ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra biomedicínské techniky
TÝMOVÝ PROJEKT
2011/2012
Martin Šišma
ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE Fakulta biomedicínského inženýrství Katedra biomedicínské techniky
Použití metod světelné mikroskopie k detekci mikroorganizmů v probiotikách Týmový projekt
Vedoucí projektu: Mgr. Veronika Vymětalová Student:
Martin Šišma
leden 2012
Anotace Cílem mého dílčího tématu našeho týmového projektu bylo vypracovat souhrnný text o metodách světelné mikroskopie, se zaměřením na fluorescenční mikroskopii, které slouží k detekci mikroorganizmů v probiotikách. V experimentální části jsem se zabýval detekcí mikroorganismů v běžně dostupných probiotických produktech. Zhotovil jsem několik nativních mikroskopických preparátů, které jsem pozoroval v mikroskopu v procházejícím světle a následně pořídil jejich mikrofotografie. Cílem bylo seznámit se s laboratorní technikou, přípravou preparátů a pořízení mikrofotografií z pozorování v procházejícím světle.
Annotation
The aim of my sub-theme of our project team was to develop a comprehensive text on methods of lightmicroscopy, focusing on fluorescencemicroscopy, which is used to detect microorganisms in probiotics. In the experimental part was dealing with detection of microorganisms in commercially available probiotic products. I made a few native microscopic specimens, which I observed in the microscope in transmitted light, and then took the micrograph. The aim was to become familiar with laboratory equipment, preparation of specimens and microphotographs taken from observations in transmitted light.
Poděkování Poděkování patří především vedoucí našeho týmového projektu, Mgr. Veronice Vymětalové, která byla naší oporou po celou dobu. Pomáhala nám a radila kdykoli bylo potřeba. Mimo to nám poskytla zázemí pro realizaci vlastního experimentu. Dále bych poděkoval svým týmovým kolegům, Monice Burdové a Ondřeji Skopalovi, kteří se mnou spolupracovali. ii
Prohlášení Prohlašuji, že jsem týmový projekt s názvem Použití metod světelné mikroskopie k detekci mikroorganizmů v probatikách vypracoval samostatně a použil k tomu úplný výčet citací použitých pramenů, které uvádím v seznamu přiloženém k závěrečné zprávě. Nemám závažný důvod proti užití tohoto školního díla ve smyslu §60 Zákona č.121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon).
V ……………. dne ………………
……………………. Podpis iii
Obsah Seznam použitých symbolů a zkratek…………………………………………………………vi Seznam obrázků………………………………………………………………………………vii 1
Úvod ................................................................................................................................... 1
2
Současný stav řešení ........................................................................................................... 2 2.1
Zákony geometrické optiky ......................................................................................... 2
2.2
Světelný mikroskop ..................................................................................................... 4
2.3
Dělení světelných mikroskopických metod na základě způsobu osvětlení objektu .... 6
2.3.1
Mikroskopie v procházejícím světle .................................................................... 6
2.3.2
Mikroskopie v dopadajícím světle ....................................................................... 6
2.3.3
Inverzní mikroskopie............................................................................................ 7
2.4
Dělení světelných mikroskopických metod na základě změny průchodu světelného
paprsku ................................................................................................................................... 7 2.4.1
Metoda temného pole ........................................................................................... 8
2.4.2
Metoda fázového kontrastu .................................................................................. 9
2.4.3
Metoda interferenční mikroskopie ..................................................................... 11
2.4.4
Metoda Nomarského diferenciálního interferenčního kontrastu (DIC) ............. 13
2.4.5
Metoda Hoffmanova modulačního kontrastu ..................................................... 14
2.4.6
Metoda fluorescenční mikroskopie .................................................................... 15
2.4.7
Metoda cytospektrofotometrie ........................................................................... 19
2.5
3
Probiotika................................................................................................................... 20
2.5.1
Požadavky na probiotika .................................................................................... 20
2.5.2
Třídění probiotik ................................................................................................ 21
2.5.3
Zdravotní přínosy ............................................................................................... 22
Experimentální část .......................................................................................................... 23 3.1
Pozorovaný materiál .................................................................................................. 23
3.2
Pomůcky a přístrojové vybavení ............................................................................... 23 iv
3.3
Příprava mikroskopických preparátů ......................................................................... 25
3.4
Pozorování a pořizování fotografií pozorovaných preparátů .................................... 25
3.5
Výsledek .................................................................................................................... 25
4
Závěr................................................................................................................................. 26
5
Seznam použité literatury ................................................................................................. 27
v
Seznam použitých symbolů a zkratek aj. … a jiné c … rychlost světla ve vakuu (3.108 m.s-1) CCD … (Charge-Coupled Device) elektronická součástka používaná pro snímání obrazové informace cm … centimetr (10-2 m) DIC … (Differential interference contrast) diferenciální interferenční kontrast E … energie f … frekvence FAO … (Food and Agriculture Organization) organizace OSN pro výživu a zemědělství h … Planckova konstanta (6,626.10-34 J.s) Hz … hertz (s-1) J … joule LDL cholesterol … (Low-density lipoprotein) lipoproteiny s nízkou hustotou m … metr NADH … nikotinamid adenin dinukleotid NADPH … nikotinamid adenin dinukleotid fosfát např. … například NH2 … amidová skupina nm … nanometr (10-9 m) OH … karboxylová skupina s … sekunda SH … sulfanylová skupina tzv. … tak zvaně UV … ultrafialová WHO … (World Health Organization) světová zdravotnická organizace λ … vlnová délka µm … mikrometr (10-6 m) O
