, de az elnevezés megmaradt. A citokinek főbb csoportjai az interleukinek és az interferonok.

8.2. INTERLEUKINEK Az immunrendszer működésében nélkülözhetetlen szerepet játszanak a leukociták által termelt interleukinek. Ritkán előforduló deficienciájuk kivétel nélkül autoimmun betegséget vagy immunhiányos állapotot eredményez. Az interleukinok többségét a CD4+ (helper) T-sejtek, a monociták, makrofágok és endotél sejtek termelik. Elősegítik a T- és B limfociták és a hematopoietikus sejtek fejlődését és differenciálódását. Az "interleukin" elnevezést 1979-ben fogadta el a kutatói társadalom. Azelőtt szinte minden kutatócsoportnak megvolt a saját elnevezése az elsőként felfedezett interleukin-1 molekulára (limfocita aktiváló faktor, mitogén protein, T-sejt pótló faktor III, B-sejt aktiváló faktor, B-sejt differenciációs faktor). Az interleukin név kissé elavult, mert időközben kiderült, hogy az interleukinokat a leukocitákon kívül más sejttípusok is termelik. A következőkben a terápiás szempontból legfontosabb interleukinekről ejtünk szót. Az interleukin-1 (IL-1) család Az interleukin 1 család (IL-1 család) 11 citokinből áll, melyek központi szerepet játszanak a fertőzések és steril károsodások elleni immun- és a gyulladásos folyamatok szabályozásában. Az IL-1α és az IL-1β a család legintenzívebben tanulmányozott tagjai, részben azért, mert ezeket fedezték fel elsőként, másrészt ezeknek van a legerősebb gyulladáskeltő hatása. Létezik egy természetes antagonistájuk is, az IL-1Ra (IL-1 receptor antagonista). Mindhárom molekula az IL-1 receptorhoz (IL-1R) kötődik, az IL-1Ra szabályozza az IL-1α és az IL-1β gyulladáskeltő hatását úgy, hogy kompetitíven gátolja kötődésüket a receptorhoz.

38

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA Az IL-1 komoly szerepet játszik az idegrendszer gyulladásos folyamataiban. A gyulladás során megemelkedik a tumor nekrózis faktor (TNF) és az IL-1 szintje az agyban, ez pedig a vér-agy gát károsodásához vezet. Manapság az IL-1 aktivitás gátlása standard terápia autoimmun kórképek és limfómák kezelésében. A gátlás az IL-1Ra adásával valósul meg, amely anakinra néven van kereskedelmi forgalomban. Az anakinra az interleukin-1 receptor antagonista (IL1-Ra) E. coli sejtekben termeltetett rekombináns verziója. Abban különbözik a natív IL-1Ra-tól, hogy nem glikozilált, és amino-terminusán egy extra metionin található. Iterleukin-2 (IL-2) Az IL-2-nek kulcsszerepe van az immuntolerancia kialakulásában, elsősorban a T-sejtekre kifejtett közvetlen hatása következtében. A tímuszban, a T-sejtek érésének helyén, az IL-2 serkenti bizonyos éretlen T-sejtek differenciálódását regulátor T-sejtekké, melyek gátolják azoknak a T-sejteknek a működését, melyek a szervezet saját, egészséges sejtjeit támadnák meg. Az IL-2 a T-sejtek effektor vagy memória T-sejtekké differenciálódását is serkenti abban az esetben, ha a T-sejtet antigén-stimulus éri, ezáltal segíti a szervezet védekezését a kórokozók ellen. Az első gyógyszerként engedélyezett rekombináns interleukin az IL-2 volt. Eredetileg T-sejt növekedési faktorként azonosították, ám később kimutatták, hogy stimulálja a természetes ölősejtek (natural killer cells, NK-sejt) egy szubpopulációját, a limfokin-aktivált ölősejteket (limphokine activated NKcells, LAK). A beteg saját daganatsejtjeinek elpusztítására képes LAK sejtek IL-2 hatására osztódni kezdenek. Kimutatták, hogy a LAK sejtek kontaktusra lépnek a tumorsejtekkel, és lizálják őket. Sajnos az IL-2 pleiotrópiájából eredő mellékhatások sokáig hátráltatták, hogy az IL-2-t gyógyszerként engedélyezzék. Végül sikerült a mellékhatásokat elfogadható szintre csökkenteni, és az IL-2 endedélyezésre került. Sokféle daganatos megbetegedésben kipróbálták, de a legígéretesebb eredmények az áttétes vesetumorok és melanóma esetében mutatkoztak. Interleukin-7 (IL-7) Az IL-7 a csontvelő és a tímusz stróma-sejtjei által szekretált hematopoietikus növekedési faktor mely stimulálja a pluripotens hematopoietikus őssejtek differenciálódását limfoid progenitor sejtekké. Az összes limfoid sejt (B-sejt, T-sejt, NK-sejt) proliferációját is serkenti. Az IL-7 fontos szerepet játszik a B-sejtek és a T-sejtek fejlődésében. Hepatocita növekedési faktorral (Hepatocyte Growth Factor, HGF) alkotott dimer-je stimulálja pre-pro-B-sejtek szaporodását. Az IL-7 terápia klinikai kipróbálás alatt áll HIV-indukálta CD4 limfopénia, HIV-kapcsolt PML, őssejt transzplantációt követő T-sejt limfopénia kezelésére. Interleukin-10 (IL-10) Az interleukin-10 (IL-10) fontos szerepet játszik az immunrendszer szabályozásában. Sokféle sejttípus képes szintetizálni, fő biológiai funkciója a gyulladásos folyamatok korlátozása és leállítása, valamint többféle immunsejt (T- és B-sejt, NK-sejt, antigén-prezentáló sejtek, hízósejtek, granulociták) differenciálódásának és osztódásának szabályozása. Számos vizsgálat (expresszió-analizis betegekben, in vitro és in vivo állatkísérletek) igazolja az IL-10 szerepét a gyulladásos folyamatokban, daganatos megbetegedésekben és autoimmun kórképekben.

CITOKINEK Az IL-10 megnövekedett expressziója megfigyelhető melanómában és különféle limfómákban, és valószínű, hogy serkenti a tumorok növekedését. A szisztémás IL-10 felszabadulás a központi idegrendszer hatékony fegyvere a túl erős gyulladásos folyamatok ellen, amelyet a neuro-endokrin tengely akut stressz általi aktivációja okozna. Ezzel ellentétben, relatív IL-10 deficiencia figyelhető meg bizonyos betegségekben, például a pszoriázisban. A rekombináns humán IL-10 klinikai kipróbálás alatt áll reumatoid artritisz, gyulladásos vastagbélbetegség, pszoriásis, szervátültetéskor jelentkező tünetek és krónikus hepatitisz C kezelésére. Interleukin-11 (IL-11) Az IL-11 multifunkciós citokin, melyet először a csontvelő sztóma-sejtjeiből izoláltak 1990-ben. A hematopoiezis több lépésének kulcsfontosságú regulátora, különösen fontos a megakariociták érésében betöltött szerepe. Terápiás célokra az interleukin-11-et a recombináns DNS technológia alkalmazásával állítják elő. Kereskedelmi forgalomba oprelvekin márkanéven kerül. A készítményt sikerrel alkalmazzák rákos betegek súlyos thrombocitopéniájának kezelésére. Interleukin-12 (IL-12) Az interleukin-12-t (IL-12) a dendritikus sejtek, a makrofágok és a neutrofil granulociták termelik antigén-stimuláció hatására. Az IL-12 serkenti a naiv T sejtek differenciálódását Th1 sejtekké. T sejt-stimuláló faktorként is ismert, mert képes a T-sejtek osztódásának és funkciójának stimulálására. Serkenti a T-sejtek és az NKsejtek interferon-gamma (IFN-γ) és tumor nekrósis faktor-alpha (TNF-α) termelését. Az IL-12 fontos szerepet játszik az NK-sejtek és a T-limfociták aktivitásában. Serkenti az NK-sejtek és a CD8+ T-limfociták citotoxikus aktivitását. Az IL-12 angiogenezis-gátló aktivitással is rendelkezik, gátolja az új véredények kialakulását. Angiogenezis-gátló hatását azáltal fejti ki, hogy növeli az interferon gamma expresszióját, amely növeli az úgynevezett indukálható protein-10 (IP-10) termelődését. Az IP-10-nek van közvetlen antiangiogén hatása. Az IL-12 – angiogenezis-gátló hatásának köszönhetően – klinikai kipróbálás alatt van petefészek karcinóma, metasztatikus melanóma, kután T-sejt és Non-Hodgkin limfóma, más karcinómák és HIV indukálta CD4+ limfopénia kezelésére. Interleukin-15 (IL-15) +

Az IL-15 szerkezeti hasonlóságot mutat az IL-2-vel. Növeli a CD8 T-limfociták citotoxikus aktivitását, ezért klinikai kipróbálás alatt áll metasztázisos melanóma és vese karcinóma kezelésére. Interleukin-21 (IL-21) Az interleukin-21 an immun-rendszer sejtjeinek potens szabályozója. Célsejtjei az NK-sejtek és a citotoxikus T-limfociták, melyek osztódását serkenti. +

Az IL-21-et aktivált CD4 T-limfociták termelik. Klinikai kipróbálás alatt áll metasztázisos melanóma és vese karcinóma kezelésére.

39

40

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA

8.3. INTERFERONOK Az interferonok (IFN) jelátviteli fehérje-molekulák, melyeket patogének (vírusok, baktériumok, paraziták, tumor sejtek) hatására választanak ki a megtámadott sejtek. Tipikus esetben a vírus által megfertőzött sejt interferonokat bocsát ki, melyek hatására a környező sejtek növelik anti-virális védekező képességüket. Később kimutatták, hogy az inerferonok különböző célsejteken különböző hatást váltanak ki, azaz pleiotróp hatással rendelkeznek. Szubtípustól függően az interferonok sokféle betegség kezelésében szerepet játszanak, például daganatos megbetegedések, hepatitisz és szklerózis multiplex Receptoraik típusa alapján an interferonokat 3 csoportba soroljuk. I. típusú interferon Általában az I. típusú interferont vírusfertőzött fibroblasztok és monociták szekretálják. A szekréciót az IL-10 gátolja. Az I. típusú interferonok olyan molekulák termelésére serkentika sejteket, amelyek gátolják a virusok DNS-ének replikációját és transzkripcióját RNS molekulákká. II. típusú interferon A II. típusú interferon (immun interferon, IFNγ) termelődését az interleukin-12 aktiválja. Th1 (1. típusú T-helper sejtek) termelik, és blokkolja a Th2 sejtek proliferációját. Ez a Th2 sejtek gátlásához és a Th1 sejtes immunválasz további indukciójához vezet. A folyamat eredménye súlyos betegség, például szklerózis multiplex. III. típusú interferon A III. típusú interferonokat nemrég fedeztékfel, de az már világos, hogy fontos szerepük van bizonyos vírusfertőzések leküzdésében. Általánosan azt mondhatjuk, hogy az I. és II. típusú interferonok felelősek an immunválasz aktiválásáért és szabályozásáért. Az I. és III. típusú interferonok szinte bármely sejttípusban indukálhatók, ha a citoplazmikus és endoszómális receptorok felismerik a sejtbe jutott vírus nukleinsavait. A II. típusú interferon termelését citokinek, elsősorban IL-12 indukálja, és elsődlegesen immunsejtek termelik, például a T-sejtek és az NK-sejtek. Interferon-alfa (IFNα) Az IFNα az I. típusú I interferonok csoportjába tartozik. Pleiotróp hatással rendelkezik, úgymint antivirális, anti-proliferatív és immunmodulációs aktivitás. Gátolja a sejtosztódást serkentő citokinek hatását, indukálja az apoptózist és gátolja a sejtosztódást. Az IFNα jól ismert anti-tumor ágens, többféle rák kezelésében alkalmazzák. Emberben az IFNα géncsalád több mint 20 génből és pszeudogénből áll, melyek 15 féle IFNα fehérjét expresszálnak. A Multiferon nevű készítmény természetes IFNα-t tartalmaz, melyet Sendai vírussal kezelt humán leukociták állítanak elő. A Multiferon többféle, természetesen előforduló, IFNα szubtípust tartalmaz, melyet affinitás kromatográfiával tisztítanak a vérből. Engedélyezett gyógyszer, melyet szőrös-sejtes leukémia (hairy cell leukaemia), Kaposi szarkóma, hepatitis B/C, follikuláris limfóma és malignus melanoma kezelésére használnak.

CITOKINEK Interferon-béta (IFNβ) Az Interferon béta 1a-t a szklerózis multiplex kezelésében alkalmazzák. Rekombináns emlős vagy rekombináns Escherichia coli sejtekben állítják elő. A szklerózis multiplex relapszusok gyakoriságát 20-40%-kal csökkenti. Kereskedelmi forgalomban többféle formulációja kapható. Interferon-gamma (IFNγ) Az interferon-gamma, a II. típusú interferonok csoportjának egyetlen tagja elengedhetetlen mind a veleszületett, mind az adaptív immunrendszer működése szempontjából. A makrofágok fontos aktivátora, indukálja az MHC I. expressziót. Az aberráns IFNγ expresszió együtt jár egy sor autoinflammációs és autoimmun betegséggel. Az IFNγ fontossága az immunrendszerben részben abból fakad, hogy képes közvetlenül gátolni a vírusok replikációját, de legfontosabbak az immunstimuláló és immunmoduláló hatásai. Az IFNγ-t elsősorban az NK-sejtek termelik a természetes immunválasz részeként, és CD4+ Th1 and CD8+ citotoxikus Tlimfociták az immunválasz antigén-specifikus szakaszában. Az interferon-γ 1b engedélyezett gyógyszer a krónikus granulomatózis és az oszteopetrózis kezelésében.

41

9. HORMONOK 9.1. BEVEZETÉS Hormonoknak nevezzük azokat a – belső elválasztású mirigyekben termelődő – jelátviteli molekulákat, melyek a keringési rendszerbe kiválasztva, távoli sejtekre hatva befolyásolják a szervezet fiziológiáját és viselkedését (endokrin jelátvitel). A hormonok kémiailag sokfélék lehetnek, például eikozanoidok, szteroidok, aminosav származékok, peptidek és proteinek. A hormonokat termelő mirigyek alkotják az endokrin rendszert. A „hormon” fogalmába olykor beleértik azokat a molekulákat is, amelyek az őket termelő sejtre (autokrin jelátvitel) vagy a termelő sejttel szomszédos sejtekre hatnak (parakrin jelátvitel). Ebben a fejezetben a szigorúan vett, azaz endokrin hormonokkal foglalkozunk. A hormonok a fogadó sejt specifikus receptoraihoz kötődve fejtik ki hatásukat. A hormon-receptorok lehetnek sejtfelszíni molekulák, például a növekedési hormon receptora, vagy sejten belüliek, például a szteroid hormonok receptorai. A hormonokat biotechnológiai szempontból feloszthatjuk peptid és nem-peptid hormonokra. Ezt az önkényesnek tűnő felosztást azért vezetjük be, mert a biotechnológia tárgykörébe a peptid hormonok, valamint ezek rekombináns formáinak előállítása és tanulmányozása tartozik.

