EVALUASI STABILITAS AKTIVITAS ENZIM SELULASE CAIRAN RUMEN DOMBA
DINA SRI WARDHANI
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
ABSTRAK DINA SRI WARDHANI. Evaluasi Stabilitas Aktivitas Enzim Selulase Cairan Rumen Domba. Dibimbing oleh SRI SUGIARTI dan WAHYU PAMUNGKAS SOENGKAWATI. Sektor perikanan di Indonesia yang terus berkembang membutuhkan solusi dalam penanganan bahan pakan.Upaya yang telah dilakukan adalah pemanfaatan cairan rumen untuk menurunkan kandungan serat kasar bahan pakan. Penelitian sebelumnyamenunjukkan bahwa di dalam cairan rumen domba terdapat aktivitas beberapa enzim. Nilai aktivitas enzim dari yang terbesar berturut-turut adalah enzim selulase (0.31 ± 0.015), amilase (0.14 ± 0.016), protease (0.11 ± 0.016) dan lipase (0.03 ± 0.011) IU/mL. Adanya aktivitas enzim selulase akan mendegradasi serat yang sulit dicerna menjadi mudah dicernaoleh ikan.Kondisi pH optimum dan stabilitas waktu penyimpanan harus diketahui untuk mengefisienkan pemakaian cairan rumen dalam mendegradasi serat dalam bahan pakan. Penelitian dilakukan pada suhu inkubasi 30 °C dengan pH 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, dan 9.0 serta waktu penyimpanan 1, 2, 3, dan 4 minggu. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas enzim selulase cairan rumen domba optimum pada pH 8.0, yaitu sebesar 0.00419 IU/mL. Stabilitas aktivitas enzim diperoleh pada pH 8.0 dengan waktu penyimpanan selama 4 minggu.
ABSTRACT DINA SRI WARDHANI.Stability Evaluation of Cellulase Enzyme Activity from Sheep Rumen Fluid. Supervised by SRI SUGIARTI and WAHYU PAMUNGKAS SOENGKAWATI. Developing Indonesian fishery sector needs solution in handling feed ingredients. An effort that has been carried out is the use of rumen fluid to lower crude fiber content of feed ingredients. Previous reasearch showed activities of several enzymes in sheep rumen fluid. The enzyme activity values were cellulase (0.015 ± 0.31), amylase (0.14 ± 0.016), protease (0.11 ± 0.016), and lipase (0.03 ± 0.011) IU/mL, respectively. The cellulase enzyme activity will degrade fibers which are difficult to digest to become easily digested by the fish. Optimum pH and storage time has to be known to make efficient the use of rumen fluid to degrade fibers in feed ingredients.The study was conducted at incubation temperature of 30 °C with the pH of 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, and 9.0 as well as the storage time of 1, 2, 3, and 4 weeks. The results showed that the cellulase enzyme activity of sheep rumen fluid was optimum at pH 8.0, that is 0.00149 IU/mL. Stability of the enzyme activity was obtained at pH 8.0 with storage time for 4 weeks.
EVALUASI STABILITAS AKTIVITAS ENZIM SELULASE CAIRAN RUMEN DOMBA
DINA SRI WARDHANI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
Judul Skripsi : Evaluasi Stabilitas Aktivitas Enzim Selulase Cairan Rumen Domba Nama : Dina Sri Wardhani NIM : G44086010
Disetujui
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr Sri Sugiarti NIP 19701225 199512 2 001
Wahyu Pamungkas S, SPi, MSi NIP 19731106 199903 2 001
Diketahui Ketua Departemen Kimia,
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS NIP 19501227 197603 2 002
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis haturkan kepada Allah SWT atas segala berkat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya ilmiah ini disusun berdasarkan penelitian yang berjudul Evaluasi Stabilitas Aktivitas Enzim Selulase Cairan Rumen Domba sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana sains pada Departemen Kimia FMIPA IPB. Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei sampai dengan Juni 2011 di Laboratorium Balai Penelitian Pemuliaan Ikan (BPPI) dan Laboratorium Pusat Antar Universitas (PAU) Institut Pertanian Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr Sri Sugiarti selaku pembimbing pertama dan Wahyu Pamungkas Soengkawati, SPi, MSi selaku pembimbing kedua yang telah memberikan arahan, saran, dan dorongan selama pelaksanaan penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Dr Imron, SPi, MSi sebagai Kepala Balai Penelitian Pemuliaan Ikan yang telah memberikan kesempatan kepada penulis melaksanakan izin belajar di Institut Pertanian Bogor dan melakukan penelitian di Laboratorium BPPI serta ucapan terima kasih kepada rekan kerja di Laboratorium BPPI. Ungkapan terima kasih penulis berikan kepada keluarga tercinta, Bapak, Ibu, kakak-kakakku, dan kekasihku yang selalu memberikan semangat, cinta, kasih sayang, dan doa. Ungkapan terima kasih juga kepada teman-teman seangkatan Ekstensi Kimia 2008 atas semangat dan dukungannya. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi ilmu pengetahuan.
