UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT LANDBOUWKUNDIGE EN TOEGEPASTE BIOLOGISCHE WETENSCHAPPEN ____________________
Academiejaar 2002 - 2003
Endocytose van sialoadhesine, de receptor voor het porcien arterivirus
Mathias LAGA
Promotor 1: Prof. Dr. P. Van Oostveldt Promotor 2: Prof. Dr. H. Nauwynck
Scriptie voorgedragen tot het behalen van de graad van BIO-INGENIEUR IN DE CEL- EN GENBIOTECHNOLOGIE
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT LANDBOUWKUNDIGE EN TOEGEPASTE BIOLOGISCHE WETENSCHAPPEN ____________________
Academiejaar 2002 - 2003
Endocytose van sialoadhesine, de receptor voor het porcien arterivirus Mathias LAGA
Promotor 1: Prof. Dr. P. Van Oostveldt Laboratorium voor Biochemie & Moleculaire Cytologie Faculteit Landbouwkundige & Toegepaste Biologische Wetenschappen Promotor 2: Prof. Dr. H. Nauwynck Laboratorium voor Virologie Faculteit Diergeneeskunde
Scriptie voorgedragen tot het behalen van de graad van BIO-INGENIEUR IN DE CEL- EN GENBIOTECHNOLOGIE
“De auteur en de promotoren geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”
“The author and the promotors give permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using results from this thesis.”
19/05/03, Gent
Lijst met afkortingen
LIJST MET AFKORTINGEN
AP:
Adaptor proteïne
CCV:
Clathrin coated vesicle
ECV:
Endosomal carrier vesicle
EE:
Early endosome, vroeg endosoom
EMM:
Endosome maturation model
ER:
Endoplasmatisch reticulum
FKS:
Foetaal kalf serum
LE:
Late endosoom, laat endosoom
Mas:
Monoklonaal antistof
ORF:
Open reading frame, open leesraam
PAM:
Porciene alveolaire macrofagen
PRRSV:
Porcien reproduktief en respiratoir syndroom virus
RE:
Recycling endosome
Sia:
Sialoadhesine
TGN:
Trans Golgi netwerk
UP:
Ultra puur water
Woord vooraf WOORD VOORAF Een eindwerk maken is een laatste stap naar het behalen van een diploma, en tegelijk een eerste stap in de onderzoekswereld. Het is een unieke kans om na vier jaar studeren je theoretische kennis om te kunnen omzetten in een “eigen onderzoek”. Uiteraard gaat zo’n eerste onderzoek gepaard met vallen en opstaan, en heb je de steun en ervaring van anderen nodig, waarvoor mijn oprechte dank. In de eerste plaats wil ik mijn begeleider, Peter Delputte, bedanken. Jij hebt me mijn eerste stappen in de onderzoekswereld laten zetten. Bedankt voor je grenzeloze inzet, je geduld en enthousiasme, voor de energie die je elke dag in mij hebt gestoken. Ik heb dit jaar echt ongelofelijk veel bijgeleerd dankzij jou! Professor Nauwynck, de manier waarop jij gebeten bent door onderzoek en je enthousiasme is onbeschrijfelijk. Bedankt voor de kritische discussies en je vernieuwende ideeën, waardoor ik steeds verder kon werken aan mijn onderzoek. Ik wil je ook bedanken voor de mogelijkheden die ik gekregen heb op het labo. Professor Pensaert, u hebt mij de mogelijkheid gegeven om bij mijn onderzoek onbeperkt gebruik te maken van de infrastructuur en middelen in uw labo. Omdat deze luxe is niet elke thesisstudent gegeven is, wil ik u daarvoor ten zeerste bedanken. Prof. Van Oostveldt, bedankt voor het ter beschikking stellen van dit onderwerp en voor het gebruik van de confocale microscoop. Ook Professor S. De Smedt en Bart Lucas wil ik bedanken voor het gebruik van hun confocale microscoop en voor de tijd die ze voor mij hebben vrij gemaakt.. Verder wil ik nog de mensen van het labo virologie bedanken en in het bijzonder Herman, Geert, Nathalie en Romeo voor de kennis en ervaring die jullie met mij gedeeld hebben. Bedankt ook Chantal en Carine voor de hulp bij een aantal van mijn experimenten. Tenslotte wil ik nog mijn ouders bedanken. Zij hebben mij tenslotte 5 jaar gesteund, zowel financieel als moreel, zowel in leuke als in moeilijke tijden. Ik wil hen ook oprecht bedanken voor de kansen die ik heb gekregen. Verder wil ik ook nog een woord van dank richten aan mijn broer voor zijn deskundig advies, aan mijn vrienden en in het bijzonder Evi voor de steun en aan mijn (ex)-kotgenoten voor de toffe studententijd.
Inhoudsopgave
1 LITERATUURSTUDIE _________________________________________________________________ 1 1.1
HET PORCIEN REPRODUCTIEF EN RESPIRATOIR SYNDROOM VIRUS ______________________________ 1
1.1.1
Inleiding _____________________________________________________________________ 1
1.1.2
Morfologie ___________________________________________________________________ 2
1.1.3
Het virale genoom _____________________________________________________________ 3
1.1.4
De meest voorkomende virale proteïnen ____________________________________________ 4
1.1.5
De virale replicatiecyclus________________________________________________________ 5
1.2
MACROFAGEN _____________________________________________________________________ 8
1.2.1
Voorkomen en functie ___________________________________________________________ 8
1.2.2
Ontogenie ____________________________________________________________________ 8
1.2.3
Fagocytose ___________________________________________________________________ 9
1.3
SIALOADHESINE ___________________________________________________________________ 12
1.3.1
Inleiding ____________________________________________________________________ 12
1.3.2
Sialoadhesine en de siglec-familie ________________________________________________ 13
1.3.3
Herkenning van koolhydraten door siglecs _________________________________________ 15
1.3.4
Rol van cis-interakties _________________________________________________________ 17
1.4
ENDOCYTOSE _____________________________________________________________________ 19
1.4.1
Inleiding ____________________________________________________________________ 19
1.4.2
Receptorgemedieerde endocytose_________________________________________________ 20
1.4.2.1
Inleiding ________________________________________________________________________ 20
1.4.2.2
Eiwitten betrokken bij de eerste stappen in receptor gemedieerde endocytose via clathrine________ 22
1.4.2.2.1
Adaptor proteïnen (AP) ___________________________________________________________ 22
1.4.2.2.2
EPS15 ________________________________________________________________________ 23
1.4.2.2.3
Manteleiwitten __________________________________________________________________ 24
1.4.2.2.4
Dynamine______________________________________________________________________ 25
1.4.2.2.5 1.4.2.3
1.4.3
HSC70 ________________________________________________________________________ 27 Klassieke endosoom – lysosoom pathway ______________________________________________ 28
1.4.2.3.1
De verschillende vesikels _________________________________________________________ 28
1.4.2.3.2
De klassieke endosoom-lysosoom pathway wordt gecoördineerd door Rab-GTPasen. __________ 30
De verschillende manieren van virusopname________________________________________ 35
1.4.3.1
Inleiding ________________________________________________________________________ 35
1.4.3.2
Via clathrine _____________________________________________________________________ 35
1.4.3.3
Via caveolae _____________________________________________________________________ 36
1.4.3.4
Via macropinocytose en fagocytose ___________________________________________________ 36
1.4.3.5
Via een clathrine en caveolae onafhankelijk proces_______________________________________ 37
2 DOELSTELLINGEN __________________________________________________________________ 38 3 MATERIAAL EN METHODEN _________________________________________________________ 39 3.1
BUFFERS, REAGENTIA EN STOCKS ______________________________________________________ 39
Inhoudsopgave
3.2
MEDIA __________________________________________________________________________ 40
3.2.1
Medium voor HEK-T __________________________________________________________ 40
3.2.2
Medium voor RK13, PK15 en SK _________________________________________________ 40
3.2.3
Medium voor 3D4_____________________________________________________________ 40
3.2.4
Medium voor PAM ____________________________________________________________ 40
3.2.5
LB (Luria Bertani)-medium _____________________________________________________ 41
3.3
CELCULTUREN ____________________________________________________________________ 42
3.3.1
HEK-T en 3D4 _______________________________________________________________ 42
3.3.2
RK13, PK15 en SK ____________________________________________________________ 42
3.3.3
Porciene alveolaire macrofagen (PAM)____________________________________________ 43
3.3.3.1
Isoleren en bewaren van PAM _______________________________________________________ 43
3.3.3.2
In cultuur brengen van de PAM ______________________________________________________ 43
3.4
DNA OPZUIVERING ________________________________________________________________ 43
3.5
TRANSFECTIE _____________________________________________________________________ 44
3.5.1
Transfectie van HEK-T, SK en RK13 ______________________________________________ 44
3.5.2
Transfectie van PK15 en 3D4____________________________________________________ 44
3.6
OPZUIVEREN VAN MONOKLONALE ANTISTOFFEN (MAS) ____________________________________ 45
3.6.1
Opzuivering _________________________________________________________________ 45
3.6.2
Analyse van de opgezuiverde Mas met SDS-PAGE ___________________________________ 45
3.7
ENDOCYTOSE ASSAYS _______________________________________________________________ 47
3.7.1
Microscopische analyse ________________________________________________________ 47
3.7.1.1
Bij PAM ________________________________________________________________________ 47
3.7.1.2
Bij HEK-T, PK15, RK13 en SK______________________________________________________ 47
3.7.1.3
Gebruik van inhibitoren ____________________________________________________________ 47
3.7.1.3.1 3.7.1.3.2
Amantadine ____________________________________________________________________ 48
3.7.1.4
Kleuringen ______________________________________________________________________ 48
3.7.1.5
Assay voor spontane endocytose _____________________________________________________ 49
3.7.2 3.8
Genisteïne, tyrphostine1, tyrphostine25 en sucrose (Sigma)_______________________________ 47
Flowcytometrische analyse bij PAM ______________________________________________ 49
STATISTISCHE VERWERKING __________________________________________________________ 50
4 RESULTATEN _______________________________________________________________________ 51 4.1
SIALOADHESINE GEMEDIEERDE ENDOCYTOSE IN PORCIENE ALVEOLAIRE MACROFAGEN MET BEHULP VAN
MAS 41D3 ______________________________________________________________________________ 51 4.1.1
Opzuiveren van Mas 41D3 ______________________________________________________ 51
4.1.2
Kinetiek van sialoadhesine endocytose in PAM ______________________________________ 52
4.1.3
Karakterisatie van het internalisatieproces in PAM __________________________________ 58
4.2
OPSTELLEN VAN EEN MODEL VOOR SIALOADHESINE GEMEDIEERDE ENDOCYTOSE _________________ 62
4.2.1
HEK-T _____________________________________________________________________ 62
Inhoudsopgave
4.2.2
RK13_______________________________________________________________________ 64
4.2.3
SK _________________________________________________________________________ 64
4.2.4
PK15_______________________________________________________________________ 64
4.2.5
3D4 ________________________________________________________________________ 71
5 DISCUSSIE __________________________________________________________________________ 75 6 BESLUIT ____________________________________________________________________________ 83 7 REFERENTIELIJST __________________________________________________________________ 84
Samenvatting / Summary
SAMENVATTING / SUMMARY
Recent werd in porciene alveolaire macrofagen (PAM) colokalisatie aangetoond tussen clathrine en zowel PRRSV als sialoadhesine, de receptor voor PRRSV. Er werd dan ook verondersteld dat sialoadhesine via clathrine gemedieerde endocytose wordt opgenomen. Deze hypothese werd getoetst door endocytose te induceren met behulp van monoklonalen en gebruik te maken van verschillende inhibitoren. In deze scriptie kon aangetoond worden dat clathrine gemedieerde endocytose belangrijk is bij opname van sialoadhesine. Om onder andere mutaties in de cytoplasmatische staart van sialoadhesine te kunnen bestuderen werd gezocht naar een cellijn die na transfectie als model kan dienen voor de internalisatie van sialoadhesine. Er kon aangetoond worden dat zowel PK15 en vooral 3D4 cellen geschikt zijn aangezien ze een gelijkaardige internalisatie vertonen als PAM en verschillende inhibitoren een gelijkaardige reduktie geven.
Recently, colocalisation was shown in porcine alveolar macrophages (PAM) between clathrin and PRRSV as well as sialoadhesin, the receptor of PRRSV. Therefore it was assumed that sialoadhesin internalisation was clathrin mediated. This hypothesis has been verified by inducing internalisation with monoclonal antibodies, and putting different inhibitors to the test. In this thesis we could show that clathrin mediated endocytosis is important in sialoadhesin internalisation. In order to be able to study mutations, e.g. in the cytoplasmatic tail of sialoadhesin, we searched a cell line that can serve as a model for internalisation. Because kinetics in PK15 en 3D4 were very similar to those in PAM, these cells were chosen as model.
Literatuurstudie
1
1
LITERATUURSTUDIE
1.1 Het porcien reproductief en respiratoir syndroom virus 1.1.1 Inleiding In 1987 werd een nieuw ziektesyndroom waargenomen bij varkens in Noord-Amerika en Canada (Keffaber, 1989). De nieuwe ziekte werd gekenmerkt door vroeggeboorte, een verhoogd aantal doodgeboren biggen, sterfte van de biggen kort na de geboorte, laatabortus en ademhalingsproblemen (Mengeling et al., 1998; Zimmerman et al., 1997; Pensaert & Vynckier, 1993; Collins et al., 1992; Wensvoort et al., 1992). In 1990 werd melding gemaakt van een analoog syndroom in Duitsland (Lindhaus & Lindhaus, 1991). Begin 1991 werden ook de eerste gevallen opgemerkt in Nederland (Wensvoort et al., 1991) en later in het jaar ook in België (Pensaert & Vynckier, 1993). De ziekte heeft zich vervolgens snel over Europa verspreid en kreeg verschillende namen zoals ‘mystery swine disease’ (MSD) ‘blue ear disease’, ‘porcine epidemic abortion and respiratory syndrome’ (PEARS), ‘swine infertility and respiratory syndrome’ (SIRS) en ‘porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), wat nu de officiële naam is (Wensvoort et al., 1992). Het agens dat de ziekte veroorzaakt, werd voor het eerst uit porciene alveolaire macrofagen geïsoleerd in Nederland in 1991 en gekarakteriseerd als een nieuw RNA virus met een enveloppe en werd het Lelystad virus genoemd (Rossow et al., 1996; Wensvoort et al., 1992; Wensvoort et al., 1991). PRRSV is een positief strengig RNA virus met enveloppe dat behoort tot de familie van de Arteriviridae (Dea et al., 2000; Meulenberg, 2000; Cavanagh, 1997). Naast PRRSV behoren ook het equine arteritis virus, het lactaat dehydrogenase-elevating virus uit muizen en het simian hemorrhagic fever virus tot deze familie (Conzelmann et al., 1993). De sterke gelijkenissen tussen de Arteriviridae en de Coronaviridae hebben er toe geleid dat beide families ondergebracht zijn in de orde van de Nidovirales (Cavanagh, 1997). Sekwentieanalyse toonde aan dat er significante verschillen zijn tussen Noord-Amerikaanse en Europese isolaten (met als prototype respectievelijk VR-2332 en Lelystad virus). Terwijl vroeger beide types alleen op hun specifiek continent voorkwamen, wordt nu ook het Europese type aangetroffen in Canada, en het Amerikaanse type in Europa. Er is bovendien variatie binnen de types die toeneemt in de tijd (Stadejek et al., 2002).
Literatuurstudie
2
1.1.2 Morfologie PRRSV virions zijn sferisch en hebben een diameter van 45-65 nm voor de Europese types (Ohlinger et al., 1991; Wensvoort et al., 1991) en 48-83 nm voor de Noord Amerikaanse types (Benfield et al., 1992; Dea et al., 1992). Het virus bestaat uit een isometrisch nucleokapsied van 25–35 nm in diameter, bestaande uit een positieve, enkelstrengige RNA molecule omgeven door een kapsied structuur die opgebouwd is uit het 15 kDa nucleokapsied eiwit (Dea et al., 2000; Figuur 1). De nucleokapsied is omgeven door een dubbele lipide laag, de enveloppe, waarin zes structurele proteïnen aanwezig zijn: het matrix proteïne M, het ‘major’ proteïne GP5, en de ‘minor’ proteïnes P2b, GP2a, GP3 en GP4. De verschillende GP zijn glycoproteïnen en M is een niet N-geglycosyleerd matrix proteïne. GP5 wordt ook wel het enveloppe-proteïne genoemd. M en GP5 vormen heterodimeren door middel van disulfide bruggen, welke essentieel zijn voor infectie (Mardassi et al., 1996; Meulenberg et al., 1996; Van Nieuwstadt et al., 1996; Meulenberg et al., 1995). P2b is een 10 kD proteïne dat recenter ontdekt werd en waarvan de functie niet gekend is (Wu et al., 2001). RNA Nucleokapsied GP 2
GP 3
GP 4 AAAA
GP 5
P2b M Proteïne
Figuur 1. Schematische structuur van PRRSV.
Literatuurstudie
3
1.1.3 Het virale genoom De nucleotiede sekwentie en de organisatie van het genoom van PRRSV lijkt sterk op die van andere virussen van de groep van de Arteriviridae (Meulenberg et al., 1993a). Het genoom bestaat uit een enkelstrengige, positieve RNA molecule die een polyadenine staart draagt (Meulenberg et al., 1993a). Het genoom is ongeveer 15 kb groot en bevat negen open leesramen (open reading frame, ORF; Stadejek et al., 2002). De organisatie van het genoom wordt in Figuur 2 weergegeven, en de functie van de verschillende ORF in Tabel 1. ORF1a en ORF1b bevinden zich aan het 5’ uiteinde van het virale genoom, nemen 75% van genoom in beslag en coderen voor de replicase eiwitten (Verheije et al., 2002; Dea et al., 2000; Snijder et al., 1998; Meulenberg et al., 1993a). ORF 2-7 aan de 3’ zijde van het DNA, worden afgeschreven als een ‘nested set’ van subgenomische mRNA-strengen. Ieder subgenomisch mRNA heeft een zelfde Niet Structurele Proteïnen
A
Structurele Proteïnen
GP2a GP4 M 5’
1a
2
1b P 2b
B
3
4
5
6
7
3’ ORF
GP3 GP5 N mRNA 1 mRNA 2 mRNA 3 mRNA 4 mRNA 5 mRNA 6 mRNA 7
Figuur 2. (A) Genoomstructuur van PRRSV: ORF 1a en 1b, coderen voor een polyproteïne dat gesplitst wordt in kleinere niet structurele proteïnen die noodzakelijk zijn voor replicatie. ORF 2-5 coderen voor glycoproteïnen GP2 tot GP5. ORF6 codeert voor het membraan proteïne M en ORF 7 codeert voor het nucleokapsied proteïne N. Een intern ORF in ORF2 codeert voor een ander structureel proteïne, P2b. (B) De 3’ ‘nested set’ van subgenomische mRNA die geproduceerd worden gedurende de replicatie: De 5’ leider sequentie is afgeleid van het genomisch RNA en is de 5’ terminus van alle subgenomische RNA strengen (voorgesteld als zwarte blokjes). (Aangepast naar Snijder et al., 1998)
Literatuurstudie
4
niet-coderende 5’ leider sekwentie die afgeleid is van het 5’ uiteinde van het virale genoom en telkens wordt alleen het 5’ terminale ORF afgeschreven (Meulenberg, 2000) (zie verder: 1.1.5 De virale replicatiecyclus).
Tabel 1. Eigenschappen en functie van de ORF van PRRSV (Lelystad) (Meulenberg 2000; Meulenberg 1993a).
ORF
Berekende grootte (kDa)
Codeert voor
ORF1a
260
Replicase (RNA polymerase)
ORF1b
161,8
Replicase (RNA polymerase)
ORF 2
28,4
GP2
ORF3
30,6
GP3
ORF4
20
GP4
ORF5
22,4
GP5 (enveloppe proteïne)
ORF6
18,9
M (matrix proteïne)
ORF7
13,8
N (nucleokapsied proteïne)
1.1.4 De meest voorkomende virale proteïnen De meest voorkomende structurele proteïnen van PRRSV zijn GP5, M en N, respectievelijk gecodeerd door ORF 5, 6 en 7 (Dea et al., 2000). Het N proteïne is klein en sterk basisch, wat de interaktie met het negatief geladen genomisch RNA tijdens het maken van de nucleokapsied kan vergemakkelijken (Meulenberg et al., 2000). Het N-proteïne is sterk antigenisch, waardoor het uitermate geschikt is om het virus te detecteren (Dea et al., 2000). Het M proteïne is het meest geconserveerde structurele proteïne van PRRSV (Meulenberg, 2000) en is betrokken bij de aanhechting aan de heparaan sulfaat receptor op porciene alveolaire macrofagen, de natuurlijke gastheercel voor PRRSV (Delputte et al., 2002). Het M-proteïne zou bovendien een rol spelen in ‘budding’ en in ‘virus assembly’ en accumuleert tijdens infectie in het endoplasmatisch reticulum waar het heterodimeren vormt met GP5. Deze laatste induceert dan apoptose in macrofagen (Dea et al., 2000; Meulenberg et al., 2000; Suarez et al., 1996).
Literatuurstudie
5
1.1.5 De virale replicatiecyclus PRRSV kan slechts in een beperkt aantal cellen repliceren. In varkens kan PRRSV enkel repliceren in alveolaire long macrofagen (‘pulmonary alveolar macrophages’; PAM) en in andere gedifferentieerde cellen van de monocyt/macrofaag cellijn. Trouwens, voor alle Arterivirussen zijn macrofagen de primaire doelcel (Snijder & Meulenberg, 1998). PRRSV repliceert ook in drie, niet-porciene cellijnen, namelijk in MARC-145 en CL2621 - twee cellijnen afkomstig van de MA104 apeniercellijn - (Duan et al., 1997) en in CRL-11171 (Meng et al., 1994). Ook repliceert PRRSV in spermatiden en spermatocyten van varkens (Snijder & Meulenberg, 1998). Na vijf tot zeven passages op celcultuur kan een titer van 105 à 107 TCID50 (50 percent tissue culture infective dose) bereikt worden (Dea et al., 2000). PRRSV vermeerdert echter het beste op alveolaire macrofagen die nog immatuur of recent geactiveerd zijn en afkomstig uit biggen jonger dan zes weken (Suarez, 2000). Het cytopathisch effect (CPE) van PRRSV op macrofagen bestaat uit het afronden van de macrofagen en het loskomen van de celcultuurplaat (Suarez, 2000; Snijder et al., 1998). Het feit dat bepaalde cellijnen niet geïnfecteerd kunnen worden met het intacte virus, maar dat na transfectie met het RNA wel replicatie optreedt, wijst er op dat het specifieke tropisme bepaald wordt door de aanwezigheid van receptoren op de celmembraan (Snijder & Meulenberg, 1998). Duan et al. (1998) hebben aangetoond dat in het specifieke geval van PRRSV, deze receptor een 210-kDa proteïne is dat recent geïdentificeerd werd als de porciene sialoadhesine (Vanderheijden et al., 2003). De receptor kon geïmmunoprecipiteerd worden met een monoklonale antistof 41D3 die gericht is tegen de receptor en de infectie in macrofagen volledig kan blokkeren. Recent werd aangetoond dat de porciene sialoadhesine PRRSV opname en infectie medieert, aangezien transfectie van het cDNA van dit eiwit leidde tot opname of infectie van verschillende celtypes die resistent zijn voor infectie met PRRSV (Vanderheijden et al., 2003). De receptor blijkt ook specifiek te zijn voor gedifferentieerde cellen van de monocyt/macrofaag lijn, daar 41D3 niet bindt op andere celtypes (Duan et al., 1998). Er is ook aangetoond dat een heparine-achtige receptormolecule op macrofagen een rol speelt in de aanhechting van het virus op de macrofagen, daar heparinase behandeling van de macrofagen een significante reductie van infectie gaf (Delputte et al., 2002). Waarschijnlijk wordt het virus dan opgenomen door receptor gemedieerde endocytose met clathrine daar deze opname kan geïnhibeerd worden met cytochalasine D en er colokalisatie kon
Literatuurstudie
6
aangetoond worden tussen clathrine en PRRSV (Nauwynck et al., 1999; Duan et al., 1998). Een lage pH schok bij de initiële stappen van internalisatie blijkt ook noodzakelijk voor een normale virusreplicatie (Nauwynck et al., 1999). Positief strengige RNA-virussen repliceren door een proces waarbij een RNA afhankelijk RNA polymerase (‘RNA dependent RNA polymerase’, RdRp) betrokken is. Het genomisch RNA doet dienst als template voor de aanmaak van negatief strengig anti-genomisch RNA dat op zijn beurt dan weer dienst doet als template om nieuwe positieve RNA strengen te maken (Verheije et al., 2002). Het replicatie proces vereist dat het RdRp op specifieke plaatsen op de template bindt. Deze sekwenties of structuren staan in de literatuur bekend als ‘cis-acting replication elements’ en worden meestal aan de terminus van het virale RNA teruggevonden (Buck et al., 1996). Na vrijstelling van het virale genoom in het cytoplasma worden ORF1a en ORF1b afgeschreven waarbij ORF1b ontstaat door een ribosomale frameshift net voor het stopcodon van ORF1a (Verheije et al., 2002). Voor deze frameshift zijn een ‘slippery sequence’ en een sekwentie die een pseudo-koop structuur kan vormen essentieel (Meulenberg et al., 1993a). De polyproteïnen gecodeerd door ORF1a en ORF1b worden vervolgens gesplitst in ten minste twaalf niet structurele proteïnen waaronder het replicase enzyme en het polymerase enzyme (Verheije et al., 2002; Dea et al., 2000; Snijder et al., 1998; Meulenberg et al., 1993a). Het daarvoor vereiste peptidase wordt gecodeerd door ORF1a (Snijder et al., 1998). Naast het replicase enzyme worden ook andere niet structurele proteïnen gemaakt die nodig zijn voor transcriptie en translatie van het subgenomische mRNA. De verdere replicatie en transcriptie van PRRSV grijpt plaats in het cytoplasma (van Marle, 1999; Benfield et al., 1992; Wensvoort et al., 1991). Andere subgenomische mRNA strengen worden gevormd door een discontinue mRNA transcriptie (Verheije et al., 2002; Meulenberg et al., 1993b). Deze subgenomische mRNA strengen hebben allen dezelfde leider sequentie die is afgeleid van het 5’ uiteinde van het virale genoom (Meulenberg et al., 1993b). Het 5’ uiteinde van het virale genoom wordt gekoppeld aan subgenomische mRNA’s door een discontinue transcriptie. De plaats waar deze fusie met de 5’ leider gebeurt wordt de junction site genoemd (Meulenberg et al., 1993b; Snijder et al., 1998). De 5’ leider sequentie is waarschijnlijk de plaats waar virale en cellulaire eiwitten binden die betrokken zijn in de replicatie van PRRSV (Oleksiewicz et al., 1999). Het 3’ uiteinde is waarschijnlijk het aanhechtingspunt voor het RdRp (Meng et al., 1994).