… stupeň
vi
Seznam obrázků
Obr. 1:
Zákon odrazu Zdroj:
.................................. 3
Obr. 2:
Inverzní mikroskop Zdroj: ..... 7
Obr. 3:
A – pozorování ve světlém poli, B – pozorování v temném poli Zdroj: ...................................... 8
Obr. 4:
Trepka obecná – metoda temného pole Zdroj: .... 9
Obr. 5:
Znázornění vlnové délky a amplitudy Zdroj: ... 9
Obr. 6:
Princip fázového kontrastu Zdroj: .................................... 10
Obr. 7:
Pozitivní a negativní fázový kontrast Zdroj: .. 11
Obr. 8:
Schéma principu interferenčního mikroskopu . Zdroj: .............................................. 12
Obr. 9:
Schéma principu polarizačního filtru, upraveno podle Zdroj: ... 12
Obr. 10:
Schéma Nomarského DIC Zdroj: ................................................................................................................. 13
Obr. 11:
Prorhinotermes simplex v Nomarského diferenciálním interferenčním kontrastu .... Zdroj: ................................. 14
Obr. 12:
Princip Hoffmanova modulačního kontrastu Zdroj:
1996(41), 1-24. Dostupné z: http://dml.cz/bitstream/handle/10338.dmlcz/139719/PokrokyMFA_41-19961_1.pdf> ................................................................................................................. 15 Obr. 13:
Elektromagnetické spektrum Zdroj: ... 16
Obr. 14:
Stavba fluorescenčního mikroskopu Zdroj: ........................................................................................... 17
Obr. 15:
A,B - fluorescein-5-isothiokyanát, C - tetramethylrhodamin-5-isothiokyanát Zdroj: < KOČÁREK, Eduard; PÁNEK, Martin; NOVOTNÁ, Drahuše. Klinická cytogenetika I. : Úvod do klinické cytogenetiky. I. Praha : Karolinum, 2006. 120 s. ISBN 80-246-1069-8> ........................................................................................... 18
Obr. 16:
A - 4´6-diamidino2-fenylindol, B - akridinová oranž Zdroj: < KOČÁREK, Eduard; PÁNEK, Martin; NOVOTNÁ, Drahuše. Klinická cytogenetika I. : Úvod do klinické cytogenetiky. I. Praha : Karolinum, 2006. 120 s. ISBN 80-246-1069-8> ........................................................................................... 19
Obr. 17:
Schéma cytospektrofotometru Zdroj: ….... 20
Obr. 18:
Mikrocentrifuga Eppendorf minispin plus, nastavená na 10 200 otáček/minutupo
dobu dvou minut....................................................................................................................... 24 Obr. 19:
mikroskop OLYMPUS CX21 s nástavcem OLYMPUS V-CMAD 3 JAPAN...... 24
viii
1 Úvod Obecně zkoumání či pozorování v oblasti mikrobiologie jsou velmi důležitými činnostmi, na jejichž základě můžeme získat cenné informace.Uplatňují se pro zjišťování morfologických znaků důležitých pro identifikaci mikroorganismů nebo k posuzování fyziologického stavu buněk. Jsou hojně užívány při přímém stanovování počtu mikroorganismů ve vzorcích, při kontrole čistoty kultur, či při pozorování charakteru směsných kultur. Rozlišovací schopnost lidského oka nám však neumožňuje detekovat objekty mikroskopických rozměrů a je tedy nutné použít zvětšovacího přístroje a vhodnou metodu, pomocí které můžeme daný objekt dále pozorovat a zkoumat. Právě seznámení s jednotlivými metodami světelné mikroskopie, které se užívají k detekci mikroorganismů, je cílem teoretické části této práce. Cílem experimentální části je získání souboru mikrofotografií, získaných různými mikroskopickými technikami, které budeme následně porovnávat a zjišťovat vhodnost jejich použití pro zobrazení probiotických kultur v laboratorní praxi. V rámci týmového projektu provedu pozorování mikroorganizmů v běžně dostupných probiotických produktech za použití mikroskopie v procházejícím světle.
1
2 Současný stav řešení Jak již v úvodu bylo zmíněno, schopnost lidského oka rozlišit od sebe dva body, tzv. rozlišovací schopnost oka, je při konvenční zrakové vzdálenosti dvaceti pěti centimetrů v intervalu 200-250 µm[1], [2]. Tab. 1: Rozměry buněk a buněčných struktur při pozorování [2] velikost rostlinná pletiva
mm
živočišné tkáně
mm
jednotlivé eukaryotní buňky
4 – 100 µm
prokaryotní buňky
1 – 2 µm
organely:
jádro
4 – 30 µm
jadérko
1 – 5 µm
plastidy
2 – 10 µm
vakuola
různá v závislosti na stáří a velikosti buňky
inkluze
2 – 100 µm
mitochondrie
0,1 – 1 µm
Výše uvedená tabulka dokazuje, že k pozorování jednotlivých buněk a jejich struktur nám již samotné lidské oko nestačí. Chceme-li pozorovat tyto objekty, musíme použít některé ze zvětšovacích přístrojů. V rámci tématu této práce se zaměříme na optické mikroskopy, které dosahují rozlišovací schopnosti přibližně0,2-0,25 µm.Tato rozlišovací schopnost je závislá na optické mohutnosti použitých čoček v objektivu a okuláru a na charakteru použitého světla. Světelná mikroskopie je založena na zákonech optiky, především pak na zákonech geometrické optiky, která zanedbává vlnový charakter světla[1], [2].
2.1 Zákony geometrické optiky Světlo je část elektromagnetického spektra, kterou je sítnice lidského oka schopna detekovat. Vlnové délky viditelného světla leží v intervalu 390-760 nm. Šířením světla se zabývá optika. Optika je část fyziky, která zkoumá podstatu světla a zákonitosti světelných jevů, které 2
vznikají při šíření světla při vzájemném působení světla a látky. Podstatu principů optických zařízení popisuje geometrická optika, která zanedbává vlnový charakter světla. Zabývá se jevy souvisejícími se zobrazováním optickými soustavami - šířením světla, jeho odrazem a lomem. Geometrickou optiku vystihuje pět základních zákonů.
Zákon přímočarého šíření světla Podle tohoto zákona se světlo v homogenním optickém prostředí šíří přímočaře v rovnoběžných, rozbíhavých nebo sbíhavých svazcích světelných paprsků. Světlo se mezi dvěma body šíří vždy po nejkratší možné dráze.
Zákon odrazu Odraz světla nastává, pokud dopadající světelný paprsek dopadá na rozhraní dvou světelných prostředí a nedojde k průniku dopadajícího světelného paprsku do druhého světelného prostředí. Dále pak platí, že velikost úhlu odrazu α´ se rovná velikosti úhlu dopaduα a odražený paprsek leží v rovině dopadu.
Obr. 1:
Zákon odrazu[viz. Seznam obrázků]
Zákon lomu K lomu světla dochází při přechodu světelného paprsku z jednoho prostředí o indexu lomu n1 do prostředí druhého o indexu lomu n2.Světelný paprsek dopadá na rozhraní prostředí pod úhlem α, což je úhel mezi kolmicí dopadu a dopadající světelným paprskem. Lomený světelný paprsek se dále šíří prostředím o indexu lomu n2 a to pod úhlem β, což je úhel svírající lomený světelný paprsek s kolmicí dopadu. Matematicky lze tento zákon vyjádřit vztahem: Indexem lomu se rozumí poměr rychlosti světla ve vakuu k rychlosti světla v daném prostředí. 3
Zákon nezávislosti chodu světelných paprsků Světelné paprsky z různých zdrojů světla se navzájem protínají, přitom se však vzájemně neovlivňují a postupují prostředím nezávisle jeden na druhém.
