ELISA-VIDITEST anti-cmv IgM capture

1023

ELISA-VIDITEST anti-CMV IgM capture OD-162

96

Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, tel.: 261 090 565, www.vidia.cz 1. NÁZEV SOUPRAVY: ELISA-VIDITEST anti-CMV IgM capture – ELISA souprava v uspořádání capture pro detekci protilátek třídy IgM proti lidskému cytomegaloviru (CMV). 2. POUŽITÍ: Souprava je určena pro diagnostiku chorob vyvolaných nebo asociovaných s CMV, např. infekční mononukleózy, CMV syndromu a akutní a chronické CMV infekce u imunosuprimovaných pacientů. Soupravu lze též využít při komplexní charakterizaci chronického únavového syndromu a pro stanovení CMV séropozitivity u dárců krve, orgánů a příjemců těchto biologických materiálů. 3. PRINCIP TESTU: ELISA-VIDITEST anti-CMV IgM capture je imunoanalytický test na pevné fázi. Na povrchu jamek mikrotitračních destiček je imobilizována anti-lidská IgM protilátka. Po aplikaci testovaných sér se na imobilizovanou protilátku navážou všechny IgM protilátky obsažené ve vzorku. V dalším kroku jsou navázané specifické protilátky detekovány pomocí směsi specifických rekombinantních antigenů a detekční protilátky, značené peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí a je přímo úměrné obsahu specifických IgM protilátek v testovaném vzorku. Negativní séra nereagují, mírná změna v zabarvení jamek je pozadím reakce. 4. OBSAH SOUPRAVY: ELISA odlamovací stripy v manipulačním rámečku, potažené protilátkou anti-lidské IgM STRIPS Ab 1,3 ml negativního kontrolního séra, r.t.u.1) CTRL 1,3 ml kalibrátoru, r.t.u. CAL Lyofilizovaná směs specifických antigenů Ag LYOF 0,15 ml protilátek anti-GST značených peroxidázou (Px konjugát) 101x konc. CONJ 101x 55 ml Promývacího roztoku 10x konc. WASH 10x 60 ml Ředicího roztoku r.t.u. DIL 13 ml Chromogensubstrátového roztoku TMB-BF r.t.u. TMB-BF 13 ml Stop roztoku r.t.u. STOP Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci)

1 x 12 ks 1 lahvička 1 lahvička 6 lahviček 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička

Chromogensubstrátový roztok TMB-BF r.t.u. je zaměnitelný pouze mezi soupravami ELISAVIDITEST, které obsahují TMB-BF, a NENÍ VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÝ s ostatními roztoky TMB použitými v jiných soupravách ELISA-VIDITEST TMB, TMB-O.

1

5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku a lyofilizované směsi antigenů, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr pro mikrotitrační destičky s filtrem pro vlnovou délku 450 nm a 620-690 nm referenčním filtrem (není podmínkou). 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ: a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér a kontrolní séra. Testovaná séra řeďte ředicím roztokem 101x (5 μl séra + 500 μl ředicího roztoku). Kontrolní séra neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use). c. Připravte pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 50 ml promývacího roztoku + 450 ml H2O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho na vodní lázni na +32 až +37oC a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 týden při teplotě +2 až +10oC. d. Chromogensubstrátový roztok TMB a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). 7. PRACOVNÍ POSTUP: a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Naplňte jamky po 100 μl jednotlivých kontrolních sér a ředěných testovaných sér takto: Dvě jamky naplňte kalibrátorem CAL a další jamku negativním kontrolním sérem CTRL-. Kalibrátor v soupravě slouží zároveň i jako pozitivní kontrola. Zbývající jamky naplňte ředěnými testovanými vzorky sér (Vz1…). Každý vzorek stačí aplikovat na jednu jamku (Vz1, Vz2, Vz3,…). Viz také Schéma aplikace vzorků. Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, vyšetřované vzorky a negativní kontrolní sérum aplikujte po dvou jamkách, kalibrátor na tři jamky. Inkubujte 60 minut (+/- 5 min.) při laboratorní teplotě. c. V průběhu inkubace se séry si připravte směs specifických antigenů a detekční protilátky tímto způsobem: Připravte si potřebný počet lahviček s lyofilizovanou směsí antigenů Ag LYOF (pro 2 stripy je zapotřebí 1 lahvička). Napipetujte do každé lahvičky se směsí antigenů 1 mL destilované/deionizované vody a obsah lahvičky rozpusťte opatrným promícháním. Po úplném rozpuštění lyofilizátu přidejte do každé lahvičky 1 mL ředicího roztoku a promíchejte. Pozn. Takto připravenou směs antigenů lze skladovat při +2 až +10 °C max. po dobu 2 týdnů (viz kap.13, bod d). Těsně před promytím stripů po inkubaci se séry smíchejte rozpuštěnou směs antigenů s Px konjugátem tímto způsobem: Pokud testujete pouze 2 stripy, tzn. používáte 1 lahvičku s rozpuštěnou směsí antigenů, přidejte do lahvičky 20 µL Px konjugátu CONJ 101x. Získáte tak výsledné ředění Px konjugátu 101x. Pokud používáte více stripů a více lahviček se směsí antigenů, odpipetujte potřebné množství roztoku směsi antigenů (např. pro 4 stripy je zapotřebí rozpustit 2 lahvičky s lyofilizovanou směsí antigenů, tj. celkem 4 ml rozpuštěné směsi – pro 4 stripy je zapotřebí přesně 3,2 ml roztoku směsi antigenů – odeberte např. 3,6 ml směsi a přidejte 36 µl Px konjugátu (ředění 101x). Jemně promíchejte. d. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 5x promyjte 250 l promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. e. Napipetujte do jamek po 100 L připravené směsi antigenů a Px konjugátu. Inkubujte 60 minut (+/-5 min.) při laboratorní teplotě. f. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 5x 250 l promývacího roztoku. Odsajte a vyklepněte. g. Napipetujte do jamek po 100 l chromogensubstrátového roztoku TMB-BF. h. Inkubujte 20 minut (+/- 30 sec.) v temnu při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. 2

Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. i. Zastavte reakci přidáním 100 l stop roztoku STOP. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku TMB-BF, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. j. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 10 minut po zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620 - 690 nm. Schéma aplikace vzorků: 1 2 a CAL b CAL c CTRL d Vz 1 e Vz 2 f Vz 3 g Vz … h

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

8. HODNOCENÍ TESTU: 8.1. Kvalitativní orientační hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu OD Kalibrátoru CAL ze dvou jamek. Pokud aplikujete tři jamky Kalibrátoru a některá z těchto hodnot se liší o více než 20% od průměru, nepoužívejte ji k výpočtu a spočítejte průměr ze zbývajících dvou hodnot. 2. Stanovte cut-off hodnotu. Cut-off hodnotu stanovíte tak, že průměrnou hodnotu OD Kalibrátoru vynásobíte korekčním faktorem. Hodnota korekčního faktoru Kalibrátoru se určuje pro každou šarži soupravy a je uvedena v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. 3. Séra s hodnotou OD < 80% cut-off jsou negativní a séra s hodnotou OD > 120% cut-off jsou považována za pozitivní. 8.2. Semikvantitativní hodnocení Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér: 1. Nejdříve stanovte cut-off hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (čl. 8.1., bod 2). 2. Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér tak, že vydělíte OD testovaného séra cut-off hodnotou. 3. Odečtěte v tabulce (viz HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ) odpovídající stupeň reaktivity séra. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ: Hodnota indexu < 0,80 0,80 – 1,20 > 1,20

Vyhodnocení Negativní +/Pozitivní

Příklad: Získaná OD Kalibrátoru průměrná hodnota OD Kalibrátoru OD vzorku séra Korekční faktor Kalibrátoru Cut-off hodnota Hodnota indexu

= 1,224; 1,272 = 1,248 = 0,712 = 0,18 = 1,248 x 0,18 = 0,225 = 0,712 / 0,225 = 3,16

3

Pozn.: Hodnocení +/- znamená, že sérum leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Leží-li sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou, nebo použijte sérum odebrané od téhož jedince o 1-2 týdny později. 9. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ: Výsledky vyšetření lze interpretovat pouze v kontextu s klinickými příznaky pacienta a s výsledky ostatních laboratorních testů. U imunodeficientních pacientů negativita IgM protilátek proti CMV nevylučuje probíhající nebo recentně proběhlou infekci. Naopak, samotný nález IgM protilátek není důkazem aktivní infekce. Vzorky od pacientů s akutní infekcí EBV, HSV, VZV, Toxoplasma gondii, legionellou, chlamydiemi nebo od pacientů s některými typy autoimunitních onemocnění mohou v testu poskytovat falešně pozitivní výsledky. Pro diagnostiku aktivní cytomegalovirové infekce u těhotných žen musí být vyšetření CMV- specifických IgM protilátek doplněno dalšími sérologickými testy (stanovení hladiny a avidity protilátek proti CMV). 10. CHARAKTERISTIKY TESTU: 10.1 Platnost testu

Hodnoty OD standardů/ kontrolních sér by měly být v rozmezích uvedených v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. Test je určen pro stanovení specifických IgM protilátek v lidském séru. 10.2. Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy - reprodukovatelnost (interassay) a během testu opakovatelnost (intraassay) bylo provedeno srovnání vzorků s různými hodnotami OD. 10.2.1 Opakovatelnost (intraassay) Variační koeficient opakovatelnosti je maximálně 12 paralelních jamkách téže destičky. Příklad: (n = počet paralelních jamek na téže destičce) n A σ 16 1,335 0,050 16 0,614 0,023

