ELISA-VIDITEST anti-TBEV IgM OD-194 Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, tel.: +420 261 090 565, www.vidia.cz 1. NÁZEV SOUPRAVY: ELISA-VIDITEST anti-TBEV IgM – ELISA souprava pro detekci protilátek třídy IgM proti viru klíšťové encefalitidy (TBEV) v lidském séru, plazmě nebo mozkomíšním moku. 2. POUŽITÍ: Souprava je určena pro diagnostiku infekcí virem klíšťové encefalitidy (TBEV), např. encefalitidy nebo meningoencefalitidy. Soupravu lze též využít pro diferenciální diagnostiku neuroinfekcí a sledování protilátkové odpovědi po očkování proti TBEV. Doplňujícím vyšetřením je průkaz IgG protilátek proti TBEV (ELISA-VIDITEST anti-TBEV IgG) a stanovení avidity IgG protilátek proti TBEV (ELISA-VIDITEST anti-TBEV IgG a avidita IgG). 3. PRINCIP TESTU: ELISA-VIDITEST anti-TBEV IgM je imunoanalytický test na pevné fázi. Na povrch jamek je navázán specifický antigen reprezentující virus klíšťové encefalitidy. Jsou-li v testovaných vzorcích příslušné protilátky, navážou se na imobilizované antigeny. Navázané protilátky pak v dalším kroku reagují s protilátkami proti lidskému IgM značenými křenovou peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí. Negativní vzorky nereagují, mírná změna v zabarvení jamek je pozadím reakce. 4. OBSAH SOUPRAVY: ELISA odlamovací stripy v manipulačním rámečku, potažené specifickým antigenem STRIPS Ag 1,3 mL negativního kontrolního séra r.t.u.1) CONTROL 1,3 mL pozitivního kontrolního séra r.t.u. CONTROL + 13 mL protilátek proti lidskému IgM značených peroxidázou (konjugát anti-IgM Px) r.t.u. CONJ 125 mL promývacího roztoku 10x konc. WASH 10x 100 mL ředicího roztoku r.t.u. DIL 13 mL chromogensubstrátového roztoku TMB r.t.u. TMB-O 13 mL stop roztoku r.t.u. STOP Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci)
1 x 12 ks 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička
Chromogensubstrátový roztok TMB-O r.t.u. je zaměnitelný pouze mezi soupravami ELISAVIDITEST, které obsahují TMB-O, a NENÍ VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÝ s ostatními roztoky TMB použitými v jiných soupravách ELISA-VIDITEST (TMB, TMB-BF). 1
5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr pro měření absorbance mikrotitrační destičky při 450nm. 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ: a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér, mozkomíšních moků a kontrolní séra. Testovaná séra řeďte 101x ředicím roztokem (např. 5 μL séra + 500 μL ředicího roztoku). Mozkomíšní moky řeďte ředicím roztokem 2x (např. 75 μL mozkomíšního moku + 75 μL ředicího roztoku). Kontrolní séra neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use). c. Připravte si pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 100 mL promývacího roztoku + 900 mL H2O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho na vodní lázni na +32 až +37oC a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 týden při teplotě +2 až +10oC. d. Konjugát anti-IgM Px, chromogensubstrátový roztok TMB-O a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). 7. PRACOVNÍ POSTUP: a. Stripy zatavené s desikantem nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Naplňte příslušné jamky po 100 μL kontrolními séry a ředěnými testovanými vzorky podle následujícího schématu (viz Tab.1): první jamku naplňte samotným ředicím roztokem pro stanovení pozadí reakce (DIL). Další dvě jamky naplňte pozitivním kontrolním sérem (CONTROL+). Další jamku naplňte negativním kontrolním sérem (CONTROL -). Zbývající jamky naplňte ředěnými testovanými vzorky (S1…). Každý vzorek stačí aplikovat na jednu jamku (S1, S2, S3,…). Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, aplikujte pozitivní kontrolní sérum do tří jamek a vyšetřované vzorky po dvou jamkách. Inkubujte 30 minut (± 2 min.) při laboratorní teplotě. c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 4x promyjte 250 μL promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. d. Důkladně promíchejte lahvičku s konjugátem anti-IgM Px r.t.u. (CONJ) a napipetujte do jamek po 100 μL konjugátu anti-IgM Px r.t.u.. Inkubujte 60 minut (± 5 min.) při laboratorní teplotě. e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 μL promývacího roztoku (viz bod c.). Odsajte a vyklepněte. f. Napipetujte do jamek po 100 μL chromogensubstrátového roztoku TMB-O. Inkubujte 10 minut (± 30 sec.) v temnu při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy neprůhledným víčkem nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. g. Zastavte reakci přidáním 100 μL stop roztoku. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku TMB-O, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. h. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 10 minut po zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620 – 690 nm. 2
Tab.1: Schéma aplikace vzorků: 1 2 A B C D E F G H
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
DIL CONTROL+ CONTROL+ CONTROL S1 S2 S3 S...