Zákon záměnnosti chodu paprsků Tento zákon neplatí pouze pro odraz a lom světla, ale obecně platí pro paprskovou optiku. Říká nám, že při odrazu a lomu světla můžeme vzájemně zaměnit dopadající a odražený paprsek. Obdobně je tomu u dopadajícího a lomeného paprsku.
2.2 Světelný mikroskop Mikroskop je zařízení konstruované pro pozorování drobných objektů a jejich detailů při velkém zvětšení. V principu je vždy tvořen dvěma základními částmi, a to částí mechanickou a optickou. Mechanická část je tvořena stativem, nosičem tubusu, tubusem, makro a mikrometrickým šroubem, pracovním stolkem s držáky preparátu a závěsem kondenzoru. Stativ zajišťuje stabilitu mikroskopu. Součástí stativu je zdroj světelného záření. Nosič tubusu tvoří tělo mikroskopu, na které jsou uchyceny jednotlivé komponenty. Makrometrický a mikrometrický šroub jsou zabudovány v nosiči tubusu. Umožňují pohyb pracovním stolkem ve vertikálním směru, ve směru optické osy, a tím zaostřujeme pozorovaný objekt. Makrometrický šroub slouží k hrubému zaostření objektu a mikrometrický šroub používáme k jemnému doostření. Tubus je upravená trubice, na kterou nasedá shora čočka nebo soustava čoček, tzv. okulár. Na dolní část tubusu je připevněn revolverový nosič s několika osazenými objektivy. Pracovní stolek slouží k upevnění preparátu av něm zabudovaný křížový posuvný mechanismus umožňuje manipulaci s preparátem v horizontální rovině.Posledním blokem mechanické části je závěs kondenzoru, umístěný pod pracovním stolkem. Optickou část tvoří tři základní bloky – kondenzor, objektiv a okulár. Kondenzor tvoří jednoduchá soustava čoček usměrňující světelní tok paprsků ze zdroje záření na preparát. Před vstupní čočkou kondenzoru je umístěna irisová aperturní clona. Zajišťuje optimální prosvětlení zorného pole. Po průchodu světelných paprsků skrze preparát postupují dále do objektivu, který tvoří taktéž soustava čoček a dochází ke vzniku zvětšeného, skutečného a 4
převráceného obrazu. Objektivy dosahují zvětšení v intervalu 5x-60x (podle [10] je zvětšení objektivů 0,5x-100x).Čočky v objektivu jsou opatřeny korekcí vad. Objektivy můžeme dělit podle dvou kritérií[2]: a) podle prostředí, které je mezi objektivem a preparátem: -
suché objektivy, kde prostředí mezi objektivem a preparátem vyplňuje vzduch
-
vodní objektivy, kde prostředí mezi objektivem a preparátem vyplňuje voda
-
imerzní objektivy, kde prostředí mezi objektivem a preparátem vyplňuje imerzní olej
b) podle korekce vad: -
achromáty, které korigují chromatickou vadu pro zelenou a žlutou složku viditelného spektra
-
apochromáty, korigují chromatickou vadu pro všechny barevné složky viditelného spektra
-
planachromáty, mimo korekci chromatické vady pro zelenou a žlutou složku viditelného spektra korigují i sférickou vadu
-
planapochromáty, korigují chromatickou vadu pro všechny barevné složky viditelného spektra, sférickou vadu a vadu vyklenutí zorného pole
Posledním optickým blokem je okulár. I v tomto případě se jedná o soustavu čoček, přes které vzniká obraz zvětšený, převrácený a zdánlivý. Zvětšení okuláru dosahuje hodnot 10x-25x. Podle počtu okulárů dělíme mikroskopy na monokulární (s jedním okulárem), binokulární (se dvěma okuláry) a trinokulární (se třemi okuláry)[1], [2], [3]. Celkové zvětšení, kterého optický mikroskop může docílit za použití suchých preparátů, je rovno součinu zvětšení objektivu a okuláru. Jedná se tedy o zvětšení až 1500x. Další zvětšení je možné, pokud zvýšíme hodnotu tzv. numerické apertury[1]. Numerickou aperturou se rozumí maximální vrcholový úhel kužele paprsků, pod kterým ještě může světelný paprsek vstoupit do pupily objektivu[10]. Je dána vztahem[2]:
kde A je numerická apertura [-], n je index lomu prostředí mezi preparátem a prvotní čočkou objektivu [-], α je polovinou otvorového úhlu objektivu [O]
5
Tab. 2: Vybrané hodnoty indexu lomu podle [2] prostředí
index lomu n[-]
vzduch
1,00
voda
1,33
imerzní olej
1,4-1,5
sklo
1,5-1,9
Výsledná rozlišovací schopnost (jakost obrazu) je rovna převrácené hodnotě rozlišovací meze soustavy, vystihuje jí vztah[2]:
kde R je rozlišovací schopnost [-], k je konstanta, λ je vlnová délka použitého světla [m] aA je numerická apertura [-]
2.3 Dělení světelných mikroskopických metod na základě způsobu osvětlení objektu 2.3.1 Mikroskopie v procházejícím světle Jedná se o nejpoužívanější mikroskopickou metodu pozorování biologických objektů, jejíž podstatou je průchod světla skrze preparát. Samotný zdroj světla je umístěný pod pracovním stolkem mikroskopu, který dále prochází kondenzorem, následně preparátem, objektivem a okulárem[2]. 2.3.2 Mikroskopie v dopadajícím světle Tato metoda se v biologii oproti mikroskopii v procházejícím světle příliš nepoužívá. Konstrukčně se mikroskop liší od klasického optického mikroskopu umístěním zdroje světla, který je v tomto případě umístěn nad preparátem a absencí kondenzoru. Hlavním využití jepozorování neprůhledných objektů (silnější tkáňové řezy – např. mozku). Světelný paprsek dopadá přímo na pozorovaný objekt, od kterého se odráží. Odražený paprsek pak prochází objektivem a následně okulárem[1], [2].
6
2.3.3 Inverzní mikroskopie Název je odvozen od inverzního uspořádání jednotlivých bloků mikroskopu. Objektiv je tedy umístěn pod pracovním stolkem a tubus s okulárem přibližně v úrovni pracovního stolku. Samotný preparát se pokládá na pracovní stolek a kondenzorje umístěn až nad preparátem. Toto charakteristické inverzní uspořádání má výhodu v tom, že můžeme na pracovní stolek pokládat například Petriho misky nebo kultivační nádoby. Proto se inverzní mikroskopie nejvíce užívá v mikrobiologii, k pozorování tkáňových či bakteriálních kultur[2].
