Stanovení imunoglobulinů (IgM) u ryb

Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a imunologie živočichů

Stanovení imunoglobulinů (IgM) u ryb

Diplomová práce

Brno 2009

Autor: Bc. Libor Vojtek Vedoucí práce: RNDr. Pavel Hyršl, Ph.D.

Prohlašuji, že jsem diplomovou práci Stanovení imunoglobulinů (IgM) u ryb vypracoval samostatně, pouze s použitím uvedené literatury. V Brně dne: ......................... Podpis: …………………….

Rád bych poděkoval svému školiteli a vedoucímu mé diplomové práce RNDr. Pavlu Hyršlovi, Ph.D. za jeho odborné rady, cenné náměty, pomoc při řešení problémů a velice vstřícné a ochotné jednání. Poděkovat bych chtěl také konzultantovi mé diplomové práce Mgr. Karlu Vostalovi za jeho trpělivost a všestrannou pomoc při řešení vzniklých problémů a navrhování nových metod. Dále bych rád poděkoval RNDr. Jaroslavu Filípkovi, CSc. z kliniky chorob přežvýkavců VFU za cenné rady a připomínky při zavádění metody srážení síranem zinečnatým a MVDr. Dagmar Pokorové z Výzkumného ústavu veterinárního lékařství za poskytnutou metodiku a protilátky pro purifikaci kapřích IgM. V neposlední řadě bych rád poděkoval Bc. Pavlu Dobešovi za příkladnou výpomoc při rutinním zpracovávání velkého množství vzorků. Můj velký dík patří také mé rodině a přátelům za jejich podporu, trpělivost a pochopení poskytované po dobu mého studia. Tato práce byla podpořena granty GAČR 524/07/0188 a 524/09/P620.

Obsah Abstrakt (česká verze) ............................................................................................................ 7 Abstract (english version) ...................................................................................................... 8 Seznam zkratek ...................................................................................................................... 9 Úvodem ............................................................................................................................... 10 I. Teoretická část ................................................................................................................ 12 1. Imunoglobuliny ........................................................................................................ 13 1.1 Struktura imunoglobulinů ................................................................................... 13 1.2 Třídy imunoglobulinů ......................................................................................... 15 1.3 Imunoglobuliny v evoluci ................................................................................... 15 2. Imunoglobuliny ryb .................................................................................................. 16 3. Metody pro stanovení rybích IgM ............................................................................. 18 3.1 EIA – enzymatická imunoanalýza ....................................................................... 19 3.1.1 Homogenní EIA ........................................................................................... 19 3.1.2 Heterogenní EIA .......................................................................................... 20 3.2 Imunoturbidimetrie ............................................................................................. 23 3.3 Metoda srážení síranem zinečnatým.................................................................... 24 3.4 Elektroforéza SDS-PAGGE ................................................................................ 25 II. Cíl práce ........................................................................................................................ 29 III. Biologický materiál ...................................................................................................... 31 IV. Metody a jejich optimalizace ....................................................................................... 34 4. ELISA ...................................................................................................................... 35 4.1 Použitý materiál .................................................................................................. 35 4.2 Roztoky a pufry .................................................................................................. 36 4.3 Přístroje .............................................................................................................. 37 4.4 Postup................................................................................................................. 38

4.4.1 Dialýza ........................................................................................................ 38 4.4.2 Navázání protilátek na mikrotitrační destičku ............................................... 39 4.4.3 Vlastní ELISA test ....................................................................................... 40 4.4.4 Optimalizace ................................................................................................ 41 4.5 Získaná data ....................................................................................................... 42 4.6 Problémy a teoretická řešení ............................................................................... 42 5. Imunoturbidimetrie ................................................................................................... 43 5.1 Použitý materiál .................................................................................................. 44 5.2 Roztoky a pufry .................................................................................................. 44 5.3 Přístroje .............................................................................................................. 44 5.4 Postup................................................................................................................. 45 5.5 Získaná data a optimalizace ................................................................................ 45 5.6 Problémy a teoretická řešení ............................................................................... 47 6. ZST (srážení síranem zinečnatým) ............................................................................ 47 6.1 Použitý materiál .................................................................................................. 47 6.2 Roztoky a pufry .................................................................................................. 48 6.3 Přístroje .............................................................................................................. 48 6.4 Postup................................................................................................................. 48 6.5 Získaná data a optimalizace ................................................................................ 49 6.6 Problémy a teoretická řešení ............................................................................... 49 7. Elektroforéza (SDS-PAGGE) ................................................................................... 50 7.1 Ředění vzorků .................................................................................................... 50 7.2 Získaná data ....................................................................................................... 51 V. Výsledky ........................................................................................................................ 53 8. Výsledky získané metodou ZST ............................................................................... 54 8.1 Srovnání - kapr obecný (Cyprinus carpio) .......................................................... 59 8.2 Srovnání - lín obecný (Tinca tinca) ..................................................................... 62

8.3 Srovnání karas - stříbřitý (Carassius auratus) ..................................................... 64 8.4 Mezidruhové srovnání ........................................................................................ 65 VI. Diskuze ......................................................................................................................... 68 VII. Závěr ........................................................................................................................... 73 VIII. Použitá literatura ...................................................................................................... 76 Přílohy a prezentace výsledků .............................................................................................. 83

Abstrakt (česká verze) Imunitní systém ryb je stejně jako imunitní systém obratlovců složen ze specifických a nespecifických složek buněčné a humorální imunity. Hlavní součástí specifické humorální imunity jsou protilátky - imunoglobuliny (Ig). Ig se specificky váží na antigen a zpřístupňují jej ostatním složkám imunitního systému. U ryb byl na rozdíl od vyšších obratlovců popsán pouze IgM, který se většinou nachází ve formě tetrameru. Pro stanovení rybího IgM je využíváno mnoha metod, v této práci byly dopodrobna popsány následující čtyři: sendvičová ELISA pro stanovení protilátek, imunoturbidimetrie, srážení síranem zinečnatým a elektroforéza. Prakticky byly vyzkoušeny všechny 4 jmenované metody, z čehož nejlépe fungovalo srážení síranem zinečnatým – ZST. Všechny vzorky tedy byly na závěr vyhodnoceny metodou srážení síranem zinečnatým. Srážení síranem zinečnatým (ZnSO4 . 7H2O) je jednoduchá, levná a časově nenáročná metoda, která využívá fyzikálně – chemických vlastností ZnSO4 . 7H2O. Metoda je běžná ve veterinární praxi, pro zpracování rybích vzorků byla dle dostupných informací použita poprvé. ZnSO4 . 7H2O odebírá selektivně imunoglobulinům v roztoku vodu a ty poté z roztoku vypadávají – vzniká sraženina. Metoda je doplněna stanovením bílkovin, kdy se výsledná koncentrace IgM rovná rozdílu mezi bílkovinami obsaženými v celém vzorku a v supernatantu po vysrážení IgM. Pro experimenty byla použita plasma kapra obecného (Cyprinus carpio) odebíraná v různých ročních obdobích, lína obecného (Tinca tinca) s různými ploidiemi a karase stříbřitého (Carassius auratus) s různými ploidiemi, včetně jeho kříženců. U kapra obecného byla zjištěna statisticky významná sezónní dynamika hladiny IgM s nejvyššími průměrnými hodnotami v červnu 20,15 g/l a nejnižšími v srpnu 12,42 g/l. Rovněž byly u kapra obecného zaznamenány statisticky významné rozdíly mezi pohlavími, s vyššími průměrnými hodnotami IgM u samic, kdežto u lína obecného rozdíly mezi pohlavími nalezeny nebyly. Diploidní (2n), triploidní (3n) a gynogenní (G) skupiny lína se statisticky významně liší, G ryby mají průměrně vyšší hladinu IgM než 2n a 3n. 2n a 3n karasi se statisticky neliší, i když průměrná hladina IgM 2n je nižší než 3n a kříženců.

7

Abstract (english version) The fish immune system as well as the immune system of other vertebrates consists of cellular or humoral specific and nonspecific factors. Main components of the specific humoral immunity are antibodies – immunoglobulins (Ig). Ig specifically bind the antigen and make it available for other components of the immune system. In contrast to the higher vertebrates, only tetrameric IgM, has been found in fish. There are many methods for IgM determination in fish. In this thesis, four of them was used and compared: sandwich ELISA for the antibodies, immunoturbidimetry, zinc sulphate precipitation and electrophoresis. From these four methods, zinc sulphate precipitation was shown to be the most efficient. Therefore were all 284 samples at the end determined by ZST. Zinc sulfate (ZnSO4 . 7H2O) precipitation is simple, cheap, fast method, based on physico-chemical properties of ZnSO4 . 7H2O. This method is basically used in mammals veterinary medicine, this is the first use for fish samples. Zinc sulfate specifically dehydrates proteins, which come out from the solution – rising precipitate. Proteins determination is also included in the method - the final IgM concentration rate, is than expressed by difference, between protein concentration in the whole sample and the protein concentration in the supernatant after precipitation. Common carp (Cyprinus carpio) blood plasma samples were collected in several year seasons. In following experiments samples obtained from different ploidity common tench (Tinca tinca) and goldfish (Carassius auratus) were used. Statistically significant differences in seasonal dynamics of blood IgM concentration in common carp were observed. Highest average values were determined in June (20,15 g/l) and lowest in August (12,42 g/l). Also in carp gender comparison the statistical significant differences were observed. Average values in females were a little bit higher than in males. There were no statistically significant differences between males and females in common tench. Diploid (2n), triploid (3n) and gynogenetics (G) forms of common tenches have no statistically significant differences, but G fish has higher average values of IgM than 2n and 3n fish. 2n and 3n goldfish have no statistically significant differences, but 2n fish have lower average values of IgM than 3n and crossbreeds.

