ENZIMTECHNOLÓGIA
Kémiai technológia laboratóriumi gyakorlat kémiatanár szakos hallgatók számára
ELTE Kémiai Intézet, Szerves Kémia Tanszék
Bevezetés Az enzimek Az enzimek az élő szervezetekben végbemenő kémiai reakciók fehérje típusú katalizátorai (biokatalizátorok). Katalitikus tulajdonságuk a szervetlen katalizátorokéhoz hasonlóan a reakciósebesség növelésében nyilvánul meg, új reakcióút megnyitásával (1. ábra). A kémiai reakciók egyensúlyi állapotát az enzimek nem befolyásolják, csupán az egyensúly kialakulását gyorsítják meg más katalizátorokhoz hasonlóan. Energia Eakt(nem katalitikus) ΔEakt
Eakt(katalitikus) Reaktánsok
Termék(ek)
1. ábra Más fehérjékhez hasonlóan, az enzimek is egyszerűek (proteinek) vagy összetettek (proteidek) lehetnek. A proteineket csak polipeptidlánc alkotja. A proteidek közé tartozó enzimek fehérjerészből (apoenzim) és nem fehérjetermészetű részből (koenzim) épülnek fel. Az apoenzim és a koenzim együttesét holoenzimnek nevezzük. Az apoenzim nem képes funkcióját ellátni a koenzim nélkül. Az enzimmolekulák azon részét, amely közvetlenül részt vesz a katalízisben aktív centrumnak nevezzük. Az aktív centrumot a kötőhely és a katalitikus hely együttese alkotja. A kötőhelyen történik a szubsztrátmolekula (azon molekula, amelynek átalakulását az enzim katalizálja) megkötése másodrendű kötések kialakításával, a kötőhelyet képező aminosavoldalláncok segítségével. A kötőhely közelében lévő katalitikus helyen olyan aminosavoldalláncok találhatók, amelyek közvetlenül közreműködnek a szubsztrát katalitikus átalakításában. Az összetett enzimeknél a koenzim is részt vesz a katalitikus hely felépítésében.
2
Aktív centrum
S
S
P
S: Szubsztrát E: Enzim
katalitikus hely
E
kötőhely
E
E
P: Termék ES: Enzim – szubsztrát komplex
E
(ES)x
E+P
2. ábra Az enzimek esetében többféle specifitásról beszélhetünk: 1.) szubsztrátspecifitás: pl. a glükózizomeráz csak a glükóz-fruktóz átalakulást katalizálja, más aldóz-ketóz átalakulást nem; 2.) reakcióspecifitás: különböző enzimek más-más úton alakítják át ugyanazt az anyagot, pl. az α-amiláz a keményítőlánc belsejében segíti elő a hidrolízist, így termékként dextrinek képződnek, ezzel szemben a β-amiláz hatására a keményítőmolekulák végeiről maltóz egységek hasadnak le; 3.) sztereospecifitás: királis vegyületek esetében csak meghatározott konfigurációjú molekulák átalakítása történik meg, vagy meghatározott konfigurációjú termék képződhet csak. Az enzimek katalitikus hatásának számszerű jellemzésére szolgál az enzimaktivitás. Ez megadja, hogy adott idő alatt, adott mennyiségű enzim mennyi anyagot képes átalakítani szigorúan definiált körülmények (T, pH stb.) között. Az enzimes katalízist számos tényező befolyásolja. A szubsztrát mennyisége, a hőmérséklet, pH stb. mind hatással vannak a reakció-sebességre (enzimaktivitásra). Egy-egy tényező hatása a többi állandó értéken tartása mellett vizsgálható. Az enzimaktivitás pH-függését a 3. ábrán láthatjuk. A gyakorlat során az amiloglükozidáz enzimaktivitásának pH-függésére
enzimaktivitás
is hasonló görbét kell kapnunk. A reakciósebesség pH-függését több tényező eredményezheti. Bármely disszociációra képes enzim- vagy szubsztrát-molekularész szerkeze-
pH
3. ábra
tét ugyanis befolyásolja a pH.