9.2. PEPTID HORMONOK Mielőtt rekombináns formáik forgalomba kerültek, a peptid hormonokat különféle állati és emberi forrásból izolálták. Az első gyógyszerként használt hormont, az inzulint például sertések és szarvasmarhák hasnyálmirigyéből vonták ki. A szarvasmarha inzulin két, a sertés inzulin egy aminosavban különbözik a humántól. Hatékonyságukkal nem volt probléma, viszont előállításuk során egyéb állati fehérjék kerülhettek a preparátumba kimutathatatlan mennyiségben, így huzamos használatuk immunreakciókat válthatott ki. A törpenövés kezelésére használt növekedési hormon állati eredetű preparátumai hatástalanok emberben, ezért ezt a hormont sokáig holttestek agyalapi mirigyéből vonták ki. Sajnos olykor szennyeződésként a halálos Creutzfeldt-Jakob betegséget okozó prion proteinek kerültek a készítménybe. Nem a növekedési hormon volt az egyetlen humán forrásból előállított hormonkészítmény, a choriogonadotróp hormont (hCG) placentából, a luteinizáló hormont (LH) és a folliculus-stimuláló hormont (FSH) vizeletből vonták ki. Míg a rövid peptidek, például a 14 aminosavból felépülő szomatosztatin kémiai szintézise eredményes volt, a hosszú fehérjeláncok, például a 191 aminosavból álló növekedési hormon szintézise alacsony kitermeléssel zajlott, az aktív hormon mellett sokféle rokon szerkezetű hatástalan fehérje keletkezett. Napjainkban a kb. 30-40 aminosavnál hosszabb polipeptid hormonokat rekombináns géntechnológiával állítják elő.

9.3. A REKOMBINÁNS HORMONOK TERÁPIÁS ALKALMAZÁSA A rekombináns technológia fejlődésével megszűntek a fehérjék mennyiségi előállításával kapcsolatos problémák. Egy hormon génjének azonosítása és klónozása után néhány napra van szükség, hogy a hormon korlátlan mennyiségben rendelkezésre álljon. Egyre több rekombináns hormon kapja meg a zöld utat a terápiás felhasználáshoz. A következőkben néhány esettanulmányon keresztül világítjuk meg azt a forradalmi átalakulást, melyet a rekombináns peptidhormonok előállítása idézett elő súlyos betegségek kezelésében

44

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA Humán növekedési hormon (human growth hormon, hGH) A rekombináns növekedési hormont 1985-ben sikerült előállítani E. coli sejtek alkalmazásával. Az így termeltetett protein N-terminális végén metionin volt, de ez nem befolyásolta a hormon funkcióját. Később sikerült megoldani az extra metionin eltávolítását. Miután a növekedési hormon korlátlan mennyiségben elérhetővé vált, eredeti alkalmazási területétől eltérő kórképek kezelésében is használni kezdték. Ezek a kórképek a Prader-Willi szindrómában jelentkező visszamaradott növekedés, méhen belüli visszamaradott növekedés, krónikus veseelégtelenség és Turner szindróma. Korlátlan hozzáférhetősége a növekedési hormon fiziológiai szerepének és in vivo hatásmechanizmusának kutatásában is előrelépést hozott. A minden eddiginél érzékenyebb bioassay-k segítségével kimutatták, hogy a növekedési hormon szintézise és szekréciója nem szűnik meg a növekedés befejeztével. Ez a tény segített elfogadtatni a klinikusokkal, hogy van alapja a hipofizektómián átesett betegek panaszainak, akik az egyéb hormonok tökéletes pótlása esetén is csökkent életminőségről számoltak be. Napjainkban már bevett gyakorlat a növekedési hormon pótlása felnőtt hipofízishiányos betegekben, akik a pótlás megkezdését követően életminőségük drámai javulásáról számolnak be. Klinikai felmérések azt is kimutatták, hogy felnőtt hipofízis-hiányos betegek növekedési hormon pótlása növeli az izom/zsír arányt és csökkenti a kardiovaszkuláris megbetegedések előfordulási valószínűségét. Humán inzulin A rekombináns humán inzulin előállítása teljesen kiszorította a korábban használt, állati eredetű inzulinokat. Az inzulin viszonylag egyszerű fehérje-molekula, két peptid láncból épül fel az egyik 21, a másik 30 aminosavból áll. A két láncot diszulfid hidak kapcsolják össze. Mivel az inzulin molekula nem tartalmaz szénhidrát oldalláncokat, szintézise rekombináns baktériumsejtekben is megoldható.

10. ENZIMEK 10.1. BEVEZETÉS Az enzimek a biológiai rendszerekben végbemenő kémiai folyamatok katalizátorai. Aktivitásuk szabályozható, ezért a katalizált folyamatok mindig a szervezet adott állapotának, funkciójának megfelelő sebességgel mennek végbe. Az enzimek szubsztrát-specificitása és a szubsztrát termékké alakításának hatékonysága figyelemre méltó. Intracelluláris és extracelluláris enzimek egyaránt léteznek. A legtöbb esetben az integrált enzimműködés szabályozásának kulcsa az enzimek eloszlása a szövetekben, sejtekben és sejtorganellumokban. Vannak olyan enzimek, amelyek csak akkor jutnak az extracelluláris térbe és a véráramba, ha a májsejtek károsodnak. Ezek vérből való kimutatása fontos diagnosztikai eszköz. Ilyen enzim például az alanin aminotranszferáz (ALT) és az aszpartát aminotranszferáz (ASP). Az enzimek túlnyomó többsége fehérje-molekula vagy molekula-komplex. Vannak azonban enzimaktivitással rendelkező RNS molekulák is, például bizonyos riboszómális RNS molekulák és az ön-splicingra képes RNS-ek. Minden enzimféleség egy bizonyos kémiai reakció aktiválási energiáját csökkenti olyan mértékben, hogy a katalizált reakció sebességét akár milliószorosára növeli. Az enzimek által katalizált reakciók maguktól is végbemennek, de olyan lassan, hogy képtelenek lennének a sejt életét és funkcióit fenntartani. Több ezer enzim-katalizált reakciót írtak le eddig, az emlőssejtek által expresszált több mint 10 000 fehérjeféleség többségének van enzimaktivitása. Több mint 4000 enzim hiánya vagy rendelenes működése köthető ismert kórképekhez. Az enzimek működésének és a sejtben betöltött szerepének megismerése lehetővé teszi alkalmazásukat súlyos betegségek kezelésében, különösen azokéban, melyek kezelésére nem állnak rendelkezésre kismolekulájú hatóanyagok.

10.2. ENZIMPÓTLÁS TERÁPIA Az anyagcsere utak enzimeinek hiányos vagy rendellenes aktivitása klinikai tüneteket eredményezhet a szubsztrát vagy a termék hiánya vagy felszaporodása következtében. Többféle enzim preparátum van forgalomban, melyek képesek enyhíteni vagy megszüntetni ezeket a tüneteket. A krónikus enzimpótlás hatékonysága függ az enzimpreparátum forrásától (humán vagy állati szövet). Egy bizonyos humán enzimfehérje állati ortológja immunreakciót válthat ki a betegben, ezért ismételt alkalmazása során a preparátum hatékonysága csökkenhet. Több eljárás ismert, mellyel az ortológ enzimpreparátum immunogenicitása csökkenthető, például rekombináns humán enzim használata, vagy az állati ortológ fehérje felszínének módosítása polietilén glikol-lal. A legtöbb metabolikus enzim, melyek pótlására általában szükség van, lizoszómákban helyezkedik el. Az ilyen enzimek felületén mannóz csoportok vannak, melyek szükségesek az enzim lizoszómákba irányuló transzportjára a mannóz-6-foszfát (Man6P) receptor segítségével. Az enzim-fehérje biológiai aktivitásának vagy stabilitásának növelése céljából szükség lehet az enzimmolekula génjének módosítására, melyet irányított (célzott) in vitro mutagenezis segítségével érhetünk el. Ha a protein génjének klónja már rendelkezésre áll, tetszőlegesen lehet mutációkat, (deléciót, inszerciót, szubsztitúciót) végezni rajta. A mesterségesen irányított mutagenezis lépései a következôk: (1) Egyszálú, rövid DNS-darabot (oligonukleotid) szintetizálnak, mely tartalmazza a kívánt mutációt, egyébként teljesen komplementer a fehérjét kódoló génszakasszal. (2) A primerként szolgáló oligonukleotidot hibridizáltatják a klónozott egyszálú DNS-sel. (3) Az így létrejött heteroduplexet gazdasejtbe (pl. Escherichia coli) transzformálják, ahol az replikálódik.

46

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA Az enzimek génjeiben leggyakrabban véghezvitt módosítások a következők: ▪ ▪ ▪ ▪

diszulfid hidak létrehozása szerin ciszteinre cserélésével (szerkezeti stabilitás növelése), aszparagin és glutamin lecserélése pl. treoninra vagy izoleucinra (hőstabilitás növelése), az enzim felszínén lévő cisztein pl. szerinre cserélése (intermolekuláris diszulfidhidak létrejöttének gátlása) proteáz hasító helyek megszüntetése

A rekombináns enzimek tisztítása során nagy gondot kell fordítani az enzim stabilitásának megőrzésére. A legkíméletesebb, ezért leggyakrabban használt módszerek az affinitás kromatográfia és az ioncserés kromatográfia. Az alábbiakban néhány kiemelkedően fontos, biotechnológiai úton előállított enzim-preparátumról ejtünk szót. Adenozin deamináz (ADA) Az adenozin deamináz-t a súlyos kombinált immunhiányos állapot (angolul Severe Combined Immunodeficiency, SCID) kezelésére használják. A SCID-et az adenozin deamináz (ADA) hiánya okozza. Az ADA hiánya a B- és a T-sejtek hiányát idézi elő a humán immunrendszerben. A funkcionális ADA 8 azonos fehérje alegységből épül fel. A SCID prevalenciája alacsony ugyan, viszont az érintett újszülöttek nagyon súlyos immundeficienciában szenvednek a B- és T-sejtek hiánya miatt, melyet az ADA enzim hiánya okoz. A SCID betegekben az ADA gén számos pontmutációját és delécióját azonosították. Az adenozin deamináz katalizálja a purin nukleozid anyagcsere fontos reakcióit, az adenozin és a 2-dezoxiadenozin átalakulását inozinná és 2-dezoxiinozinná. Adenozinra és dezoxiadenozinra szükség van a DNS és RNS szintézis folyamán, azonban túlzott mennyiségben toxikusak, ezért a sejt eliminálja őket. Ha az elimináció nem megy végbe az ADA hiánya miatt, a B- és T-sejtek elpusztulnak, így a beteg még enyhe fertőzéseket sem tud leküzdeni. Az ADA deficiencia kezelésére elsőként alkalmazott módszer az enzim pótlása volt. Az alkalmazott szarvasmarha eredetű - enzim azonban gyorsan lebomlott a szervezetben, azonkívül a beteg immunrendszere ellenagyagot termelt ellene. A szarvasmarha eredetű enzimpreparátum antigenicitását nagyban sikerült csökkenteni PEG kezeléssel. Sikertelen csontvelő-transzplantáció esetén a preparátumot ma is alkalmazzák. A SCID kezelésének legelterjedtebb módszere a csontvelő-transzplantáció, amely általában sikerre vezet, ha a donor testvér vagy valamelyik szülő. A legnagyobb esély a sikeres terápiára akkor van, ha a csuntvelő-transzplantáció a beteg három hónapos kora előtt történik. Ígéretes próbálkozások folynak az in utero transzplantációval és a köldökzsinór-vér őssejtjeinek felhasználásával is. Az in utero csontvelő-transzplantáció lehetővé teszi, hogy a magzat funkcionális immunrendszere kifejlődjön a méhen belüli steril viszonyok között, azonban a lehetséges komplikációk így nehezebben detektálhatók és kezelhetők. Napjainkban a SCID génterápiával történő gyógyításával is kísérleteznek. Az első sikerek 2000-ben jelentkeztek, amikor sikerült SCID-betegek immun funkcióit helyreállítani génterápiával. Sajnos a betegek egy része az ADA aktivitás sikeres helyreállítását követően leukémiában betegedett meg, ezért a klinikai kísérletet leállították. A leukémia azért alakult ki ezeknél a betegeknél, mert az ADA gént hordozó retrovírus onkogének közelében épültek be a genomba, aktiválva azokat. Azóta próbálkozások folynak a vírusvektor onkogenicitásának csökkentésére. Glükocerebrozidáz (Glükuronidáz) A glükocerebrozidáz enzim, nevezetesen a β-glükocerebrozidáz veleszületett hiánya okozza a Gaucher-kór nevű ritka betegséget. A β-glükocerebrozidáz neve a modern terminológiában β-

ENZIMEK glükuronidáz, a továbbiakban ezen a néven hivatkozunk rá. A β-glükuronidáz katalizálja a glükocerebrozid bomlását glükózra és cerebrozidra. A kezelés nélkül halálos megbetegedés tüneteit a makrofág-monocita rendszer sejtjein belüli glükocerebrozid lerakódás okozza. Mivel a β-glükuronidáz az intracelluláris lizoszómákban lokalizálódik, és mert a kívülről bejuttatott enzim, habár kis mértékben, de bejut a vérsejtek lizoszómáiba, az enzimpótlás terápia logikus megoldásnak tűnik. A Gaucherkór kezelésére először humán placentából kivont β-glükuronidáz-t (Ceredase, alglucerase) alkalmaztak, majd később ezt a preparátumot felváltotta a rekombináns humán β-glükuronidáz (Cerezyme, imiglucerase). A teljesen glükozilált enzimmolekula nem képes a lizoszómákban akkumulálódni, ezért a terápiában használt enzimpreparátumot úgy módosították, hogy a szénhidrát oldallánc terminális pozíciójában a natív enzimre jellemző sziálsav helyett mannóz legyen. Ez a módosítás segít a leukociták mannóz receptorban gazdag lizoszómáiba irányítani az enzimmolekulát. Az enzimpótlás terápia hatékonyan mérsékli a Gaucher-kóros betegek hematológiai és hepatikus tüneteit, azonban kevésbé hatékony a tüdőt és a csontokat érintő tünetek enyhítésében. Sajnos, mint a legtöbb krónikusan pótolt enzim, a β-glükuronidáz is immunválaszt vált ki a betegekben, mely súlyos tünetekhez, ritkán halálhoz is vezethet. Alfa-glükozidáz Az α-glükozidáz veleszületett hiánya eredményezi a Pompe-kórt. A betegség természetes lefolyása alapján korai, infantilis és késői, gyermekkori-juvenilis-felnőtt kezdetű kórformákat különítenek el. Az infantilis kórképekben a korai légzészavar, cardiomyopathia, mozgásfejlődés elmaradása a vezető tünet, míg a késői kezdetű betegségben a cardiomyopathia hiányzik. Sajnos a Pompe- csecsemők többnyire nem érik meg a második életévüket, halálukat légzési- és szívelégtelenség okozza. Az α-glükozidáz felelős a lizoszómákban tárolt glikogén glükóz alegységekre bontásáért a sejt igényei szerint. Az enzim hiánya miatt kialakuló glikogén akkumuláció sejt- és szövetpusztuláshoz vezet. A Pompe-kóros csecsemők életét enzimpótlásos kezeléssel már sikerült némileg meghosszabbítani. A terápiában alkalmazott enzimpreparátumot (Alglucosidase alfa, Myozyme) a Genzyme nevű biotechnológiai cég fejlesztette ki és állítja elő. Alfa-galaktozidáz Az α-galaktozidáz enzim funkciója a glikoszfingolipidek lebontása. Hiányában a glikoszfingolipidek, különösen a globotriaozil-ceramid, felszaporodik a lizoszómákban, az úgynevezett a Fabry-kórt okozva. Minthogy e ritka rendellenesség hibás génje az X-kromoszómán található, a teljesen kifejlődött betegség csak férfiakban fordul elő. A Fabry-kór legsúlyosabb tünetei a vese-elégtelenség, kardiomiopátia és a cerbrovaszkuláris kórképek. A tünetek csecsemőkorban kezdődnek, és a beteg egész élete során fennállnak. Az α-galaktozidáz enzim-pótlás terápiájában az enzim egy rekombináns formáját alkalmazzák, amely a kere skedelmi forgalomban Fabrazyme néven kapható. Urát oxidáz (húgysav hidroxiláz) Az urát oxidáz fontos enzim a purin bázisok lebontásában, az urát átalakulását katalizálja 5hidroxiizourát-tá. A purin bázisok forrása a szervezetben: sejtek normál pusztulása, táplálékkal felvett nukleinsavak, valamint a nagyarányú sejtpusztulással járó trauma (pl. égési sérülések, mechanikai sérülések, kemoterápia). Az urát-oxidáz hiányában urát halmozódik fel a sejtekben, majd az a véráramon keresztül a vesébe, vizeletbe kerül. A krónikus hiperurikémia köszvényesedéshez vezethet, akut esetben (főleg kemoterápiát követően) súlyos vesekárosodás következhet be.

