FÁJDALOMBAN SZEREPET JÁTSZÓ MECHANIZMUSOK KOMPLEX ÁLLATKÍSÉRLETES VIZSGÁLATA

FÁJDALOMBAN SZEREPET JÁTSZÓ MECHANIZMUSOK KOMPLEX ÁLLATKÍSÉRLETES VIZSGÁLATA

EGYETEMI DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS

TÉKUS VALÉRIA

Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet

Gyógyszertudományok Doktori Iskola Neurofarmakológiai Program Doktori iskolavezető: Dr. Pintér Erika Programvezető: Dr. Pintér Erika Témavezetők: Dr. Helyes Zsuzsanna, Dr. Pethő Gábor

2014.

TARTALOMJEGYZÉK oldalszám RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

4

ÁLTALÁNOS BEVEZETÉS Fájdalom, nocicepció, hiperalgézia, allodínia Kapszaicin-érzékeny érzőideg végződések Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 (TRPV1) és Ankirin (TRPA1) receptorok felépítése és funkciója Új típusú analgetikumok fejlesztésének indokoltsága In vivo állatmodellek alkalmazásának indokoltsága ÁLTALÁNOS CÉLKITŰZÉSEK AZ ALKALMAZOTT MÓDSZEREK ÁLTALÁNOS BEMUTATÁSA Termonocicepció: fájdalmas hőküszöb mérésen alapuló módszerek A mechanonocicepció vizsgálata a talp érintési érzékenységének mérésével Egyéb in vivo vizsgálati módszerek Lábtérfogati változások mérése A spontán súlyeloszlás vizsgálata A spontán lokomotoros aktivitás vizsgálata A motoros koordináció vizsgálata In vitro vizsgálati módszerek Gyulladásos neuropeptidek és citokinek meghatározása szövet homogenizátumokból Etikai vonatkozások

6 6 7

1.FEJEZET: TRPV1 RECEPTOR AGONISTÁK DESZENZIBILIZÁLÓ ANTINOCICEPTÍV HATÁSAINAK VIZSGÁLATA FÁJDALMAS HŐ- ÉS HIDEGKÜSZÖB MÉRÉSÉVEL PATKÁNYBAN IRODALMI HÁTTÉR, ELŐZMÉNYEK A kapszaicin, RTX és deszenzibilizáció N-oleoildopamin CÉLKITŰZÉS KÍSÉRLETI MODELLEK Kísérleti állatok A termonociceptív küszöbök meghatározása Az érzőideg végződés deszenzibilizációjának vizsgálata TRPV1 receptor deszenzibilizációjának vizsgálata Felhasznált anyagok Statisztikai analízis EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉS

8 11 12 13 13 13 15 16 16 16 17 17 17

18

19 19 20 21 21 21 21 21 22 23 23 24 28

2. FEJEZET: TRPV1 ANTAGONISTÁK HATÁSAINAK VIZSGÁLATA PATKÁNYMODELLBEN IRODALMI HÁTTÉR, ELŐZMÉNYEK 32 CÉLKITŰZÉS 33 KÍSÉRLETI MODELLEK 33 Kísérleti állatok 33 RTX által kiváltott nociceptív hőküszöbcsökkenés 33 Enyhe hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenés 34 Plantáris incízióval kiváltott hőküszöbcsökkenés 34 RTX indukálta hiperalgézia mérése Plantar Test készülékkel (latenciaidő mérés) 35 Felhasznált anyagok 35 Statisztikai analízis 36 EREDMÉNYEK 36 TRPV1 antagonisták hatásai a termonocicepciós küszöbök vizsgálatakor 36 RTX által kiváltott hőküszöbcsökkenés gátlása 36 Az enyhe hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenés gátlása 37 A plantáris bőr-izom incízió okozta hőküszöbcsökkenés gátlása 39 TRPV1 receptor antagonisták hatása az alap hőküszöbre 40

2

TRPV1 antagonisták hatásai RTX által kiváltott latenciaidő-csökkenésre MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉS

40 41

3. FEJEZET: A TRPV1 ÉS TRPA1 RECEPTOROK SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA AZ ALAP HŐÉRZÉKELÉSBEN ÉS MUSTÁROLAJ ÁLTAL KIVÁLTOTT HIPERALGÉZIA MODELLBEN RECEPTOR GÉNHIÁNYOS EGEREK FELHASZNÁLÁSÁVAL BEVEZETÉS, IRODALMI HÁTTÉR 46 CÉLKITŰZÉS 47 KÍSÉRLETI MODELLEK 48 Kísérleti állatok 48 Felhasznált anyagok 48 Előkísérletek és módszertani fejlesztések 48 Az alap termonociceptív küszöbök meghatározása 49 Mustárolaj által kiváltott termális hiperalgézia vizsgálata 49 Mustárolaj hatására kialakuló mechanikai hiperalgézia vizsgálata 49 Mustárolaj hatására kialakuló akut nocifenzív reakció 49 Statisztikai analízis 50 EREDMÉNYEK 50 Előkísérletek 50 Alap (kontroll) hőküszöb értékek meghatározása 51 Mustárolaj által kiváltott termális hiperalgézia meghatározása 52 Mustárolaj által kiváltott mechanikai hiperalgézia meghatározása 53 Mustárolaj által kiváltott akut nocifenzív reakció meghatározása 54 MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉS 55 4. FEJEZET: A KOMPLEX REGIONÁLIS FÁJDALOM SZINDRÓMA (CRPS) PASSZÍV TRANSZFER-TRAUMA EGÉRMODELLJE IRODALMI HÁTTÉR, ELŐZMÉNYEK Neuro-immun interakciók A CRPS klinikai jellemzői CÉLKITŰZÉS KÍSÉRLETI MODELLEK ÉS VIZSGÁLATI MÓDSZEREK Vizsgálati alanyok és mintagyűjtés Kísérleti állatok Kísérleti protokoll Plantáris bőr-izom incízió Vizsgálati módszerek EREDMÉNYEK Mechanikai hiperalgézia Lábduzzadás Hő- és hideghiperalgézia Spontán súlyeloszlás Spontán lokomotoros aktivitás és motoros kordináció Talphőmérséklet és testsúlyváltozás Lábhomogenizátumokban mért gyulladásos neuropeptidek és citokinek koncentrációja Potenciálisan befolyásoló tényezők MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉS

59 59 59 62 62 62 62 63 64 64 66 67 68 69 69 69 70 71 71 73

ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA

76

IRODALOMJEGYZÉK

78

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

93

PUBLIKÁCIÓS LISTA

94

3

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

ATP: adenozin-trifoszfát AITC: allyl-isothiocyanate / allil-izotiocianát ANOVA: analysis of variance / variancia-analízis BK: bradikinin B2: bradikinin receptor 2 CGRP: Calcitonin- gene-related-peptide / calcitonin gén-rokon peptid CKK: kolecisztokinin COX-2: ciklooxigenáz CRPS: Complex Regional Pain Syndrome / Komplex Regionális Fájdalom Szindróma CZP: kapszazepin DMSO: dimetil-szulfoxid H2S: hidrogén-szulfid IASP: International Association for the Study of Pain / Fájdalomkutatás Nemzetközi Szervezete IC: intracelluláris IgG: immunglobulin G i.p.: intraperitoneális i.pl.: intraplantáris LCS: latenciaidő-csökkenés MO: mustárolaj MED: minimális effektív dózis NSAID: non-steroidal anti inflammatory drug / nem szteroid gyulladáscsökkentő szer NKA: neurokinin A NGF: nerve growth factor / idegi eredetű növekedési faktor NMR: nucleus raphe magnus OLDA: N-oleoildopamin PACAP: pituitary adenylate-cyclase-activating polypeptide / hipofízis-adenilát-ciklázaktiváló polipeptid PAG: periaquaeductal grey matter/ periaquaduktális szürkeállomány PAR: proteáz aktiváló receptor PG: prosztaglandin 4

PGE2: prosztaglandin-E2 PKA: protein-kináz-A PKC: protein-kináz-C PLC: foszfolipáz-C PIP2: foszfatidilinozitol 4,5-biszfoszfát RIA: radioimmunassay RTX: reziniferatoxin SEM: standard hiba SP: substance P / P-anyag TNF-α: tumor nekrózis faktor alfa TRP: tranziens receptor potenciál TRPV1: tranziens receptor potenciál vanilloid 1 TRPA1: tranziens receptor potenciál ankirin 1 VR1: vanilloid receptor 1

5

Általános bevezetés Fájdalom, nocicepció, hiperalgézia, allodínia A fájdalomkutatás nemzetközi szervezete (International Association for the Study of Pain, IASP) az alábbiak szerint definiálja a fájdalom fogalmát: egy kellemetlen szubjektív érzéskvalitás, mely tényleges vagy potenciális szövetkárosodást jelez. Neurobiológiai komponensével, a nocicepcióval, (a fájdalmas stimulus percepciója) illetve affektív komponensével (fájdalom emociója) jellemezhető, ez utóbbi azonban csak emberekben vizsgálható. Állatkísérletek során a nociceptorok aktiválódását, illetve a fájdalmas stimulusra adott elhárító (nocifenzív) magatartást tudjuk vizsgálni. A nociceptorok, melyek szövetkárosító ingerekre specifikusan reagáló szenzoros idegvégződések, többféle szempontból csoportosíthatók. Érzékenység alapján megkülönböztethetünk unimodális (csak termális vagy mechanikai ingerekkel stimulálható) illetve polimodális (hő-, mechanikai

és

kémiai

ingerekkel

egyaránt

aktiválható)

receptorokat.

Axonjaik

mielinizáltsága alapján vékonyan mielinizált, gyorsan vezető (12–30 m/s) Aδ nociceptorokra, és mielinhüvely nélküli, lassan vezető (0,5–2 m/s) rostokkal rendelkező C nociceptorokra oszthatjuk őket. A perifériás nociceptorok olyan primer afferens neuronok végződései, melyek sejttestjei a gerincvelő hátsógyöki illetve trigeminus ganglionokban találhatók. Ezek perifériás nyúlványai alkotják a fájdalomérző idegrostokat, míg centrális nyúlványaik a központ felé a gerincvelő hátsó szarvába vagy a nucleus tractus spinalis nervi trigeminibe továbbítják az ingerületet. A fájdalom időtartama alapján lehet akut, illetve krónikus. Az akut fájdalom a szervezet legfontosabb védekező mechanizmusa, mely a szövetek valamilyen károsodására hívja fel a figyelmet, csillapítása az egyik legfontosabb tüneti kezelés. Krónikus fájdalomról beszélünk, ha az több mint három hónapig fennáll. Ez a fájdalomállapot lehet konstans (pl. malignus tumor esetében), illetve intermittáló (pl. migrén). Az enyhe fájdalmas ingerek által kiváltott fokozott fájdalomérzetet hiperalgéziának nevezzük, míg a nem fájdalmas stimulusokkal kiváltott patológiás fájdalomérzet az allodínia (Merskey és Bogduk 1994). Mind a mechanikai, mind pedig a termális allodínia és hiperalgézia kialakulhat gyulladás illetve eltérő eredetű (traumás, toxikus) centrális vagy perifériás idegsérülés hatására, melyek a szomato-szenzoros vagy a spino-talamo-kortikális pályarendszer bármely szintjén létrejöhetnek (Tajti és Vécsei 2006).

6

Kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések A perifériás nociceptorok egy nagy csoportját, kb. 50-70%-át alkotják a kapszaicinérzékeny érzőideg-végződések (Holtzer és mtsai. 1991). Nevüket a csípős paprika alkaloidjáról, a kapszaicinről kapták, mivel ezen idegvégződések membránjában lokalizálódik receptora, a Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 (TRPV1) ioncsatorna (lásd később). Ezek az érzőideg-végződések egyedülálló módon ún. hármas funkcióval rendelkeznek: egyrészt a klasszikus afferens funkcióval, mely során az ingerületbe került szenzoros idegvégződés a központi idegrendszer felé közvetíti az idegaktivitást, ennek következtében kialakul a fájdalomérzet, vagyis a nocicepció. Szolcsányi János és Gábor Aranka korai kísérleteik során patkányok n. saphenusának és n. trigeminusának elektromos izgatása következtében létrejövő arteriolás vazodilatációt, vaszkuláris permeabilitásnövekedést és plazmaproteinek extravazációjátt figyelte meg a beidegzési területeken. Ezen idegeken nagy dózisú kapszaicinnel történő előkezelés után sem ortodrómos kémiai, sem antidrómos elektromos ingerlés hatására nem alakult ki a gyulladásos reakció. Ennek alapján azt feltételezték, hogy a gyulladáskeltő mediátorok a kapszaicin-érzékeny fájdalomérző-idegvégződésekből, a nociceptorokból szabadulnak fel (Jancsó és mtsai. 1967).

Későbbi kísérleteik során igazolták, hogy az aktivált érzőideg-végződésekből

gyulladáskeltő

szenzoros

neuropeptidek

(kalcitonin

gén-rokon

peptid

(CGRP),

tachikininek (substance P (SP) és neurokinin A (NKA)) szabadulnak fel, melyek értágulatot, plazmafehérje kiáramlást okoznak, továbbá a gyulladásos sejtek aktivációjával hozzák létre a neurogén gyulladást (Szolcsányi 1984 a, b, 1988). Ezt a folyamatot nevezzük lokális efferens funkciónak. A neurogén gyulladás számos betegség patomechanizmusában

meghatározó

szerepet

játszik,

jelenleg

azonban

egyetlen

gyógyszercsoport sem képes hatékonyan gátolni a betegség neurogén komponensét (Helyes és mtsai. 2003). A gyulladáskeltő neuropeptidek mellett, gyulladásgátló és fájdalomcsillapító mediátorok (pl.

szomatosztatin,

hipofízis-adenilát-cikláz-aktiváló

polipeptid

(PACAP))

is

felszabadulnak, melyek a keringésbe jutva a test távolabbi pontjaira eljutva akadályozzák a neurogén és nem neurogén gyulladás kialakulását, illetve analgetikus hatást váltanak ki. Ez az érzőideg-végződések harmadik, ún. szisztémás efferens funkciója (Szolcsányi és mtsai. 1998 a, b).

7

1. ábra: A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések hármas funkciója (Rövidítéseket lásd a szövegben)

A Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 (TRPV1) és Ankyrin 1 (TRPA1) receptorok felépítése és funkciója A hátsó gyöki és trigeminus ganglionokban a polimodális nociceptív primer szenzoros neuronokon expresszálódnak, Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid családba tartozó Vanilloid 1 és Ankirin 1 receptorok. Jelenlétüket újabban nem neuronális struktúrákon is kimutatták (Inoue és mtsai. 2002, Fernandes és mtsai 2012). Mindkét receptor jelentős szerepet játszik az érzőidegek aktivációján keresztül a fájdalom (Fernandes és mtsai. 2011) és a neurogén gyulladás (Geppetti és mtsai. 2008) mechanizmusaiban. A TRPA1-et expresszáló szenzoros neuronok 97%-ának membránjában megtalálható a TRPV1 receptor is, míg a TRPV1-et expresszáló neuronok 30%-ában koexpresszálódik a TRPA1 is (Story és mtsai. 2003). Mindkét receptor ioncsatornához kötött receptor, melyek Ca2+ és Na+ ionok számára permeabilisek, számos kémiai irritáns, endogén mediátor és fizikai inger 8

képes őket stimulálni. Szerkezetüket tekintve hasonlók: mindkét receptort 6 β-redő szerkezetű transzmembrán domén építi fel. Az 5. és 6. alegység között intracelluláris, hidrofób hurok található, ez alkotja csatornarégiót. Ezen struktúrák négy egységből álló tetramerré alakulva alkotják a nem szelektív kationcsatornát (2. ábra). Legszembetűnőbb különbség köztük a TRPA1 receptor N-terminális régiójában található 14 ankirin ismétlődés, mely hosszúságával egyedülálló az élővilágban. A receptor elnevezését is erről kapta, ezen ismétlődésnek feltetételezhetően a mechanikai érzékelésben jut fontos szerep (Kwan és mtsai. 2006).

2. ábra: TRPV1 és TRPA1 receptor felépítése (Forrás: Bessac és Jordt 2008a.)

A TRPV1 egy olyan receptor, mely fizikai és kémiai ingerek számára molekuláris integrátor funkciót lát el (Tominaga és mtsai. 1998). A receptor létezését, Szolcsányi már 1975-ben valószínűsítette (Szolcsányi 1975). Számos exogén növényi eredetű irritáló vanilloid vegyület (reziniferatoxin (RTX), piperin, gingerol) (Pingle és mtsai. 2007, Szállási 2007) képes aktiválni, ezért a receptor eredeti elnevezése vanilloid receptor 1 (VR1) lett, melyet azonban az egyéb tranziens receptorpotenciált közvetítő ioncsatornákkal mutatott szerkezeti hasonlóságai miatt később TRPV1-re változtattak (Gunthorpe és mtsai. 2002). Kapszaicin melletti másik fontos stimulátora a fájdalmas intenzitású hő (43°C felett), míg a pH változása (acidózis), „endovanilloidok” (pl. anandamid), arachidonsavmetabolitok, oxidált linolsav metabolitok, és esszenciális olajok is képesek még a receptort aktiválni (Pingle és mtsai. 2007, Szállási 2007). Gyulladáskeltő mediátorok, mint bradikinin, prosztaglandinok, adenozin-trifoszfát (ATP), proteáz aktiváló receptorok (PAR 9

1, 2 ,4), tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-alfa), idegnövekedési faktor (nerve growth factor, NGF) is érzékenyítik a receptort foszforiláció révén. Ezen mediátorok hatására a csatornaproteinek allosztérikusan modifikálódnak, ezáltal növelik a hő, a protonok és/vagy a kapszaicin által kiváltott receptor aktiváció mértékét (Moriyama és mtsai. 2005, Szállási és mtsai. 2007). A receptor szenzibilizációjának mértékét számos mechanizmus befolyásolja, köztük a TRPV1 foszforilációjának mértéke, melyben a protein kináz A (PKA), protein kináz C (PKC) és egyéb kinázok játszanak kulcsfontosságú szerepet (Premkumar és Ahern 2000, Jung és mtsai. 2003). A TRPA1 receptor hidegérzékelésben betöltött szerepéről rendelkezésre álló adatok egymásnak ellentmondóak. Számos különböző eredmény született e téren, vannak, akik mellette (Story és mtsai. 2003, Obata és mtsai. 2005, Kwan és mtsai. 2006, Sawada és mtsai. 2008), vannak, akik ellene érvelnek (Jordt és mtsai. 2004, Nagata és mtsai. 2005, Bautista és mtsai. 2006). Feltételezhetően más mechanizmusok mellett a TRPA1 is hozzájárul a 17°C alatti hőmérséklet érzékeléséhez. A TRPA1 receptor exogén agonistái közül jelentősek a növényi eredetű vegyületek, a mustárolajban található allil-izotiocianát (AITC) (Jorgt és mtsai. 2004, Bandell és mtsai 2004, Bautista és mtsai. 2006), a fokhagymában levő allicin (Macpherson és mtsai. 2005), fahéjaldehid (Macpherson és mtsai. 2006), továbbá toxikus kipufogó gázokban és dohányfüstben található vegyületek (pl. acrolein) (Bautista és mtsai. 2006). Endogén agonistái között tartják számon az oxidatív stressz során felszabaduló reaktív gyököket (Bessac és mtsai. 2008b), köztük a 4-hidroxinonenalt (Trevisani és mtsai. 2007), lipid peroxidáz termékeket (Taylor-Clark és mtsai. 2008), továbbá cink, réz és kadmium ionokat (Hu és mtsai. 2009, Gu és Lin 2010). Endogén modulátorai között szerepelnek a gyulladásos folyamatok során felszabaduló ágensek, pl. bradikinin (Bandell és mtsai. 2004), PAR-2 agonisták (Dai és mtsai. 2007), továbbá a hidrogén-szulfid (H2S) (Miyamoto és mtsai. 2011). A receptor aktiválása többféleképpen történhet, fahéjaldehid, acrolein, AITC és a legtöbb növényi eredetű terpén a csatorna intracelluláris N-terminális részén található specifikus cisztein oldallánchoz kötődik reverzibilis kovalens kötéssel, így idézve elő a konformáció változást és a csatorna nyitását (Hinman és mtsai. 2006). A TRPA1 receptor sajátossága, hogy a Ca2+ ionokra nézve nem szelektív, az intracelluláris Ca2+-szint-növekedés direkt módon képes aktiválni a receptort. A bradikinin indirekt módon stimulálja a TRPA1 receptort, mégpedig úgy, hogy a primer szenzoros neuronon megtalálható G proteinhez 10

kötött receptorához kötődik, aktiválja a foszfolipáz C-t (PLC), amely a sejtmembránban lévő foszfatidilinozitol biszfoszfát (PIP2) hidrolíziséhez vezet. E folyamat eredményeként a keletkező inozitol-triszfoszfát (IP3) az intracelluláris Ca2+ raktárakból szabadít fel Ca2+ionokat, míg a diacilglicerol (DAG) aktiválja a protein-kináz C-t (PKC), ami a TRPV1 szenzitizációjához vezet, így még több Ca2+-ion áramlik be az extracelluláris térből a sejt belsejébe. A kétféle úton zajló események az intracelluláris Ca2+ koncentráció emelkedése révén a TRPA1 ioncsatorna nyitását okozzák (Bautista és mtsai. 2006).

3. ábra: A TRPV1 és TRPA1 receptor közötti interakcó (Forrás: Bautista és mtsai. 2006).

Új típusú analgetikumok fejlesztésének indokoltsága A fájdalomcsillapítás területén új támadáspontú szerek fejlesztésében az elmúlt 100 évben nem történt lényegi áttörés. Évtizedek óta ugyanazon hatásmechanizmusú gyógyszereket használják, melyek két nagy csoportra oszthatók, a nem-szteroid gyulladáscsökkentőkre (NSAID) illetve az opioidokra. Az NSAID-ok akut, elsősorban gyulladással és szövetkárosodással járó fájdalomra hatnak (pl. traumás vagy posztoperatív fájdalom). Hatásmechanizmusuk alapja, hogy képesek gátolni a gyulladás vagy szöveti trauma következtében indukálódó ciklooxigenáz 2 (COX2) enzimet, melynek hatására csökken a szintetizálódott prosztaglandinok (PG) mennyisége a perifériás szövetekben, így csökken a nociceptor szenzibilizáló (hiperalgéziát okozó) hatásuk. A COX-2 enzim gátlásával, akadályozzák a gerincvelő hátsó szarvában a PGE2 nociceptív, spinális neuronokon kifejtett szenzibilizáló hatását. 11

Gyulladásgátló hatásuk mellett láz és fájdalomcsillapító hatással is rendelkeznek. Mellékhatásaik többsége az élettanilag fontos COX-1 enzim gátlása révén alakul ki. Ismerünk COX izoenzimekre nem-szelektív, COX-2-preferenciális és COX-2-specifikus szereket. Az áttörést jelentő COX-2-specifikus szerek sem váltották be a hozzájuk fűződő reményeket. Ugyan a szelektivitás miatt a kialakuló gasztrointesztinális mellékhatásaik minimálisak, azonban a kardiovaszkuláris rizikót jelentősen megnövelik. Az opioidok hatékonysága nagy, ezért nagy intenzitású fájdalommal járó megbetegedések (pl. malignus tumor) kezelésében alkalmazzák őket. Az opioidok mind a fájdalom percepciójára, mind pedig a fájdalom affektív komponensére hatással vannak, csökkentik a szorongást,

emelik

a

fájdalomküszöböt.

Hatásmechanizmusuk

főként

centrális

támadáspontú, melynek magyarázata a gerincvelő opioid receptor (μ, δ, κ) gazdagsága, azonban perifériás támadásponttal is jellemezhetők, mivel µ-receptorok az érzőideg végződéseken is megtalálhatók (Stein és mtsai. 1990, Mousa és mtsai. 2001, Atkinson 2013). Bár a korábban felsorolt két csoportba tartozó vegyületek a legtöbb esetben hatékony fájdalomcsillapítók, mégis egyes fájdalom állapotokban (pl. neuropátiás fájdalomban) hatástalannak bizonyulnak. Ezen esetekben adjuváns analgetikumok alkalmazására van szükség. Ebbe a típusba tartoznak triciklikus antidepresszánsok (pl. amitriptilin, nortriptilin),

egyes

antiepileptikumok

(gabapentin,

pregabalin),

illetve

a

helyi

érzéstelenítők (pl. lidocain). Azonban gyakran e szerek alkalmazása mellett sem kielégítő a hatás, melynek eredményességét tovább csökkentik az esetenként súlyos mértékben jelentkező mellékhatások, pl. a COX izoenzimre nem szelektív NSAID-ok alkalmazásakor fellépő gasztrointesztinális és renális mellékhatások, vagy a hosszantartó opioid-kezelés következtében

jelentkező

fizikai

és

pszichés

dependencia,

tolerancia,

eufória,

légzésdepresszió, obstipáció vagy vizeletretenció. Mindezek alapján sürgető olyan új típusú célmolekulák azonosítása, melyek a perifériás nociceptorokon szeletíven ható fájdalomcsillapítók támadáspontjai lehetnek. In vivo állatmodellek alkalmazásának indokoltsága A rendelkezésre álló in vitro elektrofiziológiai (pl. 1 idegrost akciós potenciálját elvezető technika, „patch-clamp”, Ca2+-imaging technika) és különböző molekuláris biológiai technikák

alkalmazásával

lehetőség

nyílik

a

különböző

receptorok

aktivációs

mechanizmusainak, jelátviteli útvonalainak felderítésére, illetve a receptorokon ható 12

agonisták-antagonisták azonosítására. Azonban az egyes szerek szervezetben kiváltott hatásainak komplex vizsgálatához nélkülözhetetlenek az élő állatokon (egereken, patkányokon) elvégzett tesztek. Az in vivo élő szervezetekben elvégzett kísérletek kifejezetten jelentős szerepet játszottak olyan akut és krónikus fájdalomállapotok eseteiben is, ahol a perifériás input válaszok tanulmányozása humán alanyokon nem vagy alig kivitelezhető (Staud 2013). Krónikus fájdalom modellekben vizsgált fájdalmas stimulusok jelátviteli útvonalainak azonosítása, feldolgozása és percepciójának feltérképezése is állatkísérletek bevonásával valósult meg (Kuner 2007). Mivel a legtöbb humán betegség nem pontosan modellezhető állatkísérletesen, a megfelelő preklinikai módszerek kidolgozása ezek miatt nagy fontossággal bír. ÁLTALÁNOS CÉLKITŰZÉSEK 1. In vivo fájdalomtesztek során alkalmazott készülékek módszertani fejlesztése, komplex betegség modellek validálása és kidolgozása 2. A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések komplex vizsgálata, az ezeken található

receptorok

aktivációjának

serkentése

illetve

gátlása

különböző

farmakológiai vegyületekkel, továbbá szerepük meghatározása különböző fájdalom és gyulladás-modellekben AZ ALKALMAZOTT MÓDSZEREK ÁLTALÁNOS BEMUTATÁSA Termonocicepció: fájdalmas hőküszöb mérésen alapuló módszerek A nocicepció vizsgálatára számos módszer áll a rendelkezésre, az értekezés alapjául szolgáló kísérletek során főként a termonocicepció vizsgálata került fókuszpontba. Az általam alkalmazott módszerek alapelveit és fontosabb jellemzőit az alábbiakban foglalom össze, míg a részletes kísérleti protokollokat az egyes fejezetekben ismertetem. A klasszikus, latenciaidő-mérésen alapuló termonocicepciós tesztekben küszöb feletti állandó intenzitású ingereket alkalmaznak, és az elhárító reakció megjelenéséig eltelt időt mérik. Ilyen módszer például az állandó hőmérsékletű (50-55°C) forró lap, mely esetben a vizsgált állat ráhelyezésekor az összes végtag érintkezik az ingerforrással (Eddy & Leimbach 1953).

13

Másik módszer a plantar teszt (Hargraeves és mtsai. 1988) (4. ábra), ahol állatokat egy alulról üveg felületű műanyag dobozba helyezik, majd egyik talpukat állandó intenzitású

fókuszált

fénysugár

segítségével ingerlik. Abban a pillanatban, amikor az állat elhúzta a lábát, a fókuszált fény kialszik, és a kijelzőről az eltelt idő mely az elhárító reakció latenciaideje4. ábra: Plantar teszt

leolvasható. Ezzel szemben az általunk bevezetett új

mérési módszerekben a kezdeti, viszonylag alacsony kiindulási hőmérséklet fokozatos emelésével – melyet az elhárító reakció megjelenésekor azonnal leállítunk – pontosan meghatározható a termonocicepciós küszöb. E módszerek igazi előnye megbízhatóságában és jó reprodukálhatóságában rejlik, így kiváló alternatívájává vált a tradicionális latenciaidő- meghatározáson alapuló teszteknek. Az a hőmérsékleti érték, melynél az állat elhárító reakciót mutat, – megnyalja, megrázza vagy megemeli valamelyik hátsó végtagját – a fájdalmas hőküszöb. Az egerek és patkányok lábon mért termális küszöbének meghatározásához az IITC Life Science által gyártott emelkedő/csökkenő hőmérsékletű forró/hideg lapot használtuk (Almási és mtsai. 2003) (5. ábra). Az állatok szabadon mozogtak egy alulról fűthető/hűthető fém aljú plexidobozban. A fémlap fűtése szobahőmérsékletről indult, sebessége kétféle lehet, egyrészt 6 °C / perc illetve 12 °C / perc. A nocifenzív reakciót kiváltó hőmérsékleti érték elérésekor a lap fűtését/hűtést azonnal leállítottuk, és az állatot eltávolítottuk.

5. ábra: Egyenletesen emelkedő hőmérsékletű forró lap

6. ábra: Egyenletesen emelkedő hőmérsékletű vízfürdő

14

Elhárító reakció hiányában a melegítés minden esetben az 50 °C elérése után leállt, tekintve, hogy e hőmérséklet felett jelentős szövetkárosodás jöhet létre. A készülék a lábon mért fájdalmas hidegküszöbök vizsgálatára is alkalmasnak bizonyult hasonló elvek alapján. A fájdalmas hideg küszöbök meghatározásakor a legkisebb beállítható érték a 0 °C volt. A termonocicepció mérésére egy másik módszert is alkalmaztunk, az Experimetria Kft.-vel közösen kifejlesztett és intézetünkben korábban validált emelkedő hőmérsékletű vízfürdőt (6. ábra) (Bölcskei és mtsai. 2007, Füredi és mtsai. 2009). Patkányok lábán mért fájdalmas hőküszöbök vizsgálatához az állatokat gyengéden tartva, egyik hátsó végtagjukat egy vízzel teli tartályba merítettük, majd a tartály vizét 30°C-ról indulva egyenletesen melegíteni kezdtük. A mérést egy pedál segítségével a nocifenzív reakció megjelenésekor azonnal leállítottuk, és a kijelzőről leolvasott hőmérsékleti értéket tekintettük a láb termális fájdalomküszöbének. A mechanonocicepció vizsgálata a talp érintési érzékenységének mérésével A

talp

érintési

érzékenységét

dinamikus

plantáris eszteziométerrel (Ugo Basile, Comerio, Olaszország) vizsgáltuk (7. ábra). A készülék lényegében egy módosított von Frey berendezés. Az állatok szabadon mozogtak egy alul rácsos ketrecben. Egy tükrös stimulátor segítségével egy tompa végű tűt irányítottunk pontosan az állat talpának közepére, mely emelkedésével fokozatosan növekvő erőhatást fejt ki az adott 7. ábra: Dinamikus plantáris eszteziométer

területre.

