Az NMR spektroszkópia a fehérjék szolgálatában
Bodor Andrea ELTE Szerkezeti Kémia és Biológia Laboratórium 2011.01.18. Visegrád
Nobel díjak tükrében 1952 Fizika: Módszer és elméleti alapok
Felix Bloch Edward Mills Purcell 1991 Kémia: Nagy felbontású NMR spektroszkópia Fourier transzformáció, 2D technika
Richard Ernst
2002 Kémia (megosztott, ½): Biológiai makromolekulák 3D szerkezete
Kurt Wüthrich
2003 Orvosi: MRI (Magnetic Resonance Imaging) felfedezése
Paul C. Lauterbur Sir Peter Mansfield
NMR = Nuclear Magnetic Resonance Mágneses magrezonancia spektroszkópia rádiófrekvenciás tartomány Mennyire könnyű egy adott NMR magot mérni? Befolyásoló tényezők: Spinkvantumszám (pld. 1/2, 1, 3/2, 5/2) Természetes előfordulás ~ 100% 1H, 19F, 31P, 27Al Nagy giromágneses állandó
Melyek az NMR aktív magok?
Mivel mérünk?
500 MHz, ELTE
700 MHz, ELTE
A műszer felépítése
Szupravezető mágnes, mérőfej, Rádió adó, rádió vevő, analóg-digitál konverter (ADC) Számítógép
Csövek 5mm 10 mm normál Shigemi nagynyomású
A jelenség Makroszkópikus kép M0 eredő mágnesezettség
β α
Alacsony energiájú állapot Magas energiájú állapot B0
Gerjesztés
(π/2)x
egyensúlyi állapot M0=Mz
gerjesztett állapot M0=My z y x
B0 z
Transzverz relaxáció (T2)
y
y
y
y
x My B0 z
x
x
y
x
y
y z
z
z
y x
1
Megszűnik az xy síkban a fáziskoherencia 0 0
-1
4
8
12
Mx = – M0 sin(ω0t) exp(– t/T2) My = – M0 cos(ω0t) exp(– t/T2)
A longitudinális relaxáció (T1)
y
Visszaépül a z irányú mágnesezettség Lassúbb mint a transzverz relaxáció A kvantitatív NMR lényeges eleme
x
z
z
z
szabad lecsengési jel (FID, Free Induction Decay)
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 -1
y
y
y
0
20
40
60
80
1
jel-idő görbe (FID) 0 0
4
8
12
-1
Fourier transzformáció FT
jel-frekvencia változás spektrum 6.0
5.6
5.2
4.8
4.4
4.0 (ppm)
3.6
3.2
2.8
2.4
2.0
1.6
Spinek közötti kölcsönhatások 1. Kémiai eltolódás B0 Indirekt mágneses kölcsönhatás a külső mágneses mező és a magspinek között, az elektronfelhőn keresztül. elektronok
2. J csatolás Magspinek között, az őket körülvevő elektronfelhő közreműködésével megjelenő indirekt mágneses kölcsönhatás.
3. Közvetlen (direkt) dipól-dipól csatolás
Magspinek közötti közvetlen mágneses kölcsönhatás.
Spektrumból nyerhető információk 1. Kémiai eltolódás 2. Csatolási állandó
1D, 2D, 3D, nD mérések
3. nOe 4. Dinamika, cserefolyamatok csatolási állandó (J érték)
félértékszélesség
multiplicitás
terület kémiai eltolódás δ=[(υM -υR)/ υR]106
Fehérje NMR: szerkezet, dinamika, kölcsönhatás, mechanizmus
másodlagos szerkezettel rendelkező fehérje
rendezetlen IUP fehérje
membránfehérje
Wcat
rendezetlen lánc és homodimer kölcsönhatás
mechanizmus
A fehérjék szerkezete
A fehérjék belső dinamikája
10-12 ps
10-9 ns
10-6 µs
10-3 ms
100 s
feltekeredés
kötések mozgásai T1, T2, NOE
domének, nagyobb szerkezeti egységek mozgásai T1ρ, CPMG, zz exch, ...
102 sec ~min
dUTPase Beáta Vértessy
Calpastatin Péter Tompa
APPase László Polgár
CCP Péter Gál
MASP-2 Péter Gál
Homeodomains Botond Penke Peptides and miniproteins Gábor Tóth
Calmodulin Ovádi Judit
DLC László Nyitray
P
Inhibitors László Gráf
S100A,MIIA Nyitrai László
RSK Reményi Attila
PAF Batta Gyula
ERD, in-cell Tompa Péter
TPPP25 Ovádi Judit
Membránfehérjék az NMR-ben A sejtmembrán szerkezete:
Ilyen összetétel mellett NMR mérésekre alkalmatlan
A membránfehérjék típusai
Membrán mimetikumok Micellák
Detergensek: SDS, DPC,DHPC NMR-ben jól mérhetők cca 40Ǻ (DPC) Hátrány: gömb alak
Bicellák
Vezikulák, liposzómák
Kettős réteg: Lipid + detergens DMPC+ DHPC DMPG + DHPC cca 80Ǻ, q=0.5 q = [lipid]/[deterg]
DMPC
Legjobb mimetikum Nagy mérete miatt NMR mérésekhez nem megfelelő
Ioncsatornák: a K+ csatorna
1
2
3
+ 4
homotetramer
5
6
+ N C
Milyen módon nyit-zár az S3B-S4 pórus? FRAGMENSEK TANULMÁNYOZÁSA a linker szerkezete DPC micellában
Fehérje elhelyezkedése a membránban K+ csatorna fragmens 13C relaxációs mérések – nehézkes
Megoldás: 31P mérések Biverståhl, 2009
TERVEK Receptorok: GLP-1R (glucanon like peptide receptor) nGLP-1R A 7TM rész kismolekulákat, peptideket köt(het)
7TM
2-3 hélix fragmens mimetikumban való jellemzése mimetikum típusa körülmények megállapítása (pH, puffer, hőmérséklet)
cGLP-1R A GPCR B1-es családjába tartozik, kötőpartnerek: peptidhormonok, neuropeptidek A ligandum kötésében, az aktiválásban: •Az extracelluláris domain vesz részt •Szerepe van az első extracelluláris loop 206-219es szegmensének
KÖSZÖNET Perczel András
Rohonczy János
Minden közreműködő munkatársnak TÁMOP