Obr. 2:
Inverzní mikroskop[viz. Seznam obrázků]
2.4 Dělení světelných mikroskopických metod na základě změny průchodu světelného paprsku Mikroskopické pozorování mikroorganismů pomocí světelných mikroskopů je velice obtížné. Jen velmi výjimečně můžeme přímo pozorovat jednotlivé složky organel nebo přirozené kontrastní metabolity. To je zapříčiněno malým kontrastem jejich vnitřních struktur. Pro kvalitní zobrazení mikroskopovaného objektu je tedy nezbytné zvýšit kontrast jednotlivých struktur. Kontrastem rozumíme rozdíl jasu pozorovaného objektu a jeho pozadí. Zvýšení kontrastu můžeme docílit několika způsoby[3]:
-
zbarvením cytologickými a histologickými barvivy; tyto barvící techniky však mohou nést svá rizika; barvení může mít za následek poškození buněčných struktur
7
-
užitím vhodné pozorovací techniky, užívající zdroj světla z oblasti infračerveného, ultrafialového, rentgenového nebo laserového záření
-
užitím fázových destiček ke zvýšení přirozeného kontrastu
-
ohybem světelných paprsků
-
kombinací výše uvedených možností
2.4.1 Metoda temného pole Mikroskopie v temném poli, také tzv. zástin, je založena na principu, kdy do roviny pozorovaného objektu vstupují z kondenzoru pouze okrajové, šikmo dopadající světelné paprsky ze světelného zdroje. Pohlcení centrálních paprsků způsobuje clona, která bývá nejčastěji přímou součástí kondenzoru. Pozorovaný objekt je tedy osvětlen pouze paprsky šikmo dopadajícími ze stran (laterálně) a dochází k lomu, odrazu a ohybu těchto paprsků od pozorovaného objektu. Následně tyto odražené paprsky vstupují do objektivu, kde pozorujeme jasně zářící objekt na temném poli. Tato metoda se hojně užívá v mikrobiologii, a to zejména v bakteriologii a protozoologii, pro pozorování povrchových a buněčných struktur mikroorganismů (např. mitochondrie, centrioly, lyzozómy, peroxizómy a bakterie), které můžeme v klasickém světelném mikroskopu jen velmi těžko pozorovat[2], [3], [4], [5].
Obr. 3:
A – pozorování ve světlém poli, B – pozorování v temném poli, upraveno podle[3]
8
Obr. 4:
Trepka obecná – metoda temného pole[viz. Seznam obrázků]
2.4.2 Metoda fázového kontrastu Světlo lze charakterizovat vlnovou délkou a amplitudou. Změnou vlnové délky pozorujeme změnu barvy světelného záření, zatímco změnou amplitudy pozorujeme rozdíl v intenzitě světelného záření (jasu). Při průchodu preparátem dochází ke změnám těchto parametrů.
Obr. 5:
Znázornění vlnové délky a amplitudy[viz. Seznam obrázků]
V případě zbarvených preparátů dochází, při průchodu světla skrze preparát, k jeho částečnému pohlcení a tím nastane změna v amplitudě jeho vln, zatímco fáze zůstává nezměněna. Obecně zbarvené preparáty nazýváme amplitudovými objekty. Metoda fázového kontrastu se uplatňuje zejména pro mikroskopování živých, nezbarvených preparátů (např. v živých buňkách jádro, jadérko, chromozomy a vakuoly). Skrz nezbarvené preparáty prostupuje světelné záření téměř všude stejně, a tedy nedochází ke změně amplitudy světelného záření. Jednotlivé struktury preparátu se však liší svou optickou hustotou (indexem lomu), což má za následek nestejný lom světla a posun fáze světelného záření. Vzniká tzv. refrakční obraz. Nezbarvené preparáty nazýváme fázovými objekty[4], [5].
9
Mikroskop uzpůsobený pro pozorování fázového kontrastu má zabudovanou aperturu tvaru úzkého mezikruží (kondenzorová fázová clona), umístěnou v přední ohniskové rovině kondenzoru. Světelný paprsek ze zdroje po průchodu kondenzorovou fázovou clonou je pomocí soustavy kondenzoru a objektivu zobrazen v zadní rovině této soustavy, kde vstupuje do druhé apertury. Druhá apertura, taktéž tvaru mezikruží, nazývaná fázovou clonou objektivu, je umístěna v objektivu na tenké skleněné podložce a zapříčiňuje změnu fáze procházejícího světelného záření[3]. Lidské oko však malé fázové rozdíly není schopné rozeznat. Cílem fázově kontrastního zařízení je tedy modifikovat tyto malé fázové rozdíly na rozdíly amplitudové, které již bez potíží detekujeme [5]. Intenzita světla výsledného obrazu se mění lineárně v závislosti na průchodu různě opticky hustými prostředími pozorovaného preparátu [3].
Obr. 6:
Princip fázového kontrastu, upraveno podle[3]
Výsledný fázový kontrast máme dvojího typu. Pokud se nám jeví světlo procházející hustší (silnější) částí pozorovaného preparátu tmavší a řidší (slabší) světlejší, jedná se o tzv. pozitivní fázový kontrast. Fázová destička umístěná v objektivu posune fázi obrazu světelného záření zdroje proti fázi světelného záření ohybových obrazů o +90O, což je jedna čtvrtina délky vlny. V opačném případě je posun fáze obrazu světelného záření o -90Oa jedná se negativní fázový kontrast. Pozitivní fázový kontrast je pro lidské vnímání přirozenější, protože rozložení intenzity je obdobné jak u zbarvených preparátů[3], [4].
10
Obr. 7:
Pozitivní a negativní fázový kontrast[viz. Seznam obrázků]
Fázově kontrastní mikroskopy běžně dovedou zobrazit fázové rozdíly menší než 10 -2 a dosahují
rozlišovací
schopnosti
0,1µm.