A

maximális

erőhatást

10g-ban

határoztuk meg, míg a tűemelés sebességét 2,5 g/s-ra állítottuk. A mechanonociceptív küszöb elérésekor,- vagyis annál az értéknél, amelynél az állat elhárító reakciót mutat, tehát elhúzza a lábát-, a digitális számláló megáll, és az érték a kijelzőről grammban leolvasható.

15

Egyéb in vivo vizsgálati módszerek: Lábtérfogati változások mérése A láb térfogatának változásait pletizmométerrel (Ugo

Basile, 7140, Comerio, Olaszország) (8. ábra) vizsgáltuk. A készülék a közlekedőedények elve alapján működik. Két folyadékkal

jelig

transzducerhez,

töltött

mely

edény

detektálja

csatlakozik az

állat

egy

lábának

bemerítésekor kiszorított folyadék térfogatát. A digitális kijelzőről leolvasható a láb térfogata cm3-ben. A kapott adatokat

a

kezdeti

kontroll

értékekhez

viszonyítva

százalékosan ábrázoltuk. 8. ábra: Pletizmométer

A spontán súlyeloszlás vizsgálata A

hátsó

végtagok

súlyeloszlását (Linton Egyesült

spontán

Incapacitance

Instrumentation, Királyság)

Tester Norfolk,

készülékkel

vizsgáltuk (9. ábra), mellyel a hátsó végtagok detektálni.

nehézkedését

lehet

Alkalmazásával

a

hiperalgézia mértéke meghatározható a spontán súlyterhelés változásával. A 9. ábra: Incapacitance teszter

mérés egy plexiketrecben történik,

melynek aljába két digitális mérleget építettek. Az állatok hátsó végtagjaikkal ezekre a mérlegekre állnak, míg mellső lábaikat egy ezzel 45°-os szöget bezáró plexilapra támasztják. A mért értékeket a digitális kijelzőről grammban olvastuk le. Kontroll körülmények között az állatok a két hátsó végtagjukat szinte azonos mértékben terhelik, tehát a spontán súlyeloszlás 50-50%, mely fájdalom hatására eltolódik. A spontán súlyeloszlás változását a végtagok értékeinek összehasonlításával százalékban fejeztük ki.

16

A spontán lokomotoros aktivitás vizsgálata A spontán lokomotoros aktivitás mérésére open field tesztet alkalmaztunk (10. ábra). Az állatokat egy 16 egyenlő részre osztott, felülről nyitott dobozba helyeztük, majd a kísérlet

5

detektáltuk

perce a

alatt

következő

videokamerával paramétereket:

mozgással vagy mosakodással eltöltött időt, érintett mezők és ágaskodások számát, 10. ábra: Open field teszt

illetve a doboz közepén töltött időt. Krónikus fájdalom jelenlétében fokozódik a szorongás,

mellyel fordítottan arányos a mozgással és a doboz középén töltött idő, továbbá az időegység alatt érintett mezők száma, míg a mosakodás, ágaskodás, és a sarokban töltött idő azzal egyenesen arányos (Gaszner és mtsai. 2012). A motoros koordináció vizsgálata A motoros funkció és a koordináció vizsgálatát RotaRod

(Ugo

Basile,

37400,

Comerio,

Olaszország) készülékkel vizsgáltuk (11. ábra). Az egyensúlyozó képesség és az izomerő vizsgálatához az állatokat egy egyenletesen gyorsuló forgó hengerre helyeztük, majd a leesésig eltelt időt detektáltuk. A forgó henger fordulatszáma (rpm) az első 10 másodpercben konstans 4 rpm volt, majd 5 perc alatt 40 rpm-re 11. ábra: Rotarod kerék

gyorsult fel.

In vitro vizsgálati módszerek: Gyulladásos neuropeptidek és citokinek meghatározása szövet homogenizátumokból A gyulladásos neuropeptidek és citokinek meghatározásához a kivett szövetmintákat apró darabokra vágtuk, majd 2 ml jéghideg kétszer desztillált vízben homogenizáltuk 0 °C fokon 2 percen keresztül 21.000 rpm-en, Miccra D-9 homogenizátorral (Art-moderne 17

Labortechnik, Németország). Ezután a mintákat lecentrifugáltuk (4 °C, 10000 rpm 10 percig), majd a felülúszókat összegyűjtöttük és további mérésig -20 °C-on tároltuk. A szöveti homogenizátumokból meghatározható CGRP- és SP-szerű immunreaktivitás mérésére rádioimmunesszé (RIA) módszert alkalmaztunk a korábban leírtak szerint (Németh és mtsai. 1998, 1999). A vérminták IL-6 illetve IL1-béta szintjét Luminex® 100™ x MAP módszerrel (Invitrogen gyulladásos panel egerekhez, AtheNA Multi-Lyte) határoztuk meg a gyártó cég ajánlása szerint. Etikai vonatkozások A kísérleteink során alkalmazott vizsgálatok minden esetben megfeleltek az állatkísérletek végzéséről szóló 243/1998. számú kormányrendelet előírásainak. A kísérleti eljárásokat a Pécsi Tudományegyetem állatkísérletekkel foglalkozó Etikai Bizottság javaslatára a Baranya Megyei Állategészségügyi és Élelmiszer-ellenőrzési Főosztály engedélyezte (szám: BA 02/2000-9-2011). Kísérleteink során minden esetben eleget tettünk az IASP által lefektetett állatkísérletekre vonatkozó etikai alapelveknek (Zimmermann 1983). Minden esetben igyekeztünk a kísérlet elvégzéséhez szükséges legkisebb állatszámmal dolgozni, és a kísérletbe bevont állatok szenvedését minimálisra csökkenteni.

18

1.

fejezet:

antinociceptív

TRPV1

receptor

hatásainak

agonisták

vizsgálata

deszenzibilizáló

fájdalmas

hő-

és

hidegküszöb mérésével patkányban Bölcskei K., Tékus V., Dézsi L., Szolcsányi J., Pethő G.: Antinociceptive desensitizing actions of TRPV1 receptor agonists capsaicin, resiniferatoxin and N-oleoyldopamine as measured by determination of the noxious heat and cold thresholds in the rat. Eur. J. Pain 14 (5), 2010, 480-486. (megosztott első szerzős publikáció)

IRODALMI HÁTTÉR, ELŐZMÉNYEK A kapszaicin, RTX és deszenzibilizáció A kapszaicin-kutatás első adatai az 1870-es évekre mutatnak vissza, Hőgyes Endre vizsgálta először a csípős paprika anyagát, megállapítva, hogy az az érzőidegekre hat (Hőgyes 1878). A hő, mechanikai és kémiai ingerekkel is aktiválható polimodális nociceptorok szerepének ˗ melyek a TRPV1 receptorokat is expresszálják ˗ vizsgálata a kapszaicin szelektív aktiváló és az azt követő gátló hatásának felismerésével kezdődött. A kapszaicin kémiai struktúrája (12. ábra) 8-metil-N-vanillil-6nonénamid, mely hasonlít a vanillin szerkezetéhez. 12. ábra: A kapszaicin és reziniferatoxin kémiai struktúrája

A természetes körülmények között a marokkói Euphorbia

resinifera

növényben

előforduló

reziniferatoxin (RTX) (12. ábra) is képes a TRPV1 receptort aktiválni. Kapszaicinnél százszor potensebb, vagyis meghatározott koncentrációjú kapszaicin által kiváltott hatás eléréséhez az RTX százszor kisebb koncentrációja is elegendő (Szolcsányi 1990, Szállási 1999). Ha a receptor aktiválódik, Na+ és Ca2+ ionok áramlanak be a sejtbe, melyet K+ ion kiáramlás követ. A beáramló Na+ ionok hatására a membrán depolarizálódik és kialakul az akciós potenciál, ezáltal a fájdalomérzet (nocicepció), míg a sejtbe kerülő Ca

2+

ionok

hatására az idegvégződésből szenzoros neuropeptidek szabadulnak fel. Ha a TRPV1 19

tartósan vagy gyakran kerül aktivált állapotba, a sejten belüli kation koncentráció megnövekszik, melynek következtében a citoplazma és a mitokondriumok megduzzadnak, ezáltal a sejtek energiaforgalma csökken, majd idővel az idegvégződés működésképtelenné válik. Ezt a folyamatot deszenzibilizációnak nevezzük, melynek két formája ismert. Előkezelésként kis dózisban vagy rövidebb ideig alkalmazva adott kapszaicin és más TRPV1 receptor agonisták hatására csak ezen anyagokra nézve szűnik meg a válaszkészség, feltételezhetően ekkor csak a TRPV1 receptor deszenzibilizálódik. Magasabb koncentrációban és hosszabb ideig alkalmazva a kapszaicin-érzékeny érzőidegvégződés válaszkészsége az összes ingerre nézve csökken vagy megszűnik, tehát mind a hő, mechanikai és kémiai ingerekre egyaránt érzéketlen lesz. Ez esetben a TRPV1 receptort expresszáló nociceptív idegvégződés egészének funkciócsökkenéséről van szó, melynek hátterében dózistól függően ultrastruktúrális vagy markánsabb morfológiai eltérések állnak (Szolcsányi és mtsai. 1975, 1987, Szállási és mtsai. 1989, Bevan és Szolcsányi 1990, Szolcsányi 1993).

N-oleoildopamin

Az N-oleoildopamin (OLDA) a TRPV1 receptor aktivátora, bár affinitása kisebb, mint a kapszaicinnek (Chu és mtsai 2003, Szolcsányi és mtsai 2004). Az OLDA az N- acil dopaminszármazékok családjába tartozik, melyek egy új csoportot alkotnak a biológiailag aktív lipidek között. Mivel hosszú szénláncú telítetlen zsírsavak és a terminális részen amino-csoportot tartalmazó dopamin kondenzációs termékei, ezért a dopamid elnevezést kapták. Az OLDA-t eredetileg a központi idegrendszer striátum régiójában azonosították. A perifériás szövetekben eddig még nem sikerült igazolni a jelenlétét, azonban a nem neuronális eredetű dopamin fő forrása a mesenteriális szövetekben van. Ez felveti annak a lehetőségét, hogy az OLDA a bélben is szintetizálódhat, azonban ennek mechanizmusai és központi idegrendszeri jelentősége nem ismert (Chu és mtsai 2003).

20

CÉLKITŰZÉS Célunk

a

kapszaicin-érzékeny

érzőideg-végződés

és

a

TRPV1

receptor

deszenzibilizációjának vizsgálata volt patkányok fájdalmas hő- illetve hidegküszöb meghatározásán

alapuló

módszerekkel.

Az

idegvégződés

deszenzibilizációjának

analíziséhez az állatok mindkét talpába beadott különböző koncentrációjú kapszaicin, RTX vagy OLDA fájdalmas hideg- illetve hőküszöb befolyásoló hatásait monitoroztuk naponta. Az agonisták TRPV1 receptor deszenzibilizáló tulajdonságainak vizsgálatához azok akut TRPV1 receptor izgató (nocifenzív és hőköszöb-csökkentő) hatását elemeztük.

KÍSÉRLETI MODELLEK Kísérleti állatok Kísérleteinkhez 150-250 g közötti nőstény Wistar patkányokat használtunk. Az állatokat egy folyamatosan kontrollált, állandó hőmérsékletű és páratartalmú elkülönített állatszobában tartottuk 12 órás megvilágítás mellett, élelemmel és vízzel ad libitum ellátva. A termonociceptív küszöbök meghatározása Patkányok lábán mért fájdalmas hő- illetve hidegküszöbök meghatározásához a már ismertetett készüléket az emelkedő/csökkenő hőmérsékletű forró/hideg lapot alkalmaztuk (lásd 14. oldal). A fémlap fűtését/hűtését szobahőmérsékletről indítottuk, a hőmérsékletváltozás sebessége 6 °C/perc volt. A készüléken beállítható hűtési minimum érték 0 °C, azonban a legkisebb detektálható hőmérséklet -1 °C volt, mivel a lap a minimum elérése után passzívan tovább hűlt. Az érzőideg-végződés deszenzibilizációjának vizsgálata A TRPV1 receptort expresszáló szenzoros idegvégződések deszenzibilizációjának vizsgálatához az állatok mindkét talpába egyszeri dózisban 100 µl–t injektáltunk kapszaicin (3,3 nmol – 1 µmol) vagy RTX (0,016 – 0,5 nmol) illetve OLDA (5nmol - 1,25 µmol) különböző oldataiból. Mindkét talp kezelésére azért volt szükség, hogy az intakt lábon esetlegesen korábban megjelenő elhárító reakciót kivédhessük. A fájdalmas hőilletve hidegküszöb meghatározását ezután naponta ismételtük addig, míg a kiindulási kontroll értékekhez viszonyított szignifikáns különbség el nem tűnt, de maximum 14 napig. Kísérleteink egy részében a fájdalmas hő- és hidegküszöbök parallel vizsgálatait is 21

elvégeztük. Ugyanazon patkányok csoportjában meghatároztuk a fájdalmas hő és hidegküszöb értékeket a kezelések előtt, a bilaterálisan beadott kapszaicin (0,1 és 1 µmol i.pl.) vagy RTX (0,16 és 0,5 nmol i.pl.) kezelés után, majd 1 héten keresztül naponta detektáltuk a termonociceptív küszöbök változásait (mivel a hidegküszöb értékek kevesebb mint 7 nap alatt visszatértek a kontroll szintre, ezért a méréseket nem folytattuk tovább). A TRPV1 receptor deszenzibilizációjának vizsgálata A TRPV1 receptor deszenzibilizációjának vizsgálatához az állatok egyik talpát RTX vagy OLDA injekcióval kezeltük, majd a kezelés hatására kialakuló akut válaszokat – a nocifenzív viselkedés és a fájdalmas hőküszöb csökkenés – detektáltuk. (Almási és mtsai. 2003, Szolcsányi és mtsai. 2004). Az akut nocifenzív viselkedés kvantifikálásához a láb nyalásával, rázásával és emelésével töltött időt mértük, míg a hőküszöbcsökkenést 5 perccel az RTX és 10 perccel az OLDA injekció után határoztuk meg az emelkedő hőmérsékletű forró lappal. Kapszaicint kísérleteink e részében azért nem alkalmaztunk, mert korábbi kísérleteinkben nem találtunk olyan dózist, amely reprodukálható hőküszöbcsökkenést indukált volna. Az állatok egyik talpába 50 µl RTX-et (0,016 nmol) vagy annak vehikulumát injektáltuk és a küszöbcsökkenést detektáltuk. 3 órával később újra meghatároztuk a hőküszöböt és ismételten 0,016 nmol RTX-et injektáltunk a korábban kezelt talpba (1. táblázat). Ezt követően ismét elvégeztük a nocifenzív viselkedés időtartamának mérését és a termonociceptív küszöb vizsgálatát. Az állatok további két csoportját OLDA-val (250 nmol, 50 µl i.pl.) vagy annak vehikulumával (50 µl i.pl.) kezeltük és a kialakuló nocifenzív viselkedés időtartamát és a hőküszöbcsökkenést detektáltuk. 3 óra elteltével megmértük a termonociceptív hőküszöböket, majd ismételten mindkét csoport állatainak korábban kezelt talpába 50µl kisebb koncentrációjú OLDA oldatot (5 nmol i.pl.) injektáltunk. Ezt követően az OLDA által kiváltott elhárító reakció időtartamát és a hőküszöbcsökkenést ismét detektáltuk. A kialakuló deszenzibilizáció specifitásának vizsgálatához azonos koncentrációjú RTX (0,016 nmol), vagy vehikulum előkezelés (3 órával korábban) után az állatok két csoportjának talpába 1% formalint injektáltunk, majd vizsgáltuk a nocifenzív reakciókra gyakorolt hatást. Az OLDA és RTX között lehetséges kereszt-deszenzibilizáció megfigyeléséhez az állatokat intraplantárisan 50µl OLDA-val (250 nmol) vagy annak vehikulumával előkezeltük, 3 óra elteltével az azonos talpat RTX-szel (0,016 nmol)

22

kezeltük, majd a hatására létrejövő nocifenzív reakció időtartamát és a termonociceptív küszöbváltozását mértük. 1. stimulus

2. stimulus

vizsgálatok célja

RTX

RTX

homológ deszenzibilizáció

OLDA

OLDA

homológ deszenzibilizáció

RTX

formalin

deszenzibilizáció specifitása

OLDA

RTX

kereszt-deszenzibilizáció

1. táblázat: A TRPV1 receptor deszenzibilizációjának vizsgálata során alkalmazott kezelés-kombinációk.

Felhasznált anyagok A kapszaicint, a Sigma (St. Louis, USA), az N-oleolil-dopamint a Tocris Cookson (London, Egyesült Királyság) cégektől szereztük be. Mindkét anyagból törzsoldatot készítettünk (10 mg/ml illetve 5 mg/ml), 10% etanol, 10% Tween 80 és fiziológiás sóoldat felhasználásával. A kísérlet elején reziniferatoxinból (Sigma St. Louis, USA) 1 mg/ml-es törzsoldatot készítettünk 96%-os etanol felhasználásával, majd azt fiziológiás sóoldattal hígítottuk tovább a megfelelő koncentrációkra. Statisztikai analízis A kapott eredmények átlagait és azok standard hibái (SEM) feltüntetésével ábrázoltuk. Ugyanazon állatok különböző időpontokban vizsgált fájdalmas hő- illetve hidegküszöb analízisére egyutas ANOVA-t, majd ezt követően Neumann-Keuls post hoc tesztet alkalmaztunk. Az önkontrollos kísérletekben, az RTX ismételt adása által kiváltott nocifenzív reakciók és a küszöbcsökkenések összehasonlítására Student-féle egymintás ttesztet használtunk. A nem önkontrollos kísérletekben a küszöbcsökkenések, illetve a nocifenzív viselkedések összehasonlító vizsgálatához Student-féle kétmintás t-tesztet alkalmaztunk. Az eredmények összehasonlításakor a *p <0,05, **p <0,01 és ***p <0,001 értékeket fogadtuk el szignifikánsnak.

23

EREDMÉNYEK Az intraplantárisan adott kapszaicin, illetve RTX dózisfüggő módon megemelte az egymást követő napokon vizsgált nociceptív hőküszöb értékeket (13. ábra). A minimális effektív dózis (az a legkisebb dózis, mely a kísérlet bármely mérési időpontjában szignifikáns hőküszöbemelő hatással bír), kapszaicin esetében 10 nmol, míg RTX esetében 0,05 nmol volt. A maximális küszöbemelkedés 2,3 + 0,5 °C volt az általunk alkalmazott kapszaicin dózisoknál, míg ez az RTX esetében 2,8 + 0,5 °C volt. Mindkét vizsgált agonista által kiváltott hatás időtartama dózis-függő volt: a kapszaicin 10-33 nmol és RTX 0,05 nmol koncentrációja reverzibilis hőküszöbemelő hatással bírt, mely 2-5 napnál tovább nem állt fenn. A kapszaicin nagyobb koncentrációban 11 napig, az RTX pedig 9 napig fennmaradó hőküszöbemelő hatást váltott ki. A legnagyobb alkalmazott RTX dózis által kiváltott hőküszübemelő hatás monitorozását a 9. napon abbahagytuk, mivel az 5. és 9. nap között mért értékek 2 °C-kal voltak magasabbak a kiindulási kontrollhoz képest, és semmilyen csökkenő tendenciát nem mutatta. A tesztelt szerek oldószerei és az OLDA egyik vizsgált koncentrációja sem rendelkezett szignifikáns hőküszöbemelő hatással (nem ábrázolt adat).

A

3,33 10 33 100 330

50

Nociceptív hőküszöb (°C)

49 48 47 46 45

*

* *

* * * * * * * * * * * * *

* * * *

* *

nmol kapszaicin i. pl.

* * * *

44 43 42 Kontroll 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

napok

24

B 50

0,016 0,05 0,16

Nociceptív hőküszöb (°C)

49 48

*

*

* *

47

*

*

* *

*

*

7

8

*

*

46

*

nmol RTX i.pl.

*

45 44 43 42 Kontroll

1

2

3

4

5

6

9

napok

13. ábra: Mindkét talpba adott kapszaicin (A) vagy RTX (B) hatására kialakult hőküszöb változások, melyeket naponta, emelkedő hőmérsékletű forró lappal mértünk. A csillagok a kiindulási kontroll hőküszöbökhöz viszonyított szignifikáns különbségeket jelölik (n=8-12, * p <0,05; egyutas ANOVA, Neumann-Keuls post hoc teszt).

Az egyenletesen csökkenő hőmérsékletű hideg lapon mért fájdalmas hidegküszöbök átlaga kezeletlen patkányokban 1,3 + 0,2°C volt, mely 5 napon keresztül a naponta ismételt mérések során jól reprodukálhatónak bizonyult (nem ábrázolt adat). A hideg által kiváltott nocifenzív reakciók lényegében megegyeztek a hőküszöb vizsgálatok során leírtakkal (láb nyalása, emelése). A fájdalmas hő- illetve hidegküszöbök párhuzamos vizsgálata során csak a kapszaicin (0,1 és 1 µmol i.pl.) és RTX (0,16 és 0,5 nmol i.pl.) nagyobb dózisai okoztak szignifikáns csökkenést a hidegküszöb értékekben (14. ábra B és C). Fontos megemlíteni, hogy a kapszaicin bár mindkét vizsgált dózisban hasonló mértékű csökkenést okozott a hidegküszöb értékekben, addig hőküszöb emelő hatása dózisfüggő volt (14. ábra A és D). A hideggel szembeni deszenzibilizáció dózis-függőségének látszólagos hiányát feltehetően az a tény okozta, hogy a készülékkel -1 °C-nál alacsonyabb hőmérsékletet nem tudtunk mérni. Mindkét vizsgált anyag esetében, ugyanazon állatok hidegküszöb értékei 24 nap alatt visszaálltak a kiindulási kontroll állapotba, még mielőtt a fájdalmas hőküszöb értékek normalizálódtak volna.

25

A

C Kapszaicin 0,1 mol i.pl. Kapszaicin 1 mol i.pl.

50

* *

48

*

*

*

47

*

46

RTX 0,16 nmol i.pl. RTX 0,5 nmol i.pl.

49

*

*

*

45 44

Nociceptív hőküszöb (°C)

Nociceptív hőküszöb (°C)

49

50

*

48

*

* *

46

*

*

45

*

*

44

43

43

42

42 1

Kontroll

2

3

4

7

1

Kontroll

2

napok

3

4

7

napok

B

D

4

4

Kapszaicin 0,1 mol i.pl. Kapszaicin 1 mol i.pl.

2

* *

*

*

*

1

2

0

Kontroll

RTX 0,16 nmol i.pl. RTX 0,5 nmol i.pl. Nociceptív hidegküszöb (°C)

Nociceptív hidegküszöb (°C)

*

47

*

*

3

4

napok

3

2

1

* *

* *

1

2

0

-1 7

Kontroll

3

4

7

napok

14. ábra: Mindkét talpba adott kapszaicin (A-B) és reziniferatoxin (C-D) hő-és hidegküszöb befolyásoló hatásainak párhuzamos vizsgálata emelkedő illetve csökkenő hőmérsékletű forró/hideg lappal. A csillagok a kiindulási kontroll hőküszöbökhöz viszonyított szignifikáns különbségeket jelölik (n=8, p <0,05; egyutas ANOVA, Neumann-Keuls post hoc teszt).

Korábbi eredményekkel összhangban (Almási és mtsai. 2003, Szolcsányi és mtsai. 2004,) az intraplantárisan beadott 0,016 nmol RTX illetve 5 nmol OLDA akut elhárító reakciót (érintett végtag rázása, nyalása) váltott ki, mely 5 illetve 10 percen belül megszűnt (15. ábra felső rész). Mindkét agonista hatására egy jól kifejezett, 8-10 °C-os hőküszöbcsökkenés jött létre, (15. ábra alsó rész) mely 30 perc elteltével megszűnt. A kezeléseket követő 3. órában mért fájdalmas hőküszöb értékek statisztikailag nem különböztek a kiindulási kontroll értékektől (nem ábrázolt adat). A TRPV1 receptor kémiai ingerekkel szemben mutatott deszenzibilizációjának mértékének meghatározásához, a patkányok előzőleg kezelt talpába a korábbival megegyező dózisú RTX-et (0,016 nmol) illetve OLDA-t (5 nmol) injektáltunk. A 3 óra elteltével adott második RTX injekció hatására mind a nocifenzív reakció időtartama, mind pedig a hőküszöbcsökkenés mértéke 26

szignifikánsan kisebb volt az első RTX injekció által kiváltott válaszoknál (15. A). 250 nmol OLDA előkezelés után 3 órával a kezelt talpba beadott kisebb dózisú (5 nmol) OLDA szignifikánsan csökkentette mind a nocifenzív reakció időtartamát, mind pedig a hőküszöb csökkenést az előkezelés után vehikulumot kapott csoporthoz képest (15. B). Ugyanakkor az azonos dózisú RTX nem okozott szignifikáns változást a 3 órával később beadott TRPA1 agonista formalin (McNamara, 2007) 1%-os oldatával kiváltott a nocifenzív reakció időtartamában (15. A). Az OLDA előkezelés (250 nmol i.pl.) ugyancsak csökkentette 3 óra múlva a kezelt talpba beadott RTX (0,016 nmol) akut hatásait a vehikulumos előkezelést kapott állatokkal összehasonlítva. Tehát az elhárító reakció időtartamát és a hőküszöbcsökkenést is mérsékelte (15. C), mely a két TRPV1 agonista között létrejövő kereszt-deszenzibilizációra utal. 200

kontroll/szolvens i.pl. i.pl. RTX után

180 160 140 120 100 80 60

Nocifenzív reakció időtartama (s)

200

180

40

0

* RTX i.pl.

8 10 12

140 120 100 80 60 40 20

*

0

0

2

6

160

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

szolvens + RTX i.pl. OLDA + RTX i.pl.

*

FORMALIN i.pl.

0

4

C szolvens + OLDA i.pl. OLDA + OLDA i.pl.

*

2 4 6 8 10 12

*

Hőküszöb csökkenés (°C)

20

Hőküszöb csökkenés (°C)

Hőküszöb csökkenés (°C)

Nocifenzív reakció időtartama (s)

B

Nocifenzív reakció időtartama (s)

A

0 2 4 6 8

*

10 12 14 16

15. ábra: Előkezelésben (3 órával a kezelés előtt) alkalmazott intraplantáris RTX (0,016 nmol, A) vagy OLDA (250 nmol, B-C) elhárító reakciót kiváltó és hőküszöb-csökkentő hatásai ugyanazon talpba adott ismételt kezelést (0,016 nmol RTX vagy 5 nmol OLDA) követően. Az ábra A része az ismételt RTX kezelés hatásait, illetve az RTX előkezelés utáni 1 %-os formalin által kiváltott nocicepciót szemlélteti. A B rész a kétszeri OLDA injekció hatásait, míg a C rész az OLDA előkezelés utáni RTX által kiváltott válaszokat szemlélteti. A csillagok a statisztikailag szignifikáns különbségeket jelölik a kétszeri RTX adás által kiváltott küszöb-csökkenések között (A, n=8, p <0,05; Student-féle egymintás t-teszt), illetve az agonista- és szolvenskezelt csoportok között (B és C, n=8, p <0,05; Student-féle egymintás t-teszt).

