Extracelluláris mátrix Tumor metasztázis, Angiogenezis, Sebgyógyulás, Májfibrózis

Extracelluláris mátrix Tumor metasztázis, Angiogenezis, Sebgyógyulás, Májfibrózis

Bevezetés Az extracelluláris mátrix (ECM) a kötöszöveti sejteket körülvevő, fehérjékből és szénhidrátokból felépúlő hálózat. Szerkezeti-mechanikus funkcióik mellett az ECM molekulák olyan folyamatok szabályozásában is részt vesznek, mint pl. az embrionális fejlődés, gyulladás, véralvadás, sebgyógyulás, tumor metasztázis képzés, angiogenezis, különböző belső szervek fibrotikus átalakulása. Az ECM molekulák főként az integrin receptorokon keresztül kommunikálnak a sejtekkel (lsd. Sejtadhézió szemináriumi anyag). Az ECM szerkezete nem állandó, átalakulásaival folyamatosan alkalmazkodik a körülményekhez : lebontásáért proteázok, főként a mátrix metalloproteázok a felelősök, újraképződése pedig mindig az aktuális körülményekhez igazodik. A szeminárium során a következő vázlatot követjük: 1. Az extracelluláris mátrix komponensei 2. A mátrix metalloproteázok családja 3. Mátrix metalloproteázok szerepe a tumor metasztázisban 4. Sebgyógyulás, fibrózis

1. Az extracelluláris mátrix komponensei Szervezetünkben az alábbi két formában jelenik meg az ECM: 1, a bazális membrán: különböző sejteket körülvevő tömör szerkezet, ilyen sejtek pl. az epiteliális sejtek vagy egyéb fedő sejtrétegek (mesothelium), izomsejtek, zsírsejtek, stb. 2, az interstíciális mátrix: a kötőszövetben egy tér-kitöltő struktúra, amelynek összetételeszerkezete nagyon változatos, és alapjaiban meghatározza az illető kötőszövet tulajdonságait Mindkét struktúra alapja egy vízben oldhatatlan kollagénváz, amelyhez vízoldékony ún. adhezív glikoproteinek és proteoglikánok kapcsolódnak. (Az ECM egyéb oldhatatlan struktúráiról, így a retikuláris rostokról és az elasztikus rostokról nem lesz szó ebben az anyagban.) Kollagének A kollagének mindenhol előfordulnak, többségük 3 polipeptidláncból összetekert jobbmenetes triplahélix, a láncok önmaguk balmenetes alfahélixek. Az alfaláncokban minden harmadik aminosav glicin, melynek kicsi oldallánca jól elfér a triplahélixben. A kollagén típusától függően non-helikális domének szakítják meg a triplahelikális struktúrákat. Az aminosavak kb. 20 %-a prolin, hidroxiprolin. A hidroxiprolin hidroxilcsoportja H-hídkötésekben vesz részt, melyek stabilizálják a triplahélixet. A lizinek és hidroxilizinek kovalens keresztkötésekkel a szupramolekuláris struktúrát stabilizálják. A hidroxilizin oldalláncok egyben glikozilációs helyek is. A hidroxilizin/lizin arány, ill. a glikoziláltság mértéke függ az adott kollagén típusától, szöveti lokalizációjától, és az egyed korától is. A kollagén alfaláncok szintézise a szekretoros útvonalat követi, számos ko-, és poszttranszlációs módosítást követően az ER-ban áll össze a triplahélix. A prokollagén ECM-ba történő szekrécióját még több 1

típus-specifikus módosulás követi, míg végül kialakul a szupramolekuláris kollagénstruktúra. Több, mint 20 genetikailag különböző kollagén típus ismert, osztályozásuk szerkezetük alapján történt. A fibrilláris kollagén típusok (I, II, III, V és XI) az ECM-ban rostokba szerveződnek. Az intracelluláris prekurzor molekula, a prokollagén mindkét végén non-helikális régiókat tartalmaz (N-, és C-telopeptidek, N-, és C-propeptidek). Szekréciót követően specifikus N-, és C-peptidázok lehasítják a propeptideket, és az így szabaddá váló telopeptidek irányítják a kollagénrostok polimerizációját. A spontán polimerizáció során a kollagén monomerek (300 nm hosszú, 1.4 nm átmérőjű) laterálisan egymáshoz képest egy 234 aminosav hosszú eltolással szerveződnek, melynek eredménye a 67 nm-es periodicitás. Ebben a struktúrában a molekulák közötti elektrosztatikus és hidrofób kölcsönhatások kialakulása optimális, és kovalens keresztkötések alakulhatnak ki a helikális és a szomszédos non-helikális régiók lizinjei/hidroxilizinjei között. A keresztkötések kialakulásához először a lizinoxidáz aldehiddé oxidálja egy non-helikális lizin aminocsoportját, majd az új aldehid Schiff-bázist képez egy szomszédos monomer helikális lizin/hidroxilizin -aminocsoportjával. Ezek az ún. kétpontos keresztkötések közeli lizinnel/hidroxilizinnel, vagy hisztidinnel kondenzálódnak, így hárompontos kereszthidak jönnek létre. Fibrilláris kollagének tipikusan olyan szövetekben találhatóak, amelyeknél fontos a nyírással, húzással, nyomással szembeni ellenállóképesség, így pl. az ínakban, csontokban, porcokban, bőrben. Néhány kollagén típus (IV, VIII, X) hálózatos szerkezetbe szerveződik, ilyen pl. a bazálmembrán is, amely döntően IV. típusú kollagénből áll. Más kollagének a rostok felszínéhez kötődve szövetspecifikus módon befolyásolják a rostok szupramolekuláris szerkezetét (Fibril Associated Collagens with Interrupted Triple Helix-FACIT- pl. IX, XII, XIV típusok). A VI típusú kollagén gyöngyszerű struktúrát képez, a VIII. típusú pedig hexagonális hálózatot (lsd. a cornea Descemet membránja).