Literatuurstudie
7
Nieuwe virions worden geassembleerd door ‘budding’ van voorgevormde nucleopkapsieden op het zacht endoplasmatisch reticulum en het Golgi-apparaat. Het virus wordt dan waarschijnlijk vrijgesteld door exocytose (Dea et al., 2000).
Literatuurstudie
8
1.2 Macrofagen 1.2.1 Voorkomen en functie Macrofagen vormen een uitzonderlijk veelzijdige populatie van cellen die in praktisch alle weefsels aangetroffen worden (Morissette et al., 1999; Naito, 1993). Vanuit morfologisch en functioneel standpunt kunnen de macrofagen gedefinieerd worden als gedifferentieerde mononucleaire cellen met een uitgebreid stelsel van lysosomen en een dynamische plasmamembraan met microvilli (Opdenakker & Van Damme, 1991). Het zijn sterk secretorische cellen die stoffen afscheiden die ontsteking, groei of hematopoiese kunnen remmen of induceren (Woods et al., 2000). Hun belangrijkste functie vervullen ze echter in het immuunsysteem waar ze de primaire defensie zijn tegen tal van pathogenen: ze detecteren infectieuze partikels, nemen ze intracellulair op en vernietigen ze (Aderem & Underhill, 1999; Morissette et al., 1999). De fagocyterende eigenschap van macrofagen is onontbeerlijk bij het opruimen van (tumor)cellen en infectieuze agentia (Aderem & Underhill, 1999). Macrofagen stimuleren ook de T-cellen van het immuunsysteem door de antigenen van infectieuze partikels aan hun oppervlak te presenteren (Morissette et al., 1999) en zijn belangrijk bij zowel de aangeboren als de verworven (humoraal en cellulair) immuniteit (Morissette et al., 1999; Gordon, 1998). Omdat macrofagen bij zo veel processen betrokken zijn, is hun functie sterk gereguleerd. Een defect in deze regulatie kan oorzaak zijn van een ganse reeks van inflammatoire ziektes (Morissette et al., 1999).
1.2.2 Ontogenie Macrofagen ontstaan uit hematopoietische stamcellen in het beenmerg die differentiëren in monoblasten, promonocyten, monocyten en macrofagen (Naito, 1997). De heterogeniteit van macrofagen is al te merken bij de vroege ontogenie. In het embryo ontwikkelen primitieve macrofagen zich tijdens ‘yolk sac hematopoiese’ tot foetale macrofagen. Hierbij slaan ze de differentiatieweg die monocyten volgen over (Naito, 1993; Takahashi et al., 1996). Monocyten vormen een minderheid van de celpopulatie in de vroege foetale fasen, maar vergroten hun aandeel in de latere fasen (Naito, 1993). De foetale of primitieve macrofagen
Literatuurstudie
9
proliferen ter plaatse tijdens de foetale periode en differentiëren tot residente macrofagen na de geboorte (Naito, 1993; Takahashi et al., 1996). In adulten, differentiëren monocyten zich uit promonocyten, afgeleid uit de pluripotente stamcellen in beenmerg. Als monocyt migreren ze via de bloedbaan naar de perifere weefsels (Opdenakker & Vandamme, 1991). Macrofagen afgeleid van monocyten hebben een korte levensduur en prolifereren niet meer (Takahashi et al., 1996; Naito, 1993). Residente macrofagen daarentegen prolifereren wel nog en onderhouden hun populatie door zelfvernieuwing (Naito, 1993).
1.2.3 Fagocytose Vele cellen, zowel uni- als multicellulairen, kunnen fagocyteren, maar macrofagen doen dit op wel zeer efficiënte wijze en worden daarom ook professionele fagocyterende cellen genoemd (Garcia-Garcia & Rosales, 2002; Aderem & Underhill, 1999). De fagocyterende eigenschap van macrofagen is onontbeerlijk voor de opname en degradatie van infectieuze agentia en afgestorven cellen, en is betrokken bij ontstekingen en de immuunrespons (Aderem & Underhill, 1999). Fagocytose bij macrofagen verloopt zeer efficiënt omdat ze een gans arsenaal aan fagocytische receptoren tot expressie brengen op hun celmembraan (Aderem & Underhill, 1999). Die grote hoeveelheid receptoren is nodig om de verschillende pathogenen, die steeds de neiging hebben tot muteren, te kunnen herkennen en om een onderscheid te kunnen maken tussen lichaamseigen en lichaamsvreemde cellen (Aderem & Underhill, 1999). Het belang van deze fagocytische receptoren blijkt uit experimenten waarbij door transfectie met het cDNA van een fagocytische receptor het fagocytose proces nog efficiënter kan worden gemaakt en waardoor niet fagocytische cellen fagocytisch kunnen worden. (Aderem & Underhill, 1999; Hunter et al., 1994). De meeste kennis omtrent de signalisatie pathways van fagocytose komt uit studies van de Fcreceptor bij muizen (Aderem & Underhill, 1999). Deze receptor bindt de Fc-zijde van een immunoglobuline (Garcia-Garcia & Rosales, 2002) en laat toe dat macrofagen pathogenen herkennen die gedetecteerd werden door het adaptieve immuunsysteem (Aderem & Underhill, 1999). Naargelang het type immunoglobuline dat herkend wordt spreekt men van FcγR, FcεR en FcαR, de respectievelijke receptoren voor IgG, IgE en IgA (Garcia-Garcia & Rosales, 2002). Van FcγR zijn er drie verschillende klassen bekend: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII
Literatuurstudie
10
(CD16) (Ravetch & Bolland, 2001). FcγRI bindt alleen monomerisch IgG; FcγRII bindt daarentegen alleen multimerisch IgG. Beide receptoren hebben een lage affiniteit voor hun ligand, net zoals FcγRIII (Garcia-Garcia & Rosales, 2002). FcγRI en FcγRIII bestaan uit een α en een γ-keten en kunnen fagocytose induceren. De γ keten bevat immers een op tyrosine gebaseerd immunoreceptor activatie motief (ITAM; immunoreceptor tyrosine-based activation motif). De FcγRII receptor bestaat slechts uit één enkele keten en bevat een op tyrosine gebaseerd immunoreceptor inhibitie motief (ITIM; immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) (Nakamura et al., 2002; Ravetch & Bolland, 2001). Verscheidene inhibitorische moleculen zoals een SH2 (Src homologie)-domein bevattend inositol 5-fosfatase, of een SH2domein bevattend proteïne tyrosine fosfatase, binden met deze FcγRII receptor. Echter, de FcγRII receptor kan enkel inhibitorisch werken als deze receptor crosslinkt met een activerende receptor (die een ITAM-motief bevat) (Nakamura et al., 2002). Het evenwicht tussen ITIM en ITAM bevattende receptoren is meestal ook gerelateerd aan de differentiatie van de macrofaag (Morisette et al., 1999). Na binding van het ligand en clustering van de receptoren, worden de ITAM motieven gefosforyleerd (Garcia-Garcia & Rosales, 2002). Deze fosforylatie gebeurt door enzymen van de Src tyrosine kinase familie (Korade-Mirnics & Corey, 2000). Syk, een ander tyrosine kinase bindt dan op de gefosforyleerde ITAM motieven met hun SH-2 domein. Tezelfdertijd wordt het Syk-proteïne op zijn beurt gefosforyleerd door Src kinasen (Garcia-Garcia & Rosales, 2002). De exacte rol van Syk is ongekend maar is wel essentieel voor het fagocytose proces in hematopoietische cellen. (Garcia-Garcia & Rosales, 2002). De verdere pathway is eveneens onvolledig gekend. Voor een volledig overzicht van de tot nu toe gekende eiwitten, en hun rol in fagocytose wordt verwezen naar Garcia-Garcia & Rosales (2002). Hierna wordt enkel kort het internalisatie proces beschreven. Verschillende eiwitten uit de Rho familie van kleine GTPasen, zoals Rho, Rac en Cdc42, zijn belangrijk voor de reorganisatie van het actine cytoskelet waarbij ‘stress fibers’, lamellipodia en fillopodia gevormd worden. (Garcia-Garcia & Rosales, 2002). Vroeger werd gedacht dat door actinepolymerisatie de celmembraan rond het partikel geduwd werd. Maar aangezien macrofagen partikels kunnen opnemen die groter zijn dan zichzelf moeten macrofagen een interne bron hebben die de nood aan membranen aanvult (Garcia-Garcia & Rosales, 2002). Ook myosines (dit zijn motor-proteïnen die hun ATPase activiteit koppelen aan beweging over
Literatuurstudie
11
actinevezels) zouden een kracht kunnen leveren om vesikels te internaliseren. Dynamine II en amphiphisine, twee eiwitten die belangrijk zijn voor clathrine gemedieerde endocytose, zijn ook belangrijk voor de vorming van fagosomen. Ook hier is, net zoals bij endocytose, niet duidelijk of dynamine een mechanische kracht levert of werkt als GTPase die een cascade reactie in gang zet (Garcia-Garcia & Rosales, 2002). Er zijn trouwens nog overlappingen tussen endo- en fagocytose. De merkers die teruggevonden worden op endosomen, de Rab proteïnen, worden ook op fagosomen teruggevonden. Fagosomen zijn net zoals vroege endosomen geassocieerd met Rab5. Later associëren die fagosomen ook met Rab7, een merker voor late endosomen. (Garcia-Garcia & Rosales, 2002).
Literatuurstudie
12
1.3 Sialoadhesine 1.3.1 Inleiding Sialoadhesine (Sia), een proteïne van 185 kDa, werd ontdekt in beenmerg macrofagen als een receptor voor rode bloedcellen van schapen (McWilliam et al., 1992). Het feit dat Sia geen fagocytische receptor is, wijst er op dat Sia niet direct betrokken is bij het opruimen van dode cellen, celfragmenten en pathogenen. Wel kan de receptor coöpereren met fagocytische receptoren waarbij deze het adsorptieproces efficiënter maken (Munday et al., 1999; Crocker et al., 1997). De expressie van Sia is sterk gereguleerd en kan gestimuleerd worden, onder andere door serumfactoren, glucocorticoïden en ontstekingscytokinen (van den Berg et al., 2001; Crocker et al., 1999; Munday et al., 1999). Bij chronische ontstekingen worden veel sialoadhesine receptoren teruggevonden op de inflammatoire macrofagen (van den Berg et al., 2001). Sialoadhesine bindt met siaalzuren (Figuur 3), welke zure monosachariden zijn die in eukaryote cellen vaak teruggevonden worden aan het uiteinde van glycoconjugaten (BrinkmanVan der Linden & Varki, 2000; Varki, 1997). Siaalzuur wordt vooral teruggevonden op celmembranen, in uitgescheiden glycoproteïnen en in de extracellulaire matrix, waar siaalzuur gebonden zit op de niet-reducerende uiteinden van oligosacharide ketens (Freeman et al., 2001). Omdat er in de natuur meer dan veertig verschillende vormen van siaalzuur bestaan en omdat siaalzuur op verschillende manieren kan binden op andere suikers en op zichzelf, is er een enorme diversiteit aan siaalzuurderivaten en zijn siaalzuren uitermate geschikt voor de specifieke herkenning van het celoppervlak (Nitschke et al., 2001; Munday et al., 1999). Deze eigenschap
R1O R1O
OR1 OR1
R2
o
COOH OR3
Figuur 3. Chemische structuur van een siaalzuur. R1=acetyl, lactyl, methyl, sulfaat, fosfaat, anhydro, siaalzuur, fucose, glucose of galactose groep; R2= N-acetytl, N-glycolyl, N-glycolyl-O-acetyl, amino of hydroxyl groep; R3= Gal, GalNAc, GlxNAc, Sialoadhesine of 5-O-Neu5Gc (Naar Varki, 1997).
Literatuurstudie
13
wordt benut door een ganse reeks van pathogene virussen, bacteriën en protozoa welke binden met siaalzuur of siaalzuur van de cel overnemen als bescherming tegen vernietiging (Nitschke et al., 2001). De term siaalzuur wordt dikwijls gelijkgesteld aan N-acetyl-neuraminezuur (Neu5Ac), maar in feite is dit veel voorkomende siaalzuur, slechts een precursor van een familie van meer dan 40 andere zure suikers (Varki, 1997).
1.3.2 Sialoadhesine en de siglec-familie Sia behoort tot de superfamilie van de immunoglobulines (Ig; Freeman et al., 2001; van den Berg et al., 2001), heeft een grote extracellulaire regio van 1619 aminozuren, een transmembrane regio, en een korte cytoplasmatische staart van 35 aminozuren met daarop verschillende serine en threonine fosforylatieplaatsen (Crocker et al., 1997). De vaststelling dat de sekwentie van Sia opvallende gelijkenissen toonde met CD22, welke ook met siaalzuur bindt, deed het vermoeden rijzen dat ook andere verwante receptoren zoals ‘myelin associated glycoprotein’ (MAG), ‘Schwann cell myelin protein (SMP)’, en CD33 siaalzuurbindende proteïnen waren (Munday et al., 2000). Deze siaalzuurbindende proteïnen worden ‘siglecs’ genoemd (sialic acid-binding immunoglobulin-like lectines of siaalzuurbindende lectines; Freeman et al., 2001; BrinkmanVan der Linden et al., 2000; Munday et al., 1999). Omdat deze lectines ook deel uitmaken van de superfamilie van immunoglobulines, worden zij ook I-lectines genoemd. Een typisch kenmerk van alle siglecs is dat de expressie sterk weefsel- en celafhankelijk is en sterk gereguleerd, wat er op wijst dat ze geen overlappende functie hebben (Crocker et al., 1999). Behalve MAG (siglec-4a) en SMP (siglec-4b) die vooral aangetroffen worden in het centrale zenuwstelsel, zijn alle siglecs betrokken bij de hemopoietische- en immuunsystemen (Crocker et al., 1999; Munday et al., 1999). Omdat het expressiepatroon overeenkomt met de hoeveelheid gevormd mRNA, gebeurt de regulatie waarschijnlijk op het transcriptieniveau (Crocker et al., 1997). Alle siglecs die tot dusver gekarakteriseerd zijn, hebben een analoge structurele opbouw bestaande uit een V domein gevolgd door een aantal C2-Ig domeinen (Munday et al., 1999; Crocker et al., 1999; Figuren 4 en 5). Sialoadhesine is het grootste lid van deze siglec-familie met 16 C2 domeinen terwijl CD33 de kleinste is met slechts één domein (Brinkman-van der Linden et al., 2000; Crocker et al., 1999; Figuur 5). Het V domein en het aangrenzende C2 domein hebben een sterk geconserveerd patroon van drie cysteïne residuen. Dit heeft tot gevolg dat een intra-β-sheet disulfide brug ontstaat in het V-domein, welke uniek is voor deze Ig-familie
Literatuurstudie
14
TGA
ATG D1
5’ UTR
2
3
4
5 6
Leider Peptide
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17
C2-Set Domeinen V-Set Siaalzuur bindend domein 0
0,5
AAA+ 3’ UTR
AAA+
Cytoplasmatisch Domein Transmembraan Regio
1kb
Figuur 4. Schematische organisatie van het genoom van sialoadhesine-mRNA. (Aangepast naar Crocker et al., 1997)
Sialoadhesine CD22
CD33
MAG
OP-BP2
OP-BP1
P75AIRM1 Siglec-8
Siglec-1
Siglec-3
Siglec-4a
Siglec-5
Siglec-6
Siglec-7
Siglec-2
Siglec-9
Figuur 5. Schematische voorstelling van de siglec familie. (Aangepast naar Nitschke et al., 2001)
(Vinson et al., 1996). Daarnaast wordt ook een inter-β-sheet disulfide brug in het C2 domein gevormd (Crocker et al., 1997; Vinson et al., 1996). Een overzicht van de verschillende siglecs en hun plaats van expressie wordt gegeven in Tabel 2 .
Literatuurstudie
15
Tabel 2. De verschillende siglecs en hun plaats van expressie (naar Freeman et al., 2001; Zhang et al., 2000; Munday et al.,1999).
Siglec
Plaats van expressie
Nr.
Alternatieve naam
1
Sialoadhesine
Bepaalde subsets van macrofagen
2
CD22
Uniek voor B-lymfocyten
3
CD33
Op niet-rijpe en op sommige rijpe myeloiden waaronder macrofagen
4a
‘Myelin-associated glycoprotein’ (MAG) Zenuwstelsel
4b
‘Schwann cell myelin protein’ (SMP)
Zenuwstelsel
5
OB-BP2
Rijpe
myeloide
cellen,
sommige
macrofagen, neutrofielen en monocyten. 6
OB-BP1
Placentale trophoblasten en B-cellen
7
P75/AIRM1
Monocyten en ‘natural killer’ cellen
8
Eosinofielen, mast cellen en basofielen
9
Monocyten, neutrofielen, B cellen en sommige T-cellen Siglecs (behalve siglec-8; Nitschke et al., 2001) bevatten in hun cytoplasmatische staart een op
tyrosine gebaseerde, inhibitorische sekwentie (ITIM; Freeman et al., 2001; Zhang et al., 2000). Men denkt dat receptoren die dergelijke motieven dragen, een inhibitorische werking hebben wanneer ze crosslinken met activerende receptoren, welke een op tyrosine gebaseerd activatie signaal (ITAM) bevatten (Zhang et al., 2000).
1.3.3 Herkenning van koolhydraten door siglecs De plaats voor de binding van siaalzuur is beperkt tot het aminoterminale deel van het Vdomein. Dat domein is immers noodzakelijk en voldoende voor binding (van den Berg et al., 2001; Crocker et al., 1999; Vinson et al., 1996). Het V-domein bestaat uit negen β-strengen (A tot G) die samen twee ‘β-sheets’ vormen: de GFCC’C” en de ABED ‘sheet’ (Vinson et al., 1996). Men heeft vastgesteld dat de binding van siaalzuur vooral afhangt van zes
Literatuurstudie
16
aminozuurresidu (Ile39, Tyr41, Asn95, Arg97, Arg105 en Asp108) gelegen als een cluster op de GFCC’C” sheet en gecentreerd rond Arg97 dat op de F-streng gelegen is (Vinson et al., 1996; Crocker et al., 1999). Het Arg97-resididu is geconserveerd in alle sialoadhesines en is cruciaal in de herkenning van siaalzuur door sialoadhesines (Vinson et al., 1996). Uit kristallografie is gebleken dat de carboxylgroep van siaalzuur een zoutbrug vormt met Arg97 en twee tryptofaan residu’s (gelegen op de A en G β-sheet) zijn betrokken bij de hydrofobe interakties met de Nacetyl en glycerol substituenten van neuraminezuur (Nitschke et al., 2001; Crocker et al., 1999; Vinson et al., 1996) Elk lid van de siglec familie heeft een welbepaalde voorkeur voor zowel het type siaalzuur als voor de wijze waarop het gebonden is op het subterminale suikerresidu (Munday et al., 1999; Crocker et al., 1999). Zo verkiest siglec-1 (Sia) net zoals siglec-3, α2,3 gebonden sialyllactos(amine) boven de α2,6 gebonden vorm. Siglec-2 (CD22) bindt daarentegen alleen α2,6 gebonden sialyllactosamines (Brinkman-Van der Linden, 2000; Munday et al., 1999; Crocker et al., 1999). Siglec-4a vereist terminale α2,3 gebonden siaalzuren, siglec-5 bindt zowel de α2,3 als de α2,6 vorm en de α2,8 vorm. De sialyl-Tn epitoop, (Neu5Acα2,6GalNAc) een belangrijke merker voor kankercellen, kan herkend worden door siglec-2, 3, 5 en 6. Siglec-6 kan naast suikers ook een proteïne herkennen, namelijk leptine (Brinkman-Van der Linden, 2000). Bij de α2,3 binding wordt veelal op het onderliggende GlcNAc een fucose (fuc) residu gevonden dat een negatieve invloed heeft op de bindingscapaciteiten van sialoadhesine (Binkman-Van der Linden, 2000). Een overzicht van de bindingsspecificiteit verschillende siglecs wordt gegeven in Tabel 3.
Literatuurstudie
17
Tabel 3. Overzicht van de bindingsspecificiteit van de verschillende siglecs. (naar Nitschke et al., 2001; Brinkman-Van der Linden et al.,,2000)
Siglec Mogelijkheid tot herkennen van Siaα2,6
Siaα2,3
Siaα2,6
Lac(NAc)
Lac(NAc)
GalNAc
Siaα2,8Sia
(Sialyl-Tn) 1
+
++
-
+
2
++
-
++
-
3
++
+
+
-
4a
-
+
-
-
5
+
+
+
+
6
-
-
+
-
7
+
+
+
nb
8
nb
++
Nb
nb
9
+
+
+
nb
-:geen affiniteit, +: grote specificiteit, ++: zeer grote specificiteit nb: data niet beschikbaar
1.3.4 Rol van cis-interakties De meeste siglecs worden bestudeerd als opgezuiverde proteïnen. De bindingseigenschappen van deze gezuiverde proteïnen kan echter grondig verschillen van siglecs die op de celmembraan tot expressie komen (Nitschke et al., 2001). Dat verschil wordt toegeschreven aan het optreden van cis-interakties op de celmembraan. Siaalzuur wordt ook teruggevonden op de celmembraan, wat inhoudt dat vele siglecreceptoren (die siaalzuur binden) in een siaalzuur-rijke omgeving tot expressie komen. Daardoor kunnen cis-interakties optreden met endogene siaalzuren (Munday et al., 1999; Crocker et al., 1997) en dit vermindert de mogelijkheid om exogene gesialyleerde liganden te binden (Nitschke et al., 2001). Men denkt nu ook dat dit de reden is waarom Sia een zo groot aantal (17) Ig
Literatuurstudie
18
domeinen heeft, namelijk om ver boven de plasmamembraan uit te steken, en zo het inhibitorisch effect van endogene siaalzuren te vermijden (Nitschke et al., 2001; Munday et al., 1999; Crocker et al., 1997; Figuur 6). Deze evolutionaire verklaring wordt ook wel het ‘rainforest’ model
Ongeveer 30 nm
genoemd (Crocker et al., 1997).