27

MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK Munkacsoportunk korábbi közölt kísérleteiben sikeresen validálta az emelkedő hőmérsékletű „forró lap” (hot plate) módszerét, mellyel megbízható módon ismételhető mérésekkel naponta meghatározhatók a patkányok fájdalmas hőküszöb értékei (Almási és mtsai. 2003). A patkányokon végzett szisztémás kapszaicin kezelés hosszantartó termális antinociceptív hatása a tradícionális, állandó hőmérsékletű forró lap és „tail flick” módszerekkel vizsgálva ellentmondásos (Szolcsányi 1976, Obál és mtsai. 1979, Hayes és Tyers 1980, Gamse 1982, Bittner és Lahann, 1984), ugyanakkor elektrofiziológiai kísérletekben teljes egészében deszenzibilizálja a kapszaicin-érzékeny polimodális nociceptorokat (Szolcsányi 1987, Szolcsányi és mtsai. 1988). A kapszaicin hosszantartó dózisfüggő termális antinociceptív hatását patkányokban korábban már leírták (Szolcsányi 1985), de a mérésére alkalmazott technika nem volt megfelelő a fájdalmas hőküszöb pontos meghatározására. Jelen kísérleteinkben a lokálisan (talpba adott) alkalmazott kapszaicin és RTX tartós hőküszöb emelkedést okozott, ezáltal jelezve a termális antinocicepciót. Az általunk megállapított minimális effektív dózisok összehasonlításakor az RTX a kapszaicinnél kb. kétszázszor potensebbnek bizonyult, tehát ugyanazon hatás kiváltásához kétszázszor kisebb koncentrációja is elegendő volt. Ez megegyezik azon korábbi irodalmi adatokkal, melyek szerint az RTX jellemzően a deszenzibilizációban nagy hatáserősséggel rendelkezik (Szállási és Blumberg, 1999). Mindkét hatóanyag maximális küszöbemelő hatása közel azonos volt, alátámasztva teljes TRPV1 receptor agonista hatásukat (Ralevic és mtsai. 2003). Mind a kapszaicin, mind az RTX hőküszöbemelő hatásának időtartama dózisfüggő volt: az alacsonyabb dózisok hatásai 2-5 napig tartottak, míg nagyobb dózisok esetében a hatás több mint egy hétig, de legfeljebb 11 napig volt megfigyelhető. Korábbi tanulmányokban is hasonló eredményeket kaptak klasszikus, latenciaidő mérésen alapuló termonocicepciós módszerekkel (Xu és mtsai. 1997, Neubert és mtsai. 2003, Pan és mtsai. 2003, Karai és mtsai. 2004). Ezzel szemben kapszaicin perineurális alkalmazásakor már a küszöbdózis is sokáig fennmaradó termális válaszkészség csökkenést idézett elő, mely a kísérlet 120 napja alatt sem normalizálódott (Szolcsányi 1993). Érdemes megemlíteni, hogy a hot plate módszerrel a lábon mért hőküszöb értékek nem változtak sem TRPV1 génhiányos egerekben, sem pedig patkányokban előkezelésként helyileg talpba adott TRPV1 antagonista, a jód-reziniferatoxin után (Almási és mtsai. 28

2003). Hasonlóan, a TRPV1 receptor szerepe nem volt igazolható termonocicepcióban a klasszikus latenciaidő mérésen alapuló módszerekkel sem TRPV1 génhiányos egerek in vitro kísérleteiben, sem pedig in vivo viselkedés vizsgálatokban (Caterina és mtsai. 2000, Davis és mtsai. 2000, Woodbury és mtsai. 2004, Zimmermann és mtsai. 2005). Mindezek alapján a kapszaicin és RTX kísérleteinkben tapasztalt hőküszöbemelő hatása sem tudható be kizárólag a kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződésen található TRPV1 receptor deszenzibilizációjának. Az általunk kiváltott hosszantartó hőküszöb emelő hatás hátterében a funkcionális deszenzibilizáció vagyis a TRPV1 receptort expresszáló polimodális idegvégződések károsodása állhat, melynek következtében minden őket ért ingerre kevésbé reagálnak. Kapszaicin és RTX in vivo nagyobb dózisú alkalmazása során az ultrastrukturális változásokon kívül (Szolcsányi és mtsai. 1975), a sejten belüli Ca2+ szint hosszantartó és nagymértékű emelkedése az idegvégződés degenerálódásához vezet (Simone és mtsai. 1998, Dux és mtsai. 1999, Nolano és mtsai. 1999). In vitro kísérletekben kapszaicin és RTX kisebb, deszenzibilizáló dózisainak alkalmazásakor csak funkcionális elváltozások jelentek meg, többek közt gátlódtak a feszültségfüggő Na+ és Ca2+ csatornák (Liu és mtsai. 2001, Wu és mtsai. 2005). A jelentős neurotoxikus hatást cáfolják a reverzibilis elváltozások. A csak pár napig fennálló, alacsonyabb dózisú RTX vagy kapszaicin

által

kiváltott

hőküszöb

emelkedés

legvalószínűbb

magyarázata

a

kapszaicin˗érzékeny érzőideg˗végződések funkcióinak reverzibilis károdása, nem pedig a neurotoxikus hatás. Ez pedig teoretikusan új támadáspontot jelenthet új típusú, perifériás fájdalomcsillapítás területén. A

nemrég

azonosított

hatáserősségűnek

és

TRPV1

körülbelül

receptor 40%-kal

agonista kisebb

OLDA

50-szer

hatékonyságúnak

gyengébb

bizonyult

a

kapszaicinhez viszonyítva, in vitro patkányok heterológ módon expreszált TRPV1 receptorainak Ca2+ beáramlás vizsgálataiban (Szolcsányi és mtsai. 2004). Ezzel ellentétben a kapszaicin minimális effektív dózisánál 125- ször nagyobb dózisban beadott OLDA sem okozott hosszantartó hőküszöbemelkedést. Ezért feltételezhetjük, hogy ennél az OLDA dózisnál a receptor okkupancia már 100 %-os volt, tehát az OLDA kezelés következtében elmaradó hőküszöbemelkedés az OLDA korlátozott hatékonyságával magyarázható. Ezt alátámasztja egy másik tanulmány is, melyben az OLDA parciális agonistának bizonyult patkányokban, viszont humán vizsgálatokban nem (Chu és mtsai. 2003). Az OLDA által kiváltott TRPV1 receptor aktivációja következtében beáramló Ca2+ ionok megelőzik a

29

polimodális nociceptív idegvégződések károsodásához vezető folyamatokat, azáltal, hogy deszenzibilizálják a receptort. A hidegérzékenységet párhuzamosan vizsgáltuk a forró ingerek által kiváltott hőérzékenységgel patkányok ugyanazon csoportján csökkenő/emelkedő hőmérsékletű hideg/forró lappal. Érdekes, hogy míg az emberben mért fájdalmas hidegküszöb értékek 15°C körül vannak (Davis és Pope 2002), addig méréseink alapján patkányok ezen értékei sokkal alacsonyabbak, 2°C körüliek. A hidegérzékenység nem tipikusan a polimodális nociceptorok által mediált folyamat, azonban egy kisebb részük szerepet játszhat a nagy intenzitású hideg ingerek detektálásában (Leem és mtsai. 1993). A fájdalmas intenzitású hideg ingerek érzékeléséért leginkább a C és Aδ mechano-hideg érzékeny nociceptorok a felelősek (Simone és Cajander, 1996). A jelenleg ismert hideg által stimulálható ion csatornák a TRP család tagjai, a TRPM8 (McKemy és mtsai. 2002, Peier és mtsai. 2002) és a TRPA1 (Story és mtsai. 2003), melyek in vitro körülmények között 25°C, illetve 17°C körüli küszöbhőmérsékletnél kerülnek aktivált állapotba. Tudomásunk szerint elsőként szolgáltattunk adatokat a TRPV1 agonisták hosszantartó hatásainak szerepéről a hideg nocicepcióban. A kapszaicin és RTX hatására létrejövő hidegküszöbcsökkenés legvalószínűbb magyarázata a TRPV1 receptort is expresszálni képes hidegérzékeny nociceptorok károsodása lehet. Ezt a magyarázatot támasztja alá Story és mtsai 2003-ban megjelent publikációja, mely szerint a TRPA1 és TRPV1 receptorok az esetek nagy részében koexpresszálódnak a hátsó gyöki ganglionok neuronjaiban. A TRPV1 receptor agonisták által a hideg-érzékeny nociceptorok végződésein kiváltott deszenzibilizáció molekuláris mechanizmusa mindezidáig ismeretlen, de hasonló funkcionális eltéréseket tapasztaltunk, mint a hőérzékeny polimodális nociceptorok esetében. Azon megfigyelés, mely szerint a hidegküszöb értékek hamarabb térnek vissza a kontroll, kiindulási szintre, mint ahogy a hőküszöb értékek normalizálódnának, arra enged következtetni, hogy a fájdalmas intenzitású hő- illetve hideg-válaszkészség ˗ legalább részben ˗ különböző rostokon közvetítődik. Kutatócsoportunk korábbi eredménye, hogy a talpba adott RTX vagy OLDA az állatokban akut nocifenzív reakciót vált ki, és jelentős hőküszöbcsökkentő hatással bír (Almási és mtsai. 2003, Szolcsányi és mtsai. 2004). Ezen akut hatások kísérleteinkben szinte teljesen kivédhetők voltak, ha az állatokat intraplantárisan hosszantartó hőküszöbemelő hatással nem rendelkező dózisú ugyanazon TRPV1 agonista előkezelésben részesítettük. A kapott eredményekből kitűnik, hogy ez esetben maga a TRPV1 receptor deszenzibilizálódik, nem 30

pedig az egész érzőideg˗végződés. Kísérleteinkben a kis dózisú RTX ismételt adása gátolta a hatására kialakuló akut elhárító reakciók megjelenését. Ugyanakkor nem befolyásolta a formalin okozta akut nocifenzív reakciókat, tehát ez azt bizonyítja, hogy a receptor deszenzibilizációja az érzőideg-végződés funkciójának károsodása nélkül valósult meg. A TRPV1 receptor deszenzibilizációja következtében nem változik meg azon ágensek hatása, melyek a receptort nem, de az őt expresszáló afferenseket aktiválni képesek. Ilyen ágens például a TRPA1 ioncsatorna egyik aktivátora, a formalin (McNamara és mtsai. 2007). Az általa kiváltott nocifenzív reakciók nagy dózisú kapszaicin előkezeléssel meggátolhatók (Chen és mtsai. 2007), következésképp a formalin képes aktiválni a kapszaicin-érzékeny afferenseket. Az OLDA előkezelés hatására megszűnő akut RTX hatások alátámasztják az OLDA és RTX között kialakuló kereszt-deszenzibilizáció lehetőségét. A TRPV1 receptor deszenzibilizációja jellegében hasonlít a TRPV1 génhiányos egereknél tapasztaltakhoz, ahol elmarad a hőküszöbemelő hatás, mivel a termonociceptív csatornák elvesztik válaszkészségüket. Kísérleteinkben a két TRPV1 receptor agonista (kapszaicin és RTX) intraplantáris adása után erőteljes hiperalgézia alakult ki, melynek mértékét több napon keresztül mindkét hőmérsékleti tartományban meghatároztuk. A hidegtartományban a kezelés hatására lecsökkent fájdalomküszöb értékek gyorsabban normalizálódtak a meleg tartományban mért fájdalmas hőküszöb értékeknél. Ezen változások a TRPV1 receptort expresszáló szenzoros neuronok perifériás végződéseinek funkcionális deszenzibilizációját jelzik. Továbbá felelőssé tehetők a fájdalmas hő illetve hideg által kiváltott válaszok elmaradásáért, azonban feltételezhetően különböznek a kis dózisú RTX illetve OLDA által kiváltott TRPV1 receptor deszenzibilizációtól. A deszenzibilizáció mindkét típusa nagy jelentőséggel bír a periférián ható új tipusú analgetikumok kifejlesztésének szempontjából (Immke és Gavva, 2006). A TRPV1 receptor deszenzibilizáció során funkcionálisan hasonló állapot jön létre, mint amilyen az újonnan kifejlesztett periférián ható TRPV1 receptor antagonisták alkalmazása során várható. Az idegvégződés deszenzibilizációja azonban a fájdalomcsillapítás terén már kiaknázásra került, TRPV1 agonisták (pl. kapszaicin˗Qutenza tapasz vagy RTX-klinikai vizsgálat alatt) helyileg alkalmazva neuropátiás vagy más fájdalom állapotok kezelésére alkalmas (lásd 2. fejezet). Ezért az általunk alkalmazott fájdalmas küszöbhőmérséklet mérésen alapuló technika, a későbbiek során új típusú in vivo preklinikai szűrő módszerként szolgálhat.

31

2. fejezet: TRPV1 antagonisták hatásainak vizsgálata különböző termális hiperalgézia modellekben Tékus V., Bölcskei K., Kis-Varga A., Dézsi L., Szentirmay E., Visegrády A., Horváth C., Szolcsányi J., Pethő G.: Effect of transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) receptor antagonist compounds SB705498, BCTC and AMG9810 in rat models of thermal hyperalgesia measured with an increasing-temperature water bath. Eur. J. Pharmacol. 641(2-3), 2010, 135-141. IRODALMI HÁTTÉR, ELŐZMÉNYEK A preklinikai kutatások során számos olyan molekuláris mechanizmust azonosítottak, melyek szerepet játszanak a fájdalom kialakulásában és fenntartásában, ezáltal kiváló célpontok lehetnek a gyógyszerfejlesztés során. A tény, hogy a TRPV1 receptor a fájdalmas ingerek molekuláris integrátora, világszerte elfogadottá vált (Tominaga és mtsai. 1998). Központi szerepet játszik a perifériás szenzitizáció folyamatában (Immke és Gavva 2006), továbbá a gyulladás vagy sérülés hatására kialakuló upregulációs és szenzitizációs folyamatokban (Bishnoi és Premkumar 2011). Tekintve, hogy nagyszámú endogén fájdalomkeltő (nociceptív) / szenzitizáló ágens hat ezen az ioncsatornán, ezért a receptor ígéretes célpontja lehet olyan új típusú analgetikus vegyületek fejlesztésének, melyek direkt módon blokkolják a perifériás nociceptorokat (Brederson és Szállási 2013). Az egyik elsőként kifejlesztett TRPV1 receptor blokkoló a kapszazepin (CZP) volt, melyet a farmakológiai kutatásokban mind in vivo, mind pedig in vitro intenzíven használtak klasszikus kompetitív antagonistaként (Maggi és mtsai. 1993, Walpole és mtsai. 1994). Hátránya, hogy a TRPV1 receptorra nézve nem szelektív, gátolja a nikotin receptorokat, a feszültségfüggő Ca2+ csatornákat (Szállási és mtsai. 2007), illetve a TRPM8 ioncsatornát (Weil és mtsai. 2005) is. Ezért számos gyógyszercég invesztált nagy összegeket olyan új, szelektív TRPV1 antagonisták fejlesztésébe, melyek kiváló alapjai lehetnek új, hatékony fájdalomcsillapító gyógyszereknek. Az újonnan fejlesztett szintetikus vegyületek (lásd 3. táblázat), hasonlóak a CZP-hez, mely a csatorna pórus régiójába kötődik és a tetramer ioncsatorna összes monomerjének oldalláncával kapcsolatot (Messeguer és mtsai. 2006). Kísérleteink során az intézetünkben korábban beállított három eltérő kinetikájú termális hiperalgézia modellt alkalmaztunk. A termális küszöbcsökkenést egyrészt a TRPV1 receptor direkt aktivációja révén váltottuk ki potens receptor agonista RTX-szel. 32

Vizsgáltuk továbbá a termonociceptív küszöbcsökkenést enyhe hőtraumával illetve plantáris talpbőr incízióval kiváltott hiperalgézia modellekben, mivel ezekben az állaptokban a TRPV1 receptor feltehetően fontos szerepet játszik a hőhiperalgézia/ szenzibilizáció közvetítésében (Bölcskei és mtsai. 2005, Wu és mtsai. 2008, Banik és Brennan 2009), így várhatóan alkalmasak TRPV1 antagonisták tesztelésére. A megbízhatóan működő preklinikai fájdalomtesztelő módszerek fejlesztése nagy fontossággal bír, hiszen alkalmazásukkal csak az igazán hatékony gyógyszerjelölt molekulák válhatnak a rendkívül költséges klinikai tanulmányok főszereplőivé. CÉLKITŰZÉSEK PhD munkám e részének vizsgálata során a következő célokat tűztük ki: 1.) Három különböző gyógyszercég által kifejlesztett TRPV1 receptor antagonista vegyület (SB705498, BCTC és AMG9810) hatásának összehasonlítása RTX által kiváltott, plantáris bőr-izom

incíziót

követő,

illetve

enyhe

hőtrauma

következtében

kialakuló

hőhiperalgéziában, melyet a fájdalmas hőküszöbök mérésével határoztunk meg az intézetünkben korábban validált emelkedő hőmérsékletű vízfürdő segítségével. 2.) Ezen antagonisták hatásainak vizsgálata az RTX által indukált hőhiperalgézia modellben az elhárító reakció latenciaidejének mérésével plantár-teszt módszerrel. A klasszikus

latenciaidő

mérésen

alapuló

és

az

általunk

korábban

kifejlesztett

fájdalomküszöb-mérő módszer érzékenységének összehasonlítása.

KÍSÉRLETI MODELLEK Kísérleti állatok: Kísérleteinkhez 140-200 g közötti nőstény Sprague-Dawley patkányokat használtunk, melyeket a Harlan cégtől vásároltunk. Az állatokat egy állandó hőmérsékletű és páratartalmú elkülönített állatszobában tartottuk, 12 órás megvilágítás mellett, élelemmel és vízzel ad libitum ellátva. RTX-szel kiváltott nociceptív hőküszöbcsökkenés A fájdalmas hőküszöbcsökkenést a potens TRPV1 agonista RTX-szel váltottuk ki (Almási és mtsai. 2003). A kontroll mérések elvégzése után előkezelésként TRPV1 antagonista vegyületeket vagy azok vehikulumát adtunk szájon át (0,5 ml / 100 g per os), majd 1 óra 33

elteltével 0,01 µg RTX-et injektáltunk a patkányok egyik hátsó lábának talpába. Az előkezelésre azért volt szükség, mert irodalmi adatokból ismert (Almási és mtsai. 2003), hogy az RTX küszöbcsökkentő hatása 25 percnél rövidebb ideig tart, azonban ez az időtartam vélhetően nem elegendő az orálisan adott antagonisták teljes felszívódásához. Az RTX kezelést követő 5., 10., 15., 20. percben meghatároztuk a fájdalmas hőküszöb értékeket emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel (lásd 15. oldal). Enyhe hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenés Patkányok hátsó lábán mért hőküszöb csökkenést enyhe hőtraumával váltottunk ki. Korábbi eredményeink alapján ismert, hogy az enyhe hőtrauma alkalmazása minimum 1 óráig fennmaradó hőhiperalgéziát eredményez (Bölcskei és mtsai. 2007). A kontroll mérések elvégzése után az állatokat halotánnal altattuk, majd az egyik hátsó lábukat 20 s-ig 51°C -os forró vízbe merítettük. A pár perces altatást követő ébredés után a hőtrauma alkalmazását követő 10. és 20. percekben poszttraumás kontroll hőküszöb méréseket végeztünk, hogy megállapítsuk a hiperalgézia tényleges kialakulását. Azon állatokat, amelyeknél a minimális 3°C-os hőküszöbcsökkenés nem jött létre, nem vizsgáltuk tovább. A hőtraumát követő 20. percben az antagonistákat illetve azok vehikulumát intraperitoneálisan (i.p. 0.5 ml / 100 g) adtuk, majd 40, 50, és 60 percnél ismételten meghatároztuk az állatok fájdalmas hőküszöbét. Az antagonisták orális adása ez esetben nem volt célszerű, mivel viszonylag rövid idő (20 perc) telt el a kezelés és az első mérés között. Ezen időtartam pedig nem elegendő a maximális orális hasznosulás eléréséhez. Plantáris incízióval kiváltott hőküszöbcsökkenés A hőküszöbcsökkenést az állatok egyik hátsó lábán elvégzett talpi incíziós műtéti eljárással váltottuk ki (Füredi és mtsai. 2009). A kontroll hőküszöb mérések után, a patkányokat pentobarbitállal (50 mg / kg i.p.) elaltattuk, majd fél cm-re a saroktól 1 cm hosszan a talp középvonala mentén bemetszettük a bőrt, az izmot és az inakat is (16. ábra). A sebet 4.0 fonallal zártuk, majd Betadine-nal ecseteltük be. 24 órával a műtét után újabb kontroll hőküszöb mérést végeztünk a hiperalgézia kialakulásának megállapításához, melyet 30 perc múlva ismételtünk. Az antagonisták illetve a vehikulum orális adása (p. o. 0,5 ml / 100 g) után 1, 2, 3, 4 óra múlva a termonocicepciós küszöbök ismételt mérésével vizsgáltuk a hiperalgéziát.

34

16. ábra: Plantáris bőr-izom incízió

RTX indukálta hiperalgézia mérése Plantar Test készülékkel (latenciaidő mérés) Az általunk fejlesztett hőküszöb-mérő módszer érzékenységének vizsgálatához az állatok egy külön csoportjában RTX-szel hőhiperalgéziát hoztunk létre. Majd összehasonlítottuk a három antagonista hatását állandó intenzitású küszöb feletti hőinger által indukált elhárító reakció latenciaidejének mérésével. Ehhez az értekezés elején bemutatott Plantar testet használtuk (lásd 14. oldal), és a lábon mért elhárító reakció latenciaidejét detektáltuk. A kontroll mérések elvégzése után 0,06 µg RTX-et injektáltuk a patkányok egyik talpába, majd 10 perc elteltével újból megmértük a latenciaidőt. Az állatok egyik csoportja előkezelésként TRPV1 antagonistát (0,5 ml / 100 g p. o.), míg a másik csoport, azonos térfogatú vehikulumot kapott 1 órával az RTX kezelés előtt. Felhasznált anyagok A reziniferatoxint a Sigma (St. Louis, Amerikai Egyesült Államok) cégtől szereztük be. Etanolban oldottuk, majd 1 mg/ml-es törzsoldatát fiziológiás sóoldattal hígítottuk a megfelelő koncentrációkra. Az SB705498 (N-(2-bromofenil)-N′-[((R)-1-(5-trifluorometil-2 piridil) pirrolidin-3-il)] urea), a BCTC (N-(4-tertiaributilfenil)-4-(3-kolorfiridin-2-il) tetrahidropriazin-1(2H)-karbox-amid) és az AMG9810 ((E)-3-(4-tbutilfenil)- N-(2,3dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-acrilamid) 99%-os tisztaságú vegyületeit a Richter Gedeon Gyógyszergyárban szintetizálták. Az antagonistákat minden koncentráció esetén 5% Tween 80 és fiziológiás sóoldat keverékében oldottuk, melyből 0,5 ml-t adtunk 100 g testtömegre. Vehikulumként is ebben a volumenben alkalmaztuk, ez esetben antagonista nélkül.

35

Statisztikai analízis Az egyes antagonisa dózisok hatását mindig az aktuális, azonos térfogatú vehikulumot kapott kontroll csoportokhoz viszonyítottuk. A vizsgálatot végző személy nem ismerte a kezelési elrendezést. A vehikulummal vagy antagonistával kezelt állatokon mért termonociceptív küszöbcsökkenések egyes időpontokban történő összehasonlító analízisére Student-féle kétmintás t-próbát alkalmaztunk. A vehikulummal kezelt és a különböző koncentrációjú antagonista csoportok összehasonlítására egyutas variancia analízist (ANOVA) használtunk, TukeyKramer post hoc teszttel kiegészítve. A különböző csoportok közötti eredmények összehasonlításakor a *p <0,05, **p <0,01 és ***p <0,001 értékeket fogadtuk el szignifikánsnak.

Az antagonisták hatását a hiperalgézia százalékos gátlásának

ábrázolásával fejeztük ki. A fájdalmas hőküszöbök vizsgálata során egy integratív paraméterrel, a küszöbcsökkenések összegével számoltunk a következő képlet szerint: (csökkenésvehikulum ˗ csökkenésantagonista) / csökkenésvehikulum x 100, ahol csökkenésvehikulum és csökkenésantagonista a különböző időpontokban a vehikulummal illetve antagonistával kezelt csoportokban mért hőküszöbcsökkenések összegét jelölik. A lábon mért latenciaidő vizsgálatoknál a következő képlet szerint számoltunk: (LCSvehikulum ˗ LCSantagonista) / LCSvehikulum x 100, ahol az LCSvehikulum illetve LCSantagonista a vehikulummal vagy antagonistával kezelt csoportokban mért latenciaidő-csökkenések átlagát jelöli. A dózis-hatás görbén minden esetben a kialakult hőhiperalgézia százalékos gátlását ábrázoltuk úgy, hogy az egyes időpontokban mért hőküszöb értékeket csoportonként átlagoltuk, majd ezeket viszonyítottuk a traumát követően mért kontrollok átlagához. Az antihiperalgetikus hatás jellemzésére a legkisebb alkalmazott hatékony dózist, azaz a minimális effektív dózist (MED) használtuk.

EREDMÉNYEK TRPV1 receptor antagonisták hatásai a nociceptív hőküszöbök vizsgálatakor RTX által kiváltott hőküszöbcsökkenés gátlása A patkányok kontroll termonocicepciós küszöbe 43,2 + 0,4°C volt (n=36). Az intraplantárisan adott RTX injekció azonnali, de legkésőbb 5 perc alatt lezajló nocifenzív reakciót váltott ki, mely a láb rázásával, nyalásával járt. Ezután az emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel mérve nagymértékű (8-10 °C) küszöbcsökkenést detektáltunk, mely a vizsgálat 36

20 perce alatt végig fennmaradt. Az előkezelésben alkalmazott antagonisták mindegyike dózisfüggően gátolta az RTX által indukált küszöbcsökkenést mindegyik mérési időpontban 1-30 mg/kg p.o. dózisban (17. ábra). A minimális hatékony dózis 1 mg/kg volt mindhárom antagonista esetében (2. táblázat). Az SB705498 legnagyobb koncentrációban adva (10 mg/kg) teljesen megszüntette a kialakult hőküszöbcsökkenést, míg a BCTC (30 mg/kg) 74,5% és az AMG9810 (10 mg/kg) 66,2% maximális gátlást okozott.

A

B

SB705498 48

vehikulum p.o. 1 mg/kg p.o. 3 mg/kg p.o. 10 mg/kg p.o.

RTX 0,01g i.pl.

BCTC 48 46

44

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Fájdalmas hőküszöb (°C)

Fájdalmas hőküszöb (°C)

46

42 40 38 36

*

vehikulum p.o. 1 mg/kg p.o. 3 mg/kg p.o. 10 mg/kg p.o. 30 mg/kg p.o.

RTX 0,01g i.pl.

44 42

* * * *

* * * *

40 38 36

*

*

*

15

20

*

34

34

32

32 Kontroll

5

10

15

Kontroll

20

5

10 perc

perc

C

D

AMG9810 48 vehikulum p.o. 1 mg/kg p.o. 3 mg/kg p.o. 10 mg/kg p.o.

44 42

*

40 38

* * *

* *

36

* * *

* * *

Hőhiperalgézia gátlása (%)

100

RTX 0,01g i.pl. 46 Fájdalmas hőküszöb (°C)

*

* *

*

BCTC AMG9810 SB705498

80

60

40

20

34 0

32 Kontroll

5

10

15

1

20

17.

ábra:

Előkezelésben

(1

3

10

30

dózis (mg/kg)

perc

óra)

adott

TRPV1

antagonisták

hatásai

az

RTX-szel

kiváltott

hőküszöbcsökkenésre emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel mérve. A csoportonként 6-12 állat eredményeinek átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. A csillagok a vehikulummal illetve az antagonistákkal kezelt csoportok közötti statisztikailag szignifikáns (p <0,05) különbségeket jelölik (Student-féle kétmintás t-teszt). Az ábra D része a hiperalgézia százalékos gátlása alapján számolt dózis-hatás görbéket mutatja.

Az enyhe hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenés gátlása A hőtrauma kiváltásához szükséges altatásból a patkányok egy percen belül felébredtek. Ébredés után egyik állatnál sem tapasztaltunk semmilyen nocifenzív reakciót, nem rázták és nem is nyalták a lábaikat. A hőtraumát követő 10. és 20. percben emelkedő 37

hőmérsékletű vízfürdővel mért hőküszöb értékekben 7-8 °C csökkenést tapasztaltunk a kontrollhoz képest (18. ábra). Azon állatokat, melyeknél a hiperalgézia nem alakult ki, vagyis a csökkenés mértéke nem volt legalább 3 °C, kizártuk a további kísérletekből (120 patkányból összesen 5-öt). A termális hiperalgézia kialakulása utáni 20. percben i.p. beadott antagonisták mindegyike szignifikánsan mérsékelte a küszöbcsökkenést. A minimális effektív dózis SB705498 esetében 10 mg/kg, BCTC adásakor 3 mg/kg, míg az AMG9810 vegyületnél 1 mg/kg volt (2. táblázat). Az SB705498 és BCTC dózis-hatás görbéi a maximális beadott dózisnál (30 mg/kg) már enyhe csökkenést mutattak és maximális gátló hatásukat a 10 mg/kg-os koncentrációnál érték el (54,1% és 74,2%). Ezzel szemben az AMG9810 maximális gátló hatását a 30 mg/kg dózisban fejtette ki, amely 60,3% volt.

A

vehikulum i.p. 3 mg/kg i. p. 10 mg/kg i. p. 30 mg/kg i.p.

hőtrauma (51°C, 20s)

Fájdalmas hőküszöb (°C)

44 42

*

*

40

kezelés 38

*

*

*

36

46

BCTC hőtrauma (51°C, 20s) vehikulum i.p. 1 mg/kg i. p. 3 mg/kg i. p. 10 mg/kg i. p. 30 mg/kg i.p.

44 Fájdalmas hőküszöb (°C)

46

B

SB705498

42 40

*

kezelés

38

**

*

*

*

40

50

*

*

*

36 34

34

32

32 Kontroll

10

20

30

40

50

Kontroll

60

10

20

30

60

perc

perc

C

D AMG9810 100

hőtrauma (51°C, 20s)

vehikulum i.p. 1 mg/kg i. p. 3 mg/kg i. p. 10 mg/kg i. p. 30 mg/kg i.p.

Fájdalmas hőküszöb (°C)

44 42 40

** *

kezelés

38 36

* *

* *

** * *

*

Hőhiperalgézia gátlása (%)

46

BCTC AMG9810 SB705498

80

60

40

20

34

0

32 Kontroll

10

20

30 perc

40

50

60

1

3

10

30

dózis (mg/kg)

18. ábra: TRPV1 receptor antagonisták hatásai enyhe hőtraumával kiváltott termális nociceptív küszöbcsökkenésre emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel mérve. A csoportonkénti 6-11 állat eredményeinek átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. A csillagok a vehikulummal illetve az antagonistákkal kezelt csoportok közötti statisztikailag szignifikáns (p <0,05) különbségeket jelölik (Student-féle kétmintás t-teszt). Az ábra D része a hiperalgézia százalékos gátlása alapján számolt dózis-hatás görbéket mutatja.

38

A plantáris bőr-izom incízió okozta hőküszöbcsökkenés gátlása Az állatok a pentobarbitál altatás után 2-4 óra múlva felébredtek, a méréseket másnap reggel végeztük. Semmilyen elhárító viselkedést sem tapasztaltunk a gyógyulási idő alatt, habár a patkányok óvatosabban terhelték a műtött lábukat. A műtét után 24 órával az emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel mért hőküszöb értékek 7-8 °C-ot csökkentek. A 18-20 állatot tartalmazó kísérleti csoportokból maximum 1-2 állatot zártunk ki a további kísérletből (ezen állatoknál a küszöbcsökkenés mértéke nem érte el a 3°C-ot). Az alkalmazott antagonisták mindegyike dózisfüggően gátolta a sebészi incízió következtében kialakult küszöbcsökkenést 3-30 mg/kg p.o. dózisban (19. ábra). A minimális hatékony dózis SB705498 esetében 10 mg/kg, míg a BCTC és az AMG9810 egyaránt 3 mg/kg volt (2. táblázat). A maximális gátló hatás SB705498-nál 40,5%, BCTC esetében 52,9%, és 84,4% volt az AMG9810 antagonistánál.

A íncizió

vehikulum p.o. 3 mg/kg p.o. 10 mg/kg p.o. 30 mg/kg p.o.

Fájdalmas hőküszöb (°C)

44

kezelés

38

**

**

*

* *

36

* *

34 32

40

kezelés

*

38

* *

36

*

*

*

**

* *

*

*

34

op. előtti

op. utáni (24 ó)

32 1

2

3

4 óra

** kezelés

*

100

vehikulum p.o. 3 mg/kg p.o. 10 mg/kg p.o. 30 mg/kg p.o.

44

40

op. utáni (24 ó)

1

2

3

4 óra

D

AMG9810 íncizió

42

op. előtti

kontroll

* * *

38

* * *

*

* *

36

Hőhiperalgézia gátlása (%)

C Fájdalmas hőküszöb (°C)

vehikulum p.o. 3 mg/kg p.o. 10 mg/kg p.o. 30 mg/kg p.o.

42

kontroll

46

íncizió

44

42 40

BCTC 46

Fájdalmas hőküszöb (°C)

46

B

SB705498

BCTC SB705498 AMG9810

80

60

40

20

34 32

op. előtti

op. utáni (24 ó)

kontroll

0 1

2

3

4 óra

3

10

30

dózis (mg/kg)

19. ábra: TRPV1 receptor antagonisták hatásai plantáris bőr-izom incízióval kiváltott termális nociceptív küszöb-csökkenésre emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel mérve. A csoportonkénti 6-8 állat eredményeinek átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. A csillagok a vehikulummal illetve az antagonistákkal kezelt csoportok közötti statisztikailag szignifikáns (p <0,05) különbségeket jelölik (Student-féle kétmintás t-teszt). Az ábra D része a hiperalgézia százalékos gátlásából számolt dózis-hatás görbéket mutatja.

