PERBANDINGAN KOMPONEN MINYAK ATSIRI DAUN RUKU-RUKU (Ocimum tenuiflorum L) YANG DIDISTILASI MENGGUNAKAN CLEVENGER-HYDRODISLLATION DAN MICROWAVEASSISTED HYDRODISTILLATION SERTA UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DAN ANTIOKSIDAN Rismansyah 1, Yuharmen 2, Hilwan Yuda Teruna 2 1
Mahasiswa Program S1 Kimia FMIPA-Universitas Riau 2 Dosen Jurusan Kimia FMIPA-Universitas Riau Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Riau Kampus Binawidya, Pekanbaru, 28293, Indonesia
[email protected] ABSTRACT Microwave-assisted hydrodistillation was developed based on Clevengerhydrodistillation technique which used microwave as a source of energy in its refining process of essential oil. The purpose of this research was to compare these two distillation methods for isolating the oil from the leaves of Ocimum tenuiflorum L. The results showed that microwave method gave better results compare to those of Clevenger in terms of duration of process as well as product. Microwave-assisted hydrodistillation method took shorter time, 1.5 hours, whereas Clevengerhydrodistillation took much longer, 6 hours. The essential oil composition was determined by GC-MS. The main compound of essential oil of Ocimum tenuiflorum L leaves was eugenol, 25.71% and 41.75% with Clevenger-hydrodistillation and microwave-assisted hydrodistillation techniques respectively. Antimicrobial test against Escherichia coli showed that essential oil of Clevenger-hydrodistillation was more active than those of microwave-assisted hydrodistillation. Antioxidant activity using DPPH assay of the essential oil of microwave-assisted hydrodistillation was more active, with IC50 39.52 than those of Clevenger-hydrodistillation, with IC50 51.06 . Therefore, the microwave-assisted hydrodistillation method was considered to be environmentally friendly technology. Keywords : Ocimum tenuiflorum, Antibacterial, Antioxidant ABSTRAK Penggunaan microwave-assisted hydrodistillation merupakan pengembangan dari teknik Clevenger-hydrodistillation, yang melibatkan suatu energi gelombang pendek sebagai sumber energi dalam proses penyulingan. Penelitian ini dilakukan untuk menentukan metode terbaik dari dua metode ekstraksi minyak atsiri daun ruku-ruku (Ocimum tenuiflorum L). Metode microwave dan Clevenger telah dievaluasi efektivitasnya untuk mengisolasi minyak atsiri dari daun ruku-ruku (Ocimum
Repository FMIPA
1
tenuiflorum L) segar. Metode microwave-assisted hydrodistillation lebih menguntungkan dibandingkan dengan Clevenger-hydrodistillation dalam hal penyimpanan energi dan waktu isolasi. Metode microwave-assisted hydrodistillation membutuhkan waktu penyulingan selama 1,5 jam, sedangkan metode Clevengerhydrodistillation selama 6 jam. Komponen minyak atsiri hasil ekstraksi ditentukan menggunakan GC-MS. Komponen utama minyak atsiri daun ruku-ruku adalah eugenol dengan kadar 25,71% untuk metode Clevenger dan 41,75% untuk metode microwave. Uji antibakteri menunjukkan keefektifan minyak atsiri daun ruku-ruku diperoleh menggunakan Clevenger lebih baik dibandingkan dengan microwave dan paling efektif pada bakteri Escherichia coli. Uji aktivitas antioksidan terhadap radikal DPPH minyak atsiri dari microwave-assisted hydrodistillation dengan IC50 adalah 39,52 /mL dan /mL. Sedangkan metode Clevenger-hydrodistillation dengan IC50 adalah 51,06 microwave-assisted hydrodistillation dinilai sebagai teknologi yang ramah lingkungan. Kata kunci: Ocimum tenuiflorum, Antibakteri, Antioksidan. PENDAHULUAN Minyak atsiri selain digunakan sebagai bahan parfum, juga juga digunakan sebagai salah satu bahan untuk terapi berbagai jenis penyakit seperti asma, sakit kepala, dan batuk khusus yang memiliki esdragol sebagai komponen utamanya. Minyak atsiri dan ekstrak air dari rempah-rempah bersifat antioksidan (Agusta, 2000). Sifat antioksidan suatu senyawa mampu menghambat atau menunda terjadi reaksi radikal bebas akibat adanya oksigen rektif sehingga sifat tersebut menjadi penting dalam mencegah berbagai penyakit, seperti kanker dan jantung kroner (Leong et al., 2002). Penggunaan distilasi uap untuk mendapatkan minyak atsiri membutuhkan waktu yang lama (4-5 jam), perolehan rendemen kecil (1-2 %), dan terjadi pula dekomposisi beberapa komponen senyawa penyusun minyak atsiri tersebut akibat dari uap air yang panas (Lucchesi et al., 2004). Ekstraksi minyak atsiri dengan microwave dapat dilakukan dengan bebas pelarut atau air dalam jangka