Bogor, September 2012
Dina Sri Wardhani
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Sukabumi pada tanggal 13 Pebruari 1982 dari pasangan Idik Supendi dan Yetti Royeti. Penulis merupakan anak terakhir dari empat bersaudara. Tahun 2000 penulis lulus dari SMU Negeri I Sukabumi, kemudian melanjutkan pendidikan di Akademi Kimia Analisis Bogor sampai pada tahun 2004. Tahun 2004 sampai dengan Maret 2006 penulis bekerja di PT. Global Mukti Dimensi Jakarta sebagai staf marketing. Pada April 2006 sampai sekarang penulis bekerja sebagai staf teknisi laboratorium di Balai Penelitian Pemuliaan Ikan Sukamandi, Subang.
DAFTAR ISI Halaman
DAFTAR GAMBAR ..........................................................................................vii DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................vii PENDAHULUAN ..............................................................................................1 BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ........................................................................................1 Ekstraksi Cairan Rumen Domba .............................................................1 Pengaruh pH dan Lama Penyimpanan terhadap Stabilitas Enzim Selulase ...................................................................................................2 Analisis Aktivitas Enzim Selulase ..........................................................2 HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim Selulase....................................2 Stabilitas Aktivitas Enzim Selulase Berdasarkan pH dan lama penyimpanan ..................................................................................3 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan..................................................................................................4 Saran ........................................................................................................4 DAFTAR PUSTAKA .........................................................................................4 LAMPIRAN ........................................................................................................6
vi
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim selulas .................................................. 2 2 Pengaruh lama penyimpanan terhadap aktivitas enzim selulase berdasarkan pH ..................................................................................................................... 4
DAFTAR LAMPIRAN Halaman
1 Komposisi cairan rumen domba........................................................................ 6 2 Komposisi bufer pH .......................................................................................... 6 3 Komposisi media CMC 1% .............................................................................. 6 4 Kurva standar glukosa untuk pengukuran aktivitas enzim selulase ................. 7 5 Hasil analisis dan contoh perhitungan aktivitas enzim selulase......................... 8 6 Hasil analisis statistik aktivitas enzim selulase ................................................. 9
vii
PENDAHULUAN Kualitas pakan di sektor perikanan perlu terus ditingkatkan. Tingginya kadar serat kasar pada bahan pakan ditangani di antaranya dengan memanfaatkan enzim pendegradasi serat. Enzim memiliki fungsi khusus dan hanya bekerja pada 1 reaksi metabolisme. Untuk menurunkan kadar serat pada bahan pakan, digunakan enzim selulase yang mampu mendegradasi serat (selulosa). Enzim selulase merupakan sistem enzim yang terdiri atas endo-β-1,4-glukanase, eksoβ-1,4-glukanase, danβ-D-glukosidase. Enzim selulase mendegradasi selulosa dengan memecah ikatannya, prosesnya melibatkan 3 jenis enzim yang bekerja secara sinergis. Endo-β-1,4-glukanase memotong ikatan rantai dalam selulosa menghasilkan molekul selulosa yang lebih pendek, ekso-β-1,4-glukanase memotong ujung rantai selulosa