39

TRPV1 receptor antagonisták hatásai az alap hőküszöbre A kontroll mérések elvégzése után mindhárom antagonistát vagy a vehikulumot is beadtuk i. p. (n=9, 30 mg/kg dózisban), majd 30 illetve 60 perc elteltével emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel megmértük a termonocicepciós küszöböket. A tesztelt antagonisták egyike sem változtatta meg szignifikánsan az alap (nem szenzitizált) nociceptív hőküszöböket (nem ábrázolt adat). TRPV1 antagonisták hatásai az RTX által kiváltott latenciaidő-csökkenésre A lábon mért alap elhárító reakció latenciaideje 11,03 + 0,3 s volt, amely az i.pl. adott RTX injekció (0,06 µg) hatására 4,38 + 0,3 s-ra csökkent. Az 1 órával az RTX kezelés előtt p. o. beadott antagonista vegyületek mindegyike antihiperalgéziás hatással rendelkezett. Bár meghosszabították az elhárító reakció latenciaidejét, szignifikáns különséget csak a legnagyobb alkalmazott dózis beadásakor detektáltunk, ekkor a gátlás SB705498, BCTC és AMG9810 esetében 43%, 38% és 37% volt (20. ábra).

A

B SB705498

14

vehikulum p.o. 3 mg/kg p.o. 10 mg/kg p.o. 30 mg/kg p.o.

12

10

Nocifenzív reakció léatenciaideje (s)

Nocifenzív reakció léatenciaideje (s)

14

*

8

6

4

2

0

AMG9810 vehikulum p.o. 3 mg/kg p.o. 10 mg/kg p.o. 30 mg/kg p.o.

12

10

*

8

6

4

2

0

Kontroll

10 perccel az RTX kezelés után

Nocifenzív reakció léatenciaideje (s)

C

Kontroll

10 perccel az RTX kezelés után

BCTC

14

vehikulum p.o. 3 mg/kg p.o. 10 mg/kg p.o. 30 mg/kg p.o.

12

10

*

8

6

4

2

0

Kontroll

10 perccel az RTX kezelés után

20. ábra Az előkezelésben (1 óra) alkalmazott TRPV1 receptor antagonisták (A, SB-705498; B, AMG9810, C: BCTC) hatása RTX (0,06 µg, i. pl.) által kiváltott hőhiperalgéziában plantar teszttel vizsgálva a nocifenzív reakció megjelenéséig eltelt időt. A csoportonkénti 6-7 állat eredményeinek átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. A csillagok a vehikulummal illetve az antagonistákkal kezelt csoportok közötti statisztikailag szignifikáns (p <0,05) különbségeket jelölik (egyutas ANOVA és Tukey-Kramer multifaktor variancia teszt).

40

MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK Elsőként szolgáltattunk összehasonlító adatokat különböző gyógyszercégek által kifejlesztett három TRPV1 antagonista hatásairól, új fájdalmas hőküszöbmérő és a tradicionális

elhárító

reakciók

latenciaidejének

mérésén

alapuló

módszerekkel.

Eredményeink alapján elmondható, hogy a nociceptív hőküszöb csökkenés megvalósulhat direkt TRPV1 receptor aktiváción keresztül, enyhe hőtrauma alkalmazásával vagy sebészi incíziót követően, mely jól mérhető, nagyfokú érzékenységet mutat a vizsgált TRPV1 antagonisták mindegyikével szemben. Munkám e részében bemutatott mindhárom antagonista orális előkezelésben alkalmazva dózisfüggő módon gátolta a TRPV1 agonista RTX fájdalmas hőküszöb csökkentő hatását. Az RTX intraplantáris adása rövid ideig tartó, de enyhe nocifenzív reakciót vált ki a patkányokból, majd 20 percig fennmaradó küszöbcsökkenést eredményez (Almási és mtsai. 2003). Az SB705498 maximálisan beadott dózisa teljesen, míg a BCTC és AMG9810 75% illetve 66% védte ki a kialakult hiperalgéziát. Mivel az érintett végtagon viszonylag nagy koncentrációban volt jelen a TRPV1 agonista RTX, ez a nagyfokú gátlás igen figyelemre-méltó hatás. A TRPV1 antagonisták igen alacsony dózisban alkalmazva antihiperalgéziás hatással rendelkeztek, így minimális effektív dózisuk mindhárom esetben 1 mg/kg volt. Korábbi publikációkben ezen TRPV1 antagonisták termális vagy mechanikai hiperalgéziát csökkentő minimális effektív dózisai 3-10-szer nagyobbak voltak, (Rami és mtsai. 2006, Pomonis és mtsai. 2003, Gavva és mtsai. 2005, lásd 2. táblázat), amely módszerünk érzékenységét bizonyítja. Az általunk kidolgozott hőküszöbmérő módszerrel mindhárom tesztelt antagonista esetében 30-szor kisebb volt a minimális effektív dózis, összehasonlítva a tradicionális latenciaidő mérő teszttel (Hargreaves és mtsai. 1988) kapott eredményekkel, melyek további bizonyítékot szolgáltatnak módszerünk érzékenységére.

41

Modell RTX- indukált hőküszöb csökkenés RTX által kiváltott lábon mért elhárító reakciólatenciaidő csökkenés Enyhe hőtrauma okozta hőküszöb csökkenés Sebészi incízió okozta hőküszöb csökkenés Kapszaicin által kiváltott másodlagos mechanikai hiperalgézia Kapszaicin-indukált szemtörlések száma CFA- indukált termális hiperalgézia CFA-indukált mechanikai hiperalgézia Részleges ideglekötés okozta mechanikai hiperalgézia Részleges ideglekötés okozta mechanikai allodínia

SB705498

BCTC

AMG9810

1 mg/kg p.o.

1 mg/kg p.o.

1 mg/kg p.o.

30 mg/kg p.o.

30 mg/kg p.o.

30 mg/kg p.o.

10 mg/kg i.p

3 mg/kg i.p.

1 mg/kg i.p.

10 mg/kg p.o.

3 mg/kg p.o.

3 mg/kg p.o.

10 mg/kg p.o.a 3 mg/kg i.p. c 3 mg/kg p.o. b

30 mg/kg i.p. c

3 mg/kg p.o. b

100 mg/kg i.p. c

10 mg/kg p.o. b 10 mg/kg p.o. b

2. táblázat: TRPV1 receptor antagonisták (SB705498, BCTC és AMG9810) minimális hatékony dózisai patkányokban különböző in vivo nociceptív tesztekben vizsgálva, a jelen tanulmány és korábbi irodalmi adatok alapján. a Rami és mtsai. (2006.); b Pomonis és mtsai. (2003.); c Gavva és mtsai. (2005.)

Vizsgálataink során még két, intézetünkben korábban validált modellben (Bölcskei és mtsai. 2007, Füredi és mtsai. 2009) − egy akut / szubakut (enyhe hőtrauma), illetve egy krónikus (sebészi incízió) − határoztuk meg a vizsgált antagonisták antihiperalgetikus hatásait. Mindkét alkalmazott modell szerepét igazolták TRPV1 receptor aktivációs illetve szenzitizációs folyamatokban mind TRPV1 génhiányos egerek, illetve patkányokon TRPV1 antagonisták alkalmazásával (Bölcskei és mtsai. 2005, Pogatzki-Zahn és mtsai. 2005, Wu és mtsai. 2008, Banik és Brennan 2009). Az enyhe hőtrauma és a sebészi incízió módszerek jobban modellezik a valóságot, a humán klinikai kórképekhez közelebb állnak, mind a tünetek hasonlóságát, mind pedig a sérülés bekövetkezése után elkezdett kezelési protokollokat tekintve. Mindkét hiperalgézia modell rendkívül érzékenyen reagált a vizsgált antagonistákra, az SB705498 illetve a BCTC MED értéke 1 mg/kg volt, míg az AMG9810 vegyületé 3 mg/kg. A korábbi publikációkban megjelent adatokkal összehasonlítva elmondható, hogy módszerünk legalább annyira, vagy még érzékenyebb a fenti kísérletes paradigmák vizsgálatára (Rami és mtsai. 2006, Pomonis és mtsai. 2003, Gavva és mtsai. 2005, 2. táblázat). 42

Az enyhe hőtrauma okozta hőhiperalgéziát mindhárom vegyület gátolta, mégis a leghatékonyabb vegyületnek az AMG9810 bizonyult, mivel a legkisebb MED értékkel a legnagyobb gátlást érte el, míg a legkevésbé hatékony ez esetben az SB705498 volt. Érdekes módon mind az SB705498, mind pedig a BCTC hatása a legnagyobb alkalmazott dózisban csökkenést mutatott, melynek oka ismeretlen. A sebészi incíziót követő hőküszöb csökkenés gátlása dózis-hatás összefüggéseket mutatott mindhárom vizsgált antagonista esetében. Meglepő módon, habár mindhárom anyag hatékonysága hasonló, az AMG9810 mégis határozottan nagyobb mértékű gátlást ért el a másik két antagonistához viszonyítva. E modellben mind a BCTC, mind pedig az AMG9810 minimális effektív dózisa azonos, de kisebb volt, mint az SB705498-é. Említésre méltó, hogy ugyanazon TRPV1 antagonisták esetében az egyes modellekben eltérő hatékonyságot tapasztaltunk. Például az SB705498 esetében, ahol maximális gátlást értünk el az RTX-indukálta hőhiperalgézia modellben, míg ez a gátlás az enyhe hőtrauma modellben 50%, illetve a sebészi incízió okozta hiperalgézia modellben pedig 40% volt. Hasonló, de kevésbé kifejezett mintázat figyelhető meg a BCTC esetében is. Ennek egyik magyarázata lehet, hogy a TRPV1 receptor korlátozott szerepet játszik a hőtrauma, illetve a sebészi incíziót követő hőhiperalgézia fenntartásában. Korábbi publikációkban patkányokon vizsgálva, az incízió következtében létrejövő hőhiperalgéziát más TRPV1 antagonisták is csak részben gátolták (A-425619, ABT-102 és AMG0347, Honoré és mtsai. 2005, 2008, Wu és mtsai. 2008). Másik lehetséges magyarázat az lehet, hogy a TRPV1 antagonisták hatékonysága csökken, ha a TRPV1 receptor szenzitizálódik. A legnagyobb dózisban alkalmazott TRPV1 receptor antagonisták egyike sem változtatta meg az alap kontroll hőküszöb értékeket. Ez az eredmény megegyezik a korábban, más kutatócsoportok által közöltekkel, melyeknél nem volt kimutatható változás a patkányok alap (kontroll, nem érzékenyített), lábon mért elhárító reakció latenciaidejében TRPV1 receptor antagonisták (BCTC, A-425619 és ABT-102) adása után (Pomonis és mtsai. 2003, Honoré és mtsai. 2005, 2008). A TRPV1 receptor szenzitizációjának valószínűsített mechanizmusa, számos intracelluláris protein-kináz foszforilációja révén valósul meg, főként a protein-kináz C (Premkumar és mtsai. 2000, Vellani és mtsai. 2001) vagy protein-kináz A (Bhave és mtsai. 2002, Varga és mtsai. 2006) játszik fontos szerepet a folyamatban. Bizonyos gyulladásos mediátorok, mint pl.

bradikinin

és

prosztaglandinok

is

közreműködnek

a

TRPV1

receptorok

aktívációjában/szenzitizációjában a protein-kináz A és C útvonalon keresztül (Sugiura és 43

mtsai. 2002, Moriyama és mtsai. 2005). Mind az intraplantárisan adott ciklooxigenázgátlók (Bölcskei és mtsai. 2007, Füredi és mtsai. 2009), mind pedig a B2 bradikinin receptor antagonista HOE 140 gátolta az enyhe hőtrauma- illetve a sebészi incízió-okozta hőküszöb csökkenést (Füredi és mtsai. 2010). A TRPV1 receptor nélkülözhetetlen más típusú hiperalgéziás illetve szenzitizációs mechanizmusokban is (Caterina és mtsai. 2000, Davis és mtsai. 2000, Walker és mtsai. 2003, Pomonis és mtsai. 2003, Gavva és mtsai. 2005, Honoré és mtsai. 2005, Zimmermann és mtsai. 2005). A gyógyszerfejlesztésben a TRPV1 antagonisták jövője továbbra is problémás, köszönhetően potenciális, súlyos hipertermiát okozó hatásuknak (Gavva és mtsai. 2007, Holzer és mtsai. 2008, Szolcsányi 2008). Azonban irodalmi adatok szerint hipertermizáló hatásuk szétválasztható a TRPV1 receptor antagonizáló hatástól, ahogy ez néhány újonnan kifejlesztett TRPV1 ligand esetében is tapasztalható (Letho és mtsai. 2008). A klinikai fázisig eljutó első szerek, melyek 3 aktivátor (kapszaicin, hő és protonok) hatását képesek blokkolni, vagy erős hipertermiát okozó mellékhatásaik vagy hatástalanságuk miatt pedig nem kerültek forgalomba. Antagonista neve

Terápiás indikáció

Fejlesztési stádium

DWP-05195

neuropátiás fájdalom post herpeszes neuralgia

Fázis I./II.

PHE377 PHE 575 MR-1817 ABT-102 ABT-116 ABT-443 AMG-517 AMG-628

neuropátiás fájdalom per os fájdalomcsillapító gyulladás, szöveti sérülés vagy iszkémia következtében kialakuló fájdalom fájdalom

Fázis I. (folyamatban) Preklinikai fejlesztés Fázis I. Fázis I. Fejlesztés alatt Fejlesztés alatt Fázis I.B (leállított) Fejlesztés alatt

JTS-653 MK-2295

krónikus fájdalom /özofágeális reflux fájdalom, migrén és oszteoartritisz, fájdalmas hólyag szindróma fájdalom fájdalom

SB-705498

rinitisz, krónikus köhögés,

JNJ-39729209 AS(P)-1928370 AS-1725195

cisztitis, köhögés, és pruritusz

Fázis II. (felfüggesztve) Fázis II. (teljesített) Fázis II. migrén és rektális fájdalom (befejezett), Fázis II. nem allergiás rinitisz (intranazális adás-folyamatban), fejlesztés alatt

fájdalom

fejlesztés alatt

AZD-1386 GRC-6211

Fázis II. (leállított) Fázis II. oszteoartritisz vizsgálat (felfüggesztve)

3. táblázat: Klinikai vizsgálatokba bevont TRPV1 antagonisták státuszai (Forrás: Trevisani és Gatti 2013, módosított).

44

Az újabb antagonisták, melyek blokkolják a kapszaicin TRPV1 receptor aktiváló hatását, de nem befolyásolják sem az alacsony pH, sem pedig a hő által kiváltott stimulációt, feltehetően nem változtatják meg a maghőmérsékletet. Ezen szerek klinikai fázisvizsgálati eredményei ezidáig nem ismertek. Mindezek alapján reménykeltő annak a lehetősége, hogy sikerül TRPV1-antagonizmuson alapuló perifériás támadáspontú analgetikumokat kifejleszteni.

45

3. fejezet: A TRPV1 és TRPA1 receptorok szerepének vizsgálata az alap hőérzékelésben és mustárolaj által kiváltott hiperalgézia

modellben

receptor

génhiányos

egerek

felhasználásával Absztrakt: Tékus V, Hajna Z, Horváth A, Kun J, Bölcskei K, Szolcsányi J, Helyes Z: Role of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 and Ankyrin 1 (TRPV1 and TRPA1) ion channels in thermonociception in mice. CLINICAL NEUROSCIENCE 65:(1) p. 68. (2012) (eredeti közlemény elküldése folyamatban) BEVEZETÉS, IRODALMI HÁTTÉR A homeosztázis fenntartásában nélkülözhetetlen a környezeti hőmérséklet érzékelése, a szövetek károsodásával is járó extrém hideg, illetve forró ingerek elkerülése alapvető fontosságú az élővilágban. A hőérzékelésben szerepet játszó pontos mechanizmusok mindezidáig nem tisztázottak. Kutatásaink során a forró ingerek detektálására alkalmas TRPV1 receptor és a hidegérzékelésben máig vitatott jelentőséggel bíró TRPA1 receptor funkciójára (lásd 10. oldal) fókuszáltunk. A TRPV1 receptor szerkezetének pontosabb megismerésére a receptor klónozása adott lehetőséget, melynek segítségével derült fény arra, hogy a receptort a fájdalmas hőingerek és az alacsony pH közvetlenül képes aktiválni, valamint, hogy központi szerepet játszik a nociceptort érő fájdalmas stimulusok integrálásában is (Caterina és mtsai. 1997; Tominaga és mtsai. 1998). A gyulladásos illetve fájdalommal járó folyamatokban betöltött szerepének részletesebb tanulmányozása akkor vált lehetővé, amikor 2000-ben két kutatócsoport egymástól függetlenül TRPV1 receptor génhiányos egereket állított elő (Caterina és mtsai. 2000; Davis és mtsai. 2000). A TRPA1 receptort már 1999-ben klónozták (Jaquemar és mtsai. 1999), ennek ellenére neuronokon való expresszálódását csak 2003-ban közölték (Story és mtsai. 2003), akik a receptort, a fájdalmas intenzitású hideg ingerek szenzoraként azonosították. Mivel korábban e két receptor szerepének feltérképezése főként akut modellekben volt lehetséges antagonisták adása révén, génhiányos egerek alkalmazásával a receptorok működése és jelentősége vizsgálhatóvá vált krónikus kísérletekben is. Az eltelt évtizedben a TRPV1 génhiányos egerek intenzív kutatása zajlott, hogy pontosabban meghatározzák a receptorok szerepét normál fiziológiai és patológiás körülmények között. 46

Az egyik elsőként TRPV1 génhiányos egereken elvégzett kísérletben megállapították, hogy a receptor esszenciális termális hiperalgéziában (Davis és mtsai. 2000), azonban szerepe az alap hőérzékelésben nem tisztázott (Caterina és mtsai. 2000). Ezt erősítik kutatócsoportunk korábbi eredményei is, melyekben a TRPV1 génkiütött egerek nociceptív hőküszöbe nem különbözött a vad típusúakétól (Almási és mtsai. 2003), azonban TRPV1-/- állatokban szignifikánsan kisebb mértékű volt a hőtraumával kiváltott termális és mechanikai hiperalgézia mértéke (Bölcskei és mtsai. 2005). A mustárolaj a természetben is megtalálható növényi eredetű irritáns, melyet hosszú ideje alkalmaznak a népi gyógyászatban. Korábban a TRPA1 receptor szelektív exogén agonistájaként tartották számon (Jorgt és mtsai. 2004), azonban szelektivitása megkérdőjelezhető, mivel feltehetően szerepet játszik a TRPV1 receptor aktivációjában is (Gees és mtsai. 2013, Everaerts és mtsai. 2011). A benne található allil-izotiocianátot (AITC) ˗ a kapszaicinhez hasonlóan ˗ kémiai fájdalomkeltő hatása miatt régóta használják a gyulladás mechanizmusainak vizsgálatához. Az RTX-szel deszenzibilizált egerek elvesztették válaszkészségüket kapszaicinnel szemben ugyanakkor csökkent érzékenységet mutattak mustárolajjal szemben is, melynek egyik lehetséges magyarázata a két receptorra jellemző nagyfokú koexpresszió (Pecze és mtsai. 2009). Egereken egyenletesen emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel végzett lábon mért nociceptív hőküszöb-vizsgálatok nem ismertek az irodalomban. Mivel az egerek rosszul tűrik a kézben tartást, továbbá a relatív kisméretű lábon a mérés nehézkes, ezért figyelmünk központjába az egérfarok vizsgálata került. Kísérleteink során az intézetünkben fejlesztett emelkedő hőmérsékletű vízfürdőt egy egérkaloda alkalmazásával alkalmassá tettük az egerek farkán mért nociceptív hőküszöb vizsgálatokra. CÉLKITŰZÉS PhD munkám e részének célja volt a korábban intézetünkben patkány lábon mért hőküszöb meghatározására kidolgozott emelkedő hőmérsékletű vízfürdő módszertani fejlesztése, mely lehetőséget teremt az egerek farkán mért hőküszöb értékek meghatározására is. Mivel az irodalomban ellentmondásos adatok állnak rendelkezésre mind a TRPV1, mind pedig a TRPA1 receptor hő- és mechanikai-érzékelésben betöltött szerepével kapcsolatban (lásd. 10. oldal), munkám további célja volt génhiányos egerek felhasználásával tisztázni és vizsgálni e receptorok funkcióit fájdalmas küszöbmérésre alkalmas módszerekkel. 47

Mivel a receptorok szerepe feltehetően függ az érzőideg-végződések aktivációs mechanizmusától, a választott kísérleti modellektől, illetve az alkalmazott vizsgálati módszerektől, kidolgoztunk és validáltunk egy megbízhatóan működő, mustárolaj által kiváltott hiperalgézia modellt, melyben az eltérő testtájak tanulmányozása vált lehetővé. KÍSÉRLETI MODELLEK Kísérleti állatok Az előkísérleteket hím CD1 állattörzsbe tartozó egereken (25-35g), míg további vizsgálatainkat hím TRPV1 és TRPA1 génhiányos egereken és ezek vad típusú megfelelőin végeztük. Mindkét génhiányos állattörzs genetikai alapját a C57Bl/6 törzs képezi. A TRPV1 génkiütött egerek (TRPV1-/-) eredeti szülőpárjait a Jackson Laboratories (USA) cégen keresztül vásároltuk, míg a TRPA1 génhiányos állatok eredeti szülőpárjait (TRPA1-/-) Dr. Pierangelo Geppetti a firenzei Egyetem professzora bocsátotta rendelkezésünkre. A kísérletekhez felhasznált állatokat a Pécsi Tudományegyetem Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézetének állatházában tenyésztettük, standard 25 °Con vízzel és élelemmel ad libitum ellátva. Felhasznált anyagok A mustárolajat (allil-izotiocianát, AITC) a Sigma-Aldrich Kft.-től (Magyarország), míg a 96%

etanolt,

a

paraffin

olajat

és

a

dimetil-szulfoxidot

(DMSO)

a

Reanal

Finomvegyszergyár Zrt.-től vásároltuk. Előkísérletek és módszertani fejlesztések Előkísérleteink során az egyenletesen emelkedő hőmérsékletű vízfürdőt adaptáltuk egerekre. Az egerek többnyire rosszul tűrik a kézbevételt, ezért a mérések

standardizálásához

egy

egérkalodát

fejlesztettünk ki, melyeket szellőzőlyukakkal ellátott műanyag csövekből alakítottunk ki. Az állatok behelyezése

után

a

kalodákat

egy

állványon

rögzítettük, úgy hogy a farkuk pont a megfelelő mélységben érjen bele a víztartályba (21. ábra). Pár perc habituáció után megmértük az állatok fájdalmas 21. ábra: Emelkedő hőmérsékletű vízfürdő, egerek részére kifejlesztett kalodával

48

hőküszöbét, majd a mérést 10 percenként 1 órán keresztül ismételtük két egymást követő napon. Összehasonlításképpen a vizsgált állatok alomtestvéreinek hőküszöb értékeit detektáltuk, úgy, hogy az egereket a vizsgálatot végző személy a kezében tartotta. Mustárolaj hatására létrejövő hiperalgézia modell kidolgozásakor a legalkalmasabb oldószer kiválasztásához a mustárolajat 96% etanolban, paraffin olajban, illetve 30% dimetil - szulfoxidban (DMSO) oldottuk, majd a hőküszöb-csökkentő hatást detektáltuk. Ezután további kísérleteket végeztünk 0, 5, 1, 2, 5% mustárolaj alkalmazásával a megfelelő mustárolaj koncentráció kiválasztásához. Az alap termonociceptív küszöbök meghatározása Az egerek fájdalmas hőküszöbét a bevezetőben (lásd 14. oldal) bemutatott egyenletesen emelkedő hőmérsékletű forró lap alkalmazásával detektáltuk a hátsó lábon, míg a farkon, az előző pontban bemutatott módosított emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel vizsgáltuk az újonnan kifejlesztett csövek segítségével. Mustárolaj által kiváltott termális hiperalgézia vizsgálata A mustárolaj hatására kialakuló hőküszöbcsökkenést a hátsó lábon vagy farkon az emelkedő hőmérsékletű forró lappal vagy vízfürdővel határoztuk meg. A kontroll mérések elvégzése után az állatok lábát 60 s-ig, míg farkát 30 s-ig 1%-os, 30% DMSO-t tartalmazó mustárolajba merítettük, majd a hőküszöb-változást 1 órán keresztül 10 percenként detektáltuk. Mustárolaj hatására kialakuló mechanikai hiperalgézia vizsgálata Az egerek lábán mért érintési érzékenységet dinamikus plantáris észteziométerrel vizsgáltuk. A szoktató és kontroll mérések elvégzése után az egerek egyik hátsó lábát 60 másodpercre 1%-os mustárolajba merítettük, majd 30, 60, 120, 180 perccel később megmértük az állatok mechanonociceptív küszöbét. Mustárolaj hatására kialakuló akut nocifenzív reakció latenciaidejének vizsgálata Az állatok farkát, illetve lábát 1%-os mustárolajba merítettük és az elhárító reakció megjelenéséig eltelt időt detektáltuk. Elhárító reakciónak a farok illetve láb erőteljes megrázását tekintettük. A latenciaidő maximális értékét 3 percben határoztuk meg.

49

Statisztikai analízis A kapott eredmények statisztikai értékelését kétutas ANOVA utáni Bonferroni módosított post hoc teszttel végeztük. Minden esetben a * p <0,05 értéket tekintettük szignifikáns eltérésnek. EREDMÉNYEK Előkísérletek Az emelkedő hőmérsékletű vízfürdő módszertani fejlesztésekor egyik mérési pontban sem tapasztaltunk szignifikáns eltérést az állatok kézben tartása, illetve csőbe zárása között. Ugyanakkor, a kaloda alkalmazásával jelentősen csökkent a vizsgálati állatok előkészítésének ideje, ezáltal időegység alatt több állat mérésére nyílt lehetőség (22. ábra). csőbe zárt kézben tartott

Fájdalmas hőküszöb (°C)

48 47 46 45 44 43 42 0

10

20

30

40

50

60

idő (perc) 22. ábra: Farkon mért fájdalmas hőküszöb meghatározása csőbe zárva illetve kézben tartva egyenletesen emelkedő hőmérsékletű vízfürdő segítségével. Fűtési sebesség: 12°C/perc. A csoportonkénti 8 állat eredményeinek átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. Egyik vizsgálati időpontban sem tapasztaltunk statisztikailag szignifikáns (p <0,05) különbségeket.

Előkísérleteteink

következő

részében

a

mustárolaj

megfelelőnek

oldószerének

kiválasztásához, 5% MO-t oldottunk 96% -os etanolban vagy paraffin olajban, illetve 30% DMSO-ban. Az emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel detektálható hőküszöb csökkenés az első két esetben csak 1-2 °C fok volt, míg 30% DMSO-ban oldva jóval nagyobb, szignifikáns küszöbcsökkenést mértünk. A 30%-os DMSO oldat önmagában nem okozott változást a termonociceptív küszöbben, így a későbbi kísérleteink során kontrollként alkalmaztuk (23. A ábra). 50

A 2, illetve 5% százalék mustárolajat tartalmazó oldatok alkalmazása során jelentős küszöbcsökkenést és esetenként szobahőmérsékleten jelentkező spontán fájdalmat detektáltunk. Mivel az 1%-nál kisebb MO tartalmú oldatok esetében nem találtunk szignifikáns küszöbcsökkentő hatást, ezért kísérleteink további részében a 10-12°C csökkenést eredményező, szobahőmérsékleten spontán fájdalmat nem indukáló 1 %-os mustárolaj-oldatot használtuk (23. B).

A

B 50

Fájdalmas hőküszöb (°C)

48 46 44

5% MO paraffinban oldva 5% MO 96%-os etanolban oldva 5% MO 30% DMSO-ban oldva 30% DMSO

42 40 38 36

** *

34

Fájdalmas hőküszöb változása (°C)

20

0% MO 1% MO

18

0,5% MO 2% MO

5% MO

16 14

***

12

***

10 8

**

6 4 2 0 -2

0

10

20

30

40

50

60

0

Kezelés után eltelt idő (perc)

10

20

30

40

50

60

Kezelés után eltelt idő (perc)

23. ábra: A termális hiperalgézia kiváltásához szükséges megfelelő vivőanyag és mustárolaj koncentráció meghatározása egyenletesen emelkedő vízfürdő módszerrel vizsgálva. Az ábra A része a fájdalmas hőküszöb értékeket mutatja 5%-os mustárolaj (MO) kezelés (farok oldatba merítése) előtt és 10-60 perccel később, paraffinban, 96%-os etanolban és 30% DMSO-ban oldva. Az ábra B része különböző koncentrációjú MO (30% DMSO-ban oldott) oldatok hőküszöb csökkentő hatását szemlélteti. A csoportonkénti 6-9 állat eredményeinek átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. A csillagok az oldószerrel kezelt (0% MOtartalmazó) illetve a különböző koncentrációjú MOcsoportok közötti statisztikailag szignifikáns (p<0,05) különbségeket jelölik (Kétutas ANOVA és Bonferroni post hoc teszt).

Alap (kontroll) hőküszöb értékek meghatározása Meglepő módon a TRPV1 génhiányos egerek a farkán szignifikánsan magasabb hőküszöb értéket detektáltunk (TRPV1-/-: 45,42 + 0,34°C), mint vad típusú megfelelőiknél (TRPV1+/+: 42,98 + 0,4°C). A láb vizsgálatakor azonban nem találtunk statisztikai különbséget (TRPV1-/-: 46,04 + 0,4°C illetve TRPV1+/+: 45,52 + 0,4 °C) (24. A ábra). TRPA1 génhiányos egerekben sem a farkon (TRPA1-/-: 43,57 + 0,7 °C, TRPA1+/+: 43,07 + 0,4 °C), sem a lábon (TRPA1-/-: 44, 87 + 0,5 °C, TRPA1+/+: 45,22 + 0,6 °C) nem volt szignifikáns különbség (24. B ábra). A különböző testtájak vizsgálatakor csak az alap hőküszöb értékek meghatározásához használtuk fel ugyanazon állatokat, tekintve, hogy

51

ezen mérések nem voltak invazívak. Az eltérő testtájon történő mustárolaj kezelések során, kezelésenként egymás alomtestvéreit használtuk.

B

A

48

TRPV1 +/+ TRPV1 -/-

Fájdalmas hőküszöb (°C)

Fájdalmas hőküszöb (°C)

48

**

46

44

42

40

TRPA1 +/+ TRPA1 -/-

46

44

42

40

FAROK

LÁB

FAROK

LÁB

24. ábra: A TRPV1 (A) és TRPA1 (B) génhiányos egerek és azok vad típusú megfelelőinek farkon (emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel) illetve lábon (hot plate készülékkel) mért alap fájdalmas hőküszöb értékei. A csoportonkénti 6-9 állat eredményeinek átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. A csillagok a génhiányos és vad típusú egerek közötti statisztikailag szignifikáns (p <0,05) különbségeket jelölik (Studentféle t-próba).