1.Ábra A kollagén molekula szerkezete

2

2.Ábra A kollagén rostok szupramolekuláris szerveződése A proteoglikánok A proteoglikánok szintézisekor az ER-ban egy glikoziltranszferáz enzim egy core fehérjére rak egy glukózaminoglikán (GAG) láncot, mely további módosulásokon megy át a Golgi-ban. A GAG láncok ismétlődő diszacharid egységekből állnak. A chondroitinszulfátokban a (beta1-3)glükuronsav -N-acetil-glukózamin egység aminocukor része vagy a C4 (chondroitin-szulfát A) vagy a C6 (chondroitin-szulfát C) atomon szulfatált. A dermatan-szulfátban (chondroitin-szulfát B) legalább egy iduronsav van, amely a glükuronsav posztszintetikus epimerizációjával keletkezik. A heparan-szulfátban a (beta1-4)glükuronsav-N-acetil-glukózamin diszacharid ismétlődik, amelyben egyes glükuronsavak iduronsavakká epimerizálódnak, ill. mindkét cukor szulfatált is lehet. A keratán-szulfátban (beta1-4)galaktóz-N-acetil-glukózamin ismétlődik. A hialuronsav (beta1-3)glükuronsav-N-acetil-glukózamin egységeket tartalmaz, melyek nem szulfatáltak, és ez az egyetlen GAG, amely nem kapcsolódik core fehérjéhez, hanem rendkívül hosszú, szabad GAG láncok formájában található, melyek mérete a 10 000 kDa-t is elérheti. A hialuronsav aggregátumokat és hálózatokat alkot, és gyakran képez ko-aggregátumokat a proteoglikánokkal. A GAG láncok szulfatáltsága még ugyanazon a GAG láncon belül is változó lehet, továbbá ugyanaz a core fehérje különböző számú, fajta, ill. hosszúságú GAG láncokat hordozhat, így a proteoglikánok rendkívül változatos, színes világot alkotnak. A proteoglikánok tér-kitöltő szerepet játszanak az ECM-ban: a cukorsavaknak és a szulfatáltságuknak köszönhetően erősen negatív töltésűek, és erősen hidratált, gélszerű anyagot képeznek. Ez az anyag felelős az ECM térfogatáért, és egyben az összenyomással szemben igen ellenálló. Szerkezeti szerepük mellett a proteoglikánok modulálják a sejt-sejt, és sejt-mátrix kölcsönhatásokat, és szabályozzák a sejtek motilitását, proliferációját, differenciálódását. Lokalizációjuk alapján megkülönböztetjük a mátrix proteoglikánokat (pl. aggrecan a porcban, perlecan a bazálmembránban, versican az érfalban, vagy a decorin/biglycan/fibromodulin csoport, mely többféle szövetben is megtalálható), és a membrán-asszociált proteoglikánokat (pl. a syndecanok és glypicanok, CD44, thrombomodulin). Az adhezív glikoproteinek 3

Az adhezív glikoproteinek kötik össze a sejteket a mátrix struktúrával, többségük valamely sejtadhéziós receptor ligandja, és a sejtek viselkedését is befolyásolják. A mátrix szerkezeti komponenseihez is tudnak kötődni, így modulálhatják a mátrix struktúráját, és fontos szerepet játszanak a sejtek és szerkezeti elemek összerendezésében is. A Sejtadhézió c. szemináriumi anyagból már ismert fibronektin és laminin mellett ide tartozik a nidogen, tenascin, thrombospondin, osteopontin is.