Repository FMIPA
waktu yang lebih pendek (Hassanein, et al., 2011). Metode modern yang dapat meningkatkan hasil isolasi adalah mengekstrak sampel dengan bantuan gelombang ultrasonik (Ultrasonicassisted extraction/UAE) (Kwun et al., 2009) dan gelombang mikro (Microwave-assisted extraction/MAE) (Ashgari et al., 2011). METODE PENELITIAN a. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat distilasi air skala laboratorium tipe Clevenger, seperangkat Microwave MASS II merek (Sineo Microwave Chemistry Technology Co.,Ltd 2450 Mhz) dilengkapi Clevenger modifikasi, GCMS-QP2010S SHIMADZU di Laboratorium Kimia Organik FMIPA Universitas Gajah Madah (UGM), Yogyakarta, Spektrofotometer UV-VIS (Genesys 10S UV-VIS v4.002 2L9N175013), Microplate reader 96
2
well (Berthold LB-941), Benchmark™ spectrophotometer microplate (Bio-Rad, USA) dan Autoclave (All American Model No. 2X). Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun rukuruku (Ocimum tenuiflorum L) yang diperoleh dari daerah Panam, Kota Pekanbaru, Provinsi Riau. Akuades, etanol absolut, natrium sulfat (Na2SO4) anhidrat, antibiotik Amoxsan®, Nutrient Agar (Merck, VM264950 115), Nutrient Broth (Merck, VM086143 930), 1,1-difenil-1-fikril hidrazil (DPPH) dan asam askorbat. b. Bakteri uji Bakteri uji digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri Gram positif (Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus) dan bakteri Gram negatif (Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa). Bakteri diperoleh dari koleksi Laboratorium mikrobiologi Institut Teknologi Bandung. c. Isolasi minyak atsiri Sebanyak 100 gram daun rukuruku (Ocimum tenuiflorum L) kondisi segar dipotong dengan ukuran ±1 cm dan dimasukkan ke dalam labu didih volume 2000 mL, kemudian ditambahkan 1000 mL akuades hingga daun ruku-ruku terendam. Daun rukuruku didistilasi selama ± 5-7 jam meggunakan pemanas heating mantle pada suhu 100 °C hingga diperoleh distilat campuran minyak dan air didalam alat Clevenger. Pemanasan menggunakan microwave yang dimodifikasi dilakukan dengan cara memasukkan 100 gram daun ruku-ruku ke dalam dalam labu didih volume 1000
Repository FMIPA
mL dan ditambahkan 500 mL akuades. Didistilasi dilakukan selama 90 menit, temperatur 100 °C, daya 500 Watt. Minyak atsiri diperoleh ditambahkan Na2SO4 anhidrat kemudian dipisahkan, dan disimpan di dalam lemari es. Minyak atsiri diperoleh dianalisis dengan menggunakan GC-MS kemudian dilakukan uji antibakteri dan uji antioksidan. d. Uji aktivitas antibakteri Larutan Nutrient Broth (NB) berisi biakan bakteri diukur Optical Density (OD600 nm ~ 0,1) menggunakan spektofotometer UV-VIS. Pengenceran dilakukan menggunakan NaCl pisiologis 0,85 %. Sebanyak 1 mL air salin (NaCl) 0,85 % steril yang berisi biakan bakteri dari larutan Nutrient Broth (NB) dimasukkan ke dalam 15 mL Nutrient Agar (NA) steril lalu vortex sehingga bakteri tersuspensi merata. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah distrerilisasi dan dibiarkan memadat. Minyak atsiri daun ruku-ruku (Ocimum tenuiflorum L) dilarutkan dengan DMSO pada konsentrasi 100 g/disk, 200 g/disk, 500 g/disk, 800 g/disk, dan kontrol positif digunakan ® Amoxsan dengan konsentrasi 30 , larutan DMSO digunakan sebagai kontrol negatif. Sebanyak 10 µL sampel, kontrol positif dan kontrol negatif diinjeksikan pada kertas cakram. Kertas cakram diletakkan di atas permukaan media NA padat, kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C. Diameter daerah bening di sekitar kertas cakram diukur setelah inkubasi bakteri selama 24 jam.