menghasilkan molekul selobiosa, sedangkan β-D-glukosidase memotong molekul selobiosa menjadi 2 molekul glukosa (Kim et al. 2000). Enzim selulase antara lain dapat ditemukan dalam cairan rumen domba. Cairan rumen yang diperoleh dari rumah potong hewan kaya akan kandungan enzim seperti α-amilase, galaktosidase, hemiselulase, selulase, dan xilanase (Williams & Withers 1992). Menurut Kung et al. (2000), cairan rumen mengandung enzim protease yang menghidrolisis protein atau peptida, amilase yang menghidrolisis pati, selulase yang menghidrolisis selulosa, xilanase yang menghidrolisis xilan, dan lipase yang menghidrolisis lemak, komposisi cairan rumen domba diperlihatkan pada Lampiran 1. Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa enzim di dalam cairan rumen domba dari yang terbesar berturut-turut adalah selulase (0.31 ± 0.015), amilase (0.14 ± 0.016), protease (0.11 ± 0.016), dan lipase (0.03 ± 0.011) IU/mL (Pamungkas 2011). Cairan rumen adalah limbah peternakan dan merupakan salah satu bahan alternatif yang murah dan dapat dimanfaatkan dengan mudah sebagai sumber enzim hidrolase (Moharrery & Das 2002). Enzim hidrolase akan menghidrolisis serat dalam bahan pakan menjadi senyawa sederhana yang lebih mudah dicerna oleh ikan. Morgavi et al. (2000) melaporkan bahwa hidrolisis serat oleh enzim selulase berlangsung dari pH 4.5 sampai 6.5, kisaran terbaik ialah 5.0-6.5. Enzim selulase dari bakteri Bacillus amyloliquefaciens mempunyai pH optimum 7.0 (Lee et al. 2008).
Dalam rangka memanfaatkan cairan rumen domba sebagai sumber enzim selulase untuk meningkatkan kualitas bahan pakan, kondisi pH optimum untuk aktivitas enzim selulase perlu diketahui. Selain itu, stabilitas enzim perlu diuji untuk menentukan daya tahan enzim selama penyimpanan. Enzim yang diuji stabilitasnya masih dalam bentuk larutan (supernatan). Evaluasi stabilitas dilakukan terhadap pH dan lama penyimpanan berdasarkan aktivitashidrolisis selulosa menjadi gula pereduksi (glukosa).
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan yang digunakan antara lain cairan rumen domba, amonium sulfat, bufer pH 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, dan 9.0, dan bahan-bahan kimia untuk analisis aktivitas enzim selulase. Cairan rumen domba diperoleh dari rumah potong hewan. Peralatan yang digunakan antara lain sentrifus, lemari pendingin, inkubator,mikropipet,dan spektrofotometer tampak (Visible) MRC model V-200-RS. EkstraksiCairan Rumen Domba Cairan rumen yang diambil dijaga agar selalu berada dalam kondisi dingin. Cairan rumen disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 °C. Supernatan yang terbentuk direaksikan dengan amonium sulfat sebanyak 60% dari total volume cairan rumen yang digunakan. Larutan dihomogenkan kurang lebih 1 jam dengan menggunakan pengaduk magnet dan didiamkan selama 24 jam pada suhu 4 °C. Setelah itu, disentrifugasi kembali pada kecepatan 10 000 rpm selama 20 menit dengan suhu 4 °C. Supernatan yang terbentuk dibuang dan endapannya digunakan sebagai sumber enzim. Endapan kemudian dilarutkan dalam bufer dengan nisbah 1:1 (endapan dari 100 mL supernatan cairan rumen dilarutkan dalam 100 mL bufer) (Budiansyah et al. 2010). Komposisi bufer pH diperlihatkan pada Lampiran 2. Pengaruh pH dan Lama Penyimpanan terhadap Stabilitas Enzim Selulase Pengaruh pH ditentukan dengan mengukur aktivitas enzim pada bufer pH 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, dan 9.0. Stabilitas enzim ditentukan dengan mengukur aktivitas enzim setiap minggu dengan variasi waktu penyimpanan 1,