3.Ábra Néhány extracelluláris mátrix fehérje relatív mérete (core fehérje-zöld, cukorlila). A bazálmembrán (lamina basalis) szerkezete A bazálmembrán egy vékony (40-120 nm vastag), hajlékony, ECM molekulákból álló lemez, amely egyrészt epithelialis rétegek alatt található, másrészt körbevon egyes nonepithelialis sejteket, így pl. izomsejteket, zsírsejteket, Schwann sejteket. Szerepe, hogy elválasztja ezeket a sejteket a szomszédos kötőszövettől, de egyben mechanikus összeköttetést is biztosít közöttük. Az epidermolysis bullosa, egy hólyagos, néha halálos bőrbetegség alapja egy bazálmembrán komponens genetikai defektusa, melynek következtében a bőr epidermis rétege nem tökéletesen horgonyzódik az alatta lévő dermis réteghez. Struktúrális funkciója mellett a bazálmembrán komponensei befolyásolják a kapcsolódó sejtek funkcióit, továbbá a sejtek migrációs útvonalait is kijelölik. A többi ECM megjelenési formához hasonlóan a bazálmembrán is tartalmaz rostos fehérjéket (IV. típusú kollagén), adhezív glikoproteineket (lamininek, nidogen), és proteoglikánokat (perlecan - heparán-szulfát GAG láncokkal). A laminin-1 egy nagy, hajlékony fehérje, három polipeptidláncból áll (alfa, béta, és gamma), melyeket diszulfid hidak tartanak össze. Úgy néz ki, mint egy 3 virágból álló csokor, ahol a virágszárakat egymással összefonták, a virágfejek pedig szabadon állnak. Ezek a heterotrimerek egy hálózatot hoznak létre, melyben egyrészt a szomszédos fejek kötődnek egymáshoz, másrészt pedig a szárak a molekulát termelő sejtekhez horgonyozzák a képződő hálózatos lemezt. A laminin sejtekhez történő horgonyzásában főként integrin receptorok vesznek részt, ill. egy további fontos receptor a dystroglycan, egy proteoglikán transzmembrán core fehérjével, és extracelluláris GAG lánccal. Feltehetően ez a laminin hálózat koordinálja a többi bazálmembrán komponens beépülését, hiszen a laminin több kötőhellyel is rendelkezik nidogenre és perlecanra. A IV. típusú kollagén, más kollagénekhez hasonlóan, egy három polipeptidláncból álló szuperhélix, de a triplahelikális szerkezet több, mint 20 helyen megszakított, mely lehetővé teszi a molekula többszörös meghajlását. A IV. típusú kollagén a nidogenhez is, 4

és a perlecanhoz is tud kötődni, így ezen molekulákon át kapcsolódhat a kollagén a lamininhálóhoz. A bazálmembrán változatos szerepet tölt be a szervekben, pl. molekulaszűrő a vese glomerulusokban, a neuromuszkuláris junkció szervezője, és látni fogjuk később, milyen szerepet játszik a tumor metasztázis képzésben.

4.Ábra A laminin szerkezete

5.Ábra A bazálmembrán összeépülése

5

2. Az ECM átalakulása: mátrix metalloproteinázok (MMP-k) és inhibitoraik (tissue inhibitors of matrix metalloproteinases, azaz a TIMP-ek) A mátrix metalloproteinázok családjába Zn-dependens endopeptidázok tartoznak, több, mint 21 humán MMP-vel. Domén-szerkezetük alapján 8 csoportot különböztetnek meg, ebből 3 membránhoz kötött enzimeket tartalmaz (lsd. 2. Ábra az ajánlott összefoglaló cikkben). Az MMP-k együttesen szinte az egész ECM-ot le tudják bontani, beleértve a kollagéneket (kollagenázok), denaturált vagy részlegesen degradált kollagéneket (zselatinázok), laminineket, de szubsztrátjaik között vannak sejtadhéziós molekulák, növekedési faktor receptorok is, így még a sejtek működését is befolyásolni tudják.

6. Ábra Az MMP-k harmadlagos szerkezete (a katalitikus centrumban lévő Zn sárga) Az MMP-k inaktív zimogén formában szintetizálódnak: a propeptid domén egy Cys oldallánca kötődik az aktív centrumban lévő Zn-hez, és így megakadályozza az enzim működését. Az aktiváció során megszűnik a Cys-Zn kölcsönhatás, és a propeptid rész proteolitikus eltávolításra kerül. Az aktiváció két lépésben történik: az 1. lépésben megszűnik a Cys-Zn kölcsönhatás vagy egy konformációváltozás miatt (ez egyes higanyvegyületekkel, pl. az APMA-val (amino phenyl mercuric acid) indukálható), vagy 6

pedig szerin-proteázzal (pl. plazmin, furin) történő hasítás miatt. A 2. lépésben lehasad a propeptid (vagy autokatalitikusan, vagy egy másik MMP hatására) és kialakul az aktív enzim.

