Česká společnost chemická - Odborná skupina organické, farmaceutické a bioorganické chemie Československá mikrobiologická společnost
CUKRBLIK 2000 Současná glykobiologie, chemie a biochemie sacharidů v českých zemích Souhrny přednášek a posterů
15. březen 2000 Mikrobiologický ústav AV ČR, Praha
ISBN 80-86238-07-5;
EAN 978-80-86238-07-4
Program přednášek: 8.00 - 9.00 9.00 - 9.10 Předsedající: 9.10 - 9.45 9.45 - 10.00 10.00 - 10.30 10.30 - 11.00 11.00 - 11.15 11.15 - 11.35 11.35 - 13.00 Předsedající: 13.00 - 13.35 13.35 - 14.05 14.05 - 14.20 14.20 - 14.35 14.35 - 14.50 14.50 - 15.05 15.05 - 15.20 15.20 - 16.10 Předsedající: 16.10 - 16.25 16.25 - 17.00 17.00 - 17.15 17.15 - 17.30 17.30 - 17.45 17.45 - 17.50
Registrace, vyvěšení posterů Zahájení Karel Bezouška, Richard Hrabal Kragl U.: Nanofiltration for the Purification of Carbohydrates Malá Š., Marková M., Karasová P., Králová B.: The possibility of regioselective synthesis of oligosaccharides by use of α-glucosidases with different substrate specificity. Rosenberg I.: Izopolární fosfonátové analogy nukleotidů a oligonukleotidů: současnost a perspektivy Korba T.: Stanovení mono-, di- a oligosacharidů vysoceúčinnou aniontovou chromatografií s pulzně-amperometrickou detekcí (HPAE-PAD) Sklenář J.: Analýza mono- a oligosacharidů vysokokapacitní aniontovou chromatografií (HPAEC-PAD) Černý M.: Nomenklatura sacharidů Posterová sekce, oběd Miloslav Černý, Ján Hirsch Hirsch J., Koóš M.: Aminoguanidin – potenciálny ihibítor Maillardovej reakcie Hrabal R.: Role NMR spektroskopie v chemii sacharidů Kuzma M., Weignerová L., Hušákova L., Křen V.: Několik příkladů určování struktury oligosacharidů NMR spektroskopií Tkadlecová M., Dvořáková H., Hájek A., Moravcová J.: Využití NMR pro studium stereochemie xylofuranosy s anelovaným pyrazolidinovým kruhem Havlíček J., Hamerníková M., Kefurtová Z., Pospíšilová H., Kefurt K.: Využití NMR spektroskopie při studiu konformací dideoxya trideoxyaminohexonolaktamů Kniežo L., Dvořáková H, Hrabal R.: Stereoselektivita cykloadice chirálních 1oxa-1,3-butadienů s ethylvinyletherem. Raich I., Heissigerová H.: Molekulární dynamika methyltetrofuranosidů ve vodě Přestávka, posterová sekce Jitka Moravcová, Ivan Rosenberg, Budka J., Lhoták P., Stibor I.: Calix[4]aren – monosacharidové konjugáty založené na amidické vazbě Bezouška K., Novák P., Vannucci L., Horváth O., Fišerová A., Křen V., Lindhorst T. K., Pospíšil M.: Význam lektinových receptorů v aktivaci přirozených zabíječských buněk a možnost nádorové imunoterapie Krist P., Kuzma M., Halada P., Bezouška K., Křen V.: Optimizing of Aminosugar Derivatives for Activating the NK-Cells. Rauvolfová J., Macková M., Sedmera P., Bezouška K., Křen V.: Chemoenzymatic oxidation of aminoglycosides - ways to new immunoactive compounds Bilej M., Beschin A., Köhlerová P., De Baetselier P.: Lektin-sacharidové interakce v imunitě bezobratlých Zakončení
Posterová sekce: 1. Hušáková L., Dvořáková J., Riva S., Huňková Z., Křen V.: Enzymový přenos 6-acylovaného glykosylu 2. Karasová P., Malá Š., Králová B., Russell N. J.: β-Galaktosidasa z psychrofilních mikroorganismů 3. Kniežo L., Hradilová A.: Studium syntézy (2R,5S)-2-[(2,4-difluor-5-methyl)-fenyl]-5hyroxymethylpyrrolidinu jako potencionálního virostatika 4. Křen V, Huňková Z., Weignerová : Library of fungal glycosidases and its use for glycoside synthesis1 5. Ludiková J., Raich I.: Konformační analýza methyltetrofuranosidů pomocí molekulové mechaniky 6. Matoušek P., Novák P., Havlíček V., Weignerová L., Huňková Z., Křen V., Bezouška K.: Zajímavá strukturní přestavba v rodině β-N-acetylhexosaminidas 7. Moravcová J., Polická P.: Parciální benzylace 1,2-O-isopropyliden-α-D-xylofuranosy 8. Novák P., Sklenář J., Pavlíček J., Havlíček V., Horváth O., Fišerová A. Pospíšil M.: Identifikace cílových struktur důležitých pro interakci lektinových receptorů přirozených zabíječských buněk s Mycobacterium bovis 9. Pavelová R., Ledvina M., Šaman D., Císařová I.: Study of Cyclization on Reaction of D-xylo-Hex-5-ulosonamides and Synthesis of Piperidine Analogs of Aldohexoses and Aldohexono-1,5-lactones 10. Pavlíček J., Rajnochová E., Krist P., Sopko B., Novák P., Křen V., Bezouška K.: Specifická vazba N-acetyl-D-mannosaminu umožňuje definovat sacharid rozpoznávající doménu lektinového receptoru NKR-P1 11. Plíhal O., Staňková B., Pavlíček J., Sopko B., Bezouška K.: Charakterizace disulfidových můstků a strukturní výzkum lektinové domény lymfocytárního receptoru CD69 12. Rohlenová A., Zyka D., Ledvina M., Ježek J.: Příprava analogů norAbu-MDP a norAbuGMDP modifikovaných v karboxyterminální oblasti peptidového řetězce lipofilními zbytky 13. Semeňuk T., Krist P., Kuzma M., Novák P., Bezouška K., Křen V.: Syntéza imunoaktivních glykokonjugátů na bázi aminocukrů 14. Volc J., Kubátová E., Sedmera P., Halada P, Přikrylová V., Haltrich D.: Dvojnásobná oxidace monosacharidů 15. Zarevúcka M., Vacek M., Wimmer Z., Huňková Z., Křen V.: Enzymic Hydrolysis of Alkylβ-D-glucopyranosides: Preliminary Results 16. Bambasová Š., Vymětalíková B., Kefurt K., Paleta O.: Etherifikace cukerných derivátů 2-(polyfluoralkyl)-oxiranem
Význam lektinových receptorů v aktivaci přirozených zabíječských buněk a možnost nádorové imunoterapie
Karel Bezouška1,2, Petr Novák2, Luca Vannucci3, Ondrej Horváth3, Anna Fišerová3, Vladimír Křen4, Thisbe K. Lindhorst5 a Miloslav Pospíšil3 1
Katedra biochemie PřF UK, Hlavova 8, 12840 Praha 2, 2Laboratoř molekulární architektury a
modelování proteinů,
3
Laboratoř přirozené buněčné imunity,
4
Laboratoř biotransformací,
Mikrobiologický ústav AV ČR, Vídeňská 1083, 14220 Praha 4, 5Institut of Organic Chemistry, University of Hamburg, Hamburg, SRN
Přirozené zabíječské buňky představují specifickou populaci lymfocytů schopných zabíjet nádorové nebo mikroorganismy infikované buňky. Bylo prokázáno, že zatímco zdravé buňky nejsou zabity v důsledku předání inhibujících signálů po rozpoznání jejich povrchových MHC antigenů („signály dobrého zdraví“), u nádorových buněk může být zabíjení výrazně zvýšeno po preinkubaci s liposomy nesoucími sacharidové ligandy pro lektinový aktivační receptor NKR-P1 (Obrázek, cit. 1). Vysokoafinitní ligandy prvé generace byly MHC
Cílová b.
Inhib. rec.
NKR-P1
+
Sacharid
úspěšně aplikovány pro léčbu experimentálně vyvolaných nádorů u potkanů (2). Z praktického hlediska mají však tyto přirozené ligandy řadu nevýhod (stabilita, dostupnost, cena). Sacharidové mimikry, sloučeniny, které kombinují strukturu aktivního sacharidu se syntetickou kostrou odpovědnou za adekvátní prezentaci ligandu lektinovému receptoru, představují
látky druhé generace. Jejich interakce s receptorem je tak silná, že dochází ke vzniku proteinových precipitátů (3). Tyto sloučeniny umožnily poprvé isolovat přirozenou formu receptoru NKR-P1, a staly se velmi účinnými nástroji v aktivaci zabíječských buněk a potenciaci jejich cytotoxického účinku. Sacharidové mimikry jsou v současné době testovány jako aktivátory imunitního systému s výhledem využití jejich protinádorového účinku (4). Podporováno granty od MŠMT ČR (VS96141) a GAČR (303/99/1382 a 312/98/K034). 1. Bezouška K a spol. (1994) Nature (Lond.) 372, 150-157. 2. Pospíšil M. a spol. (2000) Int.J.Oncol. 16: 267-276. 3. Bezouška K a spol. (1998) FEBS Lett. 426, 243-247. 4. Pospíšil M. a spol., rukopis v přípravě.