2, 3, dan 4 minggu pada suhu 4°C. Prosedur uji aktivitas yang digunakan adalah metode asam 3,5-dinitrosalisilat (DNS) yang didasarkan pada jumlah gula pereduksi sebagai hasil hidrolisis selulase. Prinsip pengujian dengan metode DNS adalah asam 3,5-dinitrosalisilat direduksi oleh gula pereduksi menjadi asam 3amino-5-nitrosalisilat (Harisha 2007). Analisis Aktivitas Enzim Selulase Enzim selulase sebanyak 0.5 mL dicampurkan dengan 1 mL CMC 1% (Lampiran 3) dan 1 mL bufer pH, diinkubasi pada suhu 30°C selama 30 menit. Setelah itu, ditambahkan 3 mL DNS, dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 15 menit. Setelah dingin, gula pereduksi yang dibebaskan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menghasilkan 1 µmol glukosa per menit(Ghose 1987). Besar kecilnya nilai aktivitas enzim memengaruhi kadar gula pereduksi yang dihasilkan selama aktivitas berlangsung. Pembuatan Kurva Standar Glukosa Standar induk glukosa 1 mg/mL diencerkan untuk membuat deret standar glukosa dengan konsentrasi 0.1, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, dan 0.35 mg/mL. Masing-masing 2 mL standar dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 2 mL DNS, didiamkan selama 30 menit. Setelah itu, dimasukkan dalam penangas air mendidih selama 15 menit dan didinginkan pada permukaan es batu. Absorbans standar diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm dan dibuat kurva standar glukosa. Perhitungan Aktivitas Enzim Selulase Aktivitas enzim selulase dinyatakan dengan rumus sebagai berikut : IU/mL = (X s − X t ) × 1000 × fp BM glukosa × t Keterangan: Xs : Kadar gula sampel (mg/mL) Xt : Kadar gula kontrol (mg/mL) BM : Bobot molekul glukosa t : Lama inkubasi (menit) fp : Faktor pengenceran Pengolahan Data Data yang diperoleh dianalisis secara statistik menurut rancangan acak kelompok
(RAK) yang terdiri atas pengaruh pH dan lama penyimpanan. Hipotesis yang muncul adalah H0 menunjukkan bahwa perbedaan pH dan lama penyimpanan tidak berpengaruh terhadap aktivitas enzim selulase dan H1 menunjukkan setidaknya salah satu dari pH dan lama penyimpanan dapat memengaruhi aktivitas enzim.
HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim Selulase Nilai aktivitas enzim memengaruhi kadar gula pereduksi yang dihasilkan. Semakin tinggi aktivitas enzim, semakin tinggi pula gula pereduksi yang dihasilkan. Aktivitas enzim selulase pada beberapa pH dapat dilihat pada Gambar 1. Kurva standar glukosa yang digunakan untuk penentuan aktivitas enzim ditunjukkan pada Lampiran 4.
Gambar 1
Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim selulase.
pH 5.0 menunjukkan nilai aktivitas enzim paling tinggi, tetapi aktivitas tersebut menurun sangat signifikan pada minggu kedua dan menjadi nol pada minggu-minggu berikutnya (Lampiran 5). Nilai aktivitasyang cukup tinggi dan relatif stabil setiap minggunya diperoleh pada pH 8.0.Nilai rata-rata aktivitas pada berbagai pH diringkaskan pada Tabel.Dengan demikian pada penelitian ini pH optimum untuk aktivitas enzim selulase cairan rumen domba ialah 8.0. Kerja enzim dipengaruhi oleh faktor lingkungan, salah satunya ialah pH. Suasana yang terlalu asam atau basa menyebabkan denaturasi protein dan dapat menghilangkan secara total aktivitas enzim. Enzim hanya aktif pada kisaran pH yang sempit. Oleh karena itu, pH media harus benar-benar dijaga dengan
3
menggunakan bufer (larutan penyangga). Denaturasi protein menyebabkan perubahan molekul enzim (Rahima 2010). Tabel Aktivitas enzim selulase pada berbagai pH pH
Rerata aktivitas enzim selulase (IU/mL ×10-3)
5
7.34±0.13
6
0.48±0.09
7
1.81±0.93
8
4.19±0.12
9
0.68±0.13
Penelitian Morgavi et al.(2000) mendapatkan bahwa hidrolisis serat oleh selulase paling baik pada pH 5.0–6.5. Budiansyah et al. (2010) mendapatkan pH optimum enzim selulase 5.15, sementara Sari (2010) mendapatkan bahwa selulase aktif bekerja pada rentang pH 5.5–7.5. Peneliti lain, Coral et al. (2002) melaporkan pH optimum enzim selulase dari Aspergillus niger ialah 4.0–4.5 dan 7.5–8.0. Perbedaan pH optimum ini disebabkan oleh perbedaan asal sumber enzim selulase. Aktivitas enzim dipengaruhi oleh pH karena adanya gugus karboksilat yang bermuatan negatif dan gugus amonium yang bermuatan positif pada struktur protein enzim. Kesetimbangan antara kedua muatan pada titik isolistrik