Mustárolaj által kiváltott termális hiperalgézia vizsgálata TRPV1+/+ állatok farkon mért fájdalmas hőküszöb értékei 10 perccel a mustárolaj kezelést követően a kiindulási kontroll szintről (43,53 + 0,33 °C) 35,96 + 1,23 °C-ra csökkent. Ezzel szemben a TRPV1 génhiányos egerekben ez a csökkenés szignifikánsan kisebb volt (46,05 + 0,35°C-ról 40,6 + 0,6 °C-ra). A két csoport közti küszöbcsökkenés különbsége (átlagosan 4-6 °C) a kísérlet folyamán végig fennmaradt (25. A ábra). TRPA1 receptor hiánya illetve megléte esetében közel azonos mértékű hőküszöbcsökkenést detektáltunk az egerek farkán (25. B ábra). TRPV1+/+ és TRPA1+/+ állatok lábon mért kontroll fájdalomküszöbeinek átlaga (44,8 + 0,4°C és 45,0 + 0,2 °C), 20 perccel a mustárolaj kezelést követően átlagosan 12-14°C–kal csökkent. A kísérlet végéig fennmaradó csökkenés a TRPA1-/- állatok esetében nem (25. D ábra), míg a TRPV1 génhiányos egereknél szignifikánsan kisebb volt vad típusú megfelelőikhez képest (25. C ábra).

52

A

B 48

*

*

*

46

**

44

*

*

42 40 38 36

Fájdalmas hőküszöb (°C)

Fájdalmas hőküszöb (°C)

50

TRPV1 +/+ TRPV1 -/-

50

46 44 42 40 38 36 34

34 32

32 0

10

20

30

40

50

60

0

20

30

40

50

D

48

***

***

42

**

**

40 38 36 34

TRPV1 +/+ TRPV1 -/-

32

46

Fájdalmas hőküszöb (°C)

44

**

60

LÁB

48

46

Fájdalmas hőküszöb (°C)

10

1%-os mustárolaj kezelés után eltelt idő (perc)

1%-os mustárolaj kezelés után eltelt idő (perc)

C

FAROK

TRPA1+/+ TRPA1-/-

48

44 42 40 38 36 34

TRPA1 +/+ TRPA1 -/-

32

30

30 0

10

20

30

40

50

60

0

10

20

30

40

50

60

1%-os mustárolaj kezelés után eltelt idő (perc)

1%-os mustárolaj kezelés után eltelt idő (perc)

25. ábra: 1% mustárolaj által kiváltott termális hiperalgézia vizsgálata TRPV1 és TRPA1 génhiányos állatok farkán emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel (30 s; A-B), illetve lábán (60 s; C-D) emelkedő hőmérsékletű forró lappal. A csoportonkénti 6 állat eredményeinek átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. A csillagok a génhiányos egerek és azok vad tipusú megfelelőik közötti statisztikailag szignifikáns (p <0,05) különbségeket jelölik (kétutas ANOVA és Bonferroni post hoc teszt).

Mustárolaj által kiváltott mechanikai hiperalgézia meghatározása A

mustárolaj

kezelés

után

30

perccel

a

vad

típusú

állatoknál

45-55%-os

mechanonociceptív küszöbcsökkenést detektáltunk. Ez a csökkenés a TRPV1 génhiányos egereknél szignifikánsan kisebb mértékű, 25% körüli volt, mely különbség a kísérlet végéig fennmaradt (26. A ábra). Érdekes módon a mustárolaj-kezelés mind a TRPA1 receptorral rendelkező, illetve nem rendelkező állatokban hasonló hatást ért el, vagyis a kialakult mechanikai hiperalgézia közel azonos mértékű volt (26. B ábra).

53

A

B ***

-5

Mechanonociceptív küszöb változása (%)

***

***

***

-10 -15 -20 -25 -30 -35 -40

TRPV1 +/+ TRPV1 -/-

-45 -50 -55

Mechanonociceptív küszöb változása (%)

0

0

-5 -10 -15 -20 -25 -30 -35 -40

TRPA1 TRPA1

-45

+/+ -/-

-50 -55 -60

-60 0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

1% mustárolaj kezelés után eltelt idő (perc)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

1% mustárolaj kezelés után eltelt idő (perc)

26. ábra: 1%-os (60s) mustárolaj hatására kialakuló mechanikai hiperalgézia lábon dinamikus plantáris észteziométerrel mérve. A TRPV1 (A) és TRPA1 (B) génhiányos egerek és azok vad típusú megfelelőinek mechanonociceptív küszöbváltozásainak átlagát azok standard hibáival együtt ábrázoltuk (*** p <0,001; n= 7-11, kétutas ANOVA Bonferroni post hoc-teszt).

Mustárolaj által kiváltott akut nocifenzív reakció A TRPV1+/+ állatok farkán mért elhárító reakció megjelenéséig eltelt idő 103 + 14 s volt a mustárolajat nem tartalmazó oldatban, mely szignifikánsan nagyobb volt, mint a mustárolajat tartalmazó oldatban töltött idő (48 + 5 s). Ezzel szemben a TRPV1-/- állatok a nocifenzív reakció megjelenéséig mustárolajban töltött ideje szignifikánsan nagyobb volt (89 + 13 s) (27. A ábra). Hasonló eredményt kaptunk a TRPA1+/+ állatok vizsgálata során, mustárolaj nélküli oldatban 63 + 8 s töltöttek a nocifenzív reakció megjelenéséig, míg 1%os mustárolaj oldatban ez az idő szignifikánsan kisebb volt (26 + 4 s). A TRPA1-/- állatok farkán mustárolajban detektált elhárító reakció megjelenéséig eltelt idő szignifikánsan magasabb volt vad típusú társaikhoz képest (82 + 13 s) (27. B ábra).

54

B

A

140

120

*

100

80

#

60

40

20

Mustárolajban töltött idő (s)

Mustárolajban töltött idő (s)

140

120

*** 100

0

TRPV1 +/+ szolvens

TRPV1 +/+ 1% MO

TRPV1 -/1% MO

80

60

#

40

20

0

TRPA1 +/+ szolvens

TRPA1 +/+ 1% MO

TRPA1 -/1% MO

27. ábra: Mustárolajjal kiváltott akut nocifenzív reakció latenciaideje génhiányos (TRPV1 (A), TRPA1 (B)) és vad típusú egerek farkán. A csoportonkénti 8-16 állat eredményeinek átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. A * p <0,05, *** p <0,001 a vad tipusú egerekhez viszonyított, míg a # p <0,05 statisztikailag szignifikáns különbségeket jelölik. (egyutas ANOVA és Bonferroni post hoc teszt).

3.5. MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK Az emelkedő hőmérsékletű vízfürdő készülék metodikai továbbfejlesztésével lehetőségünk nyílt az egérfarok vizsgálatára, melyre a korábban alkalmazott módszerek nem voltak alkalmasak. Alkalmazásával a mérési folyamat illetve az állatok előkészítése gyorsabbá vált, standardizálva ezzel az emberi jelenlétből adódó különbségeket és az állatokat érő stressz mértékét. A kidolgozott új metodika megbízható, gyors, preklinikai szűrőmódszerré válhat. A fájdalmas hőinger aktiválja a TRPV1 receptort (Caterina és mtsai. 1997), azonban szerepét az irodalomi adatok szerint eddig kizárólag lábon vizsgálták, amely végtagon az alap-hőérzékelésben betöltött funkciójának jelentőségét nem tudták igazolni (Caterina és mtsai. 2000; Almási és mtsai. 2003; Bölcskei és mtsai. 2005), kivéve egy publikációt (Hoffmann és mtsai. 2013). A TRPV1 receptor eltérő módon vesz részt a hő által kiváltott nocifenzív viselkedés indukálásában (Caterina és mtsai. 2000). Vizsgálataik során a TRPV1 génhiányos egerek kevésbé voltak érzékenyek egyes hővel kiváltott ingerekre, (például a farok 48°C fokos vízbe merítésére), míg másokra fokozottabban reagáltak (lábon vizsgált fókuszált sugárzó hő). Hasonló ellentmondásos eredményről számolt be Davis és mtsai., akik TRPV1 receptorokat nem expresszáló DRG neuronokat vizsgáltak elektrofiziológiai módszerekkel. A vizsgált sejtek fájdalmas intenzitású hőingerekkel nem 55

voltak aktiválhatók, azonban a TRPV1 génhiányos egerek normál módon reagáltak a forró ingerekre (Davis és mtsai. 2000). Hoffmann és munkatársai TRPV1 és TRPA1 génhiányos, illetve egyik gént sem tartalmazó TRPV1-/-/TRPA1-/- állatok latenciaidejét detektálták plantar teszt segítségével. Kísérleteik során elsőként tapasztaltak normál körülmények között mindhárom génhiányos törzsben megnyúlt latenciaidőt vad típusú megfelelőikhez képest.

Feltételezéseik szerint a TRPA1 receptor is részt vesz a hő által kiváltott

nocicepció detektálásában, azonban a TRPV1 receptortól eltérő módon (Hoffmann és mtsai. 2013). A módosított emelkedő hőmérsékletű vízfürdő és forró lap módszerek alkalmazásával lehetőség nyílik a láb és a farok hőérzékelésének egyidejű összehasonlítására. E módszerek segítségével elsőként szolgáltattunk adatokat arra nézve, hogy TRPV1 génhiányos egerek farkán mérve szignifikánsan magasabb hőküszöbértékek detektálhatók, mint vad típusú társaiknál, míg a lábon hot plate-tel mérve nem tapasztaltunk különbséget. Az általuk tapasztalt eltérő testtájakon vizsgált adatok alátámaszthatják az általunk közölt és tapasztalt szignifikáns különbségeket, melyeket a TRPV1 génhiányos egerek farkán mért alap fájdalom küszöbértékekben találtunk. A korábbi adatokkal megegyezően, ez a különbség a lábon mérve kísérleteinkben sem jelentkezett (Caterina és mtsai. 2000, Almási és mtsai. 2003). Mindezek alapján feltételezhető, hogy az egerek hőérzékelésében a farok nagyobb relevanciával bír, mint a láb, illetve az egyes testtájak feltehetően eltérő receptor denzitással jellemezhetők. A metodikai fejlesztésünk másik része egy megbízhatóan működő, validált mustárolaj által kiváltott hiperalgézia modell beállítása volt. Korábbi irodalmi adatokból ismert, hogy a mustárolaj TRPA1 receptor aktivátor (Jorgt és mtsai. 2004, Bandell és mtsai. 2004). Kísérleteinkben a TRPA1 génhiányos egerekben és vad típusú kontrolljaikban a mustárolaj által kiváltott gyulladásos hiperalgézia mind a farkon, mind pedig a lábon ugyanakkora mértékű volt, amelyből arra következtettünk, hogy bár a mustárolaj számos rendszerben aktiválja a TRPA1 receptort, esetünkben csak a mustárolaj kiváltotta nocifenzív viselkedésben játszott szerepet. A mustárolaj a TRPV1 vad típusú egerekben is testtájtól függetlenül indukált gyulladásos (termális és mechanikai) hiperalgéziát. A kialakuló hiperalgézia mértéke azonban TRPV1 génhiányos egerek esetében szignifikánsan kisebb mértékű volt. Mivel azonban a TRPV1-/- egerekben is kialakult a hiperalgézia, feltehetően más,

még

nem

azonosított

elemek

is

szerepet

játszhatnak

kialakulásának

mechanizmusaiban. 56

A kapott eredmények alapján erősen feltételezhető, hogy a mustárolaj nem szelektív a TRPA1 receptorra nézve, hanem a TRPV1 receptort is aktiválja. Ezt a nézetet támasztja alá Everaerts és munkatársai, akik szerint a mustárolaj a TRPV1 ioncsatorna meghatározó mediátora. (Everaerts és mtsai. 2011). Feltételezésük szerint a mustárolaj a TRPV1 lassú és tartós aktiválásával az akut fájdalomérzést, míg a TRPA1 gyors és átmeneti stimulálásával a már korábban részletezett neurogén gyulladást hozza létre (Everaerts és mtsai. 2011). Az elektrofil ágensek e csatornákat a citoszolikus cisztein oldalláncok kovalens modifikációja révén aktiválják (Hinman és mtsai. 2006), azonban a mustárolaj okozta TRPV1 aktiváció mechanizmusa nem pontosan ismert. Feltételezések szerint a mustárolaj által kiváltott TRPV1 receptor aktivációban a cisztein oldalláncok kovalens módosulása mellett az aktiváció eredményessége nagymértékben függ az S513-as kapszaicin kötőhelyet is tartalmazó oldallánc modifikációjától (Gees és mtsai. 2013). In vitro

kísérletek

során

Alpizar

és

munkatársai

TRPV1

receptor-overexpresszált

sejtvonalakat vizsgáltak patch clamp és intracelluláris Ca2+ imaging módszerekkel. A vizsgált sejtvonalak hőingerekre mustárolaj jelenlétében szignifikánsan nagyobb csatornaaktivációt mutattak, mint kontroll körülmények között (Alpizar és mtsai. 2014). Kísérleteinkban a TRPA1 receptor a mustárolaj indukálta hiperalgézia modellben nem, csak

a

nocifenzív

reakció

vizsgálatakor

játszott

szerepet.

Ezen

eredmények

ellentmondanak Salas és munkatársai génexpressziós hipotézisének, mely szerint TRPV1 gén kiütésével, a TRPA1 receptor génexpressziója is csökken egy még nem ismert mechanizmusú interakció révén, és ennek eredményeképpen a sejtfelszínen a TRPA1 receptor „down-regulálódik” (Salas és mtsai. 2009). Így a mustárolaj csak azokon az idegvégződéseken tudja kifejteni a hatását, ahol e két ioncsatorna nem koexpresszálódik, azonban ezek a neuronok az összmennyiséghez képest kis hányadot képviselnek, így a gyulladásos hiperalgázia kisebb és az akut fájdalom elhárító viselkedés reakcióideje hosszabb lesz a TRPV1 gén hiánya esetén. Tehát fájdalommodelljeinkben a TRPV1 játszotta a kulcsszerepet, hiszen esszenciálisnak bizonyult mind a fájdalomérzékelésben, mind a mustárolaj-indukált hiperalgéziában. A perifériás és centrális szenzitizáció patomechanizmusaiban feltételezhetően a TRPV1 és TRPA1 receptorok is szerepet játszanak. Szöveti károsodás során a bőrben vagy a belső szervekben található nociceptorok ingerküszöbe lecsökken a felszabaduló gyulladásos mediátorok hatására, így kialakul a perifériás szenzitizáció (Mezei és mtsai. 2002). Ezek a gyulladásos mediátorok (pl. lipoxigenáz termékek, prosztaglandinok, bradikinin stb., lásd 57

9. oldal) a TRPV1 és a TRPA1 receptorokon keresztül fejtik ki hatásukat. Ezt követően a gerincvelő hátsó szarvában elhelyezkedő neuronok érzékenysége fokozódik, mivel a nociceptorok felől érkező folyamatos ingerek hatására excitátoros neurotranszmitterek (pl. glutamát) szabadulnak fel. Krónikus fájdalomingerek hatására ezen neurotranszmitterek túlprodukciója eredményeként a hátsószarvi gátló interneuronok egy része elpusztul. Fokozódik a Na+- és a Ca2+ csatornák illetve a kolecisztokinin (CCK) receptorok expressziója, ami hiperexcitabilitáshoz és leszálló fájdalom-moduláló pálya gátlásához vezet (a CCK antagonizálja az endogén opioidok hatását). Mindezek következtében csökken a fájdalomküszöb, az agyat egyre több fájdalominger bombázza, amely az agyi fájdalom-feldolgozásban részt vevő struktúráinak túlérzékenységéhez, vagyis a centrális szenzitizációhoz vezet (Meyer 2006). A TRPV1 receptor hiánya feltehetően csökkentette a mustárolaj beadása után (korai fázisban) a perifériás szenzitizáció révén kialakuló termális hiperalgéziát, illetve a centrálisan (késői fázisban) kialakuló mechanikai hiperalgéziát.

58

4. fejezet: Komplex Regionális Fájdalom Szindróma (CRPS) passzív transzfer-trauma egérmodellje Valéria Tékus, Zsófia Hajna, Éva Borbély, Adrienn Markovics, Teréz Bagoly, János Szolcsányi, Victoria Thompson, Ágnes Kemény, Zsuzsanna Helyes, Andreas Goebel: A CRPS-IgG-transfer-trauma model reproducing inflammatory and positive sensory signs associated with Complex Regional Pain Syndrome. Pain. 2014 Feb; 155 (2):299-308. doi: 10.1016/j.pain.2013.10.011. Epub 2013 Oct 18 IRODALMI HÁTTÉR, ELŐZMÉNYEK Neuro-immun interakciók Az idegrendszer és az immunrendszer között kétirányú kapcsolat áll fenn. Az idegvégződésekből felszabaduló mediátorokaz immunsejtek működésének modulálása révén a gyulladásos folyamatokat fokozni vagy csökkenteni képesek. Az aktivált immunsejtekből felszabaduló transzmitterek visszahatnak az érzőideg-végződésekre, stimulálják, szenzitizálják azokat, amely a fájdalom fokozódásához, további neuropeptidkiáramláshoz vezet (Gallowith-Puerta és Pavlov 2007). A neurogén gyulladásos mechanizmusok fontos szerepet játszanak számos krónikus, perzisztáló fájdalommal járó gyulladásos kórképben, pl. rheumatoid artritiszben (Levine és mtsai. 1986), így feltételezésünk szerint a Komplex Regionális Fájdalom Szindróma (Complex Regional Pain Syndrom: CRPS) kialakulásában is. A CRPS klinikai jellemzői Pontos epidemiológiai adatok a betegség sokféle formája és diagnosztikus nehézségei miatt nem állnak rendelkezésre. A nemek közti megoszlási aránya 4:1, melyben a nők aránya sokkal nagyobb. A megbetegedettek átlagos életkora 37 év (de M és mtsai. 2007). Sem a betegség etiológiája sem pedig pontos patofiziológiai mechanizmusai nem ismertek. Hátterében kisebb sérülés (rándulás, ficam, törés) hatására az érzőideg végződésekből felszabaduló antigének elleni túlzott immunválaszt és összetett neuro-immun interakciókat valószínűsítenek (Blaes és mtsai. 2007) (28. ábra).

59

28. ábra: A betegség kialakulásának feltételezett mechanizmusa.

A betegség korábbi elnevezése volt többek közt a reflex szimpatikus disztrófia (CRPS I) vagy kauzalgia (CRPS II). Az egyes tünetek egyénenként eltérő módon és gyakorisággal jelentkeznek, mely rendkívül nehézzé teszi a diagnózis felállítását. Az IASP 2010-ben egységesítette az elnevezését és meghatározta a diagnosztikus kritériumokat (Harden és mtsai 2010). Két fő típusát különböztetik meg: 1) egyes megbetegedések (vírusfertőzés, szívroham) után kialakuló valódi idegsérüléssel nem járó típusát (CRPS I), illetve 2) tényleges idegsérüléssel járó formáját (CRPS II). A betegség klinikai tüneteit 4 nagy csoportba oszthatjuk: a; abnormálisan fokozott fájdalomérzékelés, b; ödéma, vasomotor és szudomotor abnormalitások, c; a bőr színének és hőmérsékletének megváltozása, d; motoros funkciózavarok és trófikus elváltozások (29. ábra).

29. ábra: CRPS-ben szenvedő páciensek végtag- elváltozásai.

60

A tünetek az esetek egy részében spontán gyógyulnak, azonban nagyobb részüknél fokozódnak és hosszan, akár hónapokig, sőt évekig fennmaradó perzisztáló intenzív fájdalomállapot alakul ki. A jelenleg rendelkezésre álló terápia nem kielégítő, az alkalmazott gyógyszerek nem, vagy kismértékben hatásosak, ugyanakkor súlyos mellékhatásokkal járnak. A betegség lefolyását nagymértékben meghatározza a kezelés megkezdésének időpontja. A korábban néhány páciensnél alkalmazott plazmaferezis hatékonynak bizonyult, mely az autoantitestek által mediált immunreakciók lehetséges szerepére utalnak (Goebel és mtsai. 2010, 2011, Kohr és mtsai. 2011, Marinus és mtsai. 2011). A patogén autoantitestek által okozott megbetegedések vizsgálatára alkalmazható egyik módszer a humán vérszérumok tisztított IgG frakcióinak intraperitoneális beadása rágcsálókba (passzív transzfer). Miaszténia gravisz és pemfigusz vizsgálata során leírták, hogy a sejtfelszíni epitópok felismerésének képessége a fajok közti transzfert követően megőrződtek (Toyka és mtsai 1975, Anhalt és mtsai. 1982). A sikeres passzív transzfer kísérletek e típusa ezért alkalmas az autoantitestek betegségben betöltött szerepének közvetlen vizsgálatára (Rose és mtsai. 1993),

emellett

megfelelő

modellként

szolgál

az

egyes

patomechanizmusok

feltérképezésére, illetve új terápiás eszközök fejlesztésére. Kollaborátorunk korábbi eredménye (Goebel és mtsai 2011, 2013), hogy hosszan fennálló CRPS-ben szenvedő páciensek passzív transzferrel átvitt tisztított IgG frakciói csökkentik intakt egerek (sérülés nélküli) exploráló viselkedését, bár fokozott fájdalomérzetet (hiperalgézia) és ödémát nem tapasztaltak. Mivel a CRPS főként valamilyen trauma után alakul ki, feltételezhető, hogy a passzív transzfer sikere függ a trauma meglététől, például valamilyen sérülés által kiváltott helyi gyulladás szükséges a keringő autoantitestek megkötéséhez (a megkötött antitestek pedig valószínűleg tovább fokozzák a már kialakult gyulladás mértékét). A SP, CGRP, TNF-alfa és interleukin-6 (IL-6) szintek kórosan emelkedtekCRPS-sel érintett bőrből vett ödémafolyadékban (Weber és mtsai 2001, Huygen és mtsai 2002). CRPS csonttöréses rágcsáló modelljeiben az interleukin 1-béta (IL-1 béta) szintje és a korábbi eredeményekkel összhangban a szöveti SP koncentrációja is megemelkedett (Guo és mtsai. 2004, Kingery és mtsai 2010). Kísérleteink során a szöveti mikrosérülés modellezésére plantáris bőr-izom incíziót végeztünk az állatokon.

61

CÉLKITŰZÉS Mivel a betegség etiológiája és patofiziológiai mechanizmusai nem ismertek, a rendelkezésre álló terápia pedig sok esetben egyáltalán nem hatásos, feltétlenül szükség van a pontos kórélettani folyamatok feltérképezésére és potenciális új típusú gyógyszercélpontok azonosítására. Ez megfelelő állatmodell hiányában ezidáig nehéznek bizonyult. PhD munkám e részének célja ezért egy megbízhatóan működő CRPS passszív-transzfer egérmodell beállítása és integratív vizsgálata volt a Liverpooli Egyetem Fájdalom Központjával való kollaboráció segítségével (dr. Andreas Goebel, Department of Translational Medicine, és Walton Pain Center, University of Liverpool). KÍSÉRLETI MODELLEK ÉS VIZSGÁLATI MÓDSZEREK Vizsgálati alanyok és mintagyűjtés Kísérleteinkben dr. Andreas Goebel által küldött 6 CRPS szindrómában szenvedő páciens és 6 egészséges önkéntes szérumaiból tisztított IgG frakciót vizsgáltuk az általunk kidolgozott egérmodell kísérleti paradigmájában. A kiválasztott 6 beteg mindegyike esetén a 12 hónapnál régebben fennálló tüneteik kielégítették az IASP által elfogadott CRPS diagnosztikus kritériumait (Harden és mtsai. 2010), perzisztáló fájdalmaik intenzitása 5 vagy annál magasabb volt a numerikus fájdalom-mérő skálán (0-10), nem szenvedtek más krónikus fájdalommal vagy gyulladással járó megbetegedésben, illetve a Walton Pain Center gondozása alatt álltak minimum egy éve. Egészséges önkénteseknek a páciensekkel megegyező korú és nemű (+ 10 év) alanyokat választottunk, akik nem szenvedtek semmilyen krónikus fájdalommal járó kórképben és elsőfokú rokonaik között nem volt autoimmun beteg. A vizsgálati alanyoktól 150 ml vért vettek, melyet lecentrifugáltak. Az IgG frakciók elválasztásához az így kapott szérumokat affinitás kromatográf módszer alkalmazásával G protein-kötő microgyöngyöket (Sigma Aldrich, Gillingham, UK) tartalmazó oszlopon engedték át a korábban leírt módszer alapján (Buckley és mtsai 2005). Az etikai engedélyek száma: ISRCTN63226217, 12/NW/0126. Kísérleti állatok Kísérleteinkhez C57Bl/6 állattörzsbe tartozó nőstény egereket (8-10 hetes, 18-23 g) használtunk. Az eredeti szülőpárokat a Jackson Laboratories (USA) cégtől vásároltuk 62

magyarországi forgalmazójukon a Charles River Hungary-n keresztül, majd intézetünk állatházában tartottuk és szaporítottuk 24-25 °C-on, normál rágcsálótáppal és vízzel ad libitum ellátva. Az egyes vizsgálatokat minden esetben azonos személy végezte, aki a pontos kezelési protokollt nem ismerte. Kísérleti protokoll 6 CRPS beteg véréből származó tisztított IgG frakciót adtunk be i. p. az állatoknak (5-7 egér/csoport/páciens). A kontroll egerek csoportjai egészséges önkéntesekből származó tisztított IgG-t vagy fiziológiás sóoldatot kaptak. A beadott egészséges és CRPS-ben szenvedő betegekből származó IgG-k koncentrációi megegyeztek. A három egymást követő napon mért kontrollmérések előtt minden esetben szoktató mérést végeztünk, melynek eredményeit a kiértékelésnél nem vettük figyelembe. A kísérlet 0. napjának a talpbőr-izom incízió műtét idejét tekintettük. A kezeléseket a -1., 0. illetve az 5. és 6. napokon alkalmaztuk i.p. injekció formájában napi kétszer. Minden egér összesen 6 ml IgG szérumot, illetve fiziológiás sóoldatot kapott (reggelente 1ml, és késő délután 0,5 ml minden kezelési napon). A kísérlet 8. napja alatt mértük a mechanikai érzékenységet (fájdalomküszöböt) dinamikus plantáris észteziométerrel, a lábtérfogatot pletizmométerrel,

a hideg érzékenységet

a

0°C-os

vízből

való

végtagkihúzás

latenciaidejének detektálásával, a spontán lokomotoros aktivitást open field teszttel, a mozgáskoordinációt RotaRod kerékkel, továbbá a talphőmérsékletet kontakthőmérővel-, ill. a testsúlyt. A kísérlet 8. napján az állatokat túlaltattuk, a hátsó végtagokat a tibiotarzális ízületekkel együtt eltávolítottuk és -80°C-on tároltuk a szövetek neuropeptid és citokin koncentrációinak meghatározásáig (30. ábra).

63

30. ábra A kísérleti protokoll.

Vizsgálati modell A kísérleti elrendezést és paradigmát a 30. ábra foglalja össze. Plantáris bőr és izom incízió Az értekezésem korábbi fejezetében már ismertetett, eredetileg patkány modellen (Brennan és mtsai. 1996) kidolgozott, de egérre is adaptált (Banick és mtsai. 2006, Pogatzki-Zahn és mtsai. 2007) plantáris bőr-izom incíziót alkalmaztunk. Az állatokat ketamin és xylazin keverékével (100 és 5 mg/kg i.p) altattuk, majd a jobb talp bőrét 0,2 cm-re a saroktól 0,5 cm hosszan hosszanti irányban bemetszettük az izmot és kötőszövetet is érintve. A sebet 5.0 steril fonallal zártuk, majd fertőtlenítettük. Az állatok mindhárom kezelési csoportban az inciziót követően maguk távolították el a varratokat 1-2 napon belül. VIZSGÁLATI MÓDSZEREK Érintési érzékenység vizsgálata A CRPS egyik leggyakoribb klinikai tünete a fájdalom és a mechanikai hiperalgézia. A talpbőr érintési érzékenységének vizsgálatára a korábban már bemutatott dinamikus plantáris észteziométert használtuk. A méréseket a passzív-transzfer kezelés előtt és az 1., 2., 3., 7. és a 8. napokon végeztük. 64

Lábtérfogat mérése Mivel a CRPS másik meghatározó klinikai tünete az érintett végtagok erőteljes duzzadása, kísérleteinkben a láb térfogatának változásait pletizmométerrel vizsgáltuk a passzívtranszfer kezelés előtt (kontroll) és 1., 2., 3., 7. és a 8. napon. Hő- és hidegérzékenység Mind a hő, mind a hideg hiperalgézia/allodínia a CRPS-ben szenvedő páciensek közel egyharmadát érinti. A korábban már bemutatott emelkedő hőmérsékletű forró lappal vizsgáltuk az állatok fájdalmas hőküszöbét a műtét előtt, valamint az 1., 2., 3., 7. és 8. napokon. A hideg érzékenység meghatározásához az egerek érintett végtagját 0°C-os (jeges) vízbe merítettük és az elhárító reakció latenciaidejét detektáltuk a kezelések előtt, illetve a 3., 7. és 8. napokon. Spontán súlyeloszlás vizsgálata A hátsó végtagok spontán súlyeloszlásának vizsgálatát a kontroll mérések elvégzése után a kísérlet 1, 2, 3, 7 és 8. napján végeztük. Spontán lokomotoros aktivitás Spontán lokomotoros aktivitás mérésére open field tesztet alkalmaztunk. A méréseket a kísérlet 0. és 6. napján végeztük. Motoros koordináció A motoros funkció és a koordináció vizsgálatát RotaRod készülékkel vizsgáltuk a kísérlet 0. és 6. napján. A forgó henger sebessége az első 10 másodpercben konstans 4 rpm volt, majd 5 perc alatt 40 rpm-re gyorsult fel. Talphőmérséklet meghatározása A talp hőmérsékletét kontakthőmérővel mértük meg a kísérlet 7. napján. Testtömeg monitorozása Az állatok testsúlyát a kísérlet minden napján azonos időben mértük. Gyulladásos neuropeptidek és citokinek meghatározása szövet-homogenizátumokból Miután az összes funkcionális tesztet elvégeztük a kísérlet 8. napján (30. ábra), az egereken ketamin-xilazin altatás alatt cervikális dislokációt végeztünk. Ezt követően 65

mindkét hátsó lábat lemetszettük a tibiotarzális ízülettel együtt, majd az ujjakat eltávolítottuk és a mintákat steril foszfát pufferben homogenizáltuk. A CGRP- és SP- szerű immunreaktivitás mérésére rádioimmunesszé (RIA) módszert alkalmaztunk, míg a vérminták IL-6 illetve IL1-béta szintjét Luminex® 100™ x MAP módszerrel határoztuk meg a gyártó cég ajánlása szerint. A kapott értékeket a neuropeptidek esetében fmol/mgban, míg a citokinek esetében pg/mg-ban, 1 mg nedves szövetre vizsgálva ábrázoltuk.

