Ellenanyag reagensek előállítása
2015.02.23. Sándor Noémi
[email protected]
2. Antigének, immunizálás fejezet (29-31.oldal, 38-41. oldal) 3. Ellenanyagok fejezet (43-45. oldal, 47-50. oldal, 56-65. oldal, 73-75. oldal, 87. oldal)
2. Patogének, antigének, haptének (41-46. oldal) 11. A limfociták antigén-felismerő receptorának kialakulása (276-284. oldal) 14. A humorális immunválasz
Mire használjuk az ellenanyagokat? Ugyanarra, amire a természet → specifikusan kapcsolódjon a célponthoz (antigénhez) Az ellenanyag jelen esetben „eszköz” (de van hogy az ellenanyagot detektáljuk, pl. diagnosztika, oltás sikerességének ellenőrzése!) A számunkra érdekes molekula (=antigén) kimutatása, tisztítása, jelölése stb. specifikusan Antigén-ellenanyag kapcsolat nagyon erős (=nagy affinitású)
Nagyon kevés vizsgálandó anyag is kimutatható, azonosítható a mintában.
Hogyan is néz ki egy ellenanyag? Nehéz lánc
Antigén felismerés (variábilis részek által)
Könnyű lánc
Fab V=variábilis C=konstans
Fc
Effektor funckiók (Fc receptorhoz kötődés, komplement aktiválás)
Az antigén felismerés Antigénen felismert szakaszok = antigén determinánsok vagy epitópok
Erdei, Immunológia
Hogyan alakul ki az ellenanyag válasz? 3. 1.
107-109
féle
2.
Erdei, Immunológia
1. Az antigén felismerése az arra specifikus B-sejt receptort (BCR) hordozó limfociták által 2. A specifikus, kiválasztott sejtek aktiválódnak és osztódnak (klonális= az utód sejtek az eredetileg aktiválódó sejttel megegyezőek) 3. Ellenanyag termelés
Hogyan alakul ki a BCR repertoár?
RAG és TdT enzimek végzik
Erdei, Immunológia
Hogyan alakul ki a BCR repertoár?
A sokféleségért (felismerés) felelős tényezők Az B-sejtek érése során - a V, a D és a J génszegmensek száma - a kapcsolódási kombinációk - pontatlan átrendeződések - extra nukleotid beépülések - H – L kapcsolódás
Hogyan alakul ki az ellenanyag válasz? 3. 1.
107-109
féle
2.
Erdei, Immunológia
1. Az antigén felismerése az arra specifikus B-sejt receptort (BCR) hordozó limfociták által 2. A specifikus, kiválasztott sejtek aktiválódnak és osztódnak (klonális= az utód sejtek az eredetileg aktiválódó sejttel megegyezőek) 3. Ellenanyag termelés
Hogyan változik az ellenanyag az immunválasz során?
Az B-sejtek aktivációja során - a szomatikus hipermutációk (antigén kötő képesség változik) -Izotípus váltás (effektor funkciók változnak) IgM → IgG/E/A Abbas, 2012
Az antigén-ellenanyag kapcsolódás jellemzői - alapfogalmak Az ellenanyag affinitása: (disszociációs konstans, Kd): • ag koncentráció, ami az agkötőhelyek felét telíti: • 10-7 – 10-11 M/liter
valencia
aviditás
Az ellenanyag aviditása: • A kötések affinitásának összege • több ellenanyag affinitásának összessége Az ellenanyag valenciája: • egy ellenanyaghoz kapcsolódó univalens ligandumok száma (monovalens, bivalens, pentavalens) Abbas, Immunology, 7th edition
Alapfogalmak - monoklonális és poliklonális ellenanyag (készítmények)*
