SZAKDOLGOZAT BÉKÉSI ANGÉLA ELTE TTK V. éves kémia tanár szakos hallgató
A FUNKCIONÁLISAN KOMPETENS VANADIL(IV) KATION SPINCÍMKE A dUTPáz ENZIM AKTÍV CENTRUMÁBAN
Témavezető: Dr. Vértessy G. Beáta MTA SzBK Enzimológiai Intézet
Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2001.
2
Tartalomjegyzék Köszönetnyilvánítás
3
Rövidítések jegyzéke
4
Bevezetés, célkitűzés
5
1. A dUTPáz
7
1.1. Szerepe az élő szervezetben
7
1.2. A dUTPáz enzimcsalád képviselői
9
1.3. A trimer dUTPáz szerkezete
11
1.4. A dUTPáz, mint új target molekula gyógyszerszintézisek számára
14
1.5. EPR-ENDOR vizsgálatok szerepe a dUTPáz-katalízis mechanizmusának leírásában 16 1.6. A vanádium oxidációs állapotai és a vanadil kation jellemzői 2. Anyagok és módszerek
20
2.1. A felhasznált módszerek elmélete
20
2.1.1. dUTPáz preparálása
20
2.1.2. Kinetikai analízis
23
2.1.3. CD spektroszkópia
26
2.1.4. Izotermális titráló mikrokalorimetria (ITC)
29
2.1.5. FPLC (Gyors fehérjeelválasztási folyadék kromatográfia)
32
2.1.6. Nagyfeloldású szerkezet elemzése
33
2.2. Felhasznált anyagok
34
2.2.1. Általános vegyszerek
34
3. Eredmények és értékelés
38
3.1. Vanadil hatása az enzimaktivitásra
38
3.1.1. A vanadil katalitikus kompetenciája (FPLC)
38
3.1.2. Kezdeti sebesség meghatározása
40
3.1.3. Részletes kinetikai analízis (KM, vmax, kkat)
43
3.2. dUDP-dUTPáz komplex vizsgálata
45
3.2.1. CD spektroszkópiás eredmények
45
3.2.2. A komplexálódás termodinamikai paramétereinek meghatározása (ITC)
48
3.2.3. Feltételezett szerkezet
50
Eredmények összefoglalása
53
Irodalomjegyzék
54
2
3
Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom Dr. Vértessy Beátának, aki lehetővé tette számomra, hogy a kutatócsoportjában dolgozhassam, és mint témavezető megismertetett a téma alapjaival, irányított a munkában, és segített a felmerülő problémák megoldásában. Köszönöm
Dr.
Friedrich
Péter
professzornak,
az
Enzimológiai
Intézet
igazgatójának, hogy engedélyezte munkámat az intézetbenben. Szeretném megköszönni Dr. Vonderviszt Ferencnek, hogy lehetővé tette számomra a Veszprémi Egyetemen az izotermális titráló mikrokaloriméter
használatát és Gugolya
Zoltánnak, hogy tanácsaival segítette az ottani munkámat. Köszönettel tartozom továbbá Dr. Marvin Makinen professzornak és Dr. Musztafi Devkumarnak az University of Chicago Biokémiai és Molekuláris Biológiai Tanszékén, együttműködésüknek köszönhetők a dUTPáz enzimmel végzett EPR-ENDOR vizsgálatok. A csoport minden tagjának és minden munkatársnak köszönöm a jó, baráti légkört és minden segítséget, amit a munkámhoz nyújtottak.
3
4
Rövidítések jegyzéke
AMBIK CD dNTP DTT dTTP dUDP dUMP dUTP dUTPáz EDTA EGTA ENDOR EPR FPLC IPTG ITC LB MOPS PMSF PPi TES TFB VOacac VOSO4 α-β-imino-dUTP
ammónium-hidrogén-karbonát Cirkuláris Dikroizmus dezoxi-nukleotid-trifoszfát ditio-treitol dezoxi-timidin-trifoszfát dezoxi-uridin-difoszfát dezoxi-uridin-monofoszfát dezoxi-uridin-trifoszfát (dezoxi-uridin-trifoszfát)-nukleotido-hidroláz etilén-diamin-N,N,N’,N’-tetraecetsav etilénglikol-bisz[β-aminoetiléter]-N,N,N’,N’-tetraecetsav Electron Nuclear Double Resonance Electron Paramagnetic Resonance Fast Protein Liquid Chromatography izopropil-tio-galaktozid Izotermális Titráló Mikrokalorimetria Luria-Bertani (tápoldat) 3-[N-morfolino]propán-szulfonsav fenil-metil-szulfonil-fluorid anorganikus pirofoszfát N-tris[hidroximetil]metil-2-amino-etán-szulfonsav transzformáló puffer vanadil-acetil-acetonát vanadil-szulfát α-β-imino-dezoxiuridin-trifoszfát
4
5
Bevezetés, célkitűzés A
dezoxiuridin
trifoszfát
nukleotidohidroláz
(dUTPáz)
enzim
a
dUTP
pirofoszforolízisét katalizálja az alábbi reakció alapján: dUTP → dUMP + PPi A folyamat a nagyenergiájú foszfát hidrolízise miatt gyakorlatilag irreverzibilis, ezért egyirányú nyíllal írható le. Ezzel a reakcióval az enzim csökkenti a sejtbeli dUTP szintet, és közben termeli a dUMP metabolitot, ami a dTTP bioszintézisének egyik prekurzora (a timidilát szintáz szubsztrátja). A DNS polimeráz dTTP felhasználásával építi be a DNS-be a timidilát alkotóelemet (a timin bázist az adenin bázissal szembe). A dUTP eltávolítása és a dTTP termelésének elősegítése a dUTP/dTTP arány jelentős csökkenéséhez vezet, ami megakadályozza az uracil DNS-be épülését. Az enzim aktivitásának hiányában az osztódó sejtben magas uraciltartalmú DNS szintetizálódik, ami egy hatékony uracilkivágáson alapuló javító mechanizmus hiábavaló hiperaktivitásán keresztül a kromoszóma fragmentálódásához vezet, így pedig a sejt halálához. Ezt a jelenséget nevezik timinmentes sejthalálnak. A DNS integritásának biztosításában betöltött szerepe miatt a dUTPáz enzim esszenciális jelentőségű minden élő szervezet számára. Ezt támasztja alá az a tény is, hogy nem csak eukariótákban és prokariótákban van általánosan jelen, hanem számos vírus is kódolja genomjában a saját dUTPázát (herpeszvírusok, továbbá limitált méretű genommal rendelkező retrovírusok: egyes lentivírusok, B és D típusú onkovírusok). A dUTPáz gátlása vírusfertőzött vagy aktívan osztódó sejtekben a vírus ill. a sejt halálához vezet, ezért az enzim új célpont lehet antivirális és antitumor hatású gyógyszerek tervezésében. A különböző organizmusokból származó dUTPázok szerkezetének és katalitikus ciklusának részletes vizsgálata, a különbségek karakterizálása elengedhetetlen a fajspecifikus dUTPáz antagonisták tervezéséhez. Az enzim fontos kofaktora valamilyen kétértékű fémion. Fiziológiás körülmények között ez a Mg2+, viszont az enzim nagyfokú szubsztrátspecificitása mellett a fémionra nézve
5
6
kevésbé specifikus. Ez lehetővé teszi, hogy a Mg2+-ot más kétértékű fémionnal helyettesítsük. Amennyiben egy megfelelő spincímkeként működő fémion kompetens módon helyettesíti a Mg2+-ot, lehetőség nyílik az un. EPR-ENDOR spektroszkópiai módszer alkalmazására nagyfeloldású, oldatfázisú szerkezetvizsgálat céljából. A dolgozat fő célkitűzése az volt, hogy megfelelő spincímkeként működő fémionok hatását vizsgálja a dUTPáz enzim működésére. Összehasonlító enzimkinetikai méréseket végeztem Mg2+, VO2+ és Mn2+ jelenlétében és fémionok távollétében. Másik célkitűzésem az enzim és a közeli szubsztrátanalóg nukleotid, a dUDP kötődésének termodinamikai karakterizálása volt fémion jelenlétében és távollétében. Ebből a célból két független módon, cirkuláris dikroizmus spektroszkópiával és izotermális titráló mikrokalorimetriával követtem a komplexálódás folyamatát.
6
7
1.
A dUTPáz
1.1.
A dUTPáz szerepe az élő szervezetben A DNS integritásának megőrzése minden élő szervezet számára létfontosságú.
Számos környezeti hatás eredményezhet a DNS-ben az élőlényre nézve súlyos következményekkel járó változásokat, amelyek akár örökletesek is lehetnek. Ezért a DNS-ben keletkező hibák kijavítására több mechanizmus alakult ki (pl. timidin dimerek kivágása, nem komplementer bázispár javítása, stb.). Néha még a fiziológiás körülmények is mutagén hatással lehetnek. Egy ilyen spontán, fiziológiás körülmények között bekövetkező folyamat a citozin oxidatív dezaminálása, ami uracilt eredményez [1]. Ez a módosulás a következő replikáció alkalmával pontmutációt eredményezne, ezen hatás kivédésére van azonban egy báziskivágáson alapuló javító mechanizmus, amely eltávolítja az uracilt a DNS-ből (1. ábra). A javító mechanizmus első lépésében az uracil-DNS glikozidáz elhasítja a dezoxiribóz és az uracil közti glikozidos kötést. Az így bázis nélkül maradt helyen az AP-endonukleáz elhasítja a DNS dezoxiribóz-foszfát gerincszálát úgy, hogy a 3’OH marad szabadon. Ezután a DNS polimeráz - endogén foszfodiészteráz hatása révén - eltávolítja a bázis nélküli dezoxiribózt, és a 3’OH valamint a megfelelő nukleotid-trifoszfát felhasználásával komplementer bázist épít be [2]. Végül pedig a DNS ligáz enzim elvégzi a gerincszál összevarrását.
1. Ábra Báziskivágáson alapuló javító mechanizmus az uracil DNS-ből történő eltávolítására. U: uracil, N: megfelelő komplementer bázis.
7
8
Ez a mechanizmus védelmet nyújt a citozin kémiai instabilitásával szemben, de nyilvánvalóan nem tud különbséget tenni a citozin oxidatív dezaminálásával keletkezett, mutagén és a DNS szintézisekor esetleg timin helyére beépült, nem mutagén uracil között. Ezért a timin helyére való uracilbeépülést a dNTP szintek pontos szabályozásával kell a sejtnek kivédenie (a DNS polimeráz ugyanis nem tud különbséget tenni a dUTP és a dTTP között). Az alacsony dUTP/dTTP arányt a dUTPáz enzim a dUTP elbontásával és a termék dUMP dTTP-prekurzor volta miatt két oldalról is biztosítja. A dUTPáz tehát olyan preventív DNS javító faktor, amely egyedülálló módon, megelőzéssel küszöböl ki egy súlyos következménnyel járó DNS hibát. dUTPáz hiányában a magas dUTP/dTTP arány a DNS uraciltartalmának jelentős növekedését okozza. Ez által aktivizálódik az uracil kivágásán alapuló javító mechanizmus (1. ábra). A javítás azonban továbbra is fennálló magas dUTP/dTTP arány mellett nem lehet sikeres, mert a DNS polimeráz a kivágott uracil helyére újra uracilt épít be. Az így felerősödő hiábavaló ciklus kettősszáltörésekhez, az pedig kromoszómafragmentálódáshoz és a sejt halálához vezet (2. ábra)[3, 4].
2. Ábra A dUTPáz szerepe a DNS integritásának megőrzésében
8
9
A dUTPáz gátlása programozott sejthalál elősegítője is lehet a természetben: a Drosophila melanogaster a dUTPáz mellett genomjában kódol egy endogén inhibitor fehérjét is, ami a lárvaállapotok során aktiválódik, elősegítve ezzel a későbbi bábállapotban egyes sejtek elhalását [5]. A dUTPáz gén kifejeződése függ a sejt differenciáltságától: csak a sejtosztódáskor számottevő az enzim bioszintézise, hiszen csak ekkor van rá szükség a korrekt DNS szintézis végett [6]. Ezért az enzim gátlása is csak az aktívan osztódó szövetekben okozhat jelentősebb kárt, ami reményt nyújt a dUTPáz-inhibitorok daganatos megbetegedések esetén történő terápiás alkalmazására is [7]. Számos vírus is kódolja genomjában a saját dUTPáz fehérjéjét. A virális dUTPáz elsősorban azon vírusok számára fontos, melyek differenciált sejteket támadnak meg, hisz az ilyen gazdasejtben nincs elegendő dUTPáz jelen. A virális dUTPáz gének nullmutációja csökkenti a vírus fertőző- és szaporodóképességét a differenciált sejtekben, szövetekben. Ez a tény arra utal, hogy egyes vírusos megbetegedések gyógyításában a virális dUTPáz antagonistái terápiás jelentősséggel bírhatnak [8-11].
1.2.
A dUTPáz enzimcsalád képviselői
9
10
A különböző organizmusokból származó dUTPázok szerkezetüket tekintve különböző mértékben eltérnek egymástól. Az aminosav szekvencia szintjén nagyfokú eltérés mutatkozik, de minden dUTPázban fellelhető 5 konzervatív szekvenciamotívum, melyeknek
lényeges szerepük van az enzim harmadlagos és negyedleges szerkezete, ill az aktív centrum kialakításában [12]. A dUTPázok két nagy csoportra oszthatók: a herpesztípusú és az un. EuBaR (az elnevezés a származásukra utal: eukarióta, bakteriális, retrovirális) típusú dUTPázok csoportjára [13]. A herpesztípusú enzimek monomerek, szemben a többi dUTPázzal, amelyek homotrimer szerkezetűek [9, 10]. A monomer dUTPázok kb. 320-380 aminosavat tartalmaznak, szemben a trimer enzimekkel, amelyek peptidlánconként mintegy feleannyi, 141-160 aminosavat tartalmaznak csupán. Továbbá lényeges különbség az is, hogy a monomer enzimben a konzervatív motívumok más sorrendben és különböző távolságban vannak egymástól, mint a többi dUTPázban (3.ábra). Feltételezhető, hogy a monomer változat egy ősi dUTPáz gén duplikációja kapcsán jelent meg az élővilágban.