5%. Je měřen pro každou šarži minimálně na

CV opak. 3,8 % 3,7 %

10.2.2. Reprodukovatelnost (interassay) Variační koeficient reprodukovatelnosti je maximálně 15%. Je měřen pro každou šarži porovnáním jamek téhož séra v několika po sobě jdoucích testech. Příklad:(n = počet testů určitého vzorku) n A σ min – max CVrepro 18 1,369 0,064 1,223-1,476 4,7% 18 0,463 0,060 0,337-0,569 12,9% 43 1,372 0,119 1,184-1,750 8,7% 10.2.3. Recovery test Naměřené hodnoty recovery se pohybují pro každou šarži v rozmezí 80 až 120% očekávané hodnoty. 10.3. Diagnostická citlivost a specifita testu Stanovení diagnostické citlivosti bylo provedeno testováním pacientských vzorků, u kterých byly přítomny IgM protilátky proti cytomegaloviru (CMV). Výsledek byl potvrzen nezávislými komerčními testy v rámci interní studie funkční způsobilosti soupravy. Diagnostická citlivost je 96,2%. Specifita testu byla stanovena testováním charakterizovaných vzorků sér, u kterých nebyly prokázány IgM protilátky proti cytomegaloviru (CMV). Výsledná specifita testu z daných vzorků byla 95,9 %. 10.4. Interference Hemolytické a lipemické vzorky nevykazují žádný vliv na výsledek testu minimálně do 50mg/mL pro hemoglobin, 5 mg/mL pro bilirubin a 50mg/mL pro triglyceridy. 4

11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek anti-HIV-1,2. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 °C, nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Nespotřebovanou směs antigenů likvidujte jako infekční odpad, použijte vhodné dezinfekční činidlo (3% roztok chloraminu, incidur aj.) Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin, ...) v koncentraci doporučené výrobcem. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 12. UPOZORNĚNÍ: a. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. b. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií. c. Promývací roztok, stop roztok r.t.u. a ředicí roztok r.t.u. pro séra jsou vzájemně zaměnitelné mezi jednotlivými soupravami ELISA-VIDITEST, pokud není v návodu k použití soupravy uvedeno jinak. d. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. e. Kontrolní séra, ředicí roztok a Px konjugát jsou konzervovány ProClinem 300. Chromogen-substrátový roztok TMB-BF je konzervován Kathonem. f. Chromogensubstrátový roztok nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. g. Pro aplikaci roztoků a měření absorbance používejte pouze validované měřicí přístroje. h. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v bodě 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů 13. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE: a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě +2 až +10°C. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, exspirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte, nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. Soupravy se přepravují chlazené v termotaškách. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. c. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě -18 až -28°C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě +2 až +10°C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. d. Nespotřebovanou rozpuštěnou směs antigenů lze skladovat při +2 až +10°C max. po dobu 2 týdnů. e. Roztoky testovaných sér a směsi antigenů s Px konjugátem v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé.

5

14. POUŽITÉ SYMBOLY: počet testů Conformité Européenne – výrobek splňuje požadavky evropské legislativy 1023Conformité Européenne - posouzení shody bylo provedeno notifikovanou osobou číslo 1023 diagnostika in vitro σ směrodatná odchylka CV variační koeficient OD optická denzita výrobce expirace šarže soupravy 10°C 2°C

°C % n A

skladování při +2°C - +10°C stupeň Celsia procento počet testů určitého vzorku hodnota určitého vzorku čtěte příbalové informace

15. TESTOVACÍ SCHÉMA: Krok 1.

Připravte reagencie a testovaná séra v pracovním ředění 

Krok 2.

Aplikujte kontrolní a testovaná séra (100 l/ jamku)  Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě  5x promyjte (250 l/ jamku), vyklepněte 

Krok 3.

Aplikujte rozpuštěnou směs antigenů s Px konjugátem (100 l/ jamku)  Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě  5x promyjte (250 l/ jamku), vyklepněte 

Krok 4.

Aplikujte Chromogensubstrátový roztok TMB-BF (100 l/ jamku)  Inkubujte 20 minut v temnu při laboratorní teplotě 

Krok 5.

Aplikujte Stop roztok (100 l/ jamku) 

Krok 6.

Změřte absorbanci při 450/620-690 nm do 10 minut 6

Literatura: Landini M.P. & Michelson S.: Human cytomgalovirus proteins, Progr. Med. Virol. 35 : 152 – 185, 1988 Ramskill S., Senior P., Barlow P., Tovey L.A.D.: Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for cytomegalovirus antibody on donor plasma, J. Clin. Pathol. 41 : 1233 – 1235, 1988 Van der Vort, L.H.M.,vanZanten,J.,DeLeij,L.F.M.H.,The,T.H.: Determionation of human antibodies to specific antigens of cytomegalovirus usin antigen capture immunoassay. J.Immunol.Meth. 1989; 121: 95-103 Vornhagen R.,Hinderer,W.,Sonnenborn,H.H. et al.: IgM-specific serodiagnosis of acute human cytomegalovirus infection using recombinant autologous fusion proteins. J.Virol.met. 1996; 60: 73-80. Landini, M.P.,Lazzarotto,T.,Maine,G.T., et al.: Recombinant mon- and polyantigens to detect cytomegalovirus specific Immunoglobulin M in human sera by enzyme immunoassay. J.Clin.Microbiol. 1995;33: 2535-2542. Datum poslední verze tohoto návodu: 11/2015

Souprava byla vyvinuta za finanční podpory ze státních prostředků poskytnutých prostřednictvím Ministerstva průmyslu a obchodu ČR.

7