7.Ábra A mátrix metalloproteinázok aktivációja Az MMP-k aktivitását endogén inhibitorok szabályozzák, pl. a TIMP-ek (tissue inhibitors of metalloproteinases ), a plazma alfa-2-makroglobulin, és a membránhoz kötődő RECK (reversion-inducing cystein-rich protein with kazal motifs). Az alfa-2-makroglobulin magas koncentrációban kering a plazmában, az MMP-vel enzim-inhibitor komplexet képez, amelyet a makrofágok receptor-mediált endocitózissal vesznek fel. A TIMP-ek reverzibilis komplexet képeznek az MMP-kkel (1:1 arányban), a katalitikus Zn-ken keresztül. Meglepő módon a két fehérje közötti kölcsönhatásban a TIMP részéről főként csak az 5 N-terminális aminosav vesz részt, ezek szubsztrátot imitálva kötődnek az MMP aktív centrumához. A TIMP-ek C-terminális doménjének köszönhető az inhibitorok részleges specificitása: a TIMP-1 erősebben kötődik az MMP-9-hez, mint az MMP-2höz, a TIMP-2-nél viszont ez fordítva van. A TIMP-2 nem csak egy reverzibilis MMP inhibitor, hanem kofaktor szerepet játszik a proMMP-2 aktivációjában is (további részletek erről: 4.Ábra az összefoglaló cikkben, ill. a pericelluláris proMMP-2 aktiváció leírásában) 7

Az MMP-k aktivitása a gén expressziójuk szintjén is szabályozott: növekedési faktorok, citokinek, sejt-mátrix vagy sejt-sejt kölcsönhatások indukálhatják, de pl. TGFbeta vagy glukokortikoidok represszálhatják az enzimeket.

3. A mátrix metalloproteinázok szerepe a tumor metasztázis képzésben A tumor sejtek inváziójában feltehetően fontos szerepet játszanak az MMP-k, mivel degradálni tudják a sejteket körülvevő ECM állományát. Ehhez a funkcióhoz a tumorinvázió frontvonalán célszerű elhelyezkedniük. Az MT1-MMP volt az első membránhoz horgonyzott MMP, amelyről kimutatták, hogy fontos szerepet játszik a tumor sejtek körüli ECM lebontásában, az ún. pericelluláris proteolízisben. A szolubilis MMP-kétől eltérően, az MT1-MMP aktivációja már sejten belül, a trans-Golgiban bekövetkezik, furin (egy szerin-proteáz) hatására, így aktív enzimként (kollagenáz) éri el a sejtfelszínt. Az MT1-MMP mellett két kollagenáz, az MMP-2 és az MMP-9 szerepét is kimutatták. Az MMP-2 és az MMP-9 szolubilis enzimek, melyeket a tumor sejteket körülvevő stromában lévő fibroblasztok termelnek. A tumor sejtek MT1-MMP expressziója teszi lehetővé ezen enzimek sejtfelszíni kötődését és aktivációját, melynek eredménye a sejtfelszíni kollagenáz aktivitás. Az MMP-k azonban nem csak azzal segítik elő a tumor sejtek invázióját, hogy utat nyitnak előttük az ECM-ban. Az MT1-MMP a tumor sejtek migrációs képességét is fokozza, pl. sejtadhéziós receptorokat módosít (pl. CD44, egy hialuronsav receptor, ill. syndecan-1, egy transzmembrán proteoglikán), és hasítja a bazálmembránban lévő laminin-5-öt, mely hasítását követően fokozza a sejtek migrációját. A tumor növekedéséhez megfelelő vérellátás is kell, ezt az angiogenezis biztosítja. Angiogenezis során az endothel sejteknek először el kell válniuk a szomszédos sejtektől, és a tumort körülvevő stromába kell behatolniuk, proliferálniuk és hengeres struktúrákat (leendő új ereket) létrehozniuk. Ezekhez a lépésekhez a bazálmembránt és a stróma kollagénjeit is degradálni kell. Számos MMP-ről kimutatták, hogy hozzájárulhat az angiogenezis folyamatához, de knock out állatkísérletekben csak az MT1-MMP-hiányos egerekben maradt el az új erek képződése. Angiogenesis is the formation of new vessels from existing vessels and is required for an adequate blood supply in tumor growth. During this process endothelial cells need to detach from neighbouring cells, invade into the surrounding stroma, proliferate and generate a tube structure. These steps include the degradation of the basal lamina, and the collagen-rich stroma. Az MT1-MMP fokozza a tumor sejtek VEGF expresszióját is, mely az angiogenezishez szükséges növekedési faktor. Angiogenezis-rövid összefoglaló Angiogenezisnek nevezzük azt a folyamatot, amikor az erek növekedésükkel és elágazódásaikkal behálózzák a testet. Az embrionális fejlődés során kialakuló első érkezdemények létrejötte a vaszkulogenezis. Végülis a szövetek megfelelő vérellátásához a sejtek max. 50-100 m távol lehetnek a legközelebbi kapilláristól. Az érhálózat fejlesztése és újraképzése nem csak az embrionális fejlődés és a test növekedése miatt fontos, hanem pl. a szöveti regenerációhoz, ill. a tumorok növekedéséhez is szükséges. Az angiogenezis a következő lépésekből áll: 1, kijelölődik egy endothel sejt, amely majd az új érelágazást indítja, 2, ez az endothel sejt nyúlványokat képez és belenő a környező kötőszövetbe, 3, további endothel sejtek követik a vezető sejtet és üreget formálva kialakítják az ér lumenét, 4, az újonnan létrejött ér stabilizálásához simaizomsejtek, 8