47

48

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA Az urát-oxidáz hiányt rekombináns enzim bevitelével kezelik. A terápiában általában az Aspergillus flavus urát oxidázát alkalmazzák. Előállítása Saccharomyces cerevisiae heterológ expressziós rendszerrel történik. Az A. flavus használata a gyártás során (homológ expresszió) nem előnyös a gomba toxintermelése miatt. Dezoxyribonukleáz I. (DNNáz I.) A DNáz I. a citoplazmában jelen levő, 31 kDa relatív molekulatömegű enzim. A citoplazmából az extracelluláris térbe kiválasztódva funkciója az egyszálú és a dupla szálú DNS lebontása. A rekombináns humán DNáz I.-et a cisztás fibrózis kezelésében alkalmazzák. A cisztás fibrózisra jellemző, hogy a légutakban felhalmozódó nyákban megtelepedő patogénekből és széteső neutrofil granulocitákból fehérje és DNS kerül a nyákba, ami tovább növeli annak viszkozitását. Inhalálással bejuttatott DNáz I. csökkenti a nyák DNS tartalmát és ezzel a viszkozitását. A humán DNáz I-et heterológ expresszióval állítják elő, CHO sejtkultúrában, dihidrofolát reduktázos bicisztronos integratív vektort használva. Az enzim a saját szekvenciájának köszönhetően az sejten kívüli térbe szekretálódik, ami jelentősen megkönnyíti az izolálást és a tisztítást.

11. VAKCINÁK 11.1. TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS Az ENSZ Egészségügy szervezete (WHO) szerint a huszadik században a vakcinák alkalmazása volt a legfontosabb faktor az emberek egészségi állapotának javulásában és a várható élettartam növekedésében. Az 1940-es évek végén bevezetett új szövettenyésztési módszerek nagyban megnövelték a vakcinák alkalmazhatóságát és hatékonyságát. Epidemiológiai adatok világosan mutatják, hogy szoros korreláció van a vakcinák tömeges elterjedése és az olyan rettegett betegségek előfordulási gyakorisága között, mint a poliomyelitis, diftéria, kanyaró és a szamárköhögés. Az 1970-es években sikerült a fekete himlő vírusát eltörölni a föld színéről, annak a vakcinának az alkalmazásával, melyet Edward Jenner fejlesztett ki az 1700-as évek végén. Jenner a nagy himlőjárványok idején megfigyelte, hogy a tehénhimlő által megfertőződött fejőnők egyáltalán nem, vagy csak kis mértékben betegednek meg. Jenner ezt követően úgy döntött, hogy embereken folytatott kísérletekkel bebizonyítja be, hogy a tehénhimlő fertőzésen átesett emberek védettek a fekete himlővel szemben. Először az egyik fejőnő testén keletkezett tehénhimlő hólyag váladékával fertőzött meg egy nyolc éves fiút, majd egy idő után emberi himlővel is megfertőzte. A gyermek egészséges maradt, Jenner teóriája tehát igaznak bizonyult. Sok modern vakcina elődjét a 19. és 20. században fejlesztették ki úttörő immunológusok. A legjelentősebbek Louis Pasteur, aki az első vakcinákat fejlesztette ki a veszettség, a lépfene és a kolera ellen; Albert Sabin, az orálisan alkalmazható poliomyelitis vakcina kifejlesztője; Albert Calmette és Camille Guérin, akik nevéhez fűződik az 1920-as években kifejlesztett, a mai napig használatos TBC elleni vakcina. Napjainkban a modern biotechnológia alkalmazása lehetővé tette új vakcinák kifejlesztését olyan patogének ellen is (pl. a hepatitisz B vírus és a Neisseria meningitidis baktérium), melyek ellenálltak a hagyományos módszerek alkalmazásának.

11.2. A VAKCINÁK MŰKÖDÉSÉNEK IMMUNOLÓGIAI ALAPJAI Új, hatékony vakcinák létrehozásának elengedhetetlen feltétele az immunrendszer működésének beható ismerete. Az immunológia tudományának gazdagságából itt csak a legszükségesebb ismeretek vázlatos közlésére szorítkozhatunk. A patogének szervezetbe jutása után közvetlenül aktiválódik az úgynevezett természetes vagy veleszületett immunrendszer. A szervezetbe jutó kórokozókat a természetes immunrendszer elemei olyan receptorok segítségével ismerik fel, amelyek a kórokozók felszínén, illetve azok külső burkában megjelenő molekuláris mintázatokat ismerik fel. A felismert struktúrák - többnyire szakaszosan ismétlődő cukor illetve zsírsav oldalláncok - a baktériumok, vírusok illetve gombák létfontosságú elemei, ezért szinte egyáltalán nem változnak az idők során (ilyen például a Gram-negatív baktériumok falát alkotó lipopoliszacharid). Ez az oka annak, hogy a megtámadott szervezetek receptorai is változatlan formában öröklődnek egyik generációról a másikra az evolúció során. A természetes immunrendszer alkotóelemei közé egyrészt sejtes elemek tartoznak; köztük az idegen anyagok felismerésére, bekebelezésére majd lebontására képes fagociták (makrofágok, dendritikus sejtek, továbbá a granulociták), valamint a kórokozók felismerését követően pusztító anyagokat kibocsátó ún. természetes ölősejtek (natural killer, NK-sejtek). A sejtek mellett fontos szerepük van a test-

50

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA nedvekben jelen lévő antimikrobiális peptideknek és a behatolók hatására aktiválódó enzim-kaszkád rendszereknek, amelyek a káros vírusok és baktériumok oldását idézhetik elő. A természetes immunitás önmagában nem elegendő egy súlyos patogén-invázió elhárítására. Fő funkciója, hogy addig „húzza az időt”, amíg a lassabban kialakuló adaptív immunválasz képes lesz összehangolt, hatékony, specifikus támadást intézni a betolakodók ellen. A természetes immunrendszer nem képes „emlékezni”, reakciója ugyanarra a patogénre nem lesz erősebb az ismételt fertőzések során, tehát nem alkalmas arra, hogy vakcináció célpontja legyen. Az adaptív immunrendszer, ezzel ellentétben, erősen specifikus választ ad egy adott patogénre. Ez nem veleszületett specifitás, hanem minden egyes patogén ellen kialakul a szervezetben. Az adaptív immunrendszer „emlékszik” a patogénekre, ugyanazon patogén ismételt támadásaira egyre erősebb választ ad. Ez a tulajdonsága teszi lehetővé a vakcináció működését. Az immunrendszert a patogének felszínén található molekuláris mintázatok aktiválják. Az adaptív immunválasz esetében a patogénre jellemző molekuláris szekvenciákat prezentálni kell az immunsejtek számára, a fő hisztokompatibilitási komplex II. (major histocompatibility complex II, MHC II) molekulákkal együtt. Az antigén-prezentációt professzionális antigén-prezentáló sejtek (antigen-presenting cells, APC) végzik. Az antigén-prezentáló sejtek többnyire dendritikus sejtek és makrofágok, melyek fagocitálják az extracelluláris patogéneket, és proteinjeiket kisebb darabokra vágva prezentálják felszínükön. Ha a patogén intracelluláris – többnyire vírus – akkor proteinjeinek kisebb szakaszait az antigén-prezentáló sejtek MHC I. molekulákhoz kötve prezentálják felszínükön. A tumorsejtek megváltozott intracelluláris fehérjéi ugyancsak MHC I. molekulékhoz kötve prezentálódnak a sejtfelszínen, így aktiválva az immunrendszert. Az MHC I. másik fontos funkciója, hogy az őket expresszáló sejteket an immunrendszer sejtjei sajátként ismerik fel. Az immunrendszer által felismert molekula-szekvenciákat antigéneknek nevezzük. Eredetileg az antigéneket olyan molekulákként vagy patogén-részekként definiálták, melyek képesek az immunrendszer stimulálására (antitest-termelés). A modern definíció szerint minden olyan agyag antigén, melyet az adaptív immunrendszer képes felismerni. Fontos az epitóp-ok fogalma, mely egy nagyobb antigénmolekulának az antigenicitásért felelős részeit jelöli. Egyetlen antigén több epitópot tartalmazhat, melynek antigenicitásáért nemcsak aminosav-sorrendje felelős, hanem másodlagos és harmadlagos szerkezete is. Némely antigének/epitópok erősebb immunválaszt váltanak ki, mint mások, ez fontos szempont a vakcina készítésben. Az adaptív immunválaszban részt vesznek mind az antigén-prezentáló sejtek, mind a T- és Blimfociták. Attól függően, hogy a patogén extra- vagy intracelluláris, az immunsejtek különböző kombinációja vesz részt az immunválaszban. Az extracelluláris patogének leginkább humorális immunválaszt váltanak ki, az intracelluláris patogéneket pedig a sejtes immunválasz eliminálja. Az effektív immunválasz feltételezi a humorális és sejtes folyamatok együttműködését. A 11.2.1. táblázat áttekintést ad a kétféle immunválaszról. Az immunválasz beható tanulmányozása során kiderült, hogy bizonyos antigén-féleségek képesek aktiválni a B-sejteket a T-helper sejtek által kiválasztott citokinek hatása nélkül is. Ezeket az antigéneket T-sejt független (T-independent, TI) antigéneknek nevezzük. Jellemzőek rájuk a sokszorosan tandem ismétlődő szénhidrát szekvenciák ból álló epitópok. Tipikusan T-sejt független antigének a baktériumok sejtfalának poliszacharidjai. A T-sejt függő (T-dependent, TD) antigének jellemzően fehérjék. Az ellenük irányuló immunválasz során szükség van a T-helper sejtek által küldött ko-stimulációs szignálokra ahhoz, hogy a B-sejtek aktiválódjanak. A T-helper sejtek által kibocsátott citokinek mintázata alapján kétféle immunválaszt különböztetünk meg: A Th1 és a Th2 típusút. A Th1 típusú válasz főként a celluláris immunválaszt aktiválja, míg a Th2 típusú a humorálist (lsd. 11.2.1. táblázat).

VAKCINÁK 11.2.1. táblázat: Az imunválasz különböző típusainak áttekintése.

Extracelluláris patogének

Intracelluláris patogének

Patogén típusa

baktériumok, gombák, egysejtűek, paraziták

vírusok, baktériumok, egysejtűek

Antigén prezentáció

MHC II

MHC I

Immunválasz

főként humorális

főként sejtes

Th citokin mintázat

Th2

Th1

Az imunválasz fő effektor sejtjei

B-sejtek, plazmasejtek

citotoxikus T-sejtek, makrofágok

Effektor molekulák

antitestek, komplement

effektor sejtek áltak szekretált citolitikus és citotoxikus proteinek

A vakcinálás célja T-sejt függő immunválasz kiváltása, mivel ez esetben a termelt antitestek titere magasabb; az effektor mechanizmusok hatékonyabbak; az immunológiai memória tovább tart; hatékony sejt-mediált immunválasz indukálódik. Az antigén-felismerés és –prezentáció mechanizmusának megfejtése nagyon fontosnak bizonyult a vakcina-tervezés szempontjából. Elvezetett annak felismeréséhez, hogy az inokulációhoz nem szükséges a teljes vírus vagy baktérium, a hatékony vakcináláshoz bizonyos molekulák is elegendőek, melyek biotechnológiai módosítása növelheti a vakcinálás hatékonyságát. A patogén-elimináció különféle módozatainak felfedezése ugyancsak segítette a vakcina-tervezést. A patogének eliminációja kétféle módon történhet: antitest-független és antitest-függő mechanizmusokon keresztül. Mivel az antitest-függő immunválasz effektívebb a patogén-invázió leküzdésében, előnyös olyan vakcinák használata, melyek erős antitest-termelést indukálnak. Az antitest-termelés a humorális immunválasz tipikus megjelenési formája, mely során az aktivált és differenciálódott Bsejtek antitesteket szekretálnak. A primér immunválasz során, amikor az immunrendszer először találkozik egy patogénnel, alacsony affinitású IgM antitesteket termelnek rövid életű plazma sejtek. Később, ahogy az immunválasz előre halad, a B-sejt klónok tovább differenciálódnak a perifériás immunszervekben újonnan formálódott tüszőkben. A tüszőkben a B-sejtek affinitás-érésen és izotípus-cserén mennek keresztül. Ezeket a folyamatokat a T-helper sejtek által kiválasztott citokinek segítik. Az érés eredményeképpen nagy affinitású, antitestek termelődnek, melyek IgM-en kívül bármely izotípusba tartozhatnak (IgG, IgA,IgE). A tüszőkben érő B-sejtek legtöbbje plazmasejtekké differenciálódik, melyek hatalmas mennyiségű antitestet szekretálnak, és némelyikük igen hosszú életű memóriasejtként perzisztálhat a fertőzés leküzdése után. A patogén eliminációban leghatékonyabb antitest izotípus az IgG, ezért a vakcinálás célja erős IgGtermelés kiváltása. A patogén sikeres eliminációját követően antigén-specifikus, hosszú életű memória B- és T-sejtek perzisztálnak a szervezetben. Az immunológiai memóriának köszönhetően, amikor a szervezet a későbbiekben újra találkozik ugyanazzal a patogénnel, másodlagos vagy más néven memória típusú immunválasz indukálódik. Ezt a memóriasejtek gyors szaporodása, nagy affinitású antitestek azonnali termelése és effektív sejtes immunválasz jellemzi. A másodlagos immunválasz ideális esetben megelőzi a betegség kialakulását, vagy legalábbis a betegség sokkal enyhébb tünetekkel jár.

