Emberi megbetegedéseket okozó chlamydiák molekuláris diagnosztikai vizsgálata Doktori értekezés
Petrovay Fruzsina Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola
Témavezető: Prof. Gönczöl Éva, az MTA Doktora Hivatalos bírálók: Prof. Füst György, egyetemi tanár, az MTA Doktora Dr. Várkonyi Viktória, az orvostudományok kandidátusa Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Schaff Zsuzsa, egyetemi tanár, az orvostudományok doktora Szigorlati bizottság tagjai: Prof. Pajor Attila, egyetemi tanár, az orvostudományok doktora Dr. Kónya József, egyetemi docens, az orvostudományok doktora
Budapest 2009
Tartalomjegyzék 1. 2.
3.
4.
Rövidítések jegyzéke............................................................................................... 5 Bevezetés................................................................................................................. 6 2.1. A Chlamydiaceae család: történelmi áttekintés............................................ 6 2.2. XXI. század: új taxonómiai besorolás .......................................................... 7 2.2.1. Chlamydia genus .......................................................................................... 7 2.2.2. Chlamydophila genus ................................................................................... 7 2.3. Chlamydiák morfológiája, intracelluláris életciklusa................................... 8 2.4. A perzisztáló életforma............................................................................... 10 2.5. Chlamydia infekciók .................................................................................. 11 2.5.1. Chlamydia trachomatis által okozott fertőzések ........................................ 11 2.5.1.1. Epidemiológia..................................................................................... 11 2.5.1.2. Akut C. trachomatis fertőzések.......................................................... 13 2.5.1.2.1. Urogenitális infekciók .................................................................... 13 2.5.1.2.2. Újszülöttkori infekciók................................................................... 13 2.5.1.2.3. Lymphogranuloma venereum......................................................... 14 2.5.1.3. Krónikus C. trachomatis fertőzések ................................................... 15 2.5.1.3.1. Kismedencei gyulladás és meddőség ............................................. 15 2.5.1.3.2. Egyéb krónikus infekciók............................................................... 15 2.5.2. Chlamydophila psittaci okozta fertőzések.................................................. 16 2.5.2.1. Epidemiológia..................................................................................... 16 2.5.2.2. A psittacosis kórképe.......................................................................... 17 2.5.3. Chlamydophila pneumoniae okozta fertőzések.......................................... 18 2.5.3.1. Epidemiológia..................................................................................... 18 2.5.3.2. Akut légúti fertőzések......................................................................... 19 2.5.3.3. Krónikus fertőzések............................................................................ 20 2.5.3.4. C. pneumoniae potenciális szerepe az atherosclerosisban.................. 20 2.5.3.5. A cytomegalovirus (CMV) szerepe az atherosclerosisban................. 22 2.5.3.6. Atherosclerosis pathomechanizmusával kapcsolatos hazai kutatások 22 Célkitűzések .......................................................................................................... 24 3.1. C. trachomatis fertőzés prevalenciájának meghatározása, molekuláris tipizálása hazai veszélyeztetett populációban............................................ 24 3.2. C. psittaci fertőzés igazolása molekuláris módszerekkel potenciális betegekben................................................................................................. 25 3.3. C. pneumoniae és az atherosclerosis kapcsolatának vizsgálata ballonkatéteres koszorúér-tágításon átesett betegpopulációban ................ 25 Anyagok és módszerek.......................................................................................... 26 4.1. C. trachomatis fertőzés prevalenciájának meghatározása, molekuláris tipizálása hazai veszélyeztetett populációban............................................ 26 4.1.1. C. trachomatis törzsek................................................................................ 26 4.1.2. Klinikai minták........................................................................................... 26 4.1.3. DNS kivonás............................................................................................... 26 4.1.4. C. trachomatis PCR-rel történő kimutatása................................................ 27 4.1.5. Külső inhibitor kontroll PCR...................................................................... 27 4.1.6. Genotipizálás .............................................................................................. 28 4.1.6.1. C. trachomatis omp1 PCR .................................................................. 28 4.1.6.2. RFLP analízis ..................................................................................... 29
2
5.
6.
4.1.6.3. In silico RFLP..................................................................................... 29 4.1.6.4. Statisztikai analízis ............................................................................. 30 4.2. C. psittaci fertőzés igazolása molekuláris módszerekkel potenciális betegekben................................................................................................. 30 4.2.1. C. psittaci törzs ........................................................................................... 30 4.2.2. Klinikai minták........................................................................................... 30 4.2.3. Szerológiai vizsgálatok............................................................................... 31 4.2.4. DNS izolálás ............................................................................................... 32 4.2.5. C. psittaci PCR vizsgálatok ........................................................................ 32 4.2.5.1. ompA PCR .......................................................................................... 33 4.2.5.2. Omp2 PCR.......................................................................................... 33 4.3. C. pneumoniae és az atherosclerosis kapcsolatának vizsgálata ballonkatéteres koszorúér-tágításon átesett betegekben ............................ 34 4.3.1. Klinikai minták........................................................................................... 34 4.3.2. DNS izolálás ............................................................................................... 34 4.3.3. C. pneumoniae kimutatása.......................................................................... 35 4.3.4. Cytomegalovirus (CMV) kimutatása ......................................................... 35 4.3.5. Szerológiai vizsgálatok............................................................................... 36 4.3.6. Statisztikai analízis ..................................................................................... 36 Eredmények ........................................................................................................... 37 5.1. C. trachomatis fertőzés prevalenciájának meghatározása, molekuláris tipizálása hazai veszélyeztetett populációban............................................ 37 5.1.1. C. trachomatis prevalenciája ...................................................................... 37 5.1.2. Genotipizálás .............................................................................................. 38 5.2. C. psittaci fertőzés igazolása molekuláris módszerekkel potenciális betegekben................................................................................................. 40 5.2.1. Szerológiai eredmények ............................................................................. 40 5.2.2. PCR vizsgálatok ......................................................................................... 40 5.3. C. pneumoniae és az atherosclerosis kapcsolatának vizsgálata ballonkatéteres koszorúér-tágításon átesett betegpopulációban ................ 42 5.3.1. C. pneumoniae és CMV PCR eredményei és a PTCA közötti összefüggés42 5.3.2. A szerológiai vizsgálatok eredményei és a PTCA közötti összefüggés ..... 42 Megbeszélés .......................................................................................................... 44 6.1. C. trachomatis fertőzés prevalenciájának meghatározása, molekuláris tipizálása hazai veszélyeztetett populációban............................................ 44 6.1.1. A C. trachomatis prevalenciája magas rizikójú populációban ................... 44 6.1.2. C. trachomatis fertőzés prevalenciája és az életkor ................................... 45 6.1.3. C. trachomatis fertőzés prevalenciája hazánkban ...................................... 45 6.1.4. C. trachomatis genotipizálása .................................................................... 46 6.1.4.1. A gyakori szerotípusok eloszlása ....................................................... 47 6.1.4.2. Az egyes szerotípusok magasabb prevalenciájának lehetséges okai.. 47 6.1.5. A C. trachomatis fertőzés, mint népegészségügyi probléma ..................... 49 6.2. C. psittaci fertőzés igazolása molekuláris módszerekkel potenciális betegekben................................................................................................. 50 6.2.1. Klinikai kép és a betegség kimenetelében szerepet játszó tényezők .......... 50 6.2.2. Antibiotikum terápia................................................................................... 51 6.2.3. Laboratóriumi diagnosztika........................................................................ 52 6.2.4. Veszélyeztetett populációk......................................................................... 54
3
6.3.
7. 8. 9. 10. 11.
C. pneumoniae és az atherosclerosis kapcsolatának vizsgálata ballonkatéteres koszorúér-tágításon átesett betegpopulációban ................ 54 6.3.1. C. pneumoniae és CMV DNS jelenléte a perifériás vérben és a PTCA beavatkozás közötti összefüggés ............................................................... 55 6.3.2. C. pneumoniae ellenanyagszint-változás és a PTCA beavatkozás közötti összefüggés................................................................................................ 56 Következtetések – új eredmények ......................................................................... 59 Összefoglalás ......................................................................................................... 61 Irodalomjegyzék .................................................................................................... 63 Saját publikációk jegyzéke .................................................................................... 79 Köszönetnyilvánítás .............................................................................................. 82
4
1. Rövidítések jegyzéke ATP
adenozin-trifoszfát
BSA
bovine serum albumin
CDC
Centers for Disease Control and Prevention
cHSP
chlamydia hősokk-protein
CMV
cytomegalovirus
COPD
chronic obstructive pulmonary disease
CRP
cystein-rich outer membrane protein
DFA
direkt fluoreszcens antitest
dNTP
dinukleozid-trifoszfát
EBV
Epstein-Barr virus
EIA
enzyme immunoassay
ELISA
enzyme linked immunosorbent assay
HSV
herpes simplex virus
Ig
immunglobulin
LDL
low density lipoprotein
LGV
lymphogranuloma venereum
LPS
lipopoliszacharid
MIF
mikroimmunfluoreszcens
MOMP
major outer membrane protein
NTP
nukleozid-trifoszfát
OEK
Országos Epidemiológiai Központ
PBS
phosphate buffered saline
PCR
polymerase chain reaction
PID
pelvic inflammatory disease
PTCA
percutaneus transluminal coronary angioplasty
RFLP
restriction fragment length polymorphism
STD
sexually transmitted disease
TBE
tris borát EDTA
VD
variábilis domén
WHO
World Health Organization
5
2. Bevezetés 2.1.
A Chlamydiaceae család: történelmi áttekintés
Klinikai szempontból a legfontosabb, emberben megbetegedést okozó chlamydiák taxonómiailag a Chlamydiales renden belül a Chlamydiaceae családba tartoznak. Az emberi
szemre
lokalizálódó,
chlamydiák
okozta
megbetegedésekhez
hasonló
kórképekről szóló feljegyzések már az ókori kínai és egyiptomi írásokban is megtalálhatóak. Az első összefüggést, amely szerint a trachomás szembetegségért egy epithelsejten belüli vakuolumban található kórokozó tehető felelőssé, Halberstaedter és von Prowazek ismerte fel 1907-ben. A következő évtizedben Lindner és munkatársai hasonló zárványtesteket találtak újszülöttek kötőhártya epithelsejtjeiben és szüleik cervikális-, illetve urethra mintáiban is (Halberstaedter és von Prowazek 1907, Lindner 1910). A lymphogranuloma venereum (LGV) kórképét már a 18. században leírták, azonban mint önálló venerológiai megbetegedést először Durand és munkatársai ismerték fel 1913-ban (Durand és mtsai 1913). 1925-ben Siegmund Frei az LGV diagnosztikájához kifejlesztette a Frei-féle antigén tesztet. 1929-30-as évek psittacosis járványai kapcsán kiindult kutatások közül elsőként 1930ban Bedson és munkatársai találtak bizonyítékot a járványok etiológiájára vonatkozóan, amely szintén egy intracelluláris zárványt képző parazita kóroki szerepét igazolta (Bedson és mtsai 1930). A chlamydiákat sokáig vírusoknak tekintették, mivel a kórokozókat mesterséges táptalajon nem, de más vírusokhoz hasonlóan tojásban, a csirkeembrióban sikeresen lehetett tenyészteni és a baktérium-membránszűrőn nem akadtak fenn. Amikor 1965-ben Gordon és Quan szövetkultúrából sikeresen izolálták a trachoma kórokozóját, majd az elektronmikroszkópos technika fejlődésével a kórokozóban
bakteriális
riboszómákat
és
sejtfalstruktúrákat
is
azonosítottak,
nyilvánvalóvá vált, hogy nem a vírusok közé tartoznak (Gordon és Quan 1965). 1966ban Page a morfológiailag hasonló, psittacosis, trachoma, lymphogranuloma venereum kórképek kialakulásáért felelős organizmusoknak a Rickettsiales renden belül egy különálló, Chlamydia genusba történő besorolását javasolta, majd 1968-ban megtörtént két faj, a Chlamydia psittaci (C. psittaci) és Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) genuson belüli elkülönítése (Page 1966, 1968). A későbbiekben, 1971-ben Storz és Page javasolták, hogy a Chlamydia genust magába foglaló Chlamydiaceae családot az
6
egyedülálló életciklusukból adódóan sorolják új rendbe (Chlamydiales) (Storz és Page 1971). Az 1990-es évek elejéig a Chlamydia genus két új fajjal bővült. A harmadik humánpatogén chlamydiát viszonylag későn fedezték fel. Az első törzset (TW-183) már 1965-ben egy tajvani gyermek kötőhártyájából izolálták tojásembrióban, azonban csak 1971-ben sikerült sejtkultúrában tenyészteni, ahol a Chlamydia psittaci-val mutatott morfológiai hasonlóságot. A baktérium kóroki szerepére csak 1983-ban derült fény, amikor pharyngitises betegből sikerült egy légúti törzset (AR-39) izolálni. A fertőzés első klinikai leírása 1986-ban egy szero-epidemiológiai tanulmányban jelent meg. A két izolátum alapján a TWAR-nak elnevezett új törzset különálló Chlamydia psittaci törzsként azonosították, és csak 1989-ben nyilvánították Chlamydia pneumoniae (C. pneumoniae) néven új fajnak (Kuo és mtsai 1986, Grayston és mtsai 1989a). 1992-ben Fukushi és Hirai DNS-DNS homológia vizsgálatok alapján a Chlamydia genus negyedik fajaként írta le a Chlamydia pecorum elnevezésű, erszényesekből, kérődzőkből, sertésből izolált állati patogén törzseket (Fukushi és Hirai 1992). 2.2. XXI. század: új taxonómiai besorolás 1999-ben Everett és munkatársai a filogenetikai vizsgálatokra alkalmas, konzervatív 16S
és
23S
riboszóma
alegységek
RNS
génszekvenciáinak
analízisével
a
Chlamydiaceae család egyetlen genusa helyett két új genus létrehozását propagálták (Everett és mtsai 1999). 2.2.1.
Chlamydia genus
Az emberben megbetegedést okozó Chlamydia trachomatis mellett két újonnan elnevezett, rágcsálókból, sertésből izolált, állati megbetegedést okozó fajt soroltak a genusba, Chlamydia muridarium és Chlamydia suis néven, korábban mindkettőt a Chlamydia trachomatis biotípusainak tartották (1. táblázat). 2.2.2.
Chlamydophila genus
A genusba került Chlamydophila néven a Chlamydia pneumoniae, a madarakban izolált Chlamydia psittaci törzsek és a Chlamydia pecorum, valamint különféle háziállatokban megbetegedéseket okozó három új faj: Chlamydophila abortus, Chlamydophila felis,
7
Chlamydophila caviae, amelyeket korábban a Chlamydia psittaci törzsek közé soroltak (1. táblázat). 1. táblázat. Chlamydiaceae család Régi taxonómia
Új taxonómia Chlamydia trachomatis
Chlamydia trachomatis
Chlamydia muridarium Chlamydia suis Chlamydophila psittaci
Chlamydia psittaci
Chlamydophila abortus Chlamydophila felis Chlamydophila caviae
Chlamydia pneumoniae
Chlamydophila pneumoniae
Chlamydia pecorum
Chlamydophila pecorum
2.3. Chlamydiák morfológiája, intracelluláris életciklusa A chlamydiák obligát, két fázisból álló intracelluláris életciklusa egyedülálló a baktériumok között, az állatvilágban minden gerinces osztályban képesek fertőzést okozni. A chlamydiák intracelluláris adaptációja a törzsfejlődés korai szakaszában, már az egysejtű eukariótákban végbemehetett, majd ezt követte a többsejtűekbe történő radiációjuk és koevolúciójuk (Everett és mtsai 1999). A chlamydiák egymást váltó, morfológiailag eltérő két formája a fertőzőképes elemi test és a reproduktív, úgynevezett retikuláris test. A sejtmembránjuk körüli burok stabilitásáért, a többi eubaktériumtól eltérően nem a peptidoglikán sejtfal felelős. Bár a muraminsavból felépülő peptidoglikán váz szintéziséhez szükséges gének a chlamydia genomban
kódolva
megtalálhatóak,
klasszikus
peptidoglikán
sejtfallal
nem
rendelkeznek (Hammerschlag 2002). A sejtfal rigiditását elsősorban három génen kódolt, magas ciszteintartalmú külső burok fehérjék (cystein-rich outer membrane protein, CRP) adják, ezek alkotóelemei közötti diszulfid hidak stabilizálják az elemi test sejtfalát. A CRP csoportba tartozik a sejtadherenciában is szerepet játszó major outer membrane protein (MOMP), amely a C. trachomatis és a C. psittaci esetében a sejtfelszínen található és immundomináns antigén tulajdonsággal rendelkezik. A
8
sejtfalban található genus specifikus antigén tulajdonságú lipopoliszacharid a burok további merevítését teszi lehetővé (Raulston 1995). A chlamydiák energiaparaziták lévén, a fehérjeszintézishez szükséges adenozintrifoszfátból (ATP) származó energiát a gazdasejtből nyerik, bár az ATP génjei a genomban kódolva megtalálhatóak. Ezek a gének azonban, feltehetően az intracelluláris életformához történt adaptálódás következtében inaktívak. A DNS szintézishez szükséges nukleozid-trifoszfátok (NTP) közül hármat szintén a gazdasejttől vonnak el, egyedül a CTP szintézisére képesek (Hammerschlag 2002). A chlamydia elemi testek 0,2-0,4 mikrométer átmérőjű, körteformájú, vagy kerek képletek. A chlamydiák fejlődési ciklusában csak az elemi test formák fertőzőképesek, extracelluláris környezetben azonban az anyagcseréjük mindaddig inaktív, amíg a gazdasejt membránjához nem kapcsolódnak. A retikuláris testek körülbelül 1 mikrométer átmérőjűek, és a gazdasejten belüli vakuolumban találhatóak meg. Sejtfaluk az elemi testekhez képest sérülékenyebb, mivel a merevítésért felelős CRP burokfehérjék közül kettő hiányzik (Raulston 1995). A retikuláris testek aktív anyagcserével rendelkeznek, a citoplazmájukban sok riboszóma található, DNS állományuk diffúzan helyezkedik el. A chlamydiák szaporodási ciklusa más baktériumoktól eltérően igen hosszú, 48-72 óra. A fertőzést követően az elemi testek a gazdasejthez elektrosztatikusan kötődnek, majd endocitózissal vagy fagocitózissal kerülnek be a sejtbe. A vakuolumnak a gazdasejt lizoszómáival való egyesülése gátolt, a chlamydiák ezáltal képesek intracelluláris életmódot folytatni (Abdelrahman és Belland 2005). A vakuolumban az elemi test 8 órán belül retikuláris testté differenciálódik. A citoplazmából tápanyagok, metabolitok jutnak a vakuolumba, a retikuláris test a gazdasejt nukleotidjait és ATP molekuláiból származó energiát felhasználva folyamatosan osztódik, majd mintegy 36 óra múlva a retikuláris testek elemi testekké alakulnak. A gazdasejtben egy vakuolumon belül akár 500-1000 elemi test is jelen lehet, ez azonban a sejt normál működését kevéssé befolyásolja (Hammerschlag 2002). Az elemi testek a ciklus végén, körülbelül 48 óra múlva, a sejt pusztulásával járó sejtlízis útján, vagy a gazdasejtet nem károsító exocitózissal kiszabadulnak, és további sejteket fertőznek (1. ábra).
9
1. ábra. A chlamydiák életciklusa (forrás:www.cassio-lynm.com/illus) 2.4.
A perzisztáló életforma
A chlamydiák fejlődési ciklusuk során kedvezőtlen külső környezeti hatások következtében úgynevezett perzisztáló állapotba kerülhetnek. A perzisztáló forma egy életképes, de nem fertőző fejlődési állapot, amely a gazdasejttel hosszan tartó kapcsolatot eredményez (Hogan és mtsai 2004). A retikuláris test morfológiai változást mutat, alakja megnagyobbodik és pleomorf lesz, a fejlődési ciklus ebben a késői állapotában maradva az osztódás és elemi testté differenciálódás folyamatai gátoltak. A chlamydiák a perzisztáló állapotból újra reaktiválódhatnak és ismét fertőzőképes elemi testekké alakulhatnak (1. ábra). A perzisztáló létforma és a chlamydiák okozta krónikus gyulladásos folyamatok, betegségek kialakulásában nagy szerepet kapnak a stressz hatására termelődő chlamydia hősokk-proteinek (cHSP). A perzisztáló állapot kialakulásának folyamatát elsősorban in vitro modellekben vizsgálták. Chlamydiával fertőzött szövettenyészetekben antibiotikumos kezelés, tápanyagok (például aminosavak) megvonása, citokinek, elsősorban interferon-gamma kezelések indukálták a perzisztáló forma kialakulását (Hammerschlag 2002). Molekuláris szinten zajló összetett folyamatok vizsgálatával kimutatták, hogy a chlamydia gének szabályozása is megváltozik a perzisztáló állapot in vitro kialakulása
10
során, egyes gének, mint például az immunogén MOMP és CRP fehérjéket kódoló gének kifejeződése csökken, elkerülve a gazdaszervezet immunitásának kialakulását. A stresszre adott válaszként a cHSP-ket kódoló gének kifejeződése ezzel szemben fokozódik, hatására a chaperonként funkcionáló hősokk-fehérjék mennyisége megnő (Hogan és mtsai 2004). A folyamat in vivo vizsgálatai elsősorban állatkísérleteken és klinikai adatokon alapulnak. A perzisztáló állapot in vivo létezését igazoló meggyőző bizonyítékokhoz sorolható a megváltozott morfológiájú retikuláris testek azonosítása fertőzött egyedek szöveteiben, valamint rekurrens fertőzések kialakulása. További bizonyítékként szolgált a chlamydia DNS, -antigének, vagy -RNS detektálása annak ellenére, hogy tenyésztéssel nem lehetett a kórokozót izolálni a krónikus gyulladást mutató anatómiai helyekről. Mivel az RNS nagyon bomlékony molekula, in vivo detektálása életképes, de nem tenyészthető chlamydia jelenlétére utal (Hogan és mtsai 2004). 2.5.