fibroblasztok érkeznek, és extracelluláris mátrix komponensek termelésével kialakítják az ér falát. A folyamat szabályozása rendkívül bonyolult, de az egyik fő szabályozó a VEGF (vascular endothelial growth factor). A VEGF a PDGF (platelet-derived growth factor) rokona, fő célsejtje az endothel sejt. A VEGF receptorok a receptor-tirozin-kinázok családjába tartoznak, aktiválják a MAP-kináz útvonalat és a PI3K/Protein kináz B útvonalat. VEGF hatására az endothel sejtek proliferálnak, és megnő az MMP-k és szerin-proteázok termelődése is, melyek a környező ECM lebontásával elősegítik az erek növekedését. Az új érágat indító vezető endothel sejt érzékeli a VEGF koncentráció gradienst, és annak megfelelően irányítja az újonnan fejlődő eret, hogy elérje azt a helyet, mely VEGF-szekréciójával az angiogenezis iránti igényt jelezte. NO-mediált vazodilatáció és fokozott érpermeabilitás hatására kiszűrődik egy elsődleges mátrix állomány az új érág köré, és az endothel sejtek integrin-receptoraik segítségével ezen mátrix komponensek mentén vándorolnak. VEGF jelenlétében az angiopoetinek is elősegítik az új érágak képződését. Az új erek érése során végül kialakul az adott helyre és értípusra jellemző érfalstruktúra (pl. kapilláris, arteriola, artéria, véna, nyirokér). Ehhez az éréshez a VEGF-fel stimulált endothel sejtek PDGF-t termelnek, mely a helyszínre vonzza az érfal sejtjeit, és elősegíti proliferációjukat. Az endothel sejtek és az érfalsejtek által termelt angiopoetinek pedig szerepet játszanak az endothel sejt-érfalsejt kölcsönhatásokban ill. az endothel sejt- ECM kapcsolódásokban. TGF hatására az endothel sejtek és érfalsejtek ECM komponenseket és proteázokat termelnek, és a TGFb elősegíti az érfalsejtek differenciálódását is. Az erek túlzott burjánzását angiogenezis inhibitorok akadályozzák meg. Ilyen inhibitorok pl. az angiostatin, a plazminogén egy darabja, és az endostatin, a XVIII. típusú kollagén egy darabja is. Az angiogenezist kiváltó tényezők közül az egyik legjobban tanulmányozott példa a hipoxia, és a HIF-1 (hypoxia-inducible factor-1) szerepe. A HIF-1 egy alfa-béta heterodimer, a béta alegység egy folyamatosan termelődő magi fehérje, a HIF-1alfa pedig oxigén hiányában indukálódik. A HIF-1 alfa/bétát először az eritropoetin transzkripcióját fokozó DNS-kötő fehérjeként írták le, majd később kiderült, hogy sok sejtben oxigénszenzorként működik. Kellően oxigenált sejtekben a HIF-1alfa szintje alacsony, mert folyamatosan degradálódik. A degradáció fenntartásához egy dioxigenáz hidroxilálja a HIF-1alfát, 2 Pro és egy Asn oldalláncon. A Pro-hidroxiláció következménye, hogy a von Hippel-Lindau (VHL) E3 ubiquitin ligáz komplex felismeri, és proteaszomális degradációra küldi a fehérjét. Az Asn hidroxilációja pedig megakadályozza a HIF-1alfa kötődését a transzkripciós ko-aktivátor, p300 fehérjéhez (egy hiszton acetiláz). Oxigén jelenlétében tehát ez a kettős mechanizmus (proteolitikus lebomlás, ill. a transzkripciós hatás gátlása) gátolja az angiogenezishez szükséges faktorok (pl. VEGF) HIF-dependens transzkripcióját. A HIF-útvonalnak az angiogenezis szabályozásában betöltött fontos szerepét jól jelzi egy betegség, a Hippel Lindau szindróma. Az érintett betegekben a VHL gén mutációja miatt a HIF-1alfa szintje oxigén jelenlétében is magas marad, és ez érdaganatok, hemangioblasztomák kialakulásához vezet. Tumorokban a VEGF mRNA megnövekedett szintjét (tumor sejtekben és stroma sejtekben is), és fokozott angiogenezist mutattak ki. A kialakuló érhálózat struktúrája azonban jellegzetesen kóros: egyenetlen érfalvastagság, lyukas endothel sejtréteg, és az endothel sejt markerek ill. adhéziós receptorok kóros expressziója jellemző. Ezeket az elváltozásokat a pro-, és anti-angiogenetikus faktorok megbomlott egyensúlyának 9

tulajdonítják. Az angiogenezis gátlásával a tumorok növekedése és metasztázis képzése gátolható, pl. VEGF funkciót gátló szerekkel a hagyományos sugár-, és kemoterápiák hatékonysága növelhető.

