FEHÉRJÉK A MÁGNESEKBEN
Bodor Andrea ELTE, Szerkezeti Kémiai és Biológiai Laboratórium
Alkímia Ma, Budapest, 2013.02.28.
I. FEHÉRJÉK: L-α aminosavakból felépülő lineáris polimerek
H3N+
α
H2N CH COOH amino csoport
R
karboxil csoport
CH COO_ R
ikerionos szerkezet
R-oldallánc: Savas (Glu) Bázikus (Arg) Apoláris (Leu) Poláris (Ser) L-alanin D-alanin ikerionos szerkezet
20 természetes aminosav
Hogyan alakulnak ki a láncok? Két aminosav maradék között amid-, vagy peptid kötés:
Peptidek: görög πεπτίδια , kis emészthető rövid láncok (< 50 aminosav, de vannak kivételek) Fehérjék, proteinek: görög proteios, első polipeptid láncok
A fehérje szerkezete Elsődleges szerkezet: aminosavak sorrendje, szekvenciája pld. Ubikvitin, 76 aminosav, 8.5kDa: MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYN IQKESTLHLVLRLRGG Másodlagos szerkezet: peptidgerinc lokális rendezettsége (leggyakoribb az α-hélix, β-redő), hidrogénhidak stabilizálják Harmadlagos szerkezet: a polipeptidlánc teljes térbeli konformációja; hidrofób kölcsönhatások stabilizálják.
A másodlagos szerkezeti elemek rendezetlen szakaszokkal váltakoznak.
A fehérje szerkezete Nincs rendezett szerkezet: IUP (intrinsically unstructured proteins)
Fehérje feltekerdés (folding): az a folyamat, melynek során a fehérjék felveszik a natív szerkezetük
Negyedleges szerkezet: alegységek jelenléte
Miért fontos tanulmányozni a fehérjéket? Betegségek megértése Alzheimer kór (AD): β-amiloid aggregáció Creutzfeldt-Jakob szindróma, vagy kergemarhakór: prion fehérjék hibás feltekeredése (misfold)
Hozzásegít hatékonyabb gyógyszerek tervezéséhez
Megválaszolandó kérdések: Mi a fehérje szerkezete? Milyen mozgások jellemzik? Milyen kölcsönhatásokban vesz részt? Mi a funkciója?
Atomi szintű jellemzés oldatfázisban: NMR spektroszkópia
II. Az NMR spektroszkópia
1nm
hullámhossz:
frekvencia:
1018
1mm
1μm
1012
1015
1m
1km
1GHz
1MHz
109
106
energia: γ-
X- UV sugarak sugarak
IR
rádiótávoli mikroIR hullámok hullámok
rezgések e- - mágneses mag - mágneses belső külső mag átmenetek átmenetek elektronok elektronok forgások átmenetek
Mössbauer
Optikai spektroszkópia
ESR
NMR
Az NMR spektroszkópia és a periódusos rendszer
Fehérjék: 1H, 13C, 15N
Ha magspin nem nulla (I≠0): NMR aktív mag I=0, ha n=2x, p=2y (például 12C, 16O) Szinte minden elemnek van NMR aktív izotópja!
Az NMR spektroszkópia alkalmazási területei Gyógyszer kutatás Kémia: szerkezet, konformáció
Analitika: eredet, minőség
Szerkezeti biológia dinamika
-omika: metabolomika
MRI
A készülék
500 MHz, ELTE
700 MHz, ELTE
A műszer felépítése
Szupravezető mágnes, mérőfej, Rádió adó, rádió vevő, analóg-digitál konverter (ADC) Számítógép
III. Fehérje a mágnesben – a minta
Izotóp jelölés: fehérje expresszió 13C, 15N, 2D jelölés
Mérések: 2D, 3D, nD
A maximális mérettartomány: kb. 255 kDa
Térerő: 11,7 – 23,5 T 500 MHz – 1GHz
a) Szerkezet meghatározás Jelazonosítás Távolsági kényszerfeltételek Számítógépes modellezés Szerkezet finomítás 3D szerkezet
Jelazonosítás: 1H,
13C, 15N
kémiai eltolódás meghatározás 1H-1H
1H
10.0
9.0
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
(ppm)
NH,
1H-15N
aromás
alifás Hα, Hβ, Hγ
korreláció (2D)
Spinrendszer azonosítás Szekvenciális hozzárendelés
korreláció (2D) 1H-15N-13C
NH régió
korreláció (3D)
Távolsági kényszerfeltételek (NOE) 6Å
Számítógépes program: szerkezet!
b) Az NMR időskála
gerinc
ps
rotáció diffúzió domén mozgás, kinetika feltekeredés
ns
NOE, R1,R2
μs
ms
R1ρ,CPMG
s
103s
ZZ, STD, csere
Példák
H2O
i) 15N: R1, R2, hetnoe ii) -NH – H2O csere
i) A gerinc dinamikájának feltérképezése 20
R2/R1
15 10 5 0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1
HETNOE
0.8 0.6 0.4 0.2 0
mobilis
-0.2 0 -0.4
15N:
R1, R2, hetnoe
mobilis
mobilis
10
20
30
40
50
60
70
Aminosav tagszám
80
90
ii) Cserefolyamatok:
-NH – H2O csere
CLEANEX ratio
2
nincs detektálható csere
5 ms 10 ms 70 ms
1.6 1.2 0.8 0.4 0 0
5
10
15
20
25
30
Aminosav tagszám
35
40
45
c) Kölcsönhatások vizsgálata: hova kötődik a partner? Homodimer, G27 N71
E26
S17
15N
jelölt
G50 T42
E44 S23
S47 F30
L8 N33 V73
E91 L32 D74 K29
Jelaszignáció előzi meg
1H-15N
mérés, HSQC
Hova kötődik a partner? G50 T42 G27 N71
E26 S47
S17
E44 S23
F30
L8 N33 V73
E91
L32 D74 K29
A 45 aminosavból álló kötőpartner nem
Homodimer Homodimer + kötőpartner : A két monomer már nem ekvivalens
15N
jelölt!
Legnagyobb kémiai eltolódás változás: leginkább megváltozott környezet (lásd G50, L8, K29)
KÖVETKEZTETÉSEK
Oldatbeli szerkezeti, dinamikai információ DE: ezek tisztított fehérje oldatok! Tudunk-e fiziológiás/közel fiziológiás körülmények között mérni? IGEN: In cell NMR
In cell mérések
In vitro In cell
In vitro
In vitro
Élő sejtben: szerkezet, viselkedés tanulmányozása
Köszönöm a figyelmet!