Chlamydia infekciók
2.5.1.
Chlamydia trachomatis által okozott fertőzések
2.5.1.1.
Epidemiológia
A C. trachomatis világszerte az egyik leggyakoribb szexuális úton terjedő bakteriális kórokozó. A WHO adatai alapján a friss fertőzések incidenciája globálisan évente mintegy 92 millióra, Nyugat-Európában 5 millióra becsülhető (WHO 2001). A C. trachomatis immundomináns antigénje, a MOMP tipizálása révén a kórokozónak 15 alap szerotípusát különítették el (Caldwell és mtsai 1981). A C. trachomatis MOMP antigénjét kódoló omp1 gén négy variábilis szekvenciájú doménből és az ezek közt elhelyezkedő
öt
konstans
doménből
áll.
A
variábilis
domének
szekvencia
polimorfizmusából eredő, eltérő aminosav összetételű MOMP antigének felelősek a különböző C. trachomatis szerotípusok létéért. A szerotípusok az általuk okozott kórképek szerint csoportosíthatóak, ezeket biotípusnak is nevezik. A trachoma kialakulásáért felelős A-C szerotípusok a trópusi égövön endemikusan fordulnak elő, ezeken a területeken a vakság kialakulásának legfőbb kóroki tényezői (Thylefors és mtsai 1995). A legnagyobb csoport, a világszerte elterjedt D-K szerotípusok urogenitális és újszülöttkori infekciókat okoznak. A három L (1-3) szerotípus a trópusi,
11
szubtrópusi területeken előforduló szisztémás megbetegedés, a lymphogranuloma venereum (LGV) kialakulásáért felelősek. A C. trachomatis szerotípusok aminosav homológia alapján három csoportba sorolhatóak: a B-csoportba a B, D, E, L1, L2 szerotípusok; a C-csoportba az A, C, H, I, J, K, L3 szerotípusok, az úgynevezett átmeneti csoportba az F és G szerotípusok tartoznak (Yuan és mtsai 1989). A C. trachomatis szerotípusok meghatározása a laboratóriumi diagnosztikában rutinszerűen nem történik, az egyes szerotípusok azonosítása genotipizáló módszerekkel elsősorban epidemiológiai felmérésekhez nyújt segítséget. A genotipizáló metodikákat emellett klinikai vizsgálatokban, az egyes szerotípusok okozta fertőzések és a klinikai tünetek közötti összefüggések, valamint a szerotípusok patogenitásbeli eltéréseinek kutatásában alkalmazzák (Lysén és mtsai 2004, Dean és mtsai 1995, Morré és mtsai 2000, van Duynhoven és mtsai 1998). Az urogenitális C. trachomatis szerotípusok közül világszerte a D, E és az átmeneti csoportba tartozó F és G szerotípusok előfordulása a leggyakoribb (Gao és mtsai 2007, Lan és mtsai 1993, 1995b, Lima és mtsai 2007, Lysén és mtsai 2004, Morré és mtsai 2000, Ngandjio és mtsai 2004). Az urogenitális C. trachomatis fertőzések prevalenciája világszerte eltérő, és számos rizikófaktor függvénye. Ezek közül első helyen az életkor és a szexuális partnerek száma szerepel (Norman 2002). További rizikófaktornak tekinthető a megfelelő védekezés hiánya, a rendszertelen óvszerhasználat, a korábbi fertőzés ténye, a rossz szociális körülmények. A fertőzés gyakoriságát tekintve magas rizikócsoportba tartoznak a 25 év alatti fiatalok, valamint azok, akiknek egy éven belül egynél több szexuális partnere volt (CDC 2006). Értelemszerűen a magas rizikócsoportba sorolhatóak a prostituáltak és a homoszexuálisok is. A fiatalok közötti magasabb C. trachomatis prevalencia magyarázataként a szexuális szokások mellett biológiai és immunológiai okok is valószínűsíthetőek. A 25 év feletti női populációkban a C. trachomatis prevalenciájának csökkenésében az érettebb, ellenállóbb cervikális hámréteg, a nyálkahártya immunitása is szerepet játszhat, amely reinfekció esetén gyorsabban eliminálja kórokozót (Norman 2002, Pal és mtsai 2001). A C. trachomatis fertőzés horizontális transzmissziójának valószínűsége egyszeri szexuális együttlét után ismeretlen. Mindemellett szexuálisan aktív párok esetén, amennyiben az egyik partner fertőzött, a C. trachomatis fertőzési rátája magas, 40-60%
12
közötti érték (Norman 2002). A C. trachomatis fertőzés vertikális transzmissziója során az újszülött a szülőcsatornán áthaladva fertőződhet. C. trachomatis-t hordozó, kezeletlen anyák újszülötteinek 50-75%-a kolonizálódik a kórokozóval (Hammerschlag 2004). 2.5.1.2.
Akut C. trachomatis fertőzések
2.5.1.2.1. Urogenitális infekciók Az akut fertőzéshez gyakran nem társulnak tünetek, a WHO adati szerint a C. trachomatis tünetmentes előfordulása nők esetében 70%, férfiak körében 50% körül van (Gerbase és mtsai 1998). Aktív szexuális életet élő nők körében jelentkező leggyakoribb tünetek a mukopurulens cervicitis, valamint a steril pyuriával járó urethritis. Férfiaknál elsősorban urethritis tünetei jelentkeznek, amely dysuriával, purulens, vagy tiszta váladékozással jár. Homoszexuális férfiak esetében a fertőzés végbélgyulladást okozhat (Hammerschlag 2004, Paavonen és Eggert-Kruse 1999). Nem elhanyagolható tünet az extragenitális szövődményként kialakuló felnőttkori conjunctivitis, amely elsősorban autoinokuláció révén jön létre (Postema és mtsai 1996). Az akut C. trachomatis fertőzések diagnosztikájára az antigén kimutatáson alapuló direkt fluoreszcens antitest (DFA) technikák, enzim-kötött immunszorbens vizsgálatok (EIA), valamint a nukleinsav alapú metodikák ajánlottak (CDC 2006). 2.5.1.2.2. Újszülöttkori infekciók C. trachomatis-t hordozó, kezeletlen anyák újszülötteinek 20-50%-ánál a fertőzés következtében
kialakuló
leggyakoribb
kórkép
az
újszülöttkori
conjunctivitis
(ophthalmia neonatorum) (Balla 2009, Norman 2002). A fertőződést követő 5-14 nap után belövellt kötőhártya és enyhe váladékozással járó tünetek alakulnak ki, amelyek bő gennyes váladék képződésével és a kötőhártya ödémásodásával súlyosbodhatnak, (Numazaki és mtsai 1989, Hammerschlag 2004). A szüléskor fertőződött csecsemők 70%-ánál az orr-garatüregben is megtelepszik a kórokozó. Mind a conjunctivitisek, mind a nasopharynigitisek egy része spontán gyógyul. Alsó légúti fertőzés és pneumonia 4-12 hetes korban a fertőzött újszülöttek 20%-ánál jelentkezik (Balla 2009, Hammerschlag 2004). Jellemző tünetei a rohamokban jelentkező köhögés, orrfolyás és szapora lélegzetvétel, illetve a mellkasi röntgenfelvételen észlelhető hiperinfiltráció
13
(CDC 2006). Differencáldiagnosztikai szempontból kiemelt fontosságú a speciesszintű labordiagnosztika, amely lehetővé teszi a C. trachomatis eredetű pneumonia Bordetella pertussis fertőzéstől történő elkülönítését és az adekvát kezelést. Újszülöttkori conjunctivitis, illetve pneumonia esetében légúti minták DFA, vagy DNS kimutatáson alapuló technikával történő vizsgálata javasolt (CDC 2006). A szerológiai metodikák közül mikroimmunfluoreszcens (MIF) vizsgálattal a C. trachomatis specifikus IgM detektálása 1:32 titerben az akut fertőzés diagnózisát támasztja alá (Balla 2009). 2.5.1.2.3. Lymphogranuloma venereum A C. trachomatis L1, L2 és L3 szerotípusai állatmodellekben az A-K szerotípusokhoz képest virulensebbek és invazívabbak. Az L szerotípusok az A-K szerotípusokkal ellentétben nem a szem, vagy az urogenitális tájék hámsejtjeit fertőzik, hanem a monocitákat és a makrofágokat, majd általuk a környéki nyirokcsomókba jutnak. Klinikai tüneteket tekintve a klasszikus LGV lefolyását három stádium jellemzi. A primer stádiumban 3-30 napon belül a genitális tájékon fájdalmatlan fekély jelenik meg. A második stádiumban a lágyéki nyirokcsomókban fájdalmas duzzanat alakul ki, főként a férfiaknál jellemző az unilaterális lágyéki bubo tünete. A harmadik stádiumban a kezeletlen krónikus fertőzés a nyirokszövet destrukcióját okozhatja, szisztémássá válhat, a genitáliákon esetenként elefantiázis észlelhető (Mabey és Peeling 2002). A sokáig a trópusokon endemikusnak tekintett betegség a közelmúltban NyugatEurópában bukkant fel homoszexuális férfiak között. Először 2003-ban, Hollandiában diagnosztizáltak járványszerű megbetegedéseket, később több nyugat-európai ország, az Egyesült Államok és Kanada is jelentett hasonló eseteket (van de Laar 2006). A homoszexuálisok fő tünetei a genitális fekélyen kívül haemorrhagiás proctitis, analis mucopurulens váladékozás, általános gyengeség és láz volt. Az Európában azonosított járványszerű LGV megbetegedés, bár egy magas rizikócsoportba tartozó szűk populációra korlátozódik, növekvő fontosságú egészségügyi problémát jelent. Az LGV diagnosztikájában, a C. trachomatis pozitív mintákban az L1-3 szerotípusok a gyakori urogenitális D-K szerotípusoktól történő elkülönítésében egyedül a genotipizálás nyújthat segítséget (Alexander és mtsai 2008).
14
2.5.1.3.
Krónikus C. trachomatis fertőzések
2.5.1.3.1. Kismedencei gyulladás és meddőség A tünetmentes, vagy kezeletlen C. trachomatis fertőzés az alsó genitális traktusból átterjedhet a felső genitális traktusba. Az ascendáló fertőzés nőkben kismedencei gyulladás (pelvic inflammatory disease, PID) kialakulásához vezethet, amely a méhet, petevezetékeket érintheti. A PID jellemző tünetei az alhasi fájdalom, endometritis, salpingitis, de kismedencei peritonitis és perihepatitis is kialakulhat (Paavonen és Eggert-Kruse 1999). A chlamydia eredetű PID meddőséghez, valamint méhen kívüli terhességhez vezethet. Egyszeri PID esemény után a tubáris eredetű meddőség kockázata 10%, ezt az értéket minden egyes ismétlődő PID esemény megduplázza (Paavonen és Eggert-Kruse 1999). A meddőség patogenezisében nagy szerepet tulajdonítanak a perzisztáló chlamydia fertőzés során keletkező chlamydia hősokkproteineknek (cHSP). A hősokk-proteinekre jellemző, hogy aminosav szekvenciájuk evolúciósan igen konzervált. A 60 kDa chlamydia HSP (HSP-60) ellen termelődő ellenanyagok a nagyfokú, 48%-os homológia következtében az emberi szervezet saját HSP-jeivel is keresztreakcióba léphetnek, amely során autoimmun folyamatok alakulnak ki (Paavonen és Lehtinen 1994). Ezek az immunpatológiai folyamatok kismedencei összenövések kialakulását, a petevezetékek maradandó anatómiai és funkcionális károsodását eredményezhetik, ezáltal meddőséghez és a méhen kívüli terhesség kockázatának növekedéséhez vezetnek. A szerológiai vizsgálatok a C. trachomatis ellenes specifikus ellenanyagok detektálása révén elsősorban a korábban lezajlott vagy a krónikus, perzisztáló fertőzésekre deríthetnek fényt. 2.5.1.3.2. Egyéb krónikus infekciók A krónikus ascendáló C. trachomatis fertőzés további szövődménye lehet terhesekben a korai burokrepedés, koraszülés. Fiatal férfiakban a C. trachomatis fertőzés eredményeként gyakori a mellékhere fájdalmas duzzanata, az epididymitis kialakulása. Mindkét nemben a krónikus fertőzés extragenitális manifesztációjaként arthritis tünetei jelentkezhetnek (Paavonen és Eggert-Kruse 1999). A trópusokon endemikus szembetegség, a trachoma kialakulása az A-C szerotípusokkal történő ismétlődő, krónikus fertőzés következménye. A betegség fő vektorai a legyek. A
15
fertőzést követően a felső, belső szemhéj gyulladt megvastagodik, fibrózussá válhat. Később megrövidülve befelé fordul, így a szempillák folyamatosan irritálják a szaruhártyát. A conjunctiva ismétlődő, krónikus gyulladása vakság kialakulásához vezet (Burton 2007). 2.5.2.
Chlamydophila psittaci okozta fertőzések
A zoopatogén C. psittaci számos vadon élő madárfaj és háziszárnyas kórokozója, először papagájfélékből izolálták, ezt követően több száz madárfajból is kimutatták (Peeling és Brunham 1996). A C. trachomatis-hoz hasonlóan MOMP szerotipizálása alapján hat C. psittaci szerotípust (A-F) azonosítottak, ezeket később genotipizáló módszerekkel is elkülönítették (Andersen 1991, Sayada és mtsai 1995, Vanrompay és mtsai 1997, Geens és mtsai 2005) (2. táblázat). Az egyes szerotípusok előfordulása endemikus, illetve egyes madárrendekhez mutat preferenciát (Vanrompay és mtsai 1997, Geens és mtsai 2005). 2. táblázat. C. psittaci szerotípusok Szerotípus Szerotípus izolátumok előfordulása a preferált madárrendek között A
Endemikus: Psittaciformes (papagájalakúak)
B
Endemikus: Columbiformes (galambalakúak)
C
Anseriformes (lúdalakúak)
D
Galliformes (tyúkalakúak)
E
Nincs specifikus gazdaszervezet: kacsa, galamb, strucc, nandu
F
Ritka: egy izolátum, papagáj
2.5.2.1.
Epidemiológia
A C. psittaci fertőzés madarakról emberre is átterjedhet és különböző súlyosságú megbetegedéseket okozhat. A kórokozót a madarak gyakran tünetmentesen hordozzák, a perzisztáló fertőzés stressz hatására, például háziszárnyasok esetén a tömeges tartás, a szegényes táplálás, vagy a szállítás következtében aktiválódhat.
16
A C. psittaci a madarak kiszáradt székletében, légúti váladékaiban hónapokig fertőzőképes marad. A baktérium transzmissziója általában száraz székletből, vagy a tollból képződött aeroszol belélegzésével jön létre (Smith és mtsai 2005). A psittacosis foglalkozási megbetegedés, a betegség kockázatának leginkább kitett személyek a madártenyésztők, háziszárnyas feldolgozó üzemek alkalmazottai, állatorvosok, kisállatkereskedők, állatkerti dolgozók, de a házi kedvencként tartott madarak is veszély forrásai lehetnek (Heddema és mtsai 2006a, Kovacova és mtsai 2007, Kaibu és mtsai 2006, Smith és mtsai 2005). A fertőzött madarakkal való szoros és folyamatos kontaktus psittacosis járványok kialakulásához is vezethet. Az első dokumentált psittacosis járványokat 1929-30 között, Argentínából exportált fertőzött papagájok okozták, a kórokozó és az általa okozott megbetegedés közötti összefüggés felfedezése ettől kezdve datálható (Bedson és mtsai 1930). Magyarországon 2005-ben két nagy járványt jelentettek, a fertőzés mindkét esetben egy baromfi feldolgozó üzemben történt, összesen 140 esetet azonosítottak, a mortalitási ráta 1,4% volt (Országos Epidemiológiai Központ 2007). 2.5.2.2.
A psittacosis kórképe
A betegség a fertőzést követő 5-14 napos inkubációs periódus után influenza-szerű tünetekkel kezdődik, láz, hidegrázás, fejfájás, rosszullét, izomfájdalom jelentkezhet. Gyakran észlelhető improduktív köhögés, amelyet légzési nehézség kísérhet. Súlyosabb esetekben a tüdők érintettsége is megfigyelhető, pneumonia alakulhat ki. A mellkasi röntgenfelvételen lobáris, vagy intersticiális beszűrődés látható, mindkét tüdőfél érintett lehet (Smith és mtsai 2005). A psittacosis a klinikai tünetek alapján nem különíthető el más, közösségben szerzett pneumonia kórképétől, ezért az anamnézis felvételekor a terápia szempontjából döntő fontosságú a lehetséges madárkontaktus felderítése. A psittacosis egyik ritkább következménye a súlyos, gépi lélegeztetést igénylő légzési elégtelenség. Kialakulásához több ok is vezethet, az idős kor, a legyengült, rossz egészségi állapot és nem utolsósorban a betegség fel nem ismeréséből adódó helytelen antibiotikum-terápia. A fertőzés mortalitása a CDC adatai alapján napjainkban 1% alatt van, azonban a betegség előrehaladott, súlyos állapotában szenvedők esetében a prognózist a magas
17
életkor, a tüdő kétoldali érintettsége, hypoxemia, leukopenia, vesefunkciók károsodása, a többszervi elégtelenség negatív irányban befolyásolja (Verweij és mtsai 1995). A C. psittaci fertőzés diagnosztikájában a CDC által ajánlott standard diagnosztikai módszer elsődlegesen a MIF vizsgálat (Smith és mtsai 2005). 2.5.3.
Chlamydophila pneumoniae okozta fertőzések
2.5.3.1.
Epidemiológia
A C. pneumoniae világszerte elterjedt légúti kórokozó, az epidemiológiájára vonatkozó adatok elsősorban mikroimmunfluoreszcens szerológiai tanulmányokon alapulnak. A fertőzés szeroprevalenciája felnőtt populációkban magas, 50% feletti érték (Kuo és mtsai 1995). A kórokozóval történő első fertőződés iskoláskorú gyermekek között a leggyakoribb, 5 év alatti kisgyermekek infekciója ritka. Az átfertőzöttségre utaló immunglobulin G (IgG) ellenanyagszint szerinti prevalencia eloszlás korcsoportos bontásban vizsgálva folyamatosan emelkedik. Fiatalok körében, az 5-14 év közötti drasztikus emelkedést követően az IgG prevalenciája fokozatosan tovább növekszik (Kuo és mtsai 1995). Magyarországon egy 1992-ben megírt tanulmány szerint 20 éves korra a vizsgált populáció körülbelül 62%-os átfertőződöttséget mutatott (Marton és mtsai 1992). 2008-ban, laboratóriumunkban (Országos Epidemiológiai Központ, OEK Bakteriológia II. Osztály) elvégzett szerológiai vizsgálatok alapján a C. pneumoniae átfertőzöttség prevalenciájában szintén egyenletes emelkedés tapasztalható, 60 éves korra az IgG prevalenciája megközelítette a 60%-ot (3. táblázat).
3. táblázat. C. pneumoniae IgG prevalenciája (2008) Korcsoport (év)
Vizsgált minták
Pozitív IgG (%)
0-5 5-10 10-15 15-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90
88 58 53 56 125 142 112 130 94 31 7
2 (2,3) 0 (0) 6 (11,3) 14 (25) 42 (33,6) 62 (43,7) 42 (37,5) 76 (58,5) 44 (46,8) 16 (51,6) 3 (42,9)
18
A C. pneumoniae elsősorban humánpatogén kórokozó, cseppfertőzéssel terjed, és a közösségben szerzett pneumoniák mintegy 10%-áért felelős. A fertőzés legtöbbször kis közösségekben, például családokban endemikusan alakul ki, leírtak azonban C. pneumoniae által okozott járványokat is, amelyek nagyobb populációkban fordultak elő, mint például idősek otthonában, iskolai közösségekben, katonai intézményekben (Peeling és Brunham 1996). A C. pneumoniae fertőzések kialakulásával kapcsolatban szezonális összefüggés nem tapasztalható, Grayston és munkatársai azonban retrospektív szerológiai vizsgálatok alapján 4-6 évente visszatérő periodicitást figyeltek meg a járványok kialakulásában. (Grayston és mtsai 1989b). 2.5.3.2.
Akut légúti fertőzések
A C. pneumoniae okozta fertőzések rendszerint enyhe lefolyású, szubakut légúti tüneteket okoznak, súlyosabb megbetegedés idősebb korban jelentkezhet. Gyakran előfordulhat tünetmentes hordozás is. A fertőzés tünetei nem jellegzetesek, klinikailag nehéz elkülöníteni más hasonló atípusos légúti megbetegedést okozó fertőzéstől (Hammerschlag 2000a). A fertőzést követő 7-21 nap után gyakran pharyngitis alakulhat ki, amelyet bronchitis, vagy pneumonia követ. A megbetegedést gyakran kíséri elhúzódó köhögés, esetenként láz (Hammerschlag 2000a, Kuo és mtsai 1995). A pneumoniák nagyrészt enyhe lefolyásúak, nem igényelnek kórházi ápolást. Az enyhe lefolyású megbetegedések során a mellkasröntgen-felvétel pneumonitis képét mutathatja, súlyosabb hospitalizált esetekben azonban már kétoldali infiltrátum is látható (Kuo és mtsai 1995). A gyógyulás folyamata a megfelelő antibiotikumos kezelés ellenére még az enyhébb esetekben is lassú, több hétig elhúzódhat, amelyet köhögés és rossz közérzet kísér. A C. pneumoniae-t egyéb akut megbetegedésben, például purulens sinusitis vagy középfül-gyulladás során is izolálták. Esetismertetésekben a kórokozót az akut fertőzés szövődményeként kialakuló ritka kórképekben, például endocarditisben, vagy neurológiai betegségekben (encephalitis, Guillain-Barré szindróma) is kimutatták (Kuo és mtsai 1995). A MIF vizsgálat az akut C. pneumoniae fertőzés diagnosztikájára ajánlott standard, specifikus és érzékeny metodika, hátránya, hogy költséges, értékelése szubjektív. A
19
rutin diagnosztikában egyre szélesebb körben használják a nagy mintaszám vizsgálatára alkalmas, kevésbé költséges ELISA alapú vizsgálatokat, jelenleg azonban nincsen ajánlott standardizált teszt (Dowell és mtsai 2001). A C. pneumoniae nem releváns (például felső légúti) mintákból történő közvetlen kimutatása, a kórokozó gyakori előfordulása és a tünetmentes hordozás lehetősége miatt önmagában nem diagnosztikus értékű. A fertőzés etiológiájának tisztázása érdekében csak a klinikai tünetekkel és a szerológiai eredményekkel összhangban állítható fel a diagnózis (Boman és mtsai 1999). 2.5.3.3.