EREDMÉNYEK A kísérletsorozatba bevont 6 CPRS-ben szenvedő páciens demográfiai megoszlását és betegség karakterisztikáját az 4. táblázat mutatja. Páciensek Kor Nem

1 48 nő

Érintett végtag

alsó

2 43 férfi mindkét alsó

3 60 férfi

4 34 nő

5 37 nő

6 50 nő

felső

alsó

alsó

alsó

Freibergszindróma operáció és reoperáció

Mortonneuroma operáció

bokatörést követő operáció

Kiváltó ok

táncolás

kis ütés

plexus brachiális malignus tumor operáció

CRPS típusaa

1

1

2

1

nincs meghatározva

1

6

5,1

7

5-7b

1

8-10b

7

7,5

10

7

5,5

8

+

+

+

+

+

+

asztma

diabetes mellitusz 2-es típus, magas vérnyomás, magas koleszterin, pajzsmirigy túlműködés

Betegség fennállása Fájdalom intenzitásac Nyomásérzékenység az érintett végtagon

További megbetegedések

pikkelysömör , gluténérzékeny enteropátia, anémia pernicióza

nincs

korábbi miokardiális infarktus

Freibergszindróma

4. táblázat A vizsgált páciensek demográfiai és betegség jellemzői a 1 = tényleges idegsérülés nélküli típus, 2 = tényleges idegsérüléssel járó típus b A sorozatos operációk miatt a megbetegedés pontos időpontja nem meghatározható vagy a páciens nem emlékszik c : 24 órán keresztül a 11 pontos numerikus skálán (0-10) vizsgált fájdalom átlaga, ahol 0= nincs fájdalom, 10= az elképzelhető legnagyobb fájdalom

66

Mechanikai hiperalgézia A műtött lábon az operációt megelőzően mért mechanonociceptív küszöbök átlagai között nem volt szignifikáns különbség, 7,22 + 0,09 g volt a fiziológiás sóoldatottal kezelt, 7,23 + 0,09 g és 7,09 + 0,10 az egészséges és CRPS IgG-t kapott csoportokban. Az elvégzett talp bőr-izom incízió 45-50%-kal csökkentette a küszöbértéket az 1. napon mindhárom csoportban, mely a fokozott fájdalomérzékenységet demonstrálta. A fiziológiás sóoldattal kezelt kontroll csoportban a mechanikai hiperalgézia 25,74 + 2,30 %-ra és 16,01 + 2,24 % -ra mérséklődött a műtétet követő 2. és 3. napra, majd később ez utóbbi szinten állandósult. Szignifikánsan nagyobb mechanikai küszöbcsökkenést detektáltunk a CRPS IgG-vel kezelt állatcsoportban a 7. napon az egészséges IgG-vel kezelt állatokhoz képest (Bonferroni post hoc teszt, p <0,001, 31. ábra). A 7. napon mért átlag küszöbcsökkenés a CRPS IgG csoportban 31,41 + 1,7 % volt, mely szignifikánsan nagyobb volt az egészséges IgG-vel kezelt csoport küszöbcsökkenésénél (-19,94 + 3,42 %). Az ellenoldali, nem műtött lábon a küszöbcsökkenés 5 %-nál kisebb volt mindhárom csoportban (nem ábrázolt adatok).

B

0

### ### ++ ++

-10

###

***

-20 -30 Fiz. só Egészséges IgG CRPS IgG

-40 -50 -60 -2

-1

0

1 2 3 4 5 Mûtét után eltelt napok

6

7

8

Mechanonociceptív küszöb változása (%)

Mechanonociceptív küszöb változása (%)

A

0

-10

**

### -20

-30

-40 Fiz. só

Egészséges IgG

CRPS IgG

31. ábra: CRPS-ben szenvedő páciensek és egészséges önkéntesek tisztított IgG frakcióinak, vagy a fiziológiás sóoldat hatása plantáris incízió által kiváltott mechanikai hiperalgéziában egérlábon. A szérum IgG-k vagy a fiziológiás sóoldat teljes mennyisége 1,5 ml/nap/ egér, a kezelések a kísérlet -1. 0. 5. és 6. napján intraperitoneálisan történtek. Az ábra A része az összes kísérletből származó eredményt szemlélteti, melyek az egyes kezelt csoportok érintési érzékenységének százalékos változásainak átlagait a standard hibával együtt ábrázolják (n=30-37 egér/csoport). *** p <0,001 CRPS vs. Egészséges IgG; ### p <0,001 CRPS vs. fiziológiás sóoldat; + p <0,05 Egészséges IgG vs. fiziológiás sóoldat (kétutas ANOVA Bonferroni post hoc teszttel). Az ábra B része a 7. napon mért adatokat muatatja, ahol az egyes pontok az állatok azon csoportját (n=5-7) reprezentálják, melyek 1 beteg illetve 1 egészséges önkéntes tisztított IgG frakcióit vagy normál fiziológiás sóoldatot kaptak, míg a vízszintes vonalak az átlagot jelzik.

67

Lábduzzadás Az operációt megelőzően mért lábtérfogat-értékek átlaga mindhárom csoportban (fiziológiás sóoldattal, illetve egészséges- vagy CRPS- IgG–vel kezelt egerek) hasonló, 10,29 + 0,2 cm3, 10,04 + 0,1 cm3 és 9,97 + 0,1 cm3 volt. A plantáris inciziót követő 1. napon a lábduzzadás 20,56 + 2,52 % volt a fiziológiás sóoldattal kezelt csoportban, majd a 7. napig fokozatosan csökkent 10,52 + 1,83 % -ra. A CRPS IgG-vel kezelt csoportnál a 2. és 3. napon szignifikánsan nagyobb volt a lábduzzadás mértéke az egészséges IgG-vel kezelt állatokhoz képest (Bonferroni post hoc teszt, p <0,001, 32. A ábra). A CRPS betegekből származó IgG-vel kezelt csoportban a 2. napon mért átlag lábtérfogat 32,3 + 1,8 % volt, mely 45 %-kal magasabbnak bizonyult az egészséges IgG-vel kezelt állatok lábtérfogat értékénél (22,3 + 2,2 %). A lábtérfogat változások minden sorozatban nagyobbak voltak a beteg IgG-vel kezelt állatoknál, mint az egészséges IgG-vel kezelt csoportban. Az ellenoldali, nem műtőtt lábon mért lábtérfogat-változás minden csoportban 3%-nál kisebb volt (nem ábrázolt adat). *

### +

Lábduzzadás (%)

40

B ***

###

Fiz. só CRPS IgG Egészséges IgG

30

#

##

20

10

0

** ### 40

Lábduzzadás (%)

A

30

20

10

0

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Fiz. só

Egészséges IgG

CRPS IgG

Műtét után eltelt napok

32. ábra: CRPS-ben szenvedő páciensek illetve egészséges önkéntesek tisztított IgG frakcióinak, vagy fiziológiás sóoldat hatása plantáris incízió által kiváltott lábduzzadásra. A kezelés időpontjait lásd a 33. ábrán. Az ábra A része a kísérletsorozat összesített eredményét mutatja (n=30-37/kezelés/állat, melyben a megfelelő kezdeti kontroll értékekhez viszonyított százalékos változásokat ábrázoltuk. *** p <0,001 CRPS vs. Egészséges IgG; ### p <0,001 CRPS vs. fiziológiás sóoldat; + p <0,05 Egészséges IgG vs. fiziológiás sóoldat (Kétutas ANOVA Bonferroni post hoc teszttel). Az ábra B része a 7. napon mért adatokat mutatja, ahol az egyes pontok az állatok azon csoportját (n=5-7) reprezentálják, melyek 1 beteg illetve 1 egészséges önkéntes tisztított IgG frakcióit vagy normál fiziológiás sóoldatot kaptak, míg a vízszintes vonalak az átlagokat jelölik.

68

Hő- és hideghiperalgézia A termonociceptív hőküszöböt emelkedő hőmérsékletű forró lappal határoztuk meg kísérleteink első két sorozatában, azonban szignifikáns változásokat nem találtunk az egyes csoportok között (33. A ábra). Ezért későbbi kísérleteink során e módszerrel nem folytattuk tovább a tesztelést, helyette a hideg érzékenységet kezdtük el vizsgálni. A fiziológiás sóoldattal kezelt kontroll állatoknál a 0 °C-on mért lábkihúzás átlag latenciaideje az incízió előtt 157,25 + 8,26 s volt, mely a műtétet követő 3. napon 52,04 + 6,45 s-ra csökkent, ehhez hasonló eredményeket tapasztaltunk a CRPS-es és az egészséges IgG–vel kezelt csoportoknál is. A kialakuló hideg hiperalgézia a kísérlet elejétől a 8. napig mindhárom csoportban fennállt, az egyes csoportok között szignifikáns különbség nem volt (33. B. ábra). Spontán súlyeloszlás A spontán súlyeloszlást kísérleteink első két sorozatában vizsgáltuk. Mivel azonban a 3. napon mindhárom csoportban a műtőtt oldali terhelésben csak kismértékű, de nem szignifikáns csökkenést detektáltunk, kísérleteink további részében a vizsgálatokat nem folytattuk tovább (33. C ábra). Spontán lokomotoros aktivitás és motoros koordináció A 0. és 6. napon meghatározott spontán lokomotoros aktivitást a keresztezett mezők és az ágaskodások száma, a vizsgálati mező közepén tartozkodás ideje, illetve a mozgással és mosakodással töltött idő alapján értékeltük, azonban egyik paraméterben sem volt szignifikáns eltérés (33. D ábra). A kísérlet 0. napján RotaRod készülékkel elvégzett motoros koordinációs mérésekben sem találtunk szignifikáns különbséget az egyes csoportok között (nem ábrázolt adat). Kísérleteink első két sorozatában a 6. napon is végeztünk méréseket. Mindhárom kezelési csoportban egyformán megnyúlt a leesésig eltelt idő, az ebben szerepet játszó tanulási folyamatnak köszönhetően (Butriago és mtsai 2004), így a későbbiekben a 6. napon már nem folytattuk a tesztelést.

69

Talphőmérséklet és a testsúly változása Nem találtunk szignifikáns különbséget sem a műtőtt lábon mért talphőmérsékletek abszolút értékeinek átlagaiban, sem pedig a 7. napon mért átlag talphőmérséklet különbségekben egyik vizsgált csoportban sem. Így a 3. sorozat után abbahagytuk a talphőmérséklet vizsgálatát (33. E ábra). A fiziológiás sóoldattal kezelt kontroll csoport testsúlyának átlaga 18,26 + 0,25 g volt, míg az egészséges IgG-vel illetve betegekből származó IgG-vel kezelt csoportoknál 18,95 + 0,29 g és 18,53 + 0,23 g volt. A kísérletek során mért súlyváltozások nem voltak szignifikánsan különbözőek (33. F ábra).

A

0°C fokos vízben töltött idő (s)

B

Fájdalmas hőküszöb (°C)

48 47 46 45 44

Fiz. só Egészséges IgG

43

CRPS IgG

42 1

2

3 4 5 6 Műtét után eltelt napok

7

160 Fiz. só Egészséges IgG CRPS IgG

140 120 100 80 60 40

8

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Műtét után eltelt napok

C

D 5

0. nap

40

6. nap

35

Fiz. só Egészséges IgG CRPS IgG

0

Ágaskodások száma

Érintett végtag súlyeloszlás változása (%)

180

-5

30 25 20 15 10 5

-10 0

1

2 3 4 5 6 Műtét után eltelt napok

7

0

8

Fiz. só

Egészséges CRPS IgG IgG

Fiz.só Egészséges CRPS IgG IgG

F

E

Testsúly-változás (%)

6

7. napon mért jobb és bal talphőmérséklet különbsége (°C)

1.5

1.0

0.5

Fiz. só Egészséges IgG CRPS IgG

4 2 0 -2 -4 -6 -8

0.0 Fiz. só

Egészséges IgG

CRPS IgG

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Műtét után eltelt napok

33. ábra A humán IgG kezelés és a plantáris bőr-izom incízió következtében kialakuló viselkedésbeli eltérések valamint a testsúly változásai. Az ábra A része az első két szériában vizsgált emelkedő hőmérsékletű forró lappal mért fájdalmas hőküszöböt, a B rész a jeges vízből való lábkihúzási latenciaidőkkel jellemzett hideg érzékenységet mutatja a két első széria kivételével az összes vizsgálati

70

csoportban, míg a C rész az első 2 széria érintett végtagon mért spontán nehézkedését ábrázolja. A D grafikon a kísérlet 0. és 6. napján open field tesztben mért ágaskodások számát szemlélteti, míg az E grafikonon a kontakthőmérővel a 7. napon mért talphőmérsékleti különbségek (abszolút értékű különbségek a műtött és kezeletlen talpak között) látszanak. Az F grafikon a kísérlet során naponta megmért testsúly változásait szemlélteti. Az adatok átlagait a standard hibákkal együtt ábrázoltuk.

Lábhomogenizátumokban

mért

gyulladásos

neuropeptidek

és

citokinek

koncentrációja Az intakt lábak homogenizátumaiból meghatározott SP immunreaktivitásban nem találtunk szignifikáns különbséget a csoportok között. Incízió hatására a 8. napon kivett mintákban nagymértékben megemelkedett a SP koncentráció mindhárom csoportban a kontroll lábhoz viszonyítva, ugyanakkor a műtött lábból mért a SP koncentráció a CRPS IgG-vel kezelt csoportban szignifikánsan magasabb volt az egészséges IgG-vel kezelt állatokhoz képest (34. A ábra, CRPS csoport: 30,3 + 9,3 fmol/mg, egészséges csoport: 22,9 + 6 fmol/mg, átlag különbség: 7,5 fmol / mg, a különbség 95%-os konfidencia intervalluma: 2,8-12,1 fmol/mg, p <0,001 egyutas ANOVA Bonferroni post hoc teszttel). Ezzel szemben a CGRP immunoreaktivitás nem változott sem az incízió, sem pedig az IgG kezelések hatására (34. B ábra). Az IL-1béta, IL-6 illetve TNF-alfa koncentrációi nem különböztek az egyes kezelési csoportok között (34. C-E ábra). Potenciálisan befolyásoló tényezők A

kísérletsorozat

során

vizsgált

betegek

közül

az

egyik

kísérőbetegségként

pikkelysömörben (arthritis psoriatica) szenvedett (4. táblázat), mely ugyan fájdalommal járó, de nem autoantitestek által mediált megbetegedés. Összességében a 6 vizsgált beteg többé-kevésbé eltérő etiológiai tényezői és klinikai jellegzetességei ellenére a 6 egérkísérlet-sorozat eredményeiben jelentős különbségeket nem tapasztaltunk.

71

P-anyag (SP) koncentráció (fmol/mg)

40

***

+++ ###

35 30

#

25

##

20 15 10 5 0

Fiziológiás Egészséges IgG sóoldat

Fiziológiás Egészséges IgG sóoldat

CRPS IgG

CGRP 40

30 25 20 15 10 5 0

CRPS IgG

Fiziológiás Egészséges IgG sóoldat

CRPS IgG

Fiziológiás Egészséges IgG sóoldat

D

IL-1

pg/1mg nedves szövet

0.8

0.6

0.4

CRPS IgG

műtött

intakt

1.0

pg/1mg nedves szövet

35

műtőtt

intakt

C

B CGRP koncentráció (fmol/mg)

SP

A

IL-6 2.0

1.5

1.0

0.5

0.2

0.0

0.0 Fiziológiás sóoldat

Egészséges IgG

CRPS IgG

Fiziológiás sóoldat

Egészséges IgG

Fiziológiás sóoldat

CRPS IgG

műtött

intakt

Egészséges IgG

CRPS IgG

Egészséges IgG

CRPS IgG

műtött

intakt

E

Fiziológiás sóoldat

TNF-

pg/1mg nedves szövet

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

Fiziológiás sóoldat

Egészséges IgG

intakt

CRPS IgG

Fiziológiás sóoldat

Egészséges IgG

CRPS IgG

műtött

34. ábra A humán IgG kezelés hatásai szenzoros neuropeptidek és gyulladásos citokinek hátsó lábakban mért koncentrációira. A műtét utáni 8. napon a szöveti P-anyag (SP; A ) és kalcitonin gén- rokon peptid (CGRP; B) koncentrációit a hátsó lábak homogenizátumaiból vizsgáltuk rádióimmunesszé módszerrel. Míg az interleukin 1-béta (IL-1β; C), interleukin-6 (IL-6; D) és tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-α; E) koncentrációit Luminex módszerrel és/vagy enzim-kötött immunspecifikus módszerrel (ELISA) határoztuk meg ugyanazon mintákból. Az oszlopok a koncentrációk átlagait jelölik a standard hibával együtt, ahol n= 30-37 egér/ kezelés (SP, CGRP, TNF- α) és n= 6-13 egér/ kezelés (IL-1β, IL-6). # p <0,05, ## p <0,01, ### p <0,001 vs. a megfelelő intakt láb,*** p <0,001vs. Egészséges IgG kezelés és +++ p <0,001vs. fiziológiás sóoldat a kezelt lábon vizsgálva (kétutas ANOVA Bonferroni post hoc teszttel).

72

MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK Elsőként igazoltuk, hogy mikrosérülést követően kialakuló CPRS legjelentősebb klinikai tünetei (perzisztáló fájdalom/hiperalgézia, ödéma) a betegek tisztított IgG frakcióival, passzív transzferrel átvihetők egerekbe. A CRPS-ben szenvedő betegek a kiváltó trauma után nem sokkal, tipikusan erős fájdalomról illetve jelentős, a végtagot érintő különböző kóros változásokról számolnak be. A betegek többsége viszonylag hamar spontán gyógyul, míg az esetek körülbelül 15 %-ban a tünetek krónikussá válnak (Birklein és mtsai. 2004, de MM és mtsai. 2009), a fájdalom perzisztál, a kezdeti végtag-elváltozások, mint pl. az ödéma, fokozódik. Egérmodellünk is jellemzően ez utóbbi mintázatot követi. A kapott eredmények arra utalnak, hogy a CRPS-es megbetegedésekben az autoantitestek fontos szerepet játszanak. Az ínciziós műtét nélküli passzív transzferes kezelés korábban közölt irodalmi adataihoz hasonlóan, jelenlegi kísérleteinkben is minden funcionális eltérés viszonylag gyorsan, a 8. napra normalizálódott, amely az egereknek beadott humán IgG metabolizmusával magyarázható (Goebel és mtsai. 2005). Ennek kivédésére a 7. illetve 8. napon alkalmazott újbóli IgG-kezelés jó megoldásnak ígérkezik, azonban ehhez szükség lenne mind a rendelkezésre álló szérum mennyiségének növelésére, vagy kiegészítő ciklofoszfamid

kezelésre,

mely

mérsékli

az

ismeretlen

immunmechanizmusok

következtében kialakuló szérumbetegséget (Bucley és mtsai. 2005). A hideg hiperalgézia feltehetően elsősorban a perifériás idegvégződések szenzibilizációja révén alakul ki, míg a mechanikai hiperalgézia kialakulásában centrális szenzibilizációs mechanizmusok is játszanak fontos szerepet (Meyer 2006). Bár a hideg hiperalgéziában az egyes csoportok között nem volt különbség, a mechanikai hiperalgézia súlyosbodott a CRPS- IgG-vel kezelt állatokban. Ennek oka feltehetően az, hogy a centrális szenzitizáció is szerepet játszhat a CRPS IgG által közvetített mechanikai hiperalgézia súlyosságának kialakításában. A centrális szenzitizáció, perifériás trauma által kiváltott érzékenységfokozódás a hátsó gyöki primér szenzoros neuronokban és a gerincvelői szekunder érzőidegsejtekben, melynek következtében perifériás hiperérzékenység alakul ki (Latremoliere és Woolf 2009). Scherer és mtsai. 2010-ben publikált eredménye, hogy plantáris inciziót követően nem változott egerekben a hidegérzékenység, ha az állatokat 0°C-os lapra állították és a lábnyalási latenciaidejőt vizsgálták. Ezzel szemben mia kísérleteink során erős posztoperatív hideg hiperalgéziát detektáltunk. Az eltérő eredmények magyarázata az lehet, hogy a műtőtt láb 0°C-os vízbe merítésekor sokkal nagyobb terület válik érintetté, mint a hideg lapon, ahol csak a talp van kitéve a stimulusnak. Mivel hidegtolerancia73

csökkenés a CRPS kezeléstől függetlenül jelentkeztek, nem tekinthetők a CRPS-transzfer következményének. Kollaborátorunk (Goebel és mtsai. 2011) intakt egreken mért korábbi eredményeivel szemben az open field tesztben nem találtunk lényeges eltérést az egyes vizsgált csoportok között, melynek oka az lehet, hogy a 6. posztoperatív napon a kiváltott végtag trauma még jelentős befolyásoló hatást gyakorolt a viselkedési paraméterekre. A funkcionális eredmények mellett további jelentős megállapítás, hogy a humán megbetegedéssel párhuzamban (Weber és mtsai. 2001) szignifikáns emelkedést tapasztaltunk a gyulladáskeltő szenzoros neuropeptid, a SP, szöveti koncentrációjában a CRPS-kezelést kapott állatok műtött lábában az incízió utáni 8. napon. Ezzel szemben a CGRP, TNF-alfa, IL-1-béta és IL-6 koncentrációi nem változtak az intakt állapothoz viszonyítva ellentétben a CRPS szindrómában szenvedő betegek bőr mintájának vizsgálatával (Weber és mtsai. 2001, Huygen és mtsai. 2002) és azon állatmodellek eredményeivel, melyeknél a trauma létrehozásához csonttörést alkalmaztak (Sahbaie és mtsai. 2009, Wei és mtsai. 2012). Míg a CGRP főként szenzoros neuronális eredetű (Brain és mtsai. 2006), addig a SP, a kapszaicin érzékeny peptiderg afferensek mellett immunsejtekben is megtalálható (Howard 2008). E két peptid csak részben kolokalizálódik a szenzoros idegvégződésekben (Schulze és mtsai. 1997). Mivel azonban a funkcionális eltérések többsége a mintavétel (8. nap) idejére normalizálódott (31. és 32. ábra), lehetséges, hogy a CGRP és a citokinek koncentrációi is emelkedtek a kísérlet korábbi időpontjában. Más csoportok korábban közölt adatai szerint, a plantáris incízió modelljében (IgG transzfer nélkül) a SP-nek alapvető szerepe van a hiperalgézia fenntartásában: SP génhiányos egerekben incízió után csökkent mértékű mechanikai hiperalgéziát detektáltak vad típusú kontrolljaikhoz viszonyítva (Sahbaie és mtsai. 2009). A megfigyelt CRPS IgG hatások és a SP hatásai közti kölcsönhatások tisztázására további vizsgálatok szükségesek. Eredményeink legnagyobb jelentősége, hogy elsőként sikerült olyan jól reprodukálható, megbízható egérmodellt kidolgoznunk, amelyben mind a végtag sérülése, mind aspecifikus IgG autoantitestek jelen vannak, a humán betegséghez hasonlóan. Emberi CRPS IgG hatására sikerült kimutatnunk egerekben a legjelentősebb klinikai eltéréseket (fájdalom, duzzadás), a P-anyagot fontos pathofiziológiai tényezőként azonosítottuk. Modellünk egyik korlátozó tényezője, hogy a CRPS klinikai kórképét teljes mértékben nem tudtuk reprodukálni. Ilyen tünet például, a humán CRPS megbetegedésre jellemző változó 74

hőmérsékleti különbség az érintett és az ép végtag között, melyet részben a szimpatikus diszfunkció okoz (Krumova és mtsai. 2008). Önmagában csak a hiperalgézia és ödéma súlyosbodása, melyet modellünkben is tapasztaltunk, még nem elégítené ki szükségszerűen a CRPS Nemzetközi Fájdalom Társaság (IASP) által 2010-ben megállapított diagnosztikus kritériumait (Harden és mtsai. 2010). Ugyan modellünk nem képes az összes humán CRPS tünetet utánozni, azonban ezek kialakulásában is összetett mechanizmusok (Goebel és mtsai. 2011, Marinus és mtsai. 2011), illetve más klinikai tünetek esetében egymással össze nem függő mechanizmusok sorozata játszhat szerepet. Azonkívül, mivel ebben az első kísérletsorozatban nem volt lehetőségünk a fenotípusosan eltérő klinikai tüneteket mutató páciensekből (pl. mechanikai hiperalgéziával rendelkező, illetve nem rendelkező) vett szérum IgG-k hatásainak összehasonlítására, nem vonható le messzemenő következtetés azzal kapcsolatban, hogy az adott páciensek klinikai tünetei korrelálnak-e az állatoknál

tapasztalt

funkcionális

és

viselkedésbeli

eltérésekkel.

A

modell

használhatóságának gyakorlati korlátja az a viszonylag rövid „időablak”, melyben a szignifikánsan emelkedett mechanikai hiperalgézia vagy lábduzzadás jelen van. Erre vonatkozóan a közeljövőben 14 napos kísérletsorozatokat indítunk naponta történő IgG adással. A patogén antitestek epitóp specifitása egyelőre ismeretlen, és további kutatást igényel. Eredményeink klinikai szempontból is meghatározóak, mivel igazolhatják a hosszantartó CRPS egyik fontos terápiás lehetőségét, az autoantitestek plazmaferezissel való eltávolítását. A modell lehetőséget nyújt a betegség pontos mechanizmusainak feltárására kulcsmediátorok

és

célmolekuláik

azonosítására,

mely

új

gyógyszerfejlesztési

perspektívákat is nyithat.

75

AZ ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA PhD munkám során a fájdalomban szerepet játszó mechanizmusok komplex állatkísérletes vizsgálatára törekedtem. A disszertációban bemutatott legfontosabb új eredményeim, megállapításaim a következők: 1. Kísérleteinkben a két TRPV1 receptor agonista (kapszaicin és RTX) intraplantáris adása után több napon keresztül mindkét hőmérsékleti tartományban meghatároztuk azt a pontos küszöbhőmérsékletet, melynél az állatok nocifenzív reakciót mutattak. A hidegtartományban mért küszöbértékek gyorsabban normalizálódtak a fájdalmas hőküszöb értékeknél. E változások a TRPV1 receptort expresszáló szenzoros neuronok perifériás végződéseinek reverzibilis deszenzibilizációját jelzik, mely felelős a fájdalmas hő, illetve hideg által kiváltott válaszok elmaradásáért. Kis dózisú RTX illetve OLDA adásakor a TRPV1 receptor deszenzibilizálódott, az érzőideg-végződés funkciójának károsodása nélkül, hiszen a TRPA1 receptor agonista formalin képest volt hatást kifejteni. A deszenzibilizáció mindkét típusa nagy jelentőséggel bír a periférián ható új típusú analgetikumok kifejlesztése szempontjából. Az idegvégződés deszenzibilizációja a fájdalomcsillapítás terén már kiaknázásra került, viszont az általunk alkalmazott fájdalmas küszöbhőmérséklet mérésen alapuló technika a jövőben új in vivo preklinikai szűrő módszerként szolgálhat. 2. Adatokat szolgáltattunk különböző gyógyszercégek által kifejlesztett három TRPV1 antagonista hatásainak közvetlen összehasonlításáról, új fájdalmas hőküszöbmérő és a tradicionális

elhárító

reakciók

latenciaidejének

mérésén

alapuló

módszerekkel.

Eredményeink alapján elmondható, hogy a nociceptív hőküszöbcsökkenés RTX adás, enyhe hőtrauma vagy sebészi talpincízió után TRPV1 receptor aktiváción keresztül valósul meg, mely jól mérhető, nagyfokú érzékenységet mutat a vizsgált TRPV1 antagonistákkal szemben. A nociceptív hőküszöbök vizsgálatára az emelkedő hőmérsékletű vízfürdő megbízhatóan müködő, érzékenyebb módszernek bizonyult a hagyományos latenciaidő mérésen alapuló Plantar Test készülékhez képest. 3. Kimutattuk, hogy a farkon mért fájdalmas hőküszöb értékek a TRPV1 génhiányos egerekben szignifikánsan magasabbak voltak vad típusú megfelelőikhez képest, míg a 76

talpon nem volt különbség. Ez azt jelenti, hogy a korábbi adatokkal ellentétben a TRPV1 receptor szerepet játszik a forró ingerek detektálásában, legalábbis az egerek farkán. A mustárolajjal kiváltott gyulladásos termális hiperalgézia a TRPV1 génhiányos egerekben mindkét testtájon, míg a mechanikai hiperalgézia csak a lábon csökkent szignifikánsan. TRPA1 receptor hiánya esetén egyik testtájon sem detektáltunk különbséget. Az akut nocifenzív reakció latenciaidejének vizsgálata során TRPA1 és a TRPV1 génhiányos egerek is később mutattak elhárító reakciót vad típusú társaikhoz képest. Ezek alapján feltételezhető, hogy a TRPA1 agonista mustárolaj nem szelektív a TRPA1 receptorra, hanem a TRPV1 receptort is képes aktiválni. Ez utóbbi mechanizmus közvetítheti a gyulladásos hiperalgéziát és szerepet játszhat a nocifenzív reakcióban is. 4. Elsőként dolgoztunk ki egy megbízható passzív-transzfer-trauma modellt CRPS vizsgálatára, melyben a páciensekből származó tisztított szérum IgG intraperitoneális kezelésével váltottuk ki egerekben a humán megbetegedés legfontosabb klinikai tüneteit. Eredményeink

igazolták

az

IgG

antitestek

meghatározó

szerepét

a

CRPS

pathomechanizmusában. Egérmodellünk lehetőséget teremt a folyamatok kísérletes vizsgálatára, kulcsmediátorok és célmolekuláig azonosítására, amely új gyógyszerek kifejlesztéséhez is segítséget nyújthat.

77

IRODALOMJEGYZÉK Almási R, Pethö G, Bölcskei K, Szolcsányi J. (2003). Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold temperature in the rat: a novel heat allodynia model sensitive to analgesics. Br. J. Pharmacol. 139, 49–58.

Alpizar YA, Boonen B, Gees M, Sanchez A, Nilius B, Voets T, Talavera K. (2014). Allyl isothiocyanate sensitizes TRPV1 to heat stimulation. Pflugers Arch. 466(3):507-15. doi: 10.1007/s00424-013-1334-9.

Anhalt GJ, Labib RS, Voorhees JJ, Beals TF, Diaz LA. (1982). Induction of pemphigus in neonatal mice by passive transfer of IgG from patients with the disease. The New England Journal of medicine; 306, (20):1189-1196.

Atkinson TJ, Fudin J, Pandula A, Mirza M. (2013). Medication pain management in the elderly: unique and underutilized analgesic treatment options. Clin Ther. (11):1669-89. doi: 10.1016/j.clinthera.

Bandell M, Story GM, Hwang SW, Viswanath V, Eid SR, Petrus MJ, Earley TJ, Patapoutian A. (2004). Noxious cold ion channel TRPA1 is activated by pungent compounds and bradykinin. Neuron 41: 849–857.

