ELEKTROFORESIS DNA TOTAL DAN AMPLIFIKASI PCR FRAGMEN GEN COX3 PADA IKAN Kryptopterus limpok (Bleeker 1852) DARI TIGA SUNGAI RAWA BANJIRAN PROVINSI RIAU Vella Nurazizah Djalil1, Roza Elvyra2, Dewi Indriyani Roslim3 1
Mahasiswa Program S1 Biologi Dosen Bidang Zoologi Jurusan Biologi 3 Dosen Bidang Genetika Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Riau Kampus Bina Widya Pekanbaru, 28293, Indonesia
[email protected] 2
ABSTRACT Riau Province has the typical of floodplain river. One of the fish that live in this river ecosystem is Kryptopterus limpok. Information of molecular barcodes of mitochondrial cytochrome c oxydase subunit 3 (COX3) gene from K. limpok is still unknown. The objective of this research was to obtain the DNA fragment of the mitochondrial COX3 gene K. limpok from Kampar River, Tapung River, and Indragiri Hulu River. Total DNA isolated were taken from the muscle of fish-tail. The total DNA was electrophoresed on 1,2% agarose gel and then visualized using UV transiluminator (WiseUv WUV-M20, Daihan Scientific). PCR amplification was performed using a primer pair of COXIIIF1 (forward) 5’GCT TAG GTT TCA CCA CAA GA3’ and COXIIIR1 (reverse) 5'CGA ACA CAA ATC AGT GGT GTT CT3'. PCR condition based on Elvyra dan Duryadi (2007) with modification. Total DNA concentrations produced ranging from ±300 ng/µl and the fragment length of the mitochondrial COX3 gene K. limpok was 660 bp. Keywords : Amplification, DNA, Electrophoresis, Kryptopterus limpok, PCR ABSTRAK Provinsi Riau memiliki karakteristik sungai yang khas yaitu sungai rawa banjiran. Salah satu ikan yang hidup dalam ekosistem sungai tersebut adalah ikan Kryptopterus limpok. Informasi molekuler mengenai barkode ikan K. limpok pada gen sitokrom c oksidase sub unit 3 (COX3) mitokondria masih belum diketahui. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan fragmen gen COX3 mitokondria pada ikan K. limpok dari Sungai Kampar, Sungai Tapung, dan Sungai Indragiri Hulu. Isolasi DNA total diambil dari bagian otot ekor ikan. DNA total dimigrasikan pada 1,2 % gel agarosa dan divisualisasikan dengan UV transluminator (WiseUv WUV-M20, Daihan Scientific). Amplifikasi PCR dilakukan dengan menggunakan sepasang primer COXIIIF1 (forward) 5’GCT TAG GTT TCA CCA CAA GA3’dan COXIIIR1 (reverse) 5’CGA ACA ATC CAA AGT GGT GTT Repository FMIPA
1
CT3’. Kondisi PCR berdasarkan Elvyra dan Duryadi (2007) dengan modifikasi. Hasil yang diperoleh adalah konsentrasi DNA total berkisar ±300 ng/μl dan panjang fragmen gen COX3 yang berukuran 660 pb. Kata Kunci : Amplifikasi, DNA, Elektroforesis, Kryptopterus limpok, PCR PENDAHULUAN Provinsi Riau memiliki ekosistem sungai dengan ciri berbeda dengan sungai-sungai pada umumnya, yaitu ekosistem sungai rawa banjiran atau floodplain river (Elvyra 2009). Salah satu ikan yang hidup di ekosistem sungai tersebut adalah ikan Kryptopterus limpok. Ikan K. limpok termasuk ke dalam famili Siluridae (Kottelat et al. 1993) Masyarakat Riau mengenal ikan ini dengan nama ikan selais janggut. Berdasarkan informasi nelayan, ikan ini hanya ditemukan pada musim penghujan saja. Meskipun termasuk ikan ekonomis dan memiliki nilai komersil yang tinggi, data molekuler masih terbatas jumlahnya. Penelitian eksplorasi molekuler untuk mengetahui informasi genetik guna menunjang upaya konservasi sumber daya secara genetik. Tahapan elektroforesis DNA total dan amplifikasi PCR gen COX3 pada ikan K. limpok merupakan tahapan penting dalam mendapatkan fragmen DNA yang panjang. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan fragmen gen COX3 mitokondria pada ikan K. limpok dari Sungai Kampar, Sungai Tapung, dan Sungai Indragiri Hulu. METODE PENELITIAN Penelitian dilakukan pada bulan Maret 2014 - Januari 2015 di Repository FMIPA