http://absoluteantibody.com/antibody-resources/antibody-overview/antibodies-as-tools/
Egy antigénen általában több, a B-sejtek számára felismerhető antigén determináns (epitóp) található
*sok db ellenanyag mindig
Alapfogalmak - monoklonális és poliklonális ellenanyagok
Alapfogalmak - monoklonális és poliklonális ellenanyagok immunizálás
Poliklonális (=többféle B-sejt klón terméke) ellenanyagok
Egy antigén több epitópjára specifikus ellenanyagok keveréke
Egyedi B-sejtek izolálása és in vitro monoklonális (=egyetlen B-sejt klón terméke) ellenanyag termeltetése
Egy antigén egy epitópjára specifikus ellenanyag
Hogyan állítjuk elő a gyakorlatban az ellenanyagokat? IMMUNIZÁLÁS (oltás) ANTIGÉN
sIg
*
felismerés
szekretált ellenanyag
aktiváció osztódás differenciáció
B
plazmasejt
-az adott antigén és az immunizálandó egyed viszonya (filogenetikai távolság) -az antigén kémiai természete -az antigén biológiai sajátságai (mennyire immunogén?) -az antigén bejuttatásának helye -az antigén mennyisége (alacsony és magas dózis tolerancia) -az antigén bejuttatásának módja (oltás, orális, kontakt szenzibilizálás, bőrátültetés)
* sIg vagy mIg = surface vagy membrane Ig, ez maga a B-sejt receptor
Az immunizálás hatásfokának növelése ADJUVÁNSOK antigén depót képeznek (lassítják az antigén felszívódását) gyulladást idéznek elő az antigén behatolás helyén (veszély szignál a szervezet számára) Leggyakoribb típusok: Freund-adjuváns (+ /- Mycobacterium tuberculosis)IgG2a) aluminium-hidroxid (+/- Bordetella pertussis)IgG1)
Nippostrongylus brasiliensisIgE; Salmonella typhimuriumIgA) szaponin ISCOM (immun stimuláló komplex) TiterMax, RAS (Ribi Adjuvant System)
Az immunizálás menete Emlékeztető: Elsődleges és memória válasz A specifikus ellenanyagok szintjének emelkedése Izotípus megoszlás IgM Specifikus ellenanyag mennyiség A specifikus ellenanyagok átlag affinitása
gyorsabb IgG/A/E magasabb magasabb
Ráoltás/Újraoltás/ Booster oltás ugyanazzal az antigénnel oltunk (általában többször, oltási sémák) Sikeresség ellenőrzése vérvétellel
Poliklonális ellenanyagok előállítása
Főleg rágcsálókból (patkány, egér, nyúl, hörcsög) és kecskéből, marhából, lóból
Menete • Adott antigén tiszta formában történő előállítása • Ezzel immunizáljuk az állatot • vérvétel (sok) → szérumból (ezt immunszérumnak nevezzük) ellenanyagok kitisztítása • felhasználás
Poliklonális ellenanyagok előállítása Nagy mennyiségű vérvétel („immunszérum”, benne a specifikus ellenanyagok), és további tisztítás/felhasználás immunizálások Idő (napok) 0
21
42
Oltás sikerességének (=termelődött specifikus ellenanyag mennyiségének) ellenőrzése vérből
Az immunizálás menete (monoklonális)
Lépsejtek (nem szérum!) izolálása, fúzió, stb immunizálások Idő (napok) 0
21
42
Oltás sikerességének (=termelődött specifikus ellenanyag mennyiségének) ellenőrzése vérből
Monoklonális ellenanyagok előállítása • relatív hosszú idő (2 hónap + tesztelés) • felszerelés igényes (steril sejtes munka)
Lépések: 1. 2. 3. 4. 5.