51

52

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA Az immunológiai memória kialakulása elengedhetetlen ahhoz, hogy a szervezett hosszú védelmet élvezzen egy bizonyos patogénnel szemben. A vakcináció célja éppen az, hogy létrehozza az immunológiai memórián alapuló tartós védettséget. Egy fertőzés elleni immunválasz fölerősítésének kétféle módja van: a passzív és az aktív immunizálás. Passzív immunizálás esetén előre megtermelt antitesteket, míg az aktív immunizálás során immunogén anyagokat juttatunk a szervezetbe, az aktív immunizásás tehát megkívánja az immunrendszer aktív részvételét a folyamatban, hosszan tartó memóriát eredményezve. Az aktív immunizálás és a vakcináció két különböző szó ugyanarra az eljárásra. A passzív immunizálást akkor alkalmazzák, ha a beteg azonnali védelmet igényel, vagy ha immunhiányos állapota van. Az aktív immunizálásnak (vakcinálás) preventív célja van. Míg a passzív immunizálás csak néhány hétre nyújt védelmet (an antitestek lebomlanak a szervezetben), addig egy jó vakcina egész életre szóló védelmet nyújt. A következőkben áttekintjük a lényeges tudnivalókat a konvencionális és a modern, biotechnológiai módszerekkel készült vakcinákról.

11.3. KONVENCIONÁLIS VAKCINÁK Élő, legyengített vakcinák A vakcinálás kezdeti időszakában élő kórokozókkal immunizálták, melyet előbb legyengítettek, azaz csökkentették patogenicitásukat. (Itt kell megjegyezni, hogy a vakcinálás úttörője, Jenner, szerencsésen kihasználta azt, hogy egyik vírus (vaccinia) kereszt-immunitást válthat ki egy másik vírus (smallpox, variola) ellen.) Az legyengített vakcinákat a mai napig alkalmazzák, és ezek a konvencionális módszerekkel készített vakcinák közül a legpotensebbnek számítanak. Példaként említhető a BCG vakcina vagy a kanyarórubeola-mumpsz kombinált vakcina komponensei. Az ezekben a vakcinákban alkalmazott patogéneket úgy gyöngítették le, hogy non-humán gazdában vagy sejttenyészetben szaporították őket, így a kórokozók az új gazdákhoz adaptálódtak. Ezután kiszelektálták azokat a törzseket, amelyek a legkevésbé virulensek, és a legkisebb eséllyel képesek visszaalakulni az eredeti kórokozóvá. A jelenleg is használatban lévő legyengített kórokozót tartalmazó vakcinák (zárójelben a betegség amely ellen védenek) a következők: BCG (tuberkulózis), MMR (kanyaró, rubeola, mumpsz), OPV (poliomyelitis), sárgaláz elleni vakcina, tífusz elleni vakcina, fekete himlő elleni vakcina, adenovírusok elleni vakcina. Az legyengített kórokozót tartalmazó vakcináknak vannak bizonyos előnyei. A természetes fertőzési úton juthatnak be a szervezetbe, ahol szaporodhatnak, akár a virulens, vad típusú kórokozók. Továbbá bizonyosan tartalmazzák az eredeti, virulens kórokozóra jellemző antigén-mintázatokat. Ezek következtében többnyire erősebb immunválaszt váltanak ki, mint az inaktivált kórokozókat tartalmazó vakcinák (lásd alább), a kiváltott immunológiai memória tovább tart, és az immunrendszer humorális és celluláris ága is aktiválódik. Meg kell említeni azonban a legyengített vakcinák veszélyeit is. Megvan annak a lehetősége, hogy a legyengített kórokozó visszaalakul az eredeti virulens típussá. Szerencsére a napjainkban használt legyengített kórokozókat tartalmazó vakcinák esetében a visszaalakulás valószínűsége igen csekély. Mindazonáltal legyengült immunrendszerű egyéneknek ezek a vakcinák nem adhatóak, mivel az ő szervezetük még a legyengített kórokozók szaporodását sem tudják meggátolni.

VAKCINÁK Inaktivált vakcinák A virulenssé visszaalakulás veszélye kiküszöbölhető, ha a vakcinálás elölt kórokozóval történik. Az „első generációs” inaktivált vakcinák a kései 19. és a korai 20. században készültek. Ezeknek a vakcináknak közös jellemzője volt, hogy az elölt intakt kórokozót tartalmazták. Az inaktiválás rendszerint kémiai úton történt (formaldehid, glutáraldehid), esetleg hőkezeléssel. Így készültek a diftéria, szamárköhögés, kolera, tífusz és poliomyelitis elleni vakcinák. Az inaktiváció megszüntette annak a veszélyét, hogy a vakcinában levő kórokozó visszanyeri eredeti virulenciáját, de sajnos az inaktivált vakcinákkal is voltak problémák. Az „első generációs” inaktivált vakcinák sokkal kevésbé voltak immunogének, mint a legyengített vakcinák, így azoknál sokkal gyengébb védettséget biztosítottak az adott betegség ellen. Ráadásul az inaktiváció által szabaddá tett bakteriális endotoxinok súlyos mellékhatásokat okoztak. Az inaktivált vírusokkal sokkal kevesebb probléma volt, a mai napig használatban vannak „első generációs” inaktivált vírus-vakcinák, például poliomyelitis ellen. A „második generációs” inaktivált vakcinák, más néven „alegység vakcinák” inaktivált patogénekből készült preparátumok. A cél a kórokozó hasznos antigénjeinek megtartása, és a mellékhatásokat okozók eliminációja. Sok ilyen vakcina kémiailag inaktivált bakteriális exotoxinból áll, például a diftéria és a tetanusz elleni vakcinák. Az úgynevezett „harmadik generációs” inaktivált vakcinák abban különböznek a „második generációs”-aktól, hogy előállításuk során a patogének mellékhatásokat okozó komponenseitől precíz, modern tisztítási módszerekkel szabadulnak meg. Példaként említhetők az új, sejtmentes szamárköhögés vakcina, és a Haemophilus influenzae b (Hib) vakcina, amely tetanusz toxoidhoz kapcsolt bakteriális poliszacharidból áll. Összességében elmondható, hogy az inaktivált vakcinák biztonságosabbak, mint az legyengített kórokozókat tartalmazók, hiszen nem okozhatnak fertőzést. A mellékhatások általában nem súlyosak, leginkább az injekció közvetlen környezetére korlátozódnak, esetleg enyhe láz lép fel. Azonban az inaktívált vakcinák nem váltanak ki elég erős celluláris immunválaszt, ezért több emlékeztető vakcinálás szükséges, de még így is csökken a védettség néhány év után. Gondos „költség-haszon” elemzés szükséges annak eldöntésére, hogy egy adott kórokozó ellen legyengített vagy inaktivált vakcina használat előnyös.

11.4. BIOTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREKKEL ELŐÁLLÍTOTT VAKCINÁK Az alkalmazásukkal elért komoly sikerek ellenére elmondhatjuk, hogy a vakcina-előállítás konvencionális útjának megvannak a korlátai. Az élő, legyengített kórokozókat tartalmazó vakcinák hatékonyak, de veszélyesek, az inaktivált vakcinák pedig biztonságosak, de kevésbé hatékonyak. Sok olyan fertőző betegség van – köztük igen súlyosak, pl. malária – amelyek ellen eddig nem sikerült vakcinát előállítani. Továbbá sok patogén, pl. az influenza vírus, igen gyorsan evolválódik, így az alkalmazott vakcinák gyorsan hatástalanná válnak. Remélhetőleg a modern biotechnológia fegyvertárának bevetésével ezek a hiányosságok kiküszöbölhetőek lesznek. A biotechnológiai vakcina-előállítás másik potenciális hozadéka, hogy a vakcinák előállítása és terjesztése olcsóbbá válna, ami elérhetővé tenné a modern vakcinákat a fejlődő országokban is.

53

54

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA Rekombináns alegység vakcinák A modern alegység vakcinák rekombináns protein antigéneket tartalmaznak. Ezek a vakcinák több előnyös tulajdonsággal rendelkeznek, például hatékonyabb előállíthatóság, biztonságos alkalmazhatóság, állandó és reprodukálható minőség. Előállításuk módja megegyezik a többi rekombináns fehérje előállítási módjával. A fehérje antigént kódoló DNS-szekvenciát expressziós vektorba építik, amit aztán, az előállítandó fehérje természetétől függően bakterium-, élesztő-, vagy emlős sejtbe juttatnak. A transzformált sejteket nagy kapacitású ipari bioreaktorokban tenyésztik, a terméket a tenyésztés végén a felülúszóból vagy a sejtekből izolálják. A rekombináns alegység vakcinák közül a legsikeresebb a hepatitisz B elleni vakcina. A hepatitisz B vírus (HBV) felszíni antigénjének rekombináns változatát tartalmazza (HBsAg). A HBsAg molekulák vírusszerű részecskékké állnak össze, melyek immunogének, de nem okoznak fertőzést, hiszen nincs vírális örökítő anyag a vakcinában. A készítmény biztonságos és viszonylag olcsó, és a vakcinált egyének nagy részében protektív immunválaszt idéz elő. Hasonló elven működik a genitális sebeket és méhnyakrákot okozó humán papilloma vírus (HPV) elleni vakcina is. A lészítmény a vírus kapszid-fehérjéjét tartalmazza, amelyek immunoén, de nem fertőző vírusszerű részecskékké állnak össze. A HPV kapszid proteineket élesztő sejtekben termelik. Csak olyan vírusok felszíni antigénjeit érdemes klónozni, melyek kevéssé változékonyak, lassan változnak az evolúció során. Sajnos a kívánatos celluláris immunválaszt nem minden esetben sikerül kialakítani. Genetikailag módosított élő, legyengített vakcinák A molekuláris patogenezisről szerzett ismereteink bővülésével lehetővé vált genetikailag módosított legyengített mikroorganizmusok tervezése. Virulenciájuk csökkenthető a patogenicitásért felelős DNSrégiók célzott mutgenezisével. A rekombináns legyengített influenza vakcinát 2003-ba engedélyezték. Olyan mutációkat vittek be a vírusba, melyek megakadályozzák szaporodásukat 37 oC-on. Rotavírus ellen is létezik rekombináns legyengített vakcina, ez csecsemőknek orálisan adható. A kolera elleni rekombináns legyengített vakcina olyan módosított Vibrio cholerae törzset tartalmaz, amely mutáns toxoidot választ ki. A toxoid megtartotta immunogenicitását, viszont betegséget nem okoz. A rekombináns legyengített vakcinák a hagyományos legyengített vakcinák javított utódai. Sajnos, a virulens reverzió veszélye esetükben is fennáll, ezért nem alkalmas a módszer például HIV elleni vakcina előállítására. Tumor elleni vakcinák Az immunrendszer képes tumor ellenes immunválaszra, ennek kontrollált, specifikus aktiválása a rákgyógyászat „Szent Grál”-ja. A tumor vakcinák elméleti alapja: áttörni a tumorral szemben kialakult toleranciát huszen a klinikailag manifesztálódott tumorokkal szemben toleráns az immunrendszer. Hatékony celluláris immunválasz indukálása szükséges, ami nem könnyű feladat, hiszen a tumoros beteg immunszupprimált (tumor-indukálta és terápia-indukálta immunszuppresszió) állapotban van.

VAKCINÁK Jelenleg többféle koncepció mentén folynak a kutatások, ilyenek például a passzív vakcináció antitestekkel, passzív vakcináció T-sejtekkel (adoptív transzfer), vakcináció tumor-asszociált antigénekkel, vakcináció tumor-specifikus antigénekkel (anti-idiotípus vakcinák), tumorsejtekkel történő vakcináció, dendritikus sejt (DC) alapú tumor vakcinák. Passzív vakcináció Az antitestek tumorellenes effektor mechanizmusokat indítanak el. A régebben használt rágcsáló antitesteknek súlyos mellékhatásai voltak (anaphylaxis, szérum-betegség). Kiméra és humanizált antitestek csökkentették a mellékhatásokat. Forgalomban lévő készítmények: • Trastuzumab Rituximab (Mabthera®), kiméra anti-humán CD20; Non-Hodgkin Lymphoma kezelése) • Herceptin®, humanizált anti-huHER2; HER2 pozitív emlőrák kezelése Tumor-specifikus T-sejt transzfer A betegből származó T-sejteket és tumorsejteket ex vivo együtt-tenyésztik IL-2 jelenlétében, majd a tumor-infiltráló limfocitákat (TIL) szintén ex vivo felszaporítják és visszaadják. Az eddigi humán klinikai adatok ellentmondásosak, a módszer rutinszerű, széleskörű klinikai alkalmazása rövidtávon nem valószínű. Tumor-specifikus genetikailag módosított T-sejt transzfer Az in vitro felszaporított genetikailag módosíott T-sejtek ellenanyag alapján tervezett kiméra T sejt receptorokat hordoznak. A tumor antigének nem különböznek drasztikusan az egészséges sejtekétől, ezért súlyos mellékhatások jelentkezhetnek, ha nem személyre szabott a kezelés. Tumor-asszociált antigént (TAA) tartalmazó vakcinák Számos TAA ismert, alkalmazásuk elterjedt a diagnosztikában és a tumor előrehaladottsági fokának meghatározásában („staging”). Hátrány: ha egyetlen antigént tartalmaz a vakcina, a tumor megváltoztatja a kérdéses antigént, és „megszökik” a vakcina elől (tumour escape). A módszer kipróbálás alatt van, hosszú távú hatékonysága nem ismert.

55

12. GÉN- ÉS SEJTTERÁPIA Definíció A gén- és sejtterápia számos alternatív definícióval rendelkezik. Az egyik elterjedt definíció szerint minden olyan stratégia mely exogén nukleinsav – DNS vagy RNS – használatával ér el egészségi állapotban változást kezelés, módosítás vagy megelőzés révén az a gén- és sejtterápia témakörébe sorolandó.