Az alábbiakban az EuBaR típusú dUTPázokkal foglalkozunk részletesebben. Ezek az enzimek új gyógyszerkutatási célpontot jelenthetnek, továbbá fehérjeszerkezeti szempontból is nagyon jelentős a homotrimer enzimmolekula felépítése. 3. Ábra Konzerválódott szekvenciamotívumok a dUTPázok két fő csoportjában
A
EuBaR dUTPázok esetén érdemes megkülönböztetni a pro- ill. eukarióta szervezetekből származó enzimeket. Érdekes és valószínűleg funkcionálisan is fontos szerkezeti különbség mutatkozik a két csoport között [14, 15]. Nagyfeloldású kristályszerkezetek alapján ismeretes,
10
11
hogy az eukarióták dUTPázaiban a polipeptid láncok közti kommunikáció poláros csoportok közti hidrogén-kötésekkel történik, ezzel szemben a prokarióta ill virális dUTPázokban apoláros központi mag van, az alegységek közti kapcsolat hidrofób kölcsönhatással valósul meg [16] [17-21]. Ezzel párhuzamosan a két csoport katalitikus ciklusában is egy fontos különbség figyelhető meg [15]. A trimer dUTPázoknak katalitikus szempontból két fő konformációjuk van: nyitott és zárt. Az eukarióta enzimek esetén a katalitikus reakció lejátszódása után is megmarad a zárt konformáció (ld. humán dUTPáz-dUMP komplex kristályszerkezete [21-23]). Ezért nem magyarázható egyszerűen a termék távozása, és szükséges egy bonyolultabb, esetleg allosztérikus működést feltételezni az eukarióta dUTPázok esetén. Ezzel szemben a bakteriális és retrovirális enzimek aktív centrumai a katalitikus hasítás után azonnal kinyílnak, ami lehetővé teszi a termék gyors távozását. A dUTPáz család evolúciója még további kutatások témáját képezi.
11
12
1.3. A trimer dUTPáz térszerkezete Mint az előző fejezetben írtam, a dUTPázok túlnyomó része homotrimer enzim, azaz három teljesen azonos polipeptid láncból áll. Ez a trimer szerveződés viszonylag ritka az enzimek körében. További érdekessége a szerkezetnek, hogy három teljesen azonos aktív hely van benne, és mindegyik kialakításában mindhárom fehérjealegység részt vesz. Szó esett arról is, hogy függetlenül a dUTPáz eredetétől 5 konzervatív motívum fedezhető fel a szekvenciában ( 3. ábra). Ezek mindegyike fontos szerepet játszik az aktív centrum kialakításában [13, 21, 24, 25]. A fehérjealegységek harmadlagos szerkezete egy nyolcszálas "jelly-roll" β-hordó. Ebben a szerveződésben az egyik β-szál a szomszédos alegységből származik, így a negyedleges és harmadlagos szerkezet nehezen választható el. A fehérje tehát túlnyomó részben β-redős, továbbá egy rövid α-hélixet is tartalmaz (4. ábra) [18, 21].
4. Ábra A trimer dUTPáz szerkezete. Jól látható, hogy mindhárom aktív centrum felépítésében mindhárom fehérjealegység részt vesz. Az aktív helyekhez koordinálódó ligandumok ez esetben a szubsztrátanalóg dUDP molekulák.
12
13
Az aktív centrumokat a három alegység a következő módon alakítja ki: Az egyik fehérjealegységtől származik az a torzult antiparalell β-hajtű, ami az uracil koordinálásáért felelős: az uracil beékelődik a β-hajtűbe és a DNS-ben megszokott bázispárosodási hajlamnak megfelelő hidrogén-hidakkal kapcsolódik a főlánc-atomokhoz. Ez a bázisfelismerési mechanizmus rendkívül specifikus, ugyanis a DNS-ben szokásos bázispárosodási módot utánozó kapcsolódás eleve csak az uracil és a timin beépülését teszi lehetővé, de a timin beékelődése a β-hajtűbe sztérikusan gátolt. Található továbbá egy Tyr sarokmotívum ( az E. coli dUTPázban Tyr93), mely a dezoxiribóz gyűrűvel átlapol, erősítve ezzel a szubsztrát, és sztérikus módon kizárva a ribonukleotidok kötődését (5. ábra) [21].
5. Ábra A fehérjealegységek konzervált motívumainak szerepe az aktív centrum kialakításában, és a szubsztrát megkötésében. Az első alegység β-hajtűje kék színű, a második alegység α-hélixéből származó rész piros, a harmadik alegység C-terminális régiója sárga, a dUDP pedig világoskék. Csak néhány, a szubsztrát megkötésében fontos szerepet játszó aminosav oldalláncot tüntettünk fel.
13
14
A másik fehérjealegység α-hélix régiójának arginil és szeril aminosav oldalláncai hidrogénkötéseket létesítenek a szubsztrát α-foszfát csoportjának oxigénjeivel. A harmadik alegység a C-terminális végével az aktív hely fölé hajlik, létrehozva ezzel az enzim zárt konformációját – de ez csak a teljes trifoszfát részt tartalmazó szubsztrát ill. szubsztrátanalóg kötődésekor valósul meg. Ez a glicin-gazdag C-terminális régió, mely minden alegységből mintegy kilógva a másik alegységhez nyúlik át, a legtöbb kristályszerkezetben nem is látszik, mivel az enzim ezen része rendkívül flexibilis, nem lokalizálható [13, 15]. Itt helyezkedik el az 5. konzervált szekvencia- motívum, ami a β- és γfoszfát-csoportok pontos koordinálásában és az α-β foszfátkötés hasításában játszik valamiképp szerepet. Eme motívum része egy szigorúan konzervált fenilalanin, amely az aktív centrum fölé hajolva hidrofób kölcsönhatásba lép a már koordinált uracillal. Ennek ellenére a szubsztrát kötődése ezen motívum hiányában is megtörténik, hasonló termodinamikai paraméterekkel, de a katalitikus aktivitás ilyenkor az eredetinek mintegy 2,4%-ára csökken [13]. A C-terminális régió szerepe további kérdéseket vet föl, különösen a prokarióta és eukarióta dUTPázok katalitikus ciklusa közti különbségek tekintetében [14]. Tudjuk, hogy dUTPáz fontos kofaktora a Mg2+ [26], de kristályszerkezetekben még nem sikerült a Mg2+ helyét kimutatni. Megjelent azonban egy közlemény az EIAV (Equine Infectious Anemia Virus) dUTPáz szerkezetről, ami tartalmazza a Mg2+ helyett katalitikus fémionként alkalmazott Sr2+-ot [20]. Ez alapján valószínűsíthető, hogy a kétértékű fémion szerepe az lehet, hogy az α- és a γ- foszfát csoportokat centrálisan orientálja. A fémion szerepének jellemzése még pontosításokra vár, amihez a legmegfelelőbb eszköznek látszik az EPR-ENDOR spektroszkópia módszere.
14
15
1.4.
A dUTPáz, mint új target molekula gyógyszerszintézisek számára Már bemutattuk, hogy a dUTPáz gén nullmutációja magas uraciltartalmú DNS-t
eredményez az osztódó sejtben, ami pedig a báziskivágáson alapuló javító mechanizmus következtében timinmentes sejthalálhoz vezet [27, 28]. Utaltunk arra is, hogy az ilyetén esszenciális jelentőségű dUTPáz specifikus gátlásával esetleg terápiás hatást érhetünk el a rákos vagy egyes vírusos megbetegedések gyógyításában. A dUTPáz gátlása elsősorban az aktívan osztódó sejtekre nézve káros, így remélhető, hogy megfelelő inhibítorral megakadályozható a tumorsejtek szaporodása, és ezt valóban sikerült elérni több tumor sejtvonal esetében is nem hidrolizálható szubsztrátanalógokkal [7]. A széleskörben használt kemoterápiás szer, a fluorodezoxiuridin hatékonysága rezisztencia kialakulása
miatt
idővel
lecsökken.
Kimutatták,
hogy
a
rákos
sejtek
dUTPáz
koncentrációjának megnövelésével ez a rezisztencia indukálható. Szintén a timinmentes sejthalált idézi elő egy másik, a klinikai gyakorlatban használt rákellenes gyógyszer, a methotrexát. Valószínűsíthető tehát, hogy a kemoterápia hatékonysága növelhető lenne dUTPáz-antagonisták alkalmazásával (6. Ábra) [29].
6. Ábra Kapcsolat a timidilát-szintáz (TS), dihidrofolát-reduktáz (DHFR) és a dUTPáz enzimek által katalizált reakciók között.
15
16
Kísérleti adatok támasztják alá azt is, hogy a virális dUTPáz gének olyan mutációja, mely az enzim aktivitását csökkenti, erősen gátolja a vírus fertőző és szaporodó képességét. Ez megfigyelhető a fertőző lóanémia vírus (EIAV), a macskafélék HIV vírusa esetén, valamint a humán herpes simplex I. esetén [8-11]. Főleg azon vírusok ellen lehetne a virális dUTPáz gátlásával hatékonyan küzdeni, melyek elsősorban differenciálódott sejteket támadnak meg. Ezen esetekben a gazdasejt alacsony dUTPáz szintje miatt a vírus szaporodásához szükség van a virális enzimre. Így például csökkenthető lenne a herpes simplex 1. neuroinvazív karaktere [9, 10].
mocsárláz a lovaknál
LENTIVÍRUSOK -fertőző lóanémia virus -macskafélék immunodeficiencia virusa
genitális herpes herpeszkiütés
AIDS a macskaféléknél
daganatos megbetegedések Herpes simplex vírus
Tumour sejtvonalak sertésláz
Afrikai sertésláz vírus EMBERI GOMBÁS KÓROKOZÓK Candida albicans
PARAZITÁK Leishmania major Trypanosoma cruzi
leishmaniasis (trópusi kiütés, dumdum láz)
FERTŐZŐ BAKTERIUMOK Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium leprae Haemophilus influenzae
candidiasis
Chagas betegség tuberkulózis lepra
bakteriális influenza
7. ábra: A dUTPáz gátlásában rejlő lehetőségek A betegségek listája (a nagy körön kívül) és az azokat okozó szervezetek (a nagy körön belül), melyek saját dUTPázukat kódolják genomjukban. A színes hátterű körökben lévő kórokozók esetében a dUTPáz gátlásának pozitív hatásáról már létezik dokumentáció. 16
17
1.5. EPR-ENDOR vizsgálatok szerepe a dUTPáz-katalízis mechanizmusának leírásában Számos nagyfelbontású szerkezet létezik már az eukarióta, prokarióta és retrovirális dUTPázokról, de ezeknek - mindamellett, hogy kiválóan leírják a fehérje háromdimenziós szerkezetét - alapvető hiányossága, hogy nem informálnak a katalízis mechanizmusáról: a katalitikusan fontos fémiont nem tudták azonosítani, így a funkciójáról sem tudtak információval szolgálni, továbbá a flexibilis C-terminális régió katalízisben betöltött szerepéről sem tudnak biztos adatokkal szolgálni, mivel eme régió kevéssé lokalizálható [17, 21]. Az EPR-ENDOR módszer eme hiányosságokat lenne képes pótolni, amennyiben megfelelő spincímkét találunk, ami egyben a dUTPáz kofaktora is lehet. Jelen munka épp az ENDOR spektroszkópia számára kitűnő spincímke, a vanadil kation hatását vizsgálja a dUTPáz katalízisre. Kezdetben végeztem méréseket a kevésbé kedvező spincímke tulajdonságú Mn2+-nal is, amit a későbbiekben - a VO2+ kompetenciájának igazolódásával párhuzamosan - elhagytam. Az EPR-ENDOR módszer elmélete A módszerben egyaránt alkalmazzák az EPR (elektron paramágneses rezonancia) és az ENDOR (electron nuclear double resonance - elektron-mag kettős rezonancia) spektroszkópia eszközeit. Az ENDOR spektroszkópia alkalmazásának alapfeltétele valamely paramágneses csoport (legalább egy párosítatlan elektron) és egy páratlan spinű mag (pl H +) megfelelő térbeli közelsége. A rezonanciaátmenetek az elektron- és a magspin mikrohullámmal valamint rádióhullámmal történő kölcsönhatása folytán detektálhatók, melyekkel egyszerre gerjesztjük a mintát. Az un. "szögszelektív ENDOR" módszere kiválóan alkalmazható VO2+ és OHspincímkék
esetén
fagyott
oldatfázisban
molekulák
háromdimenziós
szerkezetének
analízisére. Az alkalmazott mágneses tér (H0) a molekulákat bizonyos leszűkített orientációkban szelektálja. Az EPR spektrum un. fordulópontjai lehetővé teszik a molekulák 17
18
relatíve szűk szögintervallumban történő kiválasztását [30, 31]. A molekulában megfigyelhető a párosítatlan elektron abszorpciójának egy hiperfinom csatolódása (hfc) a mágneses maggal a mágneses tér vektorához. Ezt a csatolódást írja le a következő egyenlet: Aobs = ge * βe * gn * βn * (3 cos2α - 1) / hr3
+ Aiso
ahol Aobs a párosítatlan elektron megfigyelhető abszorpciója, ge és gn az elektron és mag g faktorai, βe és βn az elektron- ill a nukleáris magneton, r az elektron és a mag közötti sugárirányú szeparáció, α a H0 mágneses tér vektora és a mag-elektron dipol kölcsönhatás vektora által bezárt szög, Aiso pedig az izotróp Fermi konstans. A radiális szeparáció értékeléséhez szükséges kimérni az alapvető hfc komponensek ENDOR spektrumát, ezek a VO2+ esetén A┴ (α=90o) és A║ (α=0o). Ezen módszer matematikai és fizikai hátteréről bőséges irodalom létezik [30, 32-35]. A módszer azért nyújthat részletes szerkezeti információkat, mert nem csak dipoláris alapon történő elkülönítésen alapul, ami skalár mennyiségeket ad, hanem függ a hiperfinom mintázatoktól vagy relatív koordinátáktól is, tekintettel a molekula mágneses vektoraira, melyek fontos információkkal szolgálnak a molekula orientációját illetően. (un szögszelektív ENDOR) [30, 35]. A paramágneses VO2+ kation esetén a szögszelektív ENDOR koncepció alkalmazása azon a tényen nyugszik, hogy ebben a rendszerben a "g" tenzor alacsony anizotrópiát mutat és axiálisan szimmetrikus, valamint a gz komponens merőleges a molekula x-y síkjára [36-39]. A mérési rendszer az EPR spektrumból adódó gz komponensre párhuzamosan és arra merőlegesen telíthető az alkalmazott H0 mágneses térerővel. Íly módon az ENDOR mérés számára különböző orientációk választhatók ki, és az ezeknek megfelelő hiperfinom csatolások (hfc) elkülöníthetők. A kifejlesztett módszer fontos előnye, hogy (fagyott) oldatfázisú makromolekulák és makromolekula-ligand komplexek három dimenziós szerkezetét olyan adatokkal képes leírni, melyek csak az egykristályok röntgendiffrakciós analíziséből nyerhető nagyfelbontású szerkezetekhez hasonlíthatók [31, 36-46].