Laboratorium Genetika Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Universitas Riau. Alatyang digunakan adalah gunting, pipet mikro berukuran 10 l, 100 l, dan 1000 l, tabung mikro berukuran 1,5 ml dan 2,0 ml, mesin sentrifus, vorteks, pinset, waterbath, sisir, cetakan agarosa tip mikro, mesin PCR, mesin elektroforesis horizontal, timbangan analitik, hot plate, gelas ukur, UV transiluminator, stirer, dan kamera. Bahan yang digunakan adalah 10 sampel DNA otot ekor ikan K. limpok dari Sungai Kampar, Sungai Tapung dan Sungai Indragiri Hulu. Bahan kimia yang digunakan adalah PCR Kit TopTaq dari Qiagen, buffer TE (dH2O; 1 MTrisHCl pH 8,0; 0,5 M EDTA pH 8,0), akuabidestilata, primer COXIIIF1 (forward) 5’GCT TAG GTT TCA CCA CAA GA3’ dan primer COXIIIR1 (reverse) 5’CGA ACA ATC CAA AGT GGT GTT CT3’, buffer TBE (TrisBorate; EDTA) 1x,etidium bromida, loading dye, gel agarosa 1,2%, dan 1 kb DNA ladder. a. Elektroforesis DNA Total Sepuluh sampel otot ekor ikan K. limpok dari masing-masing sungai di yang telah diisolasi di Laboratorium Genetika Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Universitas Riau diperiksa kualitas dan kuantitasnya melalui proses elektroforesis (Fison Mode FEC 360, 2
Large Horizontal Gel System), yaitu dengan memigrasikannya pada gel agarosa 1,2% dalam buffer TBE 1x pH 8,0 pada 75 Volt selama 45 menit. Gel hasil elektroforesis diwarnai dengan 2µg/50ml etidium bromida, lalu divisualisasikan diatas lampu UV (WiseUv WUV-M20, Daihan Scientific) dan difoto menggunakan kamera (Olympus SP-500 UZ). b. Amplifikasi PCR Fragmen Gen COX3 Molekul DNA total yang telah dielektroforesis kemudian diamplifikasi menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Amplifikasi PCR menggunakan bahan PCR Kit TopTaq dari Qiagen dan sepasang primer COXIIIF1 (forward) 5’GCT TAG GTT TCA CCA CAA GA3’ dan primer COXIIIR1 (reverse) 5’CGA ACA ATC CAA AGT GGT GTT CT3’ yang sebelumnya dilarutkan dengan buffer TE dan diencerkan dengan akuabidestilata. Komposisi komponen PCR yang dipakai meliputi : Tabel 1. Komposisi komponen PCR Komponen CoralLoad primer forward primer reverse TopTaq Mastermix dH2O DNA sampel ikan Total
[ ] akhir 10× 10 µM 10 µM 2x 300 ng/µl
Volume (µl) 5 1 1 15 25 3 50
Kondisi PCR menurut Elvyra dan Duryadi (2007) dengan beberapa modfikasi meliputi pra PCR dengan suhu 94°C selama 5 menit, PCR 35 siklus dengan tahap: denaturasi pada Repository FMIPA
suhu 94°C selama 1 menit, penempelan primer pada suhu 51,6°C selama 1 menit, pemanjangan pada suhu 72°C selama 1 menit, dan post PCR dengan suhu 72°C selama 5 menit. Setelah dilakukan PCR, kemudian dielektroforesis untuk melihat hasil PCR. HASIL DAN PEMBAHASAN a.
Molekul DNA Total
Elektroforesis dilakukan untuk melihat keutuhan DNA total. Hasil elektroforesis DNA total dari sampel 10 sampel ikan dari masing-masing sungai tidak semua menghasilkan pita. Dari 10 sampel masing-masing sungai didapatkan 4 sampel dari Sungai Kampar, 3 sampel dari Sungai Tapung, dan 2 sampel dari Sungai Indragiri Hulu (Gambar 1.). Sampel yang berhasil dielektroforesis ditunjukkan dengan adanya satu pita utuh dengan konsentrasi DNA total berkisar 300 ng/l pada tiap sampel dari ketiga sungai. Hal ini menunjukkan bahwa amplifikasi berjalan dengan baik meskipun pita yang memiliki ketebalan yang berbeda.