12.1. CSUPASZ NUKLEINSAV HASZNÁLATA Az RNS molekulák használata csupasz formában nem terjedt el. Ugyan lehetséges az úgynevezett ribozimek (RNS-alapú enzimek) megtervezése és felhasználása, azonban a megcélzott RNS molekulák lassú lebomlása és így a ribozimek csekély kapacitása miatt nem lehetséges terápiás felhasználásuk. A természetes DNS molekulák instabilitása biológia közegben (pl. szérum) problematikus, azonban a mesterséges (ribóz molekulán vagy a nitrogén-bázison módosított) DNS molekulák a módosításoknak köszönhetően kellően stabillá válnak ahhoz, hogy terápiás felhasználás is lehetségessé váljon. Közel 20 éves fejlesztést és optimalizálást követően jelenleg elérhető a szem CMV-fertőzéseinek kezelésére speciális anti-sense terápia (Vitravene). Egy másik szintén anti-sense technológián alapuló készítmény (Genasense) a krónikus limfoid leukémiában gyakran megnövekedett Bcl-2 génexpressziót mérsékli. Az RNS interferencia módszere – habár forradalmasította a genom funkcionális vizsgálatát melyért Nobel-díjban részesültek a felfedezők (Fire and Mello, 2006) – sajnos mégsem alkalmas terápiás felhasználásra. Ennek egyik oka a csekély felhalmozódás célsejtekben, mely kifejezetten igaz a célsejtek organellumaira. Egy másik probléma a természetes RNS molekulák gyors lebomlása biológiai közegben (pl. szérum), melyek következtében leállítottak gyakorlatilag minden RNS interferenciával kapcsolatos klinikai programot. Egy másik nagyon érdekes felhasználási módja a csupasz DNS molekuláknak az úgynevezett aptamerek használata. Az aptamerek specifikus kötőhelyekkel rendelkező DNS hurkok, melyeket szelektíven egyes molekulák megkötésére terveztek, biológiai közegben. A DNS molekulák a tervezés során exponenciális dúsításon esnek át, mely szisztematikus evolúciót biztosít (SELEX). Az ilyen célra tervezett csupasz DNS rendszerint polietilén-glikol konjugáción esik át (PEGiláció) melynek következtében látszólagos mérete megnövekszik és ezzel elkerülhető a vesén keresztüli ürülés. Az első terápiásan felhasznált aptamer készítmény a VEGF165 izoforma szelektív megkötésére képes (Macugen) úgy hogy nem kapcsolódik a VEGF egyéb, pl. VEGF121 izoformájához. Az utóbbi években a biológiai terápiák másik, monoklonális antitestek használatán alapuló ága kiszorította az aptamereket VEGFblokád kialakításában (Avastin, Lucentis). Bár egyes (pl. szemészeti) felhasználásban előnyös az egyes VEGF izoformák közötti különbségtétel, mely indokolja az aptamerek speciális körülmények közötti használatát. Plazmid-alapú génterápiás lehetőségek A plazmidok közvetlen terápiás felhasználása nem terjedt el tömegesen, mivel a csupasz DNS molekula korlátozott mértékben képes idegen genetikai elemek kifejezésére. Mindazonáltal léteznek terápiás lehetőségek plazmid DNS közvetlen felhasználására. Az egyik példa esetében VEGF plazmid DNS-t juttatnak izomszövetbe (Neovasculogen), melynek következtében átmenetileg és helyileg fokozott érképződés figyelhető meg. A terápiás lehetőség elsősorban csökkent érátáramlás, perifériás artériás betegség kezelésére lehet alkalmas. Egy másik klinikai alkalmazás során hepatocita növekedési faktort (HGF) alkalmaznak (Collategene), szintén érfejlődést serkentő (angiogenikus) hatása mi-

58

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA att. Az alternatív terápiás eljárás szintén perifériás érbetegség, pl. Buerger-kór esetében alkalmazható. A plazmid-alapú génterápia daganatellenes javallattal is rendelkezhet. Példaként említhető a III. és IV. stádiumú melanoma kezelésére használatos immunterápia (Allovectin). Az immunterápia HLA-B7 és beta2-mikroglobulin koexpresszióját jelenti. Ennek következtében az immunrendszer könnyebben felismeri és elpusztítja a daganatsejteket, visszaállítja a tumor-asszociált antigén-prezentációt MHCIen keresztül illetve nem specifikusan aktiválja a veleszületett immunrendszert. A plazmid-alapú génterápia vírusellenes javallatokkal is rendelkezhet. Az egyik példa a CMV fertőzés kezelésére bejegyzett TransVax készítmény, mely két CMV-eredetű genetikai elemet is tartalmaz és kifejez: az egyik a gB köpenyfehérje, míg a másik a pp65 immundomináns fehérje. A készítmény használata immunhiányos állapot esetén javallt. A plazmid DNS terápia nem csak emberi, hanem állatgyógyászatban is rendelkezik létjogosultsággal és klinikai példával. A kutyákban előforduló orális melanoma kezelésére bevezetett Oncept készítmény a humán tirozináz enzimet kódolja, melyet a plazmid-DNS terápia alkalmazása során intradermálisan alkalmaznak helyileg.

12.2. GÉNTERÁPIÁS LEHETŐSÉGEK Génterápiás lehetőségek általános stratégiái A csírasejtes génterápia emberi alkalmazása jelentős ellenállásba ütközik, mivel a csírasejtekben történő genetiki módosítások elvben átkerülhetnek következő generációkba. A génterápia testi sejtes kivitelezése lehet stabil illetve tranziens a bevitt genetikai elemek jelenlétének időtartama alapján. Bizonyos esetekben a stabil génterápia jelent előnyt, pl. hemofília esetén a hiányzó véralvadási faktor génjének stabil korrekciója esetén. Más helyzetekben azonban előnyösebb a tranziens génterápiás beavatkozás pl. kemoterápia, daganatos betegség, érbetegség vagy vakcináció esetében. Klinikai génterápiás kipróbálás során tapasztalható toxicitás, amennyiben a célszerv máj- vagy tüdőszövet, azonban izom esetében nem jelentettek ilyet. A korai génterápiás alkalmazások elsősorban virális módszereken alapultak, részben ennek következménye volt a tapasztalt toxicitás is. Jelenleg számos vírusmentes génterápiás lehetőség kínálkozik, pl. liposzómák használata, melyeket sikerrel teszteltek bizonyos tüdőbetegségek esetében. Virális vektorok génterápiás kezelésekben Töb mint 20 évnyi kutatás-fejlesztés után jelenleg mindössze három kereskedelmi forgalomban kapható vírus-vektort tartalmazó termék érhető el a piacon. Az egyik esetében replikációban gátolt adenovirális vektorban p53 gén található. A p53 tumor-szupresszor gén funkcióvesztése igen gyakori daganatok kialakulása során. Az intrahepatikusan bejuttatott vektor-készítmény (Gendicine) hatékonyan gátolja számos májban található primer és metasztatikus daganat progresszióját. Egy másik virális készítmény esetében egy rendkívül ritka betegség (LPL-hiány, 1/1-2 millió ember) genetikai korrekciója valósítható meg replikációban gátolt adeno-asszociált vírus-vektor alapú termék (Glybera) használatával. Az intramuszkuláris bejuttatást követően helyreáll a lipoprotein-lipáz hiányállapot, sikeresen gyógyítva ezt az igen ritka genetikai betegséget. Egy szintén ritka (1/80,000 ember), vakságot okozó betegség (Leber veleszületett amaurosis, LCA2) esetében a vakság okozója az RPE65 fehérje funkció-vesztése. A genetikai korrekciót adenoasszociált virális vektorok használatával lehet megoldani szubretinális bejuttatással.

GÉN- ÉS SEJTTERÁPIA Vérzékenység kezelése Vérzékenység esetében rendszerint a véralvadási rendszer egy kulcsfontosságú fehérjéje hiányzik (VII-as vagy IX-es faktor, hemofília A illetve hemofília B esetében), genetikai okok következtében. A véralvadási faktorok esetében az fiziológiás fehérjeszint jelentős tartalékokkal bír, mely következtében a génterápiás beavatkozásoknak igen csekély, a természetes szint mindössze 1%-os értékét kell megcélozni a véralvadási rendszer alapvető funkcionális helyreállításához. Mivel stabil génterápiás beavatkozásra van szükség valamint kerülendő az immunogén vektorok használata, az adenovirális vektorok használata mellőzendő, azonban az AAV (adeno asszociált virális) vektorok használata megfelelő. A IX-es faktor esetében ismert olyan izoforma (splice variáns), amelynek funkciója megtartott, azonban csökkent mérete alkalmassá teszi AAV vektorban történő alkalmazását. A klinikai kipróbálások kezdeti eredményei nagyon kedvezőek voltak májsejtek genetikai módosítása esetén elérve a természetes szint akár 12%-át is. Azonban idővel a genetikai úton bevitt véralvadási faktor expressziós szintje lecsökkent, és 8 hét elteltével eltűnt, immunológiai válaszreakció következtében. Kodon optimalizálás segítségével próbálták az új fehérjék immunogenitását csökkenteni, sajnos sikertelenül. Az immunválasz kiiktatása érdekében szteroid-kezelés alkalmazható, mely ugyan fenntartja a génterápiás eredetű véralvadási faktor expressziós szintjét, azonban egyéb mellékhatások forrása lehet hosszú távú alkalmazás esetén. Immunhiányos állapot kezelése A monogénes hematológiai betegségek kitűnő jelöltek génterápiás kezelésre: a hemopoetikus őssejt kivételesen nagy kapacitással rendelkezik a vér alakos elemeinek képzésében valamint mivel a vér 'folyékony szövet' ezért cseréje lényegesen egyszerűbb, mint más szilárd szövetek esetében. Példaként említhetők a SCID, azaz a súlyos kombinált immundefektusok, amelyeken belül pl. a legsúlyosabb az X-SCID, amelynek oka az interleukin 2 receptor gamma láncának mutációja (IL2RG). A fertőzések miatt az ezzel a mutációval született gyerekek általában 2 éves koruk előtt elhaláloznak. A betegség nagyon ritka, hazánkban évente egy ilyen beteg születése várható. A rendellenesség felismerése gyakran megkésik, ami akár végzetes is lehet, ha csontvelő átültetéssel nem próbálják meg gyógyítani. Az X-SCID betegség azonban génterápiával terljes mértékben kezelhetőnek bizonyult. Ebben az esetben egér retrovirális vektorokkal végeztek el az IL2R genetikai korrekcióját, mely az esetek döntő többségében sikeres volt, mintegy 15 évvel ezelőtt. Azonban két esetben megfigyeltek T-sejtes leukémiát, melynek kifejlődéséért a felhasznált egér retrovirális vektorok inszerciós mutagenezise volt felelős (LMO2 celluláris proto-onkogén aktivációján keresztül), így a programot leállították. A kutatás azonban nem állt le. Biztonságosabb virális vektorok tervezése indult meg, amelyeket úgy tervezték, hogy kontrollálható integrációs helyekre épüljenek be az általuk hordozott gén szekvenciák. A jelenlegi második generációs vírus vektorok klinikai alkalmazásával a kezelt 9 fiú esetében 7 viszszanyerte az immunológiai válaszadóképességét, azaz a génbevitel sikeres volt. Azonban, még a legrégebben megkezelt beteg esetében sem telt el öt év, amely az első generációs vírus vektorok esetében a leukémia megjelenésének idejét jelentette. A terápiában résztvettek folyamatos megfigyelése adhat választ arra, hogy sikerült-e a megbízható vírusvektor előállítása. Sejtterápiás lehetőségek A sejtterápiás lehetőségek egész tárházát nyitja meg a pluripotens őssejtek (PSC) használata. Ezen sejteknek alapvetően két típusát különböztetjük meg: indukált PSC (iPSC) és humán embrionális SC (hESC). A két sejtcsoport alapvetően más megközelítéssel készül és teljesen más etikai megfontolásokat illetve megszorításokat hoz magával. Terminálisan differenciált fibroblaszt sejtekből néhány gén retrovirális stabil fokozott expresszióját követően iPSC sejtek nyerhetők. Egér sejtek esetében az iPSC létrehozáshoz szükséges gének: Oct4, Sox2, c-myc és Klf4. Humán sejtek esetében rendszerint lentivirális módszerrel érik el a stabil over-expressziót az alábbi gének esetében: Oct4, Sox2, Nanog, Lin28. A humán iPSC sejtek felhasz-

59

60

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA nálási flexibilitásukat tekintve megközelítik a hESC sejtek szintjét, mely hasonlóság megmutatkozik a morfológia, proliferáció, gén-expresszió, pluripotens markerek epigenetikai státusza és telomeráz aktivitás tekintetében is. Ezen túlmenően az iPSC-k immundeficiens környezetben könnyen eredményeznek teratomákat, melyekben mindhárom csíralemez sejtjei előfordulnak, hasonlóan hESC-hez. Májsejtek (hepatociták) előállíthatók iPSC és hESC felhasználásával egyaránt. A létrehozott májsejtek számos módszer szerint megfeleltethetők primer humán májsejteknek pl. gén- és fehérje-expresszió, indocianin-zöld festődés illetve glikogén-felhalmozás tekintetében. Ugyanakkor számos kutatócsoport jelentette az AFP (alfa-fötoprotein) expresszióját is, mely differenciálatlanságra utal és ezért óvatosságra int. Más kutatócsoportok inzulin-termelő hasnyálmirigy sejtcsoportok differenciációját kísérelték meg humán mebrionális őssejtek (hESC) felhasználásával. Eredményeik sikeresek voltak, a differenciált sejtek valóban képesek voltak inzulin termelésre in vivo körülmények között is, glükózra adott válaszként. Bizonyos szövetek esetében közvetlenül szöveti őssejtek felhasználásával is jelentettek sikeres klinikai teszteket. Egyes kutatócsoportok eredményei szerint amennyiben 2 nappal szívizominfarktust követően csontvelői eredetű őssejteket injektálnak a károsodott területre, akár 30-40%-kal nagyobb lokális izomerő-növekedést, és tartós javulást lehet kimutatni. Amennyiben a sejtek rendelkeznek marker génnel (pl. GFP) a bevitt sejtek aránya, elhelyezkedése és típusa azonosítható és követhető, alátámasztva a megfigyelést. Testi sejtes klónozás A testi sejtes klónozás másnéven szomatikus sejtmag transzfer módszere közismert, Dolly a klónozott birka esetének köszönhetően. A klónozás ilyen módszere nem új, már több évtizede alkalmazzák sikerrel egyéb, egyszerűbb élőlények pl. béka esetében. Azonban kétségkívül Dolly volt az első fejlett emlősállat, aki ugyanezen módszerrel került klónozásra. Valójában a klónozás ilyen típusa rendkívül csekély hatékonysággal alkalmazható módszer, melyet Dolly esetében is alátámasztanak a statisztikák: 277 sejtfúziós kísérlet, 29 méh-implantáció, 13 béranya volt szükséges Dolly megszületéséhez. A módszer alacsony hatékonysága ellenére már fejlett emlősök számos faját klónozták az alkalmazásával úgy, mint egeret, patkányt, nyulat, macskát, kutyát, farkast, disznót, öszvért, lovat, szarvast, tevét és bivalyt. A számos emlős faj esetében elért sikeren felbuzdulva jelenleg elérhető akár internetes szolgáltatás fomájában is háziállatok klónozása. Ember esetében nem jelentettek eddig sikeres testi sejtes klónozást. A testi sejtes klónozással kapcsolatban jelentettek számos fejlődési rendellenességet illetve gyorsult öregedést (progériát) egyaránt, meéy árnyalja az összképet.

12.3. AJÁNLOTT OLVASMÁNYOK Aiuti A, Biasco L, Scaramuzza S, Ferrua F, Cicalese MP, Baricordi C, Dionisio F, Calabria A, Giannelli S, Castiello MC, Bosticardo M, Evangelio C, Assanelli A, Casiraghi M, Di Nunzio S, Callegaro L, Benati C, Rizzardi P, Pellin D, Di Serio C, Schmidt M, Von Kalle C, Gardner J, Mehta N, Neduva V, Dow DJ, Galy A, Miniero R, Finocchi A, Metin A, Banerjee PP, Orange JS, Galimberti S, Valsecchi MG, Biffi A, Montini E, Villa A, Ciceri F, Roncarolo MG, Naldini L. (2013) Lentiviral Hematopoietic Stem Cell Gene Therapy in Patients with Wiskott-Aldrich Syndrome. Science. 341: doi: 10.1126/science.1233151. AL-RUBEAI M, NACIRI M (EDS.) (2014) STEM CELL AND CELL THERAPY. SPRINGER NEW YORK HEIDELBERG DORDRECHT LONDON AUCHINCLOSS H JR, SACHS DH. (1998) XENOGENEIC TRANSPLANTATION. ANNU REV IMMUNOL. 16 433–470.