18
19
A vanadil kation, mint spincímke az ENDOR spektroszkópiás mérésekben Az NMR effektusokon alapuló módszer lehetőséget ad számunkra, hogy a VO2+ paramágneses kation koordinációs környezetének vizsgálata által bizonyos, a fémionszubsztrát-enzim terner komplexre vonatkozó szerkezeti információk birtokába jussunk. A
VO2+
ion
kedvező
spin-címkeként
működik
ENDOR
spektroszkópiás
szerkezetanalízisekben, hiszen rendelkezik mind párosítatlan elektronnal (3d1), mind páratlan spínű maggal. Egyike a legstabilabb kétatomos kationoknak, párosítatlan elektronja a 3dxy pályán foglal helyet. További előnye a VO2+ spincímkének a szintén gyakran használt Mn2+-nal szemben, hogy amennyiben a közeg pH-ja négy fölé emelkedik, a szabad állapotú vanadil kation polimerizálódva kicsapódik az oldatból, és a mágneses mérésekben nem szolgáltat jelet. Csupán az a vanadil populáció fog mérhető mágneses jelet adni, ami szerves molekulákkal való komplexálódás révén elkerüli a polimerizációt. Mustafi Devkumar és munkatársai több fehérje szerkezetvizsgálata esetén is alkalmazták már eredményesen a vanadil kation spincímkét. (Például az α-kimotripszin acilenzimének aktívcentrumának szerkezetmeghatározásához [43], a karboxipeptidáz enzim katalitikus konformációjának meghatározásához [44].) Ezen eredményekre alapozva reális lehetőség van a dUTPáz - amennyiben a vanadil ion kofaktora lehet az enzimnek - aktív centrumának jobb feltérképezésére, beleértve a C-terminális régió valamint a kofaktor fémion szerepének megértését is. A vanadil kation koordinációs szférájáról vizes oldatban, illetve víz-metanol elegyben rögzített ENDOR spektrumok alapján megállapították, hogy öt oldószermolekula koordinálódik a vanadil ion körül. Ezek közül négy ekvatoriális, egy pedig axiális pozícióban található. Az alkalmazott oldószertől függően a következő komplexek jönnek létre: [VO(H2O)5]2+, [VO(H2O)4CH3OH]2+, [VO(CH3OH)5]2+ [36]. Meghatározható a vanadil-nukleotid komplexek sztöchiometriája is, különböző nukleotid : VO2+ arányok alkalmazásával követve az EPR abszorpciós spektrum amplitudóváltozásait [37]. Az eredmények azt mutatják, hogy a vanadil kation két nukleotidot 19
20
képes koordinálni. Nem csak az ADP és analógjai esetében kaptak ilyen eredményeket, hanem a többi nukleotid esetén is (ld. 8. ábra vanadil-dUTP).
8. Ábra A vanadil-dUTP elegyben mért EPR spektrum amplitudói különböző dUTP:VO2+ aránynál. Az ábrán jól láthatóan az 1:2 aránynál jelentkezik egy éles töréspont az amplitudó növekedésében, ami arra utal, hogy eme arányon felül már nem képződik több vanadil-dUTP komplex.
Amennyiben az oldószer molekulák protonjainak zavaró hatását kiküszöbölik, pl D2O-t alkalmazva oldószerként, láthatóvá válik az EPR spektrum hiperfinom szerkezete, ami kvintett jellegű, közelítőleg 1:4:6:4:1 arányú csúcsintenzitásokkal. Ez azt jelenti, hogy négy ekvivalens csoport koordinálódik a vanadilhoz. Ezt az eredményt megerősítették
31
P ENDOR
alkalmazásával is. 1
H ENDOR eredményekből megállapítható volt, hogy a foszfátcsoportok
ekvatoriálisan helyezkednek el a vanadil ion körül, míg az oxigénnel ellentétes oldalon axiális helyzetben egy víz molekula koordinálódik. Tehát a vanadil-nukleotid komplexekben csak a foszfátcsoportok kapcsolódnak a fémionhoz, ezek ekvatoriális helyzetben, így a négy foszfátcsoport teljesen ekvivalens helyzetű [37]. A fenti megállapítások nukleotid trifoszfátok, és ezek analógjai esetén is ( GTP, GMP-Pβ-CH2-Pγ, GMP-Pβ-nh-Pγ [39], dUTP) érvényesnek bizonyultak. Munkahipotézisünk szerint annak során, amikor a szubsztrátanalóg dUDP vanadil
20
21
kationnal koordinálva épül be a dUTPáz aktív centrumába, a vanadil ion kölcsönhatásba lép a fehérje bizonyos aminosav oldalláncaival közvetlenül, vagy szerkezeti vízmolekulák által. Ez felderíthető lesz a VO2+-dUDP-dUTPáz terner komplex EPR-ENDOR vizsgálatával.
1.6. A vanádium oxidációs állapotai és a vanadil kation jellemzői A vanádium lúgos közegben főleg a színtelen HVO42- formában van jelen. Semleges vagy savas közegben ez a forma oligomerizálódik, és sárga színű di- és trivanadátok keletkeznek. Még alacsonyabb pH-n dekavanadát ionok (V10O286-), majd erősen savas oldatban (pH<1!) vanadil ionok (VO2+) képződnek. A vanádium színei az oxidációs állapottól függően: +5 oxidációs szám esetén (ld. HVO42-) színtelen, +4 esetén (ld. vanadil) kék, +3 esetén zöld, +2 esetén ibolya színű. A redukciós reakciók erősen pH-függők [47]. A nem frissen készített vanadil oldatban gyakran tapasztaltunk zöldes elszíneződést, ami valószínűleg nem a +3-as oxidációs állapotú forma jelenlétének tulajdonítható, hisz a pH nem volt olyan alacsony. Sokkal inkább a magasabb pH-jú és híg oldatban esetleg megjelenő HVO42- ionok polimerizációja miatt keletkező sárga di- és trivanadát ionok színe okozhatja az amúgy kék oldat bezöldülését. A vanadil törzsoldaton elkészítése után N2-t buborékoltattunk át kiűzendő a vízben oldott oxigént, hogy ezzel megakadályozzuk a vanadil oxidálódását, ami a 4 körüli pH-n (a törzsoldat pH-ja ilyen) a fent leírtak szerint bekövetkezne. Ezek után az oldat hűtőszekrényben jól tárolhatónak bizonyult, de a hígítást mindig frissen kellett készíteni, annál is inkább, mert a kinetikai mérésekhez szükséges volt a pH-t 7 körülire beállítani. A vanadil polimerizációját elkerülendő, az ekvimoláris vanadil-nukleotid elegyet - melyben a VO2+ a nukleotiddal komplexálódva stabilizálódik - még a pH beállítása előtt elkészítettem.
21
22
Végeztem méréseket vanadil-acetil-acetonáttal is, ahol a vanadil komplexben kötött állapotban van, ami nagyobb stabilitást biztosít a +4-es oxidációs állapotú forma számára. A komplex szerkezete látható az alábbi ábrán (9. ábra).
9. Ábra A vanadil-acetil-acetonát komplex szerkezete
A VOacac stabil szerkezethez hasonlóan stabil a VO2+ minden olyan formája, ahol a koordinációs helyeket más szerves molekulákhoz kötődő oxigén atomok töltik ki. Így például a nukleotid-di- ill. trifoszfátok foszfátcsoportjainak oxigén atomjai is kellő stabilizáló koordinálódó ligandumként szolgálhatnak. Az előző fejezetben leírt irodalmi adatok szerint ebben az esetben a következő szerkezet alakul ki (10. ábra) [37].
10. Ábra A vanadil-nukleotid-difoszfát komplex szerkezete
22
23
Ebben a szerkezetben a VO2+ - nukleotid sztöchiometria 1:2. Valószínű azonban, hogy a vanadil iont és a nukleotidot ekvimolárisan alkalmazva, a második nukleotid helyett vízmolekulák koordinálódnak a fémionhoz. Az is valószínű, hogy az enzim aktív centrumában csak egy nukleotid molekula szerepel a vanadil koordinációs partnereként, míg a szabad koordinációs helyekre esetleg egy aminosav oldallánc, vagy egy szerkezeti vízmolekula épül be. (A szerkezeti vízmolekulák a fehérjeszerkezetekben egyes oldalláncokkal kialakított hidrogén-kötések révén koordinálódnak)
23
24
2.
Anyagok és módszerek
2.1.
A felhasznált módszerek 2.1.1. A dUTPáz preparálása Az E-coli dUTPáz enzimet a BL21DE3pLysS-pET3a-dut baktériumtörzzsel
termeltetjük. Transzformálás A BL21DE3pLysS E. coli baktériumtörzset a pET3a-dut plazmiddal transzformáljuk [48]. Először a sejteket kloramfenikolos, steril LB lemezeken szaporítjuk egy hétig naponként átoltva, hogy biztosan a logaritmikus növekedési fázisban legyenek. A transzformálás előtti utolsó átoltás tápanyagban gazdagabb SOB táptalajú lemezekre történik. (Az LB, Luria-Bertani tápoldat élesztőkivonatot, triptont és ásványi sót tartalmaz, ugyanígy a SOB tápoldat, csak nagyobb koncentrációban.) Az antibiotikumot átoltás előtt szélesztjük a lemezeken, amiknek ezután két órát kell száradni a sterilfülkében. A BL21pDE3LysS baktériumtörzs már eleve tartalmazza a pLysS plazmidot, amin található egy kloramfenikol rezisztenciát kódoló gén, így a fent leírt tenyésztés során biztosan csak ez a törzs nő ki. A transzformálással célunk a baktériumsejtbe juttatni a pET3a-dut plazmidot, mely tartalmazza az E. coli dUTPáz génjét, közvetlenül ez előtt egy nagyon erős T7specifikus promoter régiót, továbbá egy ampicillin rezisztenciát kódoló gént. A sejtfal átmeneti megnyílását a plazmid számára az alkalmazott transzformáló puffer (TFB) magas sókoncentrációjával és hősokkal érjük el. 200μl TFB-ben egy kaccsnyi sejtet vortex-szel szétoszlatunk, majd 30 percig inkubáljuk jégen. Ezután hozzáadjuk a plazmidot, és újabb 40 percig jégbe tesszük. Ezt követően 45-50 másodpercre 42oC-os vízfürdő alkalmazásával hősokkoljuk a sejteket, aztán újabb 2 percre jégbe tesszük. Majd 800 μl SOC tápoldatban 45-50 percig 37oC-on rázatjuk, így nem szelektíven ugyan, de viszonylag gyorsan felszaporodnak a baktériumsejtek. Ezután már szelektív táptalajos kloramfenikolt és ampicillint egyaránt tartalmazó LB lemezeken szélesztjük a sejttenyészetet (100μl/lemez), melyeken másnapra egyedi kolóniák nőnek ki. A
24
25
baktériumtenyészet
20%-os
glicerin
pufferben,
folyékony
nitrogénben
gyorsan
lefagyasztva, -80 oC-on tárolható, és a sejtek életképesek maradnak. Expresszió A baktériumsejteket steril, szelektív (kloramfenikolt és ampicillint is tartalmazó) LB tápoldatban szaporítjuk. Így csak azok a sejtek maradnak életben és szaporodnak, amelyek még tartalmazzák a pLysS és az általunk bevitt pET3a-dut plazmidot. A sejtkoncentráció változását bizonyos időközönként vett minták optikai denzitásának spektrofotométeres mérésével követjük. A sejteket logaritmikus növekedési fázisuk elején indukáljuk IPTG-vel (izopropil-tiogalaktozid). Az IPTG a lac promoter ellenőrzése alatt álló T7 DNS-függő RNS polimeráz enzimet kódoló génről, amely a baktériumtörzs kromoszómáján található, megindítja a polimeráz expresszióját. Az így termelődött T7 polimeráz tevékenységét a pET3a-dut plazmidra irányítja a nagyon erős T7-specifikus promoter régió, ami a dUTPáz gén előtt helyezkedik el a plazmidon. Így az IPTG hozzáadásával a dUTPáz génről történő expressziót tudjuk beindítani [48]. Mintegy négy óra hosszat termeltetjük az enzimet, majd centrifugálás után feltárjuk a sejteket [49, 50]. Feltárás A feltárás lényege, hogy megbontsuk a sejtfalat, és a plazmában található, oldható fehérjéket – főleg a dUTPázt – sértetlenül oldatba vigyük. A sejtfal megbontásával azonban bizonyos proteázok működésbe lépnek, és kontollálatlanul rongálják a fehérjéket, ezért szükséges, hogy ezeket hatástalanítsuk, amit a lízis pufferbe adagolt EDTA-val és EGTA-val (amik a metalloproteázokat gátolják), valamint PMSF-fel érünk el (fenil-metil-szulfonil-fluorid, ami a szerin oldallánccal működő enzimeket – pl. tripszin, kimotripszin - specifikusan gátolja úgy, hogy velük kovalens komplexet képez). Továbbá DTT-t (ditio-treitol) is adagolunk a lízis pufferhez, ami megvédi a szabad SH csoportokat az oxidálódástól úgy, hogy a DTT maga oxidálódik. Az utóbbi két anyagot (PMSF, DTT)– lévén bomlékonyak – mindig frissen adjuk a pufferhez. A feltáráshoz a sejteket homogenizáljuk a lízis pufferben, lizozim hozzáadásával a sejtfalat megbontjuk, amit egymás után következő gyors lefagyasztásokkal és felolvasztásokkal teszünk teljessé. Ezután lecentrifugáljuk az elegyet. A felülúszóban található a dUTPáz számos 25
26
más fehérjével együtt. Elválasztás A felülúszót dializáljuk a kromatográfiás elválasztáskor használt "A" pufferben (25mM Na, K-foszfát pH=6,00, 1mM DTT, 0,5mM PMSF). A dUTPáz ioncserélő kromatográfiás elválasztása Gradifrac készüléken QSepharose anioncserélő gyantán történik (Pharmacia Biotech Fast Flow). A készülék programozható. Általunk megadható paraméterek: az áramlási sebesség, a gradiens B időtartama és jellege, a frakciók szedése ill. nem szedése, valamint az egyes frakciók szedésének ideje. A műszerbe épített, 280nm-re beállított spektrofotométer detektálja a rajta átfolyó oldat elnyelését, ami arányos a fehérjekoncentrációval. Ezt a jelet rajzolja ki a rekorder. Miután az oszlopot az "A" pufferrel egyensúlyba hoztuk, és felvittük rá a fehérjeoldatot, először "A" pufferrel mossuk, míg az oldatban lévő fehérjék egy része (amelyek nem tudnak megkötődni a gyantán, mert nincs megfelelő negatív töltésük) kimosódik (11. ábra). Ezután "B" gradienst alkalmazunk. (a "B" puffer az "A"-hoz képest még 1M NaCl-ot is tartalmaz) A gradiens ideje alatt összesen 2-2 oszloptérfogatnyi "A" ill. "B" megy át az oszlopon. A növekvő sókoncentráció következtében fokozatosan távoznak a gyantán megkötődött egyéb fehérjék is. A gradiens alatt frakciókat szedünk. A dUTPáz 50-60% "B"-nél egy éles és magas csúcsot ad (ld. 11.ábra).