Krónikus fertőzések
A krónikus légúti C. pneumoniae fertőzést szerológiai vizsgálatok alapján gyermekkori és felnőttkori asztmatikus megbetegedésekkel is összefüggésbe hozzák, valamint a tüdők krónikus gyulladásos megbetegedése, a COPD (chronic obstructive pulmonary disease) kialakulásához is köze lehet. (Hammerschlag 2000a). A C. pneumoniae atherosclerosis folyamatában játszott szerepét, a krónikus C. pneumoniae fertőzés és a szívérrendszeri megbetegedések közötti kapcsolatot közel húsz éve vizsgálják. 2.5.3.4.
C. pneumoniae potenciális szerepe az atherosclerosisban
Az atherosclerosis a fejlett országok népességének nagy részét érintő krónikus gyulladásos patológiai folyamat, melynek eredményeként különböző szív-, érrendszeri betegségek alakulnak ki. A folyamat során az érintett érfalban léziók, más néven atheromás plakkok jönnek létre, amelyek fibrózus sapkával fedett, gyulladásos sejteket, úgynevezett habos sejtekké alakult makrofágokat, limfocitákat, simaizomsejteket tartalmazó lipidgazdag képletek. Az atherosclerotikus elváltozások multifaktoriális eredetűek, megjelenésük igen komplex folyamatok eredménye. A tradicionális rizikófaktorok közé sorolható a magas vérnyomás, kóros koleszterin-szint, dohányzás, elhízás, diabetes (Belland és mtsai 2004). Az atherosclerosis kialakulásában a kórokozók potenciális szerepét tanulmányozó vizsgálatokban a legtöbb figyelmet a gazdag szakirodalommal rendelkező C. pneumoniae kapta. A C. pneumoniae és az atherosclerosis közötti összefüggésre először szerológiai vizsgálatok hívták fel a figyelmet. Saikku és munkatársai 1988-ban koszorúérbetegségben szenvedőknél detektáltak a kontroll csoportokhoz képest szignifikánsan
20
magasabb C. pneumoniae specifikus ellenanyagszinteket, ezt követően számos hasonló szero-epidemiológiai tanulmány született (Saikku és mtsai 1988, Puloakkainen és mtsai 1993). A második bizonyítékot a kórokozó atheromás plakkból történő kimutatása jelentette. Kalayoglu és munkatársai összefoglalójukban több mint negyven, C. pneumoniae atheromákból történő kimutatásával foglalkozó tanulmányt tekintettek át. Az összes eset 46%-ában sikerült detektálni a baktériumot, valamelyik fehérjéjét, vagy DNS-ét
elektronmikroszkópos
technikával,
immunhisztokémával,
illetve
PCR
(polymerase chain reaction) vizsgálattal (Kalayoglu és mtsai 2002). További vizsgálatokban
állatmodelleken
tanulmányozták
az
atherosclerosis
folyamatát.
Hiperlipémiás (ApoE -/-) egértörzsekben, amelyekben az atherosclerosis spontán lép fel, a C. pneumoniae fertőzést követően az állatok atheromás plakkjaiból sikeresen izolálták a kórokozót (Campbell és mtsai 2000). A másik állatmodellként használt újzélandi nyulakban, amelyekben atherosclerosis csak hiperlipémiás táplálást követően alakult ki, a mesterséges C. pneumoniae fertőzést követően korai atherosclerotikus léziókat találtak (Muhlestein 2000). Az atherosclerosis folyamatában a feltételezett kóroki mechanizmus szerint a C. pneumoniae egy lokális légúti fertőzés révén, például az alsó légutakból jut a véráramba a fertőzött monocitákkal (2. ábra). Az érintett érfal endotheliumán keresztül hatolva, a monocitákból kiszabaduló C. pneumoniae elemi testek megfertőzik az intima sejtjeit. In vitro kísérletekben igazolódott, hogy a C. pneumoniae az atheromában található összes sejttípust képes megfertőzni (Gaydos és mtsai 1996). A fertőzött sejtek szabályozása módosul, ennek folytán az atheromás lézió progresszióját kiváltó gyulladásos citokineket (például: interleukin-6, interleukin-12, tumor nekrózis faktor-α) és adhéziós molekulákat (például: E-szelektin, intercelluláris adhéziós molekula-1) expresszálnak, míg a simaizomsejtek a fertőzés hatására proliferálódnak. A fertőzött makrofágoknak emellett a C. pneumoniae LPS hatására az alacsony denzitású lipoprotein (LDL) felvétele megnő, és úgynevezett habos sejtekké alakulnak (2. ábra). A fertőzött makrofágok mátrix metalloproteináz termelése fokozódik, amely a plakk ruptúrájához vezethet (Kalayoglu és mtsai 2002).
21
2. ábra. C. pneumoniae szerepe az atherosclerosis folyamatában (forrás:www.cassio-lynm.com/illus) 2.5.3.5.
A cytomegalovirus (CMV) szerepe az atherosclerosisban
A CMV jelenlétét az atherosclerotikus érfalakban több tanulmányban vizsgálták és kimutatták (Lin és mtsai 2003, Chiu és mtsai 1997). A szívkoszorúér-betegségekben játszott szerepét elsősorban a restenosis folyamatával hozzák összefüggésbe, amely elmélet szerint, a plakkban látensen perzisztáló CMV az érfalat ért mechanikai stressz (műtéti beavatkozás) hatására reaktiválódik. A reaktiváció következtében kifejeződő CMV géntermékek befolyásolják a sejtek proliferációs ciklusát, ennek következtében az érfal simaizomsejtjeinek fokozott proliferációja figyelhető meg (Zhou és mtsai 1996). A CMV emellett az endothelsejtekben gyulladásos immunválaszt vált ki, ezúton is hozzájárulva a restenosis kialakulásához, új plakk formálódásához. 2.5.3.6.
Atherosclerosis pathomechanizmusával kapcsolatos hazai kutatások
Az atherosclerosis és az egyes kórokozók (C. pneumoniae, CMV) kapcsolatát vizsgáló számos hazai tanulmány született. Az atherosclerosis pathomechanizmusával foglalkozó munkacsoport kimutatta a C. pneumoniae DNS jelenlétét PCR vizsgálattal atherosclerotikus agyi erekben, vizsgálta C. pneumoniae és CMV DNS jelenlétét stroke
22
betegek perifériás vérében (Virok és mtsai 2001, Kis és mtsai 2007). Összefüggést találtak myocardiális infarktuson átesett betegek, valamint szívkoszorúér betegségben szenvedők C. pneumoniae IgG ellenanyagszintjei és a betegség között (Heltai és mtsai 2004, Burian és mtsai 2001b). In vitro kísérletekben emellett egérmodellen sikerült kimutatni a CMV fertőzés által kiváltott kezdődő primer lézió C. pneumoniae fertőzés hatására bekövetkező progresszióját (Burian és mtsai 2001a).
23
3. Célkitűzések Dolgozatomban a változatos megbetegedéseket okozó, három humánpatogén chlamydia fajjal kapcsolatos vizsgálataimat foglalom össze. Az OEK Bakteriológia II. Osztály molekuláris diagnosztikai laboratóriumában feladataim közé tartozik a chlamydiák kimutatását célzó molekuláris módszerek beállítása és fejlesztése. Munkám során kidolgoztam a C. trachomatis urogenitális- és conjunctiva mintákból történő kimutatását, valamint az egyes szerotípusok meghatározására szolgáló genotipizáló metodikát. Az OEK Virológiai Főosztály molekuláris laboratóriumában korábban beállított C. pneumoniae kimutatására szolgáló metodikát átvettem és adaptáltam a kórokozó légúti mintákból történő kimutatására, majd a C. psittaci molekuláris diagnosztikája irányában továbbfejlesztettem. Tudományos munkásságom szervesen kapcsolódik a diagnosztikai laboratóriumunk tevékenységéhez, vizsgálataimat az alábbi pontok szerint tárgyalom: 3.1. C. trachomatis fertőzés prevalenciájának meghatározása, molekuláris tipizálása hazai veszélyeztetett populációban Magyarországon a szexuális úton terjedő fertőzések közül a C. trachomatis vonatkozásában
hiányzik
egy
átfogó
surveillance-rendszer,
ezért
az
egyes
rizikócsoportokban, illetve a magyar átlagpopulációban a C. trachomatis fertőzés prevalenciájával kapcsolatban csak kevés epidemiológiai adat áll rendelkezésre. Célom egy magas rizikócsoportba tartozó prostituált populációban a C. trachomatis kimutatása és prevalencájának meghatározása volt. Az egyes urogenitális C. trachomatis szerotípusok előfordulásáról és gyakoriságáról nincsenek magyar vonatkozású adatok. További célul tűztem ki a prostituált populációban előforduló C. trachomatis szerotípusok azonosítását és eloszlásának meghatározását egy restrikciós fragmens hossz analízisen (RFLP) alapuló genotipizáló módszerrel.
24
3.2. C. psittaci fertőzés igazolása molekuláris módszerekkel potenciális betegekben A C. psittaci fertőzés klinikai tünetek alapján nehezen különíthető el más atípusos légúti fertőzéstől. A részletes anamnézis hiányában, az inadekvát, vagy késedelmes antibiotikum-terápia következtében a betegek állapota súlyosbodhat, a betegség olykor halálhoz vezethet. Célom a szerológiai vizsgálatok eredményeinek alátámasztására alkalmas, a C. psittaci közvetlen és gyors kimutatására szolgáló molekuláris módszerek kidolgozása, valamint C. psittaci fertőzés következményeként elhunyt két beteg klinikai mintáiból a fertőzés, mint haláloki tényező igazolása volt. 3.3. C. pneumoniae és az atherosclerosis kapcsolatának vizsgálata ballonkatéteres koszorúér-tágításon átesett betegpopulációban A szívkoszorúerekben kialakult atheromás plakkok által okozott érszűkületek a ballonkatéteres koszorúér-tágítási műtéti beavatkozással javíthatók. A vizsgálatok elsődleges célja a plakkokban esetlegesen jelenlévő, perzisztáló C. pneumoniae fizikai behatást követő reaktiválódásának kimutatása volt. A C. pneumoniae és egyes vírusok reaktiválódásának vizsgálata a perifériás vérben egyrészt a specifikus ellenanyagszintek meghatározásával, másrészt a kórokozók DNS-ének detektálásával történt.
25
4. Anyagok és módszerek 4.1. C. trachomatis fertőzés prevalenciájának meghatározása, molekuláris tipizálása hazai veszélyeztetett populációban 4.1.1.
C. trachomatis törzsek
A vizsgálatokhoz referencia kontrollként felhasznált, C. trachomatis törzsekből tisztított DNS mintákat Dr. Hamid Jalal és munkatársai (Addenbrook’s Kórház, Cambridge, Anglia) bocsátották rendelkezésünkre. A C. trachomatis törzseket és a DNS kivonási procedúrát egy általuk korábban közölt tanulmányban írták le (Jalal és mtsai 2006). 4.1.2.
Klinikai minták
2006. január és július között, Budapesten és környékén végzett anonim STD szűrésből származó 484 prostituált endocervikális mintájának vizsgálata készült el. A mintákat egy mobil szűrőállomáson Dacron végű mintavevő pálcával vették le és küldték a laboratóriumba. A mintavevő pálcák 400 μl chlamydia transzport folyadékot (Bartels FlexTrans, Trinity Biotech, Jamestown, USA) tartalmazó steril Eppendorf csövekben egy napig 4°C-on hűtőszekrényben áztak, majd vortexelést követően és a pálca kivétele után a transzport folyadékba kiáztatott mintákat feldolgozásig –20°C-on tároltuk. 4.1.3.
DNS kivonás
A mintákat kiolvadás után az Eppendorf csövekben ultracentrifugán 10 000 g-vel 10 percig lecentrifugáltam. A felülúszó leszívását követően a 200 μl PBS-ben felvett üledékből a DNS kivonás egy kereskedelmi forgalomban kapható DNS tisztító kittel (High Pure DNA Template Preparation Kit, Roche Diagnostics, Manheim, Németország) történt a használati utasítás szerint. A folyamat végén a tisztított DNS-t az oszlopról két lépésben, egymást követő centrifugálással 2x75 μl eluáló pufferben Eppendorf csövekben vettem fel. A kivont DNS-t tartalmazó mintákat –20°C-on a további vizsgálatokig lefagyasztva tároltuk.
26
4.1.4.
C. trachomatis PCR-rel történő kimutatása
PCR primerek A PCR vizsgálat célszekvenciája a C. trachomatis extrakromoszómális plazmidján egy 495 bázispárnyi (bp) génszakasz volt. A génszakasz amplifikációjához a korábban publikált, de az optimális olvadási hőmérséklet elérése céljából kissé módosított CTpl1 és CTpl2 primer szekvenciákat használtam (4. táblázat) (Ossewaarde és mtsai 1992). PCR reagensek és PCR kondíciók A PCR reakciók 20 μl végtérfogatban a következő reagenseket tartalmazták: 10x Reddy Mix Buffer (Abgene, Epsom, Egyesült Királyság), 200 μM dNTP, 0,5 μM primer, 0,5 U Thermoprime Taq polimeráz (ABgene) és 3 μl DNS templát. A PCR vizsgálatok Eppendorf Thermocycler készülékben készültek az alábbi kondíciók szerint: az első, 95°C-on zajló 4 perces denaturálási lépést követően az amplifikációs ciklusok 95°C-on 30 s-ig, 64°C-on 30 s-ig, 72°C-on 45 s-ig tartottak 40 cikluson keresztül, a PCR végül egy 4 perces 72°C-os elongációs lépéssel fejeződött be. DNS analízis gélelektroforézissel A PCR termékek detektálását horizontális gélelektroforézissel végeztem. A PCR termékek tris-borát EDTA (TBE) pufferben (Merck, Darmstadt, Németország), etídiumbromiddal (Sigma, St. Louis, USA) megfestett 1%-os agaróz gélen, 50 bp-os molekulamarker (Sigma) mellett futtattam meg. Az amplifikált DNS szakaszok UV transzilluminátorral
átvilágítva
váltak
láthatóvá.
A
gélfotók
dokumentálása
átvilágításkor történő fényképezést követően, a digitális kamerával összekötött számítógépes rendszerrel történt. 4.1.5.
Külső inhibitor kontroll PCR
A DNS kivonást követően a mintákban esetlegesen megmaradó PCR inhibitorok jelenléte miatt álnegatív C. trachomatis PCR eredmények születhetnek. Ennek az eshetőségnek kizárása érdekében a mintákat a humán β-globin génre beállított PCR vizsgálaton is lefuttattam, a GenBank szekvencia adatbázisban megtalálható PC04 és GH20 primerek felhasználásával (4. táblázat).
27
4.1.6.
Genotipizálás
Az egyes C. trachomatis szerotípusok elkülönítését egy PCR alapú restrikciós fragmens hossz polimorfizmus (RFLP) analízisen alapuló genotipizáló technikával végeztem. Ezzel a módszerrel az omp1 gén PCR amplifikációját követően a kapott PCR termék szekvenciájának restrikciós enzimatikus hasításával tipizálható a vizsgált C. trachomatis DNS minta. 4.1.6.1.
C. trachomatis omp1 PCR
A C. trachomatis plazmid PCR-rel detektált pozitív mintákat a MOMP fehérjét kódoló omp1 génre tervezett seminested PCR vizsgálaton futtattam le, Lan és munkatársai által korábban publikált szekvenciájú primerek felhasználásával (Lan és mtsai 1993, 1995b) (4. táblázat). Az első PCR futtatásakor a 20 μl végtérfogatú PCR reakcióba a 4.1.4. pontban leírt koncentrációjú PCR reagensek mellett a külső primer párként használt NLO és NRO primerek és 3 μl DNS templát kerültek. A második kör PCR futtatása az első PCR körből 5 μl terméket mérve 50 μl végtérfogatban zajlott az NLO és SERO2A primerek felhasználásával (4. táblázat). 4. táblázat. β-globin PCR, C trachomatis plazmid PCR, omp1 PCR primer szekvenciái Primer
Szekvencia (5’-3’)
Pozíció
Referenciák
PC04#
CAACTTCATCCACGTTCACC
21-40
GenBank no. A26623
GH20#
GAAGAGCCAAGGACAGGTAC
252-271
GenBank no. A26624
CTpl1*
GGCTATTTCTCTTGACCACAGC
329-350
CTpl2*
TACTCTCCCATTTCTCCCACA
804-824
Ossewaarde és mtsai 1992
NLO†
ATGAAAAAACTCTTGAAATCG
1-21
NRO†
CTCAACTGTAACTGCGTATTT
1108-1128
SERO2A†
TTTCTAGATTTCATCTTGTT
1045-1064
#
Lan és mtsai 1993,1995b
Humán β-globin génszekvencia alapján (GenBank no. EU863596) * C. trachomatis plazmid génszekvenciája alapján (GenBank no. X06707) † C. trachomatis E szerotípus omp1 génszekvenciája alapján (GenBank no. X52557)
28
A két PCR futtatás kondíciói azonosak voltak: 95°C-on zajló 4 perces denaturálási lépést követően az amplifikációs lépések 95°C-on 30 s-ig, 45°C-on 50 s-ig, 72°C-on 60 s-ig tartottak 45 cikluson keresztül, majd a PCR egy 72°C-on 6 percig tartó elongációs lépéssel fejeződött be. A keletkezett, körülbelül 1070 bp hosszú PCR termékek detektálása 1%-os agaróz gélen, a 4.1.4. pontban leírtak szerint zajlott. 4.1.6.2.
RFLP analízis
Az omp1 PCR termékének restrikciós emésztését először az AluI restrikciós endonukleáz (Promega, Madison, USA) enzimmel végeztem. A 20 μl térfogatú reakció 10 μl PCR terméket, 10 μg/μl BSA-t (bovine serum albumin), 10x restrikciós puffert és 10 U/μl AluI enzimet tartalmazott, az emésztési lépés a gyártó utasítása szerint 37°C-on 150 percig tartott. A C. trachomatis szerotípusok restrikciós mintázatainak detektálása 1,5%-os agaróz gélen gélelektroforézissel készült. Az azonos restrikciós mintázatú C-csoportba tartozó szerotípusokat a HinfI, EcoRI, DdeI (Promega) restrikciós endonukleázok felhasználásával különítettem el, az AluI hasítási reakcióval azonos körülmények szerint. A D szerotípusok variánsainak elkülönítése a CfoI (Promega) enzimmel történt. 4.1.6.3.
In silico RFLP
Az egyes C. trachomatis szerotípusok restrikciós mintázatait Nebcutter 2.0 software számítógépes program segítségével is elemeztem (http://tools.neb.com/NEBcutter2). A GenBank adatbázisban megtalálható C. trachomatis törzsek MOMP génszekvenciáiból az omp1 PCR termék hosszúságának megfelelő szakaszokon, a Nebcutter 2.0 programmal lefuttatott restrikciós hasításokat a gélelektroforézis eredményeivel hasonlítottam össze. A GenBank adatbázisból felhasznált C. trachomatis szerotípusok a következők voltak: D/IC-Cal8 (GenBank no. X62920), E/Bour (X52557), F/IC-Cal3 (X52080), G/UW57 (AF063199), H/UW4 (X16007), I/UW12 (AF063200), J/UW36 (AF202457), K/UW31 (AF063204).
29
4.1.6.4.
Statisztikai analízis
A prostituáltak életkor adatainak feldolgozása SAS 9.1 software statisztikai programmal zajlott. Az életkor és a C. trachomatis pozitivitás közötti összefüggés vizsgálata logisztikai regressziós analízissel történt. 4.2. C. psittaci fertőzés igazolása molekuláris módszerekkel potenciális betegekben 4.2.1.
C. psittaci törzs
A C. psittaci törzsből (DC35) izolált DNS kontrollt, amely egy úgynevezett WC genotípusú, szarvasmarhából izolált C. psittaci törzsből származik, Dr. Konrad Sachse (Nemzeti Psittacosis Referencia Laboratórium, Friedrich-Löffler Intézet, Jena, Németország) bocsátotta a laboratórium rendelkezésére. 4.2.2.