3
e.
Uji aktivitas antioksidan
Sebanyak 2 mg minyak atsiri daun ruku-ruku (Ocimum tenuiflorum L) dilarutkan dalam 2 mL metanol sehingga diperoleh larutan induk dengan konsentrasi 1000 µg/mL (ppm). Microplate terdiri dari 8 sumur baris (A-H) dan 12 kolom (1-12). Sumur baris A dimasukkan sampel sebanyak 50 µL. Sebanyak 50 µL metanol dimasukkan pada masing-masing sumur baris B-F. Sumur baris A dipipet sebanyak 50 µL kemudian dimasukkan ke baris B, sumur baris B dipipet sebanyak 50 µL, dimasukkan ke sumur baris C, selanjutnya hingga sumur baris F. Sumur baris F dipipet sebanyak 50 µL dan dibuang. Sehingga diperoleh konsentrasi (1000, 500, 250, 125, 62.5 dan 31.25 µg/mL). Sedangkan sumur baris G-H diisi dengan metanol sebanyak 50 µL, sumur baris A-G ditambah DPPH sebanyak 80 µL dengan konsentrasi 40µg/mL. Kemudian diinkubasi selama 30 menit, selanjutnya run sampel dengan microplate reader. Data absorbansi yang diperoleh maka dapat dihitung nilai % inhibisi dengan menggunakan rumus : nh
kon ro
ampe
kon ro
HASIL DAN PEMBAHASAN a. Rendemen minyak atsiri Distilasi minyak atsiri daun ruku-ruku yang menggunakan Clevenger dan microwave menghasilkan rendemen yang berbeda. Berdasarkan pengamatan, secara garis besar tidak ada perbedaan yang besar terhadap hasil minyak atsiri. Perbedaan mendasar terletak pada sumber energi
Repository FMIPA
yang digunakan untuk pemanasan sampel dan lama waktu proses distilasi. Penggunaan alat Clevenger dilakukan selama 6 jam, sedangkan penggunaan oven microwave memerlukan waktu 90 menit. Hasil isolasi minyak atsiri daun ruku-ruku (Ocimum tenuiflorum L) menggunakan Clevenger diperoleh % rendemen (w/w) 0,2333 % dengan warna minyak kuning pekat. Isolasi menggunakan microwave diperoleh % rendemen (w/w) 0,1983 % dengan warna minyak kuning. Berdasarkan pengamatan, secara garis besar tidak ada perbedaan yang besar terhadap hasil minyak atsiri. Perbedaan mendasar terletak pada sumber energi yang digunakan untuk pemanasan sampel dan lama waktu proses distilasi. Penggunaan alat Clevenger dilakukan selama 6 jam, sedangkan penggunaan oven microwave memerlukan waktu 90 menit. b. Komposisi minyak atsiri Hasil analisis GC-MS total kandungan senyawa minyak atsiri daun ruku-ruku menggunakan Clevenger dan microwave masing-masing terdapat 26 dan 11 komponen senyawa, merupakan kelompok senyawa terpenoid (monoterpen dan seskuiterpen). Minyak atsiri menggunakan Clevenger terdapat monoterpen hidrokarbon (± 2,06 %), monoterpen teroksigenasi (± 27,71 %), seskuiterpen hidrokarbon (± 67,29 %), dan sesquiterpen teroksigenasi (± 2,96 %). Minyak atsiri menggunakan microwave terdapat monoterpen hidrokarbon ( 0,0 %), monoterpen teroksigenasi (± 43,21 %), seskuiterpen hidrokarbon (± 55,16 %), dan sesquiterpen teroksigenasi (± 1,65 %). Minyak atsiri daun ruku-ruku pada penelitian ini yang didistilasi
4