Lektin-sacharidové interakce v imunitě bezobratlých Martin Bilej, Alain Beschin*, Petra Köhlerová, Patrick De Baetselier* Sektor imunologie a gnotobiologie MBÚ AV ČR, Praha *Unit of Immunology, Parasitology and Ultrastructure, Flemish Interuniversity Institute for Biotechnology, VIB-VUB, Sint-Genesius Rode, Belgium
Bezobratlí se vyvíjeli několik set milionů let a často pod silným antigenním tlakem. Absence adaptivního imunitního systému založeného na protilátkách a lymfocytárních receptorech je u nich kompenzována velmi efektivními mechanismy přirozené imunity. Mezi evolučně nejstarší způsoby diskriminace cizích antigenů se řadí bezesporu lektin-sacharidové interakce. Již více než třicet let patří mezi modely srovnávací imunologie dešťovky (Oligochaeta, Annelida). Jejich coelomová tekutina vykazuje celou řadu biologických aktivit (např. proteolytická, hemolytická, antibakteriální, cytolytická), jejichž primární úlohou je udržení integrity vnitřního prostředí a obrana proti vnějším patogenům. V současné době se nám podařilo izolovat a klonovat cytolytický protein CCF, který funkčně připomíná TNF (tumor necrosis factor) savců (cytolytická aktivita namířená proti stejným nádorovým liniím, trypanolytická aktivita, produkce stejným typem buněk atd.), ale nebyla zjištěna žádná sekvenční homologie. CCF je lektin se širokou sacharidovou specificitou, který je zapojen do profenoloxidasové (PPO) aktivační kaskády. PPO aktivační kaskáda byla prokázána u řady bezobratlých a představuje jeden z klíčových obranných mechanismů. PPO kaskáda začíná rozpoznáním a vazbou mikrobiálních polysacharidů. Po této vazbě se aktivují proteinasy, které limitovanou proteolýzou štěpí inaktivní profenoloxidasu na aktivní fenoloxidasu. Fenoloxidasa pak katalyzuje o-hydroxylaci monofenolů a oxidaci difenolů na chinony, které jsou dále neenzymaticky polymerizovány na melanin. Melanin a jeho prekursory maji antibakteriální a cytostatické účinky a uplatňují se při dalších obranných procesech. CCF představuje rozpoznávací faktor, který váže mikrobiální polysacharidy a aktivuje zatím neznámým způsobem PPO kaskádu. Sacharidová specificita CCF je poměrně široká: od sacharidové složky lipopolysacharidu (O-antigen) přes β-1,3-glukany po β-1,4-GlcNAc disacharidy (N,N´-diacetylchitobiosa) a polysacharidy (chitin). Právě lektinová aktivita specifická pro N,N´-diacetylchitobiosu je příčinou trypanolytické aktivity TNF a CCF (N,N´-diacetylchitobiosa je složkou variabilního povrchového glykoproteinu trypanosom). Široká sacharidová specificita CCF je mediována rozdílnými doménami CCF: glukanasový motiv CCF je zodpovědný za vazbu LPS a β-1,3-glukanů, C-terminální část bohatá na tryptofan váže β-1,4-GlcNAc. Přestože vazebná specificita pro LPS, β-1,3-glukany a β-1,4-GlcNAc byla popsána u řady obranných proteinů bezobratlých, přítomnost různých domén v rámci jednoho proteinu je výjimečná.
Calix[4]aren – monosacharidové konjugáty založené na amidické vazbě
Jan Budka, Pavel Lhoták a Ivan Stibor Ústav organické chemie VŠCHT Praha, Technická 5, 166 28 Praha 6 Kontakt:
[email protected], tel. 2435 4280, fax. 2435 4288 Chemie calixarenů - makrocyklických oligokondenzátů p-substituovaných fenolů a formaldehydu - umožňuje design a syntézu struktur s různou velikostí a tvarem kavity a zavedení substituentů různé chemické povahy, které definují rozložení elektronových hustot v molekule. Jednou z možností je syntéza a studium látek s odlišnou lipofilitou horního a spodního okraje calixarenové kavity. Touto cestou lze získat sloučeniny, které mohou spontánně vytvořit formou self-assembly monomolekulární vrstvu pórů na fázovém rozhraní. Příspěvek popisuje syntézu
∆δ 0.1 (ppm) 0.08 O
O O H
0.06
O
H NH
O
O
NH
HO
HO OH
OH
OH OH
OH
HO
HO I
OH
0.04 0.02 0
0
0.05
0.1 c
(mol.l
-1
0.15 )
takovýchto sloučenin na bázi p-terc-butylcalix[4]arenu spojeného na spodním okraji amidickými vazbami s dvěma monosacharidovými jednotkami: Cílová sloučenina I byla rovněž využita pro studium supramolekulárních vlastností komplexace vybraných glykosidů (1-O-oktyl-α-D-glukopyranosid - Ia, 1-O-oktyl-β-D-glukopyranosid - Ib, 1-S-oktyl-β-D-thioglukopyranosid - Ic - typickou titrační křivku ukazuje graf) a self-agregace - v roztoku deuterochloroformu pomocí 1H-NMR titrací. Získané výsledky jsou v příspěvku diskutovány. Literatura: Budka, J.; Tkadlecová, M.; Lhoták, P.; Stibor, I.: Tetrahedron 2000, in press Autoři děkují: Doc. Ing. Karlu Kefurtovi, CSc. za cenné informace, Ing. Marcele Tkadlecové, CSc. za významný podíl na NMR experimentech, Grantové agentuře České republiky za podporu z grantu č. 203 97 0350.
VYUŽITÍ NMR SPEKTROSKOPIE PŘI STUDIU KONFORMACÍ DIDEOXY- A TRIDEOXYAMINOHEXONOLAKTAMŮ J. Havlíček1, M. Hamerníková2, Z. Kefurtová2, H. Pospíšilová2, K. Kefurt2 1
Ústav analytické chemie, 2Ústav chemie přírodních látek, VŠCHT, Technická 5, Praha
6, 166 28, e-mail:
[email protected],
[email protected],
[email protected] Laktamy odvozené od aminoaldonových kyselin jsou sloučeniny výhradně syntetického charakteru. Zvýšený zájem o tyto látky pramení z možnosti jejich využití jako inhibitory glykosidas [1-3]. Při interakci enzym-substrát rozhoduje prostorové uspořádání všech zúčastněných složek, a tak se stává nezbytným požadavkem pro výzkum biologické aktivity detailní znalost jejich stereochemie. Předpokládá se, že vyskytuje v
1,N
sedmičlenný latkamový
kruh se
4
C4 a C1,N konformaci za podmínky planárního uspořádání amidového segmentu
C2-C1(=O)-N-C6. H RO
H
H N
H
H
H
H OR
H
H
1:1 R=H: in CD3OD
NH
OR H
O
H
and že
6-
6-amino-3,66-amino-2,3,6-
trideoxyhexonolaktamů, potvrzuje,
4C 1,N
uspořádání
amino-2,6-dideoxy-, dideoxy-
H
R=Ac: in CDCl3
1,NC 4
konformačního
H
H
RO
O
H
Cílem této práce bylo studium
H
H
zásadní
kde
se
vliv
na
konformaci laktamového kruhu má
postavení substituentu na uhlíkovém atomu C2 [4,5]. Právě nepřítomnost hydroxylové skupiny na C-2 u 2-deoxy laktamů způsobuje vznik rovnovážné směsi konformerů
1,N
C4 a 4C1,N.
Struktura a konformace výše uvedených sloučenin byla studována pomocí 1H a
13
C NMR
spektroskopie za využití NOE a nízkoteplotních NMR experimentů.
Literatura: [1] G.W.J. Fleet, S. Petursson, A.L. Campbell, R.A. Mueller, J.R. Behling, K.A., Babiak, J.S. Ng and M.G. Scaros, J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1, (1989) 665-666. [2] H.S. Overcleft, J. van Wiltenburg and U.K. Pandit, Tetrahedron, 50 (1994) 4215-4224. [3] R. Hoos, A. Vassela, K. Rupitz and S. G. Withers, Carbohydr. Res., 298 (1997) 291-298. [4] K. Kefurt, Z. Kefurtová, P. Trška, K. Bláha, I. Frič and J.Jarý, Collect. Czech. Chem. Commun., 54 (1989) 21562170. [5] K Kefurt, J. Havlíček, M. Hamerníková, Z. Kefurtová and H. Votavová, Collect. Czech. Chem. Commun, 62 (1997) 1919-1930.
Tato práce byla podporována projektem č. LB98233, výzkumným záměrem č.
223300006 (MŠMT) a grantem č.203/97/0621 Grantové agentury ČR.
MOLEKULÁRNÍ DYNAMIKA METHYLTETROFURANOSIDŮ VE VODĚ I. Raich, H. Heissigerová
Ústav chemie přírodních látek, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 166 28 Praha 6, Česká republika (
[email protected];
[email protected]) Konformační chování všech čtyř konfiguračních izomerů methyl-D-tetrofuranosidů obecného vzorce I (R1 = H, OMe; R2 = OMe, H; R3 = H, OH, R4 = OH, H) ve vodném roztoku bylo studováno s využitím molekulární dynamiky na úrovni molekulové mechaniky. Molekuly všech titulních látek byly umístěny do krychlové periodické buňky a obklopeny vždy 207 molekulami TIP3P vody, což odpovídá koncentraci 0,25 M. Simulace o délce 51 ps byly prováděny za konstantní teploty 300 K, objemu a počtu částic (NVT). Sběru dat předcházel záhřev systému z 0 na 300 K a cca 1ps ekvilibrace. Jako výchozí konformace byly použity geometrie s minimální energii, zjištěné dříve pomocí systematického mapování konformačního prostoru1. Simulace byly prováděny s použitím programu HyperChem a silového pole MM+ (lit.2). Z nasbíraných dat byly vypočteny všechny zajímavé strukturní parametry, zastoupení jednotlivých
konformací
a
jejich
časové
návaznosti.
s experimentálními daty i předchozími výpočty.
R1
O R3
R2
R4
OH
(I)
Literatura: 1. Ludiková, J.:Diplomová práce, VŠCHT Praha, 1999. 2. Allinger N.L.: J. Am. Chem. Soc. 1977, 99, 8127. Práce je součástí řešení výzkumného záměru MŠMT č. 223300006.