4.Sebgyógyulás és szöveti regeneráció Szöveti károsodást sokféle akut és krónikus behatás okozhat, ez lehet mechanikus sérülés, fertőzés, anyagcserebetegség, vagy éppen egy autoimmun betegség. A sérülés helyreállítása két fő lépésben történik: 1, a regeneratív fázisban a sérült sejteket lehetőség szerint ugyanolyan típusú sejtek pótolják, majd a 2, fázisban kötőszövet termelődik, lehetőleg úgy, hogy a szerv eredeti struktúrája-funkciója helyreállhasson. A folyamat elszabadulása esetén az ECM struktúra kóros lesz, maradandó hegesedés jöhet létre, ill. a károsodott parenchymális sejtek helyét is fibrotikus kötőszövet foglalja el (pl. máj fibrózis). A kóros ECM struktúra a szerv funkcióját is károsítja, és ez akár halálos következményekkel is járhat (pl. máj cirrhosis, tüdőfibrózis). A szöveti károsodások aktiválják a véralvadási rendszert, így a trombociták aggregációjához és fibrin lerakódáshoz vezetnek. Az aktivált trombociták kemokineket és növekedési faktorokat szekretálnak, ilyenek a PDGF (platelet-derived growth factor) és a TGF (tumor growth factor-beta). A kemokinek hatására leukociták érkeznek a helyszínre a keringésből és aktiválódnak. A neutrofilok (ők érkeznek legelőször) és a makrofágok (ők 1-2 nap múlva érkeznek) eliminálják a szöveti törmeléket, elhalt sejteket, kórokozókat. Az aktivált leukociták profibrotikus citokineket termelnek, ilyenek pl. az IL-13 és a TGF, melyek további makrofág és fibroblaszt aktivációhoz vezetnek. Az aktivált fibroblasztok miofibroblasztokká alakulnak át, ennek szövettani markere egy aktin izoforma, az -SMC (alpha-smooth muscle cell actin) expressziója. A miofibroblasztok egyesítik a simaizom sejtek kontraktilis tulajdonságait és a fibroblasztok ECM termelő képességét, így fibrilláris kollagéneket is termelnek. Molekuláris szinten a TGF (transforming growth factor ) az egyik legfontosabb citokin a szöveti regenerációban, ugyanakkor túlműködésére vezetik vissza az olykor szervkárosodáshoz is vezető túlzott hegesedést, fibrózist. A TGF egy 12 kDa molekulatömegű polipeptid dimerje, és azon citokinek közé tartozik, amelyek az embrionális fejlődést, sejt differenciálódást, szöveti regenerációt szabályozzák. A trombociták nagy mennyiségű TGF-t tartalmaznak, és ezt degranulációjuk során ki is eresztik. A TGF kemoattraktáns a leukocitákra nézve, angiogenetikus, és számos más citokin és gyulladásos mediátor termelődését befolyásolja. Két olyan tulajdonsága is van, amelyek miatt a TGF talán könnyen túlzott hegesedéshez, fibrózishoz vezethet: 1, a miofibroblasztok TGF termelését önmaga a TGF is indukálja – autoindukció, 2, TGF hatására az ECM szinte valamennyi komponensének termelődése indukálódik, miközben a mátrix degradációt gátolja (fokozott TIMP, csökkent MMP gén expresszió). Egyes esetekben sikerült a fibrotikus reakciót visszafogni olyan anti-TGF antitestekkel, amelyek a citokin receptorhoz való kötődését blokkolják, ami szintén jelzi a TGF fibrózisban játszott szerepét. A sebgyógyulás ill. szöveti regeneráció fogalma magában foglalja az ECM struktúra helyreállítását is. Ez nem egy egyszerű feladat, ha arra gondolunk, hogy az ECM komponensek által felépített és a parenchymás sejtekhez horgonyzott hálózatos szerkezet állandó mechanikus erőhatások alatt áll. A szövetekben fennálló mechanikai feszültség 10