menggunakanClevenger mengandung beberapa senyawa aromatik dan terpen yaitu eugenol (25,71 %), -elemene (24,04 %), germacrene-d (16,28 %), caryophyllene (12,49 %), -copaene (5,78 %) dan komponen lain sebanyak (15,70%). Sedangkan minyak atsiri yang distilasi menggunakan microwaveasissted hydrodistillation mengandung senyawa eugenol (41,75 %), -elemene (22,72 %), germacrene-d (14,71 %), caryophyllene (10,40 %), -copaene (3,67 %) dan komponen lain sebanyak (6,75%). Komponen kandungan utama minyak atsiri daun ruku-ruku pada umumnya dari senyawa aromatik gugus fenol (eugenol 0,9-84 %), monoterpen (ocimen 29,97 %), seskuiterpen (elemene 7,5 %), keton (germacren 10,36 %) , alkohol caryophyllen (5,56.9 %) (Sastry et al., 2012; Zafarhaider, 2011; Bakkali et al., 2008). Kandungan minyak atsiri daun ruku-ruku senyawa monoterpen dan seskuiterpen juga telah dilaporkan oleh Sartoratto et al., (2004) Politeo et al., (2006), Moghaddam et al., (2011), Khelifa et al., (2012), Unnithan et al., (2013). c.
Aktivitas antibakteri
Hasil uji aktivitas antibakteri minyak atsiri daun ruku-ruku (Ocimum tenuiflorum L) menggunakan Clevenger-hydrodistillation dan microwave-assisted hydrodistillation yang telah dilakukan menghasilkan data aktif pada bakteri E.coli. Eugenol pada minyak atsiri daun ruku-ruku dapat berperan sebagai antibakteri patogen. Sehingga dapat menghambat pertumbuhan organisme uji sesuai telah dilaporkan oleh Sastry et al., (2012). Komponen utama senyawa eugenol yang tinggi dalam
Repository FMIPA
minyak atsiri pada penelitian ini diduga berperan untuk manghambat pertumbuhan bakteri. Adanya gugus fenol pada senyawa eugenol yang dapat menyebabkan kerusakan pada dinding sel bakteri. Menurut Jawetz et al., (2001) mekanisme kerja agen antimikroba adalah dengan cara merusak lapisan fosfolipid membran sel mikroorganisme tersebut yang menyebabkan adanya peningkatan permeabilitas dan kerusakan membran sel diikuti dengan pecahnya sel, sehingga menyebabkan hilangnya sejumlah konstituen. Senyawa utama eugenol dalam minyak atsiri pada penelitian ini mempunyai cincin benzen aromatis. Belletti et al. (2004) mempublikasikan aktivitas antimikroba minyak atsiri yang mengandung terpen, umumnya sebagian besar kelompok senyawa terpen dengan cincin aromatis memiliki sisi aktif yang mampu membentuk ikatan hidrogen dengan sisi aktif enzim mikroba. Begitu juga dengan alkohol, aldehid dan ester yang memberikan pengaruh pada minyak atsiri sebagai agen antimikroba. Dorman et al., (2000) menyebutkan senyawa terpen dengan gugus alkohol dalam minyak atsiri dinilai sangat efektif untuk menghambat dan membunuh mikroba. Hal ini disebabkan karna terjadinya denaturasi protein pada sel mikroba. Sehingga diduga caryophyllene yang terkandung dalam minyak atsiri daun ruku-ruku ini berpotensi sebagai agen antibakteri. d. Aktivitas antioksidan Uji aktivitas antioksidan dilakukan pada masing-masing minyak atsiri terhadap radikal DPPH dengan menggunakan microplate reader 96 well pada panjang gelombang 520 nm.