Banik, RK, Brennan, TJ.( 2009). Trpv1 mediates spontaneous firing and heat sensitization of cutaneous primary afferents after plantar incision. Pain 141, 41–51.

Banik RK, Woo YC, Park SS, Brennan TJ. (2006). Strain and sex influence on pain sensitivity after plantar incision in the mouse. Anesthesiology; 105 (6):1246-1253.

Bautista DM, Jordt SE, Nikai T, Tsuruda PR, Read AJ, Poblete J, Yamoah EN, Basbaum AI, Julius D. (2006.) TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 24;124(6):1269-82.

Bessac BF, Jordt SE. (2008a). Breathtaking TRP channels: TRPA1 and TRPV1 in airway chemosensation and reflex control. Physiology (Bethesda). 23:360-70. doi: 10.1152/physiol.00026.2008.

Bessac BF, Sivula M, von Hehn CA, Escalera J, Cohn L, Jordt SE. (2008b). TRPA1 is a major oxidant sensor in murine airway sensory neurons. J Clin Invest 118: 1899–1910.

Bevan S, Andersson DA. (2009). TRP channel antagonists for pain--opportunities beyond TRPV1. Curr Opin Investig Drugs.10(7):655-63. Bevan S, Szolcsányi J. (1990). Sensory neuron-specific actions of capsaicin: mechanisms and applications. Trends in Pharmacological Sciences 11: 330-333.

78

Bánvölgyi A, Pozsgai G, Brain SD, Helyes ZS, Szolcsányi J, Ghosh M, Melegh B, Pintér E. (2004). Mustard oil induces a transient receptor potential vanilloid 1 receptor-independent neurogenic inflammation and a non-neurogenic cellular inflammatory component in mice. Neuroscience. (2):449-59.

Bhave G, Zhu W, Wang H, Brasier DJ, Oxford GS, Gereau RW. (2002). cAMP dependent protein kinase regulates desensitization of the capsaicin receptor (VR1) by direct phosphorylation. Neuron 35, 721–731.

Birklein F, Riedl B, Sieweke N, Weber M, Neundorfer B. (2000/4). Neurological findings in complex regional pain syndromes--analysis of 145 cases. Acta NeurolScand; 101(4):262-269.

Bishnoi M, Premkumar LS. (2011). Possible consequences of blocking transient receptor potential vanilloid. Curr Pharm Biotechnol. 12(1):102-14.

Bittner MA, Lahann TR. (1984). Biphasic time-course of capsaicin-induced substance P depletion: failure to correlate with thermal analgesia in the rat. Brain Res. 322:305–9.

Blaes F, Tschernatsch M, Braeu ME, Matz O, Schmitz K, Nascimento D, Kaps M, Birklein F. (2007). Autoimmunity in complex-regional pain syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1107:168-73.

Brain SD, Cox HM. (2006). Neuropeptides and their receptors: innovative science providing novel therapeutic targets. British Journal of Pharmacology; 147 Suppl 1: S202-211.

Brederson JD, Kym PR, Szallasi A. (2013). Targeting TRP channels for pain relief. Eur J Pharmacol. 716 (1-3):61-76. doi: 10.1016/j.ejphar.2013.03.003.

Brennan TJ, Vandermeulen EP, Gebhart GF. (1996). Characterization of a rat model of incisional pain. Pain. 64(3):493-501. Bölcskei K, Horváth D, Szolcsányi J, Pethö G. (2007). Heat injury-induced drop of the noxious heat threshold measured with an increasing-temperature water bath: a novel rat thermal hyperalgesia model. Eur. J. Pharmacol. 564, 80–87. Bölcskei K, Helyes Z, Szabó A, Sándor K, Elekes K, Németh J, Almási R, Pintér E, Pethő G, Szolcsányi J. (2005). Investigation of the role of TRPV1 receptors in acute and chronic nociceptive processes using genedeficient mice. Pain. 117(3):368-376.

Buckley C, Vincent A. (2005). Autoimmune channelopathies. NatClinPractNeurol. 1(1):22-33.

Buitrago M.M., J.B. Shulz, J. Dichgans, A.R. Luft. (2004). Short and long-term motor skill learning in an accelerated rotarod training paradigm. Neurobiol. Learn. Mem. 81(3): 211-6.

79

Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius D. (1997). The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389: 816-824.

Caterina MJ, Leffler A, Malmberg AB, Martin WJ, Trafton J, Petersen-Zeitz KR, Koltzenburg M, Basbaum AI, Julius D. (2000). Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science. 288, 306–313.

Chen HS, He X, Wang Y, Wen WW, You HJ, Arendt-Nielsen L. (2007). Roles of capsaicinsensitive primary afferents in differential rat models of inflammatory pain: a systematic comparative study in conscious rats. Exp Neurol. 204:244–51.

Chu CJ, Huang SM, De Petrocellis L, Bisogno T, Ewing SA, Miller JD, Zipkin RE, Daddario N, Appendino G, Di Marzo V, Walker JM. (2003). Noleoyldopamine, a novel endogenous capsaicin-like lipid that produces hyperalgesia. J Biol Chem. 278:13633–9.

Davis JB, Gray J, Gunthorpe MJ, Hatcher JP, Davey PT, Overend P, Harries MH, Latchman J, Clapham C, Atkinson K, Hughes SA, Rance K, Grau E, Harper AJ, Pugh PA, Rogers DC, Bingham S, Randall A, Sheardown AS. (2000). Vanilloid receptor-1 is essential for inflammatory thermal hyperalgesia. Nature. 405, 183–187.

Dai Y, Wang S, Tominaga M, Yamamoto S, Fukuoka T, Higashi T. (2007). Sensitization of TRPA1 by PAR2 contributes to the sensation of inflammatory pain. J Clin Invest 117: 1979–1987.

Davis KD, Pope GE. (2002). Noxious cold evokes multiple sensations with distinct time courses. Pain. 98:179–85.

Dray A, Bettaney J, Forster P. (1990). Resiniferatoxin, a potent capsaicin-like stimulator of peripheral nociceptors in the neonatal rat tail in vitro. Br J Pharmacol. 99:323–6.

de M Mos, de Bruijn AG, Huygen FJ, Dieleman JP, Stricker BH, Sturkenboom MC. (2007). The incidence of complex regional pain syndrome: a population-based study. Pain. 129:12–20.

de M M, Huygen FJ, Hoeven-Borgman M, Dieleman JP, Ch Stricker BH, Sturkenboom MC. (2009). Outcome of the complex regional pain syndrome. Clin. J. Pain. 25(7):590-597. Dux M, Sann H, Schemann M, Jancsó G. (1999). Changes in fibre populations of the rat hairy skin following selective chemodenervation by capsaicin. Cell Tissue Res. 296:471–7.

Eddy N.B, Leimbach D. (1953). Synthetic analgesics II. Dithienylbutenyl and dithienylbutylamines J. Pharmacol. Exp. Ther, 45, p. 339.

80

Everaerts W, Gees M, Alpizar YA, Farre R, Leten C, Apetrei A, Dewachter I, van Leuven F, Vennekens R, De Ridder D, Nilius B, Voets T, Talavera K. (2011). The capsaicin receptor TRPV1 is a crucial mediator of the noxious effects of mustard oil. Curr Biol. 21(4):316-21.

Fernandes ES, Fernandes MA, Keeble JE. (2012). The functions of TRPA1 and TRPV1: moving away from sensory nerves. Br J Pharmacol. 166(2):510-21.

Fernandes ES, Russell FA, Spina D, McDougall JJ, Graepel R, Gentry C, Staniland AA, Mountford DM, Keeble JE, Malcangio M, Bevan S, Brain SD. (2011). A distinct role for transient receptor potential ankyrin 1, in addition to transient receptor potential vanilloid 1, in tumor necrosis factor α-induced inflammatory hyperalgesia and Freund's complete adjuvant-induced monarthritis. Arthritis Rheum. (3):819-29. doi: 10.1002/art.30150. Füredi R, Bölcskei K, Szolcsányi J, Pethő G. (2009). Effects of analgesics on the plantar incision-induced drop of the noxious heat threshold measured with an increasingtemperature water bath in the rat. Eur. J. Pharmacol. 605, 63–67. Füredi R, Bölcskei K, Szolcsányi J, Pethő G. (2010). Comparison of the peripheral mediator background of heat injury- and plantar incision-induced drop of the noxious heat threshold in the rat. Life Sci. 86, 244–250.

Gallowitsch-Puertaa M, Pavlova V. (2007). Neuro-immune interactions via the cholinergic antiinflammatory pathway. Life Sciences. 80. 24–25. 2325–2329.

Gamse R. (1982). Capsaicin and nociception in the rat and mouse. Possible role of substance P. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 320:205–16.

Gaszner B, Kormos V, Kozicz T, Hashimoto H, Reglodi D, Helyes Z. (2012). The behavioral phenotype of pituitary adenylate–cyclase activating polypeptide-deficient mice in anxiety and depression tests is accompanied by blunted c-Fos expression in the bed nucleus of the stria terminalis, central projecting Edinger–Westphal nucleus, ventral lateral septum, and dorsal raphe nucleus. Neuroscience. pp. 283–299.

Gavva NR, Tamir R, Qu Y, Klionsky L, Zhang TJ, Immke D, Wang J, Zhu D, Vanderah TW, Porreca F, Doherty EM, Norman MH, Wild KD, Bannon AW, Louis JC, Treanor JJ. (2005). AMG 9810 [(E)-3-(4-tbutylphenyl)-N-(2, 3 dihydrobenzo[b][1, 4] dioxin-6-yl)acrylamide], a novel vanilloid receptor 1 (TRPV1) antagonist with antihyperalgesic properties. J. Pharmacol. Exp. Ther. 313, 474–484.

Gavva NR, Bannon AW, Surapaneni S, Hovland Jr, DN Lehto SG, Gore A, Juan T, Deng H, Han B, Klionsky L, Kuang R, Le A, Tamir R, Wang J, Youngblood B, Zhu D, Norman MH, Magal E, Treanor JJ,

81

Louis JC. (2007). The vanilloid receptor TRPV1 is tonically activated in vivo and involved in body temperature regulation. J. Neurosci. 27, 3366–3374.

Gavva NR, Treanor JJ, Garami A, Fang L, Surapaneni S, Akrami A, Alvarez F, Bak A, Darling M, Gore A, Jang GR, Kesslak JP, Ni L, Norman MH, Palluconi G, Rose MJ, Salfi M, Tan E, Romanovsky AA, Banfield C, Davar G. (2008). Pharmacological blockade of the vanilloid receptor TRPV1 elicitsmarked hyperthermia in humans. Pain 136, 202–210.

Gees M1, Alpizar YA, Boonen B, Sanchez A, Everaerts W, Segal A, Xue F, Janssens A, Owsianik G, Nilius B, Voets T, Talavera K. (2013). Mechanisms of transient receptor potential vanilloid 1 activation and sensitization by allyl isothiocyanate. Mol Pharmacol. 84(3):325-34. doi: 10.1124/mol.113.085548.

Geppetti P, Nassini R, Materazzi S, Benemei S. (2008). The concept of neurogenic inflammation. BJU Int.;101 Suppl 3:2-6. doi: 10.1111/j.1464-410X.2008.07493.x. Review.

Gierthmuhlen J, Maier C, Baron R, Tolle T, Treede RD, Birbaumer N, Huge V, Koroschetz J, Krumova EK, Lauchart M, Maihofner C, Richter H, Westermann A. (2012). Sensory signs in complex regional pain syndrome and peripheral nerve injury. Pain. 153(4):765-774.

Goebel A. (2011).Complex regional pain syndrome in adults. Rheumatology (Oxford) 50(10):1739-1750.

Goebel A, Baranowski AP, Maurer K, Ghiai A, McCabe C, Ambler G. (2010). Intravenous Immunoglobulin Treatment of Complex Regional Pain Syndrome: A Randomized Trial. AnnInternMed. 152(3):152-158.

Goebel A, Leite MI, Yang L, Deacon R, Cendan CM, Fox-Lewis A, Vincent A. (2011). The passive transfer of immunoglobulin G serum antibodies from patients with longstanding Complex Regional Pain Syndrome. Eur J Pain 15(5):504 e501-506.

Goebel A, Misbah, S., McKiver, K., Haynes, L., Burton, J., Philips, C., Frank, B., Poole, H. (2013). Immunoglobulin Maintenance Therapy in Lonstanding Complex Regional Pain Syndrome. Rheumatology (Oxford). 52(11):2091-3. doi: 10.1093/rheumatology/ket282.

Goebel A, Stock M, Deacon R, Sprotte G, Vincent A. (2005). Intravenous immunoglobulin response and evidence for pathogenic antibodies in a case of complex regional pain syndrome 1. AnnNeurol 3;57(3):463464.

Gu Q, Lin RL. (2010). Heavy metals zinc, cadmium, and copper stimulate pulmonary sensory neurons via direct activation of TRPA1. J Appl Physiol 108: 891–897.

82

Gunthorpe MJ, Benham CD, Randall A, Davis JB. (2002). The diversity in the vanilloid (TRPV) receptor family of ion channels. Trends Pharmacol Sci. 23: 183-191.

Guo TZ, Offley SC, Boyd EA, Jacobs CR, Kingery WS. (2004). Substance P signaling contributes to the vascular and nociceptive abnormalities observed in a tibial fracture rat model of complex regional pain syndrome type I. Pain. 108(1-2):95-107.

Harden RN, Bruehl S, Perez RS, Birklein F, Marinus J, Maihofner C, Lubenow T, Buvanendran A, Mackey S, Graciosa J, Mogilevski M, Ramsden C, Chont M, Vatine JJ. (2010). Validation of proposed diagnostic criteria (the "Budapest Criteria") for Complex Regional Pain Syndrome. Pain. 8; 150 (2):268-274.

Hargreaves K, Dubner R, Brown F, Flores C, Joris J. (1988). A new and sensitivemethod for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain 32, 77–88.

Hayes AG, Tyers MB. (1980). Effects of capsaicin on nociceptive heat, pressure and chemical thresholds and on substance P levels in the rat. Brain. Res.189:561–4. Helyes Zs, Pintér E, Németh J, Szolcsányi J. (2003). Pharmacological targets for the inhibition of neurogenic inflammation. Anti-Inflammatory and Anti-Allergy Agents in Curr. Med. Chem. 2: 191-218.

Hinman A, Chuang HH, Bautista DM, Julius D. (2006). TRP channel activation by reversible covalent modification. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103(51):19564-8.

Hoffmann T, Kistner K, Miermeister F, Winkelmann R, Wittmann J, Fischer MJ, Weidner C, Reeh PW. (2013). TRPA1 and TRPV1 are differentially involved in heat nociception of mice. Eur J Pain. May 29. doi: 10.1002/j.1532-2149.2013.00331.

Holzer P. (1991). Capsaicin: cellular targets, mechanisms of action, and selectivity for thin sensory neurons. Pharmacol. Rev. 43: 143-201.

Holzer P. (2008). The pharmacological challenge to tame the transient receptor potential vanilloid-1 (TRPV1) nocisensor. Br. J. Pharmacol. 155, 1145–1162. Honoré P, Wismer CT, Mikusa J, Zhu CZ, Zhong C, Gauvin DM, Gomtsyan AE, Kouhen R, Lee CH, Marsh K, Sullivan JP, Faltynek CR, Jarvis MF. (2005). A- 425619 [1-isoquinolin-5-yl-3-(4-trifluoromethyl-benzyl)urea], a novel transient receptor potential type V1 receptor antagonist, relieves pathophysiological pain associated with inflammation and tissue injury in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 314, 410–421.

83

Honoré P, Chandran P, Hernandez G, Gauvin DM, Mikusa JP, Zhong C, Joshi SK, Ghilardi JR, Sevcik MA, Fryer RM, Segreti JA, Banfor PN, Marsh K, Neelands T, Bayburt E, Daanen JF, Gomtsyan A, Lee CH, Kort ME, Reilly RM, Surowy CS, Howard MR, Millward-Sadler SJ, Vasilliou AS, Salter DM, Quinn JP. (2008). Mechanical stimulation induces preprotachykinin gene expression in osteoarthritic chondrocytes which is correlated with modulation of the transcription factor neuron restrictive silence factor. Neuropeptides. 42(56):681-686. Hőgyes E (1878). Beitrage zur physiologischen Wirkung der Bestandsteile de capsicum anuum. Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie 9: 117-130.

Hu H, Bandell M, Petrus MJ, Zhu MX, Patapoutian A. (2009). Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels. Nat Chem Biol 5: 183–190.

Huygen FJ, De Bruijn AG, De Bruin MT, Groeneweg JG, Klein J, Zijistra FJ. (2002). Evidence for local inflammation in complex regional pain syndrome type 1. MediatorsInflamm. 11(1):47-51.

Immke DC, Gavva NR. (2006). The TRPV1 receptor and nociception. Semin Cell Dev Biol. 17:582–91.

Inoue K, Koizumi S, Fuziwara S, Denda S, Inoue K, Denda M. (2002). Functional vanilloid receptors in cultured normal human epidermal keratinocytes. Biochem Biophys Res Commun. 291(1):124-9.

Jaquemar D, Schenker T, Trueb B. (1999). An ankyrin-like protein with transmembrane domains is specifically lost after oncogenic transformation of human fibroblasts. J Biol Chem. 274(11):7325-33. Jancsó N, Jancsó-Gábor A, Szolcsányi J. (1967). Direct evidence for neurogenic inflammation and its prevention by denervation and by pretreatment with capsaicin. British Journal of Pharmacology 31: 138-151. Jancsó N. (1960). Role of nerve terminals in the mechanism of inflammatory reactions. Bull. Millard Fillmore Hosp. Buffalo N.Y. 7: 53-77. Jordt SE, Bautista DM, Chuang HH, McKemy DD, Zygmunt PM, Högestätt ED, Meng ID, Julius D. (2004). Mustard oils and cannabinoids excite sensory nerve fibres through the TRP channel ANKTM1. Nature 427: 260–265.

Julius D. (1997). Another opiate for the masses? Nature. 386 (6624):442.

Jung SR, Kim MH, Hille B, Nguyen TD, Koh DS. (2004). Regulation of exocytosis by purinergic receptors in pancreatic duct epithelial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 286(3):C573-9.

84

Karai L, Brown DC, Mannes AJ, Connelly ST, Brown J, Gandal M, Wellisch OM, Neubert JK, Olah Z, Iadarola MJ. (2004). Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. J Clin Invest.113:1344–52.

Kingery WS. (2010). Role of neuropeptide, cytokine, and growth factor signaling in complex regional pain syndrome. Pain Med.11(8):1239-1250.

Kohr D, Singh P, Tschernatsch M, Kaps M, Pouokam E, Diener M, Kummer W, Birklein F, Vincent A, Goebel A, Wallukat G, Blaes F. (2011). Autoimmunity against the beta(2) adrenergic receptor and muscarinic-2 receptor in complex regional pain syndrome. Pain. 152(12):2690-2700.

Krumova EK, Frettloh J, Klauenberg S, Richter H, Wasner G, Maier C. (2008). Long-term skin temperature measurements - a practical diagnostic tool in complex regional pain syndrome. Pain. 140(1):8-22.

Kuner R, (2007). Genetic approaches for the study of pain. in: Zhuo M, Gebrhardt GF editors. Molecular Pain. Vol.1. Higher education Press. p. 235-244.

Kym PR, Mantyh PW, Sullivan JP, Jarvis MF, Faltynek CR. (2009). Repeated dosing of ABT-102, a potent and selective TRPV1 antagonist, enhances TRPV1-mediated analgesic activity in rodents, but attenuates antagonist-induced hyperthermia. Pain. 142, 27–35.

Kwan KY, Allchorne AJ, Vollrath MA, Christensen AP, Zhang DS, Woolf CJ, Corey DP. (2006). TRPA1 contributes to cold, mechanical, and chemical nociception but is not essential for hair-cell transduction. Neuron. 20;50(2):277-89.

Latremoliere A, Woolf CJ. (2009). Central sensitization: a generator of pain hypersensitivity by central neural plasticity. J Pain. 10(9):895-926.

Lehto SG, Tamir R, Deng H, Klionsky L, Kuang R, Le A, Lee D, Louis JC, Magal E, Manning BH, Rubino J, Surapaneni S, Tamayo N, Wang T, Wang J, Wang J, Wang W, Youngblood B, Zhang M, Zhu D, Norman MH, Gavva NR. (2008). Antihyperalgesic effects of (R, E)-N-(2-hydroxy-2, 3-dihydro-1H-inden-4-yl)-3- (2(piperidin-1-yl)-4-(trifluoromethyl)phenyl)-acrylamide (AMG8562), a novel transient receptor potential vanilloid type 1 modulator that does not cause hyperthermia in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 218–229.

Leem JW, Willis WD, Chung JM. (1993). Cutaneous sensory receptors in the rat foot. J Neurophysiol. 69:1684 99.

Levine JD, Collier DH, Basbaum AI, Moskowitz MA, Helms CA. (1986). Hypothesis: the nervous system may contribute to the pathophysiology of rheumatoid arthritis. J Rheumatol 12: 406-11.

85

Liu L, Oortgiesen M, Li L, Simon SA. (2001). Capsaicin inhibits activation of voltage-gated sodium currents in capsaicin-sensitive trigeminal ganglion neurons. J Neurophysiol. 85:745–58.

Macpherson LJ, Hwang SW, Miyamoto T, Dubin AE, Patapoutian A, Story GM. (2006). More than cool: promiscuous relationships ofmenthol and other sensory compounds. Mol. Cell. Neurosci. 32:335–343.

Macpherson LJ, Geierstanger BH, Viswanath V, Bandell M, Eid SR, Hwang S, Patapoutian A. (2005). The pungency of garlic: activation of TRPA1 and TRPV1 in response to allicin. Curr. Biol. 15: 929–934.

Maggi CA, Bevan S, Walpole CS, Rang HP, Giuliani S. (1993). A comparison of capsazepine and ruthenium red as capsaicin antagonists in the rat isolated urinary bladder and vas deferens. Br. J. Pharmacol. 108(3):801-5.

Marinus J, Moseley GL, Birklein F, Baron R, Maihofner C, Kingery WS, Van Hilten JJ. (2011). Clinical features and pathophysiology of complex regional pain syndrome. Lancet Neurol.10(7):637-648.

McKemy DD, Neuhausser WM, Julius D. (2002). Identification of a cold receptor reveals a general role for TRP channels in thermosensation. Nature. 416:52–8.

McNamara CR, Mandel-Brehm J, Bautista DM, Siemens J, Deranian KL, Zhao M, Hayward NJ, Chong JA, Julius D, Moran MM, Fanger CM. (2007). TRPA1 mediates formalin-induced pain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104(33):13525-30.

Merskey & Bogduk (Eds.) (1994). Classification of Chronic Pain. Seattle: IASP Task Force on Taxonomy

Messeguer A, Planells-Cases R, Ferrer-Montiel A. (2006). Physiology and pharmacology of the vanilloid receptor. Curr. Neuropharmacol. (1):1-15. Mezei M, Pénzes I. (2002) Megelőzhető-e az akut fájdalom krónikusáá válása? Hippocrates. IV. évf. 4. szám.

Meyer RA, Ringkamp, M., Campbell, J.N, Raja, S.N. (2006). Peripheral mechanisms of cutaneous nociception. In: SB McMahon, Kotzenburg, M., editor. Textbook of Pain. Amsterdam: Elsevier. pp. 3-33.

Miyamoto R, Otsuguro K, Ito S. (2011). Time- and concentration-dependent activation of TRPA1 by hydrogen sulfide in rat DRG neurons. Neurosci Lett. 499(2):137-42.

Moriyama T, Higashi T, Togashi K, Iida T, Segi E, Sugimoto Y, Tominaga T, Narumiya S, Tominaga M. (2005). Sensitization of TRPV1 by EP1 and IP reveals peripheral nociceptive mechanism of prostaglandins. Mol. Pain 1, 3.

86

Mousa SA, Zhang Q, Sitte N, Ji R, Stein C. (2001). Beta-endorphin-containing memory-cells and mu-opioid receptors undergo transport to peripheral inflamed tissue. J. Neuroimmunol. 115:71-78. Nagata K, Duggan A, Kumar G, García-Añoveros J. (2005). Nociceptor and hair cell transducer properties of TRPA1, a channel for pain and hearing. J. Neurosci. 25(16):4052-61.

Nemeth J, Gorcs T, Helyes Z, Oroszi G, Kocsy T, Pinter E, Szolcsanyi J. (1998). Development of a new sensitive CGRP radioimmunoassay for neuropharmacological research. Neurobiology (Bp). (4):473-475.

Nemeth J, Oroszi G, Than M, Helyes ZS, Pinter E, Farkas B, Szolcsanyi J. (1999). Substance P radioimmunoassay for quantitative characterization of sensory neurotransmitter release. Neurobiology (Bp). 7(4):437-444.

Neubert JK, Karai L, Jun JH, Kim HS, Olah Z, Iadarola MJ. (2003). Peripherally induced resiniferatoxin analgesia. Pain. 104:219–28.

Nolano M, Simone DA, Wendelschafer-Crabb G, Johnson T, Hazen E, Kennedy WR. (1999). Topical capsaicin in humans: parallel loss of epidermal nerve fibers and pain sensation. Pain. 81:135–45. Obál Jr F, Benedek G, Jancsó-Gábor A, Obál F. (1979). Salivary cooling, escape reaction and heat pain in capsaicin-desensitized rats. Pflügers Arch. 382:249–54.

Obata K, Katsura H, Mizushima T, Yamanaka H, Kobayashi K, Dai Y, Fukuoka T, Tokunaga A, Tominaga M, Noguchi K. (2005). TRPA1 induced in sensory neurons contributes to cold hyperalgesia after inflammation and nerve injury. J. Clin. Invest. 115(9):2393-401.

O'Callaghan JP, Holzman SG. (1975). Quantification of the analgesic activity of narcotic antagonists by a modified hot plate procedure. J. Pharmacol. Exp. Ther. 192: 497-505.

Pan HL, Khan GM, Alloway KD, Chen SR. (2003). Resiniferatoxin induces paradoxical changes in thermal and mechanical sensitivities in rats: mechanism of action. J Neurosci. 23. 2911–9.

Peier AM, Moqrich A, Hergarden AC, Reeve AJ, Andersson DA, Story GM, Earley TJ, Dragoni I, McIntyre P, Bevan S, Patapoutian A. (2002). A TRP channel that senses cold stimuli and menthol. Cell. 108:705–15. Pecze L, Pelsoczi P, Kecskés M, Winter Z, Papp A, Kaszás K, Letoha T, Vizler C,. Oláh Z. (2009). Resiniferatoxin mediated ablation of TRPV1+ neurons removes TRPA1 as well. Can. J. Neurol. Sci. 234– 141.

87

Pingle SC, Matta JA, Ahern GP. (2007). Capsaicin receptor: TRPV1 a promiscuous TRP channel. Handbook of Experimental Pharmacolog. 179:155-171.

Pizziketti RJ, Pressman NS, Geller EB, Cowan A, Adler MW. (1985). Rat cold water tail-flick: a novel analgesic test that distinguishes opioid agonists from mixed agonist-antagonists. European Journal of Pharmacology. 119(1-2):23-29.

Pogatzki-Zahn EM, Shimizu I, Caterina M, Raja SN. (2005). Heat hyperalgesia after incision requires TRPV1 and is distinct from pure inflammatory pain. Pain. 115, 296–307.

Pogatzki-Zahn EM, Zahn PK, Brennan TJ. (2007). Postoperative pain--clinical implications of basic research. Best Practice & Research Clin. Anaesthesiology; 21 (1):3-13.

Pomonis JD, Harrison JE, Mark L, Bristol DR, Valenzano KJ, Walker K. (2003.) N-(4- tertiarybutylphenyl)4-(3-cholorphyridin-2-yl) tetrahydropyrazine-1(2H)-carboxamide BCTC), a novel, orally effective vanilloid receptor 1 antagonist with analgesic properties: II. In vivo characterization in ratmodels of inflammatory and neuropathic pain. J. Pharmacol. Exp. Ther. 306, 387–393.

Premkumar LS, Ahern GP. (2000). Induction of vanilloid receptor channel activity by protein kinase C. Nature 408, 985–990.

Ralevic V, Jerman JC, Brough SJ, Davis JB, Egerton J, Smart D. (2003). Pharmacology of vanilloids at recombinant and endogenous rat vanilloid receptors. Biochem. Pharmacol. 65:143–51.

Rami HK, Thompson M, Stemp G, Fell S, Jerman JC, Stevens AJ, Smart D, Sargent B, Sanderson D, Randall AD, Gunthorpe MJ, Davis JB. (2006). Discovery of SB-705498: a potent, selective and orally bioavailable TRPV1 antagonist suitable for clinical development. Bioorg. Med. Chem. Lett. 16, 3287–3291.

Rose NR, Bona C. (1993). Defining criteria for autoimmune diseases (Witebsky's postulates revisited). Immunol.Today. 9;14(9):426-430.

Salas MM, Hargreaves KM, Akopian AN. (2009). TRPA1-mediated responses in trigeminal sensory neurons: interaction between TRPA1 and TRPV1. Eur. J. Neurosci. (8):1568-78.

Sahbaie P, Shi X, Guo TZ, Qiao Y, Yeomans DC, Kingery WS, Clark JD. (2009). Role of substance P signaling in enhanced nociceptive sensitization and local cytokine production after incision. Pain.145(3):341349.

Scherer M, Reichl SU, Augustin M, Pogatzki-Zahn EM, Zahn PK. (2010). The assessment of cold hyperalgesia after an incision. Anesthesia and analgesia. 110(1):222-227.

88

Schulze E, Witt M, Fink T, Hofer A, Funk RH. (1997). Immunohistochemical detection of human skin nerve fibers. Acta histochemica. 99(3):301-309.

Sawada Y, Hosokawa H, Matsumura K, Kobayashi S. (2008). Activation of transient receptor potential ankyrin 1 by hydrogen peroxide. Eur J Neurosci. 27(5):1131-42.

Simone DA, Nolano M, Johnson T, Wendelschafer-Crabb G, Kennedy WR. (1998). Intradermal injection of capsaicin in humans produces degeneration and subsequent reinnervation of epidermal nerve fibers: correlation with sensory function. J Neurosci. 18:8947–59.

Simone DA, Cajander KC. (1996). Excitation of rat cutaneous nociceptors by noxious cold. Neurosci Lett. 213. 53–6.

Staud R, Craggs JG, Robinson ME, Perlstein WM, Price DD. (2007). Brain activity related to temporal summation of C-fiber evoked pain. Pain. 129(1-2):130-42. Stein C, Hassan AH, Przewłocki R, Gramsch C, Peter K, Herz A. (1990). Opioids from immunocytes interact with receptors on sensory nerves to inhibit nociception in inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5935-5939.

Story GM, Peier AM, Reeve AJ, Eid SR, Mosbacher J, Hricik TR, Earley TJ, Hergarden AC, Andersson DA, Hwang SW, McIntyre P, Jegla T, Bevan S, Patapoutian A. (2003). ANKTM1, a TRP like channel expressed in nociceptive neurons, is activated by cold temperatures. Cell. 112:819–29.