Siaalzuu gradiën
Sialoadhesine
CD22
CD33
Siaalzure
Figuur 6. CIS-inhibitie van siaalzuurbindende plaatsen. De figuur toont aan hoe de extentie van siaalzuurbindende sequenties, weg van de plasmamembraan, belangrijk is in cel-cel interakties. Volgens dit model, bevinden de siaalzuur bindende sequenties van sialoadhesine zich ver van de plasmamembraan, en zijn zo minder gevoelig aan CIS-inhibitie. Daarentegen worden de bindingsplaatsen van CD33 volledig gemaskeerd door zijn relatief kleine afmeting. (Aangepast naar Nitschke et al., 2001)
Literatuurstudie
19
1.4 Endocytose 1.4.1 Inleiding Alle eukaryotische cellen kunnen macromoleculen, vaste deeltjes en vloeistoffen opnemen vanuit het extracellulaire milieu waardoor zij in staat zijn voedingsstoffen op te nemen en een homeostatisch evenwicht te handhaven (Lodish et al., 2001; Benmerah et al., 1998; Mellman 1996; Alberts et al., 1994). Ook voor interakties met de buitenwereld en de overdracht van neurale, metabolische en proliferatieve signalen is internalisatie onontbeerlijk, net als voor het opruimen van apoptotische cellen, opname van pathogenen en antigen presentatie en zelfs voor gentranscriptie (Bild et al., 2002; Marsh & McMahon, 1999; Mellman, 1996). Men kan in hoofdzaak onderscheid maken tussen fagocytose en endocytose. Fagocytose (macropinocytose) is een actine-gemedieerd proces waarbij cellen, bacteriën en andere grote partikels van meer dan 0,5 µm geïnternaliseerd worden. Nadat specifieke partikels zoals bacteriën gebonden zijn op de membraanreceptoren, vindt in de cel eerst een lokale polymerisatie van actine plaats op de plaats van de receptorbinding, waarna de cel pseudopodiën uitstulpt die het deeltje omhullen en internaliseren (Sieczkarski & Whittaker, 2002a; Beningo en Wang, 2001; Mellman, 1996). Bij endocytose daarentegen stulpt een kleiner deel van de celmembraan in, dat dan afsplitst en een intercellulair vesikel vormt van 50 tot 100 nm groot (Lodish et al., 2001). Recent onderzoek heeft aangetoond dat verschillende proteïnen betrokken bij endocytose ook met actine geassocieerd zijn, en dat actine receptorgemedieerde endocytose vergemakkelijkt. Echter, disruptie van de actine filamenten verstoort niet altijd het endocytoseproces (Schafner et al., 2002; Qualman et al., 2000). Er wordt gedacht dat actinepolymerisatie de kracht levert voor de invaginatie van de celmembraan en transport van de geïnternaliseerde vesikels (Schafner, 2002). Hoewel er ook een constitutieve vorm van endocytose bestaat (pinocytose), waarbij cellen kleine vloeistofdruppeltjes met de daarin opgeloste stoffen opnemen (Royle et al., 2003; Lodish et al., 2001; Gaidarov et al., 1999), wordt in wat volgt vooral aandacht besteed aan de receptorgemedieerde endocytose, en meerbepaald de clathrine gemedieerde vorm.
Literatuurstudie
20
1.4.2 Receptorgemedieerde endocytose 1.4.2.1 Inleiding Er bestaan in hoofdzaak drie vormen van receptor gemedieerde endocytose: endocytose via clathrine, via caveolae of via een clathrine en caveolae onafhankelijk proces (Sieczkarski & Whittaker, 2002a). De best gekende vorm van endocytose is de receptorgemedieerde endocytose waarbij clathrine-mantels rond de vesikels gevormd worden (Figuur 7) en deze werd in 1964 voor het eerst beschreven door Roth en Porter (Roth & Porter, 1964). Omdat deze vesikels ook een deel extracellulaire vloeistof opnemen, wordt dit proces ook wel vloeibare-fase endocytose (fluid–phase endocytosis) genoemd of micropinocytose (Alberts et al., 1994). Deze vorm van endocytose is uitvoerig bestudeerd geweest aan de hand van de low density lipoproteïne-receptor (LDL) en de transferrinereceptor.
Figuur 7. Elektronenmicroscopische opname van de vorming van ‘clathrin coated pits’ op de plasmamembraan met afsplitsing van een intercellulair vesikel en endocytose van LDL (low density lipoprotein). (Uit Alberts et al., 1994)
Niet constitutieve, receptorgemedieerde endocytose via clathrine begint met de binding van een ligand op een membraanreceptor. Deze laatste bevat één of meerdere signaalsekwenties in zijn cytoplasmatische staart die het mogelijk maakt dat de receptor opgenomen wordt in de cel (Mellman, 1996). Men kan onderscheid maken in vier belangrijke signalen, namelijk een op tyrosine gebaseerd signaal, voornamelijk van de vorm FxNPxY of Yxxφ (met φ een groot hydrofoob aminozuur; x een willekeurig aminozuur, maar Y+2 is meestal R), een dileucine bevattend signaal, een gefosforyleerd serine-rijk domein op het COOH-uiteinde van vele ‘GTP-
Literatuurstudie
21
binding protein coupled receptors’ (GPCR) en motieven die gepaard gaan met ligand geïnduceerde fosforylatie van serine residu’s (Pearse et al., 2000; Marsh et al., 1999; Mellman, 1996). Echter, de aanwezigheid van dergelijk signaal geeft nog geen garantie op internalisatie. Het signaal moet ook een bepaalde conformatie aannemen om actief te zijn (Bonifacino et al., 1999). De binding van een ligand zorgt ervoor dat receptoren dimeren vormen (Lodish et al., 1999) waarna de celmembraan invagineert en vesikels worden afgesnoerd die omhuld worden door clathrine (Mellman, 1996). Caveloae (of caveosomen) worden ook geïnternaliseerd vanaf de plasmamembraan, zijn rijk aan glycosfingolipiden en cholesterol en worden gekarakteriseerd door de aanwezigheid van het integrale membraan proteïne caveaoline (21 kDa) (Pelkmans & Helenius, 2002; Thomsen et al., 2002). De vorming van caveolae komt hoofdzakelijk voor bij celstimulatie en het ganse proces is trager dan bij clathrine gemedieerde endocytose (Sieczkarski et al., 2002a; Marsh & PelchenMatthews, 2000). De stimulatie kan de bijvoorbeeld de binding zijn van een virus of bacterie op de cel. Een bijkomend verschil is dat caveosomen niet de endosoom – lysosoom pathway volgen, en bijgevolg dus niet verzuren (Thomsen et al., 2002). Naast de clathrine gemedieerde endocytose en caveolae, bestaat er nog een slecht gedefinieerde route die onafhankelijk is van voorgaande processen. (Nichols & LippincottSchwarz, 2001; Bishop, 1997). Zoals bij caveolae, is het erg waarschijnlijk dat deze pathway sterk geassocieerd is met de aanwezigheid van detergent-resistente microdomeinen op de plasmamembraan. De interleukine-2 (IL-2) receptor is waarschijnlijk de best gekarakteriseerde merker voor deze pathway (Sieczkarski & Whittaker, 2002a; Lamaze et al., 2001). Een andere cholesterol gevoelige pathway kan materiaal direct naar het Golgi-apparaat vervoeren, zonder langs vroege endosomen te passeren (Nichols et al., 2001).
Literatuurstudie
22
1.4.2.2 Eiwitten betrokken bij de eerste stappen in receptor gemedieerde endocytose via clathrine 1.4.2.2.1 Adaptor proteïnen (AP) AP2 (~300 kDa) is een adaptorproteïne dat bestaat uit vier subeenheden die ook wel adaptines genoemd worden: twee grote eenheden van 100 kDa (α en β-adaptine), een kortere keten van 50 kDa (µ2-adaptine) en een kleine keten van 20 kDa (σ2-adaptine) (Pearse et al., 2000; Wakeham et al., 2000; Marsh et al., 1999; Benmerah et al., 1998; Clague, 1998). AP2 heeft de vorm van een blok waar het COOH-uiteinde van de α en β units als oren uitsteken (Figuur 8; Marsh et al., 1999).
COOH
COOH
µ2 α NH2 σ2
β NH2
Figuur 8. Schematische structuur van AP2. Op deze figuur werden de α, β, µ2 en σ2 keten aangeduid en tevens het COOH en NH2 terminale deel van de α en β keten. (Naar Clague, 1998)
Het Yxxφ- motief in de staart van receptoren, bindt in een uitgestrekte toestand rechtstreeks op de µ2 subeenheid van AP2 (Boll et al., 2002; Conner et al., 2002; Bonifacino et al., 1999; Ohno et al., 1996). Andere motieven zoals het dileucine motief kunnen rechtstreeks binden met clathrine en met β-adaptine van AP2 (Royle & Murell-Lagnado, 2003). De α-keten zorgt er waarschijnlijk voor dat AP2 gelokaliseerd wordt op de plasmamembraan en lijkt de werking van AP2 te regelen door interakties met fosfoinositides die zich op de celmembraan bevinden (Benmerah et al., 1999; Benmerah et al., 1998; Beck & Keen, 1991). Bovendien bindt α-adaptine met verscheidene andere proteïnen zoals amphiphysine (lokaliseert dynamine op de plasmamembraan; Wigge et al., 1997), Eps15 (lokaliseert AP2 naar de
Literatuurstudie
23
plasmamembraan; Benmerah et al., 2000), epsine (lokaliseert Eps15 naar de plasmamembraan; Benmerah et al., 2000), AP180 (induceert de vorming van clathrine triskelions; Morris et al., 1993) en auxiline (begeleid Hsc70 naar de clathrine mantels; Ungewickell et al., 1997). De βketen bindt met clathrine (Clague, 1998; Benmerah et al., 1998). De rol van de σ2-subeenheid is minder duidelijk, maar deze zou er voor zorgen dat µ2-eenheid correct gepresenteerd wordt voor binding met de endocytosemotieven (Pearse et al., 2000). Naast AP2 zijn er ook de adaptorproteïnen AP1, AP3 en AP4 die allen homologen van elkaar zijn (Pearse et al., 2000). Terwijl AP2 een rol speelt bij vesikelvorming op de plasmamembraan, is AP1 betrokken bij clathrine gemedieerde vesikelvorming op het trans-Golgi-netwerk (TGN) (Obermüller et al., 2002; Pearse et al., 2000; Mellman 1996). AP3 speelt een rol in het transport tussen het Golgi-apparaat en de lysosomen en recent werd aangetoond dat AP3 ook een rol speelt bij de vorming van kleine synaptische vesikels vanaf endosomen (Pearse et al., 2000; Clague, 1998). Over de rol van AP4 is weinig gekend. Een andere groep proteïnen die clathrine verbinden met proteïnen aan het celoppervlak zijn arrestines, en komen vooral voor bij ‘G-protein coupled receptors’ (GPCR). Binding van βarrestines met GPCR koppelt de receptor los van het heterotrimere G-proteïne en lokaliseert de receptor naar een ‘clathrin coated vesicle’ (CCV). Bovendien speelt β-arrestine ook een rol in de signaaltransductie (Luttrell & Lefkowitz, 2002). 1.4.2.2.2 EPS15 Eps15 is een eiwit dat constitutief geassocieerd is met het AP2-complex en bestaat uit drie structurele domeinen (Benmerah et al., 1998). Een eerste domein, DI, wordt nog eens onderverdeeld in drie Eps15-homologie-domeinen (EH-domeinen) (Benmerah et al., 1999). DII is belangrijk voor oligomerisatie van Eps15 (Cupers et al., 1997) en DIII zorgt voor de binding met AP2 via α-adaptine (Benmerah et al., 1999). Bij mutantanalyse is gebleken dat de drie EHdomeinen essentieel zijn voor een correcte lokalisatie van Eps15 zelf, maar ook van clathrine, AP2 en dynamine op de plasmamembraan (Benmerah et al., 1999). Eps15 is dus essentieel tijdens het endocytoseproces. De drie EH-domeinen kunnen interakties aangaan met andere proteïnen die een asparagine-proline-fenylalanine (NPF) motief bevatten (Benmerah et al., 1998). Epsine is zo’n NPF-bevattend proteïne dat zich aan de cytosolische zijde van de plasmamembraan bevindt (Benmerah et al., 1999). De rol van epsine bestaat er in Eps15 aan de
Literatuurstudie
24
plasmamembraan te koppelen, terwijl Eps15 zelf er voor zorgt dat AP2 op de plasmamembraan wordt gelokaliseerd (Benmerah et al., 2000). 1.4.2.2.3 Manteleiwitten De manteleiwitten van de vesikels zorgen ervoor dat de donormembraan vervormt en dat er vesikels kunnen gevormd worden (Figuur 14, pag. 34). De drie best bekende manteleiwitten zijn coat-protein-I (COPI), COPII en clathrine. COPI mantels zijn vooral geassocieerd met het transport van het Golgi-apparaat naar het endoplasmatisch reticulum (ER) en andere stadia in het endosomale en Golgisysteem. COPII eiwitten zijn betrokken in het transport van het ER naar het Golgi-apparaat (Marsh et al., 1999).
Figuur 9. Structuur van een clathrine triskelion bestaande uit drie lichte en drie zware ketens. (Aangepast naar Lodish et al., 1999)
Clathrine-mantels zijn betrokken bij twee processen: de receptorgemedieerde endocytose vanaf de plasmamembraan naar de vroege endosomen en het transport van het TGN naar de endosomen (Marsh et al.,1999). De clathrine eiwitten die de mantels vormen bestaan uit drie takken en worden daarom triskelions genoemd (Figuur 9) (Lodish et al., 2001; Marsh et al., 1999). Elke tak bestaat uit een lichtere keten (22-28 kDa) en een zwaardere keten (192 kDa) (Lafer, 2002; Wakeham et al., 2000). Verschillende triskelions kunnen zich onderling rangschikken om een clathrine mantel of kooi te vormen rondom de geïnvagineerde vesikels (Figuur 10). Hiervoor zijn minstens zestig triskelions vereist. Het terminale deel van elke zware keten (Figuur 9), is naar de binnenkant van de kooi gericht (Figuur 10) en bindt daar met AP2. Bijgevolg bestaat een door clathrine omhuld vesikel, respectievelijk van buiten naar binnen, uit 3
Literatuurstudie
25
Figuur 10. Verschillende triskelions vormen een clathrine kooi. In deze figuur (resolutie 21Å) werden vijf triskelions gekleurd. Het terminale uiteinde van elk triskelion is naar binnen gericht en bindt met de AP2 complexen (zie pijltjes voor de gele triskelion). (aangepast naar Marsh et al., 1999)
verschillende lagen: de triskelion laag, de terminale domeinen, en AP2-laag (Figuur 10; Smith et al., 1998). De HUB-domeinen, bestaande uit het C-terminale deel van clathrine, kunnen trimeren vormen en binden de lichte ketens (Greene et al., 2000; Nathke et al., 1992).
1.4.2.2.4 Dynamine Nadat de clathrine kooi gevormd is wordt deze van de plasmamembraan afgesplitst met behulp van dynamine (Hill et al., 2001; Marks et al., 2001; Sever et al., 2000; Achiriloaie et al., 1999), een 100 kDa GTPase met een homotetramere structuur (Wakeham et al., 2000; Muhlberg et al., 1997) die zich in de hals bevindt tussen het nog niet afgesplitste vesikel en de plamamembraan (Hill et al., 2001; Figuur 11B). Er zijn twee soorten dynamines die goed beschreven zijn, dynamineI (DI) en dynamineII (DII) (Achiriloaie et al., 1999). DI is specifiek voor neuronen en het DII is betrokken bij receptor gemedieerde endocytose (Achiriloaie et al., 1999). De belangrijkste functie van dynamine is het afsnoeren van vesikels vanaf de plasmamembraan, (Hill et al., 2001; Sever et al., 2000) maar ook vanaf endosomen (Nicoziani et al., 2000). Anderzijds is dynamine ook onrechtstreeks betrokken bij de invaginatie van de plasmamembraan: endophiline, een eiwit dat de plasmamembraan concaaf maakt, bindt immers op dynamine (Sever et al., 2000). Figuur 12 geeft schematisch de verschillende domeinen van dynamine weer en hun rol in het endocytoseproces.
Literatuurstudie
26
Figuur 11. Model voor de vorming van clathrin coated vesicles. Na de binding van adaptor
proteinen
gaat
clathrine polymeriseren (A). Daarna gaat ook dynamine polymerisren
(B)
en
na
hydrolyse van GTP splitst het
vesikel
af
plasmamembraan
van
de (C)
(aangepast naar Lodish et al., 1999) .
Het N-terminale deel van dynamine bevat het GTPase domein en het C-terminale deel een proline-arginine rijk domein (PRD). (Figuur 12; Marks et al., 2001; Muhlberg et al., 1997). Daartussen liggen nog twee andere domeinen, namelijk het pleckstrin homologie domein (PH) en het GTPase effector domein (GED) (Marks et al., 2001). Het PH-domein bindt met PI(4,5)P2 bevattende lipiden (Archiriloaie et al., 1999) en het GED-domein zou betrokken zijn in oligomerisatie van dynamine en in de activatie van het GTPase-domein (Marks et al., 2001; Achiriloaie et al., 1999; Muhlberg et al., 1997). Het PRD domein bevordert de spontane opplooing van dynamine in ringen en spiralen en verscheidene proteinen zoals amphiphysine en endophiline binden op dit domein via hun SH3-domein. Amphiphysine is verondersteld betrokken te zijn bij de localisatie van dynamine op de plasmamembraan (Hill et al., 2001). De zelfopplooing van dynamine stimuleert meteen ook de GTPase activiteit. Deze GTPaseactiviteit, evenals de daarbij behorende conformatie verandering, is onontbeerlijk voor de werking van dynamine (Hill et al., 2001; Marks et al., 2001; Muhlberg et al., 1997). Omdat deze conformatie verandering zowel een verkorten als een verlenging van de spiralen kan inhouden (Sever et al., 2000) wordt er verondersteld dat dynamine een mechanische functie heeft (Hill et al., 2001; Marks et al., 2001). Ofwel zou door een verkorten van de spiralen, de hals waarmee de vesikels nog vasthangen aan de plasmamembraan, afgesnoerd worden, ofwel zou door een toenemende afstand tussen de spiralen de vesikels van de membraan weggeduwd en
Literatuurstudie
27
Spontane opplooing, binding met amphiphysine en endophiline Activatie
GTPase 1
300
PH GED PRD 510 633 746 864 Bindt met PI(4,5)P2 bevattende lipiden
Oligomerisatie
Figuur 12. Schematische voorstelling van de verschillende domeinen in dynamine, de doelwitten waarmee ze interageren en hun rol bij endocytose. Onder de domeinen staat het aminozuurnummer vermeld.
afgescheiden worden (Sever et al., 2000). Een ander mogelijkheid is dat dynamine enkel een regulator is die andere proteïnen recruteert, die op hun beurt verantwoordelijk zijn voor de afsplitsing van de vesikels (Hill et al., 2001). De precieze werking van dynamine is tot op heden nog altijd niet duidelijk. 1.4.2.2.5 HSC70 Na het vormen van een clathrin coated vesicle (CCV) wordt het vesikel afgesplitst van de celmembraan en worden de manteleiwitten terug verwijderd met behulp van Hsc70 (Figuur 14 B, pag. 34; Newmyer en Schmid, 2001). Hsc70 is een eiwit dat verwant is met de ‘heat shock’ proteïnen en werkt ATP-afhankelijk. Hsc70 is bovendien noodzakelijk om ook AP2 te verwijderen van CCV. Auxilin lokaliseert Hsc70 naar de CCV en stimuleert de ATPase activiteit van Hsc70. Het ontmantelingproces heeft een halfwaardetijd van één à twee minuten (Newmyer en Schmid, 2001).
Literatuurstudie
28
1.4.2.3 Klassieke endosoom – lysosoom pathway 1.4.2.3.1 De verschillende vesikels Over de manier waarop de ontmantelde vesikels omvormen tot vroege endosomen (early endosome; EE), lopen de meningen uiteen. Volgens een eerste model – het ‘endosome maturation model’ (EMM) - worden vroege endosomen de novo gevormd, waarschijnlijk door samensmelten van verschillende ontmantelde CCV (Figuur 14 C2). Volgens een tweede model – het ‘vesicular traffic’ model (VTM) - vormen de vroege endosomen een stabiele, reeds bestaande pool in de cel, die in dynamisch evenwicht wordt gehouden door een voortdurende opname en afgifte van eiwitten (Figuur 14 C1; Pillay et al., 2002; Clague, 1998; Thilo et al., 1995). Volgens Thilo et al. is het EMM het meest waarschijnlijk. De vroege endosomen zijn kleiner dan 100 nm en hebben een levensduur van ongeveer één minuut (Gu & Gruenberg, 1999). Vroege endosomen hebben een licht zure pH (pH 6,3- pH 6,8; Mellman, 1996) veroorzaakt door de aanwezigheid van V-type ATPasen op de membraan van de endosomen (Forgac, 2000). Daardoor wordt dissociatie van receptor en ligand mogelijk (Pillay et al., 2002; Luzio et al., 2000; Sheff et al., 1999). Door het scheiden van receptor en ligand, heeft een vroeg endosoom een sorterende functie en wordt daarom ook wel ‘sorting endosome’ genoemd (Pillay et al.,2002; Clague, 1998). De receptoren en andere membraanproteïnen accumuleren in de tubulaire extenties van de EE en de oplosbare componenten in de vesiculaire regio’s (Figuur 14 D; Mellman, 1996). De meerderheid van de receptoren wordt daarna gerecycleerd naar de membraan door middel van ‘recycling endosomes’ (RE), terwijl de minderheid van de receptoren naar het lysosomale compartiment worden meegevoerd (Figuur 14 E; Luzio et al., 2002; Gu & Gruenberg, 1999), waarop eventueel nog een ligand gebonden is (Pillay et al., 2002). RE ontstaan uit de tubulaire extenties van EE. Sommige RE fusioneren direct met de plasmamembraan (perifere RE), terwijl anderen (perinucleaire RE) eerst in het perinucleaire cytoplasma accumuleren waar ze een intracellulaire pool van receptoren vormen waarvan de functie onduidelijk is (Daro et al., 1996). De twee modellen van vesikel transport, namelijk het EMM en het VTM, stellen dat transport tussen vroege en late endosomen (‘late endosomes’, LE of ook wel pre-lysosomale compartimenten genoemd), gebeurt door vorming van een intermediair vesikel, ook wel ‘endosomal carrier vesicle’ genoemd (ECV; Piper & Luzio, 2001). Alleen over het ontstaan van
Literatuurstudie
29
dat vesikel lopen de meningen uiteen. Volgens het EMM is dat intermediair wat rest van een EE nadat verschillende componenten verwijderd zijn uit dat vroege endosoom (Figuur 14 F2), terwijl in het VTM dit ECV ontstaan door ‘budding’ vanaf een EE (Figuur 14 F1; Piper & Luzio, 2001). De pH van deze intermediaire vesikels zakt tot 5,5 à 5 (Pillay et al., 2002). LE onderscheiden zich van EE door hun zuurdere pH (± pH 5), hun meer sferische vorm en hun multivesikulair karakter. LE zijn ook groter zijn dan EE (± 0.5 µm) en hebben een veel langere levensduur (15-30 min). Het onderscheid met lysosomen is dat LE twee types mannose6-fosfaat receptoren (MPR) bevatten terwijl lysosomen er geen bevatten (Piper & Luzio, 2001; Mellman, 1996). LE bevatten reeds lysosomale hydrolasen en lijken zo het degradatieproces in gang te zetten (Mellman, 1996). De precursoren van de hydrolasen worden, gebonden op een MPR, naar de endosomen gebracht door een CCV, ontstaan op het TGN (Pillay et al., 2002; Gu & Gruenberg, 1999). In de lysosomen worden zij omgezet in hun actieve vorm (Pillay et al., 2002). Het EMM kan geen voldoende verklaring geven voor de biosynthese van lysosomen noch voor de aflevering van proteïnen vanuit LE naar de lysosomen (Luzio et al., 2000). Zowel in vitro als in vivo is bewezen dat zowel tussen LE onderling als tussen LE en lysosomen als tussen lysosomen onderling er uitwisseling kan gebeuren van membraanproteïnen en van de inhoud van de vesikels (Piper & Luzio, 2001; Luzio et al., 2000). Luzio et al. toonde aan dat transport tussen LE en lysosomen gebeurt door fusie van LE met lysosomen, met vorming van een hybride organel (Figuur 14 H; Luzio et al., 2000, Mellman 1996). De hybride organellen gaan vervolgens hun inhoud degraderen en zullen in dichtheid toenemen omdat verteerbaar materiaal verwerkt wordt, katabolische producten vrijgesteld en het niet-verteerbaarbaar materiaal geconcentreerd wordt (Figuur 14 I; Mellman, 1996). Op die manier worden opnieuw lysosomen gevormd door ‘rijping’ van de hybride organellen (Piper & Luzio, 2001; Luzio et al., 2000). De lysosomale pH bedraagt tussen de 4,5 en 5 (Pillay et al., 2002). Lysosomen mogen niet beschouwd worden als het eindpunt van de pathway, aangezien secretorische lysosomen kunnen fusioneren met de celmembraan wat resulteert in exocytose van de lysosomale inhoud (Pillay et al., 2002). De endolysosomale membranen bestaan hoofdzakelijk uit ‘lysosome-associated membrane proteins’ (LAMP), die de membraan beschermen tegen hydrolyse en er dus voor zorgen dat de hydrolasen niet lekken naar het cytoplasma (Obermüller et al., 2002; Pillay et al., 2002).