Užívají
monochromatického
záření
(tzv.
kvazimonochromatické osvětlení) na vlnových délkách okolo 555nm, které vzniká umístěním filtru. Existují i mikroskopy užívající polychromatického záření. Jedná se pak o složitější konstrukci, která se výrazně odráží v ceně mikroskopu.Jistou nevýhodou fázově kontrastních mikroskopů jetzv. halo efekt. Halo efekt je způsobený lámáním světla na strukturách preparátu, které mají velký rozdíl indexů lomu. Halo efekt se projevuje v podobě intenzivně zářícího rozhraní mezi objektem a okolním prostředí [3]. 2.4.3 Metoda interferenční mikroskopie Tato metoda je založena na obdobném principu jako fázově kontrastní mikroskopie. Využívá polarizovaného světla, kde každý polarizovaný paprsek se nejprve rozdělí na dva (paprsky A a B). Paprsek A volně prochází prostředím (o indexu lomu n1), zatímco paprsek B prochází pozorovaným preparátem. Při průchodu preparátem dochází k opoždění paprsku B, tedy ke změně fáze, následkem průchodu přes opticky hustší prostředí (o indexu lomu n2, kdy platí n2>n1). Oba paprsky se pak opět setkávají v objektivu, kde vzájemně interferují. Interference má za následek změnu amplitud, což vede ke změně intenzity světelného záření (jasu) a tudíž se zvýší kontrast mezi jednotlivými strukturami [4], [5]. 11
Obr. 8:
Schéma principu interferenčního mikroskopu, upraveno podle[4]
Pro interferenční mikroskopii můžeme použít zdroje záření jak monochromatické (o jedné vlnové délce z oblasti viditelného záření), tak polychromatické (o vlnových délkách viditelného spektra). V případě použití monochromatického záření pozorujeme světlé a tmavé interferenční pruhy. Při použití záření polychromatického se pak obraz preparátu jeví jako barevný [4]. Konstrukčně je interferenční mikroskop sestaven z běžného optického mikroskopu a interferometru. Polarizační filtr je umístěn mezi světelným zdrojem a kondenzorem.
Obr. 9:
Schéma principu polarizačního filtru, upraveno podle[viz. Seznam obrázků]
Interferenční mikroskopie představuje řadu výhod.
Například umožňuje detailně a
barevně pozorovat živé tkáně. Fázový posun závisí jak na indexu lomu objektu, tak na jeho tlouště. Proto jsme schopni pomocí interferenční mikroskopie realizovat kvantitativní měření. Na základě zmíněného rozdílného indexu lomu můžeme stanovit obsah vody ve tkáni, z čehož jsme schopni určit hmotnost sušiny. Interferenční mikroskopie se jako rychlá diagnostická metoda používá zejména v mikrobiologii a parazitologii[4]. 12
2.4.4 Metoda Nomarského diferenciálního interferenčního kontrastu (DIC) Princip metody Nomarského diferenciálního interferenčního kontrastu je založen na detekci fázového posunu polarizovaného světla, ke kterému dochází na dvojlomných hranolech, tzv. Wollastonova typu. Světlo vstupující do kondenzoru je nejprve lineárně polarizováno hranolem, tzv. polarizátorem a následně prochází prvním hranolovým děličem (hranol Wollastonova typu). Poté prostupuje skrz pozorovaný objekt a dále prochází objektivem. V těsné blízkosti za ohniskovou rovinou objektivu je umístěn druhý hranolový dělič. Právě tento hranolový dělič plní podstatnou funkci této optické soustavy. Dochází v něm k rozdělení původně lineárně polarizovaného světla na dvě vzájemně kolmo polarizované složky. Obě tyto složky vystupují z hranolového děliče jiným směrem. To má za následek vznik dvou identických obrazů předmětu v obrazové rovině, které jsou vůči sobě lineárně posunuty. Rozlišovací schopnost mikroskopu však není schopna takto malý fázový posun detekovat. Posledním blokem je hranol – analyzátor, svírající úhel 45O s oběma vzájemně kolmými rovinami polarizace, což umožní zobrazit případné fázové posuny, které následně interferují. Interference má za následek změnu amplitud, což vede ke změně intenzity světelného záření (jasu) a tudíž se zvýší kontrast mezi jednotlivými strukturami [3],[11]. Nomarského DIC dovede zobrazit struktury, které jsou ve světlém poli nepozorovatelné. Je to způsobeno ne na základě zvýšení rozlišení, ale zlepšením kontrastu. Oproti metodě fázového kontrastu je ta, že nedochází k tzv. halo efektu. Další výhodou je například malá hloubka ostrosti, jejíž hodnota je menší než 250 nm [3],[11].
Obr. 10:
Schéma Nomarského DIC, upraveno podle[11] 13
Obr. 11:
Prorhinotermes simplex v Nomarského diferenciálním interferenčním kontrastu[viz. Seznam obrázků]
2.4.5 Metoda Hoffmanova modulačního kontrastu Hoffmanům modulační kontrast využívá jako zdroj světla záření, které vstupuje šikmo do obdélníkové štěrbiny, která je umístěna v přední ohniskové rovině kondenzoru. V místě obrazu štěrbiny, v zadní ohniskové rovině objektivu, je vložen modulátor. Modulátor je maska lišící se v jednotlivých oblastech svou propustností. V místě obrazu obdélníkové štěrbiny je její propustnost přibližně 15 % a její tvar je shodný s tvarem původní obdélníkové štěrbiny. Z jedné strany na tuto oblast nepropustná oblast o nulové propustnosti a z druhé strany oblast o 100% propustnosti. Nepropustná oblast zaujímá méně než 10 % modulátoru. Princip metody je tedy následovný. Záření ze zdroje prochází obdélníkovou štěrbinou, prochází kondenzorem a dopadá na pozorovaný objekt (preparát). S gradientem optické tloušťky, v jednotlivých oblastech preparátu, dojde k odchýlení záření od původního směru šíření. Takto vychýlené paprsky vytváří v objektivu obraz, který bude vzhledem k oblasti 15% propustnosti, posunutý do oblasti o nulové nebo 100% propustnosti. To zapříčiní zvýšení, popřípadě snížení, jasu a zvýrazní se kontrast výsledného obrazu[11]. Výhodou této metody je možnost pozorovat objekty i na dvojlomných podložkách, například buněčné kultury v kultivačních kyvetách.
14
Obr. 12:
Princip Hoffmanova modulačního kontrastu[11]
2.4.6 Metoda fluorescenční mikroskopie Podstatou fluorescenční mikroskopie je jev, nazývající se luminiscence. Luminiscencí rozumíme schopnost vyzařovat elektromagnetické záření o delších vlnových délkách (z oblasti viditelného spektra) po předchozím dodání energie v podobě elektromagnetického záření o kratších vlnových délkách (z oblasti ultrafialového spektra). Po energetické stránce je luminiscence jev, při kterém dochází k absorpci elektromagnetického záření o vyšší energii a následně se emituje záření o energii nižší.