Výsledky
jsou
porovnány
AMINOGUANIDÍN – POTENCIÁLNY INHIBÍTOR MAILLARDOVEJ REAKCIE
Ján Hirsch, Miroslav Koóš Chemický ústav SAV, Dúbravská cesta 9, SK-84238 Bratislava, Slovensko tel.: +421-7-59410201; fax: +421-7-59410222; e-mail:
[email protected] Maillardova reakcia resp. neenzymatické tmavnutie je komplexom degradačných reakcií, z ktorých počiatočnou je interakcia sacharidov i polysacharidov s aminokyselinami, polypeptidmi a proteínmi [1]. Tento typ reakcie prebieha a bol pozorovaný najmä v potravinách (počas ich tepelného spracovania, sušenia, skladovania, …) ale aj v živých organizmoch. Spôsobuje zmeny, ktoré sa navonok prejavujú v chuti, farbe i vôni potravín, mení ich nutričnú hodnotu a často prispieva aj k tvorbe mutagénnych látok. Zistenia, že Maillardova reakcia prebieha aj in vivo, ovplyvňuje proces starnutia a spôsobuje značné komplikácie u diabetikov, posunuli záujem o tento smer výskumu okrem potravinárstva a výživy aj do oblasti medicíny a farmácie. Počiatočné štádiá komplikovaného priebehu Maillardovej reakcie sú dostatočne známe a zahrňujú tvorbu 1-amino-1-deoxy-2-ulózových derivátov, nazývaných Amadoriho zlúčeniny. Tieto podliehajú ďalšej degradácii za vzniku nestálych dikarbonylových intermediátov, ktoré svojou vysokou reaktivitou zapríčiňujú vznik ďalších reakčných produktov v tomto procese [2]. Aminoguanidín, ako nukleofilný hydrazínový derivát sa ukázal byť potenciálnym inhibítorom Maillardovej reakcie za podmienok prebiehajúcich in vivo [3]. Navyše, jedná sa o netoxickú látku, ktorá je v súčasnosti testovaná ako možný preparát pri liečení diabetických ochorení. V tomto príspevku bude prezentovaná príprava niekoľkých dikarbonylových intermediátov, ktoré vznikajú zo sacharidov, či už v priebehu Maillardovej reakcie alebo pri ich spontánnej degradácii za fyziologických podmienok, ich reakcia s aminogaunidínom a charakterizácia konečných produktov – 5- a 6-substituovaných 3-aminotriazínových derivátov [4–6]. Zároveň bude tiež diskutovaná reakcia D-glukózy s aminoguanidínom [7] ako aj degradácia niektorých dikarbonylových medziproduktov, vznikajúcich degradáciou Amadoriho zlúčenín, v prítomnosti aminoguanidínu [8]. Poďakovanie. Výskum bol finančne podporený Vedeckou grantovou agentúrou (VEGA, SAV, Bratislava), číslo grantu 2/4144 a 2/7144. Literatúra: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
Fujamaki M., Naniki M., Kato H.: Amino - Carbonyl Reactions in Food and Biological Systems. (Kadansha, Editor), Tokyo, Vol. 13 (1985) Kato H., Cho R. K., Okitani A., Hirase F.: Agr. Biol. Chem., 51, 683 (1987) Brownlee M., Vlassara H., Kosney A., Ulrich P., Cerami A.: Science, 232, 1629 (1986) Hirsch J., Petráková E., Feather M. S.: Carbohydr. Res., 232, 125 (1992) Hirsch J., Barnes C. L., Feather M. S.: J. Carbohydr. Chem., 11, 891 (1992) Hirsch J., Petráková E., Feather M. S.: J. Carbohydr. Chem., 14, 1179 (1995) Hirsch J., Petráková E., Feather M. S., Barnes C. L.: Carbohydr. Res., 267, 17 (1995) Hirsch J., Mossine V. V., Feather M. S.: Carbohydr. Res., 273, 171 (1995)
Role NMR spektroskopie v chemii sacharidů.
Richard Hrabal NMR laboratoř, Vysoká škola chemicko-technologická, Technická 5, 166 28 Praha 6, tel. 02-3114782, e-mail adresa:
[email protected]
NMR spektroskopie představuje v dnešní době nenahraditelný analytický nástroj pro výzkum jak nízkomolekulárních mono- a oligosacharidů, tak i složitějších polysacharidů. Její výhoda oproti jiným spektroskopickým metodám spočívá ve vysoké specifitě NMR signálů z hlediska místa jejich původu ve zkoumané molekule, ale také např. ve faktu, že analyzovaný vzorek není procesem analýzy destruován. Tyto výhody spolu s nebývalým rozvojem instrumentace a metodiky řadí NMR spektroskopii na jedno z nejpřednějších míst ve výběru analytických metod vhodných ke zkoumání sacharidů. V příspěvku bude prezentován současný stav moderních NMR metod s důrazem na získání NMR parametrů, které charakterizují různé vlastnosti sacharidů (chemický posun, interakční konstanta, relaxační vlastnosti....). Na příkladech bude ukázán rozdíl mezi jedno- a multidimensionálními verzemi téhož experimentu (COSY, TOCSY, NOESY...), klasickou a inverzní detekcí (H,C-COSY versus HMQC, HSQC) nebo experimenty pracujícími s relaxačními vlastnostmi 1H jader (NOESY versus ROESY). Zmíněny budou velmi moderní, tzv. zřetězené experimenty např. kombinace COSY-NOESY, TOCSY-NOESY... Závěrečná část bude věnována řešení některých problémů z oblasti chemie sacharidů pomocí sofistikovaných metod NMR spektroskopie.
STUDIUM SYNTÉZY (2R,5S)-2-[(2,4-DIFLUOR-5-METHYL)-FENYL]-5HYROXYMETHYLPYRROLIDINU JAKO POTENCIONÁLNÍHO VIROSTATIKA Ladislav Kniežo*, Adéla Hradilová Ústav chemie přírodních látek, Vysoká škola chemicko-technologická, Technická 5, 166 28 Praha 6, e-mail:
[email protected] Přírodní C-nukleosidy a jejich syntetická analoga tvoří významnou skupinu organických látek s výraznými protivirovými a cytostatickými účinky. Nedávno bylo pozorováno1, že i aromatický C-nukleosid 1 by mohl vykazovat podobné účinky, protože je schopný nahrazovat při enzymatické syntéza DNA nukleosid thymidin. Tato skutečnost nás vedla k studiu přípravy nukleosidového analogu 2, kde „bázi” tvoří difluortoluen a v cukerné části nukleosidu je jednak atom kyslíku nahrazen dusíkem a jednak polohy 3 a 4 neobsahují hydroxylové skupiny. Pro přípravu sloučeniny 3, která slouží jako modelová látka, jsme vyzkoušeli dvě odlišné cesty. První postup, který jsme vybrali k studiu reakčních kroků, vychází z aminokyseliny Dserinu. Z něj jsme připravili methylester, amino a hydroxy skupiny jsme chránili tercbutyloxykarbonylem a dimethoxypropanem. Methylesterovou skupinu jsme v dalším reakčním kroku redukovali na alkohol a Swernovým způsobem oxidovali na aldehyd2. Získaný aldehyd jsme podrobili Wittigově reakci s fenylkarboxymethylen-trifenylfosforanem3. Po hydrogenaci dvojné vazby jsme provedli uzavření kruhu odstraněním chránících skupin a dostali tak sloučeninu 4, která je prekursorem sloučeniny 3. Druhý způsob syntézy látky 3 vychází z pyroglutamové kyseliny. Tu jsme v prvním reakčním kroku převedli na ester a amino skupinu jsme chránili terc-butyloxykarbonylem. Z benzylbromidu jsme připravili Grignardovo činidlo a to jsme adovali na karbonylovou skupinu esteru. Odstraněním chránící skupiny došlo k vytvoření cyklické sloučeniny 5, jejíž redukcí lze rovněž získat sloučeninu 3.
F
F
H3C HO
H3C
O
F
HO
H N
F
HO
H N
HO
N
EtOOC
N
OH
1
2
3
4
5
Práce byla provedena v rámci řešení výzkumného záměru MŠMT č. 223300006 Literatura : 1. Chaudhuri C. N., Ren X.-F., Kool E. T.: Synlett 1997, 341 2. Dondoni A., Perone D.: Synthesis 1997, 5, 527 3. Aitken R. A., Atherton J. I.: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1994, 10, 1281
STANOVENÍ MONO-, DI- A OLIGOSACHARIDŮ VYSOCEÚČINNOU ANIONTOVOU CHROMATOGRAFIÍ S PULZNĚ-AMPEROMETRICKOU DETEKCÍ (HPAE-PAD) Tomáš Korba, Amedis Praha Sacharidy jsou za vysokého pH disociovány a lze je tedy separovat na anexových kolonách. Jejich pKa závisí na strukturních vlastnostech molekul. Kolony Dionex CarboPac jsou schopny rozlišit jednotlivé mono-, di- a oligosacharidy podle jejich rozvětvení, izomerace vazeb, anomerace a sialylace. Mobilní fází při separaci mono-a disacharidů je hydroxid sodný nebo draselný, při analýze oligosacharidů se kombinuje v gradientu s octanem sodným. Tento separační systém je velmi selektivní a balastní látky z matrice stanovení neruší. Pulzně-amperometrická detekce umožňuje selektivní a vysoce citlivé stanovení. Diociované sacharidy jsou na povrchu zlaté elektrody oxidovány. Pulzní režim slouží k očištění povrchu od zplodin reakce a obnovení čistého povrchu pro detekci sacharidů. Odezvy analytů jsou pak dlouhodobě vysoce stabilní. Mez detekce se pohybuje v jednotkách pikomolů. HPAE-PAD je možné využít také jako semi-preparativní techniku. Přítomnost sodných iontů z eluentu v odebraných frakcí je však nežádoucí z důvodu možného rozkladu sacharidů. Odsolení eluentu se provádí membránovým odsolovačem (CMD) zapojeným mezi detektor a sběrač frakcí. CMD nahrazuje sodné ionty v eluentu vodíkovými, takže sacharidy jsou přítomny v odebraných frakcích v prostředí vody nebo kyseliny octové. HPAE-PAD se například využívá v následujících aplikacích: analýza mono-, di- a oligosacharidů v hydrolyzátech bílkovin, stanovení sacharidů ve fermentačních
roztocích,
potravinách,
léčivech,
identifikace
falšování
džusů
z oligosacharidového profilu, sledování autenticity instantní kávy podle zastoupení mono- a disacharidů, stanovení zeměpisného původu potravinářských přísad HPAE-PAD lze také použít pro přímé stanovení aminokyselin bez derivatizace.