8

Seznam zkratek 2n

- diploidní jedinci

3n

- triploidní jedinci

Ab

- protilátka (antibody)

Ag

- antigen

Bis

- N’,N’-methylenbisakrylamid

BSA

- bovinní sérový albumin

EIA

- enzyme immunoassay

ELISA

- enzyme-linked immunosorbent assay

EMIT

- enzyme multiplied immunoassay technique

FIA

- fluorescent immunoassay

G

- gynogenní jedinci

H

- hapten

Ig

- imunoglobulin

Mab

- monoklonální protilátka

MW

- molekulová hmotnost (molecular weight)

PBS

- fosfátový pufr

RIA

- radioimmunoassay

SDS-PAGE

- sodium dodecylsulfat polyakrylamid gel electrophoresis

SDS-PAGGE - sodium dodecylsulfat polyakrylamid gradient gel electrophoresis ZST

- zinc sulphate turbidity test

9

Úvodem Česká republika má jako vnitrozemský stát nebývale výjimečnou historickou tradici v chovu sladkovodních ryb a rybářství. V Evropském měřítku jsme získali věhlas hlavně díky našemu výbornému rybníkářství, a to především díky chovu kapra. Historie českého rybníkářství sahá až do 11. století. Největšího rozmachu dosáhlo hlavně v 15. a 16. století, kdy v tomto oboru působil např. Jakub Krčín z Jelčan a Sedlčan, nebo Vilém a Jan z Pernštejna a Helfenštejna. V této době byl nejvíce populární chov kapra (kapr je naším původním rybím druhem), který je až dodnes nejvíce a nejdéle chovanou sladkovodní rybou světa. Hned po kaprovi se dostává do českých rybníků také lín obecný. V současné době mají rybníky v České republice rozlohu 52 000 ha a vyprodukují ročně asi 20 000 tun tržních ryb. I při tak vysoké produkci sní každý občan České republiky ročně průměrně pouze 5 kg ryb (sladkovodních i mořských), kdežto evropský průměr je asi 14 kg. Přitom jsou ryby velice chutným zdrojem mnoha zdraví prospěšných látek, jako jsou např. v poslední době stále sledovanější vysoce nenasycené ω 3 mastné kyseliny (URL8). První zmínky zkoumání rybí imunologie se objevují již v roce 1840, i když dané výzkumy se zabývaly spíše srovnávací anatomií, embryologií, fyziologií, taxonomií a rybími nemocemi, takže se ještě nedá mluvit o imunologii jako takové. Teprve kolem roku 1940 se setkáváme s imunologií ryb v pravém slova smyslu a rovněž se rozvíjí obor vakcinace ryb. V roce 1938 Snieszko a kol. zjistili, že při injikaci mrtvých bakterií do těla kaprů si ryby vytvořili obranou imunitu proti daným bakteriím. V Německu ve stejné době Schäperclaus ve své laboratoři přišel na stejný fakt a začal produkovat komerčně dostupné rybí vakcíny, což přispělo k úspěšnému množení kaprů v centrální Evropě. Na konci čtyřicátých a během padesátých let pak byla vakcinace ryb spíše na ústupu, jelikož se rybí nemoci dali léčit nově vyvinutými antibiotiky. Ovšem v krátké době se některé patogeny staly resistentní vůči antibiotikům a navíc díky možnému zdravotnímu riziku pro člověka při používání různých chemických léků ve vodním prostředí, se opět přistoupilo na konci šedesátých let k vakcinaci, která přetrvává až dodnes (Van Muiswinkel, 2008). Díky těmto poznatkům dnes o imunologii ryb máme velké množství potřebných informací. Rybí imunologie je však postavena hlavně na výzkumu mořských ryb, jelikož jejich světová spotřeba je mnohem vyšší než spotřeba ryb sladkovodních. Imunologických výzkumů zkoumajících kapra obecného (Cyprinus carpio) není mnoho, zato v případě lína obecného (Tinca tinca) a karase stříbřitého (Carassius auratus) můžeme mluvit pouze o jedné 10

či dvou publikacích.

Také proto jsme se rozhodli zkoumat tyto 3 zástupce našich

sladkovodních ryb, abychom poodkryli další otazníky ve fungování jejich imunitního systému. Data získaná v této diplomové práci by tedy mohla přispět k dalšímu rozvoji ať už samotné vakcinace ryb nebo pouhému zjištění, jak se ryby různým nemocem brání, či ve kterém období jsou náchylnější nebo naopak méně náchylné k onemocněním a proč. Tyto výsledky by tak mohly být důležité pro zlepšení kvality a kontroly chovu.

11

I. Teoretická část

12

1. Imunoglobuliny Imunitní systém většiny obratlovců lze rozdělit do dvou navzájem kombinovatelných částí, z nichž každá má dvě komponenty. Jsou to: specifická a nespecifická imunita x buněčná a humorální imunita. Všechny čtyři komponenty jsou na sobě závislé a tudíž nemohou jedna bez druhé správně fungovat. Složky účastnící se jednotlivých typů imunitních odpovědí jsou uvedeny níže (tab. 1) (Hořejší a Bartůňková, 2001).

Specifická imunita Nespecifická imunita

Buněčná imunita T lymfocyty fagocyty, NK buňky

Humorální imunita protilátky komplement, sérové proteiny

Tab. 1: Složky imunity Tato práce se věnuje hlavně specifické humorální imunitě, které se účastní protilátky (imunoglobuliny). Imunoglobuliny jsou jednou ze základních výkonných funkcí imunitního systému. Jsou produkovány buňkami B lymfocytární linie, především jejich terminálním stádiem vývoje - plazmatickými buňkami (Toman a kol., 2000). Imunoglobuliny se účastní mnoha imunitních reakcí, jako např. rozpoznání antigenu, precipitace, aglutinace, fagocytóza, cytotoxicita, transport přes mukózu a placentu, aktivace komplementu a uvolňování zánětlivých mediátorů (Mix a kol., 2006).

1.1 Struktura imunoglobulinů Imunoglobuliny jsou glykoproteiny. Jejich základem jsou dva těžké (H) řetězce, které jsou spojeny disulfidickými můstky v místě pantové oblasti. Ke každému H řetězci je rovněž disulfidickým můstkem připojen jeden lehký (L) řetězec. Těžké řetězce jsou tvořeny 4 -5 imunoglobulinovými doménami z polypeptidového řetězce (obr. 2). L řetězce mají pouze 2 imunoglobulinové domény. Domény na N- konci obou řetězců jsou variabilní (VH a VL) tzn., že jejich individuální struktura se liší podle toho, kterými klony B lymfocytů byly dané imunoglobuliny produkovány. Ostatní domény jsou konstantní (CH a CL) u jednotlivých typů imunoglobulinů (viz kapitola Třídy imunoglobulinů). Variabilní domény řetězců tvoří vazebné místo pro antigen. Ta část H řetězce, která není spojena s L řetězcem, se nazývá Fc 13

fragment, a je to oblast, kterou se imunoglobuliny váží na Fc receptory fagocytů a komplementový protein C1. Naopak část, která je vázána s L řetězcem a váže antigen, se nazývá Fab fragment. Některé třídy imunoglobulinů (IgM a IgA) se skládají z několika (2-6ti) základních jednotek a jsou spojeny J řetězcem, který má zcela specifickou strukturu. Struktura imunoglobulinu je znázorněna na obr. 1 (Hořejší a Bartůňková, 2001).

Obr.1: Struktura imunoglobulinu (URL1)

Obr. 2: Polypeptidové řetězce imunoglobulinových domén s navázaným antigenem (URL2)

14

1.2 Třídy imunoglobulinů Jednotlivé třídy savčích imunoglobulinů se odlišují na základě rozdílných hodnot molekulárních hmotností, elektrických nábojů, velikostí cukerné složky a složení aminokyselin v daných glykoproteinech. Jednotlivé třídy imunoglobulinů se liší hlavně v konstantních doménách lehkých a těžkých řetězců. Existují dva typy lehkých řetězců (κ a λ) a pět typů těžkých řetězců (μ, δ, γ, α a ε). Díky těmto rozdílům rozlišujeme 5 tříd imunoglobulinů IgM, IgD, IgG (IgG1-IgG4), IgA (IgA1 a IgA2) a IgE. Pouze dvě třídy imunoglobulinů se nevyskytují ve formě monomerů, a to IgA (dimer obr. 3a) a IgM (pentamer obr. 3b). U těchto dvou skupin jsou jednotlivé monomery spojeny rovněž disulfidickými můstky a J řetězcem, IgA je spojeno ještě sekreční komponentou, což je zbytek transportního Fc receptoru (Mix a kol., 2006).