3
Az enzimek ipari alkalmazása Biotechnológiai eljárásokról beszélhetünk, ha biológiai rendszereket alkalmaznak ipari folyamatok
során.
Ez
jelentheti
mikroorganizmusok
felhasználását
(mikrobiológiai
technológia) vagy enzimkészítmények alkalmazását (enzimtechnológia). A biológiai rendszerek felhasználásának előnyei: 1.) bonyolult kémiai reakciókat tudnak végrehajtani a szintetikus megoldásnál egyszerűbben; 2.) enyhébb reakciókörülmények között mehet végbe a reakció. Az előzőek az enzimek nagymértékű specifitásának és aktivitásának köszönhetőek. Sok esetben használják fel immobilizált alakban a biológiai rendszereket, ilyenkor a sejteket vagy enzimeket szilárd hordozóhoz rögzítik, így töltenek meg velük egy oszlopot, amelyen átengedik a szubsztrát oldatát. Az immobilizáció révén megoldható a biológiai rendszerek újrahasznosítása, továbbá a folyamatos üzemmód is biztosított. Ezek a tényezők a termelés gazdaságosságát növelik. Ismert enzimtechnológiai eljárás az izocukor előállítása. Az izocukor glükóz-fruktóz elegy tömény vizes oldata, amelyet az élelmiszeriparban édesítőszerként használnak. Előnyös tulajdonsága, hogy nehezen kristályosodik, illetve erős nedvszívó képessége miatt megakadályozza a készítmény vízvesztését. Magyarországon nagy mennyiségben gyártanak izocukrot Szabadegyházán. A felhasznált nyersanyag: kukorica. A szemekből eltávolítják a fehérjetartalmú csírát, amelyet állati takarmányként hasznosítanak. A csírátlanított szemeket megőrlik, és a keményítőt elkülönítik, majd gondosan tisztítják. Ezután α-amiláz enzimet adnak hozzá, és 85-94 °C-on, 5-6 pH-n előhidrolizálják a keményítőt. Ezt az enzimet hevítéssel inaktiválják, és a lehűtött oldathoz amiloglükozidáz-készítményt adnak, amely glükózig viszi tovább a hidrolízist. Az így kapott glükóz-oldatot immobilizált glükózizomeráz enzimmel feltöltött oszlopokon engedik át, aminek hatására egyensúlyi reakció során a glükóz egy része fruktózzá izomerizálódik. A kapott oldatot tisztítják és töményre (kb. 64 m/m %-osra) bepárolják.
4
Gyakorlati munka A gyakorlat célja: Az ipari izocukor-előállítás folyamatainak vizsgálata az amiloglükozidáz enzim katalizáló hatásának tanulmányozásával (enzimaktivitás pH-függésének mérése). Amiloglükozidáz-enzimaktivitás pH-függésének mérése: A felhasználásra kerülő keményítőoldat elkészítésénél desztillált vízben 100 cm3-enként 1 g, α-amilázzal előhidrolizált keményítőt oldottunk fel, amely vizet és kis mennyiségű glükózt is tartalmazott, ezért nem egyezik meg az oldat tényleges keményítőtartalma az 1 vegyes %-os bemérési koncentrációval. Három, előre lemért csiszolatos bemérőedénybe mérjünk be analitikai pontossággal egyenként 0,5 g vízoldható keményítőt, majd helyezzük az edénykéket 100 °C-ra beállított szárítószekrénybe. Másfél óra elteltével helyezzük át az edénykéket exszikkátorba, majd kb. 15 perc elteltével mérjük le újból az edények tömegét. Négyszer 50 cm3 keményítőoldat pH-ját állítsuk be állandó kevertetés közben négy különböző értékre, pH = 3 - 6 intervallumban 1 M nátrium-acetát és 1 M ecetsav-oldatok felhasználásával. A pH értékek beállításánál a gyakorlatvezető által megadott módon adagoljuk a nátriumacetát és/vagy ecetsav-oldatokat, attól függően, hogy melyikre van szükség, és jegyezzük fel, hogy hány cm3-re higítottuk fel ez által az eredeti keményítőoldatot. Az egyik beállított pH-jú oldatot öntsük a 60 °C-on temperált reaktorba. Miután felvette a reaktor hőmérsékletét (5 perc), kevertetés közben adjunk hozzá 1 cm3 amiloglükozidázoldatot. Az enzimoldat hozzáadásától számítva pontosan 5 perc múlva (stopper!) pipettázzunk a reaktor tartalmához 5 M nátrium-hidroxid-oldatot, hogy a pH eltolásával leállítsa az enzim működését. A pH=3 körüli értékre beállított oldathoz az 5 M NaOH-ból 2 cm3-t, a többihez 1 cm3-t adjunk. További fél percig kevertessük az oldatot, majd pipettával vegyünk háromszor 5 cm3 mintát az enzimaktivitás meghatározásához (mindegyik pH-n három párhuzamost vizsgálunk). Mossuk el alaposan a reaktort és a keverőt, majd végezzük el a mérést a következő pH-jú oldattal.