Literatuurstudie
30
1.4.2.3.2 De klassieke endosoom-lysosoom pathway wordt gecoördineerd door Rab-GTPasen. Rab proteïnen zijn kleine GTPasen die in alle eukaryoten voorkomen en vesikulair transport regelen in zowel endo- als exocytose. Rab proteïnen zitten door middel van een isoprenyl motief op de membraan van vesikels gebonden en kunnen zo het koppelen en verenigen van twee vesikels controleren (Seabra et al., 2002; Rodman et al., 2000; Pfeffer et al., 1995). Zoals andere GTPasen worden Rab-proteïnen verondersteld moleculaire schakelaars te zijn die wisselen Tabel 4. Overzicht van de endosomale Rab-proteinen.
Rab
Intracellulaire lokalisatie Functie
Referentie(s)
Rab4
EE en perifere RE
Receptor recycleren naar PM Daro et al.,1996
Rab5
CCV en EE
Internalisatie en EE fusies
Christoforidis
et
al.,1999;
Mclauchlan et al., 1998 Rab7
LE
Transport van EE naar LE
Mukhopadhyay et al., 1997
Rab9
LE
Transport van LE naar TGN
Riederer et al., 1994
Rab11
Golgi en RE
Exocytose vanaf golgi via Calhoun et al., 1998; Chen et endosomen
/
Apikale
en al.,1998
basolaterale recyclage van de receptor. Rab 15 EE en RE Rab17
Inhibitie van internalisatie
Epitheel specifiek; apikale Transport via apikale RE
Zuk & Elferink, 2000 Hunziker & Peters, 1998
RE Rab18
Epitheel specifiek; EE, Recyclage van E naar PM
Lütcke et al., 1994
RE, PM Rab20
Epitheel
specifiek; Onbekend
Apikale EE
Lütcke et al., 1994; Olkkonen & Stenmark, 1997
Rab22
E, PM
Onbekend
Olkkonen et al., 1993
Rab24
ER, Golgi, LE
Onbekend
Olkkonen et al., 1993
Rab25
Epitheel specifiek; apikale Transport via apikale RE
Casanova et al., 1999
RE Afkortingen: E: endosomen; EE: early endosome; RE: Recycling endosome; CCV: clathrin coated vesicle; LE: Late endosome; PM: plasmamembraan; ER: endoplasmatisch reticulum; TGN: TransGolgi netwerk
Literatuurstudie
31
tussen een actieve, GTP-gebonden, en inactieve, GDP gebonden vorm (Seabra et al., 2002; Pfeffer et al., 1995). In actieve vorm lokaliseren Rab een diverse groep van proteïnen, effectorproteïnen genoemd, op de cytoplasmatische zijde van de membraan. De evolutionair geconserveerde Rab komen praktisch in alle celtypes en weefsels tot expressie en regelen het fundamenteel transport. De minder geconserveerde families zijn meer betrokken bij gespecialiseerde pathways (Seabra et al., 2002). Momenteel zijn er al zo’n zestig verschillende Rab-proteïnen gekend, en elk Rab-proteïne blijkt specifiek geassocieerd te zijn met een specifiek organel of pathway. Van die zestig proteïnen zijn er echter maar een aantal in detail gekarakteriseerd (Seabra et al., 2002; Rodman et al., 2000). Er zijn ook aanwijzingen dat Rab genen alternatieve splicing kunnen ondergaan waardoor verschillende isovormen ontstaan (Seabra et al., 2002). Een overzicht van de verschillende Rab-proteïnen wordt gegeven in Tabel 4 en de endosomen waarmee de Rab proteïnen geassocieerd zijn worden in Figuur 14 voorgesteld. Transportvesikels dragen GTP-gebonden, actieve Rab met zich mee (Pfeffer et al., 1995). Rab proteïnen blijven tijdens het transport in deze actieve toestand door middel van een reeks proteïnen die interageren met de Rab (Schimmöller et al., 1998). Tijdens of na de fusie worden de Rab proteïnen terug omgezet in hun inactieve vorm (Figuur 13; Pfeffer et al., 1995), waarna de effector-proteïnen van de Rab dissociëren en de Rab zelf kunnen dan losgekoppeld worden van de membraan en gerecycleerd naar een donorcompartiment met behulp van Rab GDP dissociation inhibitor (RabGDI; Seabra et al., 2002). Het RabGDP-GDI complex wordt herkend door de donor membraan door een GDI displacement factor (GDF; Seabra et al., 2002). Rab5 is belangrijk bij de initiële stappen van endocytose, meer bepaald het afzonderen van liganden in CCVs en de daaropvolgende fusie van de vesikels met vroege endosomen (Christoforidis et al.,1999a; McLauchlan et al., 1998). Overexpressie van Rab22 geeft aanleiding tot de vorming van abnormaal grote endosomale structuren in de perinucleaire regio, een fenomeen analoog met overexpressie van Rab5. Deze abnormaal grote vesikels zouden het resultaat kunnen zijn van een hyperefficiënte fusie of clustering van vroege endosomen. De colokalisatie van Rab22 en late endosomen doet het vermoeden rijzen dat Rab22 gerelateerd is met transportvesikels die materiaal van vroege naar late endosomen overbrengen (Olkkonen et al., 1993). Rab15 is een buitenbeentje in de Rab-proteïnen omdat overexpressie van Rab15 geen aanleiding geeft tot een verhoogde opname van extracellulaire liganden. Rab15 maakt de
Literatuurstudie
32
Fusiecompartiment Rab GDP
GDI
Rab GDP GDI
GDI
Rab GTP
Rab GDP GDF Donorcompartiment
Figuur 13. Werking van GDI: Na fusie van de vesikels wordt Rab-GTP omgezet naar RabGDP. Vrij cytosolisch GDI maakt geprenyleerd Rab-GDP vrij uit de membraan. GDI lokaliseert geprenyleerd Rab-GDP naar een nieuwe donormembraan waar nieuwe transportvesikels zullen ontstaan. De Rab-GDP-GDI complexen worden herkend door een GDI displacement factor (GDF). Terwijl Rab-GDP zich associeert met de membraan wordt GDI terug vrijgesteld en gerecycleerd naar het cytoplasma. Rab-GDP wordt terug omgezet naar Rab-GTP door uitwisseling van nucleotiden door een membraangebonden Rab nucleotide uitwisselaar (GEF; niet op figuur weergegeven). (Aangepast naar Rodman et al., 2000 en Pfeffer et al., 1995)
werking van Rab5 ongedaan en inhibeert de initiële processen van internalisatie (Zuk & Elferink, 2000). De directe recyclage van receptoren naar de plasmamembraan is Rab4 afhankelijk, maar Rab4 is ook betrokken bij reclyclage via perinucleaire endosomen. Rab4 en Rab5 blijken dus de in- en efflux van vroege endosomen te regelen (Rodman et al.,2000). Overexpressie van Rab4 inhibeert de dissociatie van ijzer van de transferrine receptor. Waarschijnlijk gebeurt dit doordat
Literatuurstudie
33
geïnternaliseerde transferrine-receptoren foutief gelokaliseerd worden naar niet verzuurde vesikels. Rab4 is enkel terug te vinden in vroege endosomen en perifere RV, en niet in perinucleaire RV en kan bijgevolg gebruikt worden om onderscheid te maken tussen EE en perinucleaire RV (Daro et al., 1996). Een ander Rab-proteïne dat belangrijk is bij de recyclage van receptoren is Rab11. Rab11 werd teruggevonden op RE en het Golgi-apparaat (Chen et al., 1998) en zou een kritische factor zijn op het ogenblik dat de receptor de RE moet verlaten (Calhoun et al., 1998). Bovendien is gebleken dat Rab11 ook exocytotose het Golgi-apparaat via endosomen regelt (Rodman et al., 2000). Geïnternaliseerde moleculen kunnen op minstens twee manieren naar het golgi-apparaat getransporteerd worden. Een eerste mogelijkheid is transport van RE of EE naar het Golgiapparaat. Het daarmee geassocieerd Rab proteïne is echter nog onbekend (Ghosh et al.,1998; Mallard et al., 1998). Een tweede pathway naar het golgi-apparaat verloopt via LE en is geassocieerd met Rab9 (Riederer et al., 1994). Dominant negatieve mutanten van Rab7 hebben een sterk inhiberend effect op transport van vroege naar late endosomen, wat er op wijst dat Rab7 essentieel is voor dit transport (Mukhopadhyay et al., 1997). Een aantal epitheel specifieke Rab-proteïnen (Rab17, Rab18, Rab 20 en Rab 25) vergemakkelijken endocytotisch transport naar apikale en basolaterale plasmamembranen (Casanova et al., 1999; Hunziker & Peters, 1998; Lütcke et al., 1994). Over de functie van Rab18 en Rab20 is weinig geweten (Lütcke et al., 1994). Rab17 en Rab25 reguleren receptor gemedieerde transcytose1 en transport door apikale RE (Hunziker et al., 1998).
1
Transcytose is een pathway die de apikale en basolaterale endocytotische systemen verbindt.
Literatuurstudie
34
Receptor
Ligand Plasmamembraan CCV
Rab5
A Ontmanteld CCV
Rab4 Rab11 Rab15
RE
B Hsc70
Clathrine
Rab5 Rab4 Rab15
Naar perinucleaire regio C2 EE-Pool C1
E
D
LE
F1
EE
Rab9 Rab7 Rab24
Budding
Figuur 14. Overzicht van de verschillende endosomen en hun geassocieerde Rab proteïnen. (A) Na binding van de ligand
Gefusioneerd LE
G
op de receptor worden de receptoren geïnternaliseerd en wordt een clathrine mantel gevormd rond het groeiend vesikel. (B) Nadat een CCV gevormd is, wordt het vesikel terug ontmanteld met behulp van Hsc70. De clathrine triskelions worden gerecycleerd. (C1) Volgens het ‘vesicular traffic model’ smelt het ontmantelde CCV samen met een reeds
ECV F2 Eiwitten ,…
Lysosoom
bestaande pool van vroege endosomen en vormt zo een ‘early endosome’. (C2) Volgens het ‘endosome maturation model’ H
wordt een ‘early endosome’ de novo gevormd door samensmelten van verschillende ontmantelde CCV. Vervolgens scheiden receptor en ligand zich door de zure pH van het ‘early endosome’. (D) Daarna accumuleren de receptoren in de tubulaire extenties van het ‘early endosome’. (E) Deze receptoren verzamelen zich in een ‘recycling vesicle’, en worden gerecycleerd naar de plasmamembraan. (F1) Volgens het ‘vesicular traffic model’ onstaat dan door budding vanaf de rest van het ‘early endosome’ een ‘endosomal carrier vesicle’. (F2) In het ‘endosome maturation model’ gebeurt de vorming
Lysosoom / LE hybriede
van een ‘endosomal carrier’ door het verwijderen van een aantal componenten uit het ‘early endosome’. (G) Daarna
I
fusioneert het ‘endosomal carrier vesicle’ met een ‘late endosome’. (H) Na de fusie fusioneert dit vesikel nog eens met een een lysosoom. (I) Dit hybriede organel gaat zijn inhoud degraderen met behulp van de lysosomale hydrolasen en stelt de katabolische produkten vrij. Na deze degradatie kan het lysosoom opnieuw gebruikt worden in de endosomale pathway.
Katabolische produkten
Vesicular traffic model Endosome maturation model Gemeenschappelijke pathway
Naar plasmamembraan (exocytose)
Literatuurstudie
35
1.4.3 De verschillende manieren van virusopname 1.4.3.1 Inleiding Virussen zijn obligate intracellulaire parasieten en moeten bijgevolg in de cel penetreren, om replicatie en infectie te initiëren. In dierlijke cellen gebeurt dit volgens twee belangrijke wegen, namelijk door een fusie mechanisme op de plasmamembraan zelf, of door endocytose (Sieczkarski & Whittaker, 2002a). In het geval van endocytose is internalisatie alleen meestal niet voldoende, omdat inkomende virussen in endosomen eigenlijk nog deel uitmaken van het extracellulaire milieu. Daarom moeten geëndocyteerde virussen fusioneren met de endosomale membraan ofwel de membraan penetreren. De endocytotische pathway wordt meestal aangetroffen bij virussen die een specifieke locatie in de cel nodig hebben om te repliceren (Sieczkarski & Whittaker, 2002a). 1.4.3.2 Via clathrine Vele virusfamilies gebruiken de clathrine gemedieerde endocytose-pathway. De alphavirussen (vb. semliki forest virus), orthomyxovirussen (vb. influenza), rhabdovirussen (vb. vesicular stomatitis virus) en adenovirussen zonder enveloppe, hebben een lage pH nodig om hun genoom vrij te stellen in het cytoplasma (Marsh & Pelchen-Matthews, 2000). Virussen ondergaan door deze lage pH die terug te vinden in endosomen, een conformationele verandering die fusie of penetratie bevorderd (Sieczkarski & Whittaker, 2002a). Ook PRRSV heeft een lage pH nodig voor replicatie (Nauwynck et al., 1999). Maar ook virussen die geen lage pH nodig hebben, maken gebruik van de endosomen als een snel transportsysteem doorheen het dense cytoplasma (Sieczkarski & Whittaker, 2002a; Marsh & Pelchen-Matthews, 2000). Virussen die repliceren in de nucleus, kunnen door middel van endosomen in de nabijheid van de kern gebracht worden, zodat het virus snel in het nucleoplasma geraakt (Whittaker & Helenius, 1998). Toch hangen virussen niet alleen af van het endocytose mechanisme, daar ze soms ook intracellulair getransporteerd moeten worden of de geschikte plaats moeten vinden voor replicatie. Zo resulteert fusie van het semliki forest virus met de plasmamembraan onder lage extracellulaire pH wel in internalisatie maar niet noodzakelijk in replicatie (Marsh & Bron, 1997). Dergelijk intracellulair transport hangt af van de sorteringsfunctie van de endosomen na internalisatie en in sommige gevallen ook van directe interakties van het virus met het
Literatuurstudie
36
cytoskeleton (Sodeik, 2000). Clathrine gemedieerde endocytose werd onder andere al aangetoond voor het influenza virus (Krizanova et al., 1982), het polyoma JC virus (Pho et al., 2000) en het picorna virus parechovirus type 1 (Joki-Korpela et al., 2000). Ook het celtype speelt waarschijnlijk een rol bij de manier waarop een virus een cel binnendringt. Het epstein-Barr virus dringt B-cellen van het immuunsysteem binnen via clathrine gemedieerde endocytose, maar geen endotheelcellen (Miller & Hutt-Fletcher, 1992). Analoog infecteert het humane cytomegalovirus epitheliale cellen via endocytose, maar infecteert fibroblasten na fusie met de plasmamembraan (Bodaghi et al., 1999).
1.4.3.3 Via caveolae Het polyoma virus simian virus 40 (SV40), dringt de cel binnen via caveolae die bekend staan als centra voor de initiatie van signaaltransductie in de cel (Cereasa & Schmid, 2000; Pelkmans & Helenius, 2000). Het is dus mogelijk dat polyomavirussen door binding in caveolae hun opname en de daaropvolgende infectie bevorderen, door een signaalcascade in werking te stellen (Sieczkarski & Whittaker, 2002a). Endocytose via caveolae is onder andere ook al aangetoond voor het murine polyomavirus en het picornavirus echovirus type 1 (Marjomaki et al., 2002).
1.4.3.4 Via macropinocytose en fagocytose Bij macropinocytose worden, analoog als bij fagocytose, lamellipodia gevormd die dan omvormen tot irregulaire vesikels die macropinosomen genoemd worden. Het mechanisme is niet specifiek omdat het niet afhangt van een specifieke binding tussen receptor en ligand. De internalisatie gebeurt na celstimulatie. Het mechanisme van macropinocytose is dus analoog aan fagocytose dat voorkomt in gespecialiseerde cellen van het immuunsysteem zoals macrofagen, en neutrofielen (Sieczkarski & Whittaker, 2002a). Het feit dat macropinosomen kunnen verzuren, en dat ze kunnen interfereren met endocytotische vesikels, maakt dat deze route kan gebruikt worden door een gans arsenaal virussen (Hewlett et al., 1994). Het belang van macropinocytose ligt waarschijnlijk vooral in het presenteren van het virus aan het
Literatuurstudie
37
immuunsysteem omdat macropinocytose een belangrijke pathway vormt bij antigen presenterende cellen, zoals dendritische cellen (Sieczkarski & Whittaker, 2002a). De opname via macropinocytose is onder andere aangetoond voor HIV type 1 in macrofagen, voor de intracellulaire en mature vorm van het vaccinia virus en voor het epstein-barr virus (Sieczkarski & Whittaker, 2002a,b; Marechal et al., 2001).
1.4.3.5 Via een clathrine en caveolae onafhankelijk proces Hoewel deze pathway nog niet goed gekend is, zou ze toch betrokken zijn bij de opname van vele virussen zoals de picornavirussen (Madshus et al., 1987; Matlin et al., 1981). Ook het influenza virus maakt gebruik van deze pathway, hoewel dit virus cel ook kan binnentreden via clathrine gemedieerde endocytose (Sieczkarski et al., 2002b).
Doelstellingen
38
2
DOELSTELLINGEN
PRRSV repliceert zowel in vitro als in vivo in porciene alveolaire macrofagen (PAM), de natuurlijke gastheercel voor het virus. Op het laboratorium Virologie van de Faculteit Diergeneeskunde te Merelbeke werd in PAM een 210 kDa proteïne als mogelijke receptor voor PRRSV geïdentificeerd (Duan et al., 1998). Immers Mas 41D3 (monoklonale antistof), gericht tegen deze receptor, reduceert de binding van PRRSV in PAM en kan de infectie in PAM volledig blokkeren. Bovendien werd colokalisatie tussen PRRSV en sialoadhesine/Mas 41D3 aangetoond (Duan et al., 1998). Vanderheijden et al. (2003) hebben deze receptor geïdentificeerd als de porciene sialoadhesine en konden colokalisatie aantonen tussen sialoadhesine en clathrine. Zij konden ook aantonen dat na transfektie met het cDNA van sialoadhesine resistente cellen gevoelig werden voor opname van PRRSV. De hypothese is dan ook dat sialoadhesine via clathrine gemedieerde endocytose wordt opgenomen. Membraanreceptoren, zoals sialoadhesine, die opgenomen worden via clathrine gemedieerde endocytose hebben veelal de consensus sekwentie YxxΦ in hun cytoplasmatische staart (Mellman, 1996). AP2 bindt op deze consensus sekwentie (Boll et al., 2002; Conner et al., 2002; Bonifacino et al., 1999), en lokaliseert clathrine triskelions naar de celmembraan om dan een CCV te vormen (Clague, 1998; Benmerah et al., 1998). Een eerste doelstelling van deze scriptie is verder te onderzoeken of sialoadhesine via clathrine gemedieerde endocytose opgenomen wordt. Dit zal gebeuren met het monoklonale antilichaam 41D3, gericht tegen sialoadhesine. Endocytose zal geïnduceerd worden met dit antilichaam en door gebruik te maken van specifieke inhibitoren zal bepaald worden via welk mechanisme het Mas 41D3/sialoadhesine complex opgenomen word in PAM. Op het labo werd de coderende DNA sekwentie voor het 210 kDa eiwit in een plasmide gecloneerd. In een tweede deel van deze scriptie zullen cellijnen getransfecteerd worden met dit plasmide en zal gezocht worden naar een cellijn waar de opname van sialoadhesine gelijkaardig verloopt als in PAM. Op die manier willen we een cellijn zoeken waarin we de rol van verschillende karakteristieken van sialoadhesine in het endocytoseproces kunnen bestuderen.
Materiaal en Methoden
39
3
MATERIAAL EN METHODEN
3.1 Buffers, reagentia en stocks •
•
•
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; phosphate buffered solution) NaCl
8,138 g/l
Na2HPO4
0,94 g/l
NaH2PO4
0,46 g/l
pH
7,3
Fosfaat gebufferde zoutoplossing met Ca2+ en Mg2+ (PBS+) NaCl
8 g/l
Na2HPO4
1,15 g/l
KCl
0,2 g/l
KH2PO4
0,2 g/l
MgCl2
0,1 g/l
CaCl2
0,1 g/l
pH
7,3
TE-buffer 10mM Tris.Cl (pH 8,0) 1mM EDTA (pH 8,0; Vel) in UP
•
Versene stock: 53mM ethyleendiaminetetraacetaat (EDTA, Vel) in UP
•
Trypsine stock: 24.400 units trypsine /ml (Sigma)
•
Penicilline-streptomycine: 1g streptomycine en 106 units penicilline in 100ml UP.
•
Ornithine: 100 µg poly-D/L-ornithine hydrobromide/ml UP; Sigma)
•
Laminine: 3,45 µg/ml PBS (Sigma)
Materiaal en Methoden
3.2 Media 3.2.1 Medium voor HEK-T DMEM (dulbecco’s modified eagles medium, Gibco) +10% foetaal kalf serum (FKS) +streptomycine (1g/100ml UP; Certa) +10.000 units penicilline/ml (Continental pharma) +1mM pyruvaat (Gibco) +200mM glutamine (BDH biochemical)
3.2.2 Medium voor RK13, PK15 en SK MEM (minimum essential medium, Gibco) +5% foetaal kalf serum (FKS) +1% penicilline-streptomycine oplossing +1% kanamycine oplossing +1% glutamine oplossing
3.2.3 Medium voor 3D4 MEM/RPMI (50/50) +10% FKS +1% penicilline-streptomycine oplossing +1% kanamycine oplossing +1% glutamine oplossing +1% niet-essentiële aminozuren (Gibco)
3.2.4 Medium voor PAM MEM (minimum essential medium, Gibco) +10% FKS +1% penicilline-streptomycine oplossing +1% kanamycine oplossing
40
Materiaal en Methoden
+1% glutamine oplossing +1% niet-essentiële aminozuren (Gibco) +1% natriumpyruvaat oplossing (100mM oplossing, Gibco) +1% gentamycine oplossing (10mg/l, Gibco) +1% tylosine oplossing (0,1% oplossing in UP, bewaard bij –20°C)
3.2.5 LB (Luria Bertani)-medium 10 g bacto tryptone (Becton Dickinson) 5g bacto gist extract (Becton Dickinson) 10 g NaCl (Vel) Ultra puur water tot 1l
41
Materiaal en Methoden
42
3.3 Celculturen 3.3.1 HEK-T en 3D4 Cellen werden gewassen met PBS en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met 15ml PBS met daarin 530µM EDTA en 2440 units trypsine/ml. De celsuspensie werd overgebracht in FKS en gedurende 10 minuten afgecentrifugeerd aan 260xg. De pellet werd gesuspendeerd in 5ml medium en het aantal cellen geteld met een Bürker kamer. De cellen werden geplant aan een concentratie van 40.000 cellen/ml en bij 37°C geïncubeerd met 5% CO2. Na 3 dagen werden de cellen opnieuw gesplitst. De glazen inserts waarop de HEK-T cellen werden gegroeid werden vooraf gecoat met ornithine-laminine. In elke well van een 4 of 24 well plaat met glazen insert, werd 0,5ml ornithine oplossing (100µg poly-D/L-ornithine hydrobromide/ml UP, Sigma) toegevoegd. Na 4 uur incubatie bij kamertemperatuur werd de ornithine oplossing vervangen door 0,1ml laminine oplossing (3,45µg/ml PBS, Sigma) + 0,2ml PBS. Na twee uur incubatie bij kamertemperatuur worden de welletjes nog 2 maal gewassen met Dulbecco’s modified Eagles medium voordat de cellen geplant werden.
3.3.2 RK13, PK15 en SK De cellen werden gewassen met PBS en gedurende 10 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. De PBS werd verwijderd en de cellen werden gedurende 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur geïncubeerd met 530µM EDTA en 2440 units trypsine/ml. Daarna werd de celsuspensie aan opgevangen in FKS en 10 minuten gecentrifugeerd aan 200xg. De pellet werd vervolgens geresuspendeerd in medium en de cellen werden geplant aan een concentratie van 200.000 cellen/ml en geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2. Na drie dagen werden de cellen hervoed en na 1 week opnieuw gesplitst.
Materiaal en Methoden
43
3.3.3 Porciene alveolaire macrofagen (PAM) 3.3.3.1 Isoleren en bewaren van PAM De PAM werden bekomen door de longen van PRRSV vrije biggen te spoelen met PBS. De wasvloeistof van iedere big werd gedurende 10 minuten bij 260xg (4°C) gecentrifugeerd. De pellet werd gewassen met PBS en geresuspendeerd in RPMI (met 30% FKS, 1% penicillinestreptomycine) aan een concentratie van 80.106 cellen per ml. Cryotubes (Sarstedt) werden vervolgens gevuld met 0.5 ml van de verdunde suspensie waarna 0,5 ml RPMI-1640 (Life Technologies) (+30% FKS, 20% dimethylsuloxide, 1% penicillinestreptomycine) toegevoegd werd. De cryotubes werden gradueel ingevroren tot –150°C (PTLPD81, Othodyne) en dan bewaard in vloeibare stikstof (-196°C).