3a

3b

Obr. 3a dimerní molekula IgA (URL3), 3b pentamerní molekula IgM (URL4)

1.3 Imunoglobuliny v evoluci Molekuly podobné imunoglobulinům se v evolučním žebříčku poprvé objevují u mihulí, ale jejich struktura odpovídá spíše komplementovým složkám. Pravé imunoglobuliny se tedy objevují až u chrupavčitých ryb a všech vyspělejších obratlovců. Chrupavčité i kostnaté ryby mají pouze jednu skupinu protilátek, a to IgM. Toto tvrzení však v poslední době bývá doplňováno novými objevy dalších možných tříd (viz kapitola Imunoglobuliny ryb) (Turner, 1994). U obojživelníků byly zjištěny skupiny IgM, IgX a IgY, přičemž IgX je 15

obdobou lidského IgA a IgY lidského IgG. Nově objeveny byly také IgF a IgD, které jsou zatím zkoumány na žábě Xenopus tropicalis (Zhao a kol., 2006; Turner, 1994). Plazi mají tři třídy imunoglobulinů IgM, IgY (obdoba lidského IgA) a IgG (Turner, 1994). Ptačími imunoglobuliny jsou IgM, IgG, a IgA, obdoby savčích IgE a IgD zatím nebyly objeveny, avšak některé jejich funkce zastupuje ptačí IgG (Ratcliffe, 2005; Turner, 1994). Savci včetně člověka mají již zmiňovaných 5 tříd imunoglobulinů. IgM nejvíce slouží k aktivaci klasické dráhy komplementu. IgG je nejhojnější sérový imunoglobulin a zajišťuje opět aktivaci komplementu a vazbu na fagocyty. Molekula IgA se nachází buď jako slizniční nebo sérová forma a její hlavní úlohou je ochrana sliznic před mikroorganismy. IgE je hlavní složkou v obraně proti mnohobuněčným parazitům a způsobuje mnoho alergických reakcí. Poslední třídou je IgD, který funguje hlavně jako receptor pro antigen (Hořejší a Bartůňková, 2001).

2. Imunoglobuliny ryb Humorální mechanismy specifické imunity sladkovodních ryb byly prostudovány velice důkladně, hlavně díky jejich nenahraditelnému zapojení při likvidaci chorob. Ovšem i přes toto důkladné bádání bylo bohužel prozkoumáno pouze několik málo druhů, mezi které patří ryby lososovité, kaprovité a sumci. Tyto druhy byly zkoumány hlavně díky jejich podstatné roli v potravinářském průmyslu. Mořských druhů ryb bylo prozkoumáno větší množství, a to proto, že jejich spotřeba i samotná druhová rozmanitost, je mnohem vyšší. I přes nedostatek modelových organismů pro výzkum imunologie sladkovodních ryb, byly nalezeny značné podobnosti savčího a rybího imunitního systému. Analogické jsou hlavně: základní stavba imunoglobulinů, jejich produkce B lymfocyty a jejich role při neutralizaci, opsonizaci a aktivaci komplementového systému (Stephen a kol., 1996). Až donedávna byla za jediný imunoglobulin kostnatých ryb považována třída IgM. Toto tvrzení stále převládá, i když dle některých nových výzkumů, mají některé druhy ryb více tříd imunoglobulinů. Není tedy vyloučeno, že existují třídy imunoglobulinů IgD (Saha a kol., 2004 a), IgZ a IgT, a to u zebřičky (Danio rerio), pstruha duhového (Oncorhynchus mykiss), čtverzubce fugu (Takifugu). Tyto nové třídy byly popsány také na chiméře kapra obecného (Cyprinus carpio) a zebřičky (Danio rerio) (Savan a kol., 2005; Randelli a kol, 2008).

16

IgM kostnatých ryb se na rozdíl od savčího IgM většinou vykytuje jako tetramer (obr. 4). U některých ryb však byly nalezeny IgM v séru také jako monomery či dimery (Lobb a Clem, 2008). Monomery mají stejnou strukturu jako imunoglobuliny savců (viz kapitola struktura imunoglobulinů). Na rozdíl od savčích IgM ale nejsou dohromady vázány J řetězcem, nýbrž se váží pouze kovalentně pomocí disulfidických můstků (Kaattari a Piganelli, 1996). Velikost molekuly IgM se lehce liší podle druhu ryby, ale většinou se pohybuje v hodnotách od 700kDa (treska skvrnitá) do 900kDa (Tilapiini) (Magnadottir, 1998; Suresh Babu a kol., 2008). Pokud je molekula IgM rozštěpena na jednotlivé řetězce (H a L), pak se jejich molekulární hmotnosti pohybují u těžkého řetězce mezi 72 – 88 kDa a u lehkého řetězce mezi 22 – 27 kDa (Marchalonis, 1971; Bag a kol., 2009). Tato práce se zabývá hlavně kaprem obecným (Cyprinus carpio), línem obecným (Tinca tinca) a karasem stříbřitým (Carassius auratus). Jejich molekulární hmotnosti jsou následující (tab.2) (Marchalonis, 1971):

Kapr obecný (Cyprinus carpio) Lín obecný (Tinca tinca) Karas stříbřitý (Carassius auratus)

H řetězec (kDa) 76,0 +/- 1 67,5 +/- 2 79,0 +/- 1

L řetězec (kDa) 26,0 +/- 2 26,5 +/- 2,5 26,5 +/- 2

Tab. 2: Přehled molekulárních hmotností jednotlivých řetězců IgM u zkoumaných ryb (Vilain a kol., 1984)

Obr. 4: Rybí IgM-tetramer (URL 5) Hladina rybích IgM v krvi je závislá na mnoha faktorech, jako je okolní teplota, roční období, pohlaví, období tření, parazitace apod. Jedním z nejdůležitějších faktorů je ovšem teplota vody, která se mění s ročním obdobím. Obecně platí, že čím vyšší teplota okolní vody (tedy i dané ryby), tím větší je produkce imunoglobulinů. Toto samozřejmě platí pouze do 17

určité hranice (příliš nízká či vysoká teplota), kdy dochází v bílkovinách k nezvratným změnám a jejich poškození. Rovněž platí pro různé druhy ryb různé hodnoty hladiny IgM. Tzn., že variabilita v množství IgM v krvi je dosti vysoká, a to nejen při mezidruhovém srovnání, ale také v rámci jednoho druhu. Např. kaprovitá ryba Labeo rohita má i po imunizaci velice nízkou hladinu IgM (0,33 mg/ml) (Bag a kol., 2009). U kapra obecného (Cyprinus carpio) byla popsána následující roční dynamika hladin IgM (graf 1) (Saha a kol., 2002):

Graf 1: Sezónní dynamika hladiny IgM u samců (vlevo) a samic (vpravo) kapra obecného (Cyprinus carpio) – vyšší hodnoty v dubnu jsou zapříčiněny vyšší produkcí protilátek v období tření (Saha a kol., 2002)

3. Metody pro stanovení rybích IgM Existuje velké množství metod používaných pro stanovení celkové hladiny imunoglobulinů v krvi nebo pro jejich získání a následnou purifikaci. Takovými metodami jsou např. enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), fluorescent immunoassay (FIA), turbidimetrie, srážení síranem amonným a síranem zinečnatým, elektroforéza, western blotting, průtoková cytometrie aj. V této práci budou dále zmíněny hlavně ELISA (enzymelinked immunosorbent assay), metoda srážení síranem zinečnatým, elektroforéza a turbidimetrie. Většina těchto metod je založena na přirozených vlastnostech imunoglobulinů, jako jsou např. jejich ochota vázat se k umělým povrchům, dostupnost vázání různých druhů značek (fluorescenční, radioaktivní, enzymatické) na povrch imunoglobulinů, nebo samotný fakt, že imunoglobuliny jsou proteiny s danou molekulární hmotností, díky níž mohou být 18

rozeznány a separovány od ostatních sérových proteinů. Jednotlivé metody mají svá pozitiva i negativa, přičemž nejvíce posuzovány jsou hlavně tyto aspekty:  Citlivost dané metody  Časová náročnost metody  Náročnost použitých technik při provádění metody  Zdravotní riziko způsobené používanými materiály  Finanční náročnost metody  Potřebné množství vzorku

3.1 EIA – enzymatická imunoanalýza Metoda EIA je jednou z nejvýznamnějších metod používaných při kvantitativní či kvalitativní detekci protilátek (Ab) nebo antigenů (Ag). EIA metody jsou založeny na možnosti značení protilátek či antigenů enzymy, vytvářejícími při pro ně specifické chemické reakci barevný produkt, jehož vytvořením se mění absorbance daného vzorku, která může být spektrofotometricky změřena. Hlavními výhodami EIA metod jsou: vysoká specifičnost (možnost detekce haptenů), využití veškerého potenciálu a sensitivity monoklonálních protilátek, při provádění testu jsou použity jednoduché techniky, pracují s malým množstvím vzorku a nepředstavují zvýšené zdravotní riziko pro pracovníky laboratoří (Arkoosh a Kaattari, 1993). Nevýhodami EIA metod jsou hlavně zvýšená časová a finanční náročnost testů. Jsou rozlišovány dva základní typy EIA metod, a to homogenní a heterogenní (tyto jednotlivé typy mohou být různě modifikovány).