8. HODNOCENÍ TESTU: Nejdříve odečtěte absorbanci jamky se samotným ředicím roztokem (DIL = pozadí reakce) od hodnot kontrolních sér a testovaných vzorků. 8.1. Kvalitativní orientační hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu OD pozitivního kontrolního séra (CONTROL+) ze dvou jamek. Pokud aplikujete pozitivní kontrolní sérum na tři jamky a jedna z hodnot OD liší o více než 20% od průměru, nepoužívejte ji k výpočtu a spočítejte průměr ze zbývajících dvou hodnot. 2. Stanovte cut-off hodnotu. Cut-off hodnotu stanovíte tak, že průměrnou hodnotu OD pozitivního kontrolního séra vynásobíte korekčním faktorem. Hodnota korekčního faktoru CONTROL+ se určuje pro každou šarži soupravy a je uvedena v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. Korekční faktor je rozdílný pro séra a pro mozkomíšní moky. 3. Vzorky s hodnotou OD < 90% cut-off jsou negativní a vzorky s hodnotou OD > 110% cut-off jsou považovány za pozitivní. Vzorky s OD v rozmezí 90-110% cut-off jsou hraniční (viz Pozn.). 8.2. Semikvantitativní hodnocení pomocí indexu protilátek Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér a mozkomíšních moků: 1. Nejdříve stanovte cut-off hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (čl. 8.1. bod 2). 2. Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky tak, že vydělíte OD testovaného vzorku cut-off hodnotou. 3. Odečtěte v tabulce (viz HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ) odpovídající stupeň reaktivity vzorku. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ: a) séra Hodnota indexu < 0,90 0,90 – 1,10 1,11 – 2,50 2,51 – 5,00 5,01 – 7,50 > 7,50
Vyhodnocení Negativní +/+ ++ +++ ++++
b) mozkomíšní moky Hodnota indexu < 0,90 0,90 – 1,10 > 1,10
Vyhodnocení Negativní +/+ 3
Příklad:
Získaná hodnota OD CONTROL+ Průměrná hodnota OD CONTROL+ Korekční faktor CONTROL+ Cut-off hodnota OD vzorku séra Hodnota indexu vzorku
= 1,010; 1,042 = 1,026 = 0,28 = 1,026 x 0,28 = 0,287 = 0,800 = 0,800 / 0,287 = 2,79
Pozn.: Hodnocení +/- znamená, že sérum leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Leží-li sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou nebo použijte sérum odebrané od téhož jedince o 1-2 týdny později. Přítomnost revmatoidního faktoru může interferovat se stanovením IgM. Doporučujeme ho vysytit před testem RF sorbentem, který se ředí v ředicím roztoku 51x. ELISA-VIDITEST RF sorbent 1ml není součástí soupravy a je možno si ho objednat u výrobce samostatně. 9.
INTERPRETACE VÝSLEDKŮ:
Nález protilátek proti TBEV IgG IgM Avidita IgG +
-
vysoká
-
+
-
+ +
+ -
nízká nízká
+
+
vysoká
Interpretace nálezu
Séronegativní, vnímavý k infekci Anamnestické protilátky (prodělaná infekce, stav po očkování) Infekce u očkovaných jedinců* (doporučeno sledování dynamiky IgG ve druhém vzorku séra, odebraném s odstupem 2 týdnů) Susp. akutní infekce – časná fáze, doporučeno vyšetření druhého vzorku séra s odstupem 1 týdne Průkaz akutní infekce Susp. akutní nebo recentně prodělaná infekce Susp. recentně prodělaná infekce, infekce u očkovaných, nebo nespecifická reaktivita v IgM, doporučeno vyšetření druhého vzorku séra s odstupem alespoň 2 týdnů
*POZNÁMKA: Výsledek testu lze interpretovat pouze v kontextu s klinickými příznaky a anamnézou pacienta. Souprava ELISA-VIDITEST anti-TBEV IgM může zachycovat i křížově reagující protilátky proti jiným flavivirům, např. proti viru dengue nebo viru západonilské horečky (West Nile). Detekce protilátek proti TBEV v ELISA nezaručuje protektivní imunitu proti infekci. Přítomnost protektivních protilátek je nutno ověřit virus-neutralizačním testem. 10. CHARAKTERISTIKY TESTU: 10.1. Platnost testu Průměrná hodnota absorbance (OD) CONTROL+ by měla být v rozmezí uvedeném v Certifikátu kontroly kvality. Hodnota absorbance samotného ředicího roztoku (DIL = pozadí reakce) by měla být < 0,100. Hodnota absorbance CONTROL - by měla být < 0,150. 10.2. Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy (interassay) a během testu (intraassay) bylo provedeno srovnání vzorků s různými hodnotami OD. 4
10.2.1 Opakovatelnost (intraassay) Variační koeficient opakovatelnosti je maximálně 5%. Je měřen pro každou šarži minimálně na 12 paralelních jamkách téže destičky. Příklad: (n = počet paralelních jamek na téže destičce) n OD ±σ CV opak. 14 2,480 0,060 2,4 %