akan mengakibatkan protein mengendap sehingga aktivitas enzim berkurang. Setiap protein mempunyai titik kesetimbangan yang berbeda. Muatan enzim akan cenderung positif pada keadaan asam dan negatif pada keadaan basa. Perubahan struktur enzim ini dapat menurunkan atau bahkan menghilangkan aktivitasnya (Xiong 2004). Korelasi aktivitas enzim dengan konsentrasi H+ menunjukkan kesetimbangan antara denaturasi enzim pada pH rendah atau tinggi danefek muatan enzim, substrat atau keduanya (Murray et al. 2003) Untuk mengetahui pengaruh pH dan lama penyimpanan terhadap aktivitas enzim selulase, dilakukan uji F. Pada uji F diperoleh nilai signifikasi kurang dari 5% sehingga harus dilakukan uji Brown-Forshyte. Uji ini menunjukkan adanya perbedaan rata-rata di setiap variasi pH dan lama penyimpanan terhadap aktivitas enzim selulase dalam cairan rumen domba.
Hipotesis uji statistik ini adalah H0 menunjukkan bahwa perbedaan pH dan lamanya penyimpanan tidak berpengaruh terhadap aktivitas enzim selulasedan H1 menunjukkan setidaknya salah satu faktor tersebut berpengaruh. Pada uji ini diperoleh nilai signifikasi kurang dari 5%. H0 ditolak: ada pengaruh pH dan atau lama penyimpanan terhadap aktivitas enzim selulase dalam cairan rumen domba. Uji statistik dilanjutkan dengan uji banding Tukey. Uji banding Tukey juga menunjukkan bahwa aktivitas enzim selulase nyata (P<0.05) dipengaruhi oleh pH dan lamapenyimpanan (Lampiran 6). Stabilitas Aktivitas Enzim SelulaseBerdasarkan pH dan Lama Penyimpanan Stabilitas enzim selulase cairan rumen domba berdasarkan pH dan lama penyimpanan ditunjukkan pada Gambar 2.
Gambar 2 Pengaruh lama penyimpanan cairan rumen domba terhadap aktivitas enzim selulase berdasarkan pH ( ). Aktivitas enzim selulase pada pH 5.0 menurun 68% dalam 2 minggu. Pada minggu ketiga dan keempat, nilainya negatif, menunjukkan bahwatidak ada aktivitas enzim selulaselagi. pH yang tidak sesuai dapat menyebabkan perubahan daerah katalitik dan konformasi enzim (Meryandini et al. 2009). Aktivitas enzim selulase pada pH 6.0 sangat tidak stabil sampai minggu keempat. Pada minggu pertama, aktivitas enzim naik mencapai maksimum, tetapi menurun kembali pada minggu kedua. Penyimpangan dari nilai pH optimum aktivitas suatu enzim akan menurunkan aktivitas enzim tersebut (Pelczar & Chan 1986). Stabilitas aktivitas enzim selulase teramati pada pH 7.0, sampai minggu ketiga dan menurun hingga negatif (nol) pada minggu keempat. Hal ini menunjukkan bahwa enzim
selulase pada cairan rumen domba dapat secara aktif mendegradasi selulosa dan beradaptasi pada pH netral. Enzim selulase menunjukkan kestabilan yang relatif baik dan tidak terlalu fluktuatif pada pH 8.0. Aktivitas enzim menurun di minggu pertama sebesar 5%. Persen penurunan ini tidak terlalu besar dan masih stabil sampai minggu keempat. Aktivitas enzim selulase pada pH 9.0 lebih kecil dan terus menurun sampai minggu ketiga dengan rata-rata penurunan 22%. Pada minggu keempat, enzim selulase sudah tidak menunjukkan aktivitas lagi. Hal ini disebabkan oleh sifat enzim yang mudah berubah atau labil, juga disebabkan kerusakan pada struktur protein maupun gugus aktif enzim (Pelczar & Chan 1986). Sedikit perubahan pH akan menyebabkan perubahan besar pada reaksi yang dikatalisis oleh enzim. Perubahan pH dapat menyebabkan denaturasi enzim sehingga menghilangkan fungsi katalitiknya. Dengan demikian pH merupakan salah satu faktor yang berpotensi memengaruhi aktivitas enzim, serta sangat erat kaitannya dengan fungsi aktif enzim, kelarutan substrat, dan ikatan enzim-substrat (Pelczar & Chan 1986). Gambar 2 memperlihatkan bahwa aktivitas enzim selulase pada pH 5.0 dan 9.0 relatif menurun dengan bertambahnya lama penyimpanan. Stabilitas penyimpanan yang rendah atau penurunan aktivitas enzim saat disimpan, antara lain dapat disebabkan enzim hanya aktif secara katalitik dalam jangka waktu yang pendek karena adanya autolisis (Suhartono 1989).