legkézenfekvőbb jele az, hogy az erek vagy idegek a testből kiemelve összeugranak, és in situ hosszukhoz képest kb. 25-30 %-kal rövidebbek lesznek. Az ECM így rugalmas védőpajzsként védi a parenchymás sejteket, ill. egyes szövetekben a rugalmasság a funkció előfeltétele is (pl. tüdő). A sebgyógyulás során tehát nem csak az ECM komponenseit kell újratermelni, hanem ezt a mechanikai feszültség alatt álló struktúrát is ki kell alakítani. Ez a folyamat a mechano-reguláció, amely sokféle molekuláris és sejtes komponens összjátékát igényli, fontos szerepet játszik az előbb már említett TGF és PDGF, és az ezek hatására differenciálódott miofibroblasztok. A miofibroblasztok nagy mennyiségben expresszálják az -SMC aktin kontraktilis fehérjét, így a miofibroblasztok kontraktilis tulajdonságaikkal fontos szerepet töltenek be az ECM struktúra kialakításában. Ezt a foszforilációt két kináz katalizálhatja: a Ca-dependens MLC kináz (MLCK) és a Rho-kináz (RhoA kis G-fehérje-aktiválta kináz). Az intracelluláris Cakoncentráció emelkedésének hatására az MLCK gyorsan foszforilálja az MLC-t, de a kontrakció gyorsan meg is szűnik, mert a miozin foszfatáz is gyorsan defoszforilálja a miozint. Ezzel szemben az MLC rosszabb szubsztrátja a Rho-kináznak, viszont a Rhokináz a miozin foszfatázt is foszforilálja, ami gátolja a miozin defoszforilációját, és így lassabban alakul ki a kontrakció, viszont tartósabban fennáll. A Rho-kináz aktivációjának mechanizmusa ill. a kontrakció erősségének beállítási módja pontosan nem ismert, de a Rho-kináz-mediált kontrakció alkalmas az újonnan keletkező ECM-ben az izometriás feszültség fenntartására. A miofiobroblasztok transzmembrán adhéziós komplexeket tartalmaznak, amelyek összeköttetést teremtenek az extracelluláris kollagén rostok és az intracelluláris aktin filamentumok között, így a sejtek kontrakciójuk során a kezdetben laza kollagénhálózatot összehúzzák (Fig. 8b, “B” miofibroblaszt). Az eredeti kollagén mátrix ezen deformációja miatt mechanikai feszültség ébred, amelyet a miofibroblasztok által termelt MMP-k (MMP-1, 2, 3, 9) oldanak fel. Az MMP-1 eltávolítja a külső kollagénréteget, és szubsztrátspecificitásuknak megfelelően az MMP-2 és 9 bontja a már részben degradált kollagén rostokat. Ezt követően egy újonnan termelt kollagénrost már az összehúzódást követő állapotban tudja keresztkötéseivel összekötni és rögzíteni a megmaradt kollagén darabokat, és így lehetővé válik a kollagén szerkezet mechanikai feszültség alatti kialakulása (Fig. 8c). A miofibroblasztok relaxációját követően újra indulhat ez a ciklus, és sok ciklus után végül a szövet eredeti mechanikai tulajdonságaival együtt kerül helyreállításra. A folyamat lezárásaként a miofibroblasztok apoptózisra kerülnek. Amennyiben a miofibroblasztok apoptózisa elmarad, hipertrófiás hegszövet jön létre, melyre a miofibroblasztok nagy száma és a fibrotikus ECM állomány jellemző. Ez a struktúra a szövetek normál működését is megzavarja, erre példák a hegesedés következtében kialakuló kontraktúrák pl. műtétek után, vagy a Dupuytren kontraktúra, amikor a palmaris fascia hegesedése következtében a beteg nem képes egyes ujjait mozgatni. A kóros szöveti regeneráció fibrózissal járó formája belső szervek betegségeiben is előfordulhat, amely akár halálos szervkárosodáshoz is vezethet. Ilyen pl. a májfibrózis, a tüdőfibrózis, renális fibrózis, vagy a beszűkült koszorúerek ballon angioplasztikával való tágítását követő újraelzáródás (resztenózis).

11

8. Ábra Mechanoreguláció sebgyógyulás során.

