Factors Influencing Oral Health during Cancer Treatment; with Emphasis on the Relationship between the Oral Microbiome and Oral Mucositis A.M.G.A. Laheij
Factors influencing oral health in patients during cancer treatment; with emphasis on the relationship between the oral microbiome and oral mucositis. Nederlandse samenvatting: Het doel van dit proefschrift was om consequenties van de behandeling van kanker voor de mondgezondheid te onderzoeken. Meer specifiek werden de eiwitsamenstelling van speeksel na radiotherapie van het hoofdhalsgebied, de link tussen het orale microbioom en orale en systemische complicaties na een hematopoietische stam cel transplantatie (HSCT), en de invloed van mond bacteriën, en dan met name van Porphyromonas gingivalis, op wondgenezing onderzocht. In hoofdstuk 2 is de samenstelling van eiwitten in speeksel uit de oorspeekselklier bestudeerd bij kankerpatiënten na bestraling. Daartoe is speeksel uit de rechter en linker oorspeekselklier verzameld bij negen patiënten die bestraald waren in het hoofdhalsgebied en tien gezonde controles. Er werden Lashley cups over de uitvoergang van de oorspeekselklier geplaatst en de speekselvloed werd gestimuleerd met behulp van citroenzuur. De speekselmonsters werden meteen ingevroren in vloeibaar stikstof en bewaard bij -80⁰C tot de analyses werden uitgevoerd. De speekselmonsters werden geanalyseerd met behulp van SELDI-TOF-MS op een NP20 en een IMAC-30 chip. Eiwitten en peptiden werden bepaald tussen de 1 en 30 kDa. Met behulp van de NP20 chip werden er 61 (van de 217) en met behulp van de IMAC-30 chip werden er 32 (van de 218) pieken gevonden die significant verschilden in intensiteit tussen het speeksel van bestraalde patiënten en van gezonde controles (p<0.01). 55 % Van de significante pieken was hoger in intensiteit en 45% was lager in intensiteit in het speeksel van de bestraalde patiënten. Deze pieken kunnen onder andere de speekseleiwitten lysozym, histatines, cystatine, eiwit S100 en proline-rijke eiwitten (PRP’s) zijn. We concludeerden dat er grote verschillen waren in de relatieve hoeveelheid eiwitten in een grote range van molecuulgewichten in het speeksel uit de oorspeekselklier van patiënten die bestraald zijn in het hoofdhalsgebied vergeleken met gezonde controles. We vonden verschillen in meer eiwitten dan eerder beschreven waren. In de hoofdstukken 3 en 4 is de relatie tussen virussen, bacteriën en schimmels, en orale ulceratieve mucositis bij patiënten bestudeerd die een hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) hebben ondergaan. Prospectief hebben we 49 volwassen patiënten met hematologische maligniteiten bestudeerd die een allogene HSCT hebben ondergaan. Van deze patiënten ondergingen er 26 een myeloablatief en 23 een non-myeloablatief conditioning regime. Er werd standaard geen antivirale profylaxe gegeven. Orale mucositis werd twee keer per week gescoord met behulp van de WHO-criteria. Ook werden ulceraties op de gekeratiniseerde mondslijmvliezen genoteerd. Tegelijkertijd werden mondspoelmonsters afgenomen. De statistische methode voor longitudinale data analyse Generalized Estimated Equations (GEE) werd toegepast. In hoofdstuk 3 werd de relatie tussen orale ulceraties en de aanwezigheid van het Herpes simplex type 1 virus (HSV-1), het Epstein Barr virus (EBV) en het cytomegalovirus (CMV) in de mond van HSCT patiënten bestudeerd. Verder werd de aanwezigheid van acyclovir resistente HSV-1 stammen bij deze patiëntengroep bepaald. Een persisterende infectie werd gedefinieerd als een infectie die minimaal 5 dagen duurde, ondanks antivirale medicatie. De aantallen virussen in de mondspoelsels werden bepaald met behulp van real-time PCR. Monsters van patiënten