11. Ábra A dializált fehérjeoldat kromatográfiás elválasztása anioncserélő oszlopon. A kromatogramon 50-60% "B"-nél éles csúcs jelzi a dUTPáz-tartalmú frakciók eluálódását. 26
27
A fehérjekoncentráció és aktivitás mérése a megfelelő frakciókból UV/VIS spektrofotométerrel történt. A dUTPáz koncentráció meghatározását 280 nm-en végeztem. Az E. coli-ból származó dUTPázra az ε0,1%1cm,280=0,52 [2]. Az aktivitásmérés 559 nm-en 40 µM fenolvörös indikátort tartalmazó pufferben történik (részletesebb leírást lásd a következő fejezetben). A fehérjepreparátum tisztaságát a szokott módon gélelektroforézissel ellenőriztük.
27
28
2.1.2. Kinetikai analízis A kinetikai vizsgálatokban a dUTPáz által katalizált dUTP → dUMP + PPi reakció lefolyását spekrofotometriásan követhetjük. A reakció során protonok is szabadulnak fel, és ezek mennyisége egyenesen arányos a képződő termék (dUMP) mennyiségével. Az aktivitás méréshez használt elegy összetétele: 1mM TES/HCl, pH=7.5, 150mM KCl, 40µM fenolvörös sav-bázis indikátor. Az elegy tehát csak gyengén pufferolt (alacsony a pufferként használt TES és fenolvörös koncentrációja). Így a dUTP hidrolíziséből felszabaduló protonok a közeget mérhető mértékben savanyítják. A pH változást az indikátor színváltozásán keresztül követjük, 559nm-en mérve az oldat abszorbanciáját. A méréseket JASCO-V550 spektrofotométeren, 10mm-es küvettákban, 25oC-on végeztem [13, 15]. A reakció kinetikai paraméterei meghatározhatók az így kapott görbékből. A mérések kiértékelésekor az enzimkinetikában általánosan használt Michaelis-Menten leírást alkalmazzuk, az ún. rapid equlibrium meglétét feltételezve. Az enzimkoncentrációt a monomerre számoljuk. A dUTPáz esetén az enzimkatalízis leírható a k1 E
+
S
k2 ES
P + E
k-1 egyenlet segítségével. A Michaelis-Menten kinetikai modell alapján a kezdeti sebességnek a kindulási szubsztrátkoncentrációtól ([S]0) való fűggését hiperbola írja le (12. ábra).
12. Ábra Egy tipikus szubsztráttelítési görbe.
28
29
A hiperbola egyenlete: v0 = vmax * [S]0 / (KM + [S]0), ahol vmax (=[E]össz*kkat) és KM állandók és adott enzimkoncentráció esetén az adott reakcióra jellemzők, vmax az enzimreakció maximális kezdeti sebessége, kkat a katalízis reakciósebességi állandója, KM a MichaelisMenten állandó, v0 a kezdeti sebesség, [S]0 a kezdeti szubsztrátkoncentráció, [E]össz pedig az enzim összes koncentrációja. Ha feltételezzük, hogy az ES komplex képződése és disszociációja egyaránt sokkal gyorsabb, mint a termék képződése (rapid eqilibrium), akkor érvényes lesz a reakcióra a Michaelis egyenlet. Amennyiben eme feltétel teljesül, a reakció minden pillanatában az [S], [E], [ES] koncentrációk az ES komplex disszociációs állandója által megszabott értékűek lesznek, azaz mindvégig fennáll a Ks = [E]*[S]/[ES] összefüggés. A termék keletkezésének kezdeti sebessége a következő képp írható fel: V0 = ∆[P] / ∆t = k2 * [ES] A
végtelen
nagy
szubsztrátkoncentrációhoz
tartozó
reakciósebesség
(vmax)
hasonlóképp felírható, de [ES] helyett írhatunk [E]össz-t, hiszen igen nagy [S] esetén a kettő egyenlőnek vehető. Tehát felírható, hogy v0 / vmax = k2 * [ES] / k2 * [E]össz = [ES] / ([E] + [ES]) Figyelembe véve a rapid eqilibrium kikötést, az [E] kifejezhető: [E] = K s * [ES] / [S], és behelyettesíthető a fenti egyenletbe, amiből átrendezés után megkapható a hiperbola egyenlete: v0 / vmax = [ES] / (Ks * [ES] / [S] + [ES]) = 1 / (Ks / [S] + 1) = [S] / (Ks + [S]) v0 = vmax * [S]0 / (Ks + [S]0) Látható, hogy a rapid eqilibrium közelítést alkalmazva a Michaelis állandó megegyezik az ES komplex disszociációs állandójával. Amennyiben ezt a közelítést nem lehet használni, a KM kifejezése bonyolultabb lesz, de az egyenlet továbbra is érvényes marad. Használatos továbbá a fenti egyenlet integrált alakja is (integrált Michaelis- Menten egyenlet). 29
30
Első közelítésben meghatározhatók a kezdeti sebességek a görbék kezdeti meredekségéből. A különböző szubsztrátkoncentrációknál (de azonos enzimkoncentrációnál!) mért kezdeti sebességeket ill. az ezekkel arányos ∆abs/sec meredekségeket ábrázolva a szubsztrátkoncentráció
függvényében
megkapjuk
a
szubsztráttelítési
görbét
adott
enzimkoncentráció esetén. Ezekből a telítési görbékből már megközelítőleg leolvasható a vmax és a KM értéke. Ennél pontosabb eredményekhez jutunk, ha az integrált Michaelis-Menten egyenletet használjuk. [P]t / t = vmax – KM * ln([S]0 / ([S]0 – [P]t)) / t Ahol a [P]t a termék koncentrációja az adott t időpontban, vmax a reakció maximális sebessége, KM a reakcióra adott enzimkoncentrációnál jellemző Michaelis állandó, [S]0 pedig a kezdeti szubsztrátkoncentráció. [P]t kiszámolható a mért abszorbanciaértékek és az [S]0 ismeretében: [P]t = (A0 – At) / ∆Atot * [S]0 ahol A0 a kezdeti, At a t időpillanatban mért abszorbanciaértékek, ∆Atot pedig a reakció alatt bekövetkezett totális abszorbancia csökkenés. A mért adatokból generálhatók a [P]t / t és a ln([S]0 / ([S]0 – [P]t)) / t értékek, mely adatokra egyenest illesztve egyszerűen megkaphatók a reakció kinetikai paraméterei. A katalízis reakciósebességi állandója (kkat) pedig számolható vmax-ból és az összes enzimkoncentrációból: kkat = vmax / [E]össz
30
31
2.1.3. Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia elmélete A CD spektroszkópia nagyon hatékony módot kínál királis molekulák térszerkezetének vizsgálatához. Alapja, hogy az optikailag aktív anyagok a jobb ill. bal irányban cirkulárisan polarizált fénnyel különböző módon lépnek kölcsönhatásba. A lineárisan polarizált fény két, ellentétes irányú cirkulárisan polarizált komponensre bontható. Így az optikailag aktív anyagon átbocsátott lineárisan polarizált fény, annak komponenseire vett moláris abszorpciós koefficiensek különbözősége miatt, elliptikusan polarizálttá válik, és a törésmutatók különbözősége miatt a polarizáció iránya az eredetihez képest meghatározott szöggel elfordul. Tehát kétféle jelenségről is szó van: az optikai rotációs diszperzió (ORD) és a cirkuláris dikroizmus (CD) együtt jelentkezik. Az ORD abból adódik, hogy a királis közegnek különbözõ a törésmutatója a balra ill. jobra cirkulárisan polarizált fénykomponensekre nézve. nb-nj≠0 Ezért a közegen való áthaladás után a lineárisan polarizált fény síkja meghatározott szöggel elfordul, hiszen a kijövõ fénykomponensek nem lesznek azonos fázisban. Az elforgatás szöge: α=πl(nb-nj)/λ ahol λ a hullámhossz, l a közegben megtett út. Az elforgatás mértéke a hullámhossz függvényében változik, ez az ORD jelensége. Természetesen ehhez nem szükséges, hogy az adott hullámhossztartományban legyen az anyagnak fényelnyelése. A CD alapja, hogy az optikailag aktív anyagok különböző mértékben nyelik el a lineárisan polarizált fény cirkulárisan polarizált komponenseit, azaz különbözőek a moláris abszorpciós koefficiensek: ∆ε = εb-εj ≠ 0
31
32
Ennek megfelelően az eredetileg lineárisan polarizált fény a közegen áthaladva elliptikusan polarizálttá válik. Ez a jelenség nyilván csak azon hullámhossztartományokban lép fel, ahol a molekula fényt nyel el. A CD spektrométerrel a ∆A-t, azaz a balra és jobbra cirkulárisan polarizált fénykomponensek abszorpciójának különbségét, vagy az ezzel arányos ellipticitást (Θ) mérjük. A kettő közti összefüggés: Θ = 2,303 (Ab-Aj)/4 A CD mérőszáma lehet a ∆ε vagy az ezzel arányos moláris ellipticitás[θ] [θ] = 3300 *∆ε Mint köztudott a fehérjéket felépítő aminosavak – a glicin kivételével – királisak, továbbá a fehérjék kromofor csoportjai - a peptidkötések és az aromás oldalláncok - egyaránt akirálisak. Adódik azonban kiralitás az önmagukban akirális kromoforok molekulán belüli aszimmetrikus környezetéből, és ilyenkor is fellép a cirkuláris dikromizmus jelensége. Ezért a fehérjemolekuláknak van CD spektrumuk. A fehérjék ismétlődő kromoforja az amid csoport, aminek távoli UV tartományban van jellemző elnyelése (230-210nm és 190-200nm), ezért 250nm alatt a CD spektrumot az amidcsoportok határozzák meg. Közeli UV-ban az aromás oldalláncú aminosavaknak van jellemző elnyelése 280nm körül, ill a diszulfid hidaknak 250-260nm-nél [51]. A távoli UV-ben felvett CD spektrumok alkalmasak a másodlagos szerkezeti elemek arányának becslésére a fehérje molekulában. Ezekre a számításokra többféle módszer is kínálkozik, célszerű adott esetben többet is alkalmazni a pontosabb becslés végett. Az E. coli dUTPáz esetében a távoli UV-ben felvett CD spektrumból számított szerkezeti adatok jól egyeztek a kristályszerkezet adataival [13]. Közeli UV tartományban egy fehérjének az aromás oldalláncok miatt lehet jellegzetes CD-spektruma. Továbbá az E. coli dUTPáz esetében az ilyen mérések alkalmasak
32
33
a szubsztrát aktív centrumhoz való kötődésének leírására. A szubsztrát vagy szubsztrátanalóg molekulák fehérje távollétében mért CD spektrumában az uracil gyűrű miatt egy jellegzetes csúcs mutatkozik, melynek maximuma 270 nm-nél van [13, 25]. Amennyiben a szubsztrátanalóg kötődik az aktív centrumhoz, szignifikáns különbség mutatkozik a dUTPáz – szubsztrátanalóg elegy közeli UV tartományban felvett CD spektruma és az enzim ill. szubsztrát külön felvett spektrumából számolt összeg között. Ezen különbség az enzim-szubsztrát komplex kialakulását jelzi, mivel a ligandum kötődése okozta konformációváltozás perturbálhatja a fehérje és/vagy a ligandum CD spektrumát. Az E. coli dUTPázban a 3. motivum tirozinja funkcionálisan rendkívül fontos (ezt támasztja alá az a tény is, hogy szigorúan konzervált: majdnem minden dUTPázban megtalálható), részt vesz a szubsztrát megkötésében [24, 25, 52]. Többek között ez a tény is oka lehet a fent leírt spektrális változásoknak, melyekből tehát a szubsztrát vagy szubsztrátanalóg aktív centrumhoz való kötődésére következtethetünk. Természetesen a spektrális jelekben tapasztalt változás, melyet a komplexálódás idéz elő, nem tulajdonítható egyértelműen sem csupán a nukleotid ligandumnak, sem csupán az enzim oldalláncainak. Ezek kapcsolódása indukálja a differencia spektrumot.
33
34
2.1.4. Izotermális titráló mikrokalorimetria (ITC) A módszer alkalmazásával lehetőség nyílik a szubsztrátkötődés termodinamikai paramétereinek meghatározására. A műszer állandó nyomáson és hőmérsékleten méri az oldatban a makromolekulához történő szubsztrátkötődés okozta hőmennyiségváltozásokat. Innen számolhatók a kötődésre jellemző termodinamikai paraméterek: ∆S, ∆G, ∆H, valamint a kötőhelyekre vonatkozó adatok [53-55]. Az izotermális titráló mikrokalorimetriában a mérő cellában lévő oldatot titráljuk a reaktáns oldatával egy, a műszerbe épített mikrofecskendő segítségével. Az injektáló berendezés automatikus, és nem csak a reaktáns megfelelő pontos adagolását végzi, hanem lapátszerűen kiképzett végével, gyors forgással keveri is a reakcióelegyet az egyenletes anyag- és hőeloszlás biztosítása végett. Az elegyedéssel és az esetleges reakcióval hő fejlődik vagy nyelődik el, amelyet a műszer automatikusan kompenzál, közben mérve a kompenzáláshoz szükséges elektromos munkát. Ez a munka egyenlő a változásokkal járó hőfejlődéssel, ill hőelnyelődéssel: |Q| = |W| és ∆U = 0 izoterm változások esetén. A hőváltozásokat mindig egy, a műszerbe épített referencia cellához képest mérjük. Így nagy pontosságú adatsorokhoz jutunk. Egy tipikus mérési görbe látható az ábrán: a műszer a reaktáns arányának függvényében jelzi ki az időegység alatt bekövetkező hőmennyiség-változást. Esetünkben a reaktáns a megfelelő fémion-dUDP elegy, amivel a cellában lévő E. coli dUTPáz oldatát titráljuk. 13. Ábra A felső ábra közvetlenül a mért hőváltozásokat ábrázolja, melyek nagysága függ az injektálás mennyiségétől is. (Kezdetben kisebb részletekben injektáltunk)
Az alsó ábra már az injektált térfogatokkal, a kezdeti koncentrációkkal és az injektálások miatti hígulással korrigált adatsorból számított hőmennyiségváltozásokat mutatja.