5
Az enzimaktivitás meghatározása Az amiloglükozidáz enzimaktivitása megadható azzal a glükóz- koncentrációval, amely kialakul adott enzimmennyiség hatására, adott idő alatt (esetünkben 1 cm3 enzimoldat hatására, 5 perc alatt). A glükóztartalom meghatározása jodometriásan történik lúgos oldatban a jódból hipojodit keletkezik, ami a glükóz formilcsoportját karboxilcsoporttá oxidálja; az oldathoz adott jód feleslegét savanyítás után tioszulfát-oldattal mérjük vissza; a tioszulfátos titrálás végpontjának jelzésére az amiloglükozidáz által érintetlenül hagyott keményítőtartalom szolgál. A gyakorlat során az eredeti keményítő-oldat szabad glükóz-tartalmát is meghatározzuk jodometriásan. A jodometriás mérés menete A reaktorból vett 5 cm3 mintát desztillált vízzel 25 cm3-re hígítjuk, majd hozzáadunk 4 cm3 1 M NaOH-oldatot és bürettából 5 cm3 0,05 M I2-oldatot. Ezután 20 percig állni hagyjuk sötétben, majd 10 cm3 0,5 M kénsavval savanyítjuk és 0,1 M tioszulfát-oldattal titráljuk. Mérjük
meg
három
párhuzamost
vizsgálva
5-5 cm3
kiindulási
keményítőoldat
glükóztartalmát is a fenti recept szerint. Reakcióegyenletek I2 + 2OH- = OI- + I- + H2O ~ CHO + OI- + OH- = ~ COO- + I- + H2O ___________________________________________________________________________
~ CHO + I2 + 3OH- = ~ COO- + 2I- + 2H2O OI- + I- + 2H+ = I2 + H2O 2S2O32- + I2 = S4O62- + 2IAz enzimaktivitás számítása A tioszulfát mérőoldat fogyásai alapján, a jód- és tioszulfátoldat faktorának figyelembevételével számítsuk ki a reaktorból vett minták és az eredeti keményítőoldat glükóztartalmát mmol/dm3-ben. Számítsuk ki, hogy milyen glükózkoncentráció alakult volna ki az egyes pH-értékeken, ha nem hígítottuk volna fel az eredetileg 50 cm3 térfogatú mintaoldatot. Ehhez az alábbi képlet használható fel:
Vössz . c( higított oldat ) = c , , 3 50 cm
6
ahol Vössz = 50 cm3 + a pH beállításához felhasznált nátrium-acetát és/vagy ecetsav térfogata + az enzimműködés leállítására a reaktor tartalmához adott 5 M NaOH térfogata + 1 cm3 (enzimoldat). A hígulás figyelembevételével kapott glükózkoncentrációk és a keményítőoldat glükóztartalmának különbségei adják az enzimaktivitás értékeket. Ábrázoljuk ezeket a pH függvényében!