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Aktivitas enzim selulase cairan rumen domba optimum pada pH 8.0, yaitu 0.00419 IU/mL. Aktivitas enzim ini stabil pada pH 7.0 dengan lama penyimpanan selama 3 minggu dan pada pH 8.0 dengan lama penyimpanan selama 4 minggu. Saran Disarankan untuk menyimpan enzim pada pH 8.0 karena nilai aktivitasnya lebih tinggi daripada pada pH 7.0.
DAFTAR PUSTAKA Budiansyah A, Resmi, Wiryawan KG, Soehartono MT, Widyastuti Y Ramli N. 2010. Isolasi dan karakterisasi enzim karbohidrase cairan rumen sapi asal rumah potong hewan. Media Peternakan. 33(1):36-43. Coral G, Arikan B, Unaldi MN, Guvenmez H. 2002. Some properties of crude carboxymethyl cellulose of Aspergillus niger Z10 wild-type strain. Tubitak Turk J Biol. 26:209-2013. Ghose TK. 1987. Measurement of cellulose activities.Pure &Appl Chem.59:252-268. Harisha S. 2007.Biotechnology Procedures and Experiments Handbook. Kanada: Infinity Sci Pr. Kim YS, Jung HC, Pan JG. 2000. Bacterial cell surface display of an enzyme library for selective screening of improved cellulase variants.J Appl Environ Microbiol.66:788-793. Kung LJr, Treacher RJ, Nauman GA, Smagala AM, Endres KM, Cohen MA. 2000. The effect of treating forages with fibriolytic enzymes on its nutritive value and lactation performance of dairy cows. J Dairy Sci. 83:115-122. Lee YJ, Kim BK, Lee BH, Jo KI, Lee NK, Chung CH, Lee YC, Lee JW. 2008. Purification and characterization of cellulose produced by Bacillus amyloliquefaciens DL-3 utilizing rice hull. Biores Technol. 99:378-386. Meryandini A et al. 2009.Isolasi bakteri selulolitik dan karakterisasi enzimnya.Makara Sains 13:33-38. Moharrery A, Das TK. 2002. Correlation between microbial enzyme activities in the rumen fluid of sheep under different treatments. Reprod Nutr Dev. 41:523-529. Morgavi et al. 2000. Synergy between ruminal fibrolytic enzymes and enzymes from Trichoderma longibrachiatum. J Dairy Sci. 83:1310-1321.Murray RK, Granner DK,
5
Mayes PA, Rodwell VW. 2003. Harper’s Illustrated Biochemistry. Ed ke-26. San Fransisco: McGraw-Hill. Pamungkas W. 2011. Uji efektivitas penambahan enzim cairan rumen domba terhadap penurunan serat kasar dan nilai kecernaan bungkil kelapa sawit sebagai benih ikan patin siam (Pangasius hypothalmus) [tesis]. Bogor: Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Pelczar MJ, Chan ECS. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Ratna Siri Hadioetomo,Penerjemah. Jakarta: UI Pr. Terjemahan dari: Microbiology. Rahima D. 2010. Optimasi produksi enzim selulase untuk hidrolisis jerami padi [skripsi]. Palangkaraya: Politeknik Kesehatan Kemenkes. Sari RF. 2010.Optimasi aktivitas selulase ekstraseluler dari isolat bakteri RF-10 [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Suhartono MT. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Bogor: Pusat Antar Universitas Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor. Williams AG, Withers SE. 1992. Changes in the rumen microbial population and its activities during the refaunation period after the reintroduction of ciliate protozoa into the rumen of defaunated sheep. Canadian J Microbiology.39:61-69. Xiong H. 2004. Production and characterization of Trichoderma reesei and Thermomyces lanuginosus xylanases [disertasi]. Finlandia: Department of Chemical Technology, Helsinki University of Technology.