3.3.3.2 In cultuur brengen van de PAM De PAM werden uit de vloeibare stikstof gehaald, ontdooid in een warmwaterbad (37°C) en overgebracht in een centrifugeerbuis met 10 ml celcultuurmedium op 4°C. Vervolgens werden de cellen gecentrifugeerd, het supernatans verwijderd en de pellet geresuspendeerd in medium. De cellen werden geplant aan 106 cellen/ml zonder FKS. Na 1uur werd het medium afgezogen en vervangen door cultuurmedium met 10% FKS en de cellen werden teruggeplaatst in de CO2 incubator.
3.4 DNA opzuivering Sialoadhesine werd reeds gecloneerd op het labo Virologie te Merelbeke (Vanderheijden et al., 2003) in de pcDNA3.1D vektor (Invitrogen). Een bacteriecultuur werd opgestart in LB medium met 1% ampicilline als selektie merker (Figuur 15). Voor de opzuivering werd gebruik gemaakt van de midiprep kit van Qiagen en werden de instructies van de fabrikant opgevolgd. Het bekomen DNA werd opgelost in 100µl TE buffer en bewaard bij –20°C tot gebruik.
Materiaal en Methoden
44
Figuur 15. Schematische structuur van de pcDNA 3.1D / Sia vektor waarin sialoadhesine werd gekloneerd.
3.5 Transfectie 3.5.1 Transfectie van HEK-T, SK en RK13 De cellen werden 1 dag voor de transfectie geplant aan 50.000 cellen/well en 2 uur voor transfectie werden de cellen hervoed. De transfectie gebeurde volgens de calcium-fosfaat methode (Cellphect transfection kit, Amersham Biosciences) volgens de aanbevelingen van de producent. Wel werd de hoeveelheid DNA geoptimaliseerd (optimale concentratie was 3µg per well van een 4- of 24 well plaat).
3.5.2 Transfectie van PK15 en 3D4 De dag voor de transfectie werden de cellen geplant aan 350.000 cellen per ml op glas in siliconen flexiPERM micro 12 kamertjes (Viva Science). Twee uur voor de transfectie werd het medium vervangen door 60µl DMEM met daarin 200mM glutamine (37°C). In een eerste eppendorf met daarin 22,5µl DMEM en 0,7µg DNA werd 5,4µl Plus reagens (Invitrogen) toegevoegd. In een tweede eppendorf werd 1,8µl lipofectamine reagens (Invitrogen) gemengd met 22,5µl DMEM. De twee eppendorfjes werden vervolgens gemengd en gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Aan elk welletje werd vervolgens 18µl van de suspensie toegevoegd en werden de cellen verder geïncubeerd bij 37°C + 5% CO2. Na drie uur
Materiaal en Methoden
45
werd 75µl DMEM met daarin 200mM glutamineoplossing en 10% FKS toegevoegd aan de well. Na 24h incubatie bij 37°C en 5% CO2 werden de cellen gebruikt voor het experiment.
3.6 Opzuiveren van monoklonale antistoffen (Mas) 3.6.1 Opzuivering Een proteïne G kolom (Amerstam Biosciences, proteïne G sepharose fast flow 1ml) werd aangesloten op een peristaltische pomp (Pharmacia LKB Pump p-1; 1ml/min) en gewassen met 20ml fosfaatbuffer (Na2HPO4, 20mM, pH 7,0). Daarna werd 25ml hybridoma supernatans, waaraan reeds 4ml 200mM fosfaatbuffer (pH 7,0) werd toegevoegd om de optimale bindingscondities te bekomen, op de kolom aangebracht. De kolom werd nadien gewassen met 20mM fosfaatbuffer totdat de proteïne concentratie in het eluaat kleiner was dan 50µg/ml. De op de kolom gebonden antilichamen werden geëlueerd met 10ml glycine (0,1M, pH 2,7). Het eluaat werd in fracties van 500µl opgevangen in 100µl Tris (1M, pH 9,0), dit om de pH te neutraliseren. Tenslotte werd de concentratie Mas van elke fractie bepaald, en de fracties met de hoogste concentraties werden samengevoegd. De opgezuiverde monoklonalen werden uitverdeeld en bewaard bij –70°C tot gebruik. De proteïne concentratie werd gemeten met een spektrofotometer (Biorad SmartSpec 3000) bij een golflengte van 278nm. De ijklijn werd opgesteld door de absorbantie van verschillende concentraties immunoglobulines te meten.
3.6.2 Analyse van de opgezuiverde Mas met SDS-PAGE Om na te gaan of de opzuiverde Mas vrij zijn van ongewenste proteïnen, werden de Mas geanalyseerd met SDS-PAGE en Western blotting. Op verschillende momenten in het opzuiveringsproces werden staaltjes genomen en gescheiden op een 10% polyacrylamide gel. De samenstelling van de stacking en running gel wordt weergegeven in Tabel 5.
Materiaal en Methoden
46
Tabel 5. Samenstelling van stacking en running gel voor de SDS-PAGE.
Component
4% Stacking 10% Running gel (ml)
30% acrylamide/bisacrylamide mix (37,5/1;
gel (ml)
0,66
1,67
-
1,25
1,25
-
3
2,165
SDS (10% in ultra puur water; Biorad)
0,05
0,05
Amoniumpersulfaat (10% in UP)
0,025
0,025
Tmed
0,01
0,01
5
5
(Biorad)) 1,5M Tris-Cl (pH 8,8) 0,5 Tris-Cl (pH 6,8) UP
(N,N,N’,N’-tetramethyleendiamine;
Serva) Totaal volume (ml)
De gel werd gemaakt en in een tank met SDS-PAGE buffer geplaatst (0,3% Tris pH 8,3, 1,44% glycine en 0,1% SDS in ultrapuur water). Aan de staaltjes werd een gelijke hoeveelheid ladingsbuffer (0,125 M Tris-HCl pH 6,8; 4% SDS; 20% glycerol; 10% β-mercaptoethanol) toegevoegd, waarna deze gedurende 5 minuten opgekookt werden. Aan welke well werd 15µl toegevoegd. De gel werd nadien gekleurd met Coomassie blauw (1,25‰ Coommassie blauw R250, 50% MeOH, 10% azijnzuur in ultrapuur water). De eiwitbandjes werden dan gevisualiseerd door de blot te ontkleuren met 50% MeOH en 10% azijnzuur in UP.
Materiaal en Methoden
47
3.7 Endocytose assays 3.7.1 Microscopische analyse 3.7.1.1 Bij PAM
Eén dag voor het experiment werden de cellen in een 4 of 24-well plaat geplant aan een concentratie van 1.106 cellen/ml. De cellen werden bij 4°C geplaatst en het medium vervangen door 350 µl RPMI (+2% FKS; 4°C), waaraan 5µg Mas 41D3 of Mas 13D12 per well toegevoegd werd. Na 1 uur incubatie bij 4°C werden de cellen twee maal gewassen met RPMI (+2% FKS). Daarna werd RPMI (+2% FKS) van 37°C op de cellen gebracht en deze werden dan bij 37°C gezet om het endocytoseproces te laten doorgaan. Na 15, 30, 60, 90 of 120 minuten worden de cellen 1 maal gewassen met PBS+ en gefixeerd met paraformaldehyde (3% in PBS+). Als controle (tijdstip nul) werden de cellen eerst tien minuten gefixeerd met paraformaldehyde (3% in PBS+) voor toediening van Mab 41D3 of 13D12. Om de natuurlijke distributie van sialoadhesine in de membraan te kunnen bekijken werden PAM gefixeerd met paraformaldehyde (3% in PBS+) net voor de toediening van Mas 41D3.
3.7.1.2 Bij HEK-T, PK15, RK13 en SK Voor de HEK-T, PK15, RK13 en SK cellen werd een analoog protocol gevolgd als bij de PAM, met dezelfde controles. Na incubatie met Mas 41D3, werden de cellen echter nog 2 maal gewassen met RPMI (+2% FKS) en dan 1 uur bij 4°C geïncubeerd met 300µl FITC gemerkt geit-anti-muis antlichaam (GαM-FITC; 8 µg/ml in PBS+; Molecular probes) per well. Pas dan werden de cellen bij 37°C geplaatst om het endocytoseproces te laten doorgaan. 3.7.1.3 Gebruik van inhibitoren 3.7.1.3.1 Genisteïne, tyrphostine1, tyrphostine25 en sucrose (Sigma) Eén uur voor het eigenlijk endocytose experiment werd het medium vervangen door RPMI + 2% FKS met de gewenste concentratie inhibitor en werden de cellen verder bij 37°C
Materiaal en Methoden
48
geïncubeerd. Bij alle verdere stappen in het endocytose proces werd steeds de inhibitor in de gepaste concentratie toegevoegd. 3.7.1.3.2 Amantadine De cellen werden eerst 1h bij 37°C geïncubeerd in RPMI + 2% FKS met amantadine (Sigma). Daarna werd Mas 41D3 of 13D12 toegevoegd samen met de inhibitor (37°C). De PAM werden dan op verschillende tijdstippen gefixeerd. PK15 en 3D4 cellen werden echter, 15 minuten na toevoeging van Mas 41D3 of Mas 13D12 gewassen, waarna GαM-FITC werd toegevoegd samen met de inhibitor en dan op verschillende tijdstippen gefixeerd met paraformaldehyde.
3.7.1.4
Kleuringen
De cellen werden gedurende 2 minuten gepermeabiliseerd met 0,1% Triton-X-100 (toctylphenoxypolyethoxyethanol, Sigma) in PBS+. Van alle cellen, waarin endocytose niet werd geïnduceerd met behulp van GαM-FITC, werd de sialoadhesine receptor met daarop Mab 41D3 gekleurd met GαM-FITC (8µg/ml in PBS+) door de cellen 1 uur bij 37°C te laten incuberen. Corticale actine werd vervolgens gekleurd met phalloïdine Texas Red (2 units/ml in PBS+; Molecular probes), gedurende 1 uur bij 37°C en de kern door de cellen 10 minuten te incuberen met Hoechst-33342 (10 µg/ml). De glazen inserts met daarop de cellen werden vervolgens op een draagglaasje gemonteerd met glycerine-DABCO en geanalyseerd met een confocale microscoop. De cellen die gecultiveerd werden in een flexiperm celcultuurkamertje werden gemonteerd door het kamertje te verwijderen van het draagglaasje waarop dan een dekglaasje gemonteerd werd met behulp van glycerine-DABCO. Voor de confocale analyse werd gebruik gemaakt van een Leica TCS-SP2. FITC (excitatiegolflengte: 494nm) werd geëxciteerd met een Ar-laser bij een golflengte van 488 nm. Voor de drievoudige kleuringen (Tx-red, FITC en Hoechst) werd gebruik gemaakt van een Biorad MRC-1024. FITC en Tx-red werden geëxciteerd met een Kr/Ar-laser bij respectievelijk 488 en 568 nm. Hoechst (excitatiegolflengte: 350nm) werd geëxciteerd bij 351 nm met een AIlaser.
Materiaal en Methoden
49
3.7.1.5 Assay voor spontane endocytose Voor de endocytose werd het zelfde protocol gevolgd beschreven onder 3.7.1.1. PAM werden bij 4°C geïncubeerd met Mas 13D12 of Mas 41D3. Na de shift naar 37°C om endocytose toe te laten en fixatie werden de cellen gepermeabiliseerd met triton-X-100. De PAM werden dan voor 1h bij 37°C geplaatst met Mas 41D3, nadien gewassen en gekleurd met GαM-FITC.
3.7.2 Flowcytometrische analyse bij PAM Eén dag voor het experiment werden de cellen geplant in een 4 of 24 well plaat aan een concentratie van 1.106 cellen/ml. De cellen werden eerst 1 uur bij 4°C geïncubeerd met Mas 41D3. Daarna werden de cellen overgebracht naar 37°C om het endocytoseproces te laten doorgaan. Op verschillende tijdstippen werd het medium vervangen door ijskoude PBS met 2% versene om de cellen los te maken. De celsuspensie werd vervolgens 15 minuten afgecentrifugeerd aan 520xg. De plasmembraan werd gekleurd door de pellet in 0,2 ml ijskoude GαM-FITC verdunning (20µg/ml in PBS) + 10% geitenserum te resuspenderen. Na 90 minuten werden de cellen gewassen en in PBS terug in suspensie gebracht. Als controles werden de cellen geïncubeerd met Mas 13D12 in plaats van Mas 41D3 of alleen met GαM-FITC. Om te controleren of de totale fluorescentie intensiteit onveranderd blijft tijdens het endocytoseproces werden PAM ook intern gekleurd. Na losmaken van de cellen en centrifugeren, werden de cellen gefixeerd in 350µl paraformaldehyde (1% in PBS). De celsuspensie werd afgecentrifugeerd waarna de cellen gepermeabiliseerd werden in 0,1% TritonX-100 (in PBS) gedurende 1 minuut. Na centrifugatie werden de cellen gewassen met PBS + 20% FKS en gersuspendeerd in GαM-FITC (20µg /ml in RPMI). Na 1 uur incubatie bij kamertemperatuur werde,n de cellen gewassen met PBS +20% FKS en geresuspendeerd in PBS. Voor de flowcytometrische analyse werd gebruik gemaakt van een Becton-Dickinson FACScalibur, voorzien van een 15 mW luchtgekoelde ion laser. De flowcytometer was gekoppeld aan een Macintosh computer (Apple Computer, Inc.). Metingen werden uitgevoerd met behulp van de BD Cellquest software.
Materiaal en Methoden
50
3.8 Statistische verwerking Voor de statistische verwerking werd gebruik gemaakt van het SPSS 10.0.1 software pakket. Voor de vergelijking van twee gemiddelden werd een t-toets uitgevoerd (‘independent sample ttest’). Om na te gaan of de varianties in beide populaties gelijk was werd de Levene’s test uitgevoerd op het p=0,05 significantie niveau. Indien de varianties niet gelijk waren werd de ttoets gebruikt waarin gelijkheid van variantie niet wordt aangenomen.
Resultaten
51
4
RESULTATEN
4.1 Sialoadhesine gemedieerde endocytose in porciene alveolaire macrofagen met behulp van Mas 41D3 4.1.1 Opzuiveren van Mas 41D3 Om endocytose van sialoadhesine te induceren werd gebruik gemaakt van Mas 41D3 gericht tegen sialoadhesine. Mas 41D3 werd aangemaakt op het Labo Virologie te Merelbeke in een hybridoma cellijn. Het supernatans van deze hybridoma’s bevat naast Mas 41D3 ook een grote hoeveelheid andere eiwitten. Om er zeker van te zijn dat de opgezuiverde Mas geen andere eiwitten meer bevat die eventueel endocyose zouden kunnen induceren werd de zuiverheid gecontroleerd met behulp van SDS-PAGE. Na blotten van de gel werden de eiwitten gekleurd met commassie blauw.
1 2
3
4
Zware keten
Lichte keten Figuur 16. Controle van de zuiverheid van opgezuiverde Mas 41D3 met behulp van SDSPAGE. Het hybridoma supernatans (laantje 1) bevat naast de zware keten van Mas 41D3 ook andere proteïnen. Na aanbrengen het supernatans op de kolom wordt alle Mas 41D3 op de kolom gebonden daar het eluaat geen Mas 41D3 meer bevat (laantje 2). Na wassen van de kolom worden geen proteïnen meer aangetroffen in het eluaat (laantje 3). Na elutie van Mas 41D3 zijn in het eluaat duidelijk de lichte en zware keten van Mas 41D3 te zien (laantje 4).
Resultaten
52
Op verschillende tijdstippen tijdens het opzuiveringsproces werden staatltjes genomen. Aan de staaltjes werd β-mercapto-ethanol toegevoegd dat zwavel bruggen breekt. Zo wordt de zware keten en de lichte keten van de Mas gescheiden. Het hybridoma supernatans (Figuur 16, laantje 1) bevat naast de zware keten van de Mas nog een grote hoeveelheid andere proteïnen. De kleine keten is nog niet te zien omdat de Mas nog in een te lage concentratie aanwezig is. Mas 41D3 werd gebonden op een proteïne G-sepharose kolom. Na aanbrengen van het hybridoma supernatans is in het eluaat de zware keten niet meer te zien op gel (laantje 2), wat er op wijst dat Mas 41D3 op de kolom werd gebonden. Na wassen van de kolom is het eluaat vrij van alle proteïnen (laantje 3) en na elutie van de op kolom gebonden Mas 41D3 is in het eluaat duidelijk de zware en de lichte keten te zien en kunnen geen andere eiwitten meer gedetecteerd worden (laantje 4). Voor de opzuivering van Mas 13D12 werd hetzelfde protocol gevolgd en werd hetzelfde resultaat bekomen.
4.1.2 Kinetiek van sialoadhesine endocytose in PAM Het endocytoseproces werd bestudeerd met behulp van Mas 41D3, gericht tegen de sialoadhesine receptor (Duan et al., 1998). PAM werden 1 uur bij 4°C geïncubeerd met opgezuiverde Mas 41D3. Bij deze temperatuur kunnen PAM overleven maar is geen endocytose mogelijk, waardoor enkel de membraan van de PAM gekleurd wordt. Daarna werden de cellen gewassen om niet gebonden Mas te verwijderen, vervolgens bij 37°C geplaatst om het endocytoseproces te laten doorgaan en op verschillende tijdstippen gefixeerd met paraformaldehyde. Na fixatie werden de PAM gepermeabiliseerd met Triton-X-100 en werd Mas 41D3 immunofluorescent gekleurd met behulp van een FITC gemerkt polyklonaal antilichaam, gericht tegen muisantistoffen (goat-anti-mouse-fluoroisothiocyanaat, GαM-FITC). Als controle voor internalisatie werden de cellen gefixeerd op tijdstip nul (voor de shift naar 37°C), gepermeabiliseerd en gekleurd. Om de distributie van sialoadhesine op de membraan te kunnen bekijken zonder de invloed van Mas 41D3, werden de PAM gefixeerd vÓÓr toevoeging van Mas 41D3. Als controle voor aspecifieke binding werd Mas 13D12 toegediend in plaats van Mas 41D3. Mas 13D12 is van hetzelfde isotype als Mas 41D3 (IgG1) en is gericht tegen glycoproteïne D van het suid herpesvirus type I (Nauwynck et al., 1995).
Resultaten
53
Figuur 17. Puntige distributie van sialoadhesine in de membraan van PAM na kleuring met Mas 41D3 en GαM-FITC (bij 4°C). De foto geeft een confocaal beeld weer van één enkele z-sektie genomen ter hoogte van de apikale celmembraan. (Schaal=5 µm)
Na kleuring met Mas 41D3 en GαM-FITC werd een puntige distrubutie van sialoadhesine waargenomen op de membraan (Figuur 17). Op tijdstip nul was enkel de membraan gekleurd en met Mas 13D12 werd noch een membraankleuring, noch een interne kleuring gedetecteerd. Het endocytoseproces werd kwantitatief geananalyseerd met behulp van confocale microscopie. Telkens werden willekeurig 25 cellen geselekteerd voor analyse. Het aantal vesikels per cel werd bepaald door van elke cel z-sekties op te nemen op 1 µm van elkaar en het aantal vesikels in de sekties per cel te tellen. Enkel cellen die meer dan 3 intracellulaire vesikels hadden werden beschouwd als cellen met endocytose. Omdat verschillende batches PAM werden gebruikt en aangezien daardoor variatie optrad in het aantal opgenomen vesikels, werd het aantal cellen met endocytose relatief uitgezet ten opzichte van het maximum op 90 minuten. De resultaten van het internalisatieproces worden weergegeven in Figuur 18 als een gemiddelde van 3 onafhankelijke experimenten. Met behulp van confocale microscopie kon vastgesteld worden dat na 15 minuten incubatie bij 37°C sialoadhesine reeds opgenomen is in de cel. Het aantal vesikels per cel bleef stijgen tot een maximum werd bereikt op 90 minuten (gemiddeld 11 vesikels). Daarna daalde het aantal vesikels terug. Als extra controle voor internalisatie werd in PAM een drievoudige kleuring uitgevoerd (Figuur 19). De membraan werd gekleurd met phalloïdine-Tx-red, dat het corticale actine net onder plasmamembraan kleurt (Figuur 19A). De vesikels (Figuur 19B) zitten duidelijk onder de membraan en zitten dus in het cytoplasma van de cel (Figuur 19E). De kern werd gekleurd met Hoechst (Figuur 19C).
Resultaten
54
120
Relatief aantal cellen met endocyt
100
80
60
40
20
0 0
20
40
60
80
100
120
Incubatieduur bij37°C (m inuten)
0 min
15 min
30 min
60 min
90 min
120 min
Figuur 18. Kinetiek van door Mas 41D3 geïnduceerde endocytose in PAM. In de grafiek wordt per tijdstip het relatief aantal cellen weergegeven die meer dan 3 vesikels hebben opgenomen. De foto’s onder de grafiek zijn confocale beelden van één z-sektie in PAM en geven telkens een typisch overzichtsbeeld op de verschillende tijdstippen. De vesikels zijn aangeduid met pijltjes. (Schaal= 5 µm)
Resultaten
55
Figuur 19. Visuele controle van internalisatie in PAM. De figuren zijn confocale beelden van 1 z-sektie in het midden van de cel. Corticale actine (A) werd gekleurd met phalloïdine-Tx-Red. Sialoadhesine werd gekleurd met Mas 41D3 en GαM-FITC (B). De kern werd gekleurd met Hoechst (C). Figuur D is een superpositie van A, B en C. (Schaal=5 µm)
Resultaten
56
Als controle voor spontane endocytose werden PAM bij 4°C geïncubeerd met Mas 41D3 of Mas 13D12, dat niet met sialoadhesine bindt en dus normaal geen endocytose kan induceren. Na 60 minuten incubatie bij 37°C en fixatie, werden de PAM gepermeabiliseerd. Als spontane endocytose optreedt bij induktie met Mas 13D12 dan zouden deze cellen intracellulaire vesikels moeten bezitten met sialoadhesine, welke na permeabilisatie gekleurd worden met Mas 41D3 en GαM-FITC. Na confocale analyse werden bij PAM geïnduceerd met Mas 13D12 geen vesikels gedetecteerd, terwijl dat wel het geval was bij PAM geinduceerd met Mas 41D3. Als controle werden PAM gefixeerd op tijdstip nul (Figuur 20). 0min
0min
60min
60min
13D12
41D3
13D12
41D3
Figuur 20. Controle voor spontane endocytose in PAM. Op de figuren is telkens het tijdstip van fixatie gegeven en de Mas waarmee endocytose werd geïnduceerd. Op 60 minuten is enkel endocytose waarneembaar bij PAM geïnduceerd met Mas 41D3 en niet met Mas 41D3. Op nul minuten is zowel met Mas 13D12 als Mas 41D3 geen endocytose detecteerbaar. De foto’s zijn confocale beelden van één z-sektie genomen ter hoogte van het midden van elke cel. (Schaal=5 µm)
De internalisatie van sialoadhesine werd ook bevestigd met behulp van flowcytometrische analyse. PAM werden gedurende 1 uur bij 4°C geïncubeerd met Mas 41D3 en vervolgens gedurende 1 uur bij 37°C om endocytose te laten doorgaan, en dan losgemaakt met PBS (+ 25 mM EDTA). Als controle voor het tijdstip nul werden de cellen losgemaakt net voor de shift naar 37°C. Daarna werden alle cellen in suspensie gekleurd met GαM-FITC. PAM werden niet gepermeabiliseerd voor de kleuring waardoor enkel sialoadhesine moleculen in de celmembraan gekleurd werden en niet de geïnternaliseerde vesikels. Indien endocytose optreedt, wordt een deel van de sialoadhesine receptoren in de membraan geïnternaliseerd in het cytoplasma, waardoor de fluorescentie intensiteit van de membraan vermindert. Om het endocytoseproces kwantitatief te benaderen werd de fluorescentie intensiteit van de membraan gemeten, op nul (Figuur 21B) en 60 minuten (Figuur 21C) na de shift naar
Resultaten
57
37°C. Na flowcytometrische analyse analyse bleek dat 60 minuten na de shift naar 37°C, 28% minder fluorescentie intensiteit werd vastgesteld t.o.v de controle op nul minuten. Als controle werden PAM geïncubeerd met Mas 13D12 in plaats van Mas 41D3. Bij deze controle werd een veel lagere fluorescentie intensiteit vastgesteld (2% van de fluorescentie intensiteit van de controle op nul minuten; Figuur 21A). Om te bepalen of de totale fluorescentie intensiteit (membraan + interne vesikels) tijdens het endocytoseproces constant blijft werden PAM na 60 minuten incubatie bij 37°C gepermeabiliseerd en zowel intern als extern gekleurd met GαMFITC (Figuur 21D) en werd de mediaan vergeleken met de mediaan op nul minuten (Figuur 21B). Van beide gevallen was de mediaan analoog.