Immunizálás az antigénnel Lépből B-sejtek izolálása B-sejtek hibridizációja mielómasejtekkel (immortalizáció) A sikeresen fúzionált sejtek szelektálása A megfelelő ellenanyagot termelő klónok szelekciója, felszaporítása, fagyasztása (hosszú távú tárolás)
Monoklonális ellenanyagok előállítása 1. Immunizálás → megfelelő faj kiválasztása fontos, legtöbbször egér. A cél határozza meg (pl. egér fehérje ellen patkány, humán fehérje ellen egér, stb...) 2. Lép izolálása, ebből B-sejtek tisztítása 3. Hibridizáció = B-sejtek + mielómasejtek + PEG B-sejtek: primer sejtek az állatból, képesek alternatív úton DNS-t szintetizálni , korlátozott életképességűek, de tudnak ellenanyagot termelni mielomasejtek: B-sejt eredetű tumorsejt vonalak, nem képesek ellenanyagot termelni, nem képesek alternatív úton DNS-t szintetizálni, de korlátlan életképességűek Legtöbbször használt: Sp2 PEG: polietilén glikol, vízelvonó szer
Sp2
+ PEG B-sejtek
fúzió
Ezeket az Sp2-B-sejt fúzióból létrejött hibridómákat kell szelektálni
Monoklonális ellenanyagok előállítása 4. A hibridómák szelekciója: HAT szelekciós médiumban H – hipoxantin: az alternativ DNS szintézis út szubsztrátja A – aminopterin: a klasszikus DNS szintézis út gátlószere T – timidin: az alternatív DNS szintézis út szubsztrátja Ellenanyag termelő képesség
Életképesség
Alternatív DNS szintézis út
HAT médiumban
Nem
Korlátlan
Nincs
† mert nem tud alternatívan DNS-t szintetizálni
Igen
Korlátozott (1 hét)
Van
† Mert nem korlátlan életképességű
Igen
Korlátlan
Van
Mielóma (Sp2)
B-sejt
Hibridóma
Monoklonális ellenanyagok előállítása 5. A megfelelő ellenanyagot termelő hibridómák „klónozása” (=egy sejtből eredő klonális tenyészet készítése, ahol minden sejt egyforma) A HAT szelekciót túlélt sejteket nagyon nagy hígitásban (hogy kevés sejt kerüljön egy lyukba) szétosztjuk mikorkultúrákba
Kiválasztjuk azokat a kultúrákat, melyek termelik az adott antigénre specifikus ellenanyagot (ez még oligoklonális!), és szétosztjuk úgy, hogy 1-1 klón jusson egy lyukba
Újra teszteljük, hogy mely lyukakban vannak pozitív (a megfelelő specificitású ellenanyagot termelő) sejtek
Monoklonális ellenanyagok előállítása A pozitív klónokat felszaporítjuk Fagyasztva (folyékony nitrogén) tárolás
Ellenanyag tisztítása a sejttenyészet felülúszójából Klón beoltása egér (azonos MHC hátterű/nude/scid) hasüregébe → nagy mennyiségű ellenanyag termelése aszciteszbe
Monoklonális és poliklonális ellenanyagok poliklonális ellenanyagok
monoklonális ellenanyagok
specificitás
heterogén
homogén
affinitás
heterogén
homogén
izotípus
heterogén
homogén
keresztreakciók
gyakori
nincs
előállítás
olcsó, egyszerű
drága, speciális felszerelést igényel
immunizálás
tisztított antigénnel
szennyeződés nem zavar
mennyisége
korlátozott
korlátlan
jellemzés
specificitás/keresztreagáló képesség – izotípus összetétel – átlag affinitás
finom specificitás – izotípus – affinitás
ajánlott módszerek
elsősorban az Ag-EA kötődést követő másodlagos reakciók kimutatásán alapuló precipitáció – agglutináció – komplement aktiválás
kis különbségek megkülönböztetésére alkalmas, jelöléses FACS / MACS – blot ELISA/RIA
George Köhler és Cesar Milstein 1984
Monoklonális és poliklonális ellenanyagok poliklonális
monoklonális
specificitás
Heterogén minden ellenanyag molekula az adott antigénre specifikus, de mindegyik egy másik részletére (epitópjára)
Homogén minden ellenanyag molekula teljesen egyforma , nemcsak azonos antigén, de azonos epitóp specificitás is
mennyiség
Korlátozott az adott állatból az oltás után kinyerhető savó/aszcitesz mennyisége határozza meg, új állat oltása nem ugyanolyan összetételű poliklonális készítményt ad