Klinikai minták
1. eset Az első esetben egy 69 éves nőbeteg postmortem vérmintájának és tüdőszövet mintájának vizsgálata történt. A beteg nehézlégzéssel került kórházba. A megelőző öt nap során a betegnél erős köhögés, légzési nehézség, általános rosszulléttel járó tünetek jelentkeztek. Három nappal a felvétel előtt 39°C-os láza és hasmenése volt. A háziorvos amoxicillin terápiát írt fel, ennek ellenére a beteg tünetei súlyosbodtak. A kórházi felvételkor elvégzett mellkasröntgen a bal tüdőfélben kiterjedt pleuropneumoniát igazolt, és infiltrátumokat mutatott a jobb tüdőfélben. A kórházban intravénás ciprofloxacin (200 mg) terápiát indítottak, ezt követően a beteg az intenzív osztályra került. A következő nap a beteg nehézlégzése súlyosbodott, gépi lélegeztetésre szorult. Az antibiotikumos terápiát gyomorszondán át levofloxacin (500 mg/nap) kezeléssel folytatták. A beteg keringése stabil volt, a vér oxigenizációja javult, láza nem volt, azonban még aznap este bradycardizálódott és a légzése leállt, újraéleszteni nem sikerült. A beteg a halálát megelőző fél év során egy békés megyei baromfifeldolgozó üzem kopasztó részlegén dolgozott, emiatt merült fel a psittacosis gyanúja. A postmortem vérmintából a laboratóriumunk elvégezte a szerológiai vizsgálatot, a tüdő szövetet a feldolgozásig lefagyasztva tároltuk.
30
2. eset A második esetben egy 48 éves nőbetegtől származó minták vizsgálata készült el. A beteg két hete tartó improduktív köhögési tünetekkel járó lázas (38°C) állapotban került kórházba. Antibiotikumot nem kapott. A mellkasröntgen-felvétel mindkét tüdőfélben infiltrátumokat mutatott. A kórházi felvételkor moxifloxacinból (400 mg per os/nap) és intravénás amoxicillin-klavulánsavból (3x1 g/nap) álló, kombinált antibiotikum-terápiát indítottak. A beteget súlyos légzési elégtelenség és hypoxia kialakulása miatt két nap múlva az intenzív osztályra helyezték át, ahol gépi lélegeztetés vált szükségessé. Az antibiotikum-terápiát intravénás moxifloxacin (400 mg/nap), clindamycin (2x600 mg/nap), ceftriaxon (2x2 g/nap) és gyomorszondán keresztül rifampicin (2x300 mg/nap) adásával folytatták. A beteg egy bács-kiskun megyei baromfifeldolgozó üzem kopasztó részlegén dolgozott, emiatt merült fel a psittacosis gyanúja. A mikrobiológiai laboratóriumi vizsgálatra natív vérmintát és bronchus váladékot küldtek. A clindamycin és ceftriaxon kezelést két nap után doxycyclin (500 mg/6 óra) és clarithromycin (500 mg/6 óra) terápiával folytatták. A következő három napban a beteg állapota tovább romlott, végül többszervi elégtelenség, tachycardia és hypoxia lépett fel, és a beteg elhunyt. A boncolás pneumoniát igazolt, valamint alkoholos zsírmáj, szeptikus vese és lép is észlelhető volt. A parenchimás szervekből (agy, tüdő, szív, máj, lép, vese) származó boncolási mintákat a vizsgálatig lefagyasztva tároltuk. 4.2.3.
Szerológiai vizsgálatok
A vérminták szerológiai vizsgálatát laboratóriumunk egy kereskedelmi forgalomban kapható mikroimmunfluoreszcens (MIF) teszttel (Focus Diagnostics, Cypress, USA) végezte. Ez a teszt alkalmas a chlamydia-specifikus IgM, IgG és IgA ellenanyagok elkülönített kimutatására és további előnye, hogy egy minta vizsgálatakor a három humánpatogén chlamydia elleni specifikus ellenanyagok jelenléte species szinten detektálható. A 12 minta vizsgálatára alkalmas tárgylemezen mintánként két C. psittaci, nyolc C. trachomatis (D-K szerotípusok) és egy C. pneumoniae törzsből származó tisztított chlamydia elemi testek vannak kikötve. A vizsgálatok a gyártó utasításai alapján készültek el, az eredmények kiértékelése fluoreszcens mikroszkóp (Zeiss, 40xes nagyítás) segítségével történt.
31
4.2.4.
DNS izolálás
A DNS kivonást a 4.1.3. pontban leírt DNS izoláló kittel végeztem. A kiolvasztott boncanyagokból steril szikével kivágva, körülbelül 0,5 mg mennyiségű szövetdarab került steril Eppendorf csövekbe. A bronchusváladék feldolgozása Eppendorf csőben ultracentrifugán 10 000 g-vel 10 percig tartó centrifugálást követően, a felülúszó leszívása után kezdődött. Mindegyik mintához 200 μl szövet lizáló puffer lett bemérve, a további DNS kivonási lépések a gyártó utasítása szerint zajlottak. A kivont DNS-t tartalmazó mintákat –20°C-on tároltuk. 4.2.5.
C. psittaci PCR vizsgálatok
PCR primerek A C. psittaci DNS kimutatására két különböző génre tervezett PCR vizsgálatot állítottam be. Az első nested PCR vizsgálatok a C. psittaci MOMP antigént kódoló ompA génre tervezett, korábban közölt szekvenciájú primerekkel futottak le (5. táblázat) (Tong és Sillis 1993). A nested PCR első körében a CP1 és CP2 primerek nem species specifikusak, mind a C. psittaci, mind a C. pneumoniae esetében egy 333 bázispárnyi génszakasz amplifikációja történik. A nested PCR második körében felhasznált CPC és CPD primerek csak a C. pneumoniae szekvenciájára specifikusak, az első körben amplifikált termékekből csak a C. pneumoniae célszekvenciák amplifikálódnak, és egy 207 bázispárnyi termék keletkezik. A második PCR vizsgálatban a 60 kDa külső membrán fehérje (cysteine-rich outer membrane protein) antigént kódoló Omp2 génre terveztem egy primerpárt az online Primer3 primertervező program (frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi) segítségével (5. táblázat). A vizsgálatban amplifikációja történik.
32
egy
185
bázispárnyi
génszakasz
5. táblázat. C. psittaci PCR vizsgálatokhoz használt primerek szekvenciái Primer
Szekvencia (5’-3’)
Pozíció
CP1#
TTACAAGCCTTGCCTGTAGG
61-81
GCGATCCCAAATGTTTAAGGC
373-393
TTATTAATTGATGGTACAATA
100-120
CPD
ATCTACGGCAGTAGTATAGTT
286-306
CrP1*
GCACCTTCAGGAGCAACAAT
1742-1761
*
CAGGTTCCACAATCGGAGTT
1907-1927
CP2
#
CPC# #
CrP2
1. kör ompA PCR
2. kör ompA PCR
#
C. pneumoniae ompA génszekvencia alapján (GenBank no. DQ35892)
*
C. psittaci Omp2 génszekvencia alapján (GenBank no. X 53512)
4.2.5.1.
Omp2 PCR
ompA PCR
Az első kör PCR futtatáshoz a reakciók 20 μl végtérfogatban a következő reagenseket tartalmazták: 10x Reddy Mix Buffer (ABgene), 200 μM dNTP, 0,4 μM CP1 és CP2 primer, 0,5 U Thermoprime Taq polimeráz (ABgene) és 3 μl DNS templát. A második kör PCR futtatáshoz 20 μl végtérfogatba az első kör termékeiből 2 μl került, a PCR reakciókban a CPC és CPD primerek koncentrációja 1 μM volt. A nested PCR első köre egy touchdown PCR futtatásnak felelt meg. Az első, 94°C-on zajló 3 perces denaturálási lépést követően az amplifikációs ciklusok 94°C-on 30 s-ig, 65-55°C-on 30 s-ig, 72°C-on 45 s-ig tartottak 10 cikluson keresztül, az amplifikációs hőmérséklet ciklusonként 1°C-kal csökkent, majd a további 25 cikluson keresztül az amplifikációs lépés 55°C-on zajlott. A PCR futtatás egy 5 perces 72°C-os elongációs lépéssel fejeződött be. A második PCR kör 40 ciklusból állt, amplifikációs hőmérséklet 50°C volt, a többi paraméter megegyezett az első körrel. 4.2.5.2.
Omp2 PCR
A PCR reakciók 20 μl végtérfogatban a következő reagenseket tartalmazták: 10x Reddy Mix Buffer (ABgene), 200 μM dNTP, 0,5 μM primer, 0,5 U Thermoprime Taq
33
polimeráz (ABgene) és 3 μl DNS templát. A futtatás során egy 94°C-on 4 percig tartó denaturálási lépést követően az amplifikációs ciklusok 94°C-on 30 s-ig, 60°C-on 30 sig, 72°C-on 50 s-ig tartottak 40 cikluson keresztül, a PCR végül egy 4 perces 72°C-os elongációs lépéssel fejeződött be. DNS analízis gélelektroforézissel A PCR termékek kimutatását a 4.1.4. pontban leírtakhoz hasonlóan horizontális gélelektroforézissel végeztem etídium-bromiddal megfestett 1%-os agaróz gélen. 4.3. C. pneumoniae és az atherosclerosis kapcsolatának vizsgálata ballonkatéteres koszorúér-tágításon átesett betegekben 4.3.1.
Klinikai minták
2003 folyamán a MÁV Kórház Kardiológiai osztályán instabil angina diagnózisával felvételre került, majd ballonkatéteres koszorúér-tágításon (percutaneus transluminal coronary angioplasty, PTCA) átesett páciensek közül 28 beteg, három időpontban levett vérmintáinak vizsgálatára került sor. A vizsgált betegcsoportba azok a páciensek kerültek, akiknél a koszorúérfal szűkülete legalább 50%-os volt és a kontroll angiográfiát a műtétet követő második és nyolcadik hónap között elvégezték. A restenosis fogalmát a műtétet követően legalább 50%-os új szűkület kialakulása jelentette. A betegektől az első mintát minden esetben közvetlenül a műtét előtt, a második és harmadik vérmintát a műtétet követő 4. és 14. napon vették le. A vérmintákat kétféleképpen, a kórokozó DNS kimutatása céljából, EDTA-t tartalmazó csövekben, a szerológiai vizsgálatok céljára natív állapotban vették le. A vérminták tárolása a laboratóriumi feldolgozásig –80°C-on történt. 4.3.2.
DNS izolálás
A DNS kivonás a vérmintákból kereskedelmi forgalomban kapható DNS tisztító kittel (Wizard Genomic DNA Purification Kit, Promega, Madison, USA) a gyártó utasítása szerint történt.
34
4.3.3.
C. pneumoniae kimutatása
A C. pneumoniae DNS kimutatásának vizsgálatai a 4.2.5.1. pontban ismertetett nested PCR vizsgálattal készültek. A PCR reakciók 50 μl végtérfogatban a következő reagenseket tartalmazták: 10x Taq Puffer (Fermentas, Hanover, USA), 1,5 μM Mg, 200 μM dNTP, 0,4 μM CP1 és CP2 primer, 2 U Taq polimeráz (Fermentas) és 3 μl DNS templát. A második kör PCR futtatáshoz 50 μl végtérfogatba az első kör termékeiből 3 μl került, a Mg 3 μM, a CPC és CPD primerek 0,8 μM koncentrációjúak voltak. A PCR vizsgálatok minden minta esetében a módszer érzékenységének növelése céljából öt párhuzamos reakcióban futottak le (Smieja és mtsai 2001a). A mintákban inhibitor jelenlétének meghatározása külső kontrollként β-globin PCR vizsgálattal történt. 4.3.4.
Cytomegalovirus (CMV) kimutatása
A CMV DNS kimutatása az immediate early-exon-4 génre tervezett nested PCR vizsgálattal zajlott (Frank és mtsai 1992). A specifikus primerekkel történő amplifikáció során az első PCR körben egy 162 bp, a második körben egy 120 bp hosszúságú termék keletkezik (6. táblázat). 6. táblázat. CMV PCR vizsgálatokhoz használt primerek szekvenciái Primer#
Szekvencia (5’-3’)
Pozíció
Forward-1
CCACCCGTGGTGCCAGCTCC
926-945
Reverse-1
CCCGCTCCTCCTGAGCACCC
1068-1087
Forward-2
TCTGATTCTCTGGTGTCACC
946-965
TCCTCCTCTTCCTCATCACT
1048-1069
Reverse-2 #
1. kör CMV PCR
2. kör CMV PCR
CMV Towne törzs immediate-early exon-4 génszekvencia alapján (GenBank M11630)
A nested PCR reakciók reagenseinek koncentrációi 50 μl végtérfogatban a következők voltak: 10x Taq Puffer (Fermentas), 1,5 μM Mg, 200 μM dNTP, 0,3-0,3 μM primerek, 2 U Taq polimeráz (Fermentas) és 3 μl DNS templát. Az első PCR kör paraméterei az alábbiak voltak: 94°C-on 5 percig tartó denaturálási lépés, 94°C-on 30 s-ig, 59°C-on 30
35
s-ig, 72°C-on 60 s-ig tartó 40 amplifikációs ciklus, végül egy 5 perces 72°C-os elongációs lépés. A második kör során az amplifikációs lépések 64°C-on zajlottak 35 cikluson keresztül, a többi paraméter változatlan maradt. 4.3.5.
Szerológiai vizsgálatok
A szérumminták C. pneumoniae IgA és IgG ellenanyagszintjeinek meghatározása laboratóriumunkban, egy kereskedelmi forgalomban kapható ELISA teszttel (NovaTec Immundiagnostica, Dietzenbach, Németország) történt. A szerológiai vizsgálatok eredeményeit a gyártó utasítása szerint megadott kritériumok alapján, a kontroll értékekkel kalkulálva értékeltem ki. A CMV IgG, humán herpes simplex virus (HSV) IgG és Epstein-Barr virus (EBV) IgG szintek ELISA vizsgálatokkal történő meghatározását az OEK Virológia Főosztály laboratóriumaiban végezték el. 4.3.6.
Statisztikai analízis
Az adatok feldolgozása SPSS 13.0 software statisztikai programmal történt. A műtéti beavatkozás előtt és után levett vérmintákban a C. pneumoniae és CMV DNS jelenléte és a PTCA beavatkozás közötti összefüggés vizsgálata Fisher’s exact teszt, χ2 teszt és logisztikus
regresszió
alkalmazásával
zajlott.
A
vizsgált
kórokozók
ellenanyagszintjeinek változása és a PTCA beavatkozás közötti összefüggés vizsgálata ismételt méréses kovariancia analízissel történt.
36
5. Eredmények 5.1. C. trachomatis fertőzés prevalenciájának meghatározása, molekuláris tipizálása hazai veszélyeztetett populációban 5.1.1.
C. trachomatis prevalenciája
A 484 endocervikális mintából 32 (6,6%) lett pozitív C. trachomatis plazmid PCR vizsgálattal. A tisztított DNS mintákban az inhibitorok jelenlétét kimutató β-globin külső kontroll PCR mindegyik minta esetében működött, gátlás nem volt detektálható. A C. trachomatis fertőzés és az életkor közötti összefüggés vizsgálatára összesen 275 prostituált életkor adata állt rendelkezésre. Ebben a csoportban az életkor 18-59 év közötti, az átlag életkor 27,5 év volt. A C. trachomatis fertőzés és az életkor között szignifikáns összefüggés volt kimutatható, a fiatalabb nőkben a C. trachomatis prevalenciája magasabb értéket mutatott (7. táblázat). 7. táblázat. Pozitív C. trachomatis eredmények és az életkor közötti összefüggés (n=275) Megfigyelt értékek Predikció† Korcsoportok*
Pozitív minták (n) (%)
(%)
CI 95%
<20
3/16
18,8
31,0
24,5-37,4
20-29
17/180
9,4
10,0
7,3-12,7
30-39
3/62
4,8
2,6
1,8-3,4
40-49
0/13
0,0
0,6
0,4-0,8
> 50
0/4
0,0
0,2
0,1-0,2
Összesen
23/275
8,4
8,9
5,3-12,4
* 209 nő esetében nincs életkor adat † Életkor hatása: p < 0.001
37
5.1.2.
Genotipizálás
A genotipizálás első lépéseként a 32 C. trachomatis pozitív minta amplifikációja a seminested omp1 PCR vizsgálattal mindegyik minta esetében, valamint a C. trachomatis törzsekből tisztított DNS kontrollok esetében sikeres volt. Az RFLP analízissel hét különböző urogenitális C. trachomatis szerotípust sikerült elkülöníteni, melyek a kontroll törzsekkel megegyező restrikciós mintázatot adtak. Az AluI hasítással a C-csoportba tartozó szerotípusok kivételével, restrikciós mintázatuk alapján a szerotípusok nagy része azonosítható volt (3. ábra). A C-csoportba tartozó szerotípusok további szétválasztása az EcoRI, DdeI és HinfI restrikciós enzimekkel volt lehetséges (4. ábra). Az egyes szerotípusok restrikciós endonukleázokkal történő elkülönítését a 8. táblázat foglalja össze.
3. ábra. C. trachomatis szerotípusok AluI enzimatikus hasítással kapott restrikciós mintázatai
38
4. ábra. EcoRI, DdeI, HinfI enzimatikus hasítással kapott restrikciós mintázatok
8. táblázat. C. trachomatis szerotípusok elkülönítése PCR-alapú RFLP analízissel Átmeneti C-csoport B-csoport csoport AluI
C
H
J
I
L3
EcoRI
C
H
J
I
L3
DdeI
C
H
J
I
HinfI
C
H
J
K
A
B
Ba
D
E
L1
L2
F
G
Az AluI hasítás eredményeként D szerotípusként azonosított mintákat CfoI restrikciós endonukleázos emésztéssel tovább vizsgálva egy minta adott eltérő restrikciós mintázatot, amely az úgynevezett D– variánsnak felelt meg.
39
Összességében a D szerotípus mutatkozott a leggyakoribbnak (11/32, 34,4%). A többi szerotípus prevalenciája csökkenő sorrendben a következő volt: E (7/32, 21,9%), F (6/32, 18,8%), G (3/32, 9,4%), J (3/32, 9,4%), H (1/32, 3,1%), és I (1/32, 3,1%). A GenBank adatbázisából kiválasztott referencia C. trachomatis törzsek omp1 szekvenciáinak Nebcutter software program segítségével történő RFLP analízise hasonló eredményt adott, mint a kontroll törzsek és a minták gélelektroforézissel kapott restrikciós mintázatai. 5.2. C. psittaci fertőzés igazolása molekuláris módszerekkel potenciális betegekben 5.2.1.
Szerológiai eredmények
Az első beteg postmortem vérmintájában a C. psittaci specifikus ellenanyagok közül az IgM 1:16 titerben, az IgG 1:512 titerben, az IgA 1:64 titerben volt detektálható. A második beteg vérmintájában C. psittaci specifikus IgM nem volt kimutatható, az IgG 1:256 titerben, az IgA 1:32 titerben mutatott pozitivitást. 5.2.2.
PCR vizsgálatok
ompA PCR Az első beteg postmortem tüdőszövetéből a C. psittaci DNS kimutatása pozitív eredményt adott. A nested PCR vizsgálat során az első futtatás eredményeként a C. psittaci DNS mind a mintából, mind a pozitív DNS kontrollból detektálható volt. A második PCR futtatás során, amely csak a C. pneumoniae szekvenciájára specifikus, a tüdőszövet
esetében
nem
keletkezett
termék
(5.
ábra).
A
második
beteg
bronchusváladékából ugyancsak sikerült C. psittaci DNS-t kimutatni. A postmortem szervminták közül egyedül a tüdőszövetben lehetett C. psittaci DNS-t detektálni. Omp2 PCR A fent leírtakkal összhangban ezzel a PCR vizsgálattal is sikerült kimutatni az első beteg tüdőszövetéből, illetve a második beteg bronchusváladékából C. psittaci DNS jelenlétét. A második beteg postmortem szervmintái közül a tüdőszövetben volt detektálható C. psittaci DNS (6. ábra).
40
5. ábra. OmpA nested PCR, 1. beteg tüdő boncanyag 1-2: tüdőszövet (1. beteg) párhuzamos mérés, 3: negatív kontroll, 4: DC35 C. psittaci pozitív kontroll, 5: C. pneumoniae pozitív kontroll, 6. csak a 2. körbe bemért C. pneumoniae pozitív kontroll; M: molekula marker
6. ábra. C. psittaci Omp2 PCR, 2. beteg szervmintái 1: Agy, 2: Lép, 3. Máj, 4. Szív, 5. Tüdő, 6. Vese, 7. C. psittaci pozitív kontroll
41
5.3. C. pneumoniae és az atherosclerosis kapcsolatának vizsgálata ballonkatéteres koszorúér-tágításon átesett betegpopulációban 5.3.1.
C. pneumoniae és CMV PCR eredményei és a PTCA közötti összefüggés
C. pneumoniae DNS-t a PTCA előtt levett vérminták közül egy esetben, a PTCA után levett minták közül három esetben sikerült kimutatni. CMV DNS a műtétet megelőzően egy mintában, a műtétet követően öt mintában volt detektálható. Ezek közül egyik minta sem volt pozitív egyidejűleg mindkét kórokozóra. A három különböző időpontokban levett mintákban, minden pozitív beteg esetében csak az egyik időpontban levett minta volt pozitív az adott kórokozóra. A vizsgálatok érzékenységének növelése céljából a pozitív betegmintákban, a mintánként lefuttatott öt párhuzamos reakcióból minden esetben egy adott pozitivitást. A C. pneumoniae és CMV DNS jelenléte és PTCA beavatkozás közötti összefüggés vizsgálatakor a kórokozó DNS-ek együttes jelenléte szignifikáns összefüggést mutatott (9. táblázat). 9. táblázat. C. pneumoniae és CMV DNS jelenléte a PTCA előtt és után levett mintákban PTCA előtt PTCA után p pozitív/összes (%) pozitív/összes (%) C. pneumoniae # 1/28 (3.6) 3/28 (10,7) 0,611* CMV †
1/28 (3.6)
5/28 (17,8)
C. pneumoniae + CMV
2/28 (7,1)
8/28 (28,6)
0,193* 0,084** 0,098*** 0,078* 0,036** 0,046***
#
C. pneumoniae DNS minden pozitív beteg esetében egyszer volt detektálható CMV DNS minden pozitív beteg esetében egyszer volt detektálható * Fisher’s teszt **χ2 teszt ***logisztikus regresszió p<0,05 †
5.3.2.