kde E[J] je energie fotonu, h[J.s] je Planckova konstanta, f[Hz] je frekvence, c[m.s-1] je rychlost světla ve vakuu a λ[m] je vlnová délka h = 6,626.10-34 J.s c = 3.108 m.s-1
15
Obr. 13:
Elektromagnetické spektrum[viz. Seznam obrázků]
Luminiscenci dále dělíme na fosforescenci a fluorescenci.U fluorescence emituje energii v podobě viditelného záření ten samý atom, který excitační energii ze záření UV přijal. K vyzáření této energie dochází ve velmi krátkém časovém intervalu (řádově 10-9 až 10-6 sekundy). U fosforescence dochází k přenosu emitující energie mezi atomy v krystalické mřížce, proto emitující energii vyzařuje jiný atom, než který ji přijal. Tento přenos v rámci krystalické mřížky způsobuje určité časové zpoždění, které má za následek tzv. dosvit dochází k emitování viditelného záření i po dodání excitačního záření (řádově 10-3 až 102 sekundy) [1]. Přirozenou schopnost fluorescence, tzv. primární fluorescenci nebo také autofluorescenci, mají však jen některé látky obsahující vnitřní fluorescenční barviva (například chlorofyl, který při ozáření ultrafialovým světlem vyzařuje viditelné červené světlo, celulóza, keratin, vitamín A, porfyrin, alkaloidy, některé pigmenty,…).Primární fluorescence bývá však velmi slabá. Ve fluorescenční mikroskopii se uplatňuje zejména fluorescenční barvení (sekundární fluorescence). Kdy aplikujeme na náš zkoumaný objekt, popřípadě jeho části, chemickou fluoreskující látku, tzv. fluorochrom či fluorofor, který po dopadu UV záření vyzáří světlo z viditelné oblasti spektra, které je následně v mikroskopu detekováno[3], [4]. Fluorescenční mikroskop je typem optického mikroskopu, kde zdrojem excitačního záření je ultrafialová lampa, tvořená nejčastěji vysokotlakou rtuťovou výbojkou z křehkého skla, naplněnou malým množstvím inertního plynu a rtuti, která je schopna emitovat záření v oblasti UV. Toto záření vstupuje do excitačního filtru, který selektivně propouští pouze UV
16
záření o vlnových délkách charakteristických pro aplikovaný fluorochrom. Propuštěné excitační UV záření se odráží od dichroického zrcadla a následně vstupuje přes objektiv na vyšetřovaný preparát (v tomto případě plní objektiv funkci kondenzoru). Dochází k excitaci elektronů, které při návratu do původního, energeticky výhodnějšího stavu, vyzáří přebytečnou energii v podobě fluorescenčního záření. Emitované fluorescenční záření má větší vlnovou délku než světlo excitační a šíří se všemi směry. Fluorescenční paprsky společně se zbylým odraženým excitačním zářením vstupují opět skrze objektiv a dopadají na dichroické zrcadlo, od kterého se odráží zbylé excitační paprsky zpět a prostupují skrze něj do bariérového filtru pouze fluorescenční paprsky. Bariérový filtr odfiltruje nežádoucí složky emitovaného záření a propouští pouze záření určité vlnové délky, v závislosti na použitém fluorochromu, dále do okuláru popřípadě na CCD snímač kamery [1], [3].
Obr. 14:
Stavba fluorescenčního mikroskopu, upraveno podle[1]
Dnes se s fluorescenční mikroskopie stále více užívá k diagnostickým účelům v lékařství (v imunocytologii, imunohistologii a imonucytochemii), dále pak v histologii, buněčné biologii, mikrobiologii, hematologii, genetice, aj. Přínosem této metody je skutečnost, že nám umožňují teoreticky vizualizovat jakýkoli genový produkt či organely na buněčné úrovni.
17
Pomocí fluorescenční mikroskopie jsme schopni zobrazit látky, které jsou v buňkách i ve velmi malém množství[1], [3], [4].
Fluorescenční barviva Fluorescenčními barvivy se rozumí chemické sloučeniny, které ve své molekule obsahují charakteristickou reaktivní skupinu schopnou reakce s nukleofilními skupinami NH2, SH a OH. Synonymem pro fluorescenční barviva jsou termíny fluorochromy a fluorofory. Dělí se do dvou základních skupin – vnitřní a vnější. Vnitřní flourofory jsou obsaženy v látkách, které jsou schopny primární fluorescence. Mimo uvedené v předchozím odstavci jsou to déle redukované formy NADH a NADPH, cytochromy, peroxidáza, hemoglobin, myoglobin, aj. Všechny tyto látky, vyjímaje proteinů, vyzařují fluorescenční záření v oblasti viditelného spektra. Proteiny vyzařují záření v oblasti spektra UV. Mnohem častěji se však používají vnější fluorofory. Jsou aplikovány na pozorovaný objekt a podle typu vazby, jakou se vážou na sledovanou látku, je dělíme na fluorescenční značky a fluorescenční sondy. Fluorescenční značky se vážou na sledovaný protein pomocí kovalentní vazby a slouží k jejich fluorescenčnímu značení. Zatímco fluorescenční sondy se na sledovanou strukturu navazují nekovalentní vazbou a jejich fluorescenční vlastnosti jsou proměnné. Používají se například ke studiu změn konformace bílkovin, membránového potenciálu či tloušťky membrán. Nejznámější fluorescenční značky jsou FITC (fluorescein-5-isothiokyanát) a TRITC (tetramethylrhodamin-5-isothiokyanát). Nejznámější a nejpoužívanější fluorescenční sondy jsou DAPI (4´6-diamidino2-fenylindol) a akridinová oranž (acridindiamin-N,N,N´,N´tetramethyl chlorid) [1].
Obr. 15:
A,B - fluorescein-5-isothiokyanát, C - tetramethylrhodamin-5-isothiokyanát[1]
18
Obr. 16:
A - 4´6-diamidino2-fenylindol, B - akridinová oranž[1]
2.4.7 Metoda cytospektrofotometrie Cytospektrofotometrie, též mikrospektrofotometrie, je spektrofotometrická analytická metoda založená na principu specifické absorpce světelného záření o určité vlnové délce námi pozorovanou látkou. Vychází z Lambert-Beerova zákona, který vyjadřuje vztah mezi absorpcí a koncentrací dané látky. Samotné měření realizuje za použití UV záření takové vlnové délky, kdy je absorpce pozorovanou látkou maximální. V cytospektrofotometru měříme absorpci buněk nebo jejich jednotlivých struktur přímo v mikroskopickém preparátu. Některé buněčné struktury absorbují světelné záření v oblasti viditelného spektra (plastidy, melanofory), jiné v oblasti UV (nukleové kyseliny při 260 nm, bílkoviny při 280 nm). Jako zdroj světla se používá žárovka nebo rtuťová výbojka společně s monochromátorem. Monochromátor lze nahradil filtrem, který odfiltruje nežádoucí složky světelného záření zdroje a vymezí požadovanou vlnovou délku záření. Tento odfiltrovaný světelný paprsek prochází preparátem, následně mikroskopem a dopadá na fotonásobič, který registruje výslednou intenzitu záření. Měření za použití cytospektrofotometru se provádí v temné komoře. Cytospektrofotometrie se nejčastěji používá ke stanovení koncentrace určité látky v daném místě preparátu. Příkladem může být měření obsahu DNA v buněčných jádrech[4].