Korlátlan halhatatlan B-sejt klón in vitro teremeli
ag
ag
Ellenanyagok tisztítása 1. Biokémiai tisztítási módszerek
Az immunglobulinok fiziko-kémiai (töltés, mólsúly) tulajdonságai alapján szeparálunk A választott szeparálási mód és anyag attól függ, hogy milyen tulajdonságú ellenanyagot (pl. IgM vagy IgG) milyen egyéb fehérjéktől szeretnénk elválasztani • kisózás (pl. Na-szulfát, ammónium szulfát) • ioncserélő kromatográfia (pl. DEAE és CM cellulóz oszlopok) • gélszűrés (pl. Sephadex, Sepharose) 2. Affinitás kromatográfia A: Az ellenanyag konstans részén keresztüli tisztítás Protein G → IgG nehéz lánc Protein A → IgG nehéz lánc Protein L → κ könnyű lánc Jacalin → IgA MBL → IgM Alosztályokra, fajokra eltérő lehet a kötődés erőssége
Affinitás kromatográfia a konstans részen keresztül Fehérjekeverék (pl. immunszérum)
Elúciós oldat ami megbontja az ellenanyag és a Protein G közti másodlagos kötőerőket (általában pH változtatással)
Protein G Sepharose gyöngyökön (IgG hozzákötődik)
Minden átfolyik ami nem képes Portein Ghez kapcsolódni
Affinitás kromatográfia az antigén felismerő részen keresztül B: Az ellenanyag felismerő részén keresztüli tisztítás A megfelelő specificitású ellenanyagok elválaszthatóak nemcsak a többi fehérjétől, hanem a nagyon hasonló, de más specificitású ellenanyagoktól is
Fehérjekeverék (pl. immunszérum)
Protein G-s tisztítás
Elúció ugyanúgy mint Protein G-nél
Megjegyzés: Ez a módszer antigén tisztítására is jó, csak ekkor az ellenanyagot kell a gyöngyökhöz kapcsolni, majd ezen átfolyatni az antigént is tartalmazó fehérje keveréket
Sepahrose gyöngyökre kapcsolt antigén (=antigén szorbens)
Ellenanyagok tisztítása - összefoglalás Biokémiai módszerek, affinitás kromatográfia immunszérum (poliklonális) lépsejtek kivétele monoklonális készítés
• kisózás globulinok (minden Ig izotípus, antigén specifitástól függetlenül) • ioncserélő kromatográfia IgG (minden IgG alosztály, antigén specifitástól függetlenül) • Protein A / G / (L) IgG (κ) (IgG alosztály különbségek, ill. a κ könnyűláncú ellenanyagok antigén specifitástól függetlenül ) • antigén szorbens antigén specifikus ellenanyagok, Ig izotípustól függetlenül
Sejttenyészet felülúszó (monoklonális)
• Protein A / G / (L) tiszta monoklonális ellenanyag • antigén szorbens antigén specifikus ellenanyagok, Ig izotípustól függetlenül (ha pl. Olyan izotípusú a monoklonálisunk ami nem kötődik Protein G/A/L-hez
Hibridóma beoltása hasüregbe a nagyobb ellenanyag hozamért
aszcitesz folyadék
• kisózás globulinok (főleg a monklonális Ig, de az állat „saját” ellenanyaginak egy része is bekerül az aszciteszbe!) • ioncserélő kromatográfia IgG (főleg a monklonális Ig, de az állat „saját” ellenanyaginak egy része is bekerül az aszciteszbe!) • Protein A / G / (L) IgG (κ) (főleg a monklonális Ig, de az állat „saját” ellenanyaginak egy része is bekerül az aszciteszbe!) • antigén szorbens antigén specifikus monoklonális, Ig izotípustól függetlenül
Ellenanyagok módosítása Mit és miért lehet érdemes megváltoztatni egy ellenanyagon? • specificitás és affinitás • valencia • méret • effektor funkciók • könnyű konjugálhatóság (gyógyszerek, festékek, enzimek, stb.) • in vivo immunogenitás • a lebomlás sebessége Ellenanyag terápiák (vakcináció, tumorterápia, gyógyszer irányítás) • faj idegen fehérje (pl. Egér monoklonális ellenanyag) → immunválasz → ennek elkerülésére ellenanyag módosítás (humanizálás, stb...) • az ellenanyag specificitása jó, de módosítani kívánjuk az effektor funckiót (komplement aktiváció, FcR kötés, stb..)