34
35
A mikrokalorimeter számítógépvezérelt, és a mért adatok kiértékeléséhez is rendelkezésre áll egy külön szoftver (MicroCal Origin itc), ami a mért pontokra illesztett görbéből számítja a megfelelő termodinamikai paramétereket. Szükséges megadnunk a cellában lévő anyag és a titráló fecskendőben lévő anyag koncentrációját, ezek ismeretében a hígulással is számolva a program megszerkeszti a korrekt titrálási görbét (ld. 13. ábrán alul). Ezután a molekulán belüli kötőhelyek számától és viszonyától függően több féle modell alapján illeszthető görbe a mért adatokra, ennek paraméterei alapján a katalízis termodinamikailag jellemezhető. Az egyes injektálások után felszabaduló hő kifejezhető a következő képpen: Q = n * XES*[E]0* ΔH*V0 ahol n a kötőhelyek száma a molekulán belül, XES az enzim-szubsztrát komplex anyagmennyiség aránya az összes enzim mennyiségéhez képest, [E]0 az enzim összkoncentrációja, ΔH a szubsztrátkötődés okozta moláris szabadentalpia-változás, V0 pedig a cella térfogata. Mivel XES minden egyes injektálás után más értékű, célszerű kifejezni az enzim-szubsztrát komplex stabilitási állandója segítségével. K = XES / ((1-XES)* [S]) Ha figyelembe vesszük, hogy [S] = [S]0 - n*XES*[E]0, a következő másodfokú egyenlet adódik XES-re: XES2 - XES*(1+ [S]0/(n*[E]0)+ 1/(n*K*[E]0)) + [S]0/(n*[E]0) = 0 Ennek a másodfokú egyenletnek a megoldóképletét behelyettesítve a Q kifejezésébe látható, hogy - amennyiben megadtuk a kiindulási enzim és szubsztrát koncentrációt, és a hígulásokkal is számoltunk minden lépésben - három paraméter (n, K, ΔH) variálásával illeszthető a kapott egyenlet szerint görbe a mért adatokra.
35
36
Tekintve a műszer érzékenységét célszerű a különböző effektusokból származó hatásokkal korrekciót végezni: ezeket külön-külön megmérni, és a mért görbéből levonni. Ilyen egyéb hőhatások: a reaktáns hígulásával járó hőeffektus (ez a legjelentősebb), az enzim hígulásával járó hőeffektus (ami általában elhanyagolható), az alkalmazott puffer ionizációs ill. protonálódási hője. Ez utóbbi kiküszöbölése végett szoktak párhuzamos vizsgálatokat végezni különböző pufferekben is. A mérésekhez általam használt puffer: 250mM MOPS, 50mM KCl, 11,25mM NaOH (ez utóbbi a pH beállításához volt szükséges) pH=7,1. A dUTPázt egy éjszakán át dializáltam a pufferben (657µM), a dUDP-nek vizes oldatát használtam (85mM), ugyanígy a Mg2+ és a VO2+ ionoknak is.
A mérési eredmények kellő pontosságú kiértékelhetőségéhez fontos, hogy megfelelő enzimkoncentrációt alkalmazzunk. A méréseket általában meglehetősen tömény oldatban végezzük. A megfelelő koncentrációt előre megbecsülhetjük következő egyenlet alapján, amennyiben legalább közelítőleg ismerjük az enzim-szubsztrát komplex stabilitási állandójának az értékét. 10 < Ka * C < 50 ahol Ka az enzim-szubsztrát komplex stabilitási állandója, C pedig a mintatartó cellában lévő anyag koncentrációja. Megbecsülhető továbbá a fecskendőben lévő ligandum kívánatos koncentrációja, ha van információnk a makromolekulán lévő ligandkötőhelyek számát illetően a következő egyenletek alapján az alkalmazott fecskendő térfogatától függően: 100μl-es fecskendő esetén: Cligandum = 20 * n * C 250μl-es fecskendő esetén: Cligandum = 7 * n * C ahol n a makromolekulán lévő kötőhelyek száma, C pedig a cellában lévő enzim koncentrációja. Az a jó, ha olyan titrálási görbét tudunk kimérni, amelynek mind az eleje, mind a vége jól látható, és a görbe S alakja erőteljes. Az ITC módszert dUTPáz ligandumkötésére eddig még nem használták, a jelen dolgozat tartalmazza az első ilyen leírást.
36
37
A mérés kivitelezése: Első lépésben betöltjük a cellába a pufferben oldott enzimet, és az injektáló fecskendőbe a megfelelő fémion-dUDP oldatot. Az oldatok betöltése után a fecskendőt a cellába helyezzük. A program elindításával, először beállítjuk a megadott hőmérsékletet (25oC), a hőegyensúly beállása után kezdődik a tulajdonképpeni mérés. Az előre megadott paramétereken lehetőség van változtatni mérés közben is, de ezt követően már minden művelet teljesen automatizált. Miután a titrálási görbe telítésbe megy, befejezhető a mérés. Ezután a fecskendőben maradt reagens oldatával titrálva az üres puffert hasonlóképp megmértem a ligandum hígulásával járó hőhatást is, amivel korrigáltam a mérési eredményeket.
37
38
2.1.5. FPLC (gyors fehérjeelválasztási folyadék kromatográfia) A kromatográfiás elválasztás alapja egy porózus szilárd és az azon átáramló folyadék fázis közötti megoszlás. Az elválasztás az állófázis és a minta részecskéi közti szorbciós és deszorbciós folyamatok eredménye a minta oszlopon való áthaladása során. Bármikor a mozgófázisban található molekulák relatív mennyisége meghatározza, hogy a komponens milyen gyorsan halad át az oszlopon. A minta komponenseinek retencióját a szilárd fázis szemcséin való, különböző mértékű, reverzibilis megkötődésük okozza. A különböző molekulák különböző retenciós faktorral rendelkeznek. Tehát várható, hogy minden komponens – anyagi minőségtől függően – meghatározott időben eluálódik, egyenletes haranggörbével vagy Gauss-görbével leírható csúcs formájában lép ki az oszlopból. Az anyagi minőségre jellemző a retenciós idő, jellemző továbbá a szomszédos csúcsok retenciós ideje közti különbség, és minden komponens esetén a sávszélesség. A folyadékkromatográfiában az oszlop hatékonyságát az elméleti tányérszámmal jelzik: N = 16(tR/tB)2, ahol tR a retenciós idő, tB pedig a sávszélesség. Az elméleti tányérszám arányos az oszlop hosszával: N=L/H ahol L az oszlop hossza, H pedig az arányossági tényező, melyet elméleti tányérmagasságnak is hívnak. Az elválasztás érzékenysége szempontjából ideális az, ha minél kisebb a H és minél nagyobb az N. Ezért előnyös a hosszú oszlop, lassan áramló eluens, apró szemcsés oszloptöltet, kis viszkozitású oldószer, nagyobb hőmérséklet alkalmazása. Az FPLC technika a hagyományos folyadékkromatográfia és a HPLC között foglal helyet mind műszerezettség tekintetében, mind hatékonyságában. Az elválasztás megnövelt nyomáson (1,5-4,5MPa) történik. Mi nem fehérjeelválasztásra használtuk, hanem a a dUTPáz katalizise során
38
39
képződő dUMP és a visszamaradó dUTP elválasztására. Ezért Mono Q anioncserélő oszlopot alkalmaztunk, melyen a mono- és trifoszfát csoportok eltérő nagyságú negativ töltéseik miatt
különböző mértékben képes megkötődni a termék dUMP és az esetleg visszamaradt dUTP. A
katalízis
során
időnként
mintát
vettünk,
és
EDTA
hozzáadásával
befagyasztottuk a reakciót. A különböző időpillanatokhoz tartozó mintákat analizáltuk az FPLC alkalmazásával. A mérés kivitelezése Összeállítottam a reakcióelegyeket: 20mM TES pH=7,0, 300µM dUTP, 10mM MgCl2 vagy VOSO4 vagy fémion nélkül, 3nM enzim.* Az enzim hozzáadása előtt vettem mintát, ez a 0. időpillanathoz tartozó. A dUTPáz hozzáadása után a 20. percben újra mintát vettem (75µl), és EDTA-val (150µl 0,1M) befagyasztottam a reakciót. Ezt mindhárom esetben elvégeztem, majd a mintákat kromatografáltam Mono Q anioncserélő gyantán, FPLC készülékben. “A” pufferként 50 mM AMBIK-ot (pH=7,92), “B” pufferként pedig 400 mM AMBIK-ot (pH=7,73) használtam. Miután az FPLC készüléket átmostam, és az oszlopot egyensúlyba hoztam az “A” pufferrel, az adott mintát “A” pufferrel 3ml-re hígítva az oszlopra injektáltam. Ezután “B” gradienst alkalmaztam, így a növekvő sókoncentráció hatására az oszlopon adszorbeálódott anionok kötődésük erőssége szerint eluálódtak. Az eluálódott anyagokat beépített, 280 nm-re beállított spektrofotométer detektálja. 280nm-en az uracil jelentős elnyeléssel rendelkezik (bár elnyelési maximuma 260 nm környékén van). Így a dUTP, dUMP nukleotidok egyaránt detektálhatók. A rekorder kirajzolja a detektor jelét a "B" puffer %-os arányával együtt
2.1.7. Nagyfeloldású szerkezet elemzése A szerkezeti leírásokhoz a Swiss-PdbViewer programcsomagot alkalmaztuk. (http:\\www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html) *
Megjegyzés: Ezekben a kezdeti mérésekben még nem fordítottunk különös figyelmet a VO2+-dUTP komplex létrehozására. A későbbi spektrofotometriérések során viszont már a közeg finom szabályozásának igényével, gondoskodnom kellett a vanadil megfelelő komplexálásáról, még az enzimreakciót megelőzően. 39
40
2.2.
Felhasznált anyagok
40
41
Izopropanol KCl Kloramfenikol Lizozim MgCl2 MnCl2 MOPS Na2HPO4 Na-acetát NaCl NaH2PO4 NH4HCO3 Phenol-Red PMSF
Reanal 34080-1-01-65 11230497 60,10 g/mol Reanal MSZ24234 11078 74,56 g/mol C-7795 Sigma 56-75-7 323.1 g/mol Reanal 12108 Reanal analitikai tisztaságú AnalaR Mn(II)Cl2 4H2O 197,9 g/mol 99% M-1254 Sigma Lot 93H5713 209,3 g/mol Reanal 00815-03-38 177,99 g/mol Reanal MSZ 9519 136,08 g/mol Reanal 24640-1-01-38 58,44 g/mol Reanal 04425-08-38 puriss 119,98 g/mol A-6141 Sigma Lot 49H0375 79,06 g/mol Merck Art 7241 0142825 354,38 g/mol Fluka AG CH-9470 Buchs 34444 487 174,2 g/mol
Q Sephorose Fast Flow TES Tripton Vanadil-acetil-acetonát VOSO4
3.
P-7626 Sigma 174,2g/mol Pharmacia Lot TD212181 17-0510-01 in 20% etanol T-1375 Sigma Lot 54H5715 229,2 g/mol Reanal 32151-1-99-30 26390699 Aldrich: 21,287-3, 99% 265,16 g/mol VOSO4 5H2O 253 g/mol
Eredmények és értékelés
3.1. Vanadil hatása az enzimaktivitásra A mérésekben arra kerestem a választ, hogy a vanadil kationnak, mint katalitikus fémionnak milyen hatása van a dUTPáz katalízisre. Ezt összevetettem a Mg 2+ katalitikus hatásával. Kezdetben Mn2+-nal is végeztem méréseket, de miután a vanadil ion is hatékonynak bizonyult, a Mn2+-t a továbbiakban nem vizsgáltam.
3.1.1. A vanadil katalitikus kompetenciája. Szakaszos enzimkinetikai vizsgálatok (FPLC technika) Az FPLC technikát azért választottuk, mert viszonylag gyors és megbízható, jóllehet kvalitatív információval szolgálhatott a vanadil katalitikus kompetenciáját illetően. Az alkalmazott koncentrációk: 300μM dUTP, 10mM a megfelelő fémionból, 3nM dUTPáz 20mM TES pH=7.0 pufferben. A reakció 0. ill. 20. percében vett mintákat Mono Q
41
42
anioncserélő gyantán analizáltam az FPLC készülékben. Az 14. ábra első kromatogramján, ami a reakció 0. percéhez tartozik, számottevő mértékben csak a dUTP-re jellemző csúcs jelentkezik kb. 90% "B"-nél. A dUMP-re jellemző csúcs 50% "B" körül található a 20 perces reakciót követő minta kromatogramján. A két ábrát összevetve jól látható a dUTP koncentrációjának csökkenése és a dUMP termelődése a reakció előrehaladtával.
14. Ábra A 0. és a 20. perchez tartozó kromatogramok VOSO4 alkalmazása esetén. A kék vonal a detektor jele, a "B" puffer %-os arányát ("B" gradienst) a ferde piros vonalak mutatják.
A méréseimből kiderült, hogy a VO2+ katalitikusan kompetens a dUTPáz katalizálta reakcióban, a Mg2+-hoz hasonlóan kofaktora lehet az enzimnek. A kromatogramok jól láthatóan mutatták a dUTP jelentős fogyását és a termék dUMP mennyiségének növekedését a VO2+ és a Mg2+ alkalmazása esetében egyaránt. A fent közölt eredmények ugyan kvantitatív kiértékelésre nem tarthattak számot, de
42
43
megbízható információval szolgáltak a vanadil kation katalitikus hatékonyságáról, mely ezek után behatóbb vizsgálat tárgyát képezhette.
43
44
3.1.2. Kezdeti sebesség meghatározása. Folyamatos enzimkinetikai vizsgálatok A dUTPáz által katalizált dUTP → dUMP + PPi reakció lefolyását folyamatos spekrofotometriás módszerrel követtük. Az alkalmazott enzimkoncentráció 100 ill. 50nM volt. Az enzimkoncentrációt a monomerre számoltuk. A felvett görbék kezdeti szakaszára egyenest illesztve megkaptuk az adott szubsztrátkoncentrációnál jellemző kezdeti sebességet (abs/s egységben). A mérési görbe nagyobb részének lefutása jó közelítéssel egyenes (15. ábra). Megjegyzendő azonban, hogy VO2+ ill. Voacac alkalmazása esetén a görbék kissé elhajlanak, ami összhangban lehet a vanadil-dUDP-enzim terner komplex kisebb stabilitási állandójával - mint azt a negyedik fejezetben látni fogjuk. (A mérés során biztosítani kellett, hogy az oldatok pH-ja állás közben ne változzon jelentős mértékben, mert az abszorbanciaváltozás csak egy bizonyos tartományban (0.7-1.0) vehető egyenesen arányosnak a pH változásával, azaz a termék képződésével. Ezt a kiindulási szubsztrátkoncentráció limitálásával (max. 200µM) értük el.)
15. Ábra Egy tipikus mérési görbe. A kezdeti vízszintes vonal az enzim hozzáadása előtti abszorbanciát mutatja a fémion-dUTP-t tartalmazó pufferben. A nyíl jelzi az injektálást, ami kb. 3 másodpercig tart (hiányzó adatok). Látható, hogy a görbe nagyobb szakasza jó közelítéssel egyenes, csak 100%-hoz közeli konverziónál görbül jelentősen.