19
Obr. 17:
Schéma cytospektrofotometru[viz. Seznam obrázků]
2.5 Probiotika Samotný termín probiotikum má kořeny v řečtině (z řeckého pro pro a bios život). Dnes existuje hned několik definic, kterými lze probiotika charakterizovat. Například podle FAO a WHO jsou probiotiky živé mikroorganismy, které, jsou-li přítomné (podávané) v přiměřeném množství, prospívají zdravotnímu stavu hostitele. Další definici publikoval například Miroslav Votava, kde probiotiky jsou myšleny „perorálně podávané živé mikroorganismy nebo látky sloužící k posílení zdravía růstu, mají být schopny obnovovat přirozenou mikrobiální rovnováhu a navracet zdraví“[7]. Podle [9]jsou probiotika „živé bakterie přidávané do potravin s cílem zlepšit složení a činnost mikroflóry tlustého střeva“. 2.5.1 Požadavky na probiotika Aby byl mikroorganismus považovaný za probiotikum, musí splňovat následující požadavky[7]: -
nesmí být pro hostitele patogenní
-
adheruje na střevní sliznici
-
snadno se pěstuje
-
má prokazatelně blahodárné účinky
-
tvoří metabolity užitečné pro hostitele
-
odolává HCl v žaludku a žluči v dvanáctníku 20
-
vydrží dlouho životaschopný
Podle [9]se musí přihlížet zejména ke třem okruhům kritérií, aby kmen nebo druh baktérií mohl být považován za probiotikum: -
obecná hlediska zahrnující původ, spolehlivou identifikaci, bezpečnost a odolnost vůči mutacím a stresům, které jsou vyvolány prostředím a vůči nepříznivým podmínkám, které působí na bakterie při průchodu trávicím traktem
-
technická hlediska, která zahrnují růstovou schopnost během kultivace, životnost během aplikace do potravin a jejich následné dopravy a skladování
-
funkční hlediska, což se rozumí samotný přínos pro konzumenta
2.5.2 Třídění probiotik Dnes se probiotika v humánní medicíně dělí do třech základních skupin[7],[8]: -
nepatogenní kmeny Escherichia coli
-
laktobacily a bifidobakterie
-
ostatní (nepatogenní kmen kvasinekSaccharomyces boulardi, enterokoky, laktokoky)
Nepatogenní kmeny Escherichia coli Hlavním zástupcem této skupiny je nepatogenní kmen Escherichia coli nissle, který je současně nejstarším typem farmaceuticky vyráběného probiotika. V minulosti býval tento kmen využíván v onkologii, avšak v současnosti v této oblasti převládá zájem o prebiotika. Dnes je aplikován v případě infekčních průjmů, dysbakterióz a funkčních poruch. Kmen E. coli taktéž dovede v některých případech zmírnit projevy mimodigestivních onemocnění, jako například revma, alergie, dermatologické onemocnění aj., nejedná se však o standardní léčebnou terapii. Nepatogenní kmeny E. coli jsou geneticky stabilní, což má za následek vysoký stupeň bezpečnosti. Dosud jsou známé jen dva vedlejší účinky terapie nepatogenními E. coli. A jsou to meteorismus (nadýmání) a průjmové stolice v začátku užívání [7].
Laktobacily Laktobacily jsou grampozitivní nesporulující bakterie tyčinkovitého tvaru. Jde o bakterie mléčného kvašení, které mají schopnost fermentace sacharidů na kyselinu mléčnou (laktát). Tvorba laktátu má za následek snožování hodnoty pH ve střevech, což zabraňuje expanzi mnoha patogenů (například Salmonella, Shigella). Laktobacily se aplikují při léčbě antibiotiky, při průjmech či zácpách [7], [9]. 21
Bifidobakterie Bifidobakterie
jsou
prokaryota
gram-pozitivní
přirozeně
se
vyskytující
v gastrontestinálním traktu člověka a jiných teplokrevných živočichů. Přispívají k rozkladu nestrávených polysacharidů v tračníku. Aplikují se taktéž při zažívacích problémech a posilují imunitu jedince. Podobně jako u nepatogenních kmenů E. coli jsou vedlejšími účinky konzumace bifidobakterií meteorismus a přechodné průjmy [7], [9]. Tab. 3: Mléčné bakterie používané jako probiotika pro lidskou výživu podle [8] Druhy rodu Lactobacillus L.acidophilus L.amylovorus L.crispatus L.gasseri L.johnsonii L.casei/paracasei L.plantarum L.reuteri L.rhamnosus
Druhy rodu Bifidobacterium B.adolescentis B.animalis B.bifidum B.breve B.infantis B.longum
Saccharomyces boulardi Tento nepatogenní kmen kvasinek blokuje růst patogenů, včetně Clostridia difficile. Podporuje růst laktobacilů a bifidobakterií. Současně je však na sebe i váže, což zamezuje jejich přichycení ke střevní stěně. Aplikuje se při infekčních průjmech. Vedlejší účinky mohou být nadýmání či alergická kožní přecitlivělost [7]. 2.5.3 Zdravotní přínosy Konzumace probiotik v některých případech prokazatelně zlepšuje zdravotní stav jedince. Podle [8]jsou přínosy následující: -
ustálení nebo obnovení vyváženosti mikroflóry v tlustém střevě
-
zvýšení odolnosti vůči osídlení tlustého střeva mikroorganismy, vyvolávající průjmy
-
snížení hladiny cholesterolu (celkového i LDL cholesterolu)
-
snížení tvorby bakteriálních enzymů v tlustém střevě, mající mutagenní účinky, což může vyvolat růst nádorů
-
zmírnění intolerance vůči laktóze
-
posílení imunitního systému, zvýšení vstřebávání vápníku
-
syntéza některých vitamínů
-
potlačení tvorby choroboplodných baktérií 22
3 Experimentální část V experimentální části práce jsem připravil vlastní nativní mikroskopické preparáty z běžně dostupných probiotických produktů. Tyto preparáty jsem následně pozoroval pomocí metody mikroskopie v procházejícím světle. Pomocí mikroskopu s nástavcem pro mikrofotografování jsem pořídil několik mikrofotografií.