5
Uji antioksidan dengan radikal DPPH terhadap minyak atsiri daun ruku-ruku menunjukkan bahwa konsentrasi penghambatan 50 % terhadap radikal DPPH pada minyak atsiri yang diperoleh menggunakan Clevenger adalah 51,0619 µg/mL, minyak atsiri yang diperoleh menggunakan microwave adalah 39,5209 µg/mL, sedangkan vitamin C sebagai pembanding positif adalah 7,544 µg/mL. Aktivitas antioksidan minyak atsiri dari tanaman aromatik sangat dikaitkan dengan senyawa aktif di dalamnya. Hal ini dapat disebabkan oleh tingginya persentase konstituen utama, tetapi juga kehadiran konstituen lain dalam jumlah kecil atau sinergi antaranya. Senyawa terpenoid yang ada dalam minyak atsiri daun ruku-ruku ini merupakan senyawa monoterpen dan seskuiterpen. Menurut Hussain et al, (2008) kemampuan pendonor proton ke DPPH minyak ini dapat dikaitkan dengan kehadiran linalool dalam komponen kimianya. Linalool dalam minyak atsiri daun ruku-ruku ini yang diperoleh menggunakan Clevenger (1,72 %) dan microwave (1,46 %). Membandingkan hasil penelitian ini dengan yang diperoleh oleh Pripdeevech et al., (2010), melaporkan bahwa minyak atsiri dari O. basilicum mengandung senyawa eugenol memberikan aktivitas antioksidan yang sangat penting. Bahwa kehadiran senyawa fenolik dengan linalool dalam minyak atsiri meningkatkan daya antioksidan. Temuan yang sama dilaporkan oleh Dabire et al., (2011) ketika mempelajari pengaruh pengurangan eugenol untuk aktivitas antioksidan minyak atsiri, maka menyebabkan penurunan lebih dari 87% dari daya antioksidan. Dalam penelitian
Repository FMIPA
ini kandungan konstituen senyawa utamanya adalah eugenol dengan persentase sangat tinggi yaitu Clevenger (25,71 %) dan microwave (41,75 %). Ini membuktikan peran senyawa eugenol ini aktif sebagai antioksidan. KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa komponen utama minyak atsiri daun ruku-ruku yang didistilasi menggunakan Clevengerhydrodistillation dan microwaveassisted hydrodistillation adalah eugenol, masing-masing sebanyak 25,71 % dan 41,75 %. Minyak atsiri yang didistilasi menggunakan Clevenger lebih efektif sebagai antibakteri dibandingkan dengan minyak atsiri yang diperoleh menggunakan microwave, terutama pada bakteri Escherichia coli. Minyak atsiri yang didistilasi menggunakan microwave memiliki aktivitas antioksidan lebih kuat dibandingkan dengan minyak atsiri yang diperoleh menggunakan Clevenger. UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terima kasih untuk bantuan dana penelitian dari dana PNBP LPPM Universitas Riau skim Berbasis Laboratorium PNBP Tahun anggaran 2014. DAFTAR PUSTAKA Agusta, A. 2000. Minyak Atsiri Tumbuhan Tropika. Penerbit ITB, Bandung. Asghari, Jila., Ondruschka., Bernd., Mazaheritehrani., and Mohsen. 2011. Extraction of bioactive chemical compounds from the
6
medicinal Asian plants by microwave irradiation. Journal of Medicinal Plants Research 5 (4): 495-506.
Sciences Research 7 (12): 24552461.
Bakkali, F., Averbeck, S., Averbeck, D., and Idaomar, M. 2008. Biological effects of essential oils-A review. Journal Food and Chemical Toxicology (46): 446475.
Hussain A. I., Anwar F., Sherazi S. T. H., and Przybylski. R. 2008. Chemical composition, antioxidant and antimicrobial activities of basil (Ocimum basilicum) essential oils depends on seasonal variations. Journal Food Chem (108): 986-995.