10.2.2. Reprodukovatelnost (interassay) : Variační koeficient reprodukovatelnosti je maximálně 15%. Je měřen pro každou šarži porovnáním jamek téhož séra v několika po sobě jdoucích testech. Příklad: (n = počet testů určitého vzorku) n OD ±σ min – max 5 1,140 0,079 1,035 – 1,235 6 0,502 0,061 0,420 – 0,566
CV repro. 6,9 % 12,2 %
10.3. Diagnostická citlivost a specifita testu Stanovení diagnostické citlivosti bylo provedeno testováním 28 ks vzorků vybraných z populace, kde byl očekáván pozitivní výsledek na IgM proti TBEV (pacienti s akutní nebo recentní infekcí TBEV). Diagnostická citlivost je 100%. Shoda výsledku s jiným nezávislým komerčním testem je 100%. Specifita testu byla stanovena z 97 ks vzorků krevních dárců, kde byl očekáván TBEV IgM negativní výsledek (neočkovaní a očkovaní zdraví dárci). Výsledná specifita testu z daných vzorků byla 97,9%. Shoda výsledku s jiným komerčním testem je 96,7%. 10.4. Recovery test Naměřené hodnoty recovery se pohybují pro každou šarži v rozmezí 80 až 120% očekávané hodnoty. 10.5. Interference Hemolytické a lipemické vzorky nevykazují žádný vliv na výsledek testu minimálně do 50 mg/mL pro hemoglobin, 5 mg/mL pro bilirubin a 80 mg/mL pro triglyceridy. Interference revmatoidního faktoru (RF) v tomto testu nebyla prokázána, nicméně u vzorků s vysokou hladinou RF nelze výskyt falešných pozitivit vyloučit. RF sorbent lze samostatně objednat u výrobce. 11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek anti-HIV1,2. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121°C, nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin, ...) v koncentraci doporučené výrobcem. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu.
5
12. UPOZORNĚNÍ: a. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. b. Promývací roztok, stop roztok r.t.u. a ředicí roztok r.t.u. pro séra jsou vzájemně zaměnitelné mezi jednotlivými soupravami ELISA-VIDITEST, pokud není v návodu k použití soupravy uvedeno jinak. b. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií. c. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. d. Kontrolní séra, ředicí roztok a konjugát anti-IgM Px jsou konzervovány ProClinem 300. e. Chromogensubstrátový roztok TMB-O nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. f. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v kapitole 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů 13. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE: a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě +2 až +10°C v originálních obalech. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Soupravy se přepravují chlazené v termotaškách, doba přepravy do 72 hodin nemá na expiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. c. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. d. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě -18 až -28°C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě +2 až +10°C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. e. Roztoky testovaných sér v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé.
14. DOPORUČENÁ LITERATURA: Dumpis U., Crook D., Oksi J.: Tick-Borne Encephalitis. Clinical Infectious Diseases, 1990; 28 (April): 882-890. Heinz F. X., Roggendorf M., Hofmann H., Kunz Ch., Deinhardt F.: Comparsion of Two Different Enzyme Immunoassays for Detection of Immunoglobulin M Antibodies Against Tick-Borne Encephalitis Virus in Serum and Cerebrospinal Fluid. Journal of Clinical Microbiology, Aug. 1981; 141-146. Holzmann H:Diagnosis of thick-borne encephalitis. Vaccine 2003; S1: S1/36-S1/40. Kříž B., Beneš Č.: Klíšťová encefalitida. Zpráva SZÚ www.szu.cz/tema/prevence/klistovaencefalitida-1, 16. březen 2010.
6
15. TESTOVACÍ SCHÉMA: Krok 1.
Připravte reagencie a testovaná séra v pracovním ředění ↓
Krok 2.
Aplikujte kontrolní a testovaná séra (100 μL / jamku) ↓ Inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě ↓ 4x promyjte (250 μL / jamku), vyklepněte ↓
Krok 3.
Aplikujte konjugát anti-IgM Px r.t.u. (100 μL / jamku) ↓ Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě ↓ 4x promyjte (250 μL/ jamku), vyklepněte ↓
Krok 4.
Aplikujte chromogensubstrátový roztok TMB-O (100 μL / jamku) ↓ Inkubujte 10 minut v temnu při laboratorní teplotě ↓
Krok 5.
Aplikujte stop roztok (100 μL / jamku) ↓
Krok 6.
Změřte absorbanci při 450 / 620 - 690 nm do 10 minut
Souprava byla vyvinuta za finanční podpory ze státních prostředků poskytnutých prostřednictvím Ministerstva průmyslu a obchodu.
Datum poslední verze tohoto návodu: 07/2014
7
8