3.1.1 Homogenní EIA Při homogenní EIA metodě se mění (zvyšuje či snižuje) katalytická aktivita enzymu po vzniku konjugátu s protilátkou. To znamená, že enzymová aktivita volného konjugátu (např. antigen s navázaným enzymem) je rozdílná od enzymové aktivity konjugátu vázaného s protilátkou. Tato změna enzymové aktivity je přímo úměrná množství vzniklého imunokomplexu. Díky tomuto faktu není potřeba při homogenní EIA metodě oddělovat volný konjugát od vázaného v imunokomplexech. Homogenní EIA metody se označují jako EMIT 19

(enzyme multiplied immunoassay technique). Homogenní EIA metody se používají hlavně ke kvantitativním

stanovením

nízkomolekulárních

látek

(haptenů

-

H).

Takovými

nízkomolekulárními látkami mohou být např. antibiotika, omamné látky, hypnotika, sedativa, cytostatika, hormony (tyroxin, trijódtyronin, kortizol…). Nejčastěji používanými enzymy jsou např. lysozym, malát-dehydrogenáza a glukózo-6-fosfát-dehydrogenáza. Výhodou homogenních EIA metod je hlavně jejich rychlost a jednoduchost (netřeba promývat), nevýhodou pak nižší citlivost a složitá příprava reagencií (Ferenčík, 1989; Mančal, 1987).

3.1.2 Heterogenní EIA Při heterogenních EIA metodách je na rozdíl od homogenních potřeba oddělit volné a vázané konjugáty, jelikož při těchto metodách se enzymová aktivita po navázání konjugátu do imunokomplexu nemění. Pro oddělení volného a vázaného konjugátu, se nejčastěji jeden z reaktantů (Ab, Ag, H) imobilizuje (naváže se na pevný nosič – nerozpustný polymer, nejčastěji vnitřní stěna zkumavky nebo jamky mikrotitrační destičky) a druhý zůstává mobilní (další způsoby oddělení jsou precipitace nebo použití druhé protilátky). Pokud je jedna složka takto navázána, tak oddělení volné složky probíhá jednoduše promytím. Jde o princip imunoadsorbentu, proto se těmto heterogenním metodám říká ELISA (obr. 5). Enzymy, které se při těchto metodách používají, by měly mít malou relativní molekulovou hmotnost, vysokou stabilitu a enzymovou aktivitu a musí se dát snadno kovalentně navázat na protilátky nebo antigeny. Takové enzymy jsou například křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza nebo β-D-galaktozidáza. Heterogenní EIA metody mohou být kompetitivní nebo nekompetitivní. Nejčastěji se používají metody kompetitivní, jejichž nejběžnější formou je přímá a nepřímá ELISA (Ferenčík, 1989; Mančal, 1987). Základní princip přímé ELISA metody spočívá v tom, že se nevyužívá sekundárních protilátek, ale značené jsou již ty primární. Například pokud stanovujeme antigeny, tak si na pevnou fázi navážeme protilátky specifické proti námi stanovovaným antigenům, přidáme náš vzorek, promyjeme, přidáme další specifické protilátky, které jsou tentokrát značené enzymem, a opět promyjeme. Po přidání vhodného substrátu pozorujeme barevnou reakci. Při stanovování protilátek je celá procedura obdobná, jen na desku vážeme antigen. Při nepřímé ELISA metodě není enzym navázán přímo na první specifické protilátce (primární), která se váže na námi hledaný antigen, ale je navázán až na sekundární protilátce, která se specificky 20

váže na protilátku primární. Existuje velké množství ELISA metod, které jsou založeny na různých principech vázání protilátek a antigenů, přičemž většina těchto metod využívá výše popsané základní principy. Zvláštním případem jsou kompetitivní ELISA metody, kde o vazebná místa soupeří značený a neznačený reaktant (Ab nebo Ag). Tento typ ELISA metody se využívá hlavně pro stanovování hormonů (Stanček, 1993; Crowther, 1995). Nejobvyklejšími ELISA metodami jsou:  Kompetitivní ELISA pro antigeny a hapteny

 Sendvičová ELISA pro antigeny

 Nepřímá ELISA pro antigeny

21

 Sendvičová ELISA pro protilátky

 ELISA pro IgM protilátky

Obr. 5: Nejobvyklejší ELISA metody, Ag-antigen, E-enzym, S-substrát, P-produkt (upraveno podle Ferenčík, 1989) Hlavními výhodami ELISA metody jsou tedy její vysoká citlivost a specifičnost, jednoduchost provedení, aplikování malého objemu vzorku a minimální zdravotní riziko. Nevýhodami je naopak lehce zvýšená časová náročnost, potřeba dlouhodobé optimalizace, nemožnost či obtížné stanovování jednotlivých faktorů u různých živočišných druhů a hlavně finanční dostupnost. Rovněž pro některé druhy živočichů nejsou vůbec komerčně dostupné protilátky.

22

ELISA metody jsou nejvíce využívány díky těmto faktorům (Crowther, 1995): 1, Protilátky či antigeny samy pasivně adsorbují k pevným podkladům, nejčastěji k vnitřním stěnám jamek 96-jamkových mikrotitračních destiček, které jsou komerčně dostupné, a jejich design umožňuje používání malých objemů při velkém počtu vzorků. 2, Díky tomu, že jeden reaktant je pevně vázán, separace druhého je prováděna jednoduchým promytím destičky. 3, Výsledkem ELISA metody je barevná reakce viditelná pouhým okem, kterou je možno jednoduše a rychle měřit na multikanálovém spektrofotometru (ELISA readeru).

3.2 Imunoturbidimetrie Turbidimetrie je optická metoda založena na principu imunoprecipitace. Při smíchání antigenů s pro ně specifickými protilátkami dochází k vytvoření imunokomplexů (sraženině – precipitátu). Daný roztok se tedy zakalí. Takto zakaleným roztokem se nechá procházet světlo, jehož část je vzniklými precipitáty rozptýlena pod určitým úhlem a světlo, které prochází v původním směru, je tedy zeslabeno. Díky tomuto faktu můžeme měřit jak světlo rozptýlené pod daným úhlem, pak mluvíme o nefelometrické metodě (řecky nefelé = mrak), nebo můžeme měřit světlo procházející v původním směru a provádět tak měření turbidimetrické (latinsky turba = nepořádek, tlačenice, dav) (obr. 6). Při turbidimetrickém stanovování je možno využít k měření běžné spektrofotometry (ELISA readery). Množství zakalení (tedy i množství námi hledaného antigenu/protilátky) je přímo úměrné změřené absorbanci (pouze v oblasti nadbytku protilátek viz precipitační křivka) (graf 2). Protilátky používané při turbidimetrii proto musejí být monoklonální a musí být vhodně naředěné. Fotometrická citlivost je naopak nepřímo úměrná vlnové délce, proto se nejčastěji pro turbidimetrické měření používá vlnová délka 340 nm. Výhody turbidimetrického stanovení spočívají ve velké specificitě metody (možnost měřit vzorky o koncentraci 5 – 20 mg/l), jednoduchém a rychlém provedení, možnosti vyhodnotit velké množství vzorků za krátkou dobu, potřebě malého množství vzorku (10 µl) a v přiměřených finančních nárocích. Hlavní nevýhoda této metody je potřeba před každým měřením zjistit optimální ředění Ab/Ag podle precipitační křivky (Ferenčík, 1989; Štern, 2006; Vejražka, 2008). 23

Obr. 6: Turbidimetrie a nefelometrie (Vejražka, 2008)

Graf 2: Precipitační křivka (URL6)

3.3 Metoda srážení síranem zinečnatým Metoda srážení síranem zinečnatým (zinc sulfate turbidity test – ZST) je jednoduchou, přesnou, levnou a rychlou metodou pro stanovení celkové hladiny imunoglobulinů v krvi (tab. 3). Metoda byla poprvé popsána v roce 1970 McEwanem a kol. a je dodnes využívána ve veterinární praxi ke stanovování celkové hladiny protilátek v krvi přijatých od matky (in utero nebo z kolostra) u telat, jehňat, hříbat a jiných hospodářských zvířat. Mateřské protilátky hrají velkou roli při obraně mláděte před neonatálními nemocemi do doby, než je jejich vlastní imunitní systém schopen čelit různým patogenům (Ahmad a kol., 2000; Faldyna a kol., 2003; Richter a Lohmann, 2005). Metoda je založena na principu, kdy síran zinečnatý (ZnSO4 . 24

7H2O) specificky odebírá vodu proteinům obsaženým ve vzorku. Tyto proteiny poté vypadávají z roztoku a vzniká sraženina (precipitát) (Polson a kol., 2003). Podle různých koncentrací síranu zinečnatého lze určit, které bílkoviny budou vysráženy. Pro imunoglobuliny se používá 0,7 mM ZnSO4 . 7H2O (McEwan, 1970). Pro vyšetření celkové hladiny imunoglobulinů se více hodí sérum než plasma, jelikož v plasmě může být falešně měřen i fibrinogen (Richter a Lohmann, 2005).