NANOFILTRATION FOR THE PURIFICATION OF CARBOHYDRATES Udo Kragl Rostock University, Department of Chemistry, D-18051 Rostock, Germany Tel. +49-381-498-1837; Fax +49-381-498-1763; Email
[email protected] During synthesis and purification of carbohydrates, often large amounts of salts have to be removed. On a small scale this can be effectively done by gel filtration. For purification using ion exchange chromatography volatile buffers may be used. Sometimes these techniques will not be successful or simply not suitable for a scale up. If the properties of the compounds to be separated are suitable (eg size, charge, hydrophobicity) membrane processes may be used for selective removal of a compound [1]. For the desalting of carbohydrates modern nanofiltration membranes can be used allowing the use non-volatile salt of almost any concentration. A typical purification protocol is outlined below. In the examples presented, sugar nucleotides such as GDP-Man or CMP-Neu5Ac have been separated form salts such as Na-formate or LiCl [2,3].
ultrafiltration
anion exchange chromatography on Dowex 1x2 -elution with LiCl gradient
diafiltration with H2O with nanofiltration membrane
lyophilisation
References 1. M. Mulder, Basic Principles of Membrane Technology, Kluwer Acad. Publ., 1996. 2. S. Fey, L. Elling, U. Kragl, Carbohydr. Res. 305, 475-481 (1997). 3. G. Dudziak, S. Fey, L. Hasbach, U. Kragl, J. Carbohydr. Chem. 18, 41-49 (1999).
OPTIMIZING OF AMINOSUGAR DERIVATIVES FOR ACTIVATING THE NKCELLS. Pavel Krist, Marek Kuzma, Petr Halada, Karel Bezouška, Vladimír Křen Institute of Microbiology, Laboratory of Biotransformation, Academy of the Czech Republic, Vídeňská 1083, CZ-142 20 Prague, Czech Republic
of
Sciences
http://www.biomed.cas.cz/mbu/biotrans Specific interactions between carbohydrate structures and proteins are of fundamental importance for cell-cell adhesion. Suitable glycomimetics that are able to compete or even perform better than the naturally occurring carbohydrate ligands are needed for the elucidation and manipulation of carbohydrate-protein interaction. For this purpose the clustering of glycosides proved to be advantageous in many cases. Multipresentation of specific sugar epitopes in one molecule can result in remarkably increased affinities in the respective adhesion systems examined. The first step of our work was to prepare sugar derivatives proper for construction more sophisticated molecules with required features. With these molecules we have explored the NKR-P1 protein, activating receptor of NK cells of the lectine type, which have two active sites. NK cells participate in antitumor and antimicrobial defence of the immunity system. The results shows that not only the type of sugar moiety plays an important role in the NK-cells activating process, but there is a big dependence in the bond-type of the sugar moiety to the spacer, the spacer length and the type and orientation of substituent on the C-1 and C-2 position. Microbial glycosidases will be used for further extension of the appropriate ligands for the NKR-P1 protein. OH R2a O
HO
H N
S
configuration
R2e
R2a
gluco-
NHAc
H
manno-
H
NHAc
HO R1e
N H
( CH2 )n
H OH a R2 O
HO HO
N S
N H
R2e
n = 2, 4, 6, 8, 10 Acknowledgement
This work was supported by the Grant (grant No. 303/99/1382) and Volkswagen Foundation.
Agency
of
the
Czech
Republic
Library of fungal glycosidases and its use for glycoside synthesis1 V. Křen, Z. Huňková, L. Weignerová Institute of Microbiology, Laboratory of Biotransformation, Academy of Sciences of the Czech Republic, Vídeňská 1083, 142 20 Prague 4, Czech Republic, e-mail:
[email protected] About 300 fungal strains from public collections (Culture Collection of Fungi, Charles University, Prague, (CCF) and Culture Collection of the Institute of Microbiology, Prague (CCIM)) were screened for a set of extracellular glycosidases, e.g., β-N-acetylhexosaminidase, αgalactosidase, α- and β-mannosidases and α-L-fucosidase. Although many glycosidases were produced in most of the strains constitutively in a sufficient activity (ca 0.1 - 1 U/mg prot.) it was necessary to reach high specific activity of the respective glycosidase void of other contaminating glycosidase activities. This was achieved by the use of specific inductors that increased selectively production of the desired glycosidase whereas other activities were suppressed. Controlled precipitation by ammonium sulphate was then sufficient purification step for obtaining pure enzyme preparations suitable for most synthetic purposes. Over 60 β-N-acetylhexosaminidases were prepared using chitin hydrolysate or Nacetylglucosamine and some other inductors in specific activity ranging from 10 to 70 U/mg protein. Unique β-N-acetylhexosaminidase with the β-GalNAcase/β-GlcNAcase rate exceeding 2 was found in Penicillium oxalicum. 40 α-Galactosidases were prepared employing melibiose or raffinose as inductors from strains belonging mostly to genera Aspergilus, Penicillium and Fusarium, 6-deoxyglucose was effective in some Talaromyces strains (spec. act. 5 - 50 U/mg prot.). 15 α-mannosidases (~ 0.5 U/mg prot.), 5 β-mannosidases (0.1 U/mg prot.), and 3 α-Lfucosidases (6 - 100 U/mg prot.) were prepared. For mannosidases only weak inductors were found, α-L-fucosidase was induced in some strains by 6-deoxyglucose. Glycosidases from various strains exhibit different biochemical and synthetic activities. Number of examples will be given on the particular use of the enzyme library in synthesis of β-hexosaminides,
α-galactosides,
α-L-fucosides
and
some
other
glycosides
under
transglycosylation or reversed glycosylation mode. Potential use of such an enzyme library in αgalactobiose regioisomers will be demonstrated. 1. Supported by Grant Agency of the Czech Republic, grant No. 303/99/1382.
NĚKOLIK PŘÍKLADŮ URČOVÁNÍ STRUKTURY OLIGOSACHARIDŮ NMR SPEKTROSKOPIÍ Marek Kuzma, Lenka Weignerová, Lucie Hušákova, Vladimír Křen Mikrobiologický ústav AV ČR, Vídeňská 1083, 142 20 Praha a Dirk Mampe Institute of Organic Chemistry, University of Hamburg, Matrin-Luther-King Platz 6, D20146 Hamburg, BRD
Bude probráno několik příkladů úspěšného vyřešení struktury di- a trisacharidů vzniklých enzymatickou reakcí nebo chemickou syntézou pomocí NMR spektroskopie. Úspěšná strategie zahrnovala vedle použití 2D NMR (J-resolved, gCOSY, TOCSY, HMQC, HMBC) i selektivní jednorozměrné metody jako 1D-NOE a 1D-TOCSY. K určení anomerních konfigurací bylo vedle J(H-1, H-2) využito i
1
J(C-1,H-1) získávaných z kaplovaných HMQC experimentů. Jako
nejspolehlivější prostředek k určení místa připojení cukrů se osvědčila HMBC, resp. její gradientová varianta. Použití serií 1D-TOCSY experimentů dovoluje získat podstatně větší soubor chemických posunů a interakčních konstant. Modernizace výpočetního systému NMR spektrometru byla podporována grantem LB 98233 (MŠMT)
KONFORMAČNÍ ANALÝZA METHYLTETROFURANOSIDŮ POMOCÍ MOLEKULOVÉ MECHANIKY J. Ludiková, I. Raich Ústav chemie přírodních látek, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, 166 28 Praha 6, Česká republika, (
[email protected];
[email protected]) Práce se zabývá simulací konformačního chování vybraných modelových monosacharidů s furanosovým kruhem na úrovni molekulové mechaniky. Pro všechny čtyři konfigurační isomery v řadě methyl-D-tetrofuranosidů obecného vzorce I (R1 = H, OMe; R2 = OMe, H; R3 = H, OH, R4 = OH, H) byly vypočteny energetické konformační profily, znázorněné ve formě 3D konturových map v polárních konformačních souřadnicích (fázový úhel pseudorotace, amplituda zprohýbání) podle Cremera a Poplea. Problém lokálních
minim
při
optimalizacích
byl
řešen
s využitím
systematického
mapování
konformačního prostoru, vycházejícího z 23814 vstupních konformací s částečně fixovanou geometrií pro každou konfiguraci. Pro optimalizace byla využita silová pole MM3(92)/MM3(92) a CFF91/Discover. Energetické údaje jednotlivých konformerů byly použity nejprve k výběru nejlepšího rotameru při určité konformaci furanosového kruhu, dále k výpočtu Boltzmannových populací a následně k výpočtu interakčních konstant v NMR spektrech. V případě MM3(92) byly provedeny i optimalizace rotamerů s nejnižší energií, jejichž vstupní geometrie byly úplně relaxované. Obdobné výpočty v silovém poli MM3(96) byly provedeny rovněž pro methyl-5deoxy-α-D-arabinofuranosid (II) a konformační chování je porovnáno s nižším homologem, tj. methyl-α-D-threofuranosidem. Kritériem správnosti použitých modelovacích metod byla konfrontace s experimentálními NMR daty studovaných látek. R1
O R3 R4
OH
(I)
CH3
O HO
R2 OH
( II )
Práce je součástí řešení výzkumného záměru MŠMT č. 223300006.
OCH3
The possibility of regioselective synthesis of oligosaccharides by use of α-glucosidases with different substrate specificity. Šárka Malá*, Michaela Marková, Petra Karasová, Blanka Králová Department of Biochemistry and Microbiology, Institute of Chemical Technology, Prague, Czech Republic e-mail:
[email protected] Many glycosidases that were primarily known to catalyze hydrolysis of oligosaccharides were also found to catalyze transglycosylation reaction [1]. However, regioselectivity of these enzymes during this reaction is usually low in comparison with glycosyltransferases. Concerning the control of the regioselectivity of the glycosidase catalysed synthesis of disaccharides, it has been observed that structural modifications of the sugar acceptor induce significant changes in the ratio of the regioisomers obtained. Besides, the regioselectivity of these reactions is very dependent on the source of the enzyme [2,3]. α-Glucosidases from two microbial sources, Bacillus stearothermophilus and brewer’s yeast, have been used to catalyze the transglycosylation reaction and comparative study was carried out to determine the regioselectivity of this reaction. Structure analysis of transglycosylation products by means of GC-MS and NMR revealed close correlation between hydrolytic substrate specificity and regioselectivity of transglycosylation reaction. Other possible feature of these α-glucosidases can be deduced from the experiment, where four different monosaccharides were employed as acceptors in transglycosylation reaction.