A szerológiai vizsgálatok eredményei és a PTCA közötti összefüggés
A betegek PTCA beavatkozás előtt, majd az azt követő 4. és 14. napon levett vérmintáiban a detektált ellenanyagszintekben, sem a C. pneumoniae, sem a többi vizsgált kórokozó esetében nem volt tapasztalható szignifikáns eltérés (7. ábra, 8. ábra).
42
1,6 1,4
PTCA előtt PTCA után 4 nap PTCA után 14. nap
OD érték (átlag+SE)
1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
Ig A
Ig G
7. ábra. PTCA hatása a C. pneumoniae ellenanyagszint-változásra Ismételt méréses kovariancia analízis IgA F(2,44)= 0.105, p=0.89 Kovariáns (restenosis): p= 0.19 IgG:F(2,44)= 2.200, p=0.12 Kovariáns (restenosis): p= 0.41 OD: ELISA vizsgálattal mért optikai denzitás 2,5
PTCA előtt PTCA után 4 nap PTCA után 2 hét
OD érték (átlag + SE)
2
1,5
1
0,5
0 CMV IgG
EBV IgG
HSV IgG
8. ábra. PTCA hatása a CMV, EBV és HSV ellenanyagszint-változásra. Ismételt méréses kovariancia analízis IgA: F(2,44)= 0.105, p=0.89 Kovariáns (restenosis): p= 0.19 IgG: F(2,44)= 2.200, p=0.12, Kovariáns (restenosis): p= 0.41
43
6. Megbeszélés 6.1. C. trachomatis fertőzés prevalenciájának meghatározása, molekuláris tipizálása hazai veszélyeztetett populációban 6.1.1.
A C. trachomatis prevalenciája magas rizikójú populációban
A szexuális úton terjedő infekciók, ezen belül is a C. trachomatis fertőzés tekintetében a prostituáltak magas rizikójú csoportot képviselnek. A rendszertelen óvszerhasználat, a partnerek nagy száma, az intravénás droghasználat a fertőzések rizikófaktorainak számítanak. A vizsgálatban a prostituáltak mintáiból összesen 32 esetben sikerült kimutatni C. trachomatis DNS-t. A C. trachomatis plazmidjára tervezett PCR ideális a molekuláris diagnosztikai vizsgálatokhoz. Egy elemi testben az extrakromoszómális, konzervált génszekvenciával rendelkező plazmid mintegy 7-10 kópiában megtalálható, amely a PCR vizsgálat érzékenységét növekedését eredményezi. (Ossewaarde és mtsai 1992, Paavonen és Eggert-Kruse 1999). A C. trachomatis fertőzés prevalenciája a vizsgált populációban 6,6% volt. Cwikel és munkatársai összefoglaló közleménye szerint prostituált populációkban vizsgált C. trachomatis prevalencia adatok világszerte 0,61-46,2%-os értékek között változnak (Cwikel és mtsai 2008). A magas prevalencia adatok elsősorban a fejlődő országokból származnak, ahol a prostituáltak becsült száma is nagyobb az átlagnépességhez képest. Vandepitte és munkatársai közleménye szerint ez az arány például Kelet-Afrikában és Dél Afrikában 3,4% és 2,6%, míg a kelet-európai régióban 0,4%, a nyugat- európai régióban 0,6% (Vandepitte és mtsai 2006). Cwikel és munkatársai adatai és más, C. trachomatis DNS kimutatásán alapuló közlemények eredményei szerint az európai országokban a C. trachomatis fertőzés prevalenciája prostituáltak körében 10% alatt van (Belgium 7,3%; Csehország 5,5%; Németország 9,6%; Görögország 5,9%; Spanyolország 5,9%; Egyesült Királyság 8,2%). Ezzel az aránnyal jól egyezik a Magyarországon megfigyelt 6,6%-os prevalencia érték (Mak és mtsai 2005, Resl és mtsai 2003, Rabenau és mtsai 2000, Papadogeorgaki és mtsai 2006, Folch és mtsai 2008, Ward és mtsai 2004).
44
6.1.2.
C. trachomatis fertőzés prevalenciája és az életkor
A vizsgált populáció életkora és a C. trachomatis fertőzés prevalenciája között szignifikáns összefüggés volt kimutatható. A prevalencia értéke fordítottan volt arányos az életkorral, fiatalabb nők körében magasabb volt a C. trachomatis fertőzöttség aránya. A fiatalabb nőkben, például a húsz év alattiak körében 18,8%-os, illetve a 20-29 évesek között 9,4%-os, magas prevalencia értékek voltak megfigyelhetők. Ezek az eredmények, annak ellenére, hogy egy magas rizikójú csoportba tartozó populációból származnak, alátámasztják azt a tényt, amely szerint az életkor a C. trachomatis fertőzés egyik rizikófaktora. Az életkor hatását tekintve számos tanulmányban hasonló eredményre jutottak, függetlenül attól, hogy azt milyen célcsoportban vizsgálták (Deák és mtsai 1997, Lan és mtsai 1995b, Lima és mtsai 2007, Papadogeorgaki és mtsai 2006). Az itt vizsgált populációban, miután a rendszeres és gyakori partnerváltás feltételezhetően mindegyik korcsoportra jellemző, a jelenségre a biológiai folyamatok adhatnak magyarázatot, idősebbekben az immunológiailag érettebb cervikális nyálkahártya reinfekció esetén gyorsabban és hatékonyabban küzdi le a fertőzést (Pal és mtsai 2001). A lokális immunitás C. trachomatis reinfekciójában játszott szerepét többféle állatmodellben vizsgálták. Ramsey és munkatársai egérben a humorális, Bsejthez kötött immunválasz gátlásakor azt tapasztálták, hogy reinfekció esetében a kontroll egerekhez hasonlóan a sejtközvetített lokális immunválasz eredményeként kialakult a vizsgált állatok immunitása (Ramsey és mtsai 1988). Rank és munkatársai eredményei alapján tengerimalacokban a sejtes immunválasz gátlásakor reinfekció esetén a kontroll állatokhoz képest elhúzódott a fertőzés, a meglévő humorális immunválasz hatására azonban sokkal kevesebb chlamydia elemi test volt kimutatható, mint primer fertőzéskor (Rank és munkatársai 1989). Mindez arra mutat, hogy a cervikális nyálkahártya C. trachomatis reinfekció során a sejtes és a humorális immunválasz közreműködésével hatékonyan és gyorsan képes a fertőzés leküzdésére. 6.1.3.
C. trachomatis fertőzés prevalenciája hazánkban
Európában, 14 ország adatait összehasonlító közlemény szerint tünetmentes nőkben a C. trachomatis fertőzés prevalenciája 1,7%-17% közötti, ezen belül az éves rákszűrésre jelentkezők között ez az arány átlagosan 4%-os értéket mutatott (Wilson és mtsai 2002). Magyarországon a cervikális C. trachomatis fertőzés nem tartozik a bejelentendő
45
szexuális úton terjedő fertőzések közé, így prevalenciájával kapcsolatban kevés adat áll rendelkezésre. A fertőzés kimutatására az egyes laboratóriumok többféle vizsgálatot alkalmazhatnak. Az urogenitális C. trachomatis fertőzések diagnosztikájára alkalmas C. trachomatis antigén kimutatásán alapuló direkt fluoreszcens antitest (DFA) technikát napjainkban fokozatosan felváltják a nukleinsav kimutatásán alapuló, magasabb szenzitivitású és specificitású metodikák. Ezek a módszerek az urethrából, cervixből származó minták mellett a nem invazív módon levett vizeletminták vizsgálatára is alkalmasak, például magas prevalenciájú populációk szűrésekor (Hammerschlag 2004, CDC 2006). Hazánkban az eddigi legnagyobb, célzott populációt vizsgáló felmérésben a C. trachomatis fertőzés gyakoriságát DNS hibridizációs technikával, terhes nők körében hét szülészeti központban vizsgálták, a prevalencia érték országos átlagban 5,7% volt (Deák és mtsai 1997). Fertőzésre utaló panasz miatt nőgyógyászati vizsgálatra jelentkező 18 év alatti serdülők között, hasonló technikával 15,6%-os prevalencia értéket találtak (Bardóczy és mtsai 1998). Egy másik tanulmányban 16 és 24 év közötti fiatal nőkben DNS amplifikációs technikával elvégzett vizsgálatok alapján a C. trachomatis fertőzés 7%-os prevalenciát mutatott, a húsz év alattiakban ez az érték 7,9% volt (Ujházy és mtsai 2007). Ezen korábbi közlemények, valamint a dolgozatomban tárgyalt vizsgálatok eredményei alapján kapott magas prevalencia értékek rávilágítanak a C. trachomatis fertőzés gyakori előfordulására hazánkban, amely egy jól szervezett C. trachomatis-surveillance rendszer kialakítását sürgeti. 6.1.4.
C. trachomatis genotipizálása
Az egyes C. trachomatis szerotípusokat korábban poliklonális és monoklonális ellenanyagokkal tipizálták, a molekuláris módszerek fejlődésével azonban a gyorsabb és költséghatékonyabb genotipizáló módszerek kerültek előtérbe. Napjainkban a leggyakrabban alkalmazott genotipizáló technikák a génszekvenálás és a PCR alapú restrikciós fragmens hossz polimorfizmus (RFLP) analízis. Mindkét módszer esetében az omp1 gén PCR amplifikációját követően a kapott PCR termék tipizálása történik (Gao és mtsai 2007, Lan és mtsai 1993, Lima és mtsai 2007, Lysén és mtsai 2004, Morré és mtsai 2000, Sturm-Ramirez és mtsai 2000).
46
6.1.4.1.
A gyakori szerotípusok eloszlása
A vizsgált prostituált populációban a C. trachomatis szerotípusok változatos eloszlást mutattak. Hét különböző urogenitális szerotípust sikerült azonosítani, az urogenitális csoportból egyedül a K szerotípus nem fordult elő. A három leggyakoribb szerotípus a D (34,4%), E (21,9%), és F (18,8%) volt, a kevésbé gyakoriak a G (9,4%), J (9,4%), H (3,1%) és I szerotípusok (3,1%). Számos tanulmányban a leggyakrabban előforduló C. trachomatis
szerotípusok
vonatkozásában
hasonló
eredmények
születtek.
A
szerotípusok gyakoriságát egyes tanulmányok eltérő földrajzi területeken, különböző populációkban, például magas rizikó csoportot képviselő prostituáltak között, alacsony rizikócsoportba tartozó terhes nőkben, STD betegek között nemek szerinti megoszlásban, vagy a klinikai tünetekkel összehasonlítva is vizsgálták. A tipizáláshoz PCR alapú RFLP analízist, vagy omp1 gén szekvenálásos technikát alkalmaztak, a leggyakoribbaknak ezekben a vizsgálatokban is a D, E és az átmeneti csoportba tartozó F vagy G szerotípusok mutatkoztak (Gao és mtsai 2007, Lan és mtsai 1993, 1995b, Lima és mtsai 2007, Lysén és mtsai 2004, Morré és mtsai 2000, Ngandjio és mtsai 2004, Sturm-Ramirez és mtsai 2000). Az általam vizsgált csoportban, összhangban más vizsgálatokkal, a C. trachomatis pozitív minták 75%-a D, E, vagy F szerotípus volt, amely arra utal, hogy a legtöbb urogenitális C. trachomatis fertőzésért mindössze néhány szerotípus felelős. 6.1.4.2.
Az egyes szerotípusok magasabb prevalenciájának lehetséges okai
Akut C. trachomatis fertőzéskor az immundomináns MOMP antigén az immunrendszer elsődleges célpontja. A MOMP antigén sejtfelszíni epitópjai, a három variábilis domén (VD1, VD2, VD4) antigén determinánsai felelősek a szerotípus specifikus ellenanyagválasz kialakulásáért. A VD-ek aminosav sorrendje az egyes szerotípusokban mindössze egy aminosav szubsztitúcióban különbözik, amely az antigént kódoló omp1 gén polimorfizmusának eredménye. Az egyes MOMP variánsok kialakulásával a kórokozó a specifikus immunválaszt sikeresebben védheti ki (Peeling és Brunham 1996). Az urogenitális szerotípusok közül a D, E, F/G szerotípusok gyakoribb előfordulásának lehetséges magyarázata lehet, hogy ezek a szerotípusok sikeresebben kerülik meg az immunrendszert, ezáltal hosszabb ideig képesek perzisztálni, illetve eltérő virulenciával rendelkezhetnek. Ito és munkatársai által kidolgozott egérmodellben a vizsgált
47
szerotípusok közül a D és E szerotípus hosszabb perzisztáló képességet mutatott. Ugyanebben a tanulmányban a D és H szerotípusok virulenciáját összehasonlítva a D szerotípus sokkal invazívabbnak bizonyult (Ito és mtsai 1990). Lan és munkatársai a PCR-alapú RFLP analízissel tipizálva a D szerotípus négy szerovariánsát különítették el (Lan és mtsai 1993). Az általam vizsgált tizenegy D szerotípus közül egy minta restrikciós mintázata tért el, amely a Lan és munkatársai által azonosított D– szerovariánsnak felelt meg. Lysén és munkatársai a C. trachomatis izolátumok omp1 gén szekvenálással történő tipizálásával a D szerotípuson belül találták a legnagyobb szekvencia heterogenitást (Lysén és mtsai 2004). A D szerotípus genetikai diverzitásában megfigyelt nagyfokú variabilitás elősegítheti ennek a szerotípusnak a specifikus immunválasz hatékony megkerülését és gyakoribb előfordulását. Az E szerotípus prevalenciája sok tanulmányban a legmagasabb (Gao és mtsai 2007, Sturm-Ramirez és mtsai 2000, Dean és mtsai 1995). Az E szerotípust összefüggésbe hozzák a tünetmentes és perzisztáló C. trachomatis fertőzésekkel (Dean és mtsai 1995, Gao és mtsai 2007, Morré és mtsai 2000). Az E szerotípus omp1 szekvencia variabilitása azonban a többi szerotípushoz képest alacsonyabb (Lysén és mtsai 2004, Dean és Millman 1997). A stabilitás magyarázata és a gyakori előfordulás oka az lehet, hogy ez a szerotípus kevésbé immunogén, ebből adódóan az immunológiai szelekció hatása is kisebb mértékű, amely többi szerotípussal szemben terjedési előnyt jelent. Az
F
szerotípusok
terjedési
sikerének
oka
hasonlóan
a
kisebb
mértékű
immunogenitásban keresendő. Van Duynhoven és munkatársai tanulmányukban az átmeneti csoportba tartozó F és G szerotípusok nagyobb előfordulási gyakoriságát tapasztalták olyan nők körében, akiknek alhasi fájdalommal járó, PID gyanúját felvető tünetei voltak (van Duynhoven és mtsai 1998). Hasonló eredményre jutottak Dean és munkatársai
egy
másik
vizsgálatban,
amelyben
összefüggést
találtak
az
F
szerovariánsok és a felső genitális traktus fertőződése között (Dean és mtsai 1995). Az F/G szerotípusok az alsó genitális traktusban feltehetően enyhe lefolyású fertőzést okoznak és a subklinikus fertőzést követően átterjedhetnek a kismedencébe. Ezt a hipotézist támasztja alá Workowski és munkatársai vizsgálata is, amelyben az F szerotípus okozta fertőzések a B és C-csoportba tartozó szerotípusokhoz képest
48
kismértékű lokális gyulladással és fluorral járó, enyhe tüneteket okoztak (Workowski és mtsai 1994). Az ismertetett szerotípusoknak mindezen tulajdonságai elősegíthetik, hogy a C. trachomatis fertőzés elleni szerotípus-specifikus humorális immunválaszt befolyásolják, így megteremtve a krónikus, perzisztáló fertőzés kialakításának lehetőségét. 6.1.5.
A C. trachomatis fertőzés, mint népegészségügyi probléma
Az enyhe lefolyású, illetve panaszmentes cervikális C. trachomatis fertőzés nőkben kismedencei gyulladás (PID) kialakulását okozhatja, amely később a petevezetékek anatómiai és funkcionális károsodásával meddőséghez, méhen kívüli terhességhez vezethet (Paavonen és Eggert-Kruse 1999). Terhesekben a C. trachomatis fertőzés következtében megnő a koraszülés kockázata, illetve fertőzött anyák újszülöttjeiben conjunctivitis, vagy újszülöttkori pneumonia alakulhat ki (Balla 2009). A C. trachomatis ascendáló fertőzése a felső genitális traktus szövődményes károsodását idézheti elő. A kórokozó mindezen betegségekben játszott potenciális etiológiai szerepéről a szerológiai vizsgálatok adhatnak felvilágosítást. A C. trachomatis ellenes specifikus IgG jelenléte korábbi fertőzésre utalhat, amely azonban önmagában nem nyújt információt arról, hogy a fertőzés teljesen megszűnt-e vagy tovább perzisztál. A perzisztáló fertőzés és a krónikus gyulladás szerológiai markereinek tekintik a C. trachomatis specifikus IgA ellenanyag, és a genus specifikus 60 kDa chlamydia HSP elleni IgG jelenlétét (den Hartog és mtsai 2006, Tiitinen és mtsai 2006). Az általános gyulladási markerként ismert C-reaktív protein és a C. trachomatis eredetű meddőség között a közelmúltban írtak le kapcsolatot, bővítve ezzel a szerológiai markerek körét (den Hartog és mtsai 2005). Laboratóriumunkban egy korábbi külföldi együttműködés keretében tubáris eredetű meddőségben szenvedő 107 nő és a kontroll csoportot alkotó 113 nő C. trachomatis szerostátuszát hasonlítottuk össze specifikus IgA és IgG ellenanyagok ELISA és Western blot technikán alapuló vizsgálataival. Az eredmények alapján szignifikáns összefüggés volt kimutatható a C. trachomatis szeropozitivitás és a tubáris eredetű meddőség között (Hartwell és mtsai 2006). Méhen kívüli terhességben szenvedő nőkben a C. trachomatis HSP-60 szerostátuszát vizsgáló hazai tanulmány szerint a HSP-60 elleni ellenanyagok jelenléte és a patológiás
49
terhesség között szignifikáns összefüggés volt kimutatható (Sziller és mtsai 1998). A C. trachomatis és HSP-60 szeropozitív nőkben emellett gyakoribbak voltak a patológiás klinikai állapotok (kismedencei összenövések, PID, salpingitis). Hazánkban a C. trachomatis fertőzöttség prevalenciájának populációs szintű vizsgálata mellett, a C. trachomatis fertőzés és a krónikus infekció következtében kialakult szövődmények kapcsolatát célzó további vizsgálatokra lenne szükség. 6.2. C. psittaci fertőzés igazolása molekuláris módszerekkel potenciális betegekben 6.2.1.
Klinikai kép és a betegség kimenetelében szerepet játszó tényezők
A psittacosis diagnózisának felállítása a klinikus számára nem egyszerű feladat. A betegség
tünetei
influenza-szerű
megbetegedésre
utalhatnak,
amelyek
közül
leggyakoribbak a láz, köhögés, hidegrázás, izomfájdalom és hasmenés. A pontos diagnózis legfontosabb támpontja a potenciális madárkontaktus tisztázása. Ez a tény a tünetek tükrében már önmagában felveti a psittacosis gyanúját, azaz fontos differenciáldiagnosztikai tényező. (Smith és mtsai 2005, Verweij és mtsai 1995). Manifeszt psittacosis során gyakori a tüdők érintettsége, és pneumonia kialakulása. A mellkasröntgen-felvételeken jól láthatóak az intersticiális, vagy a tüdőlebenyeket érintő infiltrátumok (Gherman és mtsai 1995, Heddema és mtsai 2003, Kovacova és mtsai 2007, Soni és mtsai 1999, Verweij és mtsai 1995). Klinikailag azonban ez a kép nem különíthető el egyéb, pneumoniával járó megbetegedéstől. Mindkét bemutatott esetben jelentkeztek az atípusos klinikai tünetek. Az első esetben a háziorvos egy hatástalan amoxicillin terápiát írt fel, a beteg állapota rosszabbodott és ezt követően kórházi felvételre került. A második esetben a lázzal, köhögéssel járó megbetegedéssel a beteg feltehetően nem fordult háziorvoshoz, a heteroanamnézis alapján a két hétig húzódó tüneteivel végül kórházi kezelésre kényszerült. A kórházi felvételt követően mindkét beteg esetében a mellkasröntgen kiterjedt pneumoniát igazolt. A betegség fatális kimenetelében, az első esetben a helytelen kezelés, míg a második esetben a késleltetett szakorvosi ellátás játszhatott döntő szerepet. A C. psittaci fertőzés során gépi lélegeztetést igénylő súlyos légzési elégtelenség kialakulása több esetleírásban megtalálható, aránylag ritka kórkép (Kovacova és mtsai 2007, Soni és mtsai 1999, Verweij és mtsai 1995). A súlyos psittacosis kialakulásának legfőbb okai közt szerepel a madárkontaktus tényének kései tisztázása. A bemutatott két
50
esetben a betegek kialakult tüdőgyulladásának kezelésére a súlyos, közösségben szerzett pneumoniának
megfelelő
empirikus
antibiotikum
terápiát
indítottak,
amely
hatástalannak bizonyult. A halálos kimenetelű psittacosis ritka, a mortalitás aránya kevesebb, mint 1% (Smith és mtsai 2005). A psittacosis előrehaladott stádiumában azonban a súlyos légzési elégtelenség kialakulása, a tüdők kétoldali érintettsége, hypoxia, a többszervi elégtelenség és a beteg általános állapota, előrehaladott kora a betegség kimenetelében szerepet játszó rizikófaktorok lehetnek. A bemutatott két esetben az azonnali adekvát kezelés hiányában súlyos légzési elégtelenség alakult ki, mindkét beteg gépi lélegeztetésre szorult, azonban az intenzív terápia ellenére egyikükön sem lehetett segíteni. Az első beteg esetében a magasabb életkor, a második beteg esetében a leromlott egészségi állapot lehetett a betegség kimenetelét befolyásoló kockázati tényező. 6.2.2.