LAMPIRAN
6
Lampiran 1 Komposisi cairan rumen domba1) Cairan rumen tanpa protozoa
Cairan rumen bebas sel mikrob
Cairan rumen dengan sel mikrob
Selulase (μg glukosa/mL/jam)
738.5±3.45
162.2±33.70
405.30±44.19
Protease (unit/mL)
0.201±0.078
0.090±0.027
0.220±0.046
Amilase (μg glukosa/menit/mL)
172.2±45.9
60.05±10.96
208.7±97.0
Enzim
Lipase (unit/mL)
1.076±0.309 0.339±0.080 1.225±0.803 Keterangan: Enzim dari cairan rumen anak domba yang diberi makan air susu dan konsentrat sampai umur 9 minggu. Sumber: Moharrery & Das (2002) 1)
Lampiran 2 Komposisi bufer pH 1.
Bufer sitrat pH 5.0: 40 mL asam sitrat 0.2 M (21.014 g asam sitrat dalam 500 mL akuades) 60 mL Na3C6H5O7·H2O 0.2 M (29.412 g Na3C6H5O7·H2O dalam 500 mL akuades)
2.
Bufer fosfat pH 6.0: 12.3 mL Na2HPO4·2H2O 0.1 M (17.799 g Na2HPO4·2H2O dalam 1000 mL akuades) 87.7 mL NaH2PO4·2H2O 0.1 M (15.601 g NaH2PO4·2H2O dalam 1000 mL akuades)
3.
Bufer fosfat pH 7.0: 61.1 mL Na2HPO4·2H2O 0.1 M (17.799 g Na2HPO4·2H2O dalam 1000 mL akuades) 38.9 mL NaH2PO4·2H2O 0.1 M (15.601 g NaH2PO4·2H2O dalam 1000 mL akuades)
4.
Bufer fosfat pH 8.0: 94.7 mL Na2HPO4·2H2O 0.1 M (17.799 g Na2HPO4·2H2O dalam 1000 mL akuades) 5.3 mL NaH2PO4·2H2O 0.1 M (15.601 g NaH2PO4·2H2O dalam 1000 mL akuades)
5.