Belletti, N., M. Ndagihimana, C. Sisto, M. Guerzoni, R. Lanciotti., and Gardini, F. 2004. Evaluation of the Antimicrobial Activity of Citrus Essences on Saccharomyces Cerevisae. Journal Agric. Food Chem (52): 6932-6938.
Jawetz, E., Melnick, G. E., and Adlberg, C. A. 2001. Mikrobiologi Kedokteran. Ed-1. Diterjemahkan oleh Pnerjemah Bagian Mikrobiologi Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga. Salemba Medika, Surabaya.
Dabire, C., Nebie, R. H. C., Belanger, A., Nacro, M., and Sib, F. S. 2011. Effect of drying the plant material on the chemical composition of the essential oil and antioxidant activity of extracts of Ocimum basilicum L. International Journal Biological Chemistry Sciences 5 (3).
Khelifa, L. H., Brada, M., Brahmi, F., Achour, D., Fauconnier, M. L., and Lognay, G. 2012. Chemical Composition and Antioxidant Activity of Essential Oil of Ocimum basilicum Leaves from the Northern Region of Algeria. Topclass Journal of Herbal Medicine 1 (2): 25-30.
Dorman, H. J. D., and Deans, S. G. 2000. Antimicrobial agents from plant: antibacterial activity of plant volatile oils. Journal of Applied Microbiology (88): 308316.
Kwun, K. H., Kim, G. J., and Shin, H. J. 2009. Ultrasonication Assistance Increases the Efficiency of Isoflavones Extraction from Kudzu (Pueraria lobata Ohwi) Roots Waste. Biotechnology and Bioprocess Engineering (14): 345-348.
Hassanein, H. D., Nazif, N. M., Aboutabi, E .A., and Hammouda, F. M. 2011. Solvent-Free microwave extraction and hepatoprotective activity of Cyperus eculentus L. and Cyperus articulatus essential oils. Journal of Applied
Repository FMIPA
Leong, S. G. 2002. An investigation of antioxidant capacity of fruits in Singapore markets. Journal Food Chem (76): 69-75. Lucchesi, M. E., Chemat, F., and Smadja, J. 2004. Solvent-free microwave extraction: An
7
innovative tool for rapid extraction of essential oil from aromatic herbs and spices. Journal of Microwave Power & Electromagnetic Energy. 39 (3): 135-139. Moghaddam, A. M. D., Jalal Shayegh, J., Mikaili, P., and Sharaf, J. D. 2011. Antimicrobial activity of essential oil extract of Ocimum basilicum L. leaves on a variety of pathogenic bacteria. Journal of Medicinal Plants Research 5 (15): 3453-3456. Politeo, O., Juki, M., and Milo, M. 2006. Chemical Composition and Antioxidant Activity of Essential Oils of Twelve Spice Plants. Croatica Chemica Acta 79 (4): 545-552.
2012. Morpho-chemical description and antimicrobial activity of different Ocimum species. Journal Plant Develop (19): 53-64. Unnithan, C. R., Dagnaw, W., Undrala, S., and Subban, R. 2013. Chemical composition and antibacterial activity of essential oil of Ocimum basilicum of Northern Ethiopia. International Research Journal of Biological Sciences 2 (9): 1-4. Zafarhaider. 2011. Essential oil composition and antimicrobial activity of three Ocimum species from Uttarakhand (India). International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences (3): 3.
Pripdeevech, P., Chumpolsri, P., Suttiarporn, P., and Wongpornchai, S. 2010. The chemical composition and antioxydant activities of basil from thailand using retention indices and comprehensive two dimensional gas chromatography. Journal Serbian chemical Society 75 (11): 1503-1513. Sartoratto, A., Machado, A. L. M., Delarmelina, C., Figueira, G. M., Marta Cristina T. Duarte, C. T., and Rehder, V. L. G. 2004. Composition and antimicrobial activity of essential oils from aromatic plants used in Brazil. Brazilian Journal of Microbiology (35): 275-280. Sastry, K. P., Kumar, R. R., Kumar, A. N., Sneha, G., and Elizabeth, M.
Repository FMIPA
8