Ellenanyagok módosítása 1. Kémiai módosítás • Részleges redukció láncok közötti diszulfid hidak megszűnnek, szabad SH csoportok jönnek létre
http://www.genovis.com/ms-analysis-of-mabs
• Limitált proteolízis papain, pepszin • Konjugálás (JELÖLÉS) Az ellenanyagot vagy a létrehozott fragmentumokat összekapcsoljuk más molekulákkal 2. Molekuláris biológiai módosítás jövő óra.... (Prechl József)
Ellenanyagok fragmentálása IgG
2x Fab Fc
IgG
F(ab’)2 pFc’
• Fajtól, izotípustól, glikoziláltságtól függ az emészthetőség (van, amit nem lehet) • Az emésztett termékeket a már ismert kromatográfiás módszerkkel lehet elválastztani egymástól • leggyakoribb enzimek: pepszin, papain • egyéb enzimek: tripszin, plazmin
Ellenanyagok tisztítása Ms /kDa
Ms /redukált
Ext.koeff. /280nm
IgG
150160
50/25
14,3
IgA
170
IgM
9001100
H
50-55
13,7
L
25
11,8
Fab
50
25
15,3
F(ab’)2
104110
25
14,8
Fc
50
25
12,2
pFc’
26
A termékek ellenőrzése SDS-PAGE-val
10,6 78/25
11,86
13,8
Ellenanyagok jelölése (=konjugálása)
+ Ellenanyag
Jelölő anyag toxin/gyógyszer
Jelölt ellenanyag
Ellenanyagok jelölése (=konjugálása)
Mivel jelöljük az ellenanyagot
Példa
Mit detektálunk
Milyen módszerben használjuk
Enzim
HRPO, AP
Enzimreakciót (szubsztrát elhasítva világít/színt vált)
ELISA, Western blot, immunhisztokémia
Fluoreszcens festék
FITC, PE, Alexa fetsékek, stb....
Fluoreszcenciát (fényt)
FACS, fluoreszcens mikroszkópia
Fémkolloid
arany, vas
A fém tulajdonságait
MACS, elektronmikroszkóp
Radioaktív izotóp
pl. 125I
Radioaktiv sugárzást
RIA
Ellenanyagok jelölése (=konjugálása) +1 sokoldalú jelölés: biotin
b
b
b
avidin b
b avidin
b
b
Avidin, Streptavidin, Extravidin, Neutravidin
b
b avidin
b
HRPO/b fluo festék/ fémkolloid/ izotóp
b
Ellenanyagok felhasználási területei
• antigén-ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló módszerek (pl. ELISA, Western blot, immunhisztokémia) • minőségi/mennyiségi meghatározások (pl. veszélyes anyagok kimutatása, finom különbségek kimutatása anyagok között) • sejtpopulációk kimutatása/szeparálása/aktiválása/aktiváció vizsgálata • anyagok tisztítása • diagnosztika • terápia
Miért jó ellenanyagokat használni ezekre a funkciókra? hagyományos és affinitás kromatográfián alapuló fehérje tisztítási módszerekkel kinyerhető
specifikus felismerő képessége kis molekuláris különbségek meghatározására alkalmas mindenféle kémiai természetű anyag ellen termeltethető
a specifitásának megfelelő antigénhez megfelelő erősséggel, de nem kovalens módon kötődik (megfelelő körülmények között szétválasztható az antigén-ellenanyag komplex) festékeket, izotópokat, enzimeket, drogokat, stb., lehet egyszerű módszerekkel hozzákonjugálni multivalens formában keresztkötni képes effektor rendszerek aktiválására in vivo és in vitro képes
Ellenanyagok felhasználása Antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapuló módszerek 1. Antigén-ellenanyag kapcsolódást követő másodlagos reakciók kimutatásán alapuló technikák
Az ellenanyag tulajdonságai (valencia, flexibilitás, affinitás) határozzák meg a másodlagos reakciót, ami pl. kicsapódás, agglutináció (térhálóképzés), stb...
2. Jelöléses technikák Közvetlenül az ellenanyagnak az antigénhez való kapcsolódását mutatjuk ki azáltal, hogy valamilyen módon detektálni tudjuk magát az ellenanyagot
Izotípus váltás és az antigén természetének összefüggése Az izotípus váltáshoz elengedhetetlen a Th sejtekkel való antigén specifikus kapcsolat
A T-sejtek csak peptideket (tehát fehérje eredetű antigéneket) ismernek fel
IgM-től eltérő izotípusú ellenanyagokat elsősorban fehérjék ellen lehet előállítani
T independens (TID) immunválasz (lipid, szénhidrát antigének) esetén főleg IgM, de! A citokin környezet hatására történhet izotípusváltás
Immunológiai módszerek 2.1. ábra, Immunológia 14.3. ábra