Relatief aantal cellen
D C A
Mediaan: A: 1,84
B
B: 71,05 C: 50,94 D: 74,32
Relatieve fluorescentie intensiteit A: Endocytose na 0 minuten met Mas 13D13 (externe kleuring) B: Endocytose na 0 minuten met Mas 41D3 (externe kleuring) C: Endocytose na 60 minuten met Mas 41D3 (externe kleuring) D: Endocytose na 60 minuten met Mas 41D3 (interne +externe kleuring)
Figuur 21. Flowcytometrische analyse van endocytose in PAM. Endocytose in PAM werd geïnduceerd met Mas 41D3 of Mas 13D12. PAM werden op nul en zestig minuten extern gekleurd met GαM-FITC en geanalyseerd. Na induktie met Mas 13D12 (A) lag de mediaan van fluorescentie intensiteit beduidend lager dan na stimulatie met Mas 41D3 (C). Na 60 minuten incubatie bij 37°C met Mas 41D3 (C) bedroeg de mediaan slechts 72% van de controle op nul minuten (B). De totale fluorescentie intensiteit van de ganse cel wijzigde tijdens het endocytoseproces bijna niet, daar de mediaan voor de interne+externe (D) kleuring op 60 minuten (membraan +cytoplasma en endosomen) niet veel verschilde van de externe kleuring (B) op nul minuten (enkel membraan).
Resultaten
58
4.1.3 Karakterisatie van het internalisatieproces in PAM Op het Labo Virologie te Merelbeke werd aangetoond dat PRRSV via een clathrine gemedieerd proces PAM infecteert. Omdat sialoadhesine betrokken is bij opname van PRRSV, wordt verondersteld dat sialoadhesine via een clathrine gemedieerd proces opgenomen wordt in PAM. Er werd ook reeds met behulp van confocale microscopie colokalisatie tussen sialoadhesine en clathrine vastgesteld (Vanderheijden et al., 2003). Deze hypothese werd nagegaan door gebruik te maken van inhibitoren die clathrine gemedieerde endocytose verhinderen. Amantadine stabiliseert CCV en verhindert zo hun ontmanteling. Bijgevolg komt de receptor niet in de klassieke endosoom-lysosoom pathway terecht (Phonphok Y.& Rosenthal K.S., 1991). Sucrose kan ook gebruikt worden als specifieke inhibitor voor clathrine gemedieerde endocytose. Een hypertonische oplossing van sucrose geeft aanleiding tot vorming van kleine ledige CCV, en maakt zo clathrine minder beschikbaar voor de vorming van normale vesikels (Heuser & Anderson, 1989). PAM werden voor het eigenlijke experiment 1 uur bij 37°C geïncubeerd met de inhibitor. Daarna werden de PAM 1 uur bij 4°C geïncubeerd met Mas 41D3 en sucrose of amantadine, waarna de cellen bij 37°C werden geplaatst en gefixeerd na 60 minuten. Omdat amantadine geen effect heeft na incubatie bij 4°C (data niet gegeven), werd deze 4°C stap in de amantadine assay weggelaten. In plaats daarvan werden de cellen na het 1e uur incubatie bij 37°, een uur met Mas 41D3 en amantadine geïncubeerd bij 37°C waarna de cellen gefixeerd werden. Het aantal vesikels per cel bij de blanco (0 µM amantadine) was niet significant verschillend van PAM die bij 4°C geïncubeerd werden. Bij zowel sucrose als amantadine werd een vermindering van internalisatie vastgesteld. De dosis afhankelijke respons wordt in Figuur 22 weergegeven. Telkens werd het aantal vesikels per cel relatief uitgezet ten opzichte van de blanco (0µM inhibitor). Zowel amantadine als sucrose hadden een dosis afhankelijk effect. Incubatie van PAM met 500 µM amantadine gaf aanleiding tot 55 % reductie van internalisatie (significant op het p=0,01 niveau). Sucrose kon de internalisatie met 94% reduceren bij een concentratie van 450 µM (significant op het p=0,01 niveau). Opvallend was ook dat niet alleen het aantal vesikels werd beïnvloed door de inhibitoren, maar ook de distributie ervan in de cel. Bij hogere concentraties van de inhibitoren werden de vesikels vooral tegen de celmembraan aangetroffen.
Resultaten
59
Relatief aantal vesikels per
A.
120
100
* 80
60
** **
40
20
0 0
125
250
500
C oncentratie A m antadine (µM )
0 µM
Relatief aantal vesikels per
125 µM
B.
500 µM
120
100
80
* 60
40
20
** 0 0
150
450
C oncentratie sucrose (µM )
0 µM
150 µM
450 µM
Figuur 22. Inhibitie van clathrine gemedieerde endocytose in PAM door incubatie met amantadine (A) en sucrose (B). De dosis afhankelijke respons wordt telkens weergegeven in de grafiek. Waarden die significant verschillen van de blanco (0µM inhibitor) werden aangeduid met 1 (p=0,05) of 2 (p=0,01) sterretjes. De foto’s onder elke grafiek zijn confocale beelden van 1 z-zektie genomen door het midden van de cel en geven een typisch beeld bij de aangeduide concentratie. De vesikels werden aangeduid met een pijltje. (Schaal = 5µm)
Resultaten
60
COOH CN +H
3N
C
H
CN
CH3O
CH 2
Tyrphostine 1
CN
HO
CN
HO
OH HO
Tyrphostine 25
Tyrosine
Figuur 23. Chemische structuur van tyrosine en de tyrosine zijketen analogen tyrphostine 1 en 25.
Om te bepalen of tyrosine fosforylatie belangrijk is bij de internalisatie van sialoadhesine werden twee tyrosine fosforylatie inhibitoren uitgetest, typhostine 25 en genisteïne. Tyrphostines zijn chemische analogen van de tyrosine zijketen (Figuur 23) en werden oorspronkelijk gebruikt als substraatcompetitieve inhibitoren van tyrosine kinases die een YxxΦ sekwentie fosforyleren. Omdat deze sekwentie ook herkend wordt door µ2 adaptine van AP2 werd vermoed dat µ2 en bepaalde tyrosine kinasen een zelfde bindingsplaats bezitten voor YxxΦ. Daarom kunnen tyrphostines ook de binding van µ2 adaptine op het YxxΦ motief verhinderen door competitie voor het zelfde substraat. Crump et al. (1998) konden aantonen dat tyrphostine 25 de interaktie tussen µ2 adaptine en het YxxΦ motief van TGN38 gedeeltelijk kan inhiberen en dat de werking van tyrphostine 25 voornamelijk te wijten is aan de inhibitie van tyrosine kinasen. Ook genisteïne inhibeert tyrosine-specifieke proteïne kinasen (Akiyama et al., 1987). In deze assay werd gebruik gemaakt van tyrphostine 25 en als negatieve controle werd tyrphostine 1 gebruikt, een inactieve vorm. Opnieuw werd een dosisafhankelijke respons waargenomen bij zowel tyrphostine 25 en genisteïne. Tyrphostine 25 verminderde significant (p=0,01) de internalisatie met 69% bij een concentratie van 250 µM (Figuur 24A). Het aantal vesikels per cel na incubatie met tyrphostine 1 was voor alle concentraties behalve 0 µM, significant (p=0,01) hoger dan aantal vesikels na incubatie met tyrphostine 25. Genisteïne reduceerde de internalisatie significant (p=0,01) met 89% bij een concentratie van 100 µM (Figuur 24B).
Resultaten
61
Relatief aantal vesikels per
120
100
* **
80
**
Tyrphostine1 Tyrphostine25
60
** **
**
40
20
0 0
50
100
150
200
250
C oncentratie Tyrphostine (µm )
100 µM
0 µM
250 µM
Relatief aantal vesikels pe
120
100
80
60
**
40
** **
20
0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
C oncentratie genisteïne (µM )
0µM
150µM
450µM
Figuur 24. Inhibitie van endocytose in PAM door incubatie met tyrphostine (A) en genisteïne (B), twee tyrosine fosforylatie inhibitoren. De dosis afhankelijke respons wordt telkens weergegeven in de grafiek. Waarden die significant verschillen van de blanco (0µM inhibitor) werden aangeduid met 1 (p=0,05) of 2 (p=0,01) sterretjes. De foto’s onder elke grafiek zijn confocale beelden van 1 zzektie genomen door het midden van de cel en geven een typisch beeld bij de aangeduide concentratie tyrphostine25 of genisteïne. De vesikels werden aangeduid met een pijltje. (Schaal = 5µm)
Resultaten
62
4.2 Opstellen van een model voor sialoadhesine gemedieerde endocytose Om te kunnen bepalen of sialoadhesine op tyrosine gebaseerde signalen bevat die noodzakelijk zijn voor internalisatie, is het noodzakelijk om een model op punt te stellen waarin mutanten van sialoadhesine kunnen bestudeerd worden. Daarom werd gezocht naar een cellijn die na transfectie met het cDNA van sialoadhesine, sialoadhesine tot expressie brengt op de plasmamembraan en waar het endocytoseproces van sialoadhesine gelijkaardig verloopt als in PAM.
4.2.1 HEK-T Omdat HEK-T cellen bij wassen en kleuren vrij gemakkelijk loskomen van de inserts waarop ze zich vasthechten werd eerst gezocht naar een optimale coating. Van de coatings die werden getest (collageen, lamininine, ornithine, BSA en ornithine-laminine) gaf de ornithine-laminine coating de beste resulaten. Vervolgens werd nagegaan of HEK-T cellen kunnen getransfecteerd worden met het cDNA van sialoadhesine en of sialoadhesine tot expressie komt op de celmembraan. HEK-T cellen werden getransfecteerd met de calcium-fosfaat methode en 1 dag later immunofluorescent gekleurd bij 4°C met Mas 41D3, gericht tegen sialoadhesine, en GαM-FITC. Met behulp van confocale microscopie kon sialoadhesine gelokaliseerd worden op de celmembraan en werd opnieuw de typisch puntige distributie waargenomen zoals gezien werd bij PAM (Figuur 25). Daarna werd het endocytoseproces bestudeerd met Mas 41D3. De cellen werden op verschillende
tijdstippen
na
de
shift
naar
37°C
gefixeerd
met
paraformaldehyde,
Figuur 25. Puntige distributie van sialoadhesine in de membraan van HEK-T na kleuring met Mas 41D3 en GαM-FITC (bij 4°C) De foto geeft een confocaal beeld weer van één enkele z-sektie genomen ter hoogte van de apikale celmembraan. (Schaal=5 µm)
Resultaten
63
gepermeabiliseerd en immunofluorescent gekleurd. Door middel van confocale microscopie kon vastgesteld worden dat HEK-T zelfs na 60 minuten internalisatie slechts een paar intracellulaire vesikels hadden (gemiddeld 2 vesikels). Het endocytoseproces kon efficiënter gemaakt worden door gebruik te maken van het secundair antilichaam GαM-FITC (gemiddeld 5 vesikels per cel). HEK-T cellen werden daarvoor eerst 1 uur bij 4°C geïncubeerd met Mas 41D3 en daarna 1 uur met GαM-FITC, eveneens bij 4°C. Door dit secundair antilichaam worden sialoadhesine eiwitten op de membraan sterker samengetrokken, wat in dit geval aanleiding geeft tot een sterker endocytotisch signaal.
Reltaief aantal cellen met endocytose (%)
100
80
60
40
20
0 0
20
40
60
80
100
120
Incubatieduur bij 37°C (min)
Figuur 26. Kinetiek van door Mas 41D3 geïnduceerde endocytose in HEK-T.
De kinetiek van opname van sialoadhesine wordt weergegeven in Figuur 26. Telkens werden willekeurig 25 cellen geanalyseerd met behulp van confocale microscopie. Van elke cel werd om de µm een z-sectie genomen en het aantal vesikels per sectie geteld. Het gemiddeld aantal cellen die meer dan 3 interne vesikels hadden werd relatief uitgezet ten opzichte van het maximum op 120 minuten. Reeds na 15 minuten bij 37°C werden vesikels gevormd in PAM, en op 120 minuten werd het maximum bereikt. De internalisatie kon echter niet geremd worden door amantadine. Daarom werden de andere inhibitoren niet meer getest en werden de HEK-T als model uitgesloten.
Resultaten
64
4.2.2 RK13 RK13 cellen werden door middel van de calcium-fosfaat methode getransfecteerd met het cDNA van sialoadhesine. Na 24 uur vertoonden de cellen een goede expressie van sialoadhesine op de celmembraan. Voor de endocytose assay werd hetzelfde protocol gevolgd als bij de HEKT, waarbij de receptoren samengetrokken werden met Mas 41D3 en GαM-FITC. De cellen bleken echter na 30 minuten al tot 50x meer vesikels opgenomen te hebben dan PAM, wat kan wijzen op aspecifieke opname (Figuur 27). Daarom werden deze cellen geweerd als model.
Figuur 27. Internalisatie van sialoadhesine in RK13, gefixeerd en gekleurd 30 minuten na de shift naar 37°C. Op de figuur is een confocaal beeld weergegeven van één enkele z-sektie in het midden van de cel. (Schaal=5 µm)
4.2.3 SK Ook deze cellen werden getransfecteerd volgens de calcium-fosfaat methode. Voor de endocytose assay werd hetzelfde protocol gevolgd als voor HEK-T en RK13 cellen. Na confocale analyse konden slechts een paar vesikels per cel gedetecteerd worden, waardoor deze cellijn niet verder gebruikt werd.
4.2.4 PK15 PK15 cellen werden getransfecteerd met het lipofectamine-plus reagens. Eén dag na transfectie bracht 5% van de cellen sialoadhesine tot expressie op de celmembraan, waarbij een puntige distributie gelijkaardig aan die in macrofagen werd waargenomen (Figuur 28). Voor de
Resultaten
65
Figuur 28. Puntige distributie van sialoadhesine in de membraan van PK15 na kleuring met Mas 41D3 en GαM-FITC (bij 4°C). De foto geeft een confocaal beeld weer van één enkele z-sektie genomen ter hoogte van de celmembraan. (Schaal=5 µm)
endocytose-assay werd hetzelfde protocol gevolgd als voor de HEK-T, RK13 en SK cellen, waarbij sialoadhesine gegroepeerd werd met GαM-FITC. De kinetiek van internalisatie wordt weergegeven in Figuur 29. Telkens werd het aantal cellen met endocytose relatief uitgezet ten opzichte van het maximum op 120 minuten. Vijftien minuten na de shift naar 37°C konden al intracellulaire vesikels waargenomen worden (gemiddeld 2 vesikels per cel). Daarna steeg het aantal vesikels met een maximum op 120 minuten (gemiddeld 6 vesikels per cel). De internalisatie werd visueel controleerd door een drievoudige kleuring uit te voeren (Figuur 30). De membraan werd gekleurd met phalloïdine-Tx-red, dat het corticale actine net onder de plasmamembraan kleurt (Figuur 30A). De vesikels (Figuur 30B) zitten duidelijk onder de membraan en zitten dus in het cytoplasma van de cel (Figuur 30D). De kern werd gekleurd met Hoechst (Figuur 30C). Om het endocytoseproces te karakteriseren werden verschillende inhibitoren uitgetest net zoals bij PAM. Bij het uittesten van de inhibitoren werd steeds hetzelfde protocol gevolgd als bij PAM. Het endocytoseproces werd wel efficiënter gemaakt door GαM-FITC als secundair antilichaam te gebruiken. Alle inhibitoren die gebruikt werden bij PAM, hadden een dosis afhankelijk effect in PK15 (Figuren 31 tot 32). Het aantal vesikels per cel daalde met 58% door toevoegen van 500 µM amantadine. Door incubatie met sucrose (450 µM) daalde het aantal met 79%. Deze dalingen zijn significant op het 0,01 niveau. De tyrosine fosforylatie inhibitoren tyrphostine en genisteïne hadden een dosisafhankelijk effect en reduceerden significant (p=0,01) het endocytoseproces respektievelijk met 65% en 74% bij een concentratie van 250 µM en
Resultaten
66
100 µM. Bij alle concentraties hoger dan 25 µM was het aantal vesikels per cel na incubatie met tyrphostine 1 significant (p=0,01) hoger dan na incubatie met tyrphostine 25. Opvallend was dat bij hogere concentraties inhibitoren de vesikels meer tegen de celmembraan aan te vinden waren.
Resultaten
67
Relatief aantal cellen met endocytose (%)
120
100
80
60
40
20
0 0
20
40
60
80
100
120
Incubatieduur bij 37°C (minuten)
0 min
15 min
30 min
60 min
90 min
120 min
Figuur 29. Kinetiek van door Mas 41D3 geïnduceerde endocytose in PK15. In de grafiek wordt per tijdstip het relatief aantal cellen weergegeven die meer dan 3 vesikels hebben opgenomen. De foto’s onder de grafiek zijn confocale beelden van één z-sektie in PK15 en geven telkens een typisch beeld op de verschillende tijdstippen. De vesikels zijn aangeduid met pijltjes. (Schaal= 5 µm)
Resultaten
Figuur 30. Visuele controle van internalisatie in PK15. De figuren zijn confocale beelden van 1 zsektie in het midden van de cel. Corticale actine (A) werd gekleurd met phalloïdine-Tx-Red. Sialoadhesine werd gekleurd met Mas 41D3 en GαM-FITC (B). De kern werd gekleurd met Hoechst (C). Figuur D is een superpositie van A, B en C. (Schaal=5 µm)
68
Resultaten
69
120
Relatief aantal vesikels per cel (%)
A.
100
80
60
**
**
40
20
0 0
125
250
500
Concentratie amantadine (µM)
0µM
Relatief aantal vesikels per
B.
125µM
500µM
120
100
80
60
*
40
** 20
0 0
150
450
C oncentratie sucrose (µM )
0µM
150µM
450µM
Figuur 31. Inhibitie van clathrine gemedieerde endocytose in PK15 door incubatie met amantadine (A) en sucrose (B). De dosis afhankelijke respons wordt telkens weergegeven in de grafiek. Waarden die significant verschillen van de blanco (0µM inhibitor) werden aangeduid met 1 (p=0,05) of 2 (p=0,01) sterretjes. De foto’s onder elke grafiek zijn confocale beelden van 1 z-zektie genomen door het midden van de cel en geven een typisch beeld bij de aangeduide concentratie. De vesikels werden aangeduid met een pijltje. (Schaal = 5µm)
70
Relatief aantal vesikels per
Resultaten
A.
120
100
* 80
** Tyrphostine 25 Tyrphostine 1
60
**
**
**
40
20
0 0
50
100
150
200
250
C oncentratie tyrphostine (µM )
100µM
Relatief aantal vesikels per
0µM
B.
250µM
120
100
*
80
*
60
**
40
**
20
0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
C oncentratie genisteïne (µM )
0µM
25µM
100µM
Figuur 32. Inhibitie van endocytose in PK15 door incubatie met tyrphostine (A) en genisteïne (B), twee tyrosine fosforylatie inhibitoren. De dosis afhankelijke respons wordt telkens weergegeven in de grafiek. Waarden die significant verschillen van de blanco (0µM inhibitor) werden aangeduid met 1 (p=0,05) of 2 (p=0,01) sterretjes. De foto’s onder elke grafiek zijn confocale beelden van 1 z-zektie genomen door het midden van de cel en geven een typisch beeld bij de aangeduide concentratie tyrphostine25 of genisteïne. De vesikels werden aangeduid met een pijltje. (Schaal = 5µm)
Resultaten
71
4.2.5 3D4 De 3D4 cellijn is een alveolaire macrofagen cellijn en dus wellicht ideaal als model aangezien sialoadhesine van nature in deze macrofagen tot expressie komt en misschien bepaalde cofactoren uit macrofagen nodig heeft om zijn functie correct uit te oefenen. Omdat 3D4 cellen geen sialoadhesine tot expressie brengen, werden de cellen getransfecteerd met behulp van het lipofectamine-plus reagens. Na transfectie brachten 3D4 cellen sialoadhesine in een typisch puntige distrubutie op de membraan tot expressie (Figuur 33).
Figuur 33. Puntige distributie van sialoadhesine in de membraan van 3D4 na kleuring met Mas 41D3 en GαM-FITC (bij 4°C). De foto geeft een confocaal beeld weer van één enkele z-sektie genomen ter hoogte van de celmembraan. (Schaal=5 µm)
Voor de endocytose-assay werd hetzelfde protocol gevolgd als voor de HEK-T, RK13, SK en PK15 cellen, waarbij sialoadhesine gegroepeerd werd met GαM-FITC. De kinetiek van internalisatie wordt weergegeven in Figuur 34. Telkens werd het aantal cellen met endocytose relatief uitgezet ten opzichte van het maximum op 90 minuten. Vijftien minuten na de shift naar 37°C werden gemiddeld 4 vesikels per cel waargenomen. Daarna steeg het aantal vesikels tot een maximum op 90 minuten (gemiddeld 8 vesikels). Om het endocytoseproces te karakteriseren werden verschillende inhibitoren gebruikt, net zoals bij PAM. Voor elke inhibitor werden 3D4 cellen geïncubeerd met de op één na hoogste concentratie die bij PAM werd gebruikt. De resultaten van één experiment staan in Figuren 35 en 36. Amantadine en sucrose reduceerden respektievelijk bij een concentratie van 250 µM en 150 µM het endocytoseproces met 60% en 64%. Tyrphostine 25 en genisteïne gaven respektievelijk aanleiding tot 51% en 71% minder internalisatie. De reduktie met tyrphostine 1 bleef beperkt tot 14%.
Resultaten
72
Relatief aantal cellen met endocytose (%)
120
100
80
60
40
20
0 0
20
40
60
80
100
120
Incubatieduur bij 37°C (min)
0 min
15 min
30 min
60 min
90 min
120 min
Figuur 34. Kinetiek van door Mas 41D3 geïnduceerde endocytose in 3D4. In de grafiek wordt per tijdstip het relatief aantal cellen weergegeven die meer dan 3 vesikels hebben opgenomen. De foto’s onder de grafiek zijn confocale beelden van één z-sektie in 3D4 en geven telkens een typisch beeld op de verschillende tijdstippen. De vesikels zijn aangeduid met pijltjes. (Schaal= 5 µm)
Resultaten
73
A.
Relatief aantal vesikels per cel (%)
120 100 80 60 40 20 0 0
250
Concentratie amantadine (µM)
B.
Relatief aantal vesikels per cel (%)
0 µM
250 µM
120 100 80 60 40 20 0 0
150
Concentratie sucrose (µM)
0 µM
150 µM
Figuur 35. Inhibitie van clathrine gemedieerde endocytose in 3D4 door incubatie met amantadine (A) en sucrose (B). De dosis afhankelijke respons wordt telkens weergegeven in de grafiek. Waarden die significant verschillen van de blanco (0µM inhibitor) werden aangeduid met 1 (p=0,05) of 2 (p=0,01) sterretjes. De foto’s onder elke grafiek zijn confocale beelden van 1 z-zektie genomen door het midden van de cel en geven een typisch beeld bij de aangeduide concentratie. De vesikels werden aangeduid met een pijltje. (Schaal = 5µm)
A.
74
Relatief aantal vesikels per cel (%)
Resultaten
120 100 80 60 40 20 0
Tyrphostine 1 & 25 0 µM
0 µM
Tyrphostine 25 150 µM
150 µM
120
Relatief aantal vesikels per cel (%)
B.