[1] M.L. Sinnott, Chem. Rev., 90 (1990) 1171-1202. [2] A. Ismail, M.Ghoul, Biotechnol. Letts. 18 (1996) 1199-1204. [3] J.H.Yoon, K. Ajisaka, Carbohydr. Res. 292 (1996) 153-163.
Zajímavá strukturní přestavba v rodině β-N-acetylhexosaminidas Petr Matoušek1,2, Petr Novák2, Vladimír Havlíček3, Lenka Weignerová4, Zdena Huňková4, Vladimír Křen4 a Karel Bezouška1,2 1
Katedra biochemie PřF UK, Hlavova 8, 12840 Praha 2,2Laboratoř molekulární architek-tury a
modelování
proteinů,
3
Laboratoř
matematických
a
fyzikálních
metod,
4
Laboratoř
biotransformací, Mikrobiologický ústav AV ČR, Vídeňská 1083, 14220 Praha 4. E-mail:
[email protected] β-N-acetylhexosaminidasa z Aspergillus oryzae je užitečným nástrojem v enzymových syntézách oligosachardů, protože poskytuje výborné výtěžky v transglykosylačních reakcích (1). Bylo zjištěno, že biosyntéza tohoto enzymu je indukovatelná až třicetinásobně přidáním směsi chitooligomerů (hydrolyzátu chitinu) do kultivačního média (2). Enzym byl vyčištěn do elektroforeticky homogenní podoby kombinací hydrofobní chromatografie na fenyl-Sepharose, ionexové chromatografie na koloně MonoQ a chromatografie na obrácené fázi (kolona Vydac C4). β-hexosaminidasa byla deglykosylována, a podrobena chemické a strukturní analýze. Kvantitativní aminokyselinová analysa prokázala hojný výskyt asparaginu, valinu a neobvykle vysoký obsah methioninu. N-terminální analýza Edmanovým odbouráváním umožnila stanovit sekvenci 44 koncových aminokyselin, a poskytla informaci pro návrh forward primeru pro klonování tohoto enzymu. Další sekvenční informace byla získána po chemické nebo enzymové fragmentaci (CNBr, trypsin), separaci vzniklých peptidových štěpů, a sekvenční analýze Edmanovým odbouráváním a hmotovou spektrometrií (LC-MS/MS na přístroji LCQDeca). Získaná sekvenační data umožnila zařadit studovaný enzym do skupiny 20 dle mezinárodní klasifikace glykosidas, a odhalila zajímavou strukturní přestavbu v molekule těchto mikrobiálních enzymů (viz.schéma). Sekvence interního peptidu konzervovaného u nejméně třech různých hexosaminidas bude použita pro návrh reverzního primeru pro získání DNA sondy metodou RT-PCR. Podporováno grantem VS96141 od MŠMT ČR, a grantem 303/99/1382 od GAČR. 1. Křen a spol. (1994) Biocatalysis 10, 181-193. 2. Huňková a spol. (1996) Biotechnol. Lett. 18, 725-730. Reverse primer
Forward primer
N-TERMINÁLNÍ A. oryzae ASNSLQYVNVQVKDIEADLQHGVDNSYT
INTERNÍ VGVXPLPAPREISWGSXGP
INTERNÍ GVRVIPEIDM
28 PODOBNOST 70 %
PODOBNOST 78%
P. chryso- VQVNPLPAPRNITWGSSGP APSGIHNVDVHVVDNDADLQYGVDESYT genum 19 99 126 INTERNÍ N-TERMINÁLNÍ
PODOBN. 99%
GVRVIPEVDM
258
267
IDENTITA
C. albicans
GVRVIPEIDM
247
256
Identifikace cílových struktur důležitých pro interakci lektinových receptorů přirozených zabíječských buněk s Mycobacterium bovis Petr Novák1,2, Jan Sklenář2, Jiří Pavlíček1, Vladimír Havlíček3, Ondrej Horváth4, Anna Fišerová4 a Miloslav Pospíšil4 1
Katedra biochemie PřF UK, Hlavova 8, 12840 Praha 2,2Laboratoř molekulární architek-tury a
modelování proteinů, 3Laboratoř matematických a fyzikálních metod, 4Laboratoř přirozené buněčné imunity, Mikrobiologický ústav AV ČR, Vídeňská 1083, 14220 Praha 4. E-mail:
[email protected] V projektu podporovaném EU hledá konsorcium laboratoří zahrnujících též naše pracoviště imunologicky důležité proteiny původce tuberkulosy (onemocnění, které se v některých zemích znovu nebezpečně šíří) vhodné pro přípravu subjednotkové vakcíny. Jednou z důležitých buněk schopných účinně zasáhnout při mykobakteriálních infekcích je přirozená zabíječská buňka, ale přesný mechanismus jejího působení není znám. Předpokládá se, že bakterie nebo jejich produkty interagují s povrchovými receptory přirozené zabíječské buňky, což vede k její aktivaci a zahájení produkce důležitých aktivátorů makrofágového systému (interferon-γ, interleukin-12). Zabývali jsme se proto identifikací mykobakteriálních komponent interagujících s dvěma významnými aktivačními receptory přirozených zabíječských buněk, antigeny CD69 a CD161. Byly použity 4 buněčné frakce isolované z M. bovis na Univerzitě v Pise: buněčný filtrát (CF), buněčné stěny (CW), frakce plasmatických membrán (MEM) a frakce cytosolární (CYT). V destičkovém inhibičním testu byla nejaktivnější frakce CYT (viz. obrázek s výsledky pro antigen CD69, výsledky pro antigen CD161 byly obdobné). Gelovou filtrací na koloně Superdexu 30 byly frakce separovány, a bylo zjištěno, že veškeré aktivní komponenty jsou makromolekulární. Pomocí afinitních technik a hmotové spektrometrie byly látky interagující s CD69 identifikovány jako chaperonin 2 o velikosti 60 kDa a polysacharid neznámé identity. CD161 se naopak vázal na dosud neidentifikované proteiny o velikosti 30 a 10 kDa. V současné době se snažíme určit povahu polysacharidového ligandu pro CD69, popřípadě extrahovat další sacharidové ligandy mírnou kyselou hydrolysou buněčných stěn M. bovis. Podporováno granty VS96141 od MŠMT ČR, a projektem 4. rámcového programu EU.
120
% inhibition
100 80 60
CYT
CF
40 20 0 0.001
CW MEM
0.01
0.1
Concentration of inhibitors [mg/ml]
1
STUDY OF CYCLIZATION REACTION OF D-xylo-HEX-5-ULOSONAMIDES AND SYNTHESIS OF PIPERIDINE ANALOGS OF ALDOHEXOSES AND ALDOHEXONO-1,5-LACTONES Radka PAVELOVÁa1, Miroslav LEDVINAa2, David ŠAMANa3 and Ivana CÍSAŘOVÁb a
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic,
Flemingovo nám. 2, 166 10 Prague 6, Czech Republic; e-mail:
1
[email protected],
2
[email protected],
[email protected]; bDepartment of Inorganic Chemistry, Charles
University, 124 40 Prague 2, Czech Republic; e-mail:
[email protected] Piperidine analogs of sugars can affect glycosylation or catabolism of glycoproteins, or inhibit the recognition of specific carbohydrates. This makes them interesting as potential therapeutics in the treatment of some metabolic disorders1,2. Transformations of suitably protected lactones of aldonic acids seemed to be an interesting tool for the synthesis of compounds possessing azasugar structure3,4. We focused our attention on the key step of this approach, i.e., reductive cyclization of D-hex-5-ulosonamides into 5-amino-5-deoxy-D-hexono1,5-lactams. We followed the influence of reaction conditions on the reaction course and population of products, with particular attention to the possible side reactions, such as epimerization and reduction of D-hex-5-ulosonamides, and their direct conversion into target 5amino-5-deoxy-D-hexopyranoses and 1,5-dideoxy-1,5-imino-D-hexitols and their N-substituted analogs. Reductive cyclization of 1a to D-glucono-1,5-lactam 2 or to 1,5-imino-D-glucitol 3 with NaBH4 or NaBH3CN under conditions of acid catalysis was studied. It was found that the population of arising products can be significantly influenced by the choice of reaction conditions. Target compounds 2 and 3 can be obtained in satisfactory yields. An unexpected conversion of 1a and 1b to 2,3,4,6-tetra-O-benzyl-idono-1,5-lactone (4) with atypical boat conformation was also observed. Its relative configuration and conformation was determined using X-ray analysis. O C NHR OBn BnO OBn O OBn
1a R = H 1b R = Bn
1. 2. 3. 4.
OBn BnO BnO
BnO
OBn NH
BnO
BnO BnO O
NH O BnO BnO
2
O
OBn
3
Winchester B., Fleet G.W.J.: Glycobiology 1992, 2, 199. Witczak Z.J.: Curr. Med. Chem. 1995, 1, 392. Overkleeft H.S., Wiltenburg J., Pandit U.K.: Tetrahedron 1994, 50, 4215. Hoos R., Naughton A.B., Vasella A.: Helv. Chim. Acta 1993, 76, 1802.
4
OBn
Specifická vazba N-acetyl-D-mannosaminu umožňuje definovat sacharid rozpoznávající doménu lektinového receptoru NKR-P1 Jiří Pavlíček1, Eva Rajnochová2, Pavel Krist2, Bruno Sopko1, Petr Novák3, Vladimír Křen2 a Karel Bezouška1,3 1
Katedra biochemie PřF UK, Hlavova 8, 12840 Praha 2, 2Laboratoř biotransformací a
3
Laboratoř molekulární architektury a modelování proteinů, Mikrobiolgický ústav AV ČR,
Vídeňská 1083, 14220 Praha 4.