Senzitivita Specificita Přesnost (%) (%) (%)

Objem vzorku (ml)

Cena Cena Čas kitu nebo jednoho (hodiny) reagencie testu (USD) (USD)

ZST

89

78

82

0,5

1

119,95

0,01

ELISA

100

97

97

< 0,001

4

674,54

0,67

Tab. 3: Srovnání metod ELISA a ZST (upraveno podle Lee a kol., 2008; Richter a Lohmann, 2005)

3.4 Elektroforéza SDS-PAGGE Elektroforéza je nejběžnější metodou používanou pro separaci proteinů. Existuje velké množství různých druhů používaných elektroforéz, např. zónová elektroforéza v agarózovém gelu, diskontinuální elektroforéza v akrylamidovém gelu (PAGE), SDS polyakrylamidová elektroforéza (SDS-PAGE), dvoudimenzionální gelová polyakrylová elektroforéza (2-D PAGE), některé z těchto metod jsou schopny rozlišit stovky až tisíce proteinů. Nejrozšířenější elektroforézou pro stanovení proteinů v tekutém médiu (všechny tělesné tekutiny) je SDS PAGE (sodium dodecylsulfat polyakrylamid gel electrophoresis)(Hyršl, 2004). Základním principem denaturační polyakrylamidové gelové elektroforézy (SDSPAGE) je separace proteinů podle jejich molekulové hmotnosti (MW). Detergent SDS (sodium dodecylsulfát, obr. 7) totiž denaturuje jednotlivé proteiny, případné disulfidické můstky jsou pak následně přerušeny redukčním činidlem (β-merkaptoetanolem), takže komplexy tvořené více proteiny se rozpadnou na jednotlivé části a denaturace se dokončí krátkým převařením. Malé záporně nabité molekuly SDS poté obklopí molekulu proteinu a díky jejich elektrostatickému odpuzování ji natáhnou. Počet navázaných molekul SDS je přímo úměrný molekulové hmotnosti jednotlivých proteinů, tzn. že každá molekula proteinu 25

obaleného SDS získává záporný náboj nehledě na její velikost (obr. 8). Díky tomuto faktu jsou proteiny děleny pouze podle jejich molekulové hmotnosti a ne podle elektrického náboje (efekt molekulárního síta) (Šmarda a kol., 2005).

Obr. 7: Struktura sodium dodecylsulfátu (URL7) Polyakrylamidové gely vznikají kopolymerací dvou monomerů, a to akrylamidu a N’,N’-methylenbisakrylamidu (bis). Akrylamid způsobuje paralelní řetězce gelu a bis jejich zesíťování, přičemž pevná matrice je vyplněna pufrem. Takto vzniklé gely mohou být buď homogenní či gradientové. Gradientové gely (mají v separačním gelu sestupný gradient bisu) se využívají při SDS-PAGGE (sodium dodecylsulfat polyakrylamid gradient gel electrophoresis) a mají tu výhodu, že zachytí větší rozpětí MW proteinů a také, že při fixaci a barvení drží svůj obdélníkový tvar, zatímco homogenní gely se stávají lichoběžníky a je poté znesnadněno přesné odečtení molekulární hmotnosti jednotlivých vzorků. Jak již bylo řečeno, proteiny se dělí pouze podle jejich molekulové hmotnosti, čehož je docíleno aplikací vzorků na řidším konci gelu a následným putováním ke koncentrovanějšímu konci gelu (díky zvyšujícímu se odporu gelu se jednotlivé proteiny zastavují podle jejich molekulové hmotnosti). Minimální množství proteinu obsaženého ve vzorku pro vytvoření bandu při barvení stříbrem (viz dále) je 2 ng a maximální množství by nemělo přesáhnout 20 – 40 µg (Hyršl, 2004). Pro identifikaci rozdělených proteinů je možno použít dvou druhů zvýraznění. Prvním je nespecifické barvení gelů (např. Coomassie brilliant blue či barvení stříbrem), druhým pak tzv. blotting (popřípadě imunoblotting). Při blottingu se do reakce vnášejí protilátky, které specificky reagují pouze s určitými, námi požadovanými proteiny, které jsou následně přenášeny na membránu a zviditelněny (Hyršl, 2004; Šmarda a kol, 2005). Hlavní výhodou elektroforézy je její vysoká specifičnost a citlivost, malý objem potřebného vzorku a reprodukovatelnost (jasné odečítání výsledků). Mezi nevýhody patří velká časová náročnost, složité pracovní postupy, zvýšené zdravotní riziko (akrylamid je

26

vysoce toxický a potenciálně karcinogenní) a také malé množství testovaných vzorků při jednom měření. Možnosti využití SDS-PAGE (Bollag a kol., 1996): 1. Analýza čistoty proteinu 2. Určování molekulové hmotnosti proteinu 3. Ověřování koncentrace proteinu 4. Detekce proteolýzy 5. První krok pro imunoblotting 6. Identifikace proteinu po imunoprecipitaci 7. Detekce změn proteinu 8. Separace a koncentrace proteinových antigenu pro produkci protilátek 9. Separace radioaktivně označených proteinů

27

Obr. 8: Využití SDS při denaturaci proteinů při SDS-PAGE (Šmarda a kol., 2005)

28

II. Cíl práce

29

Cílem této diplomové práce bylo:  Z literárních zdrojů zpracovat problematiku rybích imunoglobulinů a popsat metody, které se používají k jejich stanovení.  Optimalizování metod, které jsou využívány pro laboratorní stanovení hladiny imunoglobulinů v krvi. V této práci byly použity a optimalizovány následující 4 metody: ELISA, imunoturbidimetrie, ZST – metoda srážení síranem zinečnatým, SDS-PAGGE.  Srovnat měnící se hodnoty hladiny IgM v průběhu cirkanuálního (ročního) cyklu a porovnat produkci IgM mezi samci a samicemi u kapra obecného (Cyprinus carpio).  Vyhodnotit rozdíly v produkci IgM mezi různě ploidními jedinci (2n – diplodní, 3n triploidní, G – gynogenní) a rovněž srovnat rozdíly mezi pohlavími u lína obecného (Tinca tinca).  Sledovat rozdíly v celkové hladině IgM v krvi u různých ploidií (2n, 3n) a kříženců karase stříbřitého (Carassius auratus) s kaprem obecným (Cyprinus carpio) a karasem obecným (Carassius carassius).  Získanými výsledky přispět k celkovému poznání imunity vybraných druhů sladkovodních ryb v rámci spolupráce s oddělením Parazitologie, Ústavu botaniky a zoologie, PřF MU, Brno a Ústavem biologie obratlovců AV ČR, v.v.i., Brno (projekty GAČR 524/07/0188 a 524/09/P620).

30

III. Biologický materiál

31

Biologický materiál byl odebrán ze tří druhů našich sladkovodních ryb, a to z: kapra obecného (Cyprinus carpio, obr. 9a), lína obecného (Tinca tinca, obr. 9b), karase stříbřitého (Carassius auratus, obr. 9c) a kříženců karase stříbřitého (Carassius auratus) s karasem obecným (Carassius carassius) a karase stříbřitého (Carassius auratus) s kaprem obecným (Cyprinus carpio). Krev všech zmíněných ryb byla odebírána z kaudální vény metodou punkce ocasních cév (obr. 10, viz Svobodová a kol., 1986). Následně byla krev zpracována na plasmu/sérum a vzorky byly zamraženy při -20/-80 °C. Krevní plasma byla připravena heparinizací krve při výsledné koncentraci 50 U / 1 ml krve a následnou 10 minutovou centrifugací při 1500 x g. Část krve, která byla zpracovávána na sérum, byla přes noc uložena ve 4 °C a druhý den centrifugována rovněž 10 minut při 1500 x g.

a,

b,

c, Obr. 9a kapr obecný (Cyprinus carpio), 9b lín obecný (Tinca tinca), 9c karas stříbřitý Carassius auratus), (foto Lukáš Vetešník) Kapr obecný a lín obecný byli chováni v přírodních nádržích VÚRH JU (Výzkumný ústav rybářský a hydrobiologický, Jihočeská univerzita), karas stříbřitý a jeho kříženci byli 32

chováni v laboratorních akváriích Ústavu biologie obratlovců AV ČR v.v.i. Více než tříletí kapři (K3+) byli odebíráni pětkrát ročně (únor, duben, červen, srpen, listopad) a v každém odběru bylo odebráno 32 jedinců = 160 vzorků kapra obecného. Vzorky línů (L3+) byly odebírány v červnu, 38 diploidních jedinců, 34 triploidních jedinců a 21 gynogenních jedinců (majících pouze genom matky) = 92 vzorků lína obecného. Diploidních karasů stříbřitých (věk 2+) bylo odebráno 8 a triploidních 9. Dále bylo odebráno 8 jedinců křížence karase stříbřitého a kapra obecného a 7 jedinců křížence karase stříbřitého a karase obecného = 32 vzorků karase stříbřitého a jeho kříženců. Celkový počet tedy činil 284 vzorků plasmy/séra (viz kapitola V. Výsledky).