A
görbe
megrajzolásához
vegyünk
fel
még
egy
pontot
a
koordinátarendszerben: pH = 0-nál az enzimaktivitást tekintsük zérussal egyezőnek. A hidrolízis mértékének kiszámítása
Számítsuk ki a bemérés alapján 1 vegyes százalékosnak tekintett keményítőoldat tényleges keményítőtartalmát a 100 cm3-enként bemért 1 g anyag víztartalmának, valamint a titrálás révén meghatározott glükóztartalmának levonásával. Számítsuk ki, hogy a kapott keményítőmennyiség 100%-os hidrolízise esetén milyen glükózkoncentráció alakulna ki, az alábbi egyenlet figyelembevételével. (C6H10O5)n + n H2O = n C6H12O6 A keményítőmolekulák láncvégein lévő glükózegységeket elhanyagoljuk. Adjuk meg, hogy a maximálisan lehetséges glükózkoncentráció hány százalékát képezik az enzimaktivitásokat jellemző glükózkoncentrációk, tehát milyen mértékű volt a hidrolízis az enzim hatására az egyes pH értékeken. A pH-enzimaktivitás görbe és a hidrolízis végbemenetelének százalékos értékei alapján adjuk meg az amiloglükozidáz enzim működésének optimális pH-tartományát. A gyakorlat során elvégzendő feladatok (3 főre)
1) A vízoldható keményítő nedvességtartalmának meghatározása és az enzimaktivitás nyomon követése pH = 3 – 3,5 közötti tartományban 2) vízoldható keményítő szabad glükóztartalmának meghatározása és az enzimaktivitás nyomon követése pH = 4 – 4,5 közötti tartományban 3) Az enzimaktivitás nyomon követése pH = 4,5 – 5,0 és pH = 5,0 – 5,5 közötti tartományban. Az 1. feladatcsoportot végző hallgató a jegyzőkönyv adatlap 1-3. oldalát, a 2. feladatcsoportot végző a jegyzőkönyv 1., 4-5. oldalát míg a 3. feladatcsoportot végző hallgató a jegyzőkönyv 1., 6. és 7. oldalát nyomtassa ki a gyakorlatra.
7
Jegyzőkönyv
A jegyzőkönyvnek tartalmaznia kell: - a munka rövid leírását, - a számolásokat, - a pH-enzimaktivitás görbét, - a különböző pH-értékeknél kiszámított hidrolízis mértéket (%-ban), - az amiloglükozidáz enzim optimális pH-tartományának megadását Számolási minta
Az alábbi példán a számolás menete látható, a piros szín a jegyzőkönyv adatlap kitöltési útmutatóját jelöli. ..1.... MINTA Jód Konc.: 0,05 M Faktor: 0,986 f*c= 0,05*0,986=0,0493
Konc.: 0,1 M Faktor: 1,003 f*c= 0,1*1,003 = 0,1003
Anyagmennyiség: 0,0493*0,005= 2,47*10-4 mol
50 cm3 keményítő oldat ........0.. cm3 NaAc ......2...cm3 Hac 1 cm3 enzim .....2... cm3 NaOH
Átlag: (2,1+2,2+2,3)/3= 2,2
Fogyások 1. 2,1 cm3 2. 2,2 cm3 3. 2,3 cm3
5 cm3
pH =........3,17........... Higítások:
Tioszulfát
Összesen: ..........55....... cm3 3
cm Anyagmennyiség: 0,0022*0,1003 = 2,20*10-4 mol /2 2,20*10-4/2 = 1,10*10-4 mol
Anyagmennyiség: 2,47*10-4 - 1,10*10-4 = 1,37*10-4 mol = 0,137 mmol Minta térfogata: 5cm3 = 0,005 dm3 0,137/0,005 = 27,4 mmol/dm3
Koncentráció Glükózkonc. hígítás nélkül 55*27,4/50 = 30,1 mmol/dm3 30,1 - 2,1* = 28,0 mmol/dm3 Enzimaktivitás * a keményítőoldat glükóztartalmára kapott érték: 2,1 mmol/dm3 Hidrolízis mértéke: 1 g/100 cm3 keményítő Víztartalom: ....10,5....% = 1*0,105 g/100 cm3 = 0,105 g/100 cm3 Keményítőoldat glükóztartalma: 2,1 mmol/dm3 = 2,1 *180 mg/dm3= 378 mg/dm3 =0,0378 g/100 cm3 Keményítőoldat keményítő-tartalma: 1 g/100 cm3 – víztartalom – glükóztartalom = 1 – 0,105 – 0,0378 = 0,8572 g/100 cm3 (C6H10O5)n + nH2O = nC6H12O6 moláris tömegek: 162 g/mol →
.180 g/mol
...