GÉN- ÉS SEJTTERÁPIA Baldo A, van den Akker E, Bergmans HE, Lim F, Pauwels K. (2013) General considerations on the biosafety of virus-derived vectors used in gene therapy and vaccination. Curr. Gene Ther. 13(6): 385– 394. Bratkovič T, Glavan G, Strukelj B, Zivin M, Rogelj B. (2012) Exploiting microRNAs for cell engineering and therapy. Biotechnol. Adv. 30(3): 753–765. Burnett JC, Rossi JJ. (2012) RNA-Based Therapeutics: Current Progress and Future Prospects. Chemistry & Biology. doi 10.1016/j.chembiol.2011.12.008. CHASE LG, VEMURI MC (EDS). (2013) MESENCHYMAL STEM CELL THERAPY. HUMANA PRESS Chen GX, Zhang S, He XH, Liu SY, Ma C, Zou XP. (2014) Clinical utility of recombinant adenoviral human p53 gene therapy: current perspectives. Onco. Targets Ther. 7: 1901–1909. Chen J, Gu W, Yang L, Chen C, Shao R, Xu K, Xu ZP. (2015 ) Nanotechnology in the management of cervical cancer. Rev. Med. Virol. 25 Suppl 1: 72–83. DANQUAH MK, MAHATO RI (EDS). (2013) EMERGING TRENDS IN CELL AND GENE THERAPY. SPRINGER NEW YORK HEIDELBERG DORDRECHT LONDON Didigu C, Doms R. (2014) Gene therapy targeting HIV entry. Viruses. 6(3): 1395–1409. Esau CC, Monia BP. (2007) Therapeutic potential for microRNAs. Adv. Drug Delivery Rev. 59: 101– 114. Goldberg MS. (2013) siRNA Delivery for the treatment of ovarian cancer. Methods 63: 95–100 He D, Wagner E. (2015) Defined Polymeric Materials for Gene Delivery. Macromol. Biosci. doi: 10.1002/mabi.201400524. Jyoti S. (2014) RNA Interference and Its Applications. In Ravi I., Baunthiyal M., Jyoti S. (Eds.), Advances in Biotechnology 55–70. Springer India. Kane NM, Thrasher AJ, Angelini GD, Emanueli C. (2014) Concise review: MicroRNAs as modulators of stem cells and angiogenesis. Stem Cells. 32(5): 1059–1066. Karnati HK, Yalagala RS, Undi R, Pasupuleti SR, Gutti RK. (2014) Therapeutic potential of siRNA and DNAzymes in cancer. Tumor Biol. 35: 9505–9521. KARP JM, LENG TEO GS. (2009) MESENCHYMAL STEM CELL HOMING: THE DEVIL IS IN THE DETAILS. CELL STEM CELL. 4(3) 206–216. Lisziewicz J, Trocio J, Whitman L, Varga G, Xu J, Bakare N, Erbacher P, Fox C, Woodward R, Markham P, Arya S, Behr JP, Lori F. (2005) DermaVir: A Novel Topical Vaccine for HIV/AIDS. J. Invest. Dermatol. 124(1): 160-169. Lisziewicz J, Calarota SA, Lori F. (2007) The potential of topical DNA vaccines adjuvanted by cytokines. Expert Opin. Biol. Ther. 7(10): 1563-74. Manservigi R, Argnani R, Marconi P. (2010) HSV Recombinant Vectors for Gene Therapy. Open Virol. J. 4: 123–156. Mcconnell MJ, and Imperilale MJ. (2004) Biology of Adenovirus and Its Use as a Vector for Gene Therapy. Human Gene Ther. 15: 1022–1033.

61

62

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA MILTRECIC D, NICAISE C, GAJOVIC S, POCHET R. (2010) DISTRIBUTION, DIFFERENTIATION AND SURVIVAL OF INTRAVENOUSLY ADMINISTERED NEURAL STEM CELLS IN A RAT MODEL OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS.

CELL TRANSPLANT. 19 537–548. MITTEREGGER R, VOGT G, ROSSMANITH E, FALKENHAGEN D. (1999) ROTARY CELL CULTURE SYSTEM (RCCS): A NEW METHOD FOR CULTIVATING HEPATOCYTES ON MICROCARRIERS. INT J ARTIF ORGANS. 22(12) 816–822. RAIS Y, ZVIRAN A, GEULA S, GAFNI O, CHOMSKY E, VIUKOV S, MANSOUR AA, CASPI I, KRUPALNIK V, ZERBIB M, MAZA I, MOR N, BARAN D, W EINBERGER L, JAITIN DA, LARA-ASTIASO D, BLECHER-GONEN R, SHIPONY Z, MUKAMEL Z, HAGAI T, GILAD S, AMANN-ZALCENSTEIN D, TANAY A, AMIT I, NOVERSHTERN N, HANNA JH. (2013) DETERMINISTIC DIRECT REPROGRAMMING OF SOMATIC CELLS TO PLURIPOTENCY. NATURE. 502(7469) 65-70. RESCHIGLIAN P, ZATTONI A, RODA B, MICHELINI E, RODA A. (2005) FIELD-FLOW FRACTIONATION AND BIOTECHNOLOGY. TRENDS IN BIOTECH. 23(9) 475–483. Resnier P, Montier T, Mathieu V, Benoit JP, Passirani C. (2013) A review of the current status of siRNA nanomedicines in the treatment of cancer. Biomaterials 34: 6429–6443 Rohini K. (2014) Gene Therapy. In Ravi I., Baunthiyal M., Jyoti S. (Eds.), Advances in Biotechnology 41–54. Springer India. Tros de Ilarduya C, Sun Y, Düzgüneş N. (2010) Gene delivery by lipoplexes and polyplexes. Eur. J. Pharm. Sci. 40: 159–170 Vaishnaw AK, Gollob J, Gamba-Vitalo C, Hutabarat R, Sah D, Meyers R, de Fougerolles T, Maraganore J. (2010) A status report on RNAi therapeutics. Silence. 1(1):14. doi: 10.1186/1758-907X1-14. VASITA R., KATTI DS.(2006) NANOFIBERS AND THEIR APPLICATIONS IN TISSUE ENGINEERING INT. J. NANOMED. 1(1) 15–30. Wahid F, Shehzad A, Khan Z, Kim YY. (2010) MicroRNAs: Synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials. Biochim. Biophys. Acta 1803: 1231–1243. W HITNEY GA, MERA H, W EIDENBECHER M, AWADALLAH A, MANSOUR JM, DENNIS JE. (2012) METHODS FOR PRODUCING SCAFFOLD-FREE ENGINEERED CARTILAGE SHEETS FROM AURICULAR AND ARTICULAR CHONDROCYTE CELL SOURCES AND ATTACHMENT TO POROUS TANTALUM. BIORES OPEN ACCESS. 1(4) 157–65. Zhou J, Shum KT, Burnett JC, Rossi JJ. (2013) Nanoparticle-Based Delivery of RNAi Therapeutics: Progress and Challenges. Pharmaceuticals 6(1): 85–107. ZHANG P, REN L, ZHANG X, SHAN Y, W ANG Y, JI Y, YIN H, HUANG WE, XU J, MA B. (2015) RAMANACTIVATED CELL SORTING BASED ON DIELECTROPHORETIC SINGLE-CELL TRAP AND RELEASE. ANAL CHEM. 87(4) 2282–2289.

13. HATÓANYAG-BEVITEL OPTIMALIZÁLÁSA 13.1. BEVITELI ÚTVONALAK Nagyméretű biológiailag aktív gyógyszerek (fehérjék) bevitele esetén a szájon történő bevitel rendszerint nem célszerű. Ennek okai meglehetősen prózaiak: számos emésztő-enzim gyorsan lebontaná a fehérjét, nem sokkal bevitelét követően. Először a gyomorban található pepszin, majd a hasnyálmirigyből származó tripszin, karboxipeptidáz A, kimotripszin, észterázok hasítanák a szájon át bevitt fehérjét. A megmaradt fehérje kétes hatékonyságú felszívódást követően gyorsan metabolizálódna a májban ('first pass' hatás). Ennek következtében fehérjetermészetű anyagok bevitele esetén egyéb beviteli útvonalak használata szükséges. Ezek közé tartozik az intravénás, szubkután, intramuszkuláris, intravitreális, intratekális és intra-arteriális bevitel. Az érpályába (vénába vagy artériába) történő juttatás viszont egyéb problémákat vet fel: kivételes szintű sterilitásra van szükség a gyógyszer előllítása során, a fehérjékre valószínűleg gyors kiválasztódás vár valamint speciális kórházi környezetre van szükség mind infrastruktúra illetve személyzet tekintetében ha esetleg súlyos nemkívánatos mellékhatások jelentkeznének. Tüdőn keresztüli bevitel A légzőfelületen keresztüli gyógyszerbevitel egy rendkívül érdekes kihívás. Ezen belül egyrészt a felső légutak felülete lényegesen kisebb, mint az alsó légutak felülete, másrészt a felsőléguti köbhámsejtek magasságuk miatt (30-40um) fehérjék számára gyakorlatilag áthatolhatatlanok. Ezzel szemben az alsó légutak sokkal vonzóbbak gyógyszerbeviteli szempontból. Itt sokkal nagyobb felület áll rendelkezésre és a laphámsejtek csekély magassága miatt (0.1-0.2um) a fehérjetermészetű gyógyszerek bevitele lényegesen hatékonyabb lehet. Egy másik vonzó tulajdonsága a légzőfelületnek gyógyszerbeviteli szempontból, hogy mivel teljesen különálló vérkörről van szó (kisvérkör) ezért a gyógyszermetabolizmus során nem kell számolni a máj gyors semlegesítő hatásával ('first pass' hatás). Számos példa ismert gyógyszerbevitelre a tüdőn keresztül. A cukorbetegség (IDDM) kezelésére használt inzulin-adagolást sokszor élik meg kellemetlenségként a betegek a gyakori inzulin befecskendezések szükségessége miatt. Ezzel szemben a tüdőn keresztüli hatóanyag-bevitel sokkal kényelmesebb módja az inzulin adagolásának. Egy példa az inzulin inhalációs bevitelére az Exubera. Az inzulin hasznosulása tüdőn keresztüli bevitel esetében kivételesen jó (30-50%), azonban jelentős egyéni különbségek figyelhetők meg amely szoros kezdeti vércukorszint-ellenőrzést igényel, az alap vércukorszint illetve az étkezést követő vércukorszint homeosztázisának beállítása érdekében cukorbeteg páciensek esetében. Egy másik példa a tüdőn keresztüli hatóanyag bevitelre a DNáz aeroszol (dornáz alfa) inhaláció melyet cisztás fibrózis esetén alkalmaznak a légutakban felgyülemlő sűrű nyák oldására, mely a hibás klorid-ion sejttranszport miatt alakulhat ki. Habár ebben az esetben is a tüdőn keresztüli bevitel eleinte szoros megfigyelést követel, a későbbiekben a tartós használat egyszerűnek bizonyul és a májban történő metabolizmus ('first pass' hatás) megkerülése révén alacsony dózisok használata is elégséges. Bőrön keresztüli bevitel A bőrön keresztüli bevitel egy szintén nagyon izgalmas alternatív hatóanyag beviteli útvonal. Példának a bőr-tapaszok használata említhető. Habár az intakt bőrön keresztül szinte lehetetlen az 1kDa feletti molekulasúllyal rendelkező hatóanyagok hatékony bevitele, léteznek olyan speciális mikroméretű tűkkel rendelkező tapaszok, melyek áthatolnak az epidermisz felső 100um vastag rétegén, ezzel jelentősen elősegítve nagyobb molekulasúlyú, fehérje-természetű hatóanyagok felszívódását. Ennek megfelelően a hatóanyag-felszabadulási vizsgálatok lassú (több napig elhúzódó), folyamatos ütemű felsza-

64

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA badulást mutatnak, mely szükség esetén iontoforézis vagy ionáram segítségével fokozható. Példaként megemlíthető a szkopolamin tapasz használata tengeribetegség (kinetózis) kialakulásának megelőzésére. A szkopolamin tapasz használata alacsony szintű (0.5mg/nap), időben elhúzódó felszívódást biztosít, mely tökéletesen megfelel az igényeknek. Korábban forgalmaztak fentanil tapaszt is alacsony-szintű folyamatos opioid felszívódás biztosítására, krónikus fájdalom csillapítására. Azonban a jelentős egyéni különbségek miatt (előfordult mind a hatékonyság hiánya illetve a légzés gátlása mint nemkívánatos mellékhatás) visszavonták kereskedelmi forgalomból a fentanil tapaszokat. Egyenletes hatóanyag-leadás A szabályozott, egyenletes hatóanyag-leadás fokozott hangsúlyt kap a jelenlegi biofarmáciai kutatásfejlesztésben. A gyógyszerészetben fontos elvárás az egyenletes hatóanyag-leadás elérése a hagyományos bólus-hatással szemben. Az ilyen leadási profil képes minimálisra csökkenteni mind a túlzott illetve a hatástalan hatóanyag-koncentrációk előfordulásának valószínűségét. Ez elérhető biológiailag lebomló hordozó-anyagok használatával, melyek közé biopolimerek illetve zsír- és fehérjetermészetű részecskék tartoznak. Az ilyen hordozók esetében elvárás a biológiai úton történő lebomlás toxikus melléktermékek keletkezése nélkül valamint a fehérje-természetű hatóanyag kíméletes és gyógyszertani szempontból jelentős mennyiségben történő integrációja. PLG Egy példa hordozóanyagok tekintetében a poli-laktid-glikolát (PLG). A PLG sikeresen használt hordozóanyag humán rekombináns alfa-interferon és növekedési hormon (Nutropin Depo) alkalmazása során egyaránt. Nutropin Depo használata során a PLG hatékonyan biztosít egyenletes hatóanyagleadást akár 28 napon keresztül (kb. 1 hónapig) egyetlen szubkután injekciót követően, míg PLG használata nélkül heti 1-2 injekció adása szükséges. Egy fontos elem a komplexum létrehozásában a cink, mely fokozott stabilitást biztosít a terméknek, hosszú időn keresztül. Sajnos a tejsav (mely a PLG helyi bomlásterméke) elhúzódó lokális savasodáshoz vezethet, mely szövet-felszívódást okozhat a gyakran injektált területen. Ezért a termék forgalmazását felfüggesztették. Liposzómák A liposzómák szintén ígéretes hordozók. Átmérőjük 30-1000nm mérettartományba esik és szintén egyenletes hatóanyag-leadást biztosítanak, mivel a fehérjék rendkívül lassan, de teljes mértékben áthatolnak a liposzóma membránon. Számos sikeres alkalmazási területük ismert hordozóként például amfotericin B, doxorubicin, daunorubicin, számos interleukin (IL-1, 2, 6, 7) illetve interferon-gamma és GM-CSF bevitele során. Amennyiben a fehérje kiáramlása túlságosan lassúnak bizonyul a terápiás koncentráció eléréséhez, úgynevezett permeáció-fokozó használata lehet szükséges a liposzómás készítmények esetében. A permeáció-fokozók az alábbi kategóriákba sorolhatók: I. osztály (zsírsavak mint pl. linolénsav), II. osztály (epesó-kivonatok), III. osztály (felületi feszültség-csökkentők) illetve IV. osztály (vízoldható szerves oldószerek, maltopiranozid, glikolát és nátrium-tauro-dihidrofizudát röviden STDHF). Az STDHF egy nagyon hatékony permeáció-fokozó, használják például intranazális kalcitonin és intranazális inzulin bevitele során is. Kalcitonin / STDHF esetében a biológiai hasznosulás 8% (STDHF nélkül elenyésző), míg inzulin / STDHF esetében a permeáció-fokozás még kifejezettebb, a biológiai hasznosulás 16-47% (STDHF nélkül elenyésző). Azonban a 16-47%-os biológiai hasznosulás egy széles tartomány jelentős egyéni különbségekkel, ezért szoros személyre szabott követés szükséges a kezelés kezdeti szakaszában.