die HSV-1 positief bleven ondanks antivirale medicatie werden onderzocht op resistentie tegen deze medicatie. Een HSV-1 of EBV positief mondspoelsel was een significante positieve voorspeller voor het hebben van een ulceratie op de gekeratiniseerde slijmvliezen. HSV-1 was ook een significante voorspeller van het hebben van ulceraties op de niet-gekeratiniseerde slijmvliezen. HSV-1 was bijna alleen in de mond te vinden voor, tijdens en direct na een zichtbare ulceratie in de mond. Dus in deze patiëntengroep komt het asymptomatisch uitscheiden van HSV-1 virusdeeltjes in de mond nauwelijks voor. Persisterende HSV-1 infectie vond plaats in 12 van de 28 patiënten die behandeld werden met antivirale middelen. Acyclovir resistente HSV-1 werd in 5 persisterende infecties gevonden. In conclusie, HSV-1 is een voorspeller voor ulceraties op de niet-gekeratiniseerd en de gekeratiniseerde orale slijmvliezen na HSCT. De rol van EBV heeft meer onderzoek nodig. Een persisterende HSV-1 infectie ondanks antivirale behandeling komt vaak voor en werd veroorzaakt door resistentie in 18% van de behandelde patiënten. In hoofdstuk 4 hebben we de relatie tussen orale ulceraties na HSCT en de totale hoeveelheid bacteriën, de Gram-negatieve bacteriën: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Parvimonas micra, Fusobacterium nucleatum, Tannerella forsythia en Treponema denticola; en de schimmels: Candida albicans, Candida glabrata, Candida kefyr, Candida krusei, Candida parapsilosis en Candida tropicalis bepaald met behulp van real-time PCR met specifieke primers en probes. We vonden dat geen van de samples positief was voor A. actinomycetemcomitans, terwijl F. nucleatum het meest frequent gevonden werd (in 66% van de monsters). C. albicans was de meest geïsoleerde schimmel (in 88% van de monsters), terwijl C. parapsilosis maar in 8% van de monsters aanwezig was. De multivariate GEE analyse identificeerde P. gingivalis, P. micra, T. denticola, F. nucleatum, C. glabrata en C. kefyr als significante positieve voorspellers voor orale ulceraties op de niet-gekeratiniseerde slijmvliezen. Op de gekeratiniseerde slijmvliezen waren P. gingivalis, P. micra en C. glabrata positieve voorspellers voor ulceraties. We concludeerden dat voornamelijk P. gingivalis, maar ook P. micra, T. denticola, F. nucleatum, C. glabrata en C. kefyr voorspellers waren voor het hebben van ulceraties op de mondslijmvliezen bij patiënten die een HSCT hebben ondergaan. In hoofdstuk 5 is de associatie tussen ontstoken en geïnfecteerd parodontium (gingivitis en parodontitis) en het krijgen van een bacteriëmie tijdens de neutropene fase na allogene HSCT onderzocht. In deze prospectieve studie werden 18 patiënten geïncludeerd die een myeloablatieve allogene HSCT ontvingen. Alle patiënten kregen een volledig parodontaal onderzoek voorafgaand aan de HSCT. Patiënten werden geclassificeerd als parodontaal gezond als ze pocketdieptes hadden < 4mm en als de bloedingsscore < 10% waren. Patiënten werden geclassificeerd als gingivitis/parodontitis patiënten als ze minimaal 1 pocketdiepte > 4mm hadden en een bloedingsscore > 10%. Orale mucositis werd gescoord met behulp van de daily mucositis score. Tijdens de neutropene fase na HSCT werden minimaal twee wekelijks bloedkweken afgenomen om bacteriëmie vast te stellen. Vijf patiënten waren parodontaal gezond en 13 patiënten hadden gingivitis of parodontitis voorafgaand aan de HSCT. Na HSCT ontwikkelden alle patiënten ulceratieve mucositis en neutropenie. Twaalf patiënten (67%) kregen een bacteriëmie tijdens de neutropene fase. Elf patiënten maakten tenminste een episode van bacteriëmie door met coagulasenegatieve stafylokokken; voornamelijk Staphylococcus epidermidis, of met viridans streptokokken; voornamelijk Streptococcus mitis of Streptococcus oralis, of beiden. Meer patiënten met gingivitis/parodontitis kregen een bacteriëmie dan degenen met een gezond parodontium, en
bloedingsscores waren geassocieerd met het krijgen van een bacteriëmie. Ondanks dat alle patiënten ulceratieve mucositis ontwikkelden, waren de ernst en duur hiervan niet geassocieerd met het krijgen van een bacteriëmie. De duur van orale mucositis en het aantal dagen dat een patiënt opgenomen was in het ziekenhuis waren sterk gecorreleerd (R=0.835, p< 0.001). We concludeerden dat parodontale infecties bij kunnen dragen aan het risico op het ontwikkelen van een bacteriëmie door coagulasenegatieve stafylokokken en viridans streptokokken tijdens de neutropene fase na HSCT. Hoewel onze resultaten wijzen op het nut van parodontale screening en behandeling voorafgaand aan HSCT zijn er verdere studies nodig naar de rol van een ontstoken parodontium in het ontwikkelen van systemische infectieuze complicaties. P. gingivalis bleek geassocieerd met orale mucositis na HSCT. Onze hypothese was dat P. gingivalis de genezing van bestaande orale slijmvlies laesies negatief zou kunnen beïnvloeden. Daarom is in hoofdstuk 6 getoetst of P. gingivalis en de producten