Obr. 10: Schéma odběru krve z kaudální vény ryby metodou punkce ocasních cév (Svobodová a kol., 1986)

33

IV. Metody a jejich optimalizace

34

4. ELISA Pro stanovení rybích IgM protilátek byla vybrána nejjednodušší a nejlevnější varianta metody ELISA, tedy lehce upravená sendvičová ELISA pro protilátky (viz teoretická část obr. 5). Na pevné fázi byla navázána monoklonální anti-IgM (izotyp IgG2b) rozeznávající H řetězec kapřího IgM. Po navázání této protilátky a promytí byl přidán vzorek (kapří sérum/plasma). Opět po inkubaci a promytí byly přidány značené (křenovou peroxidázou) monoklonální anti-IgM (izotyp IgG2b) reagující s těžkým řetězcem IgM kapra. Nakonec byl přidán substrát a byla pozorována barevná změna. Obě Mab (monoklonální protilátky) pro kapra obecného jsou komerčně dostupné a byly pořízeny u firmy Aquatic Diagnostics. Bohužel pro lína obecného, ani karase stříbřitého nejsou Mab komerčně dostupné, což znesnadňuje stanovení protilátek u těchto ryb metodou ELISA.

4.1 Použitý materiál  Protilátky F16 (imunoglobuliny (IgG2b) proti kapřím IgM), Aquatic Diagnostics Ltd., Skotsko, naředěný v 1 ml vazného pufru na koncentraci 200 µg/ml a zamražen v 50 a 100 µl aliquotech při -20 °C  Protilátky C16-HRP (imunoglobuliny (IgG2b) značené křenovou peroxidázou proti kapřím IgM), Aquatic Diagnostic Ltd., Skotsko, naředěný v 1 ml PBS rozpipetován po 20, 50 a 100 µl aliquotech a zamražen při -20 °C.  Síran amonný - (NH4)2SO4 (Lachema, Brno)  Kasein (Merck, Německo)  Peroxid vodíku 30 % - H2O2 (Lachema, Brno)  OPD (1,2 diaminobenzen . 2 HCl), pracovat v rukavicích, slabě karcinogenní (SigmaAldrich, Německo)  Kit pro stanovení bílkovin roztok A a B (Bio-Rad, USA)  Mikrotitrační destičky P (Gama Group, Trhové Sviny)  Automatické pipety, multikanálové pipety a další standardní laboratorní vybavení  Dialyzační membrána 20 kDa (Visking, Německo.)  Zkoumaná plasma/sérum 35

4.2 Roztoky a pufry K přípravě všech roztoků a pufrů musí být použita dostatečně kvalitní, destilovaná či deionizovaná voda a běžné chemikálie p. a.

Vazný (karbonátový) pufr, pH = 9,6: 1,59 g Na2CO3 (Lachema, Brno) 2,93 g NaHCO3 (Lachema, Brno) 1000 ml dest. H2O Před každým použitím je dobré namíchat čerstvý pufr. PBS (fosfátový pufr), pH = 7,3: 0,876 g NaH2PO4 . 2H2O (Lachema, Brno) 2,56 g Na2HPO4 . 12 H2O (Lachema, Brno) 8,77 g NaCl (Penta, Chrudim) 1000 ml dest. H2O pH upraveno pomocí konc. HCl (Merci, Brno) Promývací roztok (low salt), pH = 7,3: 24,2 g Trisma base (Sigma-Aldrich, Německo) 222,2 g NaCl (Penta, Chrudim) 1 g NaN3 pracovat v rukavicích, silný jed (Lachema, Brno) 5 ml Tween 20 (Lachema, Blansko) 1000 ml dest. H2O pH upraveno pomocí konc. HCl (Merci, Brno) Promývací roztok (high salt), pH = 7,7: 24,2 g Trisma base (Sigma-Aldrich, Německo) 292,2 g NaCl (Penta, Chrudim) 1 g NaN3 pracovat v rukavicích, silný jed (Lachema, Brno) 10 ml Tween 20 (Lachema, Blansko) 1000 ml dest. H2O 36

pH upraveno pomocí konc. HCl (Merci, Brno) Protilátkový pufr (1 % roztok BSA): 1g BSA (Serva, Německo) 100 ml PBS

Substrátový pufr, pH = 5,4: 21 g kys. citrónové (Penta, Chrudim) 8,2 g octanu sodného (Lachema, Brno) 1000 ml dest.H2O pH upraveno pomocí 1M NaOH (Lachema, Brno), do 15 ml substrátového pufru těsně před použitím přidat 5 µl H2O2 Roztok pro zastavení reakce: 2M H2SO4 (Merci, Brno) ředěno v dest. H2O Podle získaných zkušeností, je nejlepší skladovat všechny pufry v lednici (4 °C). Před následným použitím je dobré znovu ověřit pH a nechat vytemperovat na laboratorní teplotu. Většina pufrů vydrží v lednici od 2 do 6 měsíců.

4.3 Přístroje  Analytické váhy - HR 120 EC (A&D Company, Japonsko)  pH metr - 320 (Corning, USA)  ELISA reader - Sunrise (TECAN, Švýcarsko)  Chlazená centrifuga - Universal-32 R (Hettich, Německo)  Promývačka - Nunc-immuno cash 12 (Nalge nunc international, USA)  Vortex – Minishaker MS2 (IKA, Německo)

37

4.4 Postup Postup celého testu se skládá ze tří menších částí: dialýzy IgM, navázání anti-kapřích IgM na stěny jamek mikrotitrační destičky a samotný ELISA test. Dialýza kapří plasmy byla prováděna podle postupu doporučeného MVDr. Pokorovou (VÚVL, Brno), vázání protilátek na mikrotitrační destičky bylo prováděno podle postupu Mgr. Vostala (PřF MU, Brno), a vlastní ELISA test byl proveden podle manuálu přiloženého k zakoupeným protilátkám proti kapřím IgM od firmy Aquatic Diagnostics.

4.4.1 Dialýza Dialýza kapří plasmy byla prováděna pro získání čistých kapřích IgM o známé koncentraci, které byly později použity jako standardy pro kalibraci a optimalizaci metody. Kapří plasma byla za stálého míchání vysrážena přikapáváním nasyceného síranu amonného vždy do 40 % objemu plasmy. Tzn. 6 ml plasmy bylo vysráženo 4 ml síranu amonného, poté byl roztok zcentrifugován při 6000 ot./min. po dobu 20 minut při teplotě 20 °C. Následně byl odebrán supernatant a pelet byl resuspendován dest. vodou v původním objemu plasmy, tj. v 6 ml. Celý tento proces byl třikrát opakován a v posledním opakování byl pelet resuspendován pouze v polovičním objemu dest. vody, tj. 3 ml. Takto vzniklý roztok byl přenesen do na jednom konci zaškrcené dialyzační membrány, která byla ponořena do kádinky s PBS. Dialýza proti PBS probíhala 4 dny v lednici při teplotě 4 °C a PBS bylo měněno v denních intervalech. Po čtyřech dnech byl obsah dialyzační membrány (roztok kapřích IgM) přenesen do čisté kádinky. V roztoku byla následně změřena koncentrace bílkovin pomocí kitu na stanovení bílkovin firmy BIO-RAD. Podle přiloženého návodu tohoto kitu byly použity dva roztoky, A a B. Do jamek mikrotitrační destičky bylo vždy nepipetováno 5 µl vzorku nebo standardu (roztok BSA o koncentraci 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/ml), dále 25 µl roztoku A a 200 µl roztoku B (je důležité zachovávat pořadí vzorek → roztok A → roztok B). Mikrotitrační destička byla ponechána 30 minut ve tmě při laboratorní teplotě pro vývoj barevné reakce, a po uplynulé době byla změřena absorbance při vlnové délce 700 nm. Ze získaných dat byla zhotovena kalibrační křivka a podle rovnice této křivky spočítána koncentrace proteinů (tedy IgM) v daném roztoku. Hodnota koncentrace IgM v našem směsném séru se většinou pohybovala kolem 5 - 6 mg/ml. Roztok se zjištěnou koncentrací IgM byl následně 38

rozpipetován do Eppendorfových zkumavek po 50 µl aliquotech a zamražen a skladován při teplotě – 20 °C.