Tyrphostine 1 150µM
100 80 60 40 20 0
0
50
Concentratie genisteïne (µM)
10 µM
50 µM
Figuur 36. Inhibitie van endocytose in 3D4 door incubatie met tyrphostine (A) en genisteïne (B), twee tyrosine fosforylatie inhibitoren. De dosis afhankelijke respons wordt telkens weergegeven in de grafiek. Waarden die significant verschillen van de blanco (0µM inhibitor) werden aangeduid met 1 (p=0,05) of 2 (p=0,01) sterretjes. De foto’s onder elke grafiek zijn confocale beelden van 1 zzektie genomen door het midden van de cel en geven een typisch beeld bij de aangeduide concentratie tyrphostine25 of genisteïne. De vesikels werden aangeduid met een pijltje. (Schaal = 5µm)
Discussie
75
5
DISCUSSIE
De opname van PRRSV werd reeds bestudeerd in PAM cellen en Marc-145 door Nauwynck et al. (1999) en Kreutz & Ackerman (1996). In beide gevallen werd aangetoond dat PRRSV via een clathrine gemedieerde weg opgenomen wordt. De vermoedelijke receptor voor PRRSV is sialoadhesine daar Mas 41D3, gericht tegen sialoadhesine, de opname van PRRSV in PAM volledig kon blokkeren. Daarenboven kan Mas 41D3, de binding van PRRSV met PAM reduceren (Duan et al., 1998). Bovendien werd colokalistie tussen PRRSV en sialoadhesine/Mas 41D3 aangetoond en ook tussen sialoadhesine en clathrine (Vanderheijden et al., 2003; Duan et al., 1998). Er wordt dan ook verondersteld dat sialoadhesine via clathrine gemedieerde endocytose wordt opgenomen. De bedoeling van deze scriptie is om deze hypothese verder te onderzoeken. De hypothese werd eerst onderzocht in PAM, waarin sialoadhesine van nature tot expressie komt (McWilliam et al., 1992). De internalisatie werd geïnduceerd met Mas 41D3. Deze monoklonale antistof kan met zijn Fab regio twee sialoadhesine-moleculen binden, waardoor sialoadhesine-moleculen gegroepeerd worden, wat aanleiding kan geven tot endocytose. Voor de ‘epidermal growth factor (EGF)’ receptor is bijvoorbeeld al aangetoond dat clusteren noodzakelijk is voor interactie met het cytoskeleton (Van Belzen et al., 1991). Door PAM bij 4°C te incuberen met 15 µg Mas 41D3 per ml worden de sialoadhesine receptoren in PAM verzadigd met Mas 41D3. Immers om infectie met PRRSV in PAM volledig te blokkeren met Mas 41D3, is een veel lagere concentratie reeds voldoende (Duan et al., 1998). Bij 4°C gaat vindt geen endocytose plaats, onder andere door afbraak van microtubili bij een temperatuur lager dan 20°C en door een toegenomen riditeit van de celmembraan (Rode et al., 1997). In deze scriptie werd aangetoond dat Mas 41D3 endocytose induceert in PAM. Na vijftien minuten incubatie bij 37°C had reeds 25% van de PAM intracellulaire vesikels gevormd. Het endocytoseproces werd waarschijnlijk wel vertraagd door de PAM eerst bij 4°C te incuberen met Mas 41D3. Na de shift naar 37°C moeten de PAM immers eerst weer hun cellulaire processen herstellen en microtubuli opbouwen. Het endocytoseproces bereikte een maximum na anderhalf uur, daarna daalde het aantal vesikels per cel. Een mogelijkheid is dat na anderhalf uur het lysosomale degradatie systeem Mas 41D3 en sialoadhesine sneller afbreekt dan het wordt
Discussie
76
opgenomen. Macrofagen zijn immers professioneel fagocyterende cellen met een goed werkend lysosomaal systeem (Aderem & Underhill, 1999). Een andere mogelijkheid is dat na 90 minuten minder sialoadhesine wordt opgenomen. Dit kan in overeenstemming zijn met feit dat na zelfs na 2 uur incubatie bij 37°C, nog steeds sialoadhesine kan waargenomen worden in de membraan en dat dus niet alle sialoadhesine geïnternaliseerd wordt. Deze observatie werd bevestigd door flowcytometrische analyse. Na 60 minuten incubatie bij 37°C werd slechts 28% van de membraan geïnternaliseerd. Om aspecifieke binding van Mas 41D3 met PAM te kunnen uitsluiten, werden PAM met Mas 13D12 geïncubeerd. Deze antistof is van hetzelfde isotype als 41D3 (IgG1) en is gericht tegen glycoproteïne D van het suidherpesvirus type I (Nauwynck et al., 1995). Omdat na incubatie met 13D12 geen membraankleuring, noch een intracellulaire kleuring kon vastgesteld worden, mag besloten worden dat de opname van Mas 41D3 specifiek is. Macrofagen hebben ook een Fcreceptor die de Fc-zijde van antistoffen kan binden (Garcia-Garcia & Rosales, 2002). Als bijkomende controle voor de Fc-receptor activiteit werd Mas 41D3 geïnduceerde endocytose onderzocht na verzadiging van de Fc-receptoren met geintenserum. Omdat het aantal vesikels niet significant daalde (data niet gegeven) mag besloten worden dat de vesikels in PAM enkel en alleen afkomstig zijn van opname van Mas 41D3 door sialoadhesine. Het is ook belangrijk te weten of sialoadhesine al dan niet spontaan opgenomen wordt in PAM. Daarom werd endocytose geïnduceerd met Mas 41D3 of Mas 13D12 dat niet bindt met sialoadhesine. Na fixatie van en permeabilisatie werden PAM gekleurd met Mas 41D3 en GαMFITC. Omdat na confocale analyse geen intracellulaire kleuring kon worden waargenomen bij met Mas 13D12 geïncubeerde PAM, in tegenstelling met PAM die door Mas 41D3 werden geïnduceerd, mag men besluiten dat sialoadhesine enkel opgenomen wordt na stimulatie met Mas 41D3 en niet spontaan. In deze scriptie werd ook aangetoond dat sialoadhesine waarschijnlijk via een clathrine afhankelijk proces internaliseert. Specifieke inhibitoren konden immers het internalisatieproces inhiberen. Amantadine, dat de ontmanteling van CCV verhindert (Phonphok Y.& Rosenthal K.S., 1991), reduceerde het internalisatieproces met 55% bij een concentratie van 500 µM. Sucrose, dat aanleiding geeft tot het vormen van kleine ledige CCV (Heuser & Anderson 1989), reduceerde het internalisatieproces met 94%. Deze resultaten wijzen erop dat de vorming van CCV belangrijk is bij de internalisatie van sialoadhesine. Tyrphostine 25, die naast tyrosine
Discussie
77
fosforylatie ook de binding van AP2 het YxxΦ motief verhindert (Crump et al., 1998), kon de internalisatie van sialoadhesine sterk inhiberen. Dit is opnieuw een aanwijzing dat sialoadhesine via een clathrine gemedieerde weg wordt opgenomen. Ligand geïnduceerde endocytose van cellulaire receptoren is vaak afhankelijk van tyrosine fosforylatie (Sibley et al., 1987). Zo is aangetoond dat binding van EGF (epidermal growth factor) op zijn receptor, fosforylatie op tyrosine residu’s van de zware keten van clathrine induceert (Wilde et al., 1999). Deze fosforylatie is betrokken bij de opbouw van clathrine kooien. Ook EPS15 wordt na binding van EGF gefosforyleerd op tyrosine residu’s (van Delft et al., 1997). Het feit dat genisteïne en tyrphostine 25, twee fosforylatie inhibitoren, de internalisatie respektievelijk met 89% en 69% konden reduceren wijst er op dat tyrosine fosforylatie een belangrijke rol speelt bij de internalisatie van sialoadhesine. Tyrphostine 1, de inactieve vorm van tyrphostine 25, had weinig effect op het internalisatieproces. De tyrosine fosforylatie pathway kan ook een verklaring bieden waarom bij hogere concentraties inhibitor, de weinige vesikels in de cel vooral tegen de celmembraan gevonden worden. Immers indien een receptor toch aan de inhibirende invloed van tyrphostine of genisteïne ontsnapt en internaliseert, dan zal de internalisatie hoogst waarschijnlijk geremd worden in een later stadium van het endocytoseproces. Er is bijvoorbeeld al aangetoond dat dynamine, dat de vesikels afsnoert van de celmembraan, op tyrosine residuen gefosforyleerd wordt na activatie van de insuline receptor. Ook bij EPS15 dat onder andere verantwoordelijk is voor correcte lokalisatie van dynamine naar de membraan, werd tyrosine fosforylatie aangetoond (Paolo & Fox, 1999). Om onder andere mutaties in de cytoplasmatische staart van sialoadhesine te kunnen bestuderen, en te bepalen welke motieven in de staart belangrijk zijn voor het endocytoseproces, werd gepoogd een model op te stellen voor de internalisatie van sialoadhesine. Hoewel HEK-T cellen (Human embryo kidney) succesvol getransfecteerd werden met het cDNA van sialoadhesine werd deze cellijn geweerd als model omdat amantadine geen effect had op het endocytose proces. Dit kan erop wijzen dat HEK-T cellen, sialoadhesine niet via clathrine gemedieerde endocytose opnemen, en dat HEK-T cellen bijgevolg geen goed model zijn. Getransfecteerde RK13 cellen (Rabbit kidney) bleken na 30 minuten bij 37°C tot 50x meer vesikels opgenomen te hebben dan PAM. De kans is dan ook reeël dat de opname van sialoadhesine in RK13 cellen aspecifiek gebeurt - of toch tenminste niet via een gelijkaardig mechanisme als in PAM - of dat de internalisatie ook gebeurt zonder stimulatie met Mas 41D3.
Discussie
78
Deze cellijn kan dus evenmin als model worden gebruikt. Getransfecteerde SK (Swine kidney) cellen namen daarentegen te weinig op, waardoor geen statistisch betrouwbare tellingen konden uitgevoerd worden en deze cellijn dus ook niet geschikt is als model. De PK15 (Porcine kidney) cellijn is daarentegen wel een goed model voor de gemedieerde internalisatie van sialoadhesine. De kinetiek van het internalisatieproces in PK15 heeft een analoog verloop als bij de PAM (Figuur 37). Na 15 minuten incubatie bij 37°C had respectievelijk 24% (PAM) en 6% (PK15) meer dan 3 interne vesikels gevormd. Het aantal vesikels stijgt in beide cellijnen met de tijd en bereikt in PAM een maximum op 90 minuten
Relatief aantal cellen et endocytose (%)
120
100
80
PK15 PAM
60
40
20
0 0
20
40
60
80
100
120
Incubatieduur bij 37°C (min)
Figuur 37. Vergelijking van internalisatie van sialoadhesine in PAM en PK15. In de grafiek is het gemiddeld aantal cellen met endocytose weergegeven in functie van de incubatieduur bij 37°C.
maar bij PK15 pas op 120 minuten. Het endocytoseproces in PK15 is dus minder efficiënt dan in PAM, ook al omdat bij PK15 een secundair antilichaam nodig is om voldoende endocytose te induceren. Van PK15 cellen die enkel met Mas 41D3 werden geïncubeerd, kon slechts in 10% van de getransfecteerde cellen endocytose vastgesteld worden, terwijl dat met een secundair antilichaam bij 80% van de getransfecteerde cellen het geval was. Deze resulaten wijzen er op dat groepering van sialoadhesine belangrijk is bij de internalisatie van sialoadhesine. Het verschil tussen PAM en PK15 kan te wijten zijn aan het celtype. In tegenstelling tot PK15 cellen, delen in cultuur gebrachte PAM niet meer zodat zij meer energie ter beschikking kunnen stellen voor het endocytoseproces. Bovendien gebruiken PK15 cellen na transfectie veel van hun
Discussie
79
energie voor de aanmaak van het sialoadhesine eiwit. Het belangrijkste verschil is waarschijnlijk dat PAM professionele fagocyterende en endocyterende cellen zijn (Garcia-Garcia & Rosales, 2002) en dus beter uitgerust zijn om Mas 41D3 op te nemen. Dit kan tevens een verklaring geven waarom na 2 uur het aantal vesikels in PAM daalt en in PK15 niet. Door inwerking van lysosomale enzymen kan Mas 41D3 immers vernietigd worden, zodat bij kleuring met GαMFITC deze niet meer te detecteren zijn. Om na te gaan of sialoadhesine via clathrine gemedieerde endocytose opgenomen wordt net als in PAM, werden de inhibitoren die gebruikt werden bij de PAM, uitgetest op PK15 cellen. In beide celtypes werd een dosisafhankelijk respons waargenomen. De redukties bekomen in beide cellijnen wordt vergeleken Tabel 6. Uit de tabel blijkt duidelijk dat de internalisatie in PK15 cellen op een analoge wijze geïnhibeerd wordt door de verschillende inhibitoren. Enkel de hoogste concentratie sucrose en de laagste concentratie tyrphostine waren significant verschillend in PAM en PK15. Daaruit mag besloten worden dat het internalisatieproces volgens een zelfde mechanisme verloopt als in PAM. PK15 cellen kunnen dus als model dienen voor de internalisatie van sialoadhesine.
Discussie
80
Tabel 6. Vergelijking van reduktie van internalisatie in PAM en PK15 cellen.
Inhibitor
Concentratie
Gemiddelde
Significantie
(µM)
reduktie in aantal van verschil vesikels (%)
Amantadine
Sucrose Tyrphostine 25
Tyrphostine 1
Genisteïne
In PAM
In PK15
125
12,4
24,6
-
250
63,62
55,47
-
500
54,93
60,11
-
150
47,96
60,96
-
450
94
78,4
P=0,01
25
33,01
10,64
P=0,05
50
41,62
37,74
-
100
69,83
62,24
-
150
96,54
59,75
-
250
68,29
64,87
-
25
-4,29
1,31
-
50
0,49
10
-
100
19,32
6,6
-
150
15,08
12,4
-
250
18,07
21,43
-
10
22,75
31,93
-
25
70,6
52,11
-
50
80,47
66,41
-
100
88,69
77,04
-
Discussie
81
Relatief aantal cellen met endocytose (%)
140
120
100
80 PAM 3D4 60
40
20
0 0
20
40
60
80
100
120
Incubatieduur bij 37°C (min)
Figuur 38. Vergelijking van internalisatie van sialoadhesine in PAM en 3D4. in de grafiek is het gemiddeld aantal cellen met endocytose weergegeven in functie van de incubatieduur bij 37°C.
Een tweede cellijn die werd uitgetest was de 3D4 macrofagen cellijn. De kinetiek van internalisatie wordt met PAM vergeleken in Figuur 38. Uit de Figuur blijkt dat de internalisatie vrij identiek verloopt als bij PAM. Beide celtypes bereiken een maximum op 90 minuten waarna een lichte daling kan worden waargenomen in het aantal vesikels. Aangezien de inhibitoren in 3D4 cellen slechts eenmalig getest werden kan hierop geen statistische toets gebruikt worden. Toch geeft Tabel 7 een indicatie van de verschillen tussen PAM en 3D4. Uit de tabel blijkt dat de redukties in PAM en 3D4 vergelijkbaar zijn, met uitzondering voor tyrphostine 25 waar de reduktie in 3D4 een stuk lager ligt. Desalniettemin toont Tabel 7 aan dat de internalisatie in 3D4 gelijkaardig is dan in PAM en dat 3D4 cellen waarschijnlijk een goed model zijn voor sialoadhesine gemedieerde endocytose.
Discussie
82
Tabel 7. Vergelijking van reduktie van internalisatie in PAM en 3D4 cellen.
Inhibitor
Concentratie (µM)
Gemiddelde reduktie in aantal vesikels (%) In
In 3D4
PAM Amantadine
500
54,93
59,82
Sucrose
150
47,96
63,77
Tyrphostine 25
150
96,54
50,91
Tyrphostine 1
150
15,08
13,64
Genisteïne
50
80,47
70,37
Bij vergelijken van de internalisatie van sialoadhesine in PK15 en 3D4, mag men besluiten dat 3D4 cellen waarschijnlijk het beste model zijn. De kinetiek bij 3D4 is immers quasi identiek aan die bij PAM en ook de redukties, behalve bij tyrphostine 25, zijn vrij identiek aan PAM. Het 3D4 model heeft ook als voordeel dat 3D4 cellen alveolaire macrofagen zijn, net zoals PAM en dus ook beter uitegerust zijn als professioneel fagocyterende en endocyterende cellen. Voor de verdere studie van (mutant) sialoadhesine kunnen beide cellijnen dus gebruikt worden als model, maar 3D4 zijn waarschijnlijk het meest geschikt. .
Besluit
83
6
BESLUIT
Reeds eerder werd aangetoond dat een 210kDa proteïne betrokken is bij de opname van PRRSV in PAM. Later werd dit proteïne geïdentificeerd als het porciene sialoadhesine. In deze scriptie werd met behulp van monoklonale antilichamen gericht tegen sialoadhesine en confocale microscopie, aangetoond dat sialoadhesine via clathrine gemedieerde endocytose wordt opgenomen in PAM. Incubatie van PAM met verscheidene inhibitoren van clathrine gemedieerde endocytose resulteerde in sterke inhibitie van endocytose en toonde aan dat de opname van sialoadhesine via clathrine gemedieerde endocytose verloopt. Controle antilichamen van hetzelfde isotype resulteerden niet in internalisatie. Er werd ook aangetoond dat de opname in PAM niet spontaan gebeurt waardoor besloten kan worden dat de opname van sialoadhesine in PAM specifiek gebeurt en meer bepaald door receptor gemedieerde endocytose via clathrine. Naar de toekomst toe is het de bedoeling om met behulp van mutanten te zoeken naar de signalen in cytoplasmatische staart van sialoadhesine die aanleiding geven tot endocytose. Voor dergelijk onderzoek is het nodig om een systeem te vinden waarin men sialoadhesine tot expressie kan laten komen, en waarin de internalisatie van sialoadhesine gelijkaardig is als in PAM. In deze scriptie werd aangetoond dat PK15 cellen en ook 3D4 cellen geschikt zijn als modelsysteem. De internalisatie in PAM, PK15 en 3D4 was immers vrij analoog en bovendien gaven de verschillende inhibitoren van clathrine gemedieerde endocytose aanleiding tot gelijkaardige redukties. Om te bepalen of de motieven in de cytoplasmatische staart van sialoadhesine belangrijk zijn voor endocytose werd in het kader van deze scriptie gestart met de aanmaak van een staartloze mutant. Wegens tijdsgebrek is het protocol nog niet volledig geoptimaliseerd. Verder onderzoek is dus nodig om het protocol te optimaliseren en het effect van deze staartloze mutant op endocytose te onderzoeken.
Referentielijst
84
7
REFERENTIELIJST
Achiriloaie M., Barylko B. & Albanesi J.P. (1999). Essential role of the dynamin pleckstrin homology domain in receptor mediated endocytosis. Molecular and cellular biology, 19(2), 1410-1415. Aderem A. & Underhill D.M. (1999). Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual reviews of immunology, 17, 593-623. Akiyama T., Ishida J., Nakagawa S., Ogawara H., Watanabe S., Itoh N., Shibuya M. & Fukami Y. (1987). Genistein, a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinases. Journal of biological chemistry, 262 (12), 55925595. Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K. & Watson J.D. (1994). Molecular biology of the cell. Derde druk, New York, Garland Publishing, Inc., 1293p. Beck K.A. & Keen J.H. (1991). Interaction of phosphoinositide cycle intermediates with the plasma membrane associated clathrin assembly protein AP-2. Journal of biological chemistry, 266(7), 4442-4447. Benfield D.A., Nelson E., Collins J.E., Harris L., Goyal S.M., Robinson D., Christianson W.T., Morrison R.B., Gorcyca D. & Chladek D. (1992). Characterisation of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus (isolate ATCC VR-2332). Journal of veterinary diagnostic investigation, 4, 127-133. Beningo K.A. & Wang Y. (2002). Fc-receptor-mediated phagocytosis is regulated by mechanical properties of the target. Journal of cell science, 115, 849-856. Benmerah A., Bayrou M., Cerf-Bensussan N. & Dautry-Varsat A. (1999). Inhibition of clathrin-coated pit assembly by an EPS15 mutant. Journal of cell science, 112, 1303-1311. Benmerah A., Lamaze C., Bègue B., Schmid S.L., Dautry-Varsat A. & Cerf-Bensussan N. (1998). AP-2/EPS15 interaction is required for receptor-mediated endocytosis. Journal of cell biology, 140, 1055-1062. Benmerah A., Poupon V., Cerf-Bensussan N. & Dautry-Varsat A. (2000). Mapping of EPS15 domains involved in its targeting to clathrin-coated pits. The journal of biological chemistry, 5, 3288-3295. Bild A.H., Turkson J. & Jove R. (2002). Cytoplasmatic transport of stat3 by receptor-mediated endocytosis. European molecular biology organisation, 21(13), 3255-3263.
Referentielijst
85
Bishop N.E. (1997). An update on non-clathrin coated endocytosis. Reviews in medical virology, 7, 199-207. Bodaghi B., Slobbe-van Drunen M.E., Topilko A., Vossen R.C., van Dam-Mieras M.C., Zipeto D., Virelizier J.L. LeHoang P., Bruggeman C.A. & Michelson S. (1999). Entry of human cytomegalovirus into retinal pigment epithelial and endothelial cells by endocytosis. Investigative ophtalmology & visual science, 40, 2598-2607. Boll W., Rapoport I., Brunner C., Modis Y., Prehn S. & Kirchhausen T. (2002). The µ2 subunit of the clathrin adaptor AP-2 binds to FDNPVY and YppØ sorting signals at distinct sites. Traffic, 3, 590-600. Bonifacino J.S. & Dell’Angelica E.C. (1999). Molecular bases for the recognition of tyrosine-based sorting signals. The journal of cell biology, 5, 923-926. Brinkman-Van der Linden E.C.M & Varki A. (2000). New aspects of siglec binding specifities, including the significance of fucosylation and of the sialyl-Tn epitope. Journal of biological chemistry, 275(12), 8625-8632. Buck K.W. (1996). Comparison of the replication of positive stranded RNA virusses of plants and animals. Advances in virus research, 47, 159-251. Calhoun B.C., Lapierre L.A., Chew C.S. & Goldenring J.R.(1998). Rab11a redistributes to apical secretory canaliculus during stimulation of gastric parietal cells. American journal of physiology, 275(1 pt 1), C363-370. Casanova J.E., Wang X., Kumar R., Barthur S.G., Naverre J., Woodrum J.E., Altschuler Y., Ray G.S. & Goldenring J.R. (1999). Association of rab25 and rab11a with the apical recycling system of polarized Madin-Darby canine kidney cells. Molecular biology of the cell, 10(1), 47-61. Cavanagh D. (1997). Nidovirales: a new order comprising Coronaviridae and arteriviridae. Archives of virology, 142, 629-633. Ceresa B.P. & Schmid S.L. (2000). Regulations of signal transduction by endocytosis. Current opinion in cell biology, 12, 204-210. Chen W, Feng Y., Chen D. & Wandinger-Ness A. (1998). Rab11 is required for trans-golgi network-to-plasma membrane transport and a preferential target for GDP dissociation inhibitor. Molecular biology of the cell, 9(11), 3241-3257. Christoforidis S., McBride H.M., Burgoyne R.D. & Zerial M. (1999). The Rab5 effector EEA1 is a core component of endosome docking. Nature, 397(6720), 621-625.
Referentielijst
86
Clague M.J. (1998). Molecular aspects of the endocytic pathway. Biochemical journal, 336, 271-282. Collins J.E., Benfield D.A., Christianson W.T., Harris L., Hennings J.C., Shaw D.P., Goyal S.M., McCullough S., Morrison R.B., Joo H.S., Gorcyca D. & Chladek D. (1992). Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332) in north America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs. Journal of veterinary diagnastic investigation, 4, 117-126. Conner S.D. & Schmid S.L. (2002). Identification of an adaptor-associated kinase, AAK1, as a regulator of clathrin-mediated endocytosis. The journal of cell biology, 156(5), 921-929. Conzelmann K.K., Visser N., Van Woensel P. & Thiel H.J. (1993). Molecular characterization of porcine reproductive end respiratory syndrome virus, a member of the arteritis group. Virology, 192, 1-11. Crocker P.R., Vinson M., Kelm S. & Drickamer K. (1999). Molecular analysis of sialoside binding to sialoadhesin by NMR and site-directed mutagenese. Biochemical journal, 341, 355-361. Crocker P.R., Hartnell A., Munday J. & Nath D. (1997). The potential role of sialoadhesin as a macrophage recognition molecule in health and disease. Glycoconjugate journal, 14, 601-609. Crump C.M., Williams J.L., Stephens D.J. & Banting G. (1998). Inhibition of the interaction between tyrosinebased motifs and the medium chain subunit of the AP-2 adaptor complex by specific tyrphostins. Journal of biological chemistry, 273(43), 28073-28077. Cupers P., ter Haar E., Boll W. & Kirchhausen T. (1997). Parallel dimers and anti-parallel tatramers formed by epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15 (EPS15). Journal of biological chemistry, 272(52), 33430-33434. Daro E., Van Der Sluijs P., Galli T. & Mellman I. (1996). Rab4 cellubrevin define different early endosome populations on the transferrin receptor recycling. Proceedings of the national academy of sciences of the united states of America, 93, 9559-9564. Dea S., Bilodeau R., Athanaseous R., Sauvageau R.A. & Martineau G.P. (1992). PRRS syndrome in Quebec: isolation of a virus serologically related to Lelystad virus. Veterinary Record, 130, 167. Dea S., Gagnon A., Mardassi H., Piradeh B. & Rogan D. (2000). Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates. Archives of virology, 145, 659-688.