Gambar 1. Hasil elektroforesis DNA total sampel ikan K. limpok yang telah diisolasi. Keterangan : (M) DNA ladder; (A) Sungai Kampar; (B) Sungai
3
Tapung; (C) Sungai Indragiri Hulu b.
Fragmen Gen COX3
Molekul DNA total hasil elektroforesis dijadikan cetakan DNA untuk amplifikasi gen COX3 dengan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Teknik PCR adalah suatu teknik atau metode enzimatis untuk memperbanyak suatu sekuen nukleotida tertentu secara in vitro (Yuwono 2006). Teknik PCR pertama kali ditemukan oleh Kary B. Mullis tahun 1985 yang memungkinkan adanya perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA antara dua primer hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannnya ke dalam sel (in vivo). Reaksi perbanyakan potongan DNA ini dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida yang bertindak sebagai forward dan reverse (Zein & Prawiradilaga 2014). Fragmen DNA dari gen COX3 yang diperoleh berukuran 660 pb (Gambar 2.). Hal ini menunjukkan bahwa proses amplifikasi berjalan dengan baik dan menghasilkan fragmen yang berukuran panjang. Menurut Zein & Prawiradilaga (2014), berhasil atau tidaknya amplifikasi daerah target sangat ditentukan oleh kondisi primer, penempelan primer pada DNA genom sampel yang digunakan. Selain itu, juga dipengaruhi oleh bahan pereaksi PCR. Ratnayani et al. (2007) mengemukakan bahwa dihasilkannya pita tunggal menandakan pasangan primer yang digunakan bersifat spesifik dan menempel pada posisi yang diharapkan (pada kondisi annealing yang digunakan). Repository FMIPA
Gambar 2. Hasil amplifikasi PCR fragmen gen COX3 ikan K. limpok. Keterangan: (M) DNA ladder; (A) Sungai Kampar;(B) Sungai Tapung; (C) Sungai Indragiri Hulu KESIMPULAN Dari 10 sampel otot ekor ikan K. limpok yang memiliki DNA total utuh dan tidak smear ada sebanyak 4 sampel dari Sungai Kampar, 3 sampel dari Sungai Tapung, dan 2 sampel dari Sungai Indragiri Hulu Provinsi Riau. Konsentrasi DNA total berkisar ±300 ng/µl. Fragmen gen COX3 yang didapat dari amplifikasi PCR berukuran 660 pb. Fragmen yang panjang selanjutnya dapat digunakan untuk analisis kekerabatan dan keanekaragaman genetik. UCAPAN TERIMA KASIH Penulis mengucapkan terima kasih kepada DP2M DIKTI yang telah mendanai penelitian ini melalui Hibah Kompetensi tahun anggaran 2015 atas nama Dr. Roza Elvyra, M.Si dan Dr. Dewi Indriyani Roslim, M.Si. DAFTAR PUSTAKA Elvyra R, Duryadi D. 2007. Kajian penanda genetik gen sitokrom b dna mitokondria ikan lais dari
4
Sungai Kampar Riau. J. Natur Ind 10: 6-12. Elvyra R. 2009. Kajian keragaman genetik dan biologi reproduksi ikan lais di Sungai Kampar Riau [disertasi]. Bogor: Program Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor. Kottelat M, Whitten AJ, Kartikasari SN, Wirdjoatmodjo S. 1993. Freshwater Fishes of Western Indonesia and Sulawesi. Jakarta: Periplus Edition (HK) inCwith The Environment Rep. of Indonesia.
Repository FMIPA
Ratnayani K, Wirajana IN, Laksmiwati AAIAM. 2007. Analisis variasi nukleotida daerah D-loop DNA mitokondria pada satu individu suku bali normal. Jurnal Kimia 1 (1): 7-14. Yuwono T. 2006. Teori dan Aplikasi PCR. Yogyakarta: Penerbit Andi. Zein MSA, Prawiradilaga DM. 2014. DNA Barcode Fauna Indonesia. Jakarta: Kencana.
5