4.4.2 Navázání protilátek na mikrotitrační destičku V našem experimentu jsme použili upravenou variantu sendvičového ELISA testu pro stanovení protilátek (obr. 11), kdy jsme imobilizovali (navázali) na pevnou fázi (stěna jamky mikrotitrační destičky) protilátky proti kapřím IgM → F16, anti-kapří monoklonální protilátky, Aquatic Diagnostics.

Obr. 11: Námi upravená a použitá varianta sendvičového ELISA testu pro protilátky Navazování protilátky na mikrotitrační destičku: 1. Do všech jamek mikrotitrační destičky napipetovat 200 µl etanolu, přikrýt víčkem a nechat stát na vodorovné ploše při laboratorní teplotě 2 hodiny. 2. Po uplynutí 2 hodin odsát etanol z jamek a 3x promýt destilovanou vodou. Zbytky vody v jamkách odstranit mírnými údery do buničiny (lépe saje, tlumí nárazy) či filtračního papíru. První dva kroky slouží k zlepšení vazby Ag/Ab k plastovému povrchu stěn jamky, jsou důležité především pro kvalitativní stanovení. 3. Napipetovat do jamek 100 µl vazebným roztokem naředěné protilátky F16. Destičku přikrýt víčkem a nechat inkubovat přes noc v lednici při teplotě 4 °C. 4. Druhý den odsát obsah jamek a 3x promýt promývacím roztokem (low salt). Oklepat destičku a nechat oschnout. 39

5. Odstranit špatně navázané protilátky a vysytit zbylou plochu plastu 100 µl kaseinu, naředěného vazebným pufrem na 1 – 3 % koncentraci. Pufr musí mít laboratorní teplotu, aby se mléko dokonale rozpustilo. 6. Nechat stát 2 hodiny při laboratorní teplotě. 7. Odsát obsah jamek, 3x promýt promývacím roztokem (low salt), oklepat a nechat oschnout. 8. Takto je destička připravená k použití, nebo může být uskladněna v lednici po dobu maximálně 2 měsíců (musí se zabránit přístupu vlhkosti).

4.4.3 Vlastní ELISA test Po navázání protilátek na stěny jamek mikrotitrační destičky postupovat následovně: 1. Připravit potřebné ředění vzorku/standardu v PBS a napipetovat 100 µl do jamek připravené desky. 2. Destičku přikrýt víčkem a nechat inkubovat přes noc v lednici při 4 °C. 3. Druhý den odsát obsah jamek a 5x promýt promývacím roztokem (high salt), oklepat a nechat oschnout. 4. Přidat 100 µl/jamku naředěných monoklonálních protilátek proti kapřím IgM značených křenovou peroxidázou C16-HRP (v poměru 10,8 ml protilátkového pufru: 200 µl zamraženého aliquotu), a inkubovat při laboratorní teplotě po dobu 1 hodiny. 5. Po uplynulé době odsát obsah jamek a 5x promýt promývacím roztokem (high salt), oklepat a nechat oschnout. 6. Napipetovat 100 µl/jamku chromogenu rozpuštěného v substrátovém pufru (15 ml substrátového pufru + 7,5 mg OPD + 7,5 µl H2O2) a inkubovat ve tmě po dobu 10 minut při laboratorní teplotě. 7. Po cca 10 minutách (záleží na rychlosti vývinu barevné reakce) zastavit reakci 50µl/jamku stopovacího roztoku. 8. Změřit absorbanci ELISA leaderem při 492 nm.

40

4.4.4 Optimalizace Metody ELISA jsou jedny z testů, které se velice obtížně a zdlouhavě optimalizují. Základní premisou pro přesné měření je hlavně správné ředění konjugátu vázaného na pevnou fázi, ředění vzorků, potažmo standardů a určení slepého vzorku. Jako slepé vzorky byly použity: chromogen rozpuštěný ve stopovacím roztoku a již popsaný sendvič, ovšem bez přidání vzorku plasmy/séra. Pro správné ředění konjugátu a vzorku (bylo použito směsné sérum) jsme provedli test podle následující tabulky (tab. 4): Ředění vázaného konjugátu Ředění/typ vzorku 16x (cca 258 µg/ml) 64x (cca 160 µg/ml) 256x (cca 40 µg/ml) 512x (cca 20 µg/ml) B

10 µg/ml

6 µg/ml

6 µg/ml

3 µg/ml

S

S

D

S

0,0860

0,0700

0,1010

0,0840

0,0680

0,0630

0,0940

0,0620

0,0570

0,0560

0,0680

0,0600

0,0560

0,0560

0,0730

0,0580

0,0480

0,0470

0,0570

0,0630

Tab. 4: Optimalizace ředění vázaného konjugátu a vzorku, přibližná koncentrace IgM ve vzorku spočítána podle hodnot získaných z literatury, IgM získané dialýzou naředěno podle přibližných hodnot koncentrace IgM ve vzorku (S – směsné sérum, D – IgM po dialýze, B – slepý vzorek) Z naměřených hodnot absorbance v tabulce 4 vyplývá, že nejvhodnější ředění vázané protilátky F16 je 6 µg/ml. Nejvyšší absorbance ředěného séra pak byla získána při ředění 16x a 64x, proto bylo v následujících pokusech použito ředění 16x, 32x a 64x. Při roční optimalizaci bylo vyzkoušeno mnoho jiných variant, např. byly na pevnou fázi vázány antikapří protilátky poskytnuté VÚVELem, byla také vyzkoušena jiná varianta ELISA metody (kompetitivní ELISA), ale žádné z naměřených hodnot nebyly dost vysoké pro věrohodné stanovení hladiny IgM v kapří krvi.

41

4.5 Získaná data Po dlouhé optimalizaci bylo i přes všeobecně nízké hodnoty absorbance zjištěno optimální ředění jak vzorků, tak i navazovaných protilátek. Následně byly provedeny testy vzorků plasmy kapra obecného. Bohužel u všech těchto testů byla naměřená absorbance příliš nízká pro vyhodnocení hladiny koncentrace IgM. Hodnota absorbance vzorků se většinou pohybovala jen nepatrně výš, než hodnota absorbance slepých vzorků. Standardy měly oproti vzorkům absorbanci 2 - 3 x vyšší, ale i tak byla stále nízká pro přesné kvantitativní stanovení. Pro ukázku a lepší přehled o naměřených hodnotách absorbance přikládám tabulku 5, ve které jsou vzorky 1 - 7 z odběru, který proběhl 14. 4. 2008. Všechny tyto vzorky záměrně pocházely ze samic, takže hodnoty hladiny IgM měly být vyšší, než pokud by dané vzorky pocházely ze samců. Ředění/vzorek 16x 32x 64x 128x

D

1

2

3

4

5

6

7

0,1700

0,0510

0,0680

0,0500

0,0590

0,0470

0,0580

0,0500

0,1640

0,0530

0,0700

0,0580

0,0560

0,0520

0,0570

0,0510

0,1380 0,1590

0,0510 0,0540

0,0690 0,0730

0,0540 0,0530

0,0560 0,0620

0,0490 0,0590

0,0510 0,0570

0,0450 0,0530

Tab. 5: Příklad naměřených dat, vzorky 1 – 7 (všechny samice) odběr 14. 4. 2008, hodnota absorbance blanku byla 0,0490, (D – IgM po dialýze)

4.6 Problémy a teoretická řešení Problémů při provádění ELISA metody se naskytlo hned několik. Prvním z nich byl nepřesný výklad ředění protilátek v manuálu firmy Aquatic diagnostics. Tento problém byl vyřešen po náročné konzultaci se zástupci zmíněné firmy. Dalším problémem byla zdlouhavá optimalizace, na základě které bylo teprve možné stanovovat vzorky. Už při této optimalizaci jsme se potýkali s nedostatečnou mírou absorbance (,,svítivostí“) vzorku. Z naměřených dat vyplývá, že ve směsném séru (séra z více ryb smíchaná dohromady) je nejspíše vyšší koncentrace IgM než ve vzorcích jednotlivých ryb. Díky tomuto faktu byla absorbance naměřená v jednotlivých vzorcích ještě nižší než při optimalizaci. Z takto nízkých hodnot nebylo možné vyčíst žádné závěry, a jelikož již nebyl čas a finance na další optimalizační pokusy, od této metody bylo upuštěno a přešlo se k další – imunoturbidimetrii. Do budoucna 42

bych se rád k ELISA metodě vrátil a vyřešil dané problémy. Jednou možnou cestou k jejich vyřešení je změna celého sendviče a přidání sekundární protilátky, což by vedlo k ještě senzitivnější (citlivější) reakci a možnosti detekovat nižší koncentraci IgM s vyšší mírou absorbance. Jako nejideálnější model se tedy jeví ELISA pro IgM protilátky, která by již měla fungovat mnohem lépe. Rovněž není jisté, zdali je možné, aby tetramerní molekula IgM vázala stejnou protilátku z obou stran. Při ELISA metodě pro IgM protilátky tento diskutabilní problém není potřeba řešit, neboť značená protilátka (sekundární protilátka) se v tomto případě váže na antigen navázaný na molekulu IgM (viz obr. 5). Problémy při použití ELISA metody na rybí vzorky byly popsány také v literatuře, zde se však řeší spíše opačný problém – vysoká hodnota absorbance pozadí (viz Kim a kol., 2007). Dalším zmíněným problémem ELISA testů při aplikaci na ryby je již zmíněná nemožnost sehnání komerčně dostupných značených monoklonálních protilátek pro mnoho našich sladkovodních ryb. Jejich získání je samozřejmě možné při imunizaci např. králíka či kočky a následném vyizolování daných protilátek a jejich označení enzymem, tato varianta je ovšem časově i finančně velice náročná. Jak již bylo řečeno i díky tomuto faktu jsme byli nuceni přejít k další metodě imunoturbidimetrii.