HATÓANYAG-BEVITEL OPTIMALIZÁLÁSA

13.2. HATÓANYAG ÜRÜLÉSÉNEK MÓDOSÍTÁSA A hatóanyagok ürülése két fő útvonalon, a vesén keresztül illetve a máj / keringési rendszeren (MPS vagy makrofág rendszer) keresztül történhet. Létezik egy fontos határérték a makromolekulák méretének tekintetében, mely meghatározza az ürülés hatékonyságát és útvonalát. A vesék minden 40kDa feletti makromolekulát visszatartanak a glomerulus-szerkezet jellegzetessége miatt. Ezzel szemben az MPS rendszer leginkább 100 kDa feletti makromolekulák esetében aktiválódik jelentős mértékben. Amennyiben egy makromolekula 40kDa alatti, akkor a vízben oldott (hidrált) méretét növelni kell a visszatartás érdekében. Egy gyakran használt módszer során polietilén-glikol (PEG) oldalláncokkal növelik a hidrált felületet (PEGiláció). Metilált PEG (mPEG) és többszálú PEG egyaránt alkalmazható a célra. A látszólagos méretnövekedés egy másik, nem kémiai hanem biológiai stratégiája során poszt-transzlációs módosulások, cukorcsoportok hozzáadása révén növelhető a molekula glikációja vagyis hidrált mérete. A PEG használata révén elért méretnövekedésre jó példák a PEG-ADA, PEGIL2 és PegIntron. PEG-ADA esetében (melyet egyes SCID-betegek kezelésére használnak ADAhiányállapotban) a PEGiláció révén 24h lesz a féléletidő, míg PEG használata nélkül csak pár perc lenne. PEG-IL2 esetében a fél-életidő szintén jelentősen növekszik: 8h értékre 45 perc helyett. A PEGilált interferon alfa szintén sokat, kb. 10x nyer féléletidő tekintetében (40h vs. 4h). Mivel az MPS rendszer az immunrendszer egyik része, a limfoid szövet szelektíven jól megcélozható. Példaként a liposzóma-alapú influenza vakcina esetében hemagglutinint adnak a készítményhez, melynek következtében elnyújtott, intracelluláris jelenlét és fokozott sejtes immunválasz váltható ki idős betegekben is. Egy másik példa a liposzóma-formulációjú amfotericin B. Hagyományos használat esetében az amfotericin B jelentős toxicitást mutat számos szövetben. Azonban liposzómák használata során a hatóanyag szelektíven a lépben dúsul fel (mely az amfotericin B fő célterülete) így megkímélve más szöveteket és szerveket a toxicitástól.

13.3. 'MAGIC BULLET' KÉSZÍTMÉNYEK A 'magic bullet' készítmények kombinálják a monoklonális antitestek (vagy Fab fragmensek) specificitását / affinitását és bizonyos konjugátumok (toxinok, radioaktív izotópok) előnyös tulajdonságait, ezáltal szelektíven feldúsulva a célsejtekben, megkímélve egyéb sejteket. Az ilyen készítmények funckionális csoportjainak számos példája ismert a toxinok (pl. diftéria toxin, ricin, abrin, fagyöngy lektin, modekkin) és a radioaktív izotópok között (pl. In-111, Y-90, I-131) egyaránt. Ezekben az esetekben az antitest fragmens (vagy Fab) és a funkcionális csoport (toxin / izotóp) között kovalens kötés található. Példaként említhető toxin-konjugált 'magic bullet' készítmények az anti-TAC-PE38, RFB4-PE38 és az Ontak. A speciális hematológiai betegségek kezelésére használt anti-TAC-PE38 esetében a célmolekula a CD25, míg az RFB4 esetében a célmolekula a CD22, a funkcionális csoport (PE) pedig Pseudomonas exotoxin. A bizonyos limfómák kezelésére javallt Ontak esetében az IL2-specifikus Fab fragmenshez kapcsolt funkcionális csoport egy rövidített diftéria toxin. Konkrét példák az izotóp-konjugált 'magic bullet' készítményekre a Zevalin (a-CD20-Y90) és a Bexxar (a-CD20-I131). Mindkét készítmény B-sejtes limfómák kezelésére javallt a CD20 molekula közvetítésével, ám eltérő radioaktív izotópok használatával.

13.4. REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK MOLEKULÁRIS SZINTŰ MÓDOSÍTÁSAI Ma már lehetséges a rekombináns fehérjék molekuláris szintű módosítása annak érdekében, hogy jobban megfeleljenek a farmakológiai elvárásoknak. Az alábbi három példa (inzulin, eritropoetin és antitestek) ilyen molekuláris szintű módosításokat mutatnak be.

65

66

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA Az inzulin rendszeres pótlása szükséges I-es típusú cukorbetegség esetén (IDDM) mind az alapszintű elnyújtott (bazális) illetve az étkezéseket követő gyors (posztprandiális) vércukor-háztartás biztosításához. Az elnyújtott bazális inzulin hatáshoz lassú lebomlású inzulin-variánsok használata szükséges. A glargin (Lantus, Ultralente) inzulin közel fiziológiás, állandó inzulin szintet biztosít molekuláris szintű interferencia révén. Az acetilált inzulin (Degludec, Levemir) még lassabb lebomlású inzulin variáns, mely féléletideje megközelíti a 12h értéket. Más esetekben cink által stabilizált lizpro inzulin (Humalog) vagy aszpartám inzulin (Novolog) monomerek biztosítják a rendkívül gyors inzulinhatást, lehetővé téve akár étkezést követő alkalmazást is, a dózist az elfogyasztott szénhidrát mennyiségéhez igazítva. Az eritropoetin hasonló szintű molekuláris módosításon eshet át: további N vagy O glikozilációs helyek kerülnek a genetikai szekvenciába a cukor-csoportok számának növelése érdekében, ezáltal megvédve az eritropoetint a korai lebomlástól. A NESP ('Novel erythropoiesis stimulating protein') az eredeti eritropoetinhez képest 50%-al több glikozilációs helyet tartalmaz a vad-típusú eritropoetinhez képest. Ennek megfelelően az emberi NESP (Aranesp) használata során az eritropoetin féléletideje 3.5x mértékben növekszik. Monoklonális antitestek esetében is törekednek a féléletidő növelésére, molekuláris szintű módosítások révén. Amennyiben FcRn fúziós partner kerül az antitest molekulára, az rendkívüli mértékben megnöveli a keringési rendszerben mérhető féléletidőt akár 30 napra, az eredeti néhány perces féléletidővel szemben (pl. ilyen módosítással rendelkezik a TNF receptoron ható Enbrel készítmény). Más jellegű molekuláris biológiai módosítások során a genetikai szekvenciában kódolnak funkcionális csoportot (toxint) mely lehetővé teszi a 'magic bullet' készítmények fokozott toxicitását és garantálja az 1:1 antitest / toxin arányt. Példaként az Ontak említhető, melyben kovalens kötésben található DAB (deficiens diftéria toxin).

14. INTEGRÁCIÓS TÖREKVÉSEK A biofarmáciai módszerekkel készülő hatóanyagok jelentősen hosszájárulnak a biológiai terápiaként ismert modern gyógyszerek térnyeréséhez. 2011-ben az FDA 35 új molekulát, többségében fehérjetermészetű makromolekulát vezetett be. Minden kétséget kizárólag ez egy nagy költségvetésű tendencia: a nagy gyógyszercégek összesen több mint 50 milliárd USD összegben fektettek ezek kutatás / fejlesztésébe. Egyszerű osztással is hatalmas számokat kapunk: átlagosan 1,4 milliárd USD befektetés szükséges minden egyes új molekula esetében, és még klinikai kudarc esetén is meglehetősen magas a költségek összege, átlagosan kb. 1,2 milliárd USD minden egyes klinikai fázisban megbukó molekula esetében. A magas költségek egyik oka a hosszú idő, mely a kutatólaborban kapott eredeti felfedezés és a tényleges gyógyszer-forgalmazás között eltelik: átlagosan 10-15 év. Alig 25 éve (1990) mindössze kb. 500 hatóanyag-célpont volt ismert molekuláris szinten. Ez a szám azóta drámaian megnőtt, kb. 1350 hatóanyag-célpont ismert jelenleg, mely nagyrészt a poszt-genomikus korszaknak köszönhető (a humán genom projekt eredményeinek bioinformatikai analízise következtében). Különösen nagy az érdeklődés új hatóanyagokra a krónikus betegségek, azon belül is az idegrendszeri kórképek területén úgy mint az Alzhemier-kór, Parkinson-kór, szklerózis multiplex esetében. Az új hatóanyagok kutatása azonban természetesen továbbra is együtt jár azok lehetséges kudarcaival is. A kudarcok több okra vezethetők vissza: 51%-ban a hatékonyság hiánya, 19%-ban a biztonságosság hiánya illetve meglepően gyakran 29%-ban stratégiai okok miatt – bizonyos esetekben a nagy gyógyszercégek belső stratégiai számításai egy adott hatóanyag piacról történő visszahívását teszik indokolttá. Minden esetben a kudarc minél koraibb felismerése teszi lehetővé a bevételkiesés minimalizálását a 'korai kudarc – olcsó kudarc' szabály alapján.

14.1. ÜZLETI MEGFONTOLÁSOK A fejlett országok egészségügyi kiadásai magasak és folyamatosan emelkednek. Ez különösen igaz az USA esetében. Az USA egészségügyi kiadásai a GDP 13,6%-át tették ki 1995-ben, majd 17,9%-ra emelkedtek 2010-re – ez majdnem 50%-os emelkedés 15 év alatt. Ez az érték kivételesen magas, összehasonlításul a britt egészségügyi kiadások a GDP 9,6%-át teszik ki, ugyanez az érték Németország esetében 11,6%. Azonban ezt nem tükrözi a várható átlagéletkor alakulása, mivel az USA csak kb. 25. helyezett a 30 legfejlettebb (OECD) ország között. Amennyiben kiszámoljuk az egy állampolgárra jutó egészségügyi kiadásokat a számok még drámaibbak: az USA esetében ez az érték átlag ~7,500 USD, míg az OECD átlag ~3,000 USD. Ezt részben magyarázza az egészségügyi rendszerek közötti különbség az egyes országok tekintetében, mivel az OECD országokban (az USA kivételével) az egészségügyi kiadások döntéshozói költséghatékonysági és gyógyszer-gazdaságossági adatokat kérnek a gyógyszercégektől. Erre való tekintettel a gyógyszercégek az ún. HTA ('Health Technology Assessment') rendszert használják. Gyógyszer-gazdaságossági adatokat már a III. klinikai fázis előtt gyűjtenek és elemeznek. Mivel a sikeres biológiai terápiák kivételes hasznot termelnek a gyógyszercégek számára, a gyógyszercégek a labortól a forgalmazásig eltelt időt is megpróbálják lerövidíteni: egyetlen nap csúszás a piaci bevezetésben több millió USD bevételkiesést jelenthet. A HTA protokollok jelentős területi eltéréseket mutatnak, gyakran a bizottságok összetételének különbségei miatt: az ausztrál és svéd HTA bizottságok tartalmaznak egészségügyi közgazdászokat, míg a skót és svéd HTA bizottságok etikában járatos tagokat is tartalmaznak. Egy másik fontos kritérium egy gyógyszer megítélésében az, hogy a piacon első-e a maga kategóriájában vagy sokadik egy adott kategóriában. Egy másik, nagy gyógyszercégek által a HTA rendszer mellett gyakran használt rendszer a TPP ('target product profile'). A TPP magában foglalja azt a gyógyszerleírást is, melyet a majdani kiszerelés tartalmazni fog. A TPP-t folyamatosan pontosítják az árak tekintetében a klinikai fázisok során. A preklinikai illetve az I. és II. klinikai fázisok szolgáltatják a korai modellt az árazás hozzávetőleges megállapítására. Ez egy rendkívül fontos döntési pont a klinikai fázisok folytatását vagy leállítását illetően, a költségek minimalizálása érdekében. A III. flinikai fázis szolgáltat adatokat időközi árazás kialakításához. A végleges modellt gyakran globális árazási rendszernek is hívják. Ez utóbbi egy nagyon precíz modellrendszer a globális piacra szánt gyógyszer bevezetését megelőzően. A HTA kiér-

68

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA tékelési rendszereket először a nagy gyógyszercégek kezdték használni, de a tendencia egyértelmű: ma már a kezdő cégek is alkalmazzák a HTA rendszert mely hosszú távon segít a befektetés és a haszon optimalizálásában mely közös érdeke mind a gyógyszercégnek, mind a befektetőknek.

14.2. PERSPEKTÍVÁK A legjobban teljesítő nagy gyógyszercégek bevételei túllépték az évi 7 milliárd USD értéket. Ezek közül az 5 legtöbb bevételt produkáló termék mindegyike 5 milliárd USD bevételt termelt. Jelenleg az FDA által több mint 200 biofarmáciai termék van engedélyezve, melyek mindegyike esélyes a már jelenleg is hatalmas és tovább növekvő piaci bevételből jelentős részt magáénak tudni. A termelési költségek, vélhetően jelentősen csökkenthetők lesznek új gazdaszervezetek bevezetésével. Konkrétan az emlős állatok sokkal költségesebb gazdaszervezetek (~10x költségesebbek) mint a sokkal egyszerűbb és könnyebben felskálázható eukarióta vagy különösen prokarióta gazdasejtek – melyek alkalmasságát a poszt-transzlációs módosulások szükségessége dönti el. Egyértelmű trend a nagy gyógyszercégek részéről a kivételes bevételt produkáló fehérje-természetű termékekbe történő jelentős befektetés. Mindazonáltal ideális esetbent a nagy gyógyszercégek integrált piaci szereplők, akik a hagyományos kis molekulasúlyú hatóanyagok (kémiai terápia) és az új, nagy molekulasúlyú hatóanyagok (biológiai terápia) termelésében egyaránt érdekeltek és aktívak. Jelenleg több mint 3000 új hatóanyag-jelölt molekula van kifejlesztés alatt vagy a klinikai tesztelés fázisában. Az FDA jelenleg fontolja újabb protokollok bevezetését a HTA mellett, úgy mint az NDA ('new drug application') és a TBI ('translational bioinformatics') melyek segítséget nyújthatnak a molekuláris interakciók előrejelzésében, ezzel minimalizálva a felfedezés és a piaci hasznosulás között eltelő időt és maximalizálva a várható nyereséget. Számos példa létezik az FDA sikeres szerepvállalására: a HAART bevezetése ('highly active anti-retroviral therapy') jelentősen csökkentette az AIDS halálesetek számát HIV+ betegek között (16,2 vs 3,7 haláleset 100,000 HIV+ betegre vetítve, az 1995 és 2007 közötti időszakban). Egy jelentős forradalom figyelhető jelenleg a ritka betegségek kutatási eredményeinek alkalmazása területén is. Az FDA és az USA törvényhozásának közös fellépése több mint 200 új biológiai hatóanyag bevezetését tette lehetővé az 1997 és 2010 közötti időszakban ritka betegségek kezelésére.