Antibiotikum terápia
A psittacosis kezelésére a CDC által javasolt elsődlegesen választandó antibiotikum a doxycyclin (2x100 mg 10-21 napig) (Smith és mtsai 2005). A bemutatott esetekben azonban a kórházi kezelés során először empirikus terápiát indítottak, az első esetben a terápia egy harmadik generációs fluorokinolon adásával kezdődött, majd egy negyedik generációs fluorokinolonnal folytatódott. A második esetben a kezelés során egy negyedik
generációs
fluorokinolont
kombináltak
β-laktám
antibiotikummal,
rifampicinnel és aminoglikoziddal. A második esetben a doxycyclin terápiát csak a mikrobiológiai
laboratóriumi
eredmény
ismeretében
kezdték
el.
In
vitro
tanulmányokban a chlamydiák elleni kezelésben az újonnan kifejlesztett harmadik és negyedik
generációs
fluorokinolonok
is
hatásosnak
bizonyultak,
chlamydia
speciesekkel fertőzött szövettenyészeten gátló hatást mutattak (Donati és mtsai 2002, Hammerschlag 2000b). Tetraciklinekkel és makrolidokkal in vitro összehasonlítva azonban kisebb gátló hatás volt tapasztalható. A súlyos psittacosis esetleírásokban a betegek állapotában általában a doxycyclin terápia megkezdésével javulást tapasztaltak (Soni és mtsai 1999, Verweij és mtsai 1995). A fluorokinolonok alkalmazása a chlamydia fertőzések kezelésében, in vivo hatékonyságuknak meghatározása további vizsgálatokat igényel (Hammerschlag 2000b).
51
6.2.3.
Laboratóriumi diagnosztika
A psittacosis laboratóriumi diagnosztikája elsősorban szerológiai vizsgálatokon alapul. A C. psittaci fertőzés diagnosztikájában jelenleg a MIF vizsgálatot használják elterjedten. A tünetek megjelenését követően már az akut fázisban vett szérum minták is vizsgálhatóak, az ellenanyagszint-változás követésére az első mintavételt követő két hét múlva a konvaleszcens fázisban vett szérum minta vizsgálata javasolt (Smith és mtsai 2005). A CDC esetdefiníciója alapján a psittacosis tényét alátámasztják a laboratóriumi eredmények, amennyiben az akut fázisú szérum mintában C. psittaci ellenes specifikus IgM ≥1:16 ellenanyagtiter detektálható, vagy IgG ≥1:32 ellenanyagtiterű akut fázisú szérum mintához képest a konvaleszcens fázisú második szérum mintában legalább négyszeres titer emelkedés mutatható ki (Smith és mtsai 2005). A mikroimmunfluoreszcens tesztek előnye, hogy a szérumban jelenlévő C. psittaci ellenes specifikus ellenanyagok izotípusai külön-külön detektálhatók, ezáltal az IgM kimutatása révén elősegítheti a klinikai diagnózis gyors megerősítését. Bár a kereskedelemben kapható MIF tesztekkel magas specificitásuknak köszönhetően az egyes humánpatogén chlamydiák ellen termelődött ellenanyagok elkülöníthetőek, a gyakorlatban azonban a chlamydia speciesek közötti nagyfokú antigén-homológia következtében előfordulhat keresztreakció. A tesztek másik hátránya, hogy a fertőzést követően kialakuló ellenanyagválasz dinamikájából adódóan az ellenanyagtiter-változás ellenőrzésére gyakran egy második szérum minta vizsgálata is szükséges (Wong és mtsai 1994, Smith és mtsai 2005). Amennyiben a mintavétel a fertőzés korai fázisában történik, előfordulhat, hogy a szérumban még nincsen jelen detektálható C. psittaci specifikus ellenanyag. A másik lehetőség, hogy a specifikus IgM titer már lecsökkent, csak a specifikus IgG mutatható ki. Mindkét esetben szükséges egy második vérminta vizsgálata, súlyos psittacosis esetén azonban a diagnózis megerősítésére kevés idő áll rendelkezésre. Ilyen esetekben a kórokozó közvetlen kimutatása nyújthat segítséget, a C. psittaci PCR vizsgálat segíthet alátámasztani a gyors diagnózist. A C. psittaci kimutatására nincsen standardizált, kereskedelemben forgalmazott teszt, a diagnosztikai laboratóriumok
elsősorban
saját
tervezésű
PCR
vizsgálatokat
végeznek.
A
leggyakrabban használt célszekvenciák a MOMP, a 16S rRNS, valamint a 60 kDa CRP
52
génszakaszok (Heddema és mtsai 2006b, Tong és Sillis 1993, Messmer és mtsai 1997, Sheehy és mtsai 1996). A bemutatott első esetben csak a postmortem minták vizsgálatára volt lehetőség, azonban már a szerológiai eredmények, az 1:16 titerben detektált specifikus IgM és a magas, 1:512 titerben detektált IgG, összhangban a klinikai képpel alátámasztotta a diagnózist. A tüdőszövetből a C. psittaci DNS kimutatása megerősítette a szerológiai eredményeket. A második esetben specifikus IgM már nem volt kimutatható. A specifikus IgA jelenléte nem minden esetben utal egyértelműen friss fertőzésre, egy második vérminta lett volna szükséges az ellenanyagtiterek változásának vizsgálatához. A mélylégúti mintából, a bronchus váladékból a C. psittaci DNS detektálása azonban megerősítette a diagnózist. Genotipizálás A C. psittaci pozitív humán mintákban a C. psittaci szerotípus azonosítása elsősorban a fertőzés forrásának megállapítását segítheti, a C. psittaci fertőzés diagnosztikájában epidemiológiai szerepe van. A C. psittaci szerotípusok elkülönítése PCR alapú RFLP analízisen, szekvenáláson, valamint újabban kifejlesztett DNS microarray genotipizáló technikán alapulhat (Sayada és mtsai 1995, Vanrompay és mtsai 1997, Geens és mtsai 2005, Sachse és mtsai 2008). Az egyes szerotípusok előfordulását főleg különböző madárrendeken belül, egyes madárfajokban vizsgálták, humán minták ilyen vonatkozású vizsgálatáról kevés irodalmi adat áll rendelkezésre. Heddema és munkatársai egy állatorvosi kórházban kitört psittacosis járvány kapcsán igazolták az A szerotípus jelenlétét, ahol a vizsgált papagájokat, mint fertőző forrást azonosították (Heddema és mtsai 2006a). Egy másik közleményükben összegyűjtött pozitív humán mintákból származó C. psittaci izolátumokban az ompA gén szekvenálásával az A, B és C szerotípust sikerült azonosítaniuk, hangsúlyozva, hogy zoonózis szempontjából az európai madarak által hordozott szerotípusok is potenciális veszélyt jelentenek (Heddema és mtsai 2006c). A bemutatott esetekben a C. psittaci szerotípusok azonosítása szempontjából érdekes vizsgálati alapul szolgál, hogy a minták baromfifeldolgozó-üzemekből származnak. Laboratóriumunkban további célul tűztük ki egy genotipizáló módszer beállítását, amely a psittacosis epidemiológiájáról nyújthat tisztább képet.
53
6.2.4.
Veszélyeztetett populációk
Mindkét beteg baromfifeldolgozó üzemekben, a kopasztó részlegen volt alkalmazott, Békés, illetve Bács-Kiskun megyékben, a madárkontaktus tényére azonban viszonylag későn derült fény. A lehetséges okok között szerepelhet, hogy maguk a betegek sem számoltak be a foglalkozásukról, a nem hivatalos úton történő alkalmazásukból kifolyólag. A baromfifeldolgozó üzemek alkalmazottai a psittacosis vonatkozásában magas rizikójú csoportot képviselnek. A fertőzött egyedekkel történő állandó szoros kontaktus a mészárszéknél, a kopasztó vagy a húsfeldolgozó részlegeken, megfelelő védőfelszerelés hiányában megnöveli a fertőzés kockázatát. Az első beteg munkahelyén, a Békés megyei baromfifeldolgozó üzemben, az esettel azonos időszakban 72 megbetegedéssel járó psittacosis járványt azonosítottak, halálos kimenetelű csak ez az egy eset volt (Országos Epidemiológiai Központ 2007). A feldolgozó üzemek nagy része tradicionális okokból a dél-kelet magyarországi régióban található, így a nagyszámú psittacosis megbetegedés kialakulása szempontjából ezek a leginkább érintett területek. 6.3. C. pneumoniae és az atherosclerosis kapcsolatának vizsgálata ballonkatéteres koszorúér-tágításon átesett betegpopulációban A patogén mikroorganizmusok, ezen belül is a C. pneumoniae szerepe az atherosclerosis folyamatában máig vitatott tudományos hipotézis, amelyet számos független, multicentrikus szerológiai vizsgálat, illetve a kórokozó, vagy annak valamilyen fehérjéjének kimutatásán alapuló tanulmányok eredményei támasztanak alá. A C. pneumoniae in vitro képes az összes atheromás plakk kialakulásában résztvevő sejttípust megfertőzni, melyek alapján feltételezhető, hogy ezek a kórokozó in vivo perzisztálásának lehetséges helyszínei (Gaydos és mtsai 1996). Az atherosclerosis folyamata legtöbbször a szívkoszorú-érrendszert érinti, amely során az atheromás plakk következtében kialakult érszűkület gyengébb oxigénellátást biztosít, gyengíti a szívizom működését,
és
infarktushoz
vezethet.
A
C.
pneumoniae
mellett
a
CMV
atherosclerosisban játszott szerepével is számos tanulmány foglalkozott (Smieja és mtsai 2001b, Zhou és mtsai 1996), valamint egyéb, reaktiválódásra képes perzisztáló vírusokat (HSV, EBV) is kapcsolatba hoztak a betegséggel.
54
6.3.1.
C. pneumoniae és CMV DNS jelenléte a perifériás vérben és a PTCA beavatkozás közötti összefüggés
Szívkoszorúér-betegségben szenvedők körében a PTCA eljárás az egyik legelterjedtebb műtéti beavatkozás. Az atherectomiával ellentétben a koszorúérbe vezetett ballon mechanikus felfújásával történő értágítás kevésbé invazív módszer, legnagyobb hátránya azonban a műtétet követő hat hónapon belül a restenosis kialakulásának magas, 20-60%-os gyakorisága (Zhou és mtsai 1996, Mattila és mtsai 2001). Vizsgálatunkban arra kerestük a választ, hogy a PTCA beavatkozáskor a perifériás vérben kimutatható-e a C. pneumoniae és CMV jelenléte, és ebben a tekintetben van-e különbség a műtétet megelőző, illetve azt követő állapot között. Eredményeink alapján a PTCA-t követően levett perifériás vérmintákban a C. pneumoniae és a CMV DNS nagyobb arányban volt detektálható, mint a műtétet megelőzően, amely alapján feltételezhető ezeknek a kórokozóknak a reaktivációja. A módszer érzékenységét a mintánként beállított öt párhuzamos PCR vizsgálat növelte (Smieja és mtsai 2001a). Ennek ellenére a vizsgált patogének alacsony prevalencia eredményei azt sugallják, hogy perifériás vérmintákban ezek a kórokozók nagyon kis kópiaszámban fordultak elő. Munkacsoportunk korábbi vizsgálatában stroke betegek perifériás vérmintáiból történő a C. pneumoniae és CMV DNS kimutatása eredményeként hasonlóan alacsony C. pneumoniae (10% kontroll csoport esetében, 17% stroke betegek esetében) prevalencia értéket kaptunk (Kis és mtsai 2007). A C. pneumoniae jelenléte a perifériás vérben általános jelenség. Szívkoszorúérbetegségben szenvedők körében a C. pneumoniae jelenlétét a perifériás vérben vizsgáló tanulmányok az egészséges kontrollcsoporthoz képest a betegcsoportban általában szignifikánsan nagyobb arányú pozitivitást találtak (Kaul és mtsai 2000, Wong és mtsai 1999). Smieja és munkatársai összefoglalójukban 18 tanulmány eredményeit hasonlították össze, amelyek a C. pneumoniae DNS perifériás vérből történő kimutatásával foglalkozott (Smieja és mtsai 2002). A tanulmányok egyik fele a C. pneumoniae DNS kimutatását betegekben és kontroll csoportban párhuzamosan vizsgálta. A többi tanulmányban a vizsgálatokat egy adott csoportban (egészséges véradók, szívbetegek) végezték. Smieja és munkatársai elemzése alapján a C. pneumoniae prevalenciája a kontroll csoportban 0-46% közötti, a szív-érrendszeri betegségben szenvedők körében 4,2-59% közötti volt. Megállapításuk szerint az
55
összehasonlított tanulmányok alapján a szív-érrendszeri betegségben szenvedők között a C. pneumoniae prevalenciája magasabb volt. Mindemellett a prevalencia értékekben tapasztalható nagy eltérések feltételezhetően metodológiai különbségekre vezethetőek vissza. Az egészséges véradók körében tapasztalt magas prevalencia értékek ezzel szemben az egyes vizsgálatok specificitását kérdőjelezik meg. Az atheromás plakk destrukciójával járó PTCA beavatkozás következtében a plakkból kiszabaduló kórokozók jelenlétét a perifériás vérben eddig kevés tanulmány vizsgálta. Yetkin és munkatársai a PTCA beavatkozás előtt és a beavatkozás követő pár perc után közvetlenül a kérdéses koszorúérből vett vérmintákban hasonlították össze a C. pneumoniae DNS jelenlétét (Yetkin és mtsai 2002). Vizsgálatukban, míg a műtét előtt egyik esetben sem volt detektálható, a műtétet követően négy esetben (4/14, 29%) kimutatták C. pneumoniae DNS-t, amely alátámasztotta feltevésüket, hogy a plakkban perzisztáló kórokozó a műtét hatására kiszabadulva a keringésbe juthat. Smieja és munkatársai, műtéti beavatkozással járó fizikai inger hatására a plakkban perzisztáló kórokozók reaktiválódásának hipotézisét vizsgáló tanulmányukban nem tapasztalták a műtétet követően a C. pneumoniae vagy CMV DNS prevalenciájának növekedését. A szerzők szerint ennek lehetséges magyarázatai, hogy a kórokozók a plakkban kis koncentrációban fordulnak elő, a műtétet követően nem a megfelelő időpontban történt a mintavétel (közvetlenül utána, majd négy óra elteltével), illetve a patogén nem volt jelen az atheromás plakkban (Smieja és mtsai 2001b). Vizsgálatunkban e megállapításokon kívül, a perifériás vérmintákban detektált C. pneumoniae és CMV DNS alacsony prevalenciájának további lehetséges oka a PTCA eljárás kevésbé invazív volta, ellentétben például az atherectomiával, amely nagyobb sérülést okoz az érfalban, ezáltal nagyobb fokú patogén reaktivációhoz vezethet. 6.3.2.
C. pneumoniae ellenanyagszint-változás és a PTCA beavatkozás közötti összefüggés
Szív-érrendszeri betegségben szenvedők esetében a plakkok spontán ruptúrájának jelensége magyarázatul szolgálhat e betegek körében megfigyelt magasabb C. pneumoniae ellenanyagszinteket összegző szeroepidemiológiai adatokra (Kaehler és mtsai 2005). Az értágító műtéti beavatkozást követően, a mechanikai inger hatására feltételezhetően egy hasonló folyamat zajlik le. A vizsgált hipotézis alapján, a plakkban
56
perzisztáló C. pneumoniae a PTCA beavatkozás során, a plakk ruptúrát követően bekerül a keringésbe és reaktiválódik, melynek hatására a beinduló humorális immunológiai válaszreakciót specifikus ellenanyagszint-emelkedés kíséri. A C. pneumoniae szerológiai vizsgálatok a rutin diagnosztikában alkalmazott ELISA technikával történtek. Az IgG ellenanyagszint mellett sor került az IgA ellenanyagszint vizsgálatára is. A specifikus IgA ellenanyag jelenléte reinfekcióra, vagy perzisztáló fertőzésre utalhat, a magas IgA titert krónikus fertőzéssel hozzák összefüggésbe (Saikku és mtsai 1988, Dowell és mtsai 2001). A szerológiai eredmények vizsgálatunkban nem támasztották alá sem a C. pneumoniae, sem a többi vizsgált kórokozó a PTCA beavatkozást követő reaktiválódásának hipotézisét. E tekintetben más tanulmányokban is ellentmondásos eredmények születtek. Egyes vizsgálatok során a C. pneumoniae elleni ellenanyagszint a PTCA műtétet követően megemelkedett, míg mások nem tapasztaltak változást. Kaehler és munkatársai vizsgálatukban a PTCA beavatkozást követő 6 hetes kontroll során szignifikáns C. pneumoniae IgG ellenanyagszint emelkedést detektáltak (Kaehler és mtsai 2005). Yetkin és munkatársai a PTCA-t követő egy hónap után elvégzett szerológiai vizsgálatban, a műtétet megelőzően szeronegatív betegek esetében mutattak ki szignifikáns C. pneumoniae IgG ellenanyagszint emelkedést, azonban a korábban szeropozitív betegek körében nem történt változás (Yetkin és mtsai 2004). Az ellentmondásos eredmények magyarázatául szolgálhat az átlagpopulációk magas C. pneumoniae szeropozitivitásának ténye, valamint a szeropozitív egyének között megfigyelhető magas ellenanyagszint előfordulása, amelyből kifolyólag a PTCA beavatkozást követő esetleges kisebb mértékű ellenanyagszint emelkedés szerológiailag már nem detektálható. Tuuminen és munkatársai egészséges finn populáció vizsgálatakor kimutatták, hogy a C. pneumoniae specifikus IgA szeroprevalenciája hasonlóan magas, mint az IgG szeroprevalenciája, valamint az IgA prevalenciája is korcsoportos növekedést mutatott (Tuuminen és mtsai 2000). További okokhoz sorolható a beavatkozást követően különböző időpontokban történt mintavétel, illetve szerológiai módszerek közötti különbség. Vizsgálatunkban érdemes lett volna a PTCA beavatkozást követő 14. napnál később levett mintákban is tanulmányozni az esetleges ellenanyagszint-változást, azonban a kórház PTCA műtéti protokolljából adódóan a
57
beavatkozást követő második héten zajló kontroll vizsgálat után a betegek visszahívása nem volt megoldható. Munkacsoportunk egy korábbi vizsgálatában stroke betegek perifériás vérmintáját vizsgálva, nem talált különbséget a beteg és a kontroll csoport C. pneumoniae ellenanyagszintjei között, azonban a stroke és a CMV ellenanyagszint között összefüggés volt kimutatható (Kis és mtsai 2007). Heltai és munkatársai vizsgálatukban myocardiális infarktuson átesett betegek körében detektált magas C. pneumoniae ellenanyagszint és a betegség között szignifikáns összefüggést mutattak ki, a CMV ellenanyagszintben viszont a kontroll csoporthoz képest nem volt detektálható különbség (Heltai és mtsai 2004). Hasonlóan, Burian és munkatársai szívkoszorúérbetegségben
szenvedők
körében
tapasztalt
összefüggést
a
C.
pneumoniae
ellenanyagszint és az atherosclerosis között (Burian és mtsai 2001b). Mindezen eredmények arra engednek következtetni, hogy a vizsgált kórokozók az atherosclerosis folyamatában
kockázati
tényezőt
jelentenek,
és
a
vizsgálatok
kimenetelét
befolyásolhatja, milyen betegcsoportba tartozik a választott populáció. Az érműtétet követő restenosis kialakulásával, amely az endothel simaizom sejtjeinek proliferációjával jár, elsősorban a CMV-t hozták összefüggésbe, de a C. pneumoniae szerepét is vizsgálták (Zhou és mtsai 1996, Campbell és mtsai 1995, Mattila és mtsai 2001). Vizsgálatunkban a PTCA beavatkozást követően restenosis a betegek 30%-ánál alakult ki, amely a műtéti módszer tulajdonságából adódóan várható érték volt. A vizsgált, relatív kisszámú betegcsoport, valamint a C. pneumoniae és CMV DNS előfordulásának alacsony gyakorisága következtében azonban nem lehetett összefüggést találni a kórokozók restenosis kialakulásában játszott esetleges szerepével kapcsolatban. Vizsgálatunkban emellett a PTCA beavatkozáson átesett betegek körében egyes gyulladási markerek (hisztamin, C-reaktív protein és interleukin-6) szérumszintjeinek emelkedését tapasztaltuk, amely a beavatkozást követő gyulladásos folyamatok kialakulására utal. Eredményeink a műtétet követően magasabb C. pneumoniae és CMV DNS prevalenciát mutattak, alátámasztva az atherosclerosis folyamatában játszott szerepüket.