12

Megbeszélésre javasolt témák: További, a szemináriumi anyaggal kapcsolatos szemléltető ábrákat találhatnak a honlapról, védett oldalakról letölthető Extracellular matrix PowerPoint file-ban is. 1, Az extracelluláris mátrix komponenseinek összefoglalása. Használják korábbi anatómiai, biokémiai ismereteiket is, és kövessék az itt leírtak vázlatát. 2, A mátrix metalloproteinázok családja: szerkezet, funkció, aktiváció mechanizmusa, inhibitorok. Javasolt további irodalom: 2.1 Brinckerhoff CE, Matrisian LM. Matrix metalloproteinases: a tail of a frog that became a prince. Nature Rev Mol Cell Biol 2002, 3:207-214 (Figs 2, 4) 2.2 Nagase H, Woessner JF Jr. Matrix metalloproteinases. J Biol Chem 1999, 274:2149121494. 3, Az MMP-k szerepe a tumor metasztázisban. Választási lehetőség: összefoglalás a 3.1 cikk alapján, vagy eredeti közleményekből (3.2-3.4) válogatott kísérleti ábrák megbeszélése, és az eredmények összegzése a 3.1 cikk 1.Ábrája alapján. 3.1 Összefoglaló cikk: Itoh Y, Seiki M. MT1-MMP: A potent modifier of pericellular microenvironment. J Cell Physiol 2006, 206:1-8 1. és 2. Ábra. 3.2 A proMMP2 aktivációja: Will H, Atkinson SJ, Butler GS, Smith B, Murphy G. The soluble catalytic domain of membrane type 1 matrix metalloproteinase cleaves the propeptide of progelatinase A and initiates autoproteolytic activation. J Biol Chem 1996, 271: 17119-17123. A 2. és 3. ábrán kinetikus és elektroforetikus kísérleteket láthatunk a proMMP2 MT1MMP-vel történő aktivációjáról, ill. a TIMP-2-vel való gátlásáról. 3.3 Az MMP-k fokozzák a sejtek migrációját: Gianelli G, Falk-Marzillier J, Schiraldi O, Stetler-Stevenson WG, Quaranta V. Induction of cell migration by matrix metalloproteinase-2 cleavage of laminin-5. Science 1997, 277:225-228 Összefoglalás: A sejtek ECM határokon történő átvándorlása számos folyamathoz szükséges, ilyen pl. a szöveti regeneráció és a tumor metasztázis képzés is. A laminin-5 egy bazálmembránokban található fehérje. A sejtek integrin receptorok segítségével kötődnek és vándorolnak az ECM molekulák mentén, és már kimutatták, hogy a laminin-5-integrin receptor kapcsolat fontos az epiteliális sejtek bazálmembránhoz való rögzülésében. A cikkben egy kísérleti modellben tanulmányozzák az epiteliális sejtek migrációját: a felső kamrába helyezett sejtek a felső és alsó kamrát elválasztó filteren vándorolhatnak 13

keresztül. A filtert különböző ECM komponensekkel borítják, proteázzal kezelhetik, a felső kamrában lévő pufferba is tehetnek moduláló anyagokat, stb., és adott idő után megszámolják, hány sejt jutott át a filter alsó felszínére. A kísérletek eredményei szerint az epitheliális sejtek filteren való átvándorlását a laminin-5 MMP-2-vel való emésztése specifikusan fokozta. Laminin-5 más proteázzal (MMP-9, plazmin)való emésztése ill. más bazálmembrán komponensek (IV. típusú kollagén, laminin-1, fibronektin) nem segítették elő a migrációt. Monoklonális antitestek használatával megállapították, hogy a migrációhoz egy laminin receptor, az a3b1 integrin szükséges. A laminin-5 MMP-2-vel történő emésztése egy új epitop megjelenéséhez vezet az alfa3 alegységen, mely nem szükséges magához az adhézióhoz, hanem a sejt motilitásának fokozódásához vezet. Különböző állati szövetminták vizsgálata arra utal, hogy ez az epitop olyan helyeken detektálható, ahol az ECM átépülése zajlik (pl. terhes patkány emlője, egér karcinoma), és nem detektálható stabil szövetekben (pl. patkány nyelv, vagy szexuálisan még éretlen patkány emlője). 3.4 Az MMP-k degradálják az ECM komponenseket: Sok MMP-ről közöltek eredményeket arra vonatkozólag, hogy mely ECM komponenseket tudják lebontani, itt egy cikkből láthatunk néhány kísérletet, illusztrációként. Ohuci E, Imai K, Fujii Y, Sato H, Seiki M, Okada Y. Membrane type 1 matrix metalloproteinase digests interstitial collagens and other extracellular matrix macromolecules. J Biol Chem 1997, 272: 2446-2451. A 4. és 5. Ábrákon SDS-gélelektroforézissel demonstrálják az MT1-MMP hatását különböző ECM fehérjékre (I, II, és III típusú kollagén, I.típusú zselatin, fibronektin, vitronektin, laminin-1). A 6.Ábrán látható az MT1-MMP és MMP2 szinergizmusa a fibrilláris kollagének hasításában. A kinetikai paramétereket az I.Táblázat foglalja össze. 4, A sebgyógyulás és a TGF. Javasolt cikkek, ábrák: 4.1 Wynn TA. Common and unique mechanisms regulate fibrosis in various fibroproliferative diseases. J Clin Invest 2007, 117:524-529. Figure 1. 4.2 Border WA, Ruoshlati E. Transforming growth factor- in disease: the dark side of tissue repair. J Clin Invest 1992, 90:1-7. Figure 2. Egyik klinikai vonatkozása a kóros szöveti regenerációnak a máj fibrózis: 4.3 Iredale JP. Cirrhosis: new research provides a basis for rational and targeted treatments. Br Med J 2003, 327:143-147. 4.4 Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury. J Biol Chem 2000, 275: 2247-2250

14