Bufer borat pH 9.0: 20 mL H3BO3 0.2 M (6.184 g H3BO3 dalam 500 mL akuades) 80 mL Na2B4O7·10H2O 0.05 M (9.536 g Na2B4O7·10H2O dalam 500 mL akuades)
Lampiran 3 Komposisi media CMC 1% Komposisi CMC MgSO4·7H2O KNO3 K2HPO4 FeSO4·7H2O CaCl2·2H2O Agar-agar Glukosa Antibiotik
gram/liter 10 0.2 0.75 0.5 0.02 0.04 15 1 0.25
7
Lampiran 4 Kurva standar glukosa untuk pengukuran aktivitas enzim selulase Konsentrasi Standar Glukosa (mg/mL)
Absorbans1
Absorbans2
Rerata
Absorbansterkoreksi
0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
0.254 0.353 0.482 0.592 0.724 0.867
0.250 0.359 0.497 0.598 0.733 0.862
0.252 0.356 0.490 0.595 0.729 0.865
0.000 0.104 0.238 0.343 0.477 0.613
8
Lampiran 5 Hasil analisis dan contoh perhitungan aktivitas enzim selulase cairan rumen domba
1
Sampel (pH 5.0) 0.299
2
0.288
0.113
0.257
0.0715
0.0588
0.00234
3
0.280
0.212
0.281
0.0278
0.0282
-0.00008
4
0.278
0.215
0.280
0.0257
0.0265
-0.00015
5
0.277
0.205
0.281
0.0294
0.0310
-0.00030
Blangko
Kontrol
Xs
Xt
IU/mL
0.107
0.125
0.0098
0.0074
0.00454
Minggu
Blangko
Kontrol
Xs
Xt
IU/mL
0.117
0.202
0.0743
0.0347
0.00734
1
Sampel (pH 6.0) 0.131
2
0.685
0.100
0.641
0.2389
0.2209
0.00333
3
0.686
0.116
0.653
0.2328
0.2193
0.00250
4
0.686
0.121
0.675
0.2307
0.2262
0.00083
0.684
0.110
0.675
0.2344
0.2307
0.00068
Blangko
Kontrol
Xs
Xt
IU/mL
0.124
0.652
0.2238
0.2156
0.00152
Minggu
5
1
Sampel (pH 7.0) 0.681
2
0.702
0.112
0.671
0.2371
0.2283
0.00163
3
0.735
0.115
0.719
0.2491
0.2466
0.00046
4
0.703
0.120
0.706
0.2342
0.2393
-0.00094
5
0.686
0.105
0.701
0.2334
0.2434
-0.00184
Minggu
Sampel (pH 8.0)
Blangko
Kontrol
Xs
Xt
IU/mL
1
0.732
0.122
0.677
0.2491
0.2266
0.00416
2
0.754
0.119
0.702
0.2593
0.2381
0.00393
3
0.732
0.113
0.682
0.2528
0.2323
0.00378
4
0.717
0.104
0.670
0.2503
0.2311
0.00355
5
0.692
0.127
0.663
0.2307
0.2189
0.00219
Minggu
Sampel (pH 9.0)
Blangko
Kontrol
Xs
Xt
IU/mL
1
0.324
0.105
0.315
0.0894
0.0858
0.00068
2
0.317
0.095
0.310
0.0907
0.0878
0.00053
3
0.333
0.115
0.328
0.0890
0.0870
0.00038
4
0.323
0.112
0.319
0.0862
0.0845
0.00030
5
0.318
0.109
0.321
0.0853
0.0866
-0.00023
Minggu
Keterangan: Xs =
Contoh perhitungan:
Abs sampel − Abs
blangko
Slope
Xt =
Abs kontrol − Abs Slope
blangko
IU/mL = (X s − X t ) × 1000 × fp BM glukosa × t IU/mL = (0.2491 − 0.2266) ×1000 × fp = 0.00416 IU/mL 180 × 30
9
Lampiran 6 Hasil analisis statistik aktivitas enzim selulase cairan rumen domba
Sumber Keragaman Perlakuan Galat Total
Derajat Bebas (db) 4 20 24
Jumlah Kuadrat (JK) 4.005 ×10-5 6.552 ×10-5 0.0001056
Rata-rata Kuadrat (KT)
Fhit (KTP/KTG)
F0.05 (4,20)
1.001 ×10-5 3.276 ×10-6 1.329 ×10-5
3.056
2.866
Hipotesis: H0: ∂1= ∂2= …. = ∂t = 0, semua perlakuan tidak berpengaruh terhadap respons H1: Paling sedikit ada satu i dengan ∂1 tidak sama dengan 0 Simpulan:
F hitung > F tabel: Tolak H0 Terdapat perbedaan pengaruh perlakuan terhadap respons yang diamati (Setiap minggunya memberikan nilai aktivitas enzim selulase yang berbeda)
Uji banding Tukey pH
N
6.00a 9.00ab 7.00b 8.00c 5.00d Sig
3 3 3 3 3
1 (×10-3) .44800 .6833
Subset for alpha 2 3 (×10-3) (×10-3)
4 (×10-3)
.6833 1.8133 4.1900
.975
.057
1.000
7.3433 1.000
Simpulan: Aktivitas enzim selulase pada cairan rumen domba bervariasi selama waktu penyimpanan, maka waktu penyimpanan berpengaruh terhadap aktivitas enzim selulase cairan rumen domba (kode huruf berbeda).