[email protected] Efektorové funkce přirozených zabíječských buněk, specializované subpopu-lace lymfocytů důležité pro svou schopnost zabíjet nádorové a virově infikované buňky,jsou aktivovány receptory lektinové, integrinové a imunoglobulinové rodiny. Funkčně důležitým příkladem receptoru patřícího do rodiny živočišných lektinů C-typu je antigen NKR-P1A potkana, který je důležitým aktivačním receptorem. V naší laboratoři se zabýváme molekulární stavbou a vyhledáváním sacharidových ligandů pro tento receptor (1,2). Schopnost vázat sacharid se soustřeďuje do monomerní proteinové domény o velikosti přibližně sta aminokyselin, která má sekvenční homologii s analogickými doménami lektinů C-typu. Problémem při vyhledávání funkčně aktivní sacharid vázající domény v proteinu NKR-P1 je skutečnost, že její interakce s běžnými sacharidovými ligandy je na hranici detekovatelnosti. Proto bylo prováděno systematické sledování aktivity jednotlivých N-acetyl-D-hexosaminů jako monosacharidových ligandů v inhibičním testu s použitím rekombinantního proteinu NKR391, o němž bylo prokázáno,že představuje nejmenší segment proteinu NKR-P1A s biologickou aktivitou. Nejlepším monosacharidovým inhibitorem vazby tohoto proteinu na vysokoafinitní ligand, GlcNAc23BSA byl N-acetyl-D-mannosamin, jehož aktivita byla téměř desetkrát vyšší než u klasického monosacharidového ligandu N-acetyl-D-glukosaminu. S využitím N-acetylD-mannosaminu jako nejaktivnějšího inhibitoru byla zkoušena v destičkovém inhibičním testu vazebná aktivita řady delečních proteinových mutantů zahrnujících oblast lektinové domény receptoru NKR-P1. Bylo zjištěno, že pro vazbu sacharidu je třeba zachování nejméně té části proteinu obsahující cystein122 – lysin215. Oba disulfidové můstky obsažené v tomto proteinu jsou také nezbytné, záměna cysteinu122 za alanin vede k výraznému snížení obsahu α-helixu a ztrátě sacharidové vazebné aktivity. Podporováno granty od MŠMT ČR (VS96141) a GAČR (303/99/1382 a 312/98/K034). 1. 2.
Bezouška K. a spol. /1994/ J.Biol.Chem.269, 16945. Pavlíček J. a spol. /1999/ Plakátové sdělení, Eurocarb X, Galway, Irsko.
PARCIÁLNÍ BENZYLACE 1,2-O-ISOPROPYLIDEN-α-D-XYLOFURANOSY JITKA MORAVCOVÁ a PETRA POLICKÁ Ústav chemie přírodních látek, VŠCHT, Technická 5, 166 28 Praha, e-mail:
[email protected] Částečně benzylované deriváty cukrů se s výhodou používají jako klíčové intermediáty v řadě synthes. Benzylová chránící skupina má řadu nepřehlédnutelných výhod: je stabilní v bázickém i kyselém prostředí, nepodléhá migraci a může být selektivně odstraněna bez současného štěpení glykosidické vazby. Zatímco selektivita benzylace hexopyranos a hexopyranosidů byla v minulosti detailně studována, podobné údaje o regioselektivitě této reakce na furanosovém kruhu prozatím chybí. Zabývaly jsme se parciální benzylací 1,2-O-isopropyliden-α-D-xylofuranosy (1), protože jsme potřebovaly větší množství 5-O-benzyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-xylofuranosy (2). Výchozím bodem byl publikovaný postup[1], ve kterém ale nebyl uveden ani výtěžek ani poměr OR1 O OR2 O O
R1 1 H 2 Bn 3 H
R2 H H Bn
vznikajících
isomerů,
5-O-benzylderivátu
2
a
3-O-
benzylderivátu 3. Nukleofilní substituce byla prováděna benzylbromidem
a
benzylchloridem
v tetrahydrofuranu
(THF), N,N-dimethylformamidu, acetonitrilu nebo dioxanu za katalýzy
hydridem
sodným,
hydridem
vápenatým,
methanolátem sodným, t-butoxidem sodným a oxidem stříbrným a při dvou teplotách (25 a –20 o
C). Pouze v jediném případě (benzylbromid, CaH2, THF) vznikal žádaný 5-O-benzylether 2, ale
reakce byla velice pomalá, pro preparativní účely prakticky nepoužitelná. Ve všech ostatních případech byl dominantním produktem 3-O-benzylether 2, který kupodivu nebyl doposud popsán. Důvodem zvýšené nukleofility kyslíku hydroxylové skupiny v poloze 3 může být silná intramolekulární vodíková vazba v molekule furanosy 1 prokázaná IČ spektrem (ν = 3487 cm-1). K přípravě 5-O-benzylderivátu 2 je tedy nutno použít alternativní postupy buď z 3,5anhydroderivátu látky 1[2] (výtěžek 63 %) nebo přes stanylaci[3] furanosy 1 (výtěžek 65 %). Ani v těchto případech se ale nelze vyhnout velice obtížné separaci derivátů 2 a 3. [1] Yadav J. S., Chander M. C., Rao C. S.: Tetrahedron Lett. 1989, 30, 5455. [2] Martin P., Conan J. Y., Harmouch B.: Chem. Lett. 1994, 141. [3] Alper P. B., Hendrix M., Sears P.: J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 1965. Práce je součástí řešení výzkumného záměru MŠMT č. 223300006.
CHEMOENZYMATIC OXIDATION OF AMINOGLYCOSIDES - WAYS TO NEW IMMUNOACTIVE COMPOUNDS J. Rauvolfová1, M. Macková2, P. Sedmera 1, K. Bezouška3 and V. Křen1, 1
Institute of Microbiology, Academy of Sciences of the Czech Republic, Laboratory of Biotransformation, Vídeňská 1083, CZ 142 20 Prague 4, 2 Institute of Chemical Technology, Department of Biochemistry and Microbiology, Technická 5, CZ 162 00 Prague 6, 3 Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Hlavova 8, 128 40 Prague 2 Natural killer cells (NK) belong to a group of lymphocytes able to lyse tumor or virally infected cells. Their activity is regulated by signals from receptors that activate or inhibit effector (killing) function. One of the major activating receptors of NK-cells is NKR-P1 protein (recently cloned). This protein is related to C-type animal lectines which after binding to carbohydrate ligands activates NK-cells, especially their antitumor activity. In the previous studies, we have shown, that many of various aminosugars (pNP-α,β-GalNAc, pNP-α,β-GlcNAc and α,β-ManNAc) in their free or clustered form are important to high affinity for major activating receptors of rat natural killer cells NKR-P1. Introduction of charged groups as carboxyl or sulphate into the saccharide ligands strongly enhances the binding. Therefore, pNP-β-GalNAc (or pNP-β-Gal) was oxidised enzymatically selectively at the C-6 position to -CHO moiety (I). Consecutively, -CHO was selectively oxidised by Br2/H2O into -COOH group (II), or it was used directly for further conjugation reactions (III). Other mentioned amino sugars were also oxidised at C-6 by Pt/O2 to respective glycosiduronic derivatives (IV). Galactose oxidase (EC 1.1.3.9) from Dactylium dendroides was used for selective oxidation of the primary hydroxyl group at the position C-6. The binding affinity of these new carbohydrates was investigated and compared with previously obtained results. HO
HO
OH O OpNP + O2
HO
HO
NHAc HO
conjugation
COOH O
OH
OH OpNP
II
OpNP + H2O2
NHAc
I
Br2/H2O
HO
HO HO
NHAc
O
OpNP
HO NHAc
Pt/O2
HO HO
NHAc
O
N CH
OpNP
HO OpNP
IV
NH2
HO
O
COOH O NHAc
O
HO
NHAc HO
OH HO
CHO O
GAO
III
NHAc
This work was supported by the grant from the Grant Agency of the Czech Republic No. 303/99/1382.
Příprava analogů norAbu-MDP a norAbu-GMDP modifikovaných v karboxyterminální oblasti peptidového řetězce lipofilními zbytky
A. Rohlenováa, D. Zykab, M. Ledvinac, J. Ježekd Ústav organické chemie a biochemie, AV ČR, Flemingovo nám. 2, 166 10, Praha 6 e-mail:
[email protected],
[email protected],
[email protected],
[email protected] Muramylové glykopeptidy, t.j. látky odvozené od „muramyldipeptidu“ (MDP, MurNAcL-Ala-D-isoGln) a „glukosaminylmuramyldipeptidu“ (GMDP, β-D-GlcNAc-(1→4)-MurNAc-LAla-D-isoGln), jsou skupinou látek, která je v současnosti studována jako potenciální imunofarmaka. Byla připravena řada jejich analogů s cílem potlačit nežádoucí vedlejší účinky (zejména pyrogenitu) a stimulovat imunopotenciační aktivitu, což se podařilo jen částečně. Prokázali jsme, že profil biologických aktivit muramylových glykopeptidů je možné efektivně modulovat kombinací strukturních změn v cukerné a peptidové části jejich molekuly. V případě norAbu-MDP a norAbu-GMDP (Obr. 1) došlo k potlačení resp. eliminaci pyrogenity a výrazné potenciaci
jejich
imunoadjuvantní
peptidového řetězce molekul MDP a
OH
aktivity.
Skutečnost, že modifikace karboxyterminální části GMDP via
linker vázanými lipofilními zbytky vedla k posunu jejich imunomodulační aktivity směrem k potenciaci
HO
HO
HO
O NHAc
O O
O
OH
NHAc CH2CO-L-Abu-D-isoGln norAbu-MDP
linker-R
norAbu-GMDP
přirozené imunity, t.j. nespecifické resistence vůči bakteriálním, virovým a parazitálním infekcím a nádorovému bujení, nás motivovala k přípravě podobných analogů odvozených od molekul norAbu-MDP a norAbu-GMDP (viz. obr.1, R = lipofilní zbytek). Je možné očekávat, že tyto změny povedou k obdobnému posunu imunomodulační aktivity a zachování příznivých farmakologických parametrů matečných struktur. Bude prezentována syntéza analogů norAbu-MDP a norAbu-GMDP modifikovaných v karboxyterminální oblasti: a) via L-alanin vázaným glyceroldipalmitátovým zbytkem, která byla provedena v roztoku a b) via L-lysin připojeným stearoylovým zbytkem, která byla provedená na pevné fázi s použitím 2-chlortritylové pryskyřice. Tyto látky by mohly nalézt uplatnění jako imunofarmaka zejména v kombinované terapii nádorových onemocnění a terapii některých závažných virových onemocnění.