Sugiura T, Tominaga M, Katsuya H, Mizumura K. (2002). Bradykinin lowers the threshold temperature for heat activation of vanilloid receptor 1. J. Neurophysiol. 88, 544–548.

Szabo A, Helyes Z, Sandor K, Bite A, Pinter E, Nemeth J, Banvolgyi A, Bolcskei K, Elekes K, Szolcsanyi J. (2005). Role of transient receptor potential vanilloid 1 receptors in adjuvant-induced chronic arthritis: in vivo study using gene-deficient mice. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 314(1):111119. Szallasi A, Szabó T, Bíró T, Modarres S, Blumberg PM, Krause JE, Cortright DN, Appendino G. (1999). Resiniferatoxin-type phorboid vanilloids display capsaicin-like selectivity at native vanilloid receptors on rat DRG neurons and at the cloned vanilloid receptor VR1. Br J Pharmacol. 128(2):428-34.

Szallasi A, Cortright DN, Blum CA, Eid SR. (2007). The vanilloid receptor TRPV1: 10 years from channel cloning to antagonist proof-of-concept. Nat. Rev. Drug Discov. 6(5):357-72.

89

Szallasi A, Joo F, Blumberg PM. (1989). Duration of desensitization and ultrastructural changes in dorsal root ganglia in rats treated with resiniferatoxin, an ultrapotent capsaicin analog. Brain Res. 503(1):68-72. Szolcsányi J. (2008). Hot target on nociceptors: perspectives, caveats and unique features. Br. J. Pharmacol. 155, 1142–1144. Szolcsányi J, Sándor Z, Petho G, Varga A, Bölcskei K, Almási R, Riedl Z, Hajos G, Czéh G. (2004). Direct evidence for activation and desensitization of the capsaicin receptor by Noleoyldopamine on TRPV1transfected cell, line in gene deleted mice and in the rat. Neurosci Letter. 361:155–8. Szolcsányi J, Helyes Zs, Oroszi G, Németh J, Pintér E. (1998a). Release of somatostatin and its role in the mediation of the anti-inflammatory effect induced by antidromic stimulation of sensory fibres of rat sciatic nerve. British Journal of Pharmacology. 123: 936-942. Szolcsányi J, Pintér E, Helyes Zs, Oroszi G, Németh J. (1998b). Systemic anti-inflammatory effect induced by counter-irritation through a local release of somatostatin from nociceptors. British Journal of Pharmacology 125: 916-922. Szolcsányi J. (1993). Actions of capsaicin on sensory receptors. In: Wood J, editor. Capsaicin in the Study of Pain. London: Academic Press. p. 1–26.

Szolcsanyi J, Szallasi A, Szallasi Z, Joo F, Blumberg PM. (1990). Resiniferatoxin: an ultrapotent selective modulator of capsaicin-sensitive primary afferent neurons. J Pharmacol Exp Ther. 255(2):923-8. Szolcsányi J. (1988). Antidromic vasodilatation and neurogenic inflammation. Agents Actions. 23: 4-11. Szolcsányi J. (1987). Selective responsiveness of polymodal nociceptors of the rabbit ear to capsaicin, bradykinin and ultra-violet irradiation. J Physiol (Lond). 388:9–23. Szolcsányi J. (1985). Sensory receptors and the antinociceptive effects of capsaicin. In: Hakanson R, Sundler F, editors. Tachykinin Antagonists. Amsterdam: Elsevier. p45–54. Szolcsányi J. (1984a.) Capsaicin and neurogenic inflammation: history and early findings. In: Antidromic Vasodilatation and Neurogenic Inflammation (eds: Chahl LA, Szolcsányi J, Lembeck F), pp. 7-26, Akadémiai Kiadó, Budapest. Szolcsányi J. (1984b). Capsaicin-sensitive chemoceptive neural system with dual sensoryefferent function. In: Antidromic Vasodilatation and Neurogenic Inflammation (eds: Chahl LA, Szolcsányi J, Lembeck F), pp. 27-53, Akadémiai Kiadó, Budapest.

90

Szolcsányi J, Jancsó-Gábor A. (1976). Sensory effects of capsaicin congeners II: Importance of chemical structure and pungency in desensitizing activity of capsaicin type compounds. Arzneimittelforschung. 26: 3337. Szolcsányi J, Jancsó-Gábor A. (1975). Sensory effects of capsaicin congeners I: Relationship between chemical structure and pain-producing potency of pungent agents. Arzneimittelforschung. 25: 1877-1881. Tajti J, Vécsei L. (2006). Mozgásszervi megbetegedéseket utánzó neuropátiás fájdalmak patomechanizmusa és terápiája. Magyar Tudomány 167: 1191-1196.

Taylor-Clark TE, Undem BJ, Macglashan DW Jr, Ghatta S, Carr MJ, McAlexander MA. (2008). Prostaglandin-induced activation of nociceptive neurons via direct interaction with transient receptor potential A1 (TRPA1). Mol Pharmacol 73: 274–281.

Teeling JL, Felton LM, Deacon RM, Cunningham C, Rawlins JN, Perry VH. (2007). Sub-pyrogenic systemic inflammation impacts on brain and behavior, independent of cytokines. Brain Behav.Immun. 21(6):836-850.

Tominaga M, Caterina MJ, Malmberg AB, Rosen TA, Gilbert H, Skinner K, Raumann, B.E., Basbaum, A.I., Julius, D. (1998). The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-producing stimuli. Neuron. 21:531-543.

Toyka KV, Brachman DB, Pestronk A, Kao I. (1975). Myasthenia gravis: passive transfer from man to mouse. Science. 190. (4212):397-399.

Trevisani M, Gatti R. (2013). TRPV1 Antagonists as Analgesic Agents. The Open Pain Journal. 108-118. Trevisani M, Siemens J, Materazzi S, Bautista DM, Nassini R, Campi B, Imamachi N, Andrè E, Patacchini R, Cottrell GS, Gatti R, Basbaum AI, Bunnett NW,Julius D, Geppetti P. (2007). 4-Hydroxynonenal, an endogenous aldehyde, causes pain and neurogenic inflammation through activation of the irritant receptor TRPA1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:13519–13524. Varga A, Bölcskei K, Szőke É, Almási R, Czéh G, Szolcsányi J, Pethő G. (2006). Relative roles of protein kinase A and protein kinase C in modulation of transient receptor potential vanilloid type 1 receptor responsiveness in rat sensory neurons in vitro and peripheral nociceptors in vivo. Neuroscience 140, 645– 657.

Vellani V, Mapplebeck S, Moriondo A, Davis JB, McNaughton PA. (2001). Protein kinase C activation potentiates gating of the vanilloid receptor VR1 by capsaicin, protons, heat and anandamide. J. Physiol. 534, 813–825.

91

Xu XJ, Farkas-Szállási T, Lundberg JM, Hökfelt T, Wiesenfeld-Hallin Z, Szállási A. (1997). Effects of the capsaicin

analogue

resiniferatoxin

on

spinal

nociceptive

mechanisms

in

the

rat:

behavioral,

electrophysiological and in situ hybridization studies. Brain Res.752:52–60.

Walker KM, Urban L, Medhurst SJ, Patel S, Panesar M, Fox AJ, McIntyre P. (2003). The VR1 antagonist capsazepine reverses mechanical hyperalgesia in models of inflammatory and neuropathic pain. J. Pharmacol. Exp. Ther. 304, 56–62.

Walpole CS, Bevan S, Bovermann G, Boelsterli JJ, Breckenridge R, Davies JW, Hughes GA, James I, Oberer L, Winter J. (1994). The discovery of capsazepine, the first competitive antagonist of the sensory neuron excitants capsaicin and resiniferatoxin. J Med Chem. 37(13):1942-54.

Weber M, Birklein F, Neundorfer B, Schmelz M. (2001). Facilitated neurogenic inflammation in complex regional pain syndrome. Pain. 91(3):251-257.

Wei T, Guo TZ, Li WW, Hou S, Kingery WS, Clark JD. (2012). Keratinocyte expression of inflammatory mediators plays a crucial role in substance P-induced acute and chronic pain. Journal of Neuroinflammation. 9:181.

Weil A, Moore SE, Waite NJ, Randall A, Guntrope MJ. (2005). Conservation of functional and pharmacological properties in the distantly related temperature sensors TRPV1 and TRPM8 . Mol. Pharmacol. 68(2): 518-27.

Woodbury CJ, Zwick M, Wang S, Lawson JJ, Caterina MJ, Koltzenburg M, Albers KM, Koerber HR, Davis BM. (2004). Nociceptors lacking TRPV1 and TRPV2 have normal heat responses. J Neurosci. 24:6410–5.

Wu C, Gavva NR, Brennan TJ. (2008). Effect of AMG0347, a transient receptor potentialtype V1 receptor antagonist, and morphine on pain behavior after plantar incision. Anesthesiology 108, 1100–1108.

Zimmermann M. (1983). Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain 16, 109–110.

Zimmermann K, Leffler A, Fischer MM, Messlinger K, Nau C, Reeh PW. (2005). The TRPV1/2/3 activator 2-aminoethoxydiphenyl borate sensitizes native nociceptive neurons to heat in wildtype but not TRPV1 deficient mice. Neuroscience 135, 1277–1284.

92

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton szeretném kifejezni köszönetemet mindazoknak, aki az eltelt évek során segítették a munkámat. Köszönöm témavezetőimnek, dr. Helyes Zsuzsanna és dr. Pethő Gábor professzoroknak, hogy bevezettek a kutatás világába, szakmai felkészültségükkel, lelkesedésükkel és precizitásukkal mutatva jó és követendő példát. Köszönettel tartozom dr. Bölcskei Katának, akihez mind a kísérletes munka során, mind pedig az értekezés készítésekor mindig bizalommal fordulhattam. Hálával tartozom dr. Pintér Erika és dr. Szolcsányi János professzoroknak, akik rendkivül magasszintű szakmai tanácsaikkal folyamatosan segítették munkámat. Köszönöm „szobatársaimnak” dr. Borbély Évának és dr. Hajna Zsófiának, hogy barátságukkal, lelkesedésükkel és szakmai tanácsaikkal folyamatosan inspiráltak és jobb teljesítményre ösztökéltek. Köszönöm a kísérletek során nyújtott nélkülözhetetlen segítséget Ömböliné Dórának, Góglné Katinak, Zádor Csillának, Bagoly Teréznek, Zöldhegyi Máriának, dr. Scheich Bálintnak, dr. Markovics Adriennek, dr. Kemény Ágnesnek, dr. Botz Bálintnak, Boros Melindának és diákköröseimnek Horváth Ádámnak és Kóger Tamásnak. Köszönöm dr. Andreas Goebelnek a komplex regionális fájdalom szindrómával kapcsolatos kooperációt. Köszönöm a „volt Richteres” kollegáimnak dr. Szőke Évának, dr. Sándor Zoltánnak, dr. Tóth Dániel Mártonnak és dr. Dézsi Lászlónak, hogy mindig számíthattam szakmai tanácsaikra. Továbbá köszönettel tartozom a Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet összes munkatársának. Végül, de nem utolsó sorban köszönöm családom támogatását, férjem türelmét és mindazt a szeretetet, amit tőlük kaptam.

93

Publikációs lista Értekezés alapjául szolgáló eredeti közlemények: Valéria Tékus, Zsófia Hajna, Éva Borbély, Adrienn Markovics, Teréz Bagoly, János Szolcsányi, Victoria Thompson, Ágnes Kemény, Zsuzsanna Helyes, Andreas Goebel: A CRPS-IgG-transfer-trauma model reproducing inflammatory and positive sensory signs associated with Complex Regional Pain Syndrome. Pain. 2014 Feb; 155 (2):299-308. doi: 10.1016/j.pain.2013.10.011. Epub 2013 Oct 18. (IF:5,644)

Tékus V., Bölcskei K., Kis-Varga A., Dézsi L., Szentirmay E., Visegrády A., Horváth C., Szolcsányi J., Pethő G.: Effect of transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) receptor antagonist compounds SB705498, BCTC and AMG9810 in rat models of thermal hyperalgesia measured with an increasingtemperature water bath. Eur. J. Pharmacol. 641(2-3), 2010, 135-141. (IF: 2.737 FC:4)

Bölcskei K., Tékus V., Dézsi L., Szolcsányi J., Pethő G.: Antinociceptive desensitizing actions of TRPV1 receptor agonists capsaicin, resiniferatoxin and N-oleoyldopamine as measured by determination of the noxious heat and cold thresholds in the rat. Eur. J. Pain 14 (5), 2010, 480-486. (IF:3.819 FC:3) (megosztott első szerző)

Az értekezés alapját képező publikációk kumulatív impact faktora: 12,2 Független citációk száma: 7

Egyéb teljes közlemények: de Oliveira C, Garami A, Lehto SG, Pakai E, Tekus V, Pohoczky K, Youngblood BD, Wang W, Kort ME, Kym PR, Pinter E, Gavva NR, Romanovsky AA.: Transient receptor potential channel ankyrin-1 is not a cold sensor for autonomic thermoregulation in rodents. J. Neurosci. 2014 Mar 26;34 (13):4445-52. doi: 10.1523/JNEUROSCI.5387-13.2014. (IF: 7,271; FC:0) Helyes Zs., Sándor K., Borbély É., Tékus V., Pintér E., Elekes K., Tóth D.M., Szolcsányi J., J.J. McDougall: Involvement of Transient Receptor Potential Vanilloid 1 receptors in Protease-Activated Receptor 2-induced joint inflammation and nociception. Eur. J. Pain 14(4), 2010, 351-358. (IF: 3.819; FC: 7)

Elekes K., Helyes Zs., Kereskai L., Sándor K., Pintér E., Pozsgai G., Tékus V., Bánvölgyi Á., Németh J., Szűts T., Kéri Gy., Szolcsányi J.: Inhibitory effects of synthetic somatostatin receptor subtype 4 agonists on acute and chronic airway inflammation and hyperreactivity in the mouse. Eur. J. Pharmacol. 578(2-3), 2008, 313-322. (IF:2,787, FC:14)

94

Az értekezés alapját képező konferencia-prezentációk: Valéria Tékus, Hajna Zsófia, Borbély Éva, Markovics Adrienn, Bagoly Teréz, Szolcsányi János, Thompson Victoria, Kemény Ágnes, Andreas Goebel, Zsuzsanna Helyes: Passive- transfer-trauma model for the Complex Regional Pain Syndrome (CRPS) in mice II. Pécs-Oklahoma Szimpózium, Pécs, 2013. (előadás)

Hajna Zsófia, Valéria Tékus, Borbély Éva, Markovics Adrienn, Bagoly Teréz, Szolcsányi János, Thompson Victoria, Kemény Ágnes, Andreas Goebel, Zsuzsanna Helyes: Passive- transfer-trauma model for the Complex Regional Pain Syndrome (CRPS) in mice Neuroinflammation Crongess, Prága, 2013. (poszter)

Valéria Tékus, Hajna Zsófia, Borbély Éva, Markovics Adrienn, Bagoly Teréz, Szolcsányi János, Thompson Victoria, Kemény Ágnes, Andreas Goebel, Zsuzsanna Helyes: Passive- transfer-trauma model for the Complex Regional Pain Syndrome (CRPS) in mice From Bionics to Medicine 1st European Ph.D. Conference Budapest, 2013. (poszter) Tékus Valéria, Kóger Tamás, Scheich Bálint, Hajna Zsófia Pintér, Erika, Szolcsányi János, Helyes Zsuzsanna:

A Tranziens Receptor Potenciál Ankyrin 1 (TRPA1) ioncsatorna szerepe fájdalomérző

folyamatokban Magyar Élettani Társaság, a Magyar Anatómusok Társasága, a Magyar Biofizikai Társaság és a Magyar Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Kongresszusa, Budapest, 2013. (előadás)

Zsuzsanna Helyes, Valéria Tékus, Hajna Zsófia, Borbély Éva, Markovics Adrienn, Bagoly Teréz, Szolcsányi János, Thompson Victoria, Kemény Ágnes, Andreas Goebel: A komplex regionális fájdalom szindróma (CRPS) passzív transzfer-trauma egérmodellje Magyar Élettani Társaság, a Magyar Anatómusok Társasága, a Magyar Biofizikai Társaság és a Magyar Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Kongresszusa, Budapest, 2013. (poszter)

Valéria Tékus, Tamás Kóger, Bálint Scheich, Zsófia Hajna, Éva Borbély, Erika Pintér, János Szolcsányi, Zsuzsanna Helyes: Role of the Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) ion channel in nociceptive processes 10th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the Summer Neuropeptide Conference, Gdynia 2013. (poszter)

Valéria Tékus, Bálint Scheich, Tamás Kóger, Ádám Horváth, Zsófia Hajna, Éva Borbély, Erika Pintér, János Szolcsányi, Zsuzsanna Helyes: Role of Transient Receptor Ankyrin 1 ( TRPA1) ion channel in nociceptive processes Magyar Idegtudományi Társaság XIV. Konferenciája, 2013. Budapest (poszter)

95

Tékus V., Helyes Z., Hajna Z., Horváth Á,, Kun J., Bölcskei K., Pintér E., Szolcsányi J.: Transient Receptor Potential Vanilloid (TRPV1), but not Ankyrin 1 (TRPA1) ion channels mediate mustard oil-induced hyperalgesia in mice I. International Doctoral Workshop of Natural Sciences 2012. Pécs (előadás)

Tékus, V, Hajna, Z, Horváth, A, Kun J, Bölcskei, K, Szolcsányi, J and Helyes Z. : Role of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 and Ankyrin 1 (TRPV1 and TRPA1) ion channels in thermonociception in mice IBRO International Workshop 2012. Szeged, Hungary (poszter)

Tékus, V, Helyes Z., Hajna, Z, Horváth, A, Kun J, Bölcskei, K, Pintér E. Szolcsányi, J: Involvement of Transient Receptor Vanilloid 1 (TRPV1) but not Ankyrin 1 (TRPA1) ion channels in mustard oil-induced hyperalgesia in the mouse 9th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the Summer Neuropeptide Conference, London 2012. (poszter)

Bölcskei Kata, Tékus Valéria, Pethő Gábor, Szolcsányi János: A termonocicepció új állatkísérletes vizsgálómódszerei: a magatartási nociceptív hőküszöb mérése Magyar Élettani Társaság, a Magyar Anatómusok Társasága, a Magyar Biofizikai Társaság és a Magyar Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Kongresszusa, Debrecen, 2012. (előadás) Valéria Tékus, Kata Bölcskei, Ágnes Kis-Varga, László Dézsi, Csilla Horváth, Gábor Pethő, János Szolcsányi: Antihyperalgesic effect of Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1) receptor antagonists SB705498, BCTC, AMG9810 in the rat measured with an increasing-temperature water bath IBRO International Workshop, Pécs, 2010. (poszter) Gábor Pethő, Kata Bölcskei, Valéria Tékus, Ágnes Kis-Varga, László Dézsi, Csilla Horváth, János Szolcsányi: Models for screening in rats the effects of TRPV1 receptor antagonists on thermal hyperalgesia and thermoregulation WorldPharma, Copenhagen, 2010. (poszter)

Valéria Tékus, Kata Bölcskei, László Dézsi, János Szolcsányi: Effects of the TRPV1 receptor antagonists SB705498, BCTC, AMG9810 in rat models of thermal hyperalgesia using noxious heat threshold measurements 12th World Congress of Pain, Glasgow, 2008 (poszter)

96

Dézsi László, Bölcskei Kata, Tékus Valéria, Szolcsányi János: Kapszaicin (TRPV1) receptor blokkolók hatása a nociceptív hőküszöbre patkány termális hiperalgézia modellekben Gyógyszerkémiai és Gyógyszertechnológiai Szimpózium, 2008. Zalakaros (előadás)

Dézsi László, Bölcskei Kata, Sándor Zoltán, Tékus Valéria, Szőke Éva, Tóth Dániel Márton és Szolcsányi János: Kísérletes mérési módszerek alkalmazása a fájdalomcsillapítók kutatásában In: Proc. of BUDAMED '08 14. MATE, 5 MEDING Orvostechnikai Konferencia, 2008. Budapest

Valéria Tékus, Kata Bölcskei, László Dézsi, János Szolcsányi: Effects of the TRPV1 receptor antagonists SB705498, BCTC, AMG9810 in rat models of thermal hyperalgesia using noxious heat threshold measurements Richter Gedeon Kutatási Fórum, Visegrád 2008. (poszter)

Tékus Valéria, Dézsi László, Bölcskei Kata, Szolcsányi János: TRPV1 receptor antagonisták hatása a fájdalmas hőküszöbre patkány termális hiperalgézia modellekben MKKFT-MÉT Vándorgyűlés, Debrecen 2008. (poszter)

Tékus Valéria, Bölcskei Kata, Tóth Dániel Márton, Dézsi László, Szolcsányi János: Az SB705498 TRPV1 receptor antagonista vegyület hatásai patkány in vivo nociceptív modellekben. Magyarországi Fájdalom Társaság Konferenciája, Kecskemét, 2007. (poszter)

Dézsi László, Bölcskei Kata, Tékus Valéria, Tóth Dániel Márton, Horváth Csilla,Pethő Gábor, Szolcsányi János: Kísérleti módszerek kapszaicin érzékenyreceptorok által közvetített fájdalom vizsgálatára. Gyógyszerkémiai és Gyógyszertechnológiai Szimpózium, Eger, 2007. (előadás)

Dézsi László, Tékus Valéria, Tóth Dániel Márton, Bölcskei Kata, Horváth Csilla, Pethő Gábor és Szolcsányi János: Nocicepció vizsgálata patkány in vivo modelleken a PTE-RG Analgetikum Kutatólaboratóriumban Richter Gedeon Kutatási Fórum, Dobogókő, 2007. (előadás)

Egyéb konferencia-prezentációk: Bálint Scheich, Viktória Kormos, Valéria Tékus, Zsófia Hajna, Balázs Gaszner, Kristóf László, László Lénárd, Erika Pintér, János Szolcsányi, Zsuzsanna Helyes Functional and immunocytochemical evidence for anxiolytic and antidepressant actions of somatostatin receptor subtype 4 activation in mice Neuroinflammation Crongess, Prága, 2013. (poszter)

Pintér Erika, Hajna Zsófia, Szabadfi Krisztina, Gábriel Róbert, Balla Zsolt, Bíró Zsolt, Degrell Péter, Kőszegi Tamás, Tékus Valéria, Helyes Zsuzsanna, Dobos András, Farkas Sándor, Szűcs Gyula: Az 1-es

97

típusú diabetes mellitus modellezése diabeteses neuropathia, nephropathia és szemelváltozások vizsgálatára patkányban Magyar Élettani Társaság, a Magyar Anatómusok Társasága, a Magyar Biofizikai Társaság és a Magyar Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Kongresszusa, Budapest, 2013. (előadás)

Kemény Ágnes, Boros Melinda, Sétáló György, Tékus Valéria, Perkecz Anikó, Helyes Zsuzsanna: A citokin profil változása monojód-acetáttal kiváltott izületi gyulladás modellben Magyar Élettani Társaság, a Magyar Anatómusok Társasága, a Magyar Biofizikai Társaság és a Magyar Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Kongresszusa, Budapest, 2013. (poszter)

Scheich Bálint, Kormos Viktória, Tékus Valéria, Hajna Zsófia, Gaszner Balázs, Pintér Erika, Szolcsányi János, Helyes Zsuzsanna: Inhibitory function of Somatostatin Receptor Subtype 4 (sst4) in anxiety and depression-like behaviours in the mouse 10th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the Summer Neuropeptide Conference, Gdynia 2013. (poszter)

Kemény Ágnes, Boros Melinda, Sétáló György, Tékus Valéria, Perkecz Anikó, Helyes Zsuzsanna: Changes of cytokyne profile in monosodium-iodoacetate-induced joint inflammation in TRPA1 WT and KO mice 10th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the Summer Neuropeptide Conference, Gdynia 2013. (poszter)

Éva Borbély, Liza Nabi, Zsófia Hajna, Valéria Tékus, Kristóf László, Tamás Ollmann, Zoltán Karádi, László Lénárd, John P.Quinn, Alexandra Berger, Christopher J Paige, Julie Keeble, János Szolcsányi, Erika Pintér, Zsuzsanna Helyes: Role of Hemokinin-1 and NK1 receptors in anxiety, stress and depression-like behaviour in mice 10th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the Summer Neuropeptide Conference, Gdynia 2013. (poszter)

Hajna Zsófia, Szitter István, Kemény Ágnes, Kereskai László, Tékus Valéria, Markovics Adrienn, Szolcsányi János, Pintér Erika, Helyes Zsuzsanna: Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) receptor plays a protective role in endotoxin-induced acute pneumonia, but not in smoking-related chronic bronchitis of the mouse 10th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the Summer Neuropeptide Conference, Gdynia 2013. (poszter)

Zsófia Hajna, Éva Borbély, Valéria Tékus, István Tóth, Alexandra Berger, Christopher J. Paige, Erika Pintér, József Kun, János Szolcsányi, Zsuzsanna Helyes: Hemokinin-1 induces hyperalgesia in inflammatory and neuropathic pain models of the mouse

98

Magyar Idegtudományi Társaság XIV. Konferenciája, 2013. Budapest (poszter)

Éva Borbély, Zsófia Hajna, Lisa Nabi, Valéria Tékus, Kristóf László, Tamás Ollmann, Zoltán Karádi, László Lénárd, John P. Quinn, Alexandra Berger, Christopher J. Paige, Julie Keeble, János Szolcsányi, Erika Pintér, Zsuzsanna Helyes: Role of hemokinin-1 and NK1 receptors in anxiety, stress and depression-like behaviour in mice Magyar Idegtudományi Társaság XIV. Konferenciája, 2013. Budapest (poszter)

Bálint Scheich, Viktória Kormos, Valéria Tékus, Zsófia Hajna, Balázs Gasztner, Kristóf László, László Lénárd, Erika Pintér, János Szolcsányi, Zsuzsanna Helyes: Funtional and immunochemical evidence for anxiolytic and antidepressant actions of somatostatin receptor subtype 4 activation in mice Magyar Idegtudományi Társaság XIV. Konferenciája, 2013. Budapest (poszter)

Sándor K., Tékus V., Pintér E., Elekes K., Tóth D.M., Szolcsányi J., J.J. McDougall, Helyes Zs.: Involvement of Transient receptor potential vanilloid 1 receptors in proteinase-activated receptor 2-induced joint inflammation and nociception. 30th Winter Neuropeptide Conference, Breckenridge, Colorado, USA, 2009 (poszter)

Dániel Márton Tóth, Éva Szőke, Kata Bölcskei, Valéria Tékus, László Dézsi, Zoltán Sándor, János Szolcsányi: Inhibition of the expression of the rat TRPV1 receptor by RNA interference. European Opioid Conference-European Neuropeptide Club, 2008, Ferrara (poszter)

Sándor Z, Tóth DM, Szőke É, Bölcskei K, Tékus V, Dézsi L, Szolcsányi J: RNS interferencia alkalmazása a TRPV1 receptor kutatásában. A Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság és a MÉT LXXII. Vándorgyűlése, Debrecen, Magyarország, 2008 (előadás)

Sándor Zoltán, Tóth Dániel Márton, Szőke Éva, Bölcskei Kata, Tékus Valéria, Dézsi László, Szolcsányi János: RNS interferencia alkalmazása a TRPV1 receptor kutatásában. A Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság és a MÉT LXXII. Vándorgyűlése, 2008, Debrecen

Tóth Dániel Márton, Szőke Éva, Bölcskei Kata, Tékus Valéria, Dézsi László, Sándor Zoltán, Szolcsányi János: Patkány TRPV1 receptor expressziójának gátlása RNS interferenciával. Membrán-transzport Konferencia, 2008, Sümeg

Tóth Dániel Márton, Szőke Éva, Bölcskei Kata, Tékus Valéria, Dézsi László, Sándor Zoltán, Szolcsányi János: Patkány TRPV1 receptor expressziójánakgátlása RNS interferenciával. A Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság és a MÉT LXXII. Vándorgyűlése, 2008, Debrecen

99

Idézhető absztraktok: Tékus, V, Hajna, Z, Horváth, A, Kun J, Bölcskei, K, Szolcsányi, J and Helyes Z. : Role of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 and Ankyrin 1 (TRPV1 and TRPA1) ion channels in thermonociception in mice Clinical Neuroscience 2012; 65: (1). pp.68 (IF:1.247)

Scheich B, Kormos V, Tékus V, Hajna Z, Gaszner B, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Z: Somatostatin receptor subtype 4 (sst4) plays an inhibitory role in anxiety and depression-like behaviours of mice Clinical Neuroscience 2012; 65: (1). pp.57 (IF:1.247)

Pethő G, Bölcskei K, Tékus V, Dézsi L, Szolcsányi J. Antinociceptive desensitizing actions of TRPV1 receptor agonists capsaicin, resiniferatoxin and N-oleoyldopamine as measured by determination of the noxious heat and cold thresholds in the rat. Acta Physiol Hung 2010; 97:(1) pp. 129-130 (IF: 0.453)

Helyes Z, Sandor K, Tekus V, Pinter E, Elekes K, Toth DM, Szolcsanyi J, McDougall JJ Involvement of TRPV1 receptors in protease-activated receptor 2-induced joint inflammation and nociception NEUROPEPTIDES 43: (5)451 (2009) (IF:2.036)

Helyes Zs., Sándor K., Tékus V., Pintér E., Elekes K., Tóth D.M., Szolcsányi J., J.J. McDougall: Involvement of TRPV1 receptors in protease-activated receptor 2-induced joint inflammation and nociception. Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and Summer Neuropeptide Conference, Salzburg, Austria, 2009 - absztrakt: Neuropeptides 43(5), p.451., 2009. (IF:2.438)

Tékus V, Dézsi L, Bölcskei K, Szolcsányi J.: Effects of TRPV1 receptor antagonists on the noxious heat threshold in rat thermal hyperalgesia models. Acta Physiol Hung 96:(1), 2009. p. 68. (IF: 0.75)

Tóth DM, Szőke É, Bölcskei K, Tékus V, Dézsi L, Sándor Z, Szolcsányi J; Inhibition of the expression of the rat TRPV1 receptor by RNA interference. A Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság és a MÉT LXXII. Vándorgyűlése, Debrecen, Magyarország, 2008 (poszter). absztrakt: Acta Physiol Hung 2009, 96:(1): p.138 (IF: 0.75)

Dézsi L, Laszy J, Kocsis P, Bölcskei K, Tékus V, Tarnawa I, Gyertyán I, Szolcsányi J. Hippocampusdependent learning and cortical spreading depression unaffected by TRPV1 receptor. Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and Summer Neuropeptide Conference, Salzburg, Austria, 2009 - absztrakt: Neuropeptides 2009; 43:(5) pp. 450-451 (IF: 2.036)

Az összes publikáció kumulatív impact factora: 26,077 Összes független citációk száma: 27

100