....0,952.... g/100 cm3 ......0,857.. g/100 cm3 .......0,00529.. mol/100 cm3 = .......52,9....mmol/dm3 Minta 1
pH 3,17
Enzimaktivitás 28,0
8
Hidrolízis mértéke 28,0/52,9=0,529 =52,9%
Ellenőrző kérdések
1. Milyen feladatokat kell elvégezniük a gyakorlaton? (Mind az 5 feladatrészben összesítve) 2. Mi a gyakorlat célja? 3. Milyen enzimmel dolgozunk a gyakorlaton? 4. Mit nevezünk enzimnek? 5. Milyen módon befolyásolják a kémiai reakciókat az enzimek? 6. Milyen enzimspecificitások lehetségesek? 7. Mondjon példát egy szubsztrátspecifikus enzimre! 8. Mondjon példát egy reakcióspecifikus enzimre! 9. Mit jelent, ha egy enzim sztereospecifikus? 10. A gyakorlaton használt enzimet melyik specificitási csoportba lehet sorolni? 11. Mit nevezünk proteidnek? 12. Milyen részei vannak a proteidnek? 13. Mit nevezünk az enzimeknél aktív centrumnak? Milyen részekből áll? 14. Mit nevezünk enzimaktivitásnak? 15. Milyen tényezők befolyásolhatják az enzimaktivitást? 16. Milyen módszerrel határozzuk meg az enzimaktivitást a gyakorlaton? 17. Hány különböző pH-n fogunk enzimaktivitást mérni a gyakorlat során? (Mind az 5 feladatrészben összesítve) 18. Milyen oldatokkal állítják be a keményítőoldat pH-ját a gyakorlaton? 19. Mi a pH? 20. Ismertesse az üvegelektród működésének elvét! 21. Miért van szükség NaOH reaktor tartalmához való hozzáadására a gyakorlaton? 22. Mit nevezünk biotechnológiának? 23. Melyek a biotechnológia felhasználásának az előnyei? 24. Mit nevezünk izocukornak? 25. Hogyan állítják elő az izocukrot? 26. Milyen mérőoldatokat használunk a titrálás során? 27. Milyen végpontjelzést alkalmazunk a titrálásnál a gyakorlaton? 28. Ismertesse a gyakorlat során alkalmazott titrálás menetét! 29. Ismertesse a gyakorlat során alkalmazott titrálás egyenleteit! 30. Mi a keményítő? 31. Milyen részekből áll a keményítő? 9
32. Mi a különbség az amilóz és az amilopektin között? 33. Hogyan határozzuk meg a keményítő nedvességtartalmát? 34. Miért van szükség a keményítő nedvességtartalmának ismeretére? 35. Mi a keményítő hidrolízisének az egyenlete? 36. Számítsuk ki, hogy x vegyes%-os keményítő oldat (x g keményítő / 100 ml vízben) teljes hidrolízise során milyen glükózkoncentráció alakul ki! 37. 5 cm3 ismeretlen koncentrációjú glükózoldatot jodometriásan titrálunk. A mintát desztillált vízzel hígítjuk, majd NaOH-ot adunk hozzá. Bürettából 5 cm3 0,05 M I2- oldatot adunk hozzá, 20 percig állni hagyjuk, majd kénsavval megsavanyítva 0,1 M tioszulfátoldattal titráljuk. A fogyás x ml. Számítsuk ki a minta glükózkoncentrációját! (A mérőoldatok faktora: f(I2) = 0,980, f(S2O32-) = 1,045) A gyakorlat anyagát képezik "Gerecs Árpád: Bevezetés a kémiai technológiába (Tankönyvkiadó, Budapest)" című tankönyvének ide vonatkozó fejezetei is: "Mikrobiológiai iparok termékei" (429-454. oldal) és "Keményítőgyártás" (517-523. oldal)!!!
10
