Az ellenanyag mint eszköz, diagnosztikum, gyógyszer Vizler Csaba 2010
Az ellenanyagkötés esetében helyesebb lenne aviditásról beszélni, de inkább affinitást használunk
Az ismétlődő immunizálások egyre több specifikus IgG ellenanyagot eredményeznek.
Az IgG ellenyagok affinitása az affinitásérésnek köszönhetően nő.
Jó, ha az antigén •nagy molekula •komplex szerkezetű •ismétlődő epitopokat tartalmaz/multimer •oldhatatlan •nagyon különbözik a saját struktúráktól •nincs túl nagy dózisban jelen “high dose tolerance”
Egy antigén immunogenitása függ a bevitel útjától:
csökkenő immunogenitás
szubkután (s.c.) intramuszkuláris (i.m.) intraperitoneális (i.p.) intravénás (i.v.) orális (p.o.)
A szervezetbe juttatott potenciális antigének nem mindíg képesek önmagukban immunválaszt kiváltani. Az immunizálásnál alkalmazott adjuvánsok •lassítják az antigén felszabadulását •DANGER szignált produkálnak •legújabb generációjuk egyenesen az antigénprezentáló sejtek citoszoljába juttathatja az antigént, így indukál CTL aktivitást
Komplett Freund adjuváns ásványolajvíz emulzió+elölt Mycobacterium tuberculosis Inkomplett Freund adjuváns ásványolajvíz emulzió Alumíniumhidroxid+elölt Bordatella pertussis Alumíniumhidroxid ISCOM lipidemulzió, ami az antigént a citoszolba juttatja
Az ellenanyagok forrása Egér olcsó, egyszerű, monoklonális ellenanyaggá fejleszthető Patkány ha egérben nem menne Nyúl ha több poliklonális ellenanyagra van szükség Birka – kecske szamár Tyúk Ember allélspecifikus ellenanyagok: MHC, ABO, Rh
Monoklonális ellenyagok Ha egy affinitásérésen átment B sejtet halhatatlanná teszünk, korlátlan mennyiségben termelhetünk egy adott specificitású ellenanyagmolekulát.
Monoklonális ellenanyaggyártás: Immunizált egér (vagy más emlős) B sejtek + SP/2 myeloma, HGPRT, halhatatlan
Purin nukleotidok szintézisútjai: aminopterinnel (antifolát) gátolható de novo szintézis hypoxanthinból kiinduló, HGPRTfüggő salvage szintézis
Myeloma sejtvonal HPGRT mutáns, HAT médiumban elpusztul egyébként “halhatatlan”
Aktivált B sejt ellenanyagot termel anyagcseréje normális sejtkultúrában elpusztul
Fúziós hibrid HPGRT+, HAT médiumban életképes “halhatatlan”
Klónozás, a kívánt klónok szelekciója
Részlet Milstein nekrológjából: Margaret Thatcher, as Prime Minister, criticised Milstein and the MRC's failure to apply for a patent.
PHAGE DISPLAY technikával B sejt génbankból átrendezett immunglobulin könnyű és nehézlánc géneket foghatunk ki.
PHAGE DISPLAY technikával B sejt génbankból átrendezett immunglobulin könnyű és nehézlánc géneket foghatunk ki.
Iparilag alkalmazható epitopellenanyag párok: Flagtag DYKDDDDK. Számos nagy affinitású,ellenanyag kapható hozzá, köztük Ca++ függők. Histag (polyhistidinetag), legalább 6 hisztidin Ellenanyagok kaphatók ellene, Co++ vagy Ni++ kelátot képez
Agglutinációnprecipitáción alapuló módszerek
A vércsoportantigéneket agglutinációval mutatják ki
Coombs teszt: Az antiRh ellenanyag okozta agglutinációt második (antihumán) ellenanyaggal fokozzák. Hasonló teszttel mutatják ki az autoimmun hemolitikus anémiát
Az immunprecipitáció antigének kimutatására, mennyiségi meghatározására és tisztítására alkalmas. Túlsúlyban az ellenyag (oldat)
Ekvivalencia (precipitátum)
Túlsúlyban az antigén (oldat)
Mieszórás, nagyobb részecskeméretnél vörösből kékbe vált a kolloid arnyszuszpenzió
A terhességi gyorstesztek egy része kolloid arany alapú
Fehérjék tisztítása ellenanyag alapú affinitáskromatográfiával. “tükörképe” az ellenyagok affinitástisztitása, itt az antigént kötjük szilárd hordozóhoz és az ellenanyagot tisztítjuk vele.