IZOPOLÁRNÍ FOSFONÁTOVÉ ANALOGY NUKLEOTIDŮ A OLIGONUKLEOTIDŮ: SOUČASTNOST A PERSPEKTIVY Ivan Rosenberg Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, Flemingovo n. 2, 166 10 Praha 6, [
[email protected]] Před 40 lety byly v několika světových laboratořích podniknuty první syntézy analogù nukleotidù 2-4, které se vyznačovaly modifikací fosfátové skupiny nukleotidù 1, jinak esterově připojené k 5' nebo 3' hydroxylu ribofuranozové části nukleosidu. Tyto, tzv. nukleosid fosfonové kyseliny, nebo zkráceně nukleosidfosfonáty, které obsahovaly P-C vazbu místo esterové P-O se brzy ocitly v popředí zájmu biochemikù. Dùvodem byla hydrolyticky stabilní P-C vazba, která oddolávala pùsobení nukleolytických enzymù, fosfomonoesteráz, nukleotidáz a exo- a endonukleáz. Je pozoruhodné, že se několik základních typù fosfonátových analogù nukleotidù stalo na více než dvě desetiletí významnými nástroji, pomocí kterých bylo objasněno mnoho mechanismù enzymových reakcí týkajících se štěpení nebo přenosu fosfátového zbytku. Počet prací v tomto ohledu dosáhl několika set. O
B
O
(HO)2P
(HO)2P
R
B
O
O
B
O
(HO)2P
HO
O
O HO
HO
OH
HO
OH
O O
OH
B
OH
(HO)2P 2 3 1 4 Po více než desetileté "odmlce" v této oblasti, během které byla pozornost renomovaných laboratořích věnována syntéze analogù nukleosidù, byly v prùběhu 80 let připraveny na ÚOCHB AV ČR zcela nové typy fosfonátových analogù nukleotidù 5-9, mezi kterými byly objeveny látky, které vykazovaly silné a selektivní účinky proti DNA virùm a retrovirùm. Látky jako HPMPA 5 (B=A), HPMPC 5 (B=C), PMEA 6 (R=H), PMPA 6 (R=CH3), a další byly a dosud jsou předmìtem biochemických a farmakologických studií, jejichž počet dnes značně přesahuje číslo 100. Tyto látky pùsobí převážnì až po fosforylaci na analogy deoxynukleosidtrifosfátù, jako inhibitory virem kódovaných DNA polymeráz a reverzních transkriptáz. Pøestože byly dosud syntetizovány desítky typù modifikací fosfonátové vazby a stovky nových nukleosidfosfonátù, zùstává skutečností, že v klinickém použití jsou zatím dvě z této obrovské skupiny látek, HPMPC 5 (B=C) a PMEA 6 (R=H).
B
A
CH2 O
CH2 O
(HO)2P O
5
OH
(HO)2P O
6
CH2 O
CH2 O
(HO)2P R
O
B
B
O
(HO)2P
7
HO
O
OH
( )n
8
3
1
R
2
R
R
O
9
X
A
O
(HO)2P
4
R
Existence desítek typù fosfonátových analogù nukleotidù, které propadly sítem biologického screeningu je však výzvou k jejich dalšímu využití - tentokrát jako stavební bloky (napø. 10-13) pro syntézu modifikovaných oligonukleotidù s výraznou stabilitou vùči nukleázám. Krátké synteticky CH2 O
O
B
HO P O MopO
10
RO
MopO HO
ODMTr
P
O
B HO
O
11
MopO
ODMTr
CH2 O P O
CH3
12
O
B
DMTrO
O MopO P CH N 2 ODMTr HO
O
B
13
připravené modifikované oligonukleotidy (15-30 bazí) jsou v současné době považovány za novou generaci potenciálních chemoterapeutik, vyznačujících se selektivitou a specificitou dannou jejich interakcemi s cílovými sekvencemi RNA nebo DNA. Tento zpùsob ovlivňování exprese genomu se odráží v přístupech označovaných v literatuře jako antisense, antigene and aptamer strategies. Tato oblast je jednou z nejvíce progresivních a velmi rychle se rozvíjejících oblastí vědeckého bádání.
Syntéza imunoaktivních glykokonjugátů na bázi aminocukrů Tomáš Semeňuk1,2, Pavel Krist1, Marek Kuzma1, Petr Novák1, Karel Bezouška2, Vladimír Křen1 1 2
Mikrobiologický ústav AV ČR, Laboratoř biotransformací, Vídeňská 1083, 142 00 Praha 4 Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta UK, Hlavova 8, 128 40 Praha 2
Cílem práce je příprava imunoaktivních ligandů pro NKR-P1 protein, který působí jako aktivační receptor NK buněk potkana. Tento protein patří do skupiny živočišných lektinů C-typu. Silná nekovalentní vazba ligandu k receptoru spouští zabíječskou aktivitu NK buněk vůči nádorově poškozeným nebo virově infikovaným buňkám. Předchozí studie ukázaly, že nejvhodnějšími ligandy jsou deriváty jednoduchých aminocukrů, především oligomery odvozené od 2-deoxy-2-N-acetylglukosaminu (GlcNAc) a 2-deoxy-2-Nacetylgalaktosaminu. Multivalentní interakce často silně zesiluje vazbu lektin-ligand. Naše práce je rozdělena do následujících kroků: • optimalizace struktury ligandu HO
HO O
RO HO
OH
NH4HCO3 sat. 30°C, 6d
NHAc
O
RO HO
CSCl2 aceton, 2h
NH2 NHAc
R = (GlcNAc)n, β1-4 R=H HO RO HO
HO O NCS NHAc
BSA/PAMAM pH 8-9
RO HO
O
H N
NHAc
C
H N
nosič (BSA,PAMAM)
S
• syntéza dané látky a následná konjugace s BSA a dendrimerními jádry na bázi PAMAM (ligand se váže na volné –NH2 skupiny Jako ligandy jsou využívány chitooligomery - deriváty (GlcNAc)n , n=1-5, připravované řízenou kyselou hydrolýzou chitinu, u kterých byla popsána vysoká afinita k NKR-P1.1 Byly připraveny konjugáty BSA s GlcNAc, chitobiosou a chitotriosou, charakterizovány pomocí MALDI-TOF a ELISA. Průměrný stupeň glykosylace je dle MALDI MS 13-15 sach.zbytků. Jsou prováděny imunologické testy těchto látek. Zároveň probíhá alternativní příprava p-nitrofenyl derivátů aminocukrů reakcí s 4nitrofenylisothiokyanátem. Po následné redukci –NO2 skupiny na amín lze tyto látky využít k obdobné reakci s CSCl2 a následné konjugaci. Očekává se vyšší vazebná síla těchto glykokonjugátů ve srovnání s jejich analogy neobsahujícími fenylové spacery. 1
K. Bezouška , J. Sklenář, J. Dvořáková, V. Havlíček, M. Pospíšil, J. Thiem, V. Křen: Biochem. Biophys. Res. Commun. 238, 149-153 (1997). Tato práce byla podporována grantem GAČR No. 303/99/1382.
ANALÝZA MONO- A OLIGOSACHARIDŮ VYSOKOKAPACITNÍ ANIONTOVOU CHROMATOGRAFIÍ (HPAEC-PAD) Jan Sklenář MBÚ AVČR Kapalinová chromatografie nativních sacharidů se provádí na silikagelových nosičích modifikovaných aminoskupinou nebo na polymerních katexech s vázanými ionty kovu při ultrafialové nebo refrakční detekci. Tyto metody kladou zvýšené nároky na rozpustnost vzorku, dostatečné zakoncentrováni a v případě kationtové chromatografie na vyhřívání kolon. Nadto oba výše zmíněné způsoby detekují stejnou měrou i nesacharidové látky; tedy i použité eluenty, což snižuje jejich citlivost. Vysokokapacitní aniontová chromatografie s pulsní amperometrickou detekcí do jisté míry odstraňuje uvedené nedostatky. Separace probíhá na slabých anexech za vysokého pH , kdy sacharidy, jež se chovají jako slabé kyseliny, nesou záporný náboj a interagují s nosičem. Pulsní amperometrie detekuje jen látky, které nesou skupiny oxidovatelné při zvoleném potenciálu. Tím jsou sacharidy preferenčně detekovány před ostatními kontaminanty. Citlivost monosacharidové analýzy, která se pohybuje v rozmezí 5 – 1000pmol, umožňuje stanovit obsah sacharidů např. z proužku PVDF membrány s přeblotovaným glykoproteinem. Při separaci monosacharidů isokratickou elucí 18mM NaOH jsou kompletně odděleny, L-fukosa, N-acetyl-D-galaktosamin, N-acetyl-D-glukosamin, D-galaktosa, Dglukosa , D-mannosa a 2-deoxy-D-glukosa, která se používá jako vnitřní standard. Vysoká separační účinnost se rovněž využívá při stanovení primární struktury oligosacharidů. Enzymaticky desialylované komplexní řetězce oligosacharidů lidského erythropoietinu jsou rozděleny nejen podle antenarity, ale dochází i k rozdělení 2,4- a 2,6-větvených triantenárních struktur. Sebrané píky jsou po odsolení a permethylaci analyzovány hmotovou spektrometrií. Podporováno granty: MŠMT ČR (VS 96141) a GAČR (303/99/1382)
CHARAKTERIZACE DISULFIDOVÝCH MŮSTKŮ A STRUKTURNÍ LEKTINOVÉ DOMÉNY LYMFOCYTÁRNÍHO RECEPTORU CD69
VÝZKUM
Ondřej Plíhal1, Barbara Staňková1, Jiří Pavlíček1, Bruno Sopko1 a Karel Bezouška1,2 1
Katedra biochemie PřF UK, Hlavova 8, 12840 Praha 2, 2Laboratoř molekulární architektury a
modelování proteinů, Mikrobiolgický ústav AV ČR, Vídeňská 1083, 14220 Praha 4.