Az azonos enzimkoncentrációhoz tartozó kezdeti sebességeket ábrázoljuk a szubsztrátkoncentráció függvényében, így megkapjuk a szubsztrát-telítési görbéket, melyekre az enzimkinetikában általánosan használt Michaelis-Menten leírás alapján hiperbolát 44
45
illeszthetünk:
v0 = vmax * [S]0 / (KM + [S]0)
28
voso mg voac
k/ (1/s)
21
14
7 0
30
60
90
120
150
180
210
[dUTP] / (µ M)
16. Ábra Szubsztráttelítés a különböző fémionok alkalmazása esetén. Az illesztett görbék paraméterei: VOSO4 esetén kkat=27,4±1,9 KM=8,6±2,4; Mg2+ esetén kkat=14,76±0,59 KM=1,6±1,2; Voacac esetén kkat=25,55±0,76 KM=10,5±2,0.
A görbék alapján elmondható, hogy VOSO4 és VOacac jelenlétében az enzim-dUTP komplex KM értéke szignifikánsan magasabb, mint Mg2+, Mn2+ vagy jelenlétében. A Mn2+-nal végzett mérések eredményét nem tüntettem fel az ábrán, de elmondható, hogy ekkor a Mg2+os esethez nagyon hasonló eredményeket adott. Továbbá az enzimreakció maximális sebessége VOSO4 vagy VOacac jelenlétében hozzávetőleg kétszeresére nő a többi esethez viszonyítva. Az is látható továbbá, hogy VOSO4 esetén kissé nagyobb a katalízis maximális sebessége, mint Voacac esetén. Az így kapott telítési görbéből első közelítésként jól megbecsülhető a KM értéke. Még szükséges lenne alacsonyabb szubsztrátkoncentrációknál is meghatározni a kezdeti sebességeket ahhoz, hogy megbízható paramétereket kapjunk a hiperbolaillesztésekből. Ez méréstechnikailag nehezen megvalósítható a reakció gyors lefutása miatt. Így a továbbiakban az integrált Michaelis-Menten egyenletet fogjuk használni a KM számolására. Az irodalmi adatok szerint Mg2+ esetében a kinetikai méréseket általában
45
46
fémionfeleslegnél mérték [26]. Ezen a gyakorlaton a VO2+ stabilitásának biztosítása végett változtattunk, lévén a vanadil ion ekvimoláris mennyiségben a dUTP-vel komplexálódhat, ami növeli a stabilitását. A mérési eredmények összehasonlíthatósága végett minden esetben ekvimolárisan alkalmaztam a fémiont és a dUTP-t. Felmerült azonban a kérdés, hogy a Mg2+ felesleg nem befolyásolja-e pozitívan a katalitikus aktivitást. Ezért Mg2+-mal titrálva is végeztem kinetikai méréseket. Ezek alapján valóban szükséges a Mg2+ fémion feleslege, hogy az adott szubsztrátkoncentrációnál elérhető maximális aktivitást kapjuk. Ennek valószínű oka, hogy a Mg2+-dUTP komplexnek nagyobb a disszociációs állandója (Kd=50μM, [56]), ezért az aktivitásmérő elegyben használt 40μM dUTP esetén csak mintegy 0,5 mM Mg2+ biztosítja a dUTP megfelelő komplexálódását. Mivel a vanadil-dUTP disszociációs állandója ennél jóval kisebb (kb. tizede a Mg2+-dUTP Kdjének), a vanadilt valószínűleg elegendő a dUTP-vel ekvimoláris mennyiségben alkalmazni. Ez utóbbi kérdést pontosan tisztázni fogják a VOacac felesleg mellett végezendő tervezett méréseink. A katalízis sebességének Mg2+-feleslegtől való függését vizsgálandó 40 µM szubsztrátkoncentráció esetén végeztem titrálást Mg2+-mal. A kezdeti sebesség értékekből hasonló telítési görbékhez juthatunk (17. ábra). 100
v 0 /v max / (%)
80
A kezdeti sebesség alakulása 40µ M [dUTP] esetén
60
2+
a Mg -felesleg függvényében 40
20
0 0
200
400
600
800
1000
2+
[Mg ] / (µ M)
A telítési Mg2+ koncentrációnál mért kkat értékek tehát 16,8±3,4 %-kal haladják meg a 40µM dUTP esetére vonatkoztatott ekvimoláris koncentrációnál mérteket. Ennek alapján
17. Ábra Telítés Mg2+-mal 40μM 46szubsztrátkoncentrációnál. Jól látható, hogy mintegy tízszeres Mg2+ felesleg szükséges a katalízis maximális sebességének eléréséhez.
47
kijelenthetjük, hogy a VOSO4 és a VOacac jelenlétében mért 85,6±20 ill. 73,1±12 %-os kkat növekedés nem csupán a fémionnal való telítődésnek tulajdonítható, hanem ezt szignifikáns mértékben meghaladja. A VO2+ kation tehát a fiziológiás Mg2+ ion hatását – érdekes módon – meghaladó mértékben képes aktiválni a dUTPáz enzimet. Ezért a hatásért valószínűleg az a felelős, hogy a nagy elektronegativitású oxigént tartalmazó kétatomos VO2+ erősebben képes polarizálni a hasítandó kötést a dUTP szubsztrát molekulában. Egyik további célunk ennek a feltételezett mechanizmusnak vizsgálata.
47
48
3.1.3. Részletes kinetikai analízis integrált Michaelis-Menten egyenlet alkalmazásával Az előző fejezetben leírt eredmények pontosíthatók, ha a teljes mért abszorbanciagörbékre illesztjük az integrált Michaelis-Menten egyenletet. [P]t / t = vmax – KM * ln([S]0 / ([S]0 – [P]t)) / t ahol [P]t a következő képletből számolható: [P]t = (A0 – At) / ∆Atot * [S]0 A mért adatsorokat Origin 5.0 szoftverrel értékeltem ki. Első lépésben az eredeti adatsort átalakítottam, hogy a reakció kezdete a 0. időpillanatban legyen (18.A ábra). Eztán az abszorbancia értékekből generáltam a [P]t értékeit (B ábra), majd két további oszlopban kiszámoltam a [P]t / t és az ln([S]0 / ([S]0 – [P]t)) / t kifejezések értékeit. A két utóbbi között az egyenlet szerint lineáris összefüggés van, így ezek könnyen ábrázolhatók, és a kapott egyenes meredeksége, valamint tengelymetszete megadja a KM és vmax értékeket. A gyakorlatban a görbéknek csak egy bizonyos szakaszára igaz, hogy egyenest ad (C ábra). Meggyőződhetünk azonban a modell alkalmazhatóságáról, ha a kapott paramétereket felhasználva az eredeti mért [P]t értékekből generáljuk az egyenlet szerinti t értékeket. (Egyszerűbb a koncentráció értékekhez számolni az időt, mint fordítva.) Amennyiben a számolt és mért értékeket egy grafikonon ábrázoljuk, látható a jó illeszkedés (D ábra). Fontos megjegyezni azonban, hogy a vanadil kationnal végzett mérések során a felvett abszorbanciagörbék meglehetősen elhajlanak, ami megnehezíti a kiértékelésüket. Valószínűleg a Michaelis-Menten kinetikai leírás csak közelítőleg alkalmazható a vanadil ionnal (a VOSO4-tal és a VOacac-tal egyaránt) történő enzimkatalízis leírására. A számolt görbe ilyenkor a mért görbe elhajlását nem tudja leírni (E és F ábra).
48
49
18.A. Ábra Mért abszorbancia görbe
18.B. Ábra Számított [P]t görbe
18.C. Ábra [P]t/t a logaritmikus kkifejezés függvényében
A katalízis reakciósebességi állandója a fenti adatokból a következő képpen
18.E. Ábra Illeszkedés VOSO4 alkalmazása esetén. 18.D. Ábra Illeszkedés Mg2+ alkalmazása esetén
18.F. Ábra Illeszkedés VOacac alkalmazása esetén.
49
50
számolható: kkat = vmax / [E]össz A fent leírt eljárás alapján kiértékelve a következő értékek adódtak (több mérésből átlagolva): Táblázat KM (μM) vmax (μM/sec) kkat (1/sec)
Mg2+ 2.01±0.08 0.60±0.10 12.5±1.9
VOSO4 6.55±1.27 1.35±0.20 27.1±4.1
Mn2+ 0.90±0.11 0.68±0.06 13.6±1.2
VOacac 1.94±0.18 0.52±0.02 10.4±0.5
A fenti eredmények szerint a Mn2+ és a VOacac hasonlóan hat a dUTPáz aktivitására, mint a fiziológiás körülmények között kofaktor Mg2+. Látható továbbá, hogy a VOSO4 alkalmazásával az enzimkatalízis sebessége megnő a Mg2+ által kiváltotthoz képest. A nagyobb
Michaelis
állandó
azonban
azt
mutatja,
hogy
csak
nagyobb
szubsztrátkoncentrációnál lesz telítésben az enzim. Az integrált Michaelis-Menten egyenlet segítségével kapott adatok VOSO4 és Mg2+ esetén (ez mondható a Mn2+-ról is) jól egyeznek a szubsztráttelítési görbékre illesztett hiperbolából
nyert
eredményekkel.
VOacac
esetén
azonban
a hiperbolaillesztéses
kiértékeléssel a VOSO4-hoz hasonló eredményeket, míg az integrált módszerrel inkább a Mg2+-os esethez hasonló eredményeket kaptunk. A VOacac ezen viselkedésének magyarázata még további vizsgálódásokat igényel, de valószínűleg összefüggésbe hozható az ez esetben mért abszorbanciagörbék erőteljesebb elhajlásával. Végeztem fémion nélküli méréseket is. Ehhez az aktivitásmérő puffert előzőleg Chelex gyantát1 tartalmazó oszlopon engedtem át, ami megköti a kétértékű az oldatban lévő fémionokat. Ezután végeztem aktivitásmérést 30μM dUTP és 100 nM enzim alkalmazásával a fémionmentesített és a Chelex gyantán nem tisztított pufferekben egyaránt katalitikus fémion távollétében. A mért aktivitás a Chelex gyantás kezelés után 60%-ára esett vissza A nem kezelt pufferben mérthez képest. Ebből is látható, hogy a kétértékű fémionok jó része valóban megkötődött a gyantán. Az így fémion nélkül mért kinetikai paraméterek a következőknek adódtak: kkat= 4,49±0,01 s-1, KM= 7,05±0,03 µM, vmax= 0,449±0,001 µM/s (100 nM enzimkoncentrációnál). A reakciógörbe teljes lefutását értékelő módszer tehát Mg2+, Mn2+ és VO2+ esetén a 1
A Chelex ioncserélő gyanta (Bio-Rad 142-2832) sztirol divinilbenzol kopolimer vázra épített iminodiacetát csoportokat tartalmaz. Ezek a funkciós csoportok nagy szelektivitással és affinitással kötik meg a kétértékű fémionokat. Egyértékű fémionokkal való kölcsönhatásuk elhanyagolható. 50
51
kezdeti sebességek elemzésére hagyatkozó módszerrel nagyban egyező eredményeket adott. Ennek alapján ismét kiemeljük a VO2+ kation (VOSO4) két hatását az enzimkinetikai paraméterekre: -
KM növelése (a Mg2+-hoz képest megközelítőleg ötszörösre)
-
kkat növelése (a Mg2+-hoz képest kétszeresre)
51
3.1. dUDP-dUTPáz komplex vizsgálata
3.2.1. CD spektroszkópiás eredmények A közeli UV tartományban a szubsztrát kötődése perturbálja az enzim CD spektrumát (ld. 2.1.3. fej.). Ezekből a spektrális változásokból következtethetünk tehát a szubsztrát vagy szubsztrátanalóg aktív centrumhoz való kötődésére.
19. Ábra A dUDP kötődése a dUTPázhoz perturbálja a fehérje és/vagy a ligandum CD spektrumát.Az enzim spektrumának (fekete) és a ligandum spektrumának (piros) összege (kék) jelentősen eltér a fehérje-ligandum komplex spektrumától (zöld), ami a kötődés okozta konformációváltozásra utal.
Közeli UV tartományban vizsgáltam a dUDP szubsztrátanalóg aktív helyhez való kötődését Mg2+ ill. VO2+ jelenlétében, valamint fémion távollétében2. A méréseket JASCO 720 spektropolariméterben, 10 mm-es küvettákban, 25oC-on végeztem. A puffer 50mM TES pH=7,5 volt, ami tartalmazott még 150 mM KCl-ot. A fémionokat ekvimolárisan alkalmaztam a dUDP-vel: mivel a VO2+ instabilis ilyen pH-jú vizes közegben, nem lehet egyszerűen a pufferbe adagolni, hanem a dUDP-vel komplexálva alkalmazható csupán. A méréseket 100µM enzimkoncentrációnál és 100µM fém-dUDP koncentrációnál végeztem, de 2
Chelex gyantán előkezelt puffer. 52
titráltam is 100µM enzimet vanadil-dUDP-vel (5-100µM). Az ábrán közölt differencia spektrumokat az elegyekben felvett spektrumok és a megfelelő összegspektrumok különbségeként állítottam elő (20. ábra). Látható egyrészt, hogy a Mg2+ felesleg pozitívan befolyásolja a szubsztrátanalóg dUDP enzimhez való kötődését. Továbbá megállapítható, hogy a fémion nélküli és Mg2+-os esetekben felvett spektrumok jellege nagyon hasonló, csak az intenzitásukban van jelentős eltérés. Vanadil ion jelenlétében felvett spektrum azonban kissé más jellegű, ill. kissé eltolódott nagyobb hullámhossz felé. Megjegyzendő továbbá, hogy a VO2+-dUDP elegyben felvett spektrum is kisebb intenzitású, mint az azonos töménységű dUDP oldatban felvetté. A vanadil ion tehát önmagában is megváltoztatja
a
spektrumot,
ezért
nem
vonhatunk
le
messzemenő
kvantitatív
következtetéseket abból a tényből, hogy a VO2+-dUDP esetén kapott differencia spektrum a fémion távollétében kapott spektrumhoz hasonló intenzitású. Mindenesetre a szignifikáns differencia meglétéből következtethetünk arra, hogy a VO2+-dUDP kötődik az enzimhez.
20. Ábra Különböző fémionok mellett, ill. fémion távollétében mért differencia spektrumok.
Itt
érdemes
megemlíteni,
hogy
a
VO-dUDP
enzimhez
való
kollaborációban végzett EPR spektroszkópiás mérések is megerősítik (21. ábra).