Fehérjék azonosítása “futószalagon” Ismeretlen molekula tisztítása Ellenanyag előállítása Immunprecipitációval tisztított antigén Részleges emésztés Tömegspektrográfia (pl. MALDITOF) Néhány aminosavas peptidszekvenciák A keresett fehérje meghatározása adatbázisok alapján
Sejtszeparálás ellenanyaggal bevont mágnesezhető gyöngyökkel. Pl. őssejttranszplantátumok “tisztítására” használják.
Dynabead
MACS bead
“Jelölt” ellenanyagok felhasználása antigének kimutatására Fluoreszcens festékek: •Fluoreszcein izotiocianát (FITC) •Fikoeritrin (PE) •Allofikocianin (APC) Enzimek: •Tormaperoxidáz (HRP) •Alkalikus foszfatáz (AP) oldható és oldhatalan színes szubsztrátok, lumineszkáló szubsztrátok Elektronmikroszkópos kontrasztanyagok •Aranykomplexek
Immunhisztokémia színes reakciótermék kimutatásával. CD8+ T sejtek okozta autoimmun diabéteszben szenvedő egér Langerhans szigete antiCD8HRP
diabétesz
kontroll
antiinzulinHRP
Direkt jelölés
Indirekt jelölés biotinavidin rendszerrel
Indirekt jelölés második ellenanyaggal
Immunfluoreszcencia gerjesztő fény
fluoreszcencia
Áramlási citofluorimetria, FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter)
Side Scatter (struktúráltsággal arányos)
Fluoreszcencia
Argon lézer Forward Scatter (mérettel arányos)
Szortírozás (opcionális)
Példa: A dendritikus sejtek magas szinten fejeznek ki MHCII és kostimuláló molekulákat (B7.2)
EnzymeLinked Immuno Sorbent Assay (ELISA)
„szendvics” ELISA blokkoló fehérje
„bead array” a mintához adott gyöngyök felületén tucatnyi „ELISA” reakciót végzünk egyidejűleg, kiértékelés FACSszal
Radioimmunoassay RIA Alapja a vizsgált antigén kompetíciója ismert koncentrációjú radioaktív antigénnel.
Western blot Fehérje gélelektroforézis
Transzfer nitrocellulóz membránra
Előhívás (többnyire HRP alapú, ma főleg lumineszcens)
A monoklonális ellenyagokkal definiált molekulák CD kódot (Cluster of Differentiation) kapnak. A monoklonális ellenyagok létfontosságúak a daganatok diagnosztikájában. Nemcsak diagnosztikai eszközként, hanem gyógyszerként is használhatóak. A T sejtes immunválasz gátlására (immunszuppresszíóra) használható az OKT3 antiCD3 monoklonális ellenyag.
Szabadalmazható minden 1. új, 2. feltalálói tevékenységen alapuló, 3. iparilag alkalmazható műszaki megoldás. A szabadalom jogosultjának kizárólagos joga van arra, hogy a találmányt 1. hasznosítsa, vagy 2. a hasznosításra másnak engedélyt (licenciát) adjon. A szabadalmi oltalom időtartama a bejelentés napjától húsz év. A jogosulatlan hasznosítás polgári perben támadható meg.
Drug development pipeline
Target identification Hit generation Lead generation Preclinical studies (animal models, e.t.c.) Phase I (safety, 2080 healthy volunteers) Phase II (efficacy, 100300 patients) Phase III (10003000 patients)
GLP (Good Laboratory Practice) és GMP (Good Manufacturing Practice) Minőségbiztosítási rendszerek Traceability: the ability to reconstruct the development history of a drug. Accountability: who has contributed what to the development, and when. Használjuk, de nem sokszor nem tudjuk a nevét: SOP=standard (or standing) operating procedure
CD20 CD20
CD20 CD25 TNF EGFR GPIIb/IIIa HER2 RSV CD33 CD52 IgE CD11a VEGF
CD25
TNF