58
7. Következtetések – új eredmények C. trachomatis fertőzés prevalenciájának meghatározása, molekuláris tipizálása hazai veszélyeztetett populációban Magyarországon a különböző populációkban vizsgált C. trachomatis előfordulási gyakoriságáról kevés adat áll rendelkezésre, az egyes C. trachomatis szerotípusok megoszlásával és prevalenciájával kapcsolatban hazai tanulmány még nem foglalkozott. Munkám során hazánkban egy eddig nem vizsgált, magas rizikójú csoportot képviselő populációban egy általam beállított módszerrel meghatároztam a C. trachomatis fertőzés prevalenciáját. Ezt követően laboratóriumunkban egy új genotipizáló technika adaptálásával azonosítottam az egyes C. trachomatis szerotípusokat. Az eredmények összhangban állnak hasonló külföldi vizsgálatok eredményeivel. A rizikócsoportot képviselő prostituált populációban megfigyelt prevalencia érték (6,6%) korrelál a közép-, illetve a nyugat-európai felmérések adataival. A C. trachomatis szerotípusok megoszlási gyakoriságának vizsgálatával megállapítható, hogy más külföldi tanulmányokhoz hasonlóan Magyarországon is a D, E és F szerotípusok a leggyakoribbak. A dolgozatomban ismertetett, hazánkban elsőként alkalmazott RFLP analízis alapú genotipizáló technika további epidemiológiai vizsgálatokban és a diagnosztikában is jól alkalmazható molekuláris metodika. A munkám során beállított molekuláris technikák jó alapot jelentenek további epidemiológiai felmérésekhez, az egyes populációkban cirkuláló C.
trachomatis szerotípusok prevalenciájának meghatározásához. A
genotipizálás továbbá a C. trachomatis fertőzés tünetekkel összefüggő vizsgálatában, valamint az Európában már számos országban felbukkanó LGV klinikai gyanúja esetén a differenciáldiagnosztika módszereként alkalmazható. C. psittaci fertőzés igazolása molekuláris módszerekkel potenciális betegekben A C. psittaci fertőzés okozta megbetegedések, megfelelő laboratóriumi diagnosztika hiányában, pusztán a klinikai kép alapján nehezen ismerhetőek fel. Klinikai gyanú esetén döntő fontosságú a madárkontaktus felderítése. A helytelen klinikai diagnózis, a
59
nem megfelelő antibiotikum-kezelés a beteg állapotának súlyosbodását vonhatja maga után, a fertőzés akár halálhoz is vezethet. Munkámban két haláleset kapcsán a klinikai kép és az anamnézis alapján felmerülő psittacosis gyanúját az általam kidolgozott molekuláris diagnosztikai módszerekkel sikerült először alátámasztani, melyek a szerológiai vizsgálati eredményeket is megerősítették. Mindkét beteg egy baromfifeldolgozó üzemben dolgozott. A klinikai diagnózis felállításakor a lázzal járó légúti fertőzések vonatkozásában nem hagyható figyelmen kívül a C. psittaci fertőzés gyanúja, elsősorban a háziszárnyasok tenyésztésével, feldolgozásával foglalkozó vidékeken. A dolgozatomban ismertetett eredmények a laboratóriumi diagnosztikán belül rávilágítanak a C. psittaci közvetlen kimutatásának jelentőségére, amely gyorsabb eredményt adva hatékonyabbá teheti a súlyos psittacosis-gyanús megbetegedések kezelését. C. pneumoniae és az atherosclerosis kapcsolatának vizsgálata ballonkatéteres koszorúér-tágításon átesett betegpopulációban A PTCA beavatkozáson átesett betegek körében a C. pneumoniae és az atherosclerosis közötti összefüggés vizsgálatával kapcsolatos eredmények arra engednek következtetni, hogy az atherosclerosis folyamatában esetlegesen szerepet játszó kórokozók, a C. pneumoniae és a CMV a műtéti beavatkozás hatására reaktiválódnak. PTCA műtét után, eredményeink alapján először sikerült kimutatni nagyobb arányú C. pneumoniae és a CMV DNS jelenlétét betegek perifériás vérmintáiban. A jelen megfigyelések alátámasztása céljából további vizsgálatokra, elsősorban nagyobb beteganyag feldolgozására lenne szükség. A C. pneumoniae DNS perifériás vérben történő detektálása mellett, érdekes lenne atherectomia esetén a plakkban, PTCA esetén az érintett koszorúerekből vett vérben megvizsgálni a kórokozó DNS jelenlétét és a kapott eredményeket összehasonlítani. A szerológiai vizsgálatok a C. pneumoniae és az atherosclerosis tekintetében, elsősorban a C. pneumoniae magas prevalenciájának köszönhetően korlátozott értékűek. Ellenanyagszint-változások további vizsgálata szempontjából a PTCA beavatkozást követően a gyakoribb, illetve hosszabb idő elteltével történő mintavétel nyújthat több információt.
60
8. Összefoglalás A chlamydiák obligát intracelluláris baktériumok, képviselőik közül három faj széles körben elterjedt emberi megbetegedéseket okoz. Dolgozatomban a három patogén chlamydiával kapcsolatos molekuláris diagnosztikai vizsgálataimat foglaltam össze. A Chlamydia trachomatis világszerte az egyik leggyakoribb szexuális úton terjedő bakteriális kórokozó. Magyarországon a fertőzés prevalenciájával kapcsolatban kevés adat áll rendelkezésre. Ezen belül az egyes urogenitális C. trachomatis szerotípusok megoszlását
hazánkban
eddig
még
nem
vizsgálták.
Munkám
célja
magas
rizikócsoportot képviselő prostituált populációban a C. trachomatis fertőzés prevalenciájának meghatározása, valamint az egyes szerotípusok azonosítására szolgáló genotipizáló metodika kidolgozása volt. Az eredmények alapján a fertőzés prevalenciája 6,6% volt, amely az életkorral fordított összefüggést mutatott. A pozitív mintákban hét különböző szerotípust sikerült azonosítani, ezek közül -más külföldi adatokkal összhangban-, hazánkban is a D, E és F szerotípusok bizonyultak a leggyakoribbaknak. A C. psittaci fertőzés madarakról emberre terjedő, ritkán fatális kimenetelű légúti megbetegedéseket okoz. Jelen értekezésben feltehetőleg psittacosis következtében elhunyt két baromfifeldolgozó üzemi alkalmazott esetét tárgyalom. Az általam kidolgozott molekuláris diagnosztikai módszerekkel sikerült alátámasztani a psittacosis diagnózisát. Ezek az eredmények rávilágítanak a C. psittaci közvetlen kimutatásának jelentőségére a laboratóriumi diagnosztikában, amely lehetővé teszi a súlyos psittacosis gyanús megbetegedések célzott kezelését. A C. pneumoniae rendszerint enyhe lefolyású légúti megbetegedéseket okoz, a fejlett országokban a területen szerzett pneumoniás esetek mintegy 10%-áért tehető felelőssé. A kórokozó az elmúlt húsz évben kitüntetett szerepet kapott az atherosclerosis kialakulását vizsgáló kutatásokban. Vizsgálatunk célja szívkoszorúér-szűkületek ballonkatéteres műtéti tágításának hatására, az érfalban perzisztáló C. pneumoniae és cytomegalovirus reaktiválódásának kimutatása volt. Eredményeink alapján először sikerült betegek perifériás vérmintáiban nagyobb arányú C. pneumoniae és CMV DNS jelenlétét kimutatni a műtétet követően, mint azt megelőzően. Ezek a megfigyelések arra engednek következtetni, hogy az atherosclerotikus érfalban jelenlévő kórokozók a fizikai inger hatására valóban reaktiválódhatnak, amely további gyulladáshoz vezethet.
61
Summary Chlamydiae are obligate intracellular bacteria among which three human pathogen species are described for causing widespread infections. In this dissertation I summarized my molecular diagnostic research results on these three chlamydia species. Chlamydia trachomatis is one of the most prevalent sexually transmitted bacterium worldwide. In Hungary, only limited information is available on the prevalence of Chlamydia trachomatis infection, and the distribution of certain urogenital serovars has not been determined yet. The aims of this thesis were to determine the prevalence of Chlamydia trachomatis infection in a high-risk population and to develop a genotyping method for characterizing certain serovars. According to the results the prevalence of the infection was 6,6%, which showed a negative correlation with age. In the positive samples seven different serovars could be identified, the most prevalent were serovars D, E and F in correlation with other findings from different countries. C. psittaci infection spreading from birds to humans causes respiratory disease, which can be occasionally fatal. In the present work cases of two poultry-processing-plant employees have been discussed, who presumably died due to psittacosis. I have adapted some molecular methods for human samples by which the diagnosis was eventually confirmed. These results point out the relevance of direct detection of C. psittaci in the laboratory diagnostics, which could make more effective the management of suspected cases of psittacosis. C. pneumoniae usually causes mild respiratory infections and it is responsible for about 10% of community acquired pneumonia cases in developed countries. The pathogen has gained a significant role in the research field of the development of atherosclerosis. The objective of this work was to detect the reactivation of persistent C. pneumoniae and cytomegalovirus as the result of coronary angioplasty intervention. Our results have revealed for the first time a higher prevalence of C. pneumoniae and CMV DNA in the periferial blood samples of patients after the intervention than before. These findings might suggest that certain pathogens present in the atherosclerotic vessel wall, could be reactivated by the mechanical injury, which could be a risk factor for further inflammation process.
62
9. Irodalomjegyzék Abdelrahman YM, Belland RJ. (2005) The chlamydial developmental cycle. FEMS Microbiol Rev 29, 949-959. Alexander S, Martin IM, Ison C. (2008) A comparison of two methods for the diagnosis of lymphogranuloma venereum. J Med Microbiol 57, 962-965. Andersen AA. (1991) Serotyping of Chlamydia psittaci isolates using serovar-specific monoclonal antibodies with the microimmunofluorescence test. J Clin Microbiol 29, 707-711. Balla E. (2009) Újszülöttkori Chlamydia trachomatis-fertőzések – az aktuális laboratóriumi diagnosztikai módszerek áttekintése. Orv Hetil 150, 805-809. Bardóczy Zs, Sziller I, Sembery K, Ujházy A, Demeter A, Papp Z. (1998) Szexuális úton terjedő fertőzések előfordulása serdülőkorú leányokon, különös tekintettel a Chlamydia trachomatis-ra. Magy Venerol Arc 2, 117-120. Bedson SP, Western GT, Simpson SL. (1930) Observations on the aetiology of psittacosis. Lancet i, 235-236. Belland RJ, Ouellette SP, Gieffers J, Byrne GI. (2004) Chlamydia pneumoniae and atherosclerosis. Cell Microbiol 6, 117-127. Boman J, Gaydos CA, Quinn TC. (1999) Molecular diagnosis of Chlamydia pneumoniae infection. J Clin Microbiol 37, 3791-3799. Burian K, Berencsi K, Endresz V, Gyulai Z, Valyi-Nagy T, Valyi-Nagy I, Bakay M, Geng Y, Virok D, Kari L, Hajnal-Papp R, Trinchieri G, Gonczol E. (2001a) Chlamydia pneumoniae exacerbates aortic inflammatory foci caused by murine cytomegalovirus infection in normocholesterolemic mice. Clin Diagn Lab Immunol 8, 1263-1266.
63
Burian K, Kis Z, Virok D, Endresz V, Prohaszka Z, Duba J, Berencsi K, Boda K, Horvath L, Romics L, Fust G, Gonczol E. (2001b) Independent and joint effects of antibodies to human heat-shock protein 60 and Chlamydia pneumoniae infection in the development of coronary atherosclerosis. Circulation 103, 1503-1508. Burton MJ. (2007) Trachoma: an overview. Br Med Bull 84, 99-116. Caldwell HD, Kromhout J, Schachter J. (1981) Purification and partial characterization of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. Infect Immun 31, 11611176. Campbell LA, Blessing E, Rosenfeld M, Lin T, Kuo C. (2000) Mouse models of C. pneumoniae infection and atherosclerosis. J Infect Dis 181 (Suppl 3), S508-513. Campbell LA, O'Brien ER, Cappuccio AL, Kuo CC, Wang SP, Stewart D, Patton DL, Cummings PK, Grayston JT. (1995) Detection of Chlamydia pneumoniae TWAR in human coronary atherectomy tissues. J Infect Dis 172, 585-588. Centers for Disease Control and Prevention, Workowski KA, Berman SM. (2006) Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2006. MMWR Recomm Rep 55 (RR11), 1-94. Chiu B, Viira E, Tucker W, Fong IW. (1997) Chlamydia pneumoniae, cytomegalovirus, and herpes simplex virus in atherosclerosis of the carotid artery. Circulation 96, 21442148. Cwikel JG, Lazer T, Press F, Lazer S. (2008) Sexually transmissible infections among female sex workers: an international review with an emphasis on hard-to-access populations. Sex Health 5, 9-16.
64
Deák J, Nagy E, Veréb I, Mészáros G, Kovács L, Nyári T, Berbik I. (1997) Prevalence of Chlamydia trachomatis infection in a low-risk population in Hungary. Sex Transm Dis 24, 538-542. Dean D, Millman K. (1997) Molecular and mutation trends analyses of omp1 alleles for Serovar E of Chlamydia trachomatis. J Clin Invest 99, 475–483. Dean D, Oudens E, Bolan G, Padian N, Schachter J. (1995) Major outer membrane protein variants of Chlamydia trachomatis are associated with severe upper genital tract infections and histopathology in San Francisco. J Infect Dis 172, 1013-1022. den Hartog JE, Land JA, Stassen FR, Kessels AG, Bruggeman CA. (2005) Serological markers of persistent C. trachomatis infections in women with tubal factor subfertility. Hum Reprod 20, 986-990. den Hartog JE, Morré SA, Land JA. (2006) Chlamydia trachomatis-associated tubal factor subfertility: immunogenetic aspects and serological screening. Hum Reprod Update 12, 719–730. Donati M, Pollini GM, Sparacino M, Fortugno MT, LaghiE, Cevenini R. (2002) Comparative in vitro activity of garenoxacin against Chlamydia spp. J Antimicrob Chemother 50, 407-410. Dowell SF, Peeling RW, Boman J, Carlone GM, Fields BS, Guarner J, Hammerschlag MR, Jackson LA, Kuo CC, Maass M, Messmer TO, Talkington DF, Tondella ML, Zaki SR; C. pneumoniae Workshop Participants. (2001) Standardizing Chlamydia pneumoniae assays: recommendations from the Centers for Disease Control and Prevention (USA) and the Laboratory Centre for Disease Control (Canada). Clin Infect Dis 33, 492-503.
65
Durand NJ, Nicolas J, Favre M. (1913). Lymphogranulomatose inguinale subaiguë d’origine génitale probable, peut-être vénérienne. Bulletin de la Société des Médecins des Hôpitaux de Paris 3, 274-288. Everett KD, Bush RM, Andersen AA. (1999) Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms. Int J Syst Bacteriol 49, 415-440. Folch C, Esteve A, Sanclemente C, Martro E, Lugo R, Molinos S, Gonzalez V, Ausina V, Casabona J. (2008) Prevalence of human immunodeficiency virus, Chlamydia trachomatis, and Neisseria gonorrhoeae and risk factors for sexually transmitted infections among immigrant female sex workers in Catalonia, Spain. Sex Transm Dis 35, 178-183. Frank TS, Cook SM, Del Buono EA, Wilson MD. (1992) A simplified method for detecting cytomegalovirus by polymerase chain reaction from histologic sections of small biopsies. Mod Pathol 5, 449-454. Fukushi H, Hirai K. (1992) Proposal of Chlamydia pecorum sp. nov. for Chlamydia strains derived from ruminants. Int J Syst Bacteriol 42, 306-308. Gao X, Chen XS, Yin YP, Zhong MY, Shi MQ, Wei WH, Chen Q, Peeling RW, Mabey D. (2007) Distribution study of Chlamydia trachomatis serovars among high-risk women in China performed using PCR-restriction fragment length polymorphism genotyping. J Clin Microbiol 45, 1185-1189. Gaydos CA, Summersgill JT, Sahney NN, Ramirez JA, Quinn TC. (1996) Replication of Chlamydia pneumoniae in vitro in human macrophages, endothelial cells, and aortic artery smooth muscle cells. Infect Immun 64, 1614-1620.
66
Geens T, Desplanques A, Van Loock M, Bonner BM, Kaleta EF, Magnino S, Andersen AA, Everett KD, Vanrompay D. (2005) Sequencing of the Chlamydophila psittaci ompA gene reveals a new genotype, E/B, and the need for a rapid discriminatory genotyping method. J Clin Microbiol 43, 2456-2461. Gerbase AC, Rowley JT, Heymann DH, Berkley SF, Piot P. (1998) Global prevalence and incidence estimates of selected curable STDs. Sex Transm Infect 74 (Suppl 1), S12S16. Gherman RB, Leventis LL, Miller RC. (1995) Chlamydial psittacosis during pregnancy: a case report. Obstet Gynecol 86, 648-650. Gordon FB, Quan AL. (1965) Isolation of the trachoma agent in cell culture. Proc Soc Exp Biol Med 118, 354-359. Grayston JT, Kuo CC, Campbell LA, Wang SP. (1989a) Chlamydia pneumoniae sp. nov. for Chlamydia sp. Strain TWAR. Int J Syst Bacteriol 39, 88-90. Grayston JT, Mordhorst C, Bruu AL, Vene S, Wang SP. (1989b) Countrywilde epidemics of Chlamydia pneumoniae, strain TWAR, in Scandinavia, in 1981-1983. J Infect Dis 159, 1111-1114. Halberstaedter L, von Prowazek S. (1907) Zur Atiologie des Trachoms. Dtsch Med Wochenschr 33, 1285-1287. Hammerschlag MR. (2000a) Chlamydia pneumoniae and the lung. Eur Respir J 16, 1001-1007. Hammerschlag MR. (2000b) Activity of gemifloxacin and other new quinolones against Chlamydia pneumoniae: a review. J Antimicrob Chemother 45, 35-39.
67
Hammerschlag MR. (2002) The intracellular life of chlamydiae. Semin Pediatr Infect Dis 13, 239-248. Hammerschlag MR. (2004) Chlamydia trachomatis and Chlamydia pneumoniae infections in children and adolescents. Pediatr Rev 25, 43-51. Hartwell D, Christiansen OB, Petrovay F, Lidegaard Ø, Gönczöl E, Garred P. (2006) Genetic factors determining innate immunity and the risk of tubal infertility. 35th Nordic Congress of Obstetrics and Gynecology, Göteborg, Sweden. Heddema ER, Kraan MC, Buys-Bergen EC, Smith HE, Wertheim-van Dillen PM. (2003) A woman with a lobar infiltrate due to psittacosis detected by polymerase chain reaction. Scand J Infect Dis 35, 422-424. Heddema ER, van Hannen EJ, Duim B, de Jongh BM, Kaan JA, van Kessel R, Lumeij JT, Visser CE, Vandenbroucke-Grauls CM. (2006a) An outbreak of psittacosis due to Chlamydophila psittaci genotype A in a veterinary teaching hospital. J Med Microbiol 55, 1571-1575. Heddema ER, Beld MG, de Wever B, Langerak AA, Pannekoek Y, Duim B. (2006b) Development of an iternally controlled real-time PCR assay for detection of Chlamydophila psittaci in the LightCycler 2.0 system. CMI 12, 571-575. Heddema ER, van Hannen EJ, Duim B, Vandenbroucke-Grauls CM, Pannekoek Y. (2006c) Genotyping of Chlamydophila psittaci in human samples. EID 12, 1989-1990. Heltai K, Kis Z, Burian K, Endresz V, Veres A, Ludwig E, Gönczöl E, Valyi-Nagy I. (2004). Elevated antibody levels against Chlamydia pneumoniae, human HSP60 and mycobacterial HSP65 are independent risk factors in myocardial infarction and ischaemic heart disease. Atherosclerosis 173, 339-346. Hogan RJ, Mathews SA, Mukhopadhyay S, Summersgill JT, Timms P. (2004) Chlamydial persistence: beyond the biphasic paradigm. Infect Immun 72, 1843-1855.
68
Ito JI, Lyons JM, Airo-Brown LP. (1990) Variation in virulence among oculogenital serovars of Chlamydia trachomatis in experimental genital tract infection. Infect Immun 58, 2021-2023. Jalal H, Stephen H, Curran MD, Burton J, Bradley M, Carne C. (2006) Development and validation of a rotor-gene real-time PCR assay for detection, identification, and quantification of Chlamydia trachomatis in a single reaction. J Clin Microbiol 44, 206213. Kaehler J, Haar A, Schaps KP, Gaede A, Carstensen M, Schalwat I, Koester R, Laufs R, Meinertz T, Terres W. (2005) A randomized trial in patients undergoing percutaneous coronary angioplasty: roxithromycin does not reduce clinical restenosis but angioplasty increases antibody concentrations against Chlamydia pneumoniae. Am Heart J 150, 987-993. Kaibu H, Iida K, Ueki S, Ehara H, Shimasaki Y, Watanabe S, Anzai H, Takebu W, Muta T, Kusaba T, Kishimoto T, Ando S. (2006) Psittacosis in all four members of a family in Nagasaki, Japan. Jpn J Infect Dis 59, 349-350. Kalayoglu MV, Libby P, Byrne GI. (2002) Chlamydia pneumoniae as an emerging risk factor in cardiovascular disease. JAMA 288, 2724-2731. Kaul R, Uphoff J, Wiedeman J, Yadlapalli S, Wenman WM. (2000) Detection of Chlamydia pneumoniae DNA in CD31 lymphocytes from healthy blood donors and patients with coronary artery disease. Circulation 102, 2341-2346. Kis Z, Sas K, Gyulai Z, Treso B, Petrovay F, Kapusinszky B, Csire M, Endresz V, Burian K, Mandi Y, Vecsei L, Gonczol E. (2007) Chronic infections and genetic factors in the development of ischemic stroke. New Microbiol 30, 213-220.