53
kötődését
A fémion-nukleotid komplex spektrumában több csúcs is felhasad (pl az ábrán nyíllal jelzett és a B. ábrán kinagyított csúcs), ami valószínűleg a vanadil ionhoz koordinálódó oldószermolekulák protonjainak köszönhető. Ezek a felhasadások azonban eltűnnek a fémionnukleotid-enzim komplex spektrumában, amiből arra következtethetünk, hogy az eddig a vanadil ionhoz koordinált oldószermolekuláknak legalább egy része helyett az enzim oldalláncai koordinálódnak közvetlenül vagy közvetve.
21.A. Ábra A VO(acac)2-dUDP komplex és a dUTPáz-VO(acac)2-dUDP ternerkomplex EPR spektruma.
21.B. Ábra A fenti spektrum nyíllal jelzett csúcsának kinagyítása. Jól láthatóan a ternerkomplex spektrumában megszűnt a jel felhasadása. 54
3.2.2. A komplexálódás termodinamikai paramétereinek meghatározása (ITC) Az
ITC-s
méréseket
a
Veszprémi
Egyetemen
Dr.
Vonderviszt
Ferenc
laboratóriumában végeztem. Titráltam a dUTPázt (105µM) Mg-dUDP-vel (a fecskendőben lévő koncentrációja 2mM), valamint 262,8µM enzimet VO-dUDP-vel (5,1mM), aztán fém nélküli dUDP-vel (5,1mM), és Mg2+felesleg (10mM) mellett dUDP-vel (3,2mM, az enzim koncentrációja pedig ebben az esetben 169µM). Kíváncsiak voltunk továbbá arra, hogy vannak-e olyan, kalorimetriával detektálható Mg2+-kötő helyek az enzimen, melyek nukleotid távollétében is jól elérhetők, ezért szubsztrátanalóg nélkül, csak Mg2+-mal (10mM) titráltam a dUTPázt (169µM). Ez utóbbi esetben nem sikerült értékelhető változásokat észlelni. Így megállapítható, hogy a Mg2+ enzimhez való kötődése nukleotid távollétében nem okoz érzékelhető kalorimetriás jelet, vagyis a nukleotiddal végzett méréseink esetén a termodinamikai paramétereket valóban a nukleotid-enzim kölcsönhatás határozza meg. Alább láthatók a kiértékelt adatok ekvimolárisan alkalmazott Mg2+ esetén (22.ábra). Ez a mérés jól kiértékelhető görbét adott, mely összhangban van más irodalmi adatokkal is. Enzim monomerre számítva egy nukleotid kötődik, Mg-dUDP esetén 15μM disszociációs állandóval. Kinetikai [26] és CD spektroszkópiás [25] mérések alapján szintén 10-15μM a Mg-dUDP-dUTPáz komplex disszociációs állandója. Ezért kijelenthetjük, hogy az ITC mérési módszer megbízhatóan alkalmazható a dUTPáz nukleotid ligandkötésének vizsgálatára.
22. Ábra Kalorimetriás titrálási görbe. 105μM enzim titrálása 2mM Mg-dUDP-vel
55
1.Táblázat
N Kd ∆H ∆S
Mg2+ ekvimoláris 1,06 ± 0,015 15µM ± 1µM -2200 kJ/mol ±400kJ/mol 18,5 kJ/(mol*K)
(N a kötőhelyek száma.)
A megállapított ΔH és ΔS értékeket az irodalomban először közöljük. Ezek alapján a dUTPáz-Mg2+-nukleotid kölcsönhatás nagy negatív ΔH értékkel, és kicsi, a ΔH mellett elhanyagolható pozitív ΔS értékkel jellemezhető. Vagyis a kölcsönhatást nagy, kedvező entalpiaváltozás jellemzi. (Hasonlóan ITC-s mérések alapján határozták meg a timidilát szintáz - nukleotid komplex képződési szabadentalpiáját is, amely mindössze -14,6 kJ/mol [54]) A további összehasonlítás kedvéért egy átlagos hidrogénkötés 5-8 kJ/mol, a szerves vegyületekben legyakoribb kovalens kötések pedig 300-500 kJ/mol energiát képviselnek. Ebből látható, hogy a dUTPáz-nukleotid kölcsönhatás rendkívül erős, mintegy öt kovalens kötéssel ekvivalens energiájú, ami több hidrogénkötésnek (uracil a főláncatomokhoz, foszfát csoportok egyes aminosav oldalláncokkal), aromás gyűrűk átlapolásának, hidrofób kölcsönhatásoknak és valószínűleg főként a fémion és a koordinálódó aminosav oldalláncok közti kölcsönhatásnak köszönhető. Szükséges lehetőség szerint minél töményebb oldatokban mérni, hogy a teljes titrálási görbe jól kivehető legyen. Amint már leírtam, az alkalmazandó töménység függ a vizsgált komplex stabilitási állandójától is. Sajnos csak korlátozott mértékben állt rendelkezésünkre dUDP, ezért a vanadil ionnal és kétértékű fémion távollétében mért görbék kevéssé értékelhetők. Ugyanakkor szignifikáns különbség mutatkozik a két titrálási görbe között: a fémion nélküli mérés esetén sokkal kevésbé értékelhető, ami indirekt bizonyíték a vanadil ion enzim-szubsztrát komplex kialakításában betöltött pozitív szerepére. Tervezünk még további méréseket töményebb oldatokban, és nem csak dUDP-vel, hanem a mindhárom foszfát-csoportot tartalmazó, nemhidrolizálható szubsztrátanalóggal (α-β-imino-dUTP) is.
56
3.2.3. Feltételezett szerkezet A VO2+ kationról a fentiek alapján megállapítottuk a következőket: 1. Katalitikusan kompetens módon helyettesíti a Mg2+-ot a dUTPáz által katalizált reakcióban. (3.1. fej.) 2. Résztvesz a nukleotid szubsztrátanalóg ligand enzimhez való kötődésében. (3.2. fej.) Ezek alapján joggal feltehető, hogy a VO2+ az enzim-nukleotid komplexben a Mg2+hoz legalábbis nagy mértékben hasonló helyet foglal el. Erre ionrádiusza is alkalmassá teheti (Mg2+ 65 pm, VO2+ 63 pm [57]). Rendelkezésünkre áll egy olyan dUTPáz kristályszerkezet, melyben a Sr2+ lokalizálható, mely szintén képes a Mg2+ helyettesítésére a katalitikus reakcióban, bár sokkal kevésbé hatékonyan, mint a vanadil ion (a Sr2+ ionrádiusza 113 pm!). Ez a szerkezet a fertőző lóanémia retrovírus (EIAV) dUTPázának kristályszerkezete [20]. Az EIAV és az E. coli dUTPáz szerkezeteket fedésbe hoztam a Swiss PdbViewer program segítségével. A két szerkezet jól illeszkedett, különösen az aktív centrumok és a kötődő dUDP molekulák helyzetét tekintve. Egy fontos különbség látszott a dUDP-k difoszfátjainak konformációját illetően, ugyanis a fémion nélküli szerkezetben nyitott, míg a Sr2+-ot tartalmazó szerkezetben zárt konformációban figyelhetők meg. Ez összhangban lehet azzal, a feltevéssel, hogy a fémionnak a katalízisben betöltött egyik funkciója, hogy az α-β foszfátcsoportokat a katalitikus hasítás szempontjából kedvező zárt konformációba orientálja [17]. Miután a két szerkezet illeszkedése megfelelőnek bizonyult, az EIAV szerkezetben szereplő Sr2+ helyét mintegy rávetítettem az E. coli szerkezetre. Megállapítottam, hogy a vanadil ezen helyen való koordinálása sztérikusan lehetséges, koordináló szerepet esetleg szerkezeti vízmolekulák játszhatnak. (23. ábra) Az ábra további in silico vizsgálataink kiindulópontját képezik.
57
22. Ábra Az ábrán az enzim monomer látható szalagdiagramos ábrázolásban (zöld). Látható amint a dUDP kötődik az aktív centrumhoz, bár az aktív centrum a másik két fehérjealegység hiányában nem teljes. A kék kör sematikusan a VO2+ helyét jelzi. Ezen felül láthatók még a szerkezeti vízmolekulák is (piros).
58
Eredmények összefoglalása 1. Megállapítható, hogy a dUTPáz nem specifikus a katalízisben kofaktorként résztvevő fémionra nézve, és a Mg2+ katalitikusan kompetens módon helyettesíthető más kétértékű fémionnal, így a Mn2+-nal és a VO2+-lal is, amint ezt az enzimkinetikai méréseim igazolják. 2. A katalízis kinetikai paraméterei megváltoznak, amennyiben vanadil iont alkalmazunk kofaktorként a magnézium ion helyett (KM ötszörösre, kkat kétszeresre nő, ld. 3.1.3. fejezet). A kkat növekedését valószínűleg a vanadil ion eltérő polarizációs hatása okozza (hasítandó kötés erősebb polarizálása). 3. A Mg2+-ot feleslegben kell alkalmazni ahhoz, hogy gyakorlatilag az összes szubsztrátot komplexálja, és így a katalízis sebességét lehetőség szerint maximálissá tegye. (ld. Mg2+ titrálás 3.1.2. fej. 17. ábra) Ezzel szemben, amennyiben vanadil ion a katalitikus fémion - lényegesen jobb komplexáló tulajdonságából kifolyólag - elegendő azt a szubsztráttal ekvimoláris mennyiségben alkalmazni. 4. A vanadil ion kötődését a dUTPázhoz két független úton is vizsgálva megállapítható, hogy a fémion résztvesz a dUDP-enzim komplex kialakításában (ld.3.2.1. fejezet 21. ábrán lévő EPR spektrumok, valamint a 3.2.2. fejezet). Eme kötődés pontos termodinamikai karakterizálása még további méréseket igényel. Valószínűsíthető, hogy a vanadil-dUDP-dUTPáz komplex nem tér el jelentős mértékben a Mg-dUDP-dUTPáz komplextől. 5. Szerkezeti - egyelőre kvalitatív - modellt alkottam az E. coli dUTPáz esetén a nagyfeloldású kristályszerkezetek felhasználásával. Megmutattam, hogy a VO2+ elfoglalhat egy olyan helyet az enzim-dUDP szerkezetben, ahol megfelelő térhelyzetben van a ligand foszfátcsoportjaival és egyes - valószínűleg az 1. szekvenciamotívum aminosav oldalláncai révén koordinált - szerkezeti vízmolekulákkal. Az eredmények felhasználásával egy konferencia előadás valamint egy konferencia poszterelőadás készült, továbbá beküldés alatt áll egy folyóirat közlemény. Ezen három publikáció absztraktját a következő oldalakon mellékelem.
59
Az eredmények felhasználásával készült közlemények absztraktjai Meghívott előadás: Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Scientific Meeting of International Research Scholars Vancouver, Canada, 2001. június 20-23. International Research Scolar: Beáta G. Vértessy Affiliation: Institute of Enzymology, Biological Research Center, Hungarian Academy of Sciences Title: The dUTPase enzyme family: preventive DNA repair via exclusion of uracil Authors: Angéla Békési1, Orsolya Barabás1, Michaela Rumlová2, Iva Pichová2, Devkumar Mustafi3, Marvin Makinen3 and Beáta G. Vértessy1 1
Institute of Enzymology, Biological Research Center, Hungarian Academy of Sciences, Budapest, Hungary, 2Institute of Chemistry and Biochemistry, Czech Academy of Sciences, Prague, Czech Republic, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Chicago, USA. Abstract: The continued existence of a biological species over successive generations requires the maintenance of stable genetic information, together with strict metabolic, and developmental control of biosynthesis of the nucleotide building blocks. One of the few protein factors essential in both of these processes is dUTPase. The enzyme catalyzes pyrophosphorolysis of dUTP, products are dUMP and pyrophosphate. Homotrimeric dUTPases build their three symmetric active sites via recruiting conserved sequence motifs from all the three subunits. Lack of dUTPase leads to an elevated dUTP/dTTP ratio which results in highly uracilsubstituted DNA inducing the transformation of base excision repair into a hyperactive futile cycle towards thymine-less cell death. In addition to ubiquity in eu- and prokaryotes, the enzyme is encoded in herpesviral and retroviral genomes. The crucial function of dUTPase in DNA metabolism and repair, together with strict developmental control of its expression, identifies the protein as a potential new target in antiviral and antitumour therapy. We suggest three possible and fundamentally different routes for dUTPase antagonism: i) substrate analogous small molecule inhibition, ii) endogenous antagonism by cellular protein factors, and iii) modulation of enzymic activity in bifunctional dUTPases of Type B and Type D retroviruses by the N-terminal retroviral nucleocapsid (NC) domain. Pursuing these avenues with a combined test system for structural and functional investigations, we now report: i) that dUTPase is amenable to high-resolution structural studies by EPR/ENDOR spectroscopy as the excellent spin label VO2+ cation competently replaces Mg2+ in the active site, (Interestingly, kcat in the presence of VO2+ is more than twice the value in the presence of Mg2+.)
60
ii) the first microcalorimetric data on dUTPase-substrate analogue interactions, iii) cloning, isolation and characterization of a bifunctional NC-dUTPase, and iv) the first crystals of NC-dUTPase (diffraction to 3.5 angstrom as of January 18, 2001), structure determination is in progress.
Poszterelőadás:
A Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztálya MUNKAÉRTEKEZLETE Sárospatak, 2001. május 14-17 A VANADIL(II) KATION (VO2+) SPINCÍMKE SZEREPE A dUTPáz ENZIM MŰKÖDÉSÉBEN Békési Angéla, Vértessy G. Beáta MTA SzBK Enzimológiai Intézet A dUTPáz enzim a dUTP pirofoszforolízisét katalizálja. Így megakadályozza az uracil DNS-be történő beépülését, és prekurzort termel a dTTP bioszintézise számára. Hiánya vírusfertőzött és tumoros sejtekben is timinmentes sejthalálhoz vezet, ezért az enzim új kemoterápiás célpont. Célunk az enzim katalitikus ciklusának vizsgálata, antagonisták jellemzése. Az aktiv centrum nagyfeloldású szerkezetének, valamint a katalízisben lényegi kofaktorként szereplő Mg2+ szerepének és helyének meghatározásában jelentős szerepet kap az EPR-ENDOR (elektron-magmágneses kettős rezonancia) spektroszkópia. Eme módszer alkalmazásához a VO2+ (vanadil) kation rendkívül alkalmas spincímke. Igazoltuk, hogy a Mg2+ vanadillal kompetens módon helyettesíthető a katalízisben E. coliból származó dUTPáz esetén. Vizsgáltuk a katalitikus aktivitást, az enzim-fémionszubsztrát komplexek képződését, ennek termodinamikai paramétereit Mg2+ és vanadil alkalmazása valamint fémion távolléte esetén egyaránt. Alkalmazott módszereink: látható és UV spektrofotometria, CD spektroszkópia, izotermális titráló mikrokalorimetria valamint in silico szerkezetelemzés.