Referentielijst
87
Delputte P.L., Venderheijden N., Nauwynck H.J. & Pensaert M.B. (2002). Involvement of the matrix protein in attachment of porcine reproductive and respiratory syndrome virus to a heparinlike receptor on porcine alveolar macrphages. Journal of virology, 76(9), 4312-4320. Duan X., Nauwynck H.J. & Pensaert M.B. (1997). Effects of origin and state of differentiation and activation of monocytes/macrophages on their susceptibility to porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Archives of virology, 142, 1-15. Duan X., Nauwynck H.J., Favoreel H.W. & Pensaert M.B. (1998). Identification of a putative receptor for porcine reproductive and respiratory syndrome virus on porcine alveolar macrphages. Journal of virology, 72(5), 4520-4523. Duman J.G., Tyagarajan K., Kolsi M.S., Moore H.P.& Forte J.G.(1999). Expression of Rab11a N124I in gestric parietal cells inhibits stimulatory recruitment of the H+-K+-ATPase. American journal of physiology, 277(3 pt 1), C361-372. Forgac M. (2000). Structure, mechanism and regulation of the clathrin-coated vesicle and yeast vacuolar H+ATPases. The journal of experimental biology, 203, 71-80. Freeman S., Birrell H.C., D’Alessio K., Erickson-Miller C., Kikly K. & Camilleri P. (2001). A comparative study of the asparagine-linked oligosaccharides on siglec-5, siglec-7 and siglec-8, expressed in a CHO cell line, and their contribution to ligand recognition. European journal of biochemistry, 268, 1228-1237. Gaidarov I., Santini F., Warren R.A. & Keen J.H. (1999). Spatial control of coated-pit dynamics in living cells. Nature, 1(1), 1-7. Garcia-Garcia E. & Rosales C. (2002). Signal transduction during Fc receptor-mediated phagocytosis. Journal of leukocyte biology, 72, 1092-1108. Ghosh R.N., Mallet W.G., Soe T.T., McGraw T.E. & Maxfield F.R. (1998) An endocytosed TGN38 chimeric protein is delivered to the TGN after trafficking through the endocytic compartment in CHO cells. Journal of cell biology, 142(4), 923-936. Gordon S. (1998). The role of the macrophage in immune regulation. Research in immunology, 149(7-8), 685688. Greene B., liu S., Wilde A. & Brodsky F.M. (2000). Complete reconstruction of clathrin basket formation with recombinant protein fragments: adaptor control of clathrin self-assembly. Traffic, 1, 69-75.
Referentielijst
88
Gu F. & Gruenberg J. (1999). Biogenesis of transport intermediates in the endocytic pathway. Federation of European biochemical societies, 452, 61-66. Heuser J.E. & Anderson R.G. (1989). Hypertonic media inhibit receptor-mediated endocytosis by blocking clathrin-coated pit formation. Journal of cell biology, 108(2), 389-400. Hewlett L.J., Prescott A.R. & Watts C. (1994). The coated pit and macropinocytic pathways serve distinct endosome populations. Journal of cell biology, 124, 689-703. Hill E., van der Kaay J., Downes C.P. & Smythe E. (2001). The role of dynamin and its binding partners in coated pit invagination ans scission. The journal of cell biology, 2, 309-323. Hunter S., Kamoun M. & Schreiber A.D. (1994). Transfection of an Fcγ receptor cDNA induces T cells to become become fagocytic. Proceedings of the national academy of sciences of the united states of America, 91, 10232-10236. Hunziker W. & Peters P.J. (1998). Rab17 localizes to recycling endosomes and regulates receptor-mediated transcytosis in epithelial cells. The journal of biological chemistry, 273(25), 15734-15741. Joki-Korpela P., Marjomaki V., Krogerus C., Heino J. & Hyypia I. (2001). Entry of human parechovirus 1. Journal of virology, 75, 1958-1967. Keffaber K.K. (1989). Reproductive failure of unknown etiology. American association of swine practitices newletter, 1, 1-10. Korade-Mirnics Z. & Corey S.J. (2000). Src kinase-mediated signalling in leukocytes. Journal of leukocyte biology, 68, 603-613. Kreutz L.C. & Ackerman M.R. (1996). Porcine reproductive and respiratory syndrome virus enters cells through a low pH-dependant endocytic pathway. Virus research, 42, 137-147. Krizanová O., Ciampor F. & Verber P. (1982). Influence of chlorpromazine on the replication of influenza virus chick embryo fibroblasts. Acta virology, 26, 209-216. Lafer E.M. (2002). Clathrin-protein interactions. Traffic, 3, 513-520.
Referentielijst
89
Lamaze C., Dujeancourt A., Baba T., Lo C.G., Benmerah A. & Dautry-Varsat A. (2001). Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. Molecular cell, 7, 661671. Lindhaus W. & Lindhaus B. (1991). Ratselhafte Sweinekrankheitt. Der praktische Tierarzt, 5, 423-425. Lodish H., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J. (2001). Molecular cell biology. Derde druk, New York, W.H. Freeman and company, 1084p. Lütcke A., Parton R.G., Murphy C., Olkkonen V.M., Dupree P., Valencia A., Simons K. & Zerial M. (1994). Cloning and subcellular localisation of novel rab proteins rerveals polarized and cell type-specific expression. Journal of cell science, 107(pt.12), 3437-3448. Luttrell L.M. & Lefkowitz R.J. (2002). The role of β-arrestins in the termination and transduction of G-proteincoupled receptor signals. Journal of cell science, 115, 455-465. Luzio J.P., Rous B.A., Bright N.A., Pryor P.R., Mullock B.M., Piper R.C. (2000). Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis. Journal of cell science, 113, 1515-1524. Mallard F., Antony C., Tenza D., Salamero J., Goud B.& Johannes L. (1998). Direct pathway from earlyrecycling revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. Journal of cell biology, 143(4), 973-990. Mallet W.G. & Maxfield F.R. (1999). Chimeric forms of furin and TGN38 are transported with the plasma membrane in the trans-Golgi network via distinct endosomal pathways. Journal of cell biology, 146(2), 345-359. Mardassi H., Massie B. & Dea S. (1996). Intracellular synthesis, processing and transport of proteins encoded by ORFs 5 to 7 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Virology, 221, 98-112. Marechal V., Prevost M.C., Petit C., Perret E., Heard J.M. & Schwartz O. (2001). Human Immunodeficiency virus type 1 entry into macrophages mediated by macropinocytosis. Virology, 75, 1856-1865. Marjomaki V., Pietiainen V., Matilainen H., Upla P., Ivaska J., Nissinen L., Reunanen H., Huttunen P., Hyypia T. & Heino J. (2002). Internalisation of echovirus 1 in caveolae. Virology, 76, 1856-1865. Marks B., Stowell M.H.B., Vallis Y., Mills I.G., Gibson A., Hopkins C.R. & McMahon H.T. (2001). GTPase activity of dynamin and resulting change are essential for endocytosis. Nature, 410, 231-235.
Referentielijst
90
Marsh M. & Bron R. (1997). SFV infection in CHO cells: cell-type specific restrictions to productive virus entry at the cell surface. Journal of cell science, 110(pt 1), 95-103. Marsh M. & McMahon H.T. (1999). The structural era of endocytosis. Science, 285(5425), 215-220. Marsh M. & Pelchen-Matthews A. (2000). Endocytosis in viral replication. Traffic, 1, 525-532. Madshus I.H., Sandvig K., Olsnes S. & van Deurs B. (1987). Effect of reduced endocytosis induced by hypotonic shock and potassium depletion on the infection of Hep 2 cells by picornaviruses. Journal of cellular physiology, 131, 14-22. Matlin K.S., Reggio H., Helenius A. & Simons K. (1982). Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. Journal of cell biology, 91, 601-613. McLauchlan H., Newell J., Morrice N., Osborne A., West M., Smythe E. (1998). A novel role for Rab5-GDI in ligand sequestration into clathrin coated pits. Current opinion in cell biology, 8(1),34-45. McWilliam A.S., Tree P. & Gordon S. (1992). Interleukin 4 regulates induction of sialoadhesin, the macrophage sialic acid-specific receptor. Proceedings of the national academy of sciences of the united states of America, 89, 10522-10526. Mellman I. (1996). Endocytosis and molecular sorting. Annual reviews, 12, 575-625. Meng X-J, Paul P.S. & Halbur P.G. (1994). Molecular cloning and nucleotide sequencing of the 3’-terminal genomic RNA of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Journal of general virology, 75, 17951801. Mengeling W.M., Lager K.M.& Vorwald A.C. (1998). Clinical effects of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on pigs during the early postnatal interval. Amercican journal of veterinary research, 59(1), 52-55. Meulenberg J.J. (2000). PRRSV, The virus. Veterinary resaerch, 31(1), 11-22. Meulenberg J.J.M., de Meijer E.J. & Moormann R.J. (1993a). Subgenomic RNAs of lelystad virus contain a conserved leader-body junction sequence. Journal of general virology, 74(pt 8), 1697-1701. Meulenberg J.J.M, Hulst M.M., De Meijer E.J., Moonen P.L.J.M., Den Besten A., De Kluyver E.P., Wensvoort G. & Moormann R.J.M. (1993b). Lelystad Virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS), is related to LDV and EAV. Virology, 192, 62-72.
Referentielijst
91
Meulenberg J.J.M. & Den Besten A.P. (1996). Identification and characterisation of a sixth structural protein of Lelystad virus: the glycoprotein GP2 encoded by ORF2 is incorporated in virus particles. Virology, 225, 44-51. Meulenberg J.J.M., Petersen-den Besten E.P., De kluyver E.P., Moormann R.J., Schaaper W.M. & Wensvoort G. (1995). Characterisation of proteins encoded by ORFs 2 to 7 of Lelystad virus. Virology, 206, 155-163. Miller N. & Hutt-Fletcher L.M. (1992). Epstein-Barr virus enters B cells and epithelial cells by different routes. Journal of virology, 66, 3409-3414. Morris S.A., Schroeder S., Plessmann U., Weber K.& Ungewickell E. (1993). Clathrin assembly protein AP180: primary structure domain organisation and identification of a clathrin binding site. European molecular biology organisation, 12(2), 667-675. Morrisette N., Gold E. & Aderem A. (1999). The macrofage – a cell for all seasons. Trends in cell biology, 9, 199-201. Muhlberg A.B., Warnock D.E. & Schmid S.L. (1997). Domain structure and intramolecular regulation of dynamin GTPase. European molecular biology organisation, 16(22), 6676-6683. Mukhopadhyay AM., Funato K. & Stahl P.D. (1997). Rab7 regulates transport from early to late endocytic compartments in Xenopus oocytes. The journal of biological chemistry, 272(20), 13055-13059. Munday J., Floyd H. & Crocker P.R. (1999). Sialic acid binding receptors (siglecs) expressed by macrophages. Journal of leukocyte biology, 66, 705-711. Naito M. (1993). Macrophage heterogeneity in development and differentiation. Archives of histology and cytology, 56(4), 331-351. Naito M., Umeda S., Takahashi K. & Schultz L.D. (1997). Macrophage differentiation and granulomatous inflammation in osteopetronic mice (op/op) defective in the production of CSF-1. Molecular reproduction and development, 46,85-91. Nakamura K., Malykhin A. & Coggeshall K.M. (2000). The Src homology 2 domain-containing inositol 5phosphatase negatively regulates Fcγ receptor-mediated phagocytosis through immunoreceptor tyrosine-besed activation motif-bearing phagocytic receptors. Blood, 100(9), 3374-3382.
Referentielijst
92
Nathke I.S., Heuser J., Lupas A., Stock J., Turck C.W. & Brodsky F.M. (1992). Folding and trimerisation of clathrin subunits at the triskelion hub. The cell, 68(5), 899-910. Nauwynck H.J., Duan X., Favoreel H.W., Van Oostveldt P. & Pensaert M.B. (1999). Entry of porcine reproductive and respiratory syndrome virus into porcine alveolar macrphages via receptor mediated endocytosis. Journal of general virology, 80, 297-305. Newmyer S.L & Schmid L.S. (2001). Dominant-interfering Hsc70 mutants disrupt multiple stages of the clathrincoated vesicle cycle in vivo. The journal of cell biology, 152(3), 607-620. Nichols B.J. & Lippincott-Schwarz J. (2001). Endocytosis without clathrin coats. Trends in cell biology, 11, 406412. Nichols B.J., Kenworthy A.K., Polishchuk R.S., Lodge R., Roberts T.H., Hirschberg K., Phair R.D. & Lippincott-Schwarz J. (2001). Rapid recycling of lipid rafts markers between the cell surface and Golgi complex. Journal of cell biology, 153, 529-541. Nicoziani P., Vilhardt F., Llorente A., Hilout L., Courtoy P.J., Sandvig K. & van Deurs B. (2000). Role for dynamin in late endosomen dynamics and trafficking of the cation-independent mannose 6-phosfate receptor. Molecular biology of the cell, 11, 481-495. Nitschke L., Floyd H. & Crocker P.R. (2001). New functions for the sialic acid-binding adhesion molecule CD22, a member of the growing family siglecs. Scandinavian journal of immunology, 53, 227-234. Obermüller S., Kiecke C., von Figura K. & Höning S. (2002). The tyrosine motifs of LAMP1 en LAP determine their direct and indirect targetting to lysosomes, Journal of cell science, 115, 185-194. Ohlinger V.F, Weiland F., Haas B., Visser N., Ahl R., Mettenleiter T.C., Weiland E., Rziha H.J., Saalmuller A. & Straub O.C. (1991). Aetiological studies of the porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS). Tierarztliche Umschau, 46, 703-708. Ohno H., Fournier M-C., Poy G. & Bonifacino J.S. (1996). Structural determinants of interaction of tyrosinebased sorting signals with the adaptor medium chains. Journal of biological chemistry, 271(46), 29009-29015. Oleksiewicz M.B., Bøtner A., Nielsen J. & Storgaard T. (1999). Determination of 5’-leader sequences from radically disparate strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus reveals the presence of highly conserved sequence motifs. Archives of virology, 144, 981-987.
Referentielijst
93
Olkkonen V.M., Dupree P., Killisch I., Lütcke A., Zerial M. & Simons K. (1993). Molecular cloning and subcellular localisation of three GTP-binding proteins of the rab subfamily. Journal of cell science, 106, 1249-1261. Opdenakker G. & Van Damme J. (1991). De macrofaag. Tijdschrift voor geneeskunde, 47(5), 365-374. Paolo G.P. & Fox A.P. (1999). Tyrosine phosphorylation regulates rapid endocytosis in adrenal chromaffin cells. Journal of neuroscience, 19(22), 9739-9746. Pearse B.M.F., Smith C.S. & Owen D.J. (2000). Clathrin coat construction in endocytosis. Current opinion in structural biology, 10, 220-228. Pelkmans L. & Helenius A. (2001). Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular transport pathway to the ER. Nature cell biology, 3, 473-483. Pelkmans L. & Helenius A. (2002). Endocytosis via caveolae. Traffic, 3, 311-320. Pensaert M. & Vynckier A. (1993). Het porcien reproductief en respiratoir syndroom: een overzicht. Vlaamds diergeneeskundig tijdschrift, 62, 113-117. Pho M.T., Ashok A. & Atwood W.J. (2000). JC virus enters human glial cells by clathrin-dependent receptormediated endocytosis. Journal of virology, 74, 2288-2292. Phonphok Y. & Rosenthal K.S. (1991). Stabilisation of clathrin coated vesicles by amantadine, tromantadine and other hydrophobic amines. Federation of European biochemical societies, 281(1-2), 188-190. Pillay C.S., Eliott E. & Dennison C (2002). Endolysosomal proteolysis and its regulation. Biochemical journal, 363, 417-429. Piper R.C. & Luzio J.P. (2001). Late endosomes: sorting and partitioning in multivesicular bodies. Traffic, 2, 612-621. Pfeffer S.R., Dirac-Svejstrup A.B. & Soldati T. (1995). Rab GDP dissociation inhibitor: putting Rab GTPases in the right place. Journal of biological chemistry, 270(29), 17057-17059. Qualmann B., Kessels M.M. & Kelly R.B. (2000). Molecular links between endocytosis and the actin cytoskeleton, Journal of cell biology, 150(5), F111-F116. Ravetch J.V. & Bolland S. (2001). IgG Fc receptors. Annual reviews of immunology, 19, 275-290.
Referentielijst
94
Riederer M.A., Soldati T., Shapiro A.D.& Pfeffer S.R.(1994). Lysosome biogenesis requires Rab9 function and receptor recycling from endosomes to the trans-Golgi network. Journal of cell biology, 125(3), 573-582. Rode M., Berg T. & GjØen T. (1997). Effect of temperature on endocytosis and intracellular transport in the cell line SHK-1 derives from salmon head kidney. Comparative biochemistry and physiology, 117(4), 531-537. Rodman J.S.& Wandinger-Ness A. (2000). Rab GTPases coordinate endocytosis. Journal of cell science, 113, 183-192. Royle S. & Murell-Lagnado R.D. (2003). Constitutive cycling: a general mechanism to regulate cell surface proteins. Bioessays, 25, 39-46. Rossow K.D., Benfield D.A., Goyal S.M., Nelson E.A., Christopher-hennings J.& Collins J.E. (1996). Chronological immunohistochemical detection and localisation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in gnotobiotic pigs. Veterinary pathology, 33, 551-556. Roth T.F.& Porter K.R. (1964). Yolk protein uptake in the oocyte of the mosquito Aedes aegypti. Journal of cell biology, 20, 313-330. Schimmöller F., Simon I. & Pfeffer S.R. (1998). Rab GTPases, directors of vesicle docking. The journal of biological chemistry, 273(35), 22161-22164. Seabra M.C., Mules E.H.& Hume A.N. (2002). Rab GTPases, intracellular traffic and disease. Trends in molecular medicine, 8(1), 23-30. Sever S., Damke H. & Schmid S.L. (2000). Dynamin: GTP controls the formation of constricted coated pits, the rate limiting step in clathrin-mediated endocytosis. The journal of cell biology, 5, 1137-1147. Shafner D.A. (2002). Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current opinion in cell biology, 14, 76-81. Sheff D.L., Daro E.A., Hull M. & Mellman I. (1999). The receptor recycling pathway contains two distinct populations of early endosomes with different sorting functions. The journal of cell biology, 145(1), 123-139. Sibley D.R., benovic J.L., Caron M.G. & Lefkowitz R.J. (1987). Regulation of transmembrane signalling by receptor phosphorylation. Cell, 48, 913-922.
Referentielijst
95
Sieczkarski S.B. & Whittaker G.R. (2002a). Dissecting virus entry via endocytosis. Journal of general virology, 83, 1535-1545. Sieczkarski S.B. & Whittaker G.R. (2002b). Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin mediated endocytosis. Journal of virology, 76(20), 10455-10464. Smith C.J., Grigorief N. & Pearse B.M.F. (1998). Clathrin coats at 21Å resolution: a cellular assembly designed to recycle multiple membrane receptors. European molecular biology organisation, 17, 4943-4953. Snijder E.J. & Meulenberg J.M. (1998). The molecular biology of arterivirusses. Journal of general virology, 79, 961-979. Sodeik B. (2000). Mechanisms of viral transport in the cytoplasm. Trends in microbiology, 8, 465-472. Stedejek T., Stanckevicius A., Storgaard T., Oleksiewicz M.B., Belak S., Drew T.W. & Pejsak Z. (2002). Identification of radically different variants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in eastern Europe: towards a common ancestor for European and Amerivan viruses. Journal of general virology, 83, 18611873. Suarez P. (2000). Ultrastructural pathogenesis of the PRRS virus. Veterinary research, 31, 47-55. Suarez P., Diaz-Guerra M., Prieto C., Esteban M., Castro J.M., Nieto A. & Ortin J. (1996). Open reading frame 5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus as a cause of virus-induced apoptosis. Journal of virology, 70(5), 2876-2882. Takahashi K., Naito M. & Takeya M. (1996). Development and heterogeneity of macrophages and their related cell through their differentiation pathways. Pathology international, 46(7), 473-485. Thilo L., Stroud E. & Haylett T. (1995). Maturation of early endosomes and vesicular trafiic to lysosomes in relation to membrane recycling. Journal of cell science, 108, 1791-1803. Thomsen P., Roepstorff K., Stahlhut M. & van Deurs B. (2001). Caveolae are highly immobile plasma membrane microdomains, which are not involved in constitutive endocytic trafficking. Molecular biology of the cell, 13, 238250. Ungewickell E., Ungewickell H. & Holstein S.E.H. (1997). Functional interaction of the auxilin J domain with the nucleotide- and substrate-binding molecules of Hsc70. Journal of biological chemistry, 272(31), 19594-19600.
Referentielijst
96
Van Belzen N., Spaargaren M., Verkleij A.J. & Boonstra J. (1991). Interaction of the epidermal growth factor receptors with the cytoskeleton is related to receptor clustering. Journal of cellular physiology, 145(2), 365-375. Van Delft S., Govers R., Strous G.J., Verkleij A. & van Bergen en Henegouwen P.M.P. (1997). Epidermal growth factor induces ubiquitinain of Eps15. Journal of biological chemistry, 272(22), 14013-14016. Van den Berg T., Nath D., Ziltener H.J., Vestweber D., Fukuda M., van Die I. & Crocker P.R. (2001). Cutting edge: CD43 functions as a T cell counterreceptor for the macrophage adhesion receptor sialoadhesin (Siglec-1). Journal of immunology, 166, 3637-3640. Van Nieuwstadt A.P., Meulenberg J.J.M., Van Essen-Zandbergen A.P., Den Besten R.J., Bende R.J., Moorman R.J.M. & Wensvoort G. (1996). Proteins encoded by open reading frames 3 and 4 of the genome of Lelystad virus (arteriviridae) are structural proteins of the virion. Journal of general virology, 70, 4767-4772. Vanderheijden N., Delputte P.L., Favoreel H.W., Vandekerckhove J., Van Damme J, Van Woensel P.A. & Nauwynck H.J. (2003). Sialoadhesin mediates swine arterivirus entry into alveolar macrophages. Submitted. Varki A. (1997). Sialic acids as ligands in recognition phenomena. The Faseb journal, 11, 248-255. Verheije M.H., Olsthoorn R.C.L., Kroese M.V., Rottier P.J.M. & Meulenberg J.J.M. (2002). Kissing interaction between 3’ noncoding and coding sequences is essential for porcine arterivirus RNA replication. Virology, 76(3), 1521-1526. Vinson M., van der Merwe P.A., Sørge K., May A., Jones E.Y. & Crocker P.R. (1996). Characterisation of the sialic acid-binding stite in sialoadhesin by site-directed mutagenesis. Journal of biological chemistry, 271(16), 92679272. Wakeham D.E., Ybe J.A., Brodsky F.M. & Hwang P.K. (2000). Molecular structures of proteins involved in vesicle coat formation. Traffic, 1, 393-398. Wensvoort G., de Kluyver E.P., Pol J.M.A., Wagenaar F., Moormann R.J.M., Hulst M.M., Bloemraad R., den Besten A., Zetstra T.& Terpstra C. (1992). Lelystad virus, the cause of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome: a review of mystery swine disease research at Lelystad. Veterinary microbiology, 33, 185-193. Wensvoort G., Terpstra C., Pol J.M.A., ter Laak E.A., Bloemraad M., de Kluyver E.P., Kragten C., van Buiten L., den Besten A., Wagenaar F., Broekhuijsen J.M., Moonen P.L.J.M, Zetstra T., de Boer E.A., Tibben H.J., de Jong M.F., van ’t Veld P., Groenland G.J.R., van Gennep J.A., Voets M.Th. Verheijden J.H.M.& Braamskamp J. (1991). Mystery swine disease in the Netherlands: the isolation of lelystad virus. The veterinary quarterly, 13(3), 121-130.
Referentielijst
97
Whittaker G.R.& Helenius A. (1998). Nuclear import and export of virusses and virus genomes. Virology, 246, 1-23. Wilde A., Beattie E.C., Lem L., Riethof D.A., Liu S-H., Mobley W.C., Soriano P. & Brodsky F.M. (1999). EGF receptor signalling stimulates SRC kinase phosphorylation of clathrin, influencing clathrin redistribution and EGF uptake. Cell, 96, 677-687. Wigge P., Köhler K., Vallis Y., Doyle C.A., Owen D., Hunt S.P. & McMMahon H.T. (1997). Amphiphysin heterodimers: potential role in clathrin-mediated endocytosis. Molecular biology of the cell, 8, 2003-2015. Woods J.A., Lu Q., Ceddia M.A. & Lowder T. (2000). Exercise-induced modulation of macrophage function. Immunology and cell biology, 78, 545-553. Wu W.H., Fang Y., Farwell R., Steffen-Bien M., Rowland R.R.R., Christopher-Hennings J. & Nelson E.A. (2001). A 10-kD structural protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus encoded ny ORF2b. Virology, 287, 183-191. Zhang J.Q., Nicoll G., Jones C. & Crocker P.R. (2000). Siglec-9, a novel sialic acid binding member of the immunoglobulin superfamily expressed broadly on human blood leukocytes. Journal of biological chemistry, 275(29), 22121-22126. Zimmerman J.J., Yoon K.J., Wills R.W. & Swenson S.L. (1997). General overview of PRRSV: A perspective from the United States. Veterinary Microbiology, 55, 187-196. Zuk P.A.& Elferink L.A. (2000). Rab15 differentially regulates early endocytic trafficking. The journal of biological chemistry, 275(1), 26754-26764.
Inhoudsopgave