3.1 Pozorovaný materiál Zvolil jsem běžně dostupnéprodukty, které obsahují bifidokultury. Jednalo se o produkt „Florian active“ od firmy OLMA, „Activia bílá – kysaný mléčný výrobek s bifidokulturou“ od firmy DANONE, „Acidofilní mléko - neochucené“ od firmy Mlékárna KUNÍN. Složení Florian active:mléko, ochucující složka 16 % (cukr, jahody 25 %, černý rybíz 8,5 %, zahušťovadla – modifikovaný škrob a pektin, fosforečnan vápenatý, barvivo – koncentrát z černé mrkve, aroma, probatické kultury – Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium species, Lactobacillus rhamnosus) Složení Activia bílá:mléko, mléčné bílkoviny, jogurtová kultura, Bifidus ActiRegularis Složení Acidofilní mléko: mléko, probatická kultura obsahující Lactobacillus acidophilus a další bifidobakterie
3.2 Pomůcky a přístrojové vybavení Pomůcky: nálevka, Erlenmeyerova baňka, filtrační papír, lžička, Pasteurova pipeta, Eppendorf mikrozkumavky, stojan na mikrozkumavky, podložní sklíčka, krycí sklíčka, pinzeta, preparační jehla, tampóny z buničité vaty Přístrojové vybavení: mikrocentrifuga Eppendorf minispin plus, mikroskop OLYMPUS CX21 s nástavcem OLYMPUS V-CMAD 3 JAPAN pro mikrofotografování.
23
Obr. 18:
Mikrocentrifuga Eppendorf minispin plus, nastavená na 10 200 otáček/minutu po dobu dvou minut [viz. Seznam obrázků]
Obr. 19:
mikroskop OLYMPUS CX21 s nástavcem OLYMPUS V-CMAD 3 JAPAN [viz. Seznam obrázků]
24
3.3 Příprava mikroskopických preparátů Nejprve jsem přefiltroval probatické produkty přes filtrační papír. Filtrátem z každého probatického
produktu
jsem
pomocí
Pasteurovy
pipety
naplnil
čtyři
Eppendorf
mikrozkumavky, které jsem následně odstředil v mikrocentrifuze Eppendorf minispin plus rychlostí 10 200 otáček/minutu po dobu 2 minut. Z odstředěných filtrátů jsem odebral pomocí Pasteurovy pipety vzorky, které jsem kápnul na podložní sklíčka.Pomocí preparační jehly jsem opatrně umístil krycí sklíčka tak, aby nevznikly mezi podložním a krycím sklíčkem vzduchové bublinky.
3.4 Pozorování a pořizování fotografií pozorovaných preparátů Připravené preparáty jsem pozoroval pomocí mikroskopu OLYMPUS CX21. Pozorování jsem začal pomocí objektivu s nejmenším zvětšením (10x). Nasnímání mikrofotografií nám umožnil nástavec OLYMPUS V-CMAD 3 JAPAN, který byl součástí jednoho z mikroskopů OLYMPUS CX21 v laboratoři biologie.
3.5 Výsledek V pozorovaných,
běžnědostupných
probiotických
produktech,
probiotické mikroorganizmy a vytvořil jejich mikrofotografie.
25
jsem
zpozoroval
4 Závěr V teoretické části této práce jsem vypracoval souhrnný přehled metod světelné mikroskopie, které se v současné době užívají k detekci mikroorganismů. U jednotlivých metod jsem popsal stavbu mikroskopů a stručně vysvětlil, na jakých fyzikálních principech jsou založené. Dále jsem uvedl u jednotlivých metod příklady nejčastějšího užití jednotlivých typů mikroskopu. Ve druhém bloku teoretické části jsem objasnil, co se rozumí pod pojmem probiotika a vytvořil stručný přehled jednotlivých kmenů. Cílem experimentální části bylo seznámení se s laboratorní technikou a získání souboru mikrofotografií
probiotických
mikroorganismů
v běžně
dostupných
probiotických
produktech. Zhotovil jsem několik nativních preparátů, které jsem pozoroval za použití mikroskopie v procházejícím světle. Z těchto preparátů jsem nasnímal soubor mikrofotografií, které budu v rámci bakalářské práce porovnávat s mikrofotografiemi probiotických mikroorganismů, pořízených jinými mikroskopickými metodami. Následně určíme vhodnost jednotlivých mikroskopických technik pro zobrazování probiotických kultur v laboratorní praxi.
26
5 Seznam použité literatury [1] KOČÁREK,
Eduard;
PÁNEK,
Martin;
NOVOTNÁ,
Drahuše.
Klinická
cytogenetika I. : Úvod do klinické cytogenetiky. I. Praha : Karolinum, 2006. 120 s. ISBN 80-246-1069-8. [2] VYMĚTALOVÁ, Veronika. Laboratorní cvičení z biologie. Praha : VŠCHT, 2001. 69 s. ISBN 80-7080-438-6. [3] PALEČEK, Jiří. Biologie buňky I. - Základy mikroskopické cytologie. Praha : Karolinum, 1996. 120 s. ISBN 80-7184-266-4. [4] HABROVÁ, Věra. Mikroskopická technika. I. Praha : Státní pedagogické nakladatelství, 1990. 158 s. ISBN 80-7066-149-6. [5] HEJTMÁNEK, Milan. Úvod do světelné mikroskopie. V. Olomouc : Polygrafické středisko VUP, 2001. 65 s. ISBN 80-244-0333-1. [6] VOTAVA, Miroslav. Lékařská mikrobiologie obecná. II. Brno: Neptun, 2005. 349 s. ISBN 80-86850-00-5. [7] ZBOŘIL, Vladimír. Mikroflóra trávicího traktu: Klinické souvislosti. I. Praha: GRADA, 2005. 156 s. ISBN 80-247-0584-2. [8] KALAČ, Pavel. Funkční potraviny: kroky ke zdraví. České Budějovice: DONA, 2003. 132 s. ISBN 80-7322-029-6. [9] JULÁK, Jaroslav. Úvod do lékařské bakteriologie. Praha: Karolinum, 2006. 404 s. ISBN 80-246-1270-4.
27
Internetové zdroje
[10]
Www.mikroskopy.cz. Http://www.are.cz/documents/ZAKLADNI_METODY_ SVETELNE_MIKROSKOPIE.pdf [online]. [cit. 2011-12-15].
[11]
PLÁŠEK, Jaromír. Nové metody optické mikroskopie. Pokroky matematiky,
fyziky a astronomie. Praha: Jednota českých matematiků a fyziků, 1996(41), 1-24. Dostupné z: http://dml.cz/bitstream/handle/10338.dmlcz/139719/PokrokyMFA_ 41-1996-1_1.pdf
28