61
Folyóirat közlemény: THE VANADYL(IV) (VO2+) CATION IS A CONVENIENT SPIN LABEL IN THE ACTIVE SITE OF DUTPASE Angéla Békési1, Devkumar Mustafi2, Marvin M. Makinen2, and Beáta G. Vértessy1,* 1
Institute of Enzymology, BRC, Hungarian Academy of Sciences, Budapest, Hungary and Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Chicago, Chicago, USA
2
*
To whom correspondence should be addressed at: Inst. Enzymol. POB 7, H-1518, Budapest, Hungary, e-mail:
[email protected] ABSTRACT Elucidation of the catalytic mechanism of the enzyme dUTPase, an essential preventive DNA repair factor, is expected to foster design of antagonists against this novel target in antiviral and anticancer chemotherapy. In the present work, we propose to introduce a spin label into the dUTPase active site for mechanistic investigations. Vanadyl(IV), both in the form of the inorganic sulfate salt and in the organic complex with acetylacetonate, is shown to competently support enzymatic catalysis when it replaces the physiological metal ion cofactor Mg2+. This replacement leads to a twofold increase in kcat together with a fivefold increase in KM. The increase in kcat is suggested to be due to the high electronegativity of the vanadyl(IV) cation which might help polarising the scissile bond. Consonantly with the increase in KM, replacement of Mg2+ with VO2+ decreases binding affinity for the non-hydrolysable substrate analogue dUDP to the enzyme as reflected in differential circular dichroism measurements. EPR/ENDOR experiments with VOSO4 indicate formation of the binary VO2+-dUDP, VO2+dUTP, and the ternary VO2+-dUDP-dUTPase complexes, while excluding the formation of the binary VO2+-enzyme complex. A tenfold excess of Mg2+ is required to competitively remove VO2+ from the VO2+-dUDP-enzyme complex arguing that interactions involved in the metalnucleotide-enzyme complex are considerably stronger in the presence of VO2+. When VO2+ is used in the form of the organic complex with acetylacetonate, the presence of enzyme is indispensable to break the vanadyl-acetylacetonate connection and render the vanadyl cation able to coordinate to the nucleotide-enzyme complex. Results show that the diatomic spin label cation VO2+ is a catalytically competent metal cofactor for dUTPase with specific binding site on the enzyme-nucleotide complex, and potentiate its future use for detailed structural investigations via magnetic resonance spectroscopies.
Irodalomjegyzék 1.
Lindahl, T., Instability and decay of the primary structure of DNA [see comments]. Nature, 1993. 362(6422): p. 709-15.
2.
Seeberg, E., L. Eide, and M. Bjoras, The base excision repair pathway. Trends 62
Biochem Sci, 1995. 20(10): p. 391-7. 3.
Traut, T.W., Physiological concentrations of purines and pyrimidines. Mol Cell Biochem, 1994. 140(1): p. 1-22.
4.
Goulian, M., et al., Mechanism of thymineless death. Adv Exp Med Biol, 1986. 195 Pt B: p. 89-95.
5.
Nation, M.D., et al., Control of Drosophila deoxyuridine triphosphatase. Existence of a developmentally expressed protein inhibitor. Biochem J, 1989. 259(2): p. 593-6.
6.
Strahler, J.R., et al., Maturation stage and proliferation-dependent expression of dUTPase in human T cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(11): p. 4991-5.
7.
Zalud, P., et al., Inhibition of the proliferation of human cancer cells in-vitro by substrate-analogous inhibitors of dUTPase. Adv Exp Med Biol, 1994. 370: p. 135-8.
8.
Threadgill, D.S., et al., Characterization of equine infectious anemia virus dUTPase: growth properties of a dUTPase-deficient mutant. J Virol, 1993. 67(5): p. 2592-600.
9.
Pyles, R.B., N.M. Sawtell, and R.L. Thompson, Herpes simplex virus type 1 dUTPase mutants are attenuated for neurovirulence, neuroinvasiveness, and reactivation from latency. J Virol, 1992. 66(11): p. 6706-13.
10.
Pyles, R.B. and R.L. Thompson, Evidence that the herpes simplex virus type 1 uracil DNA glycosylase is required for efficient viral replication and latency in the murine nervous system. J Virol, 1994. 68(8): p. 4963-72.
11.
Lerner, D.L., et al., Increased mutation frequency of feline immunodeficiency virus lacking functional deoxyuridine-triphosphatase. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995. 92(16): p. 7480-4.
12.
Baldo, A.M. and M.A. McClure, Evolution and horizontal transfer of dUTPaseencoding genes in viruses and their hosts. J Virol, 1999. 73(9): p. 7710-7721.
13.
Vertessy, B.G., Flexible glycine rich motif of Escherichia coli deoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase is important for functional but not for structural integrity of the enzyme. Proteins, 1997. 28(4): p. 568-79.
14.
Fiser, A. and B.G. Vertessy, Altered Subunit Communication in Subfamilies of Trimeric dUTPases. Biochem Biophys Res Commun, 2000. 279(2): p. 534-542.
15.
Vertessy, B.G., et al., The complete triphosphate moeity of non-hydrolyzable substrate analogues is required for a conformational shift of the flexible C-terminus in E. coli dUTP pyrophosphatase. FEBS Lett., 1998. 421(1): p. 83-88.
16.
Prasad, G.S., et al., Crystal structure of dUTP pyrophosphatase from feline
63
immunodeficiency virus. Protein Sci, 1996. 5(12): p. 2429-37. 17.
Prasad,
G.S.,
et al.,
Structures
of feline
immunodeficiency
virus
dUTP
pyrophosphatase and its nucleotide complexes in three crystal forms [In Process Citation]. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2000. 56(Pt 9): p. 1100-9. 18.
Larsson, G., L.A. Svensson, and P.O. Nyman, Crystal structure of the Escherichia coli dUTPase in complex with a substrate analogue (dUDP). Nat Struct Biol, 1996. 3(6): p. 532-8.
19.
Cedergren-Zeppezauer, E.S., et al., Crystal structure of a dUTPase. Nature, 1992. 355(6362): p. 740-3.
20.
Dauter, Z., et al., Crystal structure of dUTPase from equine infectious anaemia virus; active site metal binding in a substrate analogue complex. J Mol Biol, 1999. 285(2): p. 655-73.
21.
Mol, C.D., et al., Human dUTP pyrophosphatase: uracil recognition by a beta hairpin and active sites formed by three separate subunits. Structure, 1996. 4(9): p. 1077-92.
22.
Mol, C.D., et al., Crystal structure of human uracil-DNA glycosylase in complex with a protein inhibitor: protein mimicry of DNA. Cell, 1995. 82(5): p. 701-8.
23.
Mol, C.D., et al., Crystal structure and mutational analysis of human uracil-DNA glycosylase: structural basis for specificity and catalysis [see comments]. Cell, 1995. 80(6): p. 869-78.
24.
Vertessy, B.G., et al., Identification of tyrosine as a functional residue in the active site of Escherichia coli dUTPase. Biochim Biophys Acta, 1994. 1205(1): p. 146-50.
25.
Vertessy, B.G., et al., Specific derivatization of the active site tyrosine in dUTPase perturbs ligand binding to the active site. Biochem Biophys Res Commun, 1996. 219(2): p. 294-300.
26.
Larsson, G., P.O. Nyman, and J.O. Kvassman, Kinetic characterization of dUTPase from Escherichia coli. J Biol Chem, 1996. 271(39): p. 24010-6.
27.
Gadsden, M.H., et al., dUTP pyrophosphatase is an essential enzyme in Saccharomyces cerevisiae. Embo J, 1993. 12(11): p. 4425-31.
28.
el-Hajj, H.H., H. Zhang, and B. Weiss, Lethality of a dut (deoxyuridine triphosphatase) mutation in Escherichia coli. J Bacteriol, 1988. 170(3): p. 1069-75.
29.
Canman, C.E., et al., Induction of resistance to fluorodeoxyuridine cytotoxicity and DNA damage in human tumor cells by expression of Escherichia coli deoxyuridinetriphosphatase. Cancer Res, 1994. 54(9): p. 2296-8.
64
30.
Henderson, T.A., G.C. Hurst, and R.W. Kreillick, Angle-selected ENDOR spectroscopy. 2. Determination of proton coordinates from a polycrystalline sample of bis(2,4-pentanedionato)copper(II). J. Am. Chem. Soc., 1985. 107: p. 7299-7303.
31.
Mustafi, D., et al., Structure and conformation of spin-labeled amino acids in frozen solutions determined by electron nuclear double resonance. 1. Methyl N-(2,2,5,5Tetramethyl-1-oxypyrrolinyl-3-carbonyl)-L-phenylalanate, a molecula with a single preferred conformation. J. Am. Chem. Soc., 1990. 112: p. 2558-2566.
32.
Rist, G.H. and J.S. Hyde, Ligand ENDOR of metal complexes in powders. J. Chem. Phys., 1970. 52: p. 4633-4643.
33.
Hoffman, B.M., R.A. Venters, and J. Martinsen, General theory of polycrystalline ENDOR patterns. Effects of finite EPR and ENDOR component linewidths. J. Magn. Reson., 1985. 62: p. 537-542.
34.
Hoffman, B.M. and R.J. Gurbiel, Polycrisalline ENDOR patterns from centers of axial EPR spectra. General formulas and simple analytic expressions for deriving geometric information from dipolar couplings. J. Magn. Reson., 1989. 82: p. 309-317.
35.
Hurst, G.C., T.A. Henderson, and R.W. Kreilick, Angle-selected ENDOR spectroscopy. 1. Theoretical interpretation of ENDOR shifts from randomly oriented transition-metal complexes. J. Am. Chem. Soc., 1985. 107: p. 7294-7299.
36.
Mustafi, D. and M.W. Makinen, ENDOR-determined solvation structure of VO2+ in frozen solutions. Inorg. Chem., 1988. 27: p. 3360-3368.
37.
Mustafi, D., J. Telser, and M.W. Makinen, Molecular geometry of vanadyl-adenine nukleotide complexes determined by EPR, and ENDOR, and molecular modeling. J. Am. Chem. Soc., 1992. 114: p. 6219-6226.
38.
Makinen, M.W. and D. Mustafi, The vanadyl ion: Molecular structure of coordinating ligands by electron paramagnetic resonance and electron nuclear double resonance spectroscopy., in Metal Ions in Biological Systems, H. Sigel and A. Sigel, Editors. 1995, Marcel Dekker: New York. p. 89-127.
39.
Banerjee, A., et al., Interaction of the vanadyl (VO2+) cation with guanosine nucleotides and elongation factor Tu, in Vanadium Compounds: Chemistry, Biochemistry, and Therapeutic Applications, A.S. Tracey and D.C. Crans, Editors. 1998, Am. Chem. Soc. Symposium Series: Washington D. C. p. 104-135.
40.
Makinen, M.W., D. Mustafi, and S. Kasa, ENDOR of spin-Labels for structure determination: From small molecules to enzyme reaction intermediates, in Biological
65
Magnetic Resonance, L.J. Berliner, Editor. 1998, Plenum: New York. p. 181-249. 41.
Mustafi, D. and M.W. Makinen, Structure, conformation, and probable mechanism of hydrolysis of a spin-labeled penicillin revealed by electron nuclear double resonance spectroscopy. J. Am. Chem. Soc., 1995. 117: p. 6739-6746.
42.
Mustafi, D., et al., Conformational changes in spin-labeled cephalosporin and penicillin upon hydrolysis revealed by electron nuclear double resonance spectroscopy. J. Am. Chem. Soc., 1997. 119: p. 12619-12628.
43.
Wells, G.B., D. Mustafi, and M.W. Makinen, Structure at the active site of an acylenzyme of alpha-chymotrypsin and implications for the catalytic mechanism. An electron nuclear double resonance study. J Biol Chem, 1994. 269(6): p. 4577-86.
44.
Mustafi, D. and M.W. Makinen, Catalytic conformation of carboxypeptidase A. Structure of a true enzyme reaction intermediate determined by electron nuclear double resonance. J Biol Chem, 1994. 269(6): p. 4587-95.
45.
Wells, G.B. and M.W. Makinen, ENDOR determined molecular geometries of spinlabeled fluoranilides in frozen solution. J. Am. Chem. Soc., 1988. 110: p. 6343-6352.
46.
Makinen, M.W., Electron nuclear double resonance determined structures of enzyme reaction
intermediates:
Structural
evidence
for
substrate
destabilization.
Spectrochimica Acta, 1998. A54: p. 2269-2281. 47.
Barcza, L. and Á. Buvári, A minőségi kémiai analízis alapjai. 1997, Budapest: Medicina Könyvkiadó Rt.
48.
Studier, F.W., et al., Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol, 1990. 185: p. 60-89.
49.
Climie, S., et al., Expression of trimeric human dUTP pyrophosphatase in Escherichia coli and purification of the enzyme. Protein Expr Purif, 1994. 5(3): p. 252-8.
50.
Persson, R., et al., dUTPase from Escherichia coli; High-Level Expression and OneStep Purification, in On Monomeric and Trimeric dUTPases, R. Persson, Editor. 1998, Department of Biochemistry, Lund University: Lund. p. 1-14.
51.
Perczel, A., I. Laczkó, and M. Hollósi, eds. A kémia újabb eredményei. . 1994, Akadémia Kiadó: Budapest.
52.
Vertessy, B.G. and M. Zeppezauer, Identification of tyrosine as an active site residue involved in the catalytic mechanism of Escherichia coli dUTPase. Biochem Soc Trans, 1994. 22(2): p. 233S.
53.
Gilli, R., et al., Thermodynamic analysis of calcium and magnesium binding to
66
calmodulin. Biochemistry, 1998. 37(16): p. 5450-6. 54.
Garcia-Fuentes, L., et al., Thermodynamic analysis of the binding of 5-fluoro-2'deoxyuridine 5'-monophosphate to thymidylate synthase over a range of temperatures. Eur J Biochem, 1995. 232(2): p. 641-5.
55.
Bundle, D.R. and B.W. Sigurskjold, Determination of accurate thermodynamics of binding by titration microcalorimetry. Methods Enzymol, 1994. 247: p. 288-305.
56.
Churchich, J.E., Binding of a fluorescent nucleotide analog to Hsc70. The effect of peptide protein interactions on the luminescence properties of the probe. Eur J Biochem, 1995. 231(3): p. 736-41.
57.
Lord, K.A. and G.H. Reed, Vanadyl(IV) complexes with pyruvate kinase: activation of the enzyme and electron paramagnetic resonance properties of ternary complexes with the protein. Arch Biochem Biophys, 1990. 281(1): p. 124-31.
67