die het uitscheidt de migratie van orale epitheelcellen kan verhinderen in een in vitro wondgenezingsmodel. P. gingivalis is vergeleken met de mondbacteriën P. nigrescens, P. intermedia, T. forsythia, die bestudeerd zijn in hoofdstuk 4 en Streptococcus mitis, die in tegenstelling tot de andere bacteriën geassocieerd is met mondgezondheid. Het wondgenezingsmodel bestond uit een laag van humane epitheelcellen waar een gestandaardiseerde kras in werd gemaakt. Bacteriën en medium met uitscheidingsproducten van de bacteriën werden toegevoegd aan de epitheelcellen. Het sluiten van de kras werd na 17 uur gemeten met behulp van een fasecontrastmicroscoop. Het sluiten van de kras werd vergeleken met controlecondities: alleen medium. P. gingivalis, P. nigrescens, en de uitscheidingsproducten van P. gingivalis remden het sluiten van de kras in sterke mate. Minder sterke remming trad op bij de andere bacteriën. Deze resultaten bevestigden onze hypothese dat de geteste mondbacteriën van invloed kunnen zijn op vertraagde wondgenezing en de loop van mucositis kunnen beïnvloeden. In hoofdstuk 7 bestudeerden we de invloed was belangrijke virulentiefactoren van P. gingivalis op wondgenezing met behulp van hetzelfde in vitro wondgenezingsmodel als werd gebruikt in hoofdstuk 6. De invloed van het kapsel, de Arg- en Lys- gingipains, de grote fimbriae en lipopolysaccharide (LPS) werden onderzocht. De epitheelcellen werden gestimuleerd met verschillende wild type stammen en knockoutmutanten. De P. gingivalis stammen ATCC 33277, W83 en W50 remden de wondgenezing significant en P. gingivalis ATCC 33277 hinderde wondgenezing het sterkst. De aanwezigheid van een kapsel zorgde voor significant minder remming van migratie van epitheelcellen, terwijl de gingipain activiteit zorgde voor meer remming. LPS en de grote fimbriae hadden geen invloed op wondgenezing. Geen van de geteste P. gingivalis stammen kon de remming van celmigratie helemaal voorkomen. In conclusie, het kapsel en de gingipains van P. gingivalis beïnvloeden de remming van de wondgenezing door P. gingivalis, terwijl LPS en de grote fimbriae geen effect hadden. De resultaten suggereren dat ook andere eigenschappen van P. gingivalis een rol spelen in de remming van wondgenezing. In hoofdstuk 8 is een overzicht gegeven van recente onderzoeken in de literatuur betreffende de relatie tussen de orale microflora en mucositis. De rol van de microflora in orale en in intestinale mucositis krijgt meer aandacht in de recente literatuur dan voorheen. Na chemo- of radiotherapie is er duidelijk een shift te zien in de microflora, zowel in de mond als in het darmkanaal. De aanwezigheid van orale
ulceratieve mucositis valt samen met de aanwezigheid van bacteriën die geassocieerd zijn met parodontitis, en dan met name met P. gingivalis. Ook hebben we aangetoond dat deze bacterie de epitheliale cel migratie kan hinderen in een in vitro wondgenezingsmodel. We concludeerden dat in de mondholte bacteriën die met parodontitis geassocieerd zijn in ieder geval de genezing van ulceraties kunnen beïnvloeden en dat de rol die ze spelen in de loop van mucositis subtieler en ingewikkelder zou kunnen zijn dan voorheen werd gedacht. Algemene conclusie • •
• • • •
Bestraling van het hoofdhalsgebied verandert waarschijnlijk het klierweefsel waardoor er een verandering optreedt in de eiwitsamenstelling van speeksel uit de oorspeekselklier. Verschillende microorganismen: het virus HSV-1, de bacteriën: P. gingivalis, P. micra, T. denticola en F. nucleatum en de schimmels C. glabrata en C. kefyr zijn voorspellers voor de aanwezigheid van orale ulceraties bij patiënten na HSCT. Ontsteking van het parodontium kan een risicofactor zijn voor het ontwikkelen van systemische infectieuze complicaties in de neutropene fase na HSCT. Verschillende mondbacteriën waren in staat om het sluiten van een wond in een orale epitheelcellaag in vitro te remmen. Daarvan remde P. gingivalis de wondgenezing het sterkst. De virulentie factoren het kapsel en de gingipains waren van invloed op de eigenschap van P. gingivalis om wondgenezing te remmen. Ondanks dat micro-organismen maar een kleine rol toebedeeld werd in het ontstaan van orale mucositis, wordt in dit proefschrift duidelijk dat zij op zijn minst het beloop van mucositis kunnen beïnvloeden door het helen van bestaande laesies te remmen.