69
Kovacova E, Majtan J, Botek R, Bokor T, Blaskovicova H, Solavova M, Ondicova M, Kazar J. (2007) A fatal case of psittacosis in Slovakia, January 2006. Euro Surveill 12, E070802.1. Kuo CC, Chen HH, Wang SP, Grayston JT. (1986) Identification of a new group of Chlamydia psittaci strains called TWAR. J Clin Microbiol 24, 1034-1037. Kuo CC, Jackson LA, Campbell LA, Grayston T. (1995) Chlamydia pneumoniae (TWAR) Clin Microbiol Rev 8, 451-461. Lan J, Walboomers JM, Roosendaal R, van Doornum GJ, MacLaren DM, Meijer CJ, van den Brule AJ. (1993) Direct detection and genotyping of Chlamydia trachomatis in cervical scrapes by using polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis. J Clin Microbiol 31, 1060-1065. Lan J, van den Brule AJ, Hemrika DJ, Risse EK, J Walboomers M, Schipper ME, Meijer CJ. (1995a) Chlamydia trachomatis and ectopic pregnancy: retrospective analysis of salpingectomy specimens, endometrial biopsies, and cervical smears. J Clin Pathol 48, 815-819. Lan J, Melgers I, Meijer CJ, Walboomers JM, Roosendaal R, Burger C, Bleker OP, van den Brule AJ. (1995b) Prevalence and serovar distribution of asymptomatic cervical Chlamydia trachomatis infections as determined by highly sensitive PCR. J Clin Microbiol 33, 3194-3197. Lima HE, Oliveira MB, Valente BG, Afonso DA, Darocha WD, Souza MC, Alvim TC, Barbosa-Stancioli EF, Noronha FS. (2007) Genotyping of Chlamydia trachomatis from endocervical specimens in Brazil. Sex Transm Dis 34, 709-717. Lin TM, Chen WJ, Chen HY, Wang PW, Eng HL. (2003) Increased incidence of cytomegalovirus but not Chlamydia pneumoniae in atherosclerotic lesions of arteries of
70
lower extremities from patients with diabetes mellitus undergoing amputation. J Clin Pathol 56, 429-432. Lindner, K. (1910) Zur aetiologie der gonokokkenfreien urethritis. Wien klin Wschr 23, 283. Lysén M, Österlund A, Rubin CJ, Persson T, Persson I, Herrmann B. (2004) Characterization of ompA genotypes by sequence analysis of DNA from all detected cases of Chlamydia trachomatis infections during 1 year of contact tracing in a Swedish County. J Clin Microbiol 42, 1641-1647. Mabey D, Peeling RW. (2002) Lymphogranuloma venereum. Sex Transm Infect 78, 9092. Mak RP, Van Renterghem L, Traen A. (2005) Chlamydia trachomatis in female sex workers in Belgium: 1998-2003. Sex Transm Infect 81, 89-90. Marton A, Károlyi A, Szalka A. (1992) Prevalence of Chlamydia peumoniae antibodies in Hungary. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 11, 139-42. Mattila KJ, Juvonen JT, Kotamaki MK, Saikku PA. (2001) Chlamydia pneumoniae and luminal narrowing after coronary angioplasty. Journal of Internal Medicine 250, 67-71. Messmer TO, Skelton SK, Moroney JF, Daugharty H, Fields BS. (1997) Application of a nested, multiplex PCR to psittacosis outbreaks. J Clin Microbiol 35, 2043-2046. Morré SA, Rozendaal L, van Valkengoed IG, Boeke AJ, van Voorst Vader PC, Schirm J, de Blok S, van den Hoek JA, van Doornum GJ, Meijer CJ, van den Brule AJ. (2000) Urogenital Chlamydia trachomatis serovars in men and women with a symptomatic or asymptomatic infection: an association with clinical manifestations? J Clin Microbiol 38, 2292-2296.
71
Muhlestein JB. (2000) Chlamydia pneumoniae-induced atherosclerosis in a rabbit model. J Infect Dis 181 (Suppl 3), S505-507. Ngandjio A, Clerc M, Fonkoua MC, Thonnon J, Lunel F, Bébéar C, Bianchi A, de Barbeyrac B. (2004) Restriction endonuclease patterns of the omp1 gene of reference Chlamydia trachomatis strains and characterization of isolates from Cameroonian students. J Med Microbiol 53, 47-50. Norman J. (2002) Epidemiology of female genital Chlamydia trachomatis infections. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 16, 775-87. Numazaki K, Wainberg MA, McDonald J. (1989) Chlamydia trachomatis infections in infants. CMAJ 140, 615–622. Országos Epidemiológiai Központ. (2007) Magyarország 2005. járványügyi helyzete. Epinfo 14, 9-40. Ossewaarde JM, Rieffe M, Rozenberg-Arska M, Ossenkoppele PM, Nawrocki RP, van Loon AM. (1992) Development and clinical evaluation of a polymerase chain reaction test for detection of Chlamydia trachomatis. J Clin Microbiol 30, 2122-2128. Paavonen J, Eggert-Kruse W. (1999) Chlamydia trachomatis: impact on human reproduction. Hum Reprod Update 5, 433-447. Paavonen J, Lehtinen M. (1994) Immunopathogenesis of chlamydial pelvic inflammatory disease: the role of heat-shock proteins. Infect Dis Obstet Gynecol 2, 105– 110. Page LA. (1966) Revision of the family Chlamydiaceae Rake (Rickettsiales): unification of the psittacosis-lymphogranuloma venereum-trachoma group of organisms in the genus Chlamydia Jones, Rake, and Stearns, 1945. Int J Syst Bacteriol 16, 223252.
72
Page LA. (1968) Proposal for the recognition of two species in the genus Chlamydia. Jones, Rake, and Stearns, 1945. Int J Sys Bacteriol 18, 51-66. Pal S, Peterson EM, de la Maza LM. (2001) Susceptibility of mice to vaginal infection with Chlamydia trachomatis mouse pneumonitis is dependent on the age of the animal. Infect Immun 69, 5203-5206. Papadogeorgaki H, Caroni C, Frangouli E, Flemetakis A, Katsambas A, Hadjivassiliou M. (2006) Prevalence of sexually transmitted infections in female sex workers in Athens, Greece - 2005. Eur J Dermatol 16, 662-665. Peeling RW, Brunham RC. (1996) Chlamydiae as pathogens: New species and new issues. 2, 307-319. Postema EJ, Remeijer L, van der Meijden WI. (1996) Epidemiology of genital chlamydial infections in patients with chlamydial conjunctivitis; a retrospective study. Genitourin Med 72, 203-205. Puolakkainen M, Kuo CC, Shor A, Wang SP, Grayston JT, Campbell LA. (1993) Serological response to Chlamydia pneumoniae in adults with coronary arterial fatty streaks and fibrolipid plaques. J Clin Microbiol 31, 2212-2214. Rabenau HF, Köhler E, Peters M, Doerr HW, Weber B. (2000) Low correlation of serology with detection of Chlamydia trachomatis by ligase chain reaction and antigen EIA. Infection 28, 97-102. Ramsey KH, Soderberg LS, Rank RG. (1988) Resolution of chlamydial genital infection in B-cell-deficient mice and immunity to reinfection. Infect Immun 56, 13201325.
73
Rank RG, Soderberg LS, Sanders MM, Batteiger BE. (1989) Role of cell-mediated immunity in the resolution of secondary chlamydial genital infection in guinea pigs infected with the agent of guinea pig inclusion conjunctivitis. Infect Immun 57, 706-710. Raulston JE. (1995) Chlamydial envelope components and pathogen-host cell interactions. Mol Microbiol 15, 607-616. Resl V, Kumpová M, Cerná L, Novák M, Pazdiora P. (2003) Prevalence of STDs among prostitutes in Czech border area with Germany in 1997-2001 assessed in project “Jana”. Sex Transm Infect 79, E3. Sachse K, Laroucau K, Hotzel H, Schubert E, Ehricht R, Slickers P. (2008) Genotyping of Chlamydophila psittaci using a new DNA microarray assay based on sequence analysis of ompA genes. BMC Microbiology 8, 63. Saikku P, Leinonen M, Mattila K, Ekman MR, Nieminen MS, Mäkelä PH, Huttunen JK, Valtonen V. (1988) Serological evidence of an association of a novel Chlamydia, TWAR, with chronic coronary heart disease and acute myocardial infarction. Lancet 2, 983-986. Sayada C, Andersen AA, Storey C, Milon A, Eb F, Hashimoto N, Hirai K, Elion J, Denamur E. (1995) Usefulness of omp1 restriction mapping for avian Chlamydia psittaci isolate differentiation. Res Microbiol 146, 155-165. Sheehy N, Markey B, Gleeson M, Quinn J. (1996) Differentiation of Chlamydia psittaci and C. pecorum strains by species-specific PCR. J Clin Microbiol 34, 3175-3179. Smieja M, Mahony JB, Goldsmith CH, Chong S, Petrich A, Chernesky M. (2001a) Replicate PCR testing and probit analysis for detection and quantitation of Chlamydia pneumoniae in clinical specimens J Clin Microbiol 39, 1796-1801.
74
Smieja M, Chong S, Natarajan M, Petrich A, Rainen L, Mahony JB. (2001b) Circulating nucleic acids of Chlamydia pneumoniae and cytomegalovirus in patients undergoing coronary angiography. J Clin Microbiol 39, 596-600. Smieja M, Mahony J, Petrich A, Boman J, Chernesky M. (2002) Association of circulating Chlamydia pneumoniae DNA with cardiovascular disease: a systematic review. BMC Infect Dis 2:21. Smith KA, Bradley KK, Stobierski MG, Tengelsen LA. (2005) Compendium of measures to control Chlamydophila psittaci (formerly Chlamydia psittaci) infection among humans (psittacosis) and pet birds, 2005. J Am Vet Med Assoc 226, 532–539. Soni R, Seale JP, Young IH. (1999) Fulminant psittacosis requiring mechanical ventilation and demonstrating serological cross-reactivity between Legionella longbeachae and Chlamydia psittaci. Respirology 4, 203-205. Storz J, Page LA. (1971) Taxonomy of the chlamydiae: reasons for classifying organisms of the genus Chamydia family Chlamydiaceae, in a separate order, Chlamydiales ord. nov. Int J Syst Bacteriol 21, 332-334. Sturm-Ramirez K, Brumblay H, Diop K, Gueye-Ndiaye A, Sankalé JL, Thior I, N’Doye I, Hsieh CC, Mboup S, Kanki PJ. (2000) Molecular epidemiology of genital Chlamydia trachomatis infection in high-risk women in Senegal, West Africa. J Clin Microbiol 38, 138-145. Sziller I, Witkin SS, Ziegert M, Csapó Zs, Ujházy A, Papp Z. (1998) Serological responses of patients with ectopic pregnancy to epitopes of the Chlamydia trachomatis 60 kDa heat shock protein. Hum Reprod 13, 1088-1093. Thylefors B, Négrel AD, Pararajasegaram R, Dadzie KY. (1995) Global data on blindness. Bull World Health Organ 73, 115-121.
75
Tiitinen A, Surcel HM, Halttunen M, Birkelund S, Bloigu A, Christiansen G, Koskela P, Morrison SG, Morrison RP, Paavonen J. (2006) Chlamydia trachomatis and chlamydial heat shock protein 60-specific antibody and cellmediated responses predict tubal factor infertility. Hum Reprod 21, 1533–1538. Tong CY, Sillis M. (1993) Detection of Chlamydia pneumoniae and Chlamydia psittaci in sputum samples by PCR. J Clin Pathol 46, 313-317. Tuuminen T, Varjo S, Ingman H, Weber T, Oksi J, Viljanen M. (2000) Prevalence of Chlamydia pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae immunoglobulin G and A antibodies in a healthy Finnish population as analyzed by quantitative enzyme immunoassays. Clin Diagn Lab Immunol 7, 734-738. Ujházy A, Csaba Á, Máté Sz, Papp Z, Sziller I. (2007) Chlamydia prevalence and correlates among female adolescents in Hungary. J Adolescent Health 41, 513-515. van de Laar MJ. (2006) The emergence of LGV in western Europe: what do we know, what can we do? Euro Surveill 11, 146-148. Vandepitte J, Lyerla R, Dallabetta G, Crabbé F, Alary M, Buvé A. (2006) Estimates of the number of female sex workers in different regions of the world. Sex Transm Infect 82 (Suppl 3), iii18-25. Van Duynhoven YT, Ossewaarde JM, Derksen-Nawrocki RP, van der Meijden WI, van de Laar MJ. (1998) Chlamydia trachomatis genotypes: correlation with clinical manifestations of infection and patiens’ characteristics. Clin Infect Dis 26, 314-322. Vanrompay D, Butaye P, Sayada C, Ducatelle R, Haesebrouck F. (1997) Characterization of avian Chlamydia psittaci strains using omp1 restriction mapping and serovar-specific monoclonal antibodies. Res Microbiol 148, 327-333.
76
Verweij PE, Meis JF, Eijk R, Melchers WJ, Galama JM. (1995) Severe human psittacosis requiring artificial ventilation: case report and review. Clin Infect Dis 20, 440-442. Virok D, Kis Z, Karai L, Intzedy L, Burian K, Szabo A, Ivanyi B, Gonczol E. (2001) Chlamydia pneumoniae in atherosclerotic middle cerebral artery. Stroke 32, 1973-1976. Ward H, Day S, Green A, Cooper K, Weber J. (2004) Declining prevalence of STI in the London sex industry, 1985 to 2002. Sex Transm Infect 80, 374-378. WHO. (2001) Global prevalence and incidence of selected curable sexually transmitted infections: overview and estimates. WHO, Geneva, 2001. Wilson JS, Honey E, Templeton A, Paavonen J, Mårdh PA, Stray-Pedersen B; EU Biomed Concerted Action Group. (2002) A systematic review of the prevalence of Chlamydia trachomatis among European women. Hum Reprod Update 8, 385-394. Wong KH, Skelton SK, Daugharty H. (1994) Utility of complement fixation and microimmunofluorescence assays for detecting serologic responses in patients with clinically diagnosed psittacosis. J Clin Microbiol 32, 2417-2421. Wong YK, Dawkins KD, Ward ME. (1999) Circulating Chlamydia pneumoniae DNA as a predictor of coronary artery disease. J Am Coll Cardiol 34, 1435-1439. Workowski KA, Stevens CE, Suchland RJ, Holmes KK, Eschenbach DA, Pettinger MB, Stamm WE. (1994) Clinical manifestations of genital infection due to Chlamydia trachomatis in women: differences related to serovar. Clin Infect Dis 19, 756-760. Yetkin E, Yetkin G, Tandogan I, Kocabas NA, Ileri M, Ozdemir R, Kosar F, Turhan H, Cehreli S, Mert A. (2002) Detection of Chlamydia pneumoniae deoxyribonucleic acid in blood samples taken from coronary sinus after coronary angioplasty. Am J Cardiol 90, 179-181.
77
Yetkin G, Yetkin E, Aksoy Y, Gurbuz OA, Mert A. (2004) Changes in antibody titers against Chlamydia pneumoniae after coronary angioplasty. Int J Cardiol 95, 293-297. Yuan Y, Zhang YX, Watkins NG, Caldwell HD. (1989) Nucleotide and deduced amino acid sequences for the four variable domains of the major outer membrane proteins of the 15 Chlamydia trachomatis serovars. Infect Immun 57, 1040-1049. Zhou YF, Leon MB, Waclawiw MA, Popma JJ, Yu ZX, Finkel T, Epstein SE. (1996) Association between prior cytomegalovirus infection and the risk of restenosis after coronary atherectomy. N Engl J Med 335, 624-630.
78
10. Saját publikációk jegyzéke A doktori értekezés témájához felhasznált közlemények: Petrovay F, Balla E, Németh I, Gönczöl E. (2009) Genotyping of Chlamydia trachomatis from the endocervical specimens of high-risk women in Hungary. J Med Microbiol 58, 760-764. IF: 2,190 Petrovay F, Balla E. (2008) Two fatal cases of psittacosis caused by Chlamydophila psittaci. J Med Microbiol 57, 1296-1268. IF: 2,190 Petrovay F, Heltai K, Kis Z, Treso B, Gonczol E, Burian K, Endresz V, Valyi-Nagy I. (2007) Chronic infections and histamine, CRP and IL-6 levels after percutaneous transluminal coronary angioplasty. Inflamm Res 56, 362-367. IF: 1,504 A doktori értekezés témájához kapcsolódó közlemények: Kis Z, Sas K, Gyulai Z, Treso B, Petrovay F, Kapusinszky B, Csire M, Endresz V, Burian K, Mandi Y, Vecsei L, Gonczol E. (2007) Chronic infections and genetic factors in the development of ischemic stroke. New Microbiol 30, 213-220. IF: 0,956 Balla E, Petrovay F. (2007) Az ornithosis laboratóriumi diagnosztikai módszereinek fejlesztése I. Mikrobiológiai Körlevél 7, 2. Balla E, Petrovay F. (2007) Az ornithosis laboratóriumi diagnosztikai módszereinek fejlesztése II. A laboratóriumi eredmények interpretációja. Mikrobiológiai Körlevél 7, 3.
79
A doktori értkezés témájához nem kapcsolódó közlemények: Balla E, Petrovay F, Boross K, Koós-Hutás P. (2008) Urogenitális mycoplasmák előfordulási gyakorisága és potenciális kóroki szerepe terhes nők körében. STD és Genitális Infektológia 2, 53-58. Balla E, Petrovay F, Boross K. (2004) Mycoplasma pneumoniae és Chlamydia pneumoniae fertőzések szerodiagnosztikája. Mikrobiológiai Körlevél 4, 1. Petrovay F, Balla E, Boross K. (2008) Treponema pallidum nested PCR gyakorlati jelentősége a szifilisz diagnosztikában. STD és Genitális Infektológia 2, 167-169. A doktori értekezés témájához kapcsolódó előadások jegyzéke: Petrovay F, Balla E. Chlamydia trachomatis szerotípusok meghatározása molekuláris módszerekkel. 2006.11.17-18. Magyar STD Társaság Nagygyűlése, Budapest. Összefoglalók Könyve 41. oldal. Petrovay F, Balla E. Humán psittacosis: a korai laboratóriumi diagnózis jelentősége. 2006.10.18-20. Magyar Mikrobiológiai Társaság Nagygyűlése, Keszthely. Acta Microbiol Immunol Hung, 2006, 53(3), 331-332. Petrovay F, Heltai K, Endrész V, Ludwig E, Kiss R, Gönczöl É, Vályi-Nagy I. Összefüggés a ballonkatéteres koszorúér-tágítás (PTCA) után bekövetkező restenosis és a Chlamydia pneumoniae illetve cytomegalovirus ellenanyagszint emelkedése között. 2004. 10. 7-9. Magyar Mikrobiológiai Társaság Nagygyűlése, Keszthely. Összefoglalók Könyve 98. oldal. Petrovay F, Heltai K, Endrész V, Ludwig E, Kiss R, Gönczöl É, Vályi-Nagy I. Összefüggés a ballonkatéteres koszorúér-tágítás (PTCA) után bekövetkező restenosis és a Chlamydia pneumoniae illetve cytomegalovirus ellenanyagszint emelkedése között. 2005. 04. 14-15. Semmelweis Egyetem PhD Tudományos Napok, Budapest.
80
Balla E, Petrovay F. Ascendáló Chlamydia trachomatis fertőzés diagnosztikájatapasztalataink Western Blot vizgálattal. 2006.11.17-18. Magyar STD Társaság Nagygyűlése, Budapest. Összefoglalók Könyve 31. oldal. Balla E, Petrovay F. Neonatalis pneumonia- a kórkép diagnosztikája, epidemiológiai jelentősége.
2006.11.17-18.
Magyar
STD
Társaság
Nagygyűlése,
Budapest.
Összefoglalók Könyve 42. oldal. Hartwell D, Christiansen OB, Petrovay F, Lidegaard O, Gönczöl E, Garred P: Genetic factors determining innate immunity and risk of tubal infertility. 2006. 05. 20-23. 35. Nordic Congress of Obstetrics and Gynecology, Göteborg, Sweden.
81
11. Köszönetnyilvánítás Köszönöm témavezetőmnek, Gönczöl Éva professzorasszonynak a lehetőséget, hogy csatlakozhattam tudományos kutatócsoportjához, hálás vagyok támogatásáért a doktori munkám során, és hogy szigorú kritikai észrevételeivel, javaslataival segítette a jelen dolgozat végleges formájának kialakítását. Hálával tartozom laboratóriumvezetőmnek, Dr. Balla Eszternek, aki a szakma iránti lelkesedését rám is átsugározta, tudását, tapasztalatát velem megosztotta és támogatott a doktori fokozatom megszerzésében, a cikkek és az értekezés javításában pedig nagy segítséget nyújtott. Köszönöm Mag Tündének, akivel hasonló cipőben járva egyszerre kezdtünk bele a doktori fokozatszerzésbe, és a nehezebb időszakokban mindig sikerre biztatott. Köszönettel tartozom kolléganőimnek, Dr. Kienle Zsuzsának és Boross Katalinnak biztatásukért, asszisztenseinknek, Kertész Zsuzsának, Kelemen Évának, Dancs Rozinak, hogy laborunkban mindig jó hangulatot teremtenek. Köszönettel tartozom osztályvezetőmnek, Dr. Herpay Máriának, hogy laboratóriumi feladataim mellett belekezdhettem doktori munkámba. Köszönöm Farkas Nórának, hogy lehetőséget biztosított doktori tanulmányaim megkezdésére. Ezúton szeretném megköszöni Laczik Ceciliának, hogy a doktori fokozatszerzés során felmerülő adminisztratív problémák megoldásában mindvégig segítségemre volt. Szeretnék köszönetet mondani drága szüleimnek és családomnak, akik mindvégig mellettem álltak, mindent megtettek, hogy tanulhassak, mindig hittek bennem és támogattak. Köszönöm Istvánnak folyamatos biztatását, bátorítását és türelmét az elmúlt évek során.
82