15. SZEMÉLYRE SZABOTT ORVOSLÁS Definíció A személyre szabott orvoslás legegyszerűbb megfogalmazása szerint a megfelelő gyógyszert kell adni a megfelelő betegnek. Vagyis minden egyes személynek egyéni adottságai szerint a legmegfelelőbb gyógyszert kell kapnia a legmegfelelőbb dózisban egy adott betegség esetén. Az indoklás elméleti háttére, hogy a gyógyszerfelszívódás (farmakokinetika) és a gyógyszerhatás (farmakodinamika) esetében egyaránt figyelembe lehet és kell venni az egyéni, genetikai alapon meghatározott érzékenységet (farmakogenetika). Speciális eseteiben előfordul, hogy a kezelés csak emberek szűk csoportjában hatásos. Egyének közötti különbségek A farmakokinetikai egyéni különbségei elsősorban a gyógyszerfelszívódásért felelős fehérjék (enzimek és transzporterek) genetikai különbségeiből erednek. A gyógyszerhatásban megfigyelhető egyéni különbségek más fehérjék (receptorok) genetikai különbségeihez köthetők. Az egyéni különbségek gyakran okai a klinikai fázisban megfigyelt kudarcoknak és gyógyszerek visszavonásának. Jól ismert példák az alacsony terápiás index miatt plazma-koncentráció monitorozást igénylő gyógyszerek úgy mint az epilepszia-ellenes szerek, a digoxin, egyes kemoterápiás szerek (pl. ciklofoszfamid) és egyes immunszuppresszor szerek (pl. ciklosporin A). A farmakogenetika eredete A farmakogenetika tudománya idősebb, mint gondolnánk már 150 éves. Német és francia tudósok már 1866-ban felvetették, hogy a genetikai állomány döntően befolyásolhatja a kémiai folyamatokat állatokban és emberben, kódolhat enzimeket lehetővé téve hatóanyagok működését és azok lebomlását ártalmatlan anyagokká. A farmakogenetika kifejezést 1959-ben Vogel vezette be, Motulsky hatására. Az első farmakogenetikai eset az afro-amerikai népesség körében megfigyelhető primakinmediált hemolízis volt, melyért etnikai eredetű glükóz-6-foszfát dehidrogenáz hiányállapot felelős. A citokróm P450 rendszer központi szerepe A leginkább ájsejtekben aktív rendszer szereplői oxigént adnak szerves molekulákhoz, a xenobiotikumok lebontásának utolsó lépéseként. Ez rendszerint csökkenti a xenobiotikumok toxivitását, azonban néhány esetben ez pont fordítva történik, növelve a termék toxicitását vagy karcinogenitását. A citokróm P450 rendszer több mint 50 elemet tartalmaz, melyek közül a legnagyobb mennyiségben expresszált csoport a CYP3A család. A CYP3A4 farmakológiai jelentősége A citokróm P450 fehérjék expressziójának mintegy 30%-át teszi ki a CYP3A család expressziója és a xenobiotikumok oxidációjának mintegy 50%-át végzi. A CYP3A4 májbeli expressziós szintjében kb. 50X egyéni eltérés figyelhető meg egyes emberek között, melynek következtében kb. 20X gyógyszerürülési eltérések figyelhetők az egyes embereket összevetve. A CYP3A család legnagyobb mennyiségben jelenlevő tagja a CYP3A4, mely főleg a májban és a bélben fejeződik ki. A CYP2D6 farmakológiai jelentősége Ez az enzim szintén rendkívül kiterjedt xenobiotikum csoport feldolgozásában vesz részt. Ez az enzim rendkívül nagy, 100x metabolikus aktivitás-különbséget mutat a populációban. Összesen 53 allélja

70

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA ismert, melyek között szerepel génduplikáció illetve 48 esetben szekvencia-különbség. A CYP2D6 több mint 30 hatóanyag metabolizmusában rendelkezik fontos szereppel, beleértve a debrisoquin hatóanyag-modellt is. A CYP2C19 farmakológiai jelentősége A citokróm P450 rendszer ezen tagja a gyomorfekély kialakulását okozó Helicobacter pylori (HP) kezelésében kap fontos szerepet. Amennyiben metabolikusan igen aktív CYP2C19 enzimmel rendelekző egyén proton-pumpa gátló (PPI) szert kap a HP-eradkiációs kezelés részeként, akkor rendkívül magas az esélye (kb. 97%) az eradkiáció sikertelenségére. Ennek oka, hogy a PPI mint xenobiotikum lebomlása a CYP2C19 enzimen keresztül történik, vagyis kifejezett metabolikus aktivitás esetén jelentősen csökken a gyógyszer effektív koncentrációja, annak hatástalanságát, végső soron pedig a HP-eradikáció kudarcát okozva. Ennek megfelelően HP-eradikáció esetében javasolt a CYP2C19 allél meghatározása, és szükség esetén a PPI dózis emelése, a HP-eradkiáció sikere érdekében. A CYP2C19 esetében a csökkent metabolikus aktivitás is probléma forrása lehet. Vérrög-képződés gátlására használt szer a clopidogrel (vérlemezke-gátlószer), melynek aktív formáját a CYP2C19 enzimen keresztüli átalakulás szolgáltatja. Amennyiben alacsony a CYP2C19 metabolikus aktivitás, elégtelen koncentrációban lesz jelen a vérlemezke-gátlószer, mely vér fokozott rögösödéséhez vezethet. Ezért clopidogrel szedése esetén is javasolt a CYP2C19 allél meghatározása, és szükség esetén a clopidogrel dózis emelése vagy más jellegű gyógyszer használata, a vérrögképzőséd megelőzése érdekében. A CYP2C9 farmakológiai jelentősége Bizonyos citokróm P450 enzimek esetében nem xenobiotikumok, hanem endogén faktorok metabolizmusának eltérései rendelkeznek farmakológiai jelentőséggel. Bizonyos CYP2C9 allélok esetében egyes alvadási faktorok szintje alacsonyabb. Az alacsonyabb szint egészséges alvadási rendszer esetében nem okoz eltérést, mivel az alvadási rendszer jelentős biztonsági tartalékokkal rendelkezik. Azonban alvadásgátló-kezelés esetén figyelembe kell venni. Jelenleg az FDA ajánlása szerint CYP2C9 allélmeghatározás szükséges warfarin (K-vitamin antagonista alvadásgátló) használata előtt. Bizonyos allélok esetében ugyanis szokásos dózisnál jóval kisebb (akár 1/10x) használata szükséges, megelőzve fokozott vérzékenység kialakulását. Egyéb CYP450 rendszeren kívüli fontos xenobiotikum-metabolizáló elemek Kétségtelenül döntő szerepe van a CYP450 rendszernek számos hatóanyag metabolizmusában, azonban számos egyéb rendszer is fontos részt kap a folyamatban. Ezek közé tartoznak – a teljesség igénye nélkül – a dihidropirimidin-dehidrogenáz (DPD), a glükóz-6-foszfát dehidrogenáz (G6PD), az arilamin N-acetil-transzferáz (NAT1), a tiopurin S-metil-transzferáz (TPMT) és az uridin difoszfát glükuronil-transzferáz (UGT). A CYP450 rendszeren kívüli metabolikus rendszerek allélpolimorfizmusai és azok metabolikus következményei jelenleg kevésbé ismertek, azonban egyértelműen hozzájárulnak az egyéni gyógyszer-metabolizmus variancia növeléséhez.

15.1. DAGANATOK KEZELÉSE SZEMÉLYRE SZABOTT ORVOSLÁS SZERINT Genetikai háttér A farmakogenomika felhívja a figyelmet arra, hogy az egyének közötti genetikai különbségek komoly behatással lehetnek egy adott szer szükséges dózisára és a kezelés sikerességére. A daganatok

SZEMÉLYRE SZABOTT ORVOSLÁS ezen túlmenően egy további komplexitási szintet mutatnak: jelentős genetikai variabilitást mutatnak ugyanazon egyénen belül is! Ennek megfelelően az egyes daganatok genetikai jellemzése lehet szükséges a konkrét terápiás protokollra adott válaszkészség meghatározásáhaz. Kemoterápiás rezisztencia és az MDR1 Egyes becslések szerint a daganatok akár 75%-a rezisztenssé válhat több különböző kemoterápiás szerre. A rendkívül sokféle daganattípus esetében az egyik közös tényező rezisztencia kialakulása esetén a P-glikoprotein sejtpumpa-fehérje fokozott expressziója. A Pgp fehérje génje az MDR1 (multidrug resistance 1) és fiziológiás körülmények között a Pgp jellemzően a máj, tüdő, vese, bélszövetben illetve a vér-agy gát területén fejeződik ki, a toxikus anyagok fokozott koncentrációja vagy a szövet fokozott érzékenysége miatt. A Pgp rendkívül sokféle hatóanyagot képes sejtekből kimpumpálni, ezzel megakadályozni hatását, a xenobiotikumok közel 30%-a lehet szubsztrát. Az MDR1 15 polimorfizmusa ismert jelenleg, közülük azonban csak egy okoz csökkent Pgp aktivitást. A polimorfizmusok etnikai megoszlása szélsőséges: míg kaukázusi / ázsiai emberekben a populáció 20-47%-a rendelkezik csökkent Pgp aktivitással, ugyanez az arány csak 6% afro-amerikai emberekben. Jelenlegi tudásunk szerint nem ismert szelektív Pgp-gátló hatóanyag. Genetikai variációk hatása a kemoterápiás válaszra Az egyik közismert gén, melynek mutációja hatással lehet kemoterápiás válaszra a BRCA1 (breast cancer 1) gén, mely egy tumor szuppresszor gén. A BRCA1 szabályozza a Bcl-2 apoptózist gátló fehérje expresszióját, melynek nagyon fontos szerepe van a daganatok túlélésében kemoterápiás kezelés során. Ezért olyan BRCA1 mutációk esetében, melyek fokozott Bcl-2 aktivitáshoz vezetnek, jelentősen megnövekszik a mellrák kialakulásának kockázata. Ilyen mutáció esetén nőkben a mellrák kialakulásának valószínűsége rendkívül magas: 50-80%-ra tehető a teljes élethosszra vetítve. Férfiak esetében a prosztata-daganatok vonatkozásában ismert hasonló jelenség. Az SRD5A2 gén terméke a 2,5 alfa-reduktáz, mely a dihidrotesztoszteron (DHT) konverzióját végzi. A fehérjék aktivitásának függyvényében változhat a DHT szintje, mely befolyásolja jóindulatú prosztatamegnagyobbodás (BPH) kialakulását. A BPH a prosztata karcinóma előszobájának is tekinthető, ezért BPH esetén fokozott karcinóma kialakulásának veszélye. A finasteride hatóanyagot BPH kezelésére javallják. Azonban mivel az SRD5A2 aktivitásában a jelenleg ismert 10 allél polimorfizmus akár 200x aktivitás-különbséget is mutathat, a finasteride hatékonyságában is kb. 60X figyelhető meg. A farmakogenomika jelentősége a váralvadásra ható gyógyszerek esetében Fent kifejtésre került a CYP2C9 aktivitásának kérdésköre, mely befolyásolja bizonyos endogén alvadási faktorok szintjét, meghatározva a véralvadás hatékonyságát, illetve alvadásgátló hatóanyag dózisát, annak szükségessége esetén. Az alábbiakban további farmakogenomikai példák találhatók a véralvadási rendszer vonatkozásában. Magas vérnyomás betegség esetében gyakran használt gyógyszercsoport a beta-adrenerg receptor blokkoló és az angiotenzin konvertáz enzim (ACE) gátló család. Azonban létezik egy olyan ACE polimorfizmus, mely esetében hiányzik a gén egy szakasza, deléció következtében (ACE D). Ez elméletben kedvező hatású lehetne a vérnyomás alakulásár, azonban jelenleg ismeretlen okból szignifikánsan rosszabb ACE D allél esetén a túlélés esélye, hacsak a beteg nem részesül beta-adrenerg receptor blokkoló kezelésben. A statisztikai összefüggés többször beigazolódott, ezért beta-adrenerg receptor blokkoló kezelés javallt minden érrendszeri eseményt követően ACE D allél esetében, bár a pontos mechanizmus megértése még várat magára.

71

72

FEHÉRJÉK ÉS GÉNEK GYÓGYSZERRÉ ALAKÍTÁSA Menopausa után nők esetében megnövekszik az érrendszeri esemény kockázata, mely hormonpótlással (ösztrogén) megelőzhető. Azonban az ösztrogén egyben protrombotikus (alvadást fokozó) hatással is rendelkezik. Ezért hormonpótlás megkezdése előtt fontos lehet olyan protrombin allélok jelenlétének ismerete, melyek fokozott aktivitással rendelkeznek. Protrombin esetében ismert, hogy a 20210 G>A szubsztitúció jelentősen növeli a protrombin aktivitását és így a hormonpótlás a várt hatással ellenkezőleg, fokozhatja érrendszer iesemény kialakulásának kockázatát. 'A megfelelő gyógyszer a megfelelő betegnek' Ma már ismert néhány példa, melyek tökéletesen bemutatják a személyre szabott orvoslás jövőjét – már ma. Az egyik példa az ALK mutáció lehetséges kezelése. A tüdődaganatok rosszul reagálnak kemoterápiás kezelésre, daganat-remisszió csak az esetek átlagosan 10%-ban figyelhető meg. Egy kivételt képeznek az ALK (EML4-ALK fúziós gén) mutációval rendelkező daganatok, melyekre specifikusan és szelektíven ható gyógyszer a crizotinib (Xalkori). ALK mutáció esetében crizotinib kezelésre 60%-os daganat-remisszió várható, mey hatalmas előrelépés a tüdődaganatok kemoterápiás kezelésében. Azonban mivel a kezelés rendkívül drága és csak ALK mutáció esetében érdemes használni, mindenképpen szükséges a daganat genetikai jellemzése és ALK mutáció azonosítása még kezelés előtt. Egy másik közismert példa a trastuzumab (Herceptin) sikere, emlőrák kezelésében. A kezelés specifikusan és szelektíven hat ebben az esetben is, célfehérjéje a HER2/neu. Az emlődaganatok kb. 30%-a fejezi ki a HER2/neu fehérjét és a kezelés rendkívül drága, ezért ebben az esetben is szükséges a daganat genetikai jellemzése, erbB-2 aktivitás igazolása a kezelés megkezdése előtt. Egy harmadik sikeres példa az imatinib (Gleevec) esete, mely specifikusan és szelektíven a Philadelphia-kromoszóma (FIP1L1-PDGFRalfa fúziós gén) termékeként kifejeződő kinázra hat, bizonyos krónikus myeloid leukemia (CML) esetekben. Akárcsak a fenti példákban, itt is feltétlenül szükséges a daganat genetikai analízise és Philadelphia-kromoszóma kimutatása a drága, sikeres kezelés megkezdése előtt.