[email protected] Funkčně důležitým příkladem receptoru patřícího do rodiny živočišných lektinů C-typu je povrchový antigen lidských lymfocytů CD69, označovaný někdy též jako velmi časný aktivační receptor lymfocytů. V naší laboratoři se zabýváme molekulární stavbou a vyhledáváním sacharidových a jiných ligandů pro tento receptor. Abychom byli schopni připravit dostatečné množství tohoto proteinu pro strukturní studie, byl gen kódující lektinovou doménu tohoto receptoru klonován do vysokoprodukčního expresního vektoru pRSETB obsahujícího histidinovou kotvu. Po indukci produkčního kmene E.coli BL-21 je protein produkován do inkluzních tělísek. Pro purifkaci a zároveň správné poskládání proteinu používáme moderní technologie refoldingu přímo na afinitní chromatografické koloně. Takto získaný protein není agregovaný prostřednicvím disulfidových můstků jak je zjevné z SDS elektroforesy za neredukujících podmínek (obrázek a, dráha n). Molekulární hmota proteinu byla prokázána hmotovou spektrometrií MALDI (obrázek b). Po odstranění histidinové kotvy enterokinasou byla struktura nativního lektinu zkoumána pomocí homology modelingu, měřením spekter cirkulárního dichroismu, a proteinovou krystalizací. Obsah α-helixu stanovený CD spektroskopií byl spočítána na 12 %, což odpovídá velmi dobře modelu (11.5 %). Metody chemie a hmotové spektroskopie proteinů byly použity pro důkaz uspořádání disulfidových můstků v molekule CD69. Po opatrném štěpení domény pepsinem v kyselém prostředí došlo k fragmetaci, která byla sledována isolací fragmentů a stanovením jejich přesné hmotnosti a sekvence (hmotoví spektrometrie MALDI, proteinová sekvenátor). Bylo zjištěno očekávané uspořádání disulfidových můstků při němž jsou párovány cysteiny 105 a 118 a cysteiny 45 a 126. Posledně jmenovaný disulfid je částí proteolyticky odolného jádra.
Podporováno grantem VS96141 od MŠMT ČR.
Využití NMR pro studium stereochemie xylofuranosy s anelovaným pyrazolidinovým kruhem
M. Tkadlecová1, H. Dvořáková2, A. Hájek3, J. Moravcová3 1
Ústav analytické chemie, 2Centrální laboratoře, 3Ústav chemie přírodních látek,
VŠCHT Praha, Technická 5, 16628 Praha 6, e-mail:
[email protected].
Při syntéze biologicky zajímavých nukleosidových analogů byly jako meziprodukty získány dva anomerní furanosové deriváty 1 a 2 s anelovaným pyrazolidinovým kruhem [1,2]. Protonová spektra těchto dvou látek odrážela zajímavé konfor-mační chování. Ve spektru měřeném při laboratorní teplotě bylo R1 u β-anomeru 1 pozorováno zdvojení signálů všech O protonů furanosového kruhu, přičemž v ROESY spektru R2 byly mezi příslušnými zdvojenými signály nalezeny EtOOC N N OCOCH3 výměnné krospíky. Se zvyšující se teplotou docházelo postupně k rozšiřování zdvojených signálů β-anomeru 1 COOEt a následně ke koalescenci (při 60oC). To vše je typické 1, R1 = OCOCH3, R2 = H pro chemickou výměnu. Při snižování teploty docházelo u 2, R1 = H, R2 = OCOCH3 obou anomerů k dalšímu štěpení signálů. U β-anomeru 1 tak byly pozorovány celkem čtyři, u α-anomeru 2 dva signály pro každý proton furanosy. K vysvětlení jevů pozorovaných ve spektru je třeba pro uvažovaný bicyklický systém vzít v úvahu tři typy konformačních změn: 1. inverzi na dusíku, 2. prostorové chování kruhů, 3. bráněnou rotaci kolem C-N, event. C-O vazby. Ab initio výpočet naznačuje [3], že u obou anomerů jsou preferovány transkonfigurace na dusíkových atomech, přičemž interkonverze je velmi rychlá, ve spektru nepozorovatelná. To je případ α-anomeru. U β-anomeru je interkonverze pravděpodobně do té míry zpomalena stabilizací trans konformerů nevazebnou interakcí volného elekronového páru na dusíku s karbonylovým uhlíkem O-acetylové skupiny v poloze 1, že je možno pozorovat dva konformery při laboratorní teplotě. Této teorií odpovídají i konformace furanosového kruhu látek 1 a 2 vypočtené pomocí Karplusovy rovnice [4]. U β-anomeru totiž severní typ konformace podporuje výše zmíněnou stabilizaci trans uspořádání na dusících. U α-anomeru dochází zřejmě k velmi rychlé [5] výměně mezi oběma typickými uspořádáními. Bráněná rotace kolem amidické, event. esterové vazby je pravděpodobně příčinou pozorované výměny při nízké teplotě, kdy změny signálů protonů byly kvalitativně shodné u obou anomerů. [1] [2] [3] [4] [5]
Střížová P.: Diplomová práce, VŠCHT Praha, 1997. Hájek A.: Diplomová práce, VŠCHT Praha, 1998. Rollin P.: nepublikované výsledky. de Leeuw F., Altona C.: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2, 1982, 375 Stoddard J.F.: Stereochemistry of Carbohydrates, p.97, John Wiley 1971.
Práce je součástí řešení výzkumného záměru MŠMT č. 223300006.
Dvojnásobná oxidace monosacharidů Jindřich Volca, Elena Kubátováa, Petr Sedmeraa, Petr Haladaa, Věra Přikrylováa a Dietmar Haltrichb a
Mikrobiologický ústav AV ČR, Vídeňská 1083, 142 20 Praha
b
Institute of Food Technology, University of Agricultural Sciences,
Muthgasse 18, A-1190, Vienna, Austria
Chinon-dependentní pyranosodehydratasa z Agaricus bisporus transformuje glukosu na 2-keto-, 3-keto- a 2,3-diketoglukosu 1-3. Bylo studováno působení téhož enzymu, vyčištěného do homogenity, na další substráty – xylosu a galaktosu za přítomnosti 1,4-benzochinonu jako akceptoru elektronů. Časový průběh reakce byl monitorován HPLC. Místo oxidace bylo odvozeno ze struktur difenylhydrazonů produktů biotransformace, určených pomocí NMR a hmotnostní spektrometrie. Jak u xylosy 4, tak u galaktosy
5
probíhá primární oxidace na C-2, po ní následuje
tvorba 2,3-diketoderivátu. Lze dosáhnout až 80% konverse (HPLC). Vedlejší reakcí je v obou případech neenzymatická oxidativní dekarboxylace. 1. J. Volc, E. Kubátová, D. A. Wood, G. Daniel, Arch. Mikrobiol. 167 (1997), 119 – 125. 2. P. Sedmera, J. Volc, V. Havlíček, S. Pakhomova, A. Jegorov, Carbohydr. Res. 297 (1997), 375 – 378. 3. J. Volc, C. Leitner, P. Sedmera, P. Halada, D. Haltrich, J. Carbohydr. Chem. 18 (1999) 999 – 1007. 4. J. Volc, P. Sedmera, P. Halada, V. Přikrylová, D. Haltrich, zasláno do Carbohydr. Res. 5. J. Volc, E. Kubátová, P. Sedmera, P. Halada, V. Přikrylová, D. Haltrich, připravovaný rukopis.
Tato práce byla podporována granty 206/99/1191 (GA ČR), LB 98233 (MŠMT) a FWF P11459-MOB (Austrian Science Foundation).
Enzymic Hydrolysis of Alkyl-β-D-glucopyranosides: Preliminary Results Marie Zarevúcka,a Miroslav Vacek,b Zdeněk Wimmer,a Zdenka Huňkovác and Vladimír Křenc a
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry AS CR, Flemingovo náměstí 2, 166 10 Prague
6; b Institute of Chemical Technology, Technická 5, 160 28 Prague 6; c Institute of Microbiology AS CR, Laboratory of Biotransformation, Vídeňská 1083, 142 20 Prague 4, Czech Republic
Extracellular β-glucosidases from Aspergillus oryzae CCF 147, Aspergillus oryzae CCF 1066, Fusarium oxysporum CCF 377, Aspergillus terreus CCF 58 and Talaromyces flavus CCF 2686 which were induced by different inductors were tested to catalyze stereoselective hydrolyses of diastereoisomeric mixtures of alkyl-β-D-glucopyranosides. These substrates were synthesized from the respective pure cis- and trans-isomers of 2-(4-methoxybenzyl)-1cyclohexanols by the Koenigs-Knorr method. Stereoselective preferences of the enzymes towards one of the diastereoisomers of the glucosides were studied. Both, the chiral alcohols (resolved substrates) and alkyl-β-D-glucopyranosides were prepared. Higher stereoselectivity was achieved in most of the processes employing the glucoside derivatives of cis-2-(4-methoxybenzyl)-1cyclohexanol. At this stage of the study, only preliminary results are available, which will be shown during the presentation.
Acknowledgment: This study has been supported by the Ministry of Education of the Czech Republic through the project COST D10/0005/98 (D10.10), and by Grant Agency of the Czech Republic, grant No. 303/99/1382.
Enzymic Hydrolysis of Alkyl-β-D-glucopyranosides: Preliminary Results Marie Zarevúcka,a Miroslav Vacek,b Zdeněk Wimmer,a Zdenka Huňkovác and Vladimír Křenc a
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry AS CR, Flemingovo náměstí 2, 166 10 Prague
6; b Institute of Chemical Technology, Technická 5, 160 28 Prague 6; c Institute of Microbiology AS CR, Laboratory of Biotransformation, Vídeňská 1083, 142 20 Prague 4, Czech Republic
Extracellular β-glucosidases from Aspergillus oryzae CCF 147, Aspergillus oryzae CCF 1066, Fusarium oxysporum CCF 377, Aspergillus terreus CCF 58 and Talaromyces flavus CCF 2686 which were induced by different inductors were tested to catalyze stereoselective hydrolyses of diastereoisomeric mixtures of alkyl-β-D-glucopyranosides. These substrates were synthesized from the respective pure cis- and trans-isomers of 2-(4-methoxybenzyl)-1-cyclohexanols by the Koenigs-Knorr method. Stereoselective preferences of the enzymes towards one of the diastereoisomers of the glucosides were studied. Both, the chiral alcohols (resolved substrates) and alkyl-β-D-glucopyranosides were prepared. Higher stereoselectivity was achieved in most of the processes employing the glucoside derivatives of cis-2-(4-methoxybenzyl)-1-cyclohexanol. At this stage of the study, only preliminary results are available, which will be shown during the presentation.
Acknowledgment: This study has been supported by the Ministry of Education of the Czech Republic through the project COST D10/0005/98 (D10.10), and by Grant Agency of the Czech Republic, grant No. 303/99/1382.