5. Imunoturbidimetrie Další metodou použitou při detekci rybích IgM byla imunoturbidimetrie. Tato metoda je hojně využívána např. pro stanovení lidského IgG. Metoda je založena na reakci mezi hledanými imunoglobuliny jako antigeny a specifickému antiséru jako protilátce. Při této reakci vzniká nerozpustný komplex tvořící zákal, který je měřen spektrofotometricky. Tato metoda byla vybrána díky jejímu rychlému provedení a možnosti upotřebit již nakoupené protilátky, použité při ELISA testech.

43

5.1 Použitý materiál  Protilátky F16 (imunoglobuliny (IgG2b) proti kapřím IgM), Aquatic Diagnostics Ltd., Skotsko, naředěný v 1 ml vazného pufru na koncentraci 200 µg/ml a zamražen v 50 a 100 µl aliquotech při -20 °C  Síran amonný - (NH4)2SO4 (Lachema, Brno)  Kit pro stanovení bílkovin roztok A a B (Bio-Rad, USA)  Mikrotitrační destičky P (Gama Group, Trhové Sviny)  Automatické pipety a další standardní laboratorní vybavení  Dialyzační membrána 20 kDa (Visking, Německo)  Zkoumaná plasma/sérum

5.2 Roztoky a pufry Reakční pufr: 0,05 M Tris (Biomedica) Roztok antiséra: 10 µl protilátky F16 20 µl reakčního pufru Fyziologický roztok: 0,85 g NaCl (Penta, Chrudim) 100 ml dest. H2O

5.3 Přístroje  Analytické váhy - HR 120 EC (A&D Company, Japonsko)  ELISA reader – Sunrise (TECAN, Švýcarsko)  Chlazená centrifuga – Universal-32 R (Hettich, Německo) 44

 Spektrofotometr - ND-1000 (NanoDrop, USA)  Vortex – Minishaker MS2 (IKA, Německo)

5.4 Postup Stejně jako při ELISA testu byly potřeba izolované kapří IgM pro kalibrační účely. Tyto byly opět získány dialýzou kapřího směsného séra a následným stanovením koncentrace proteinů pomocí kitu firmy BIO-RAD. Podrobný postup těchto dvou kroků je popsán v kapitole 5.4.1 Dialýza. Vlastní postup imunoturbidimetrie byl prováděn podle upraveného protokolu používaného pro stanovení lidského IgG používaného v praktických cvičeních imunologie. Vlastní provedení imunoturbidimetrie: 1. Připravit ředění předialyzovaných IgM pro standardní roztoky, ředění reakčním pufrem na koncentrace od 16 do 0,5 mg/ml. 2. Do

Eppendorfových

zkumavek

postupně

napipetovat

5

µl

vzorku/standardu/fyziologického roztoku, 30 µl roztoku antiséra a 220 µl reakčního pufru. 3. Obsah Eppendorfových zkumavek napipetovat do mikrotitrační destičky, vždy po 100 µl a změřit na ELISA readeru/NanoDropu při vlnové délce 275 nm.

5.5 Získaná data a optimalizace Jelikož optimální vlnová délka pro odečtení absorbance imunokomplexů je velice nízká, byl pro její měření použit spektrofotometr NanoDrop, který je schopen měřit nejen danou vlnovou délku, ale celé spektrum. Při prvních pokusech jsme zjistili, že optimální vlnová délka pro měření zákalu je asi 275 nm, v tomto bodě dosahovala absorbance stálých a vysokých hodnot viz obr. 12.

45

Obr. 12: Optimální vlnová délka pro měření zákalu – imunokomplexů Po získání ideální vlnové délky, byly změřeny první vzorky s odpovídající kalibrací. Hodnoty absorbance dosahovaly vhodných mezí pro přesné stanovení hladiny IgM, pohybovaly se cca od 0,100 do 0,200 po odečtení blanku (reakční pufr). Bohužel při měření slepého vzorku (protilátka F16 v pracovním objemu reakčního pufru) bylo zjištěno, že hodnota absorbance v poměru ku standardům či vzorkům dosahuje příliš vysokých hodnot, a proto tato data nemohla být brána jako relevantní (viz tabulka 6). Standardy / Vzorky / Slepý vzorek 20 mg/ml 15 mg/ml 10 mg/ml 6 mg/ml 5 mg/ml 3 mg/ml 1,5 mg/ml Vz. 1 Vz. 2 Vz. 3 Vz. 4 Vz. 5 F16

A275 0,263 0,275 0,250 0,158 0,146 0,142 0,099 0,171 0,155 0,126 0,139 0,211

0,132

Tab. 6: Data naměřená imunoturbidimetricky, slepý vzorek příliš - vysoká hodnota absorbance 46

5.6 Problémy a teoretická řešení I přes slibný začátek tato metoda s použitím daných monoklonálních protilátek (F16) neposkytla akceptovatelné výsledky pro stanovení hladiny IgM u kapra obecného. Při následném jednání se zástupci firmy Aquatic Diagnostic, bylo zjištěno, že monoklonální protilátky F16 nejsou určeny pro imunoturbidimetrii, i když jejich složení nevylučuje jejich použití, a že pro imunoturbidimetriii daná firma, ani žádná jiná, neposkytuje komerčně dostupné protilátky. Daná metoda tedy nemohla správně fungovat, a proto od ní bylo rovněž jako od metody ELISA upuštěno. Pokud by ovšem některá z firem nabízela komerčně dostupné protilátky pro imunoturbidimetrii, daná metoda by nejspíše přinesla snadné, rychlé a přesné výsledky. Další metodu, kterou jsme vyzkoušeli pro stanovení rybích IgM, bylo srážení síranem zinečnatým.

6. ZST (srážení síranem zinečnatým) Metoda srážení síranem zinečnatým je stará metoda (1970) využívaná hlavně ve veterinární praxi. Tato metoda je velmi jednoduchá, rychlá a levná. Její jedinou nevýhodou je, že stanovuje všechny přítomné imunoglobuliny v krvi, toto však díky přítomnosti pouze IgM při práci s rybími vzorky není problém.

6.1 Použitý materiál  Kit pro stanovení bílkovin roztok A a B (Bio-Rad, USA)  Mikrotitrační destičky P (Gama Group, Trhové Sviny)  Automatické pipety a další standardní laboratorní vybavení  Zkoumaná plasma/sérum

47

6.2 Roztoky a pufry Roztok 0,7 mM síranu zinečnatého, pH = 5,8: 208 mg ZnSO4 . H2O (Lachema, Brno) 1000 ml dest. H2O Fyziologický roztok: 0,85 g NaCl (Penta, Chrudim) 100 ml dest. H2O

6.3 Přístroje  Analytické váhy - HR 120 EC (A&D Company, Japonsko)  ELISA reader – Sunrise (TECAN, Švýcarsko)  Chlazená centrifuga – Universal-32 R (Hettich, Německo)  Vortex – Minishaker MS2 (IKA, Německo)

6.4 Postup Celý pokus byl proveden podle upraveného originálního protokolu sestaveného McEwanem v roce 1970 a byl doplněn o stanovení koncentrace bílkovin pomocí kitu pro stanovení proteinů firmy BIO-RAD. Toto stanovení je důkladně popsáno v kapitole 5.4.1 Dialýza, proto v dalším postupu nebude důkladněji popisováno.

48

Provedení ZST: 1. Do 1,5 ml roztoku ZnSO4 přidat 25 µl neředěného vzorku - plasmy/séra nebo fyziologického roztoku jako slepého vzorku, nakonec všechny zkumavky protřepat na Vortexu. 2. Inkubovat 120 minut při laboratorní teplotě. Během inkubace je možno rovněž vzorky protřepat na Vortexu. 3. Během inkubace 60x naředit plasmu/sérum destilovanou vodou a změřit obsah bílkovin. 4. Po uplynutí inkubační doby napipetovat obsah zkumavek do Eppendorfových zkumavek a centrifugovat při 6000 ot./min. 15 minut při 20 °C. 5. Ve vzniklém supernatantu změřit obsah bílkovin. 6. Pro získání výsledků odečíst koncentraci bílkovin naměřenou v supernatantu od koncentrace získané z naředěného séra.

6.5 Získaná data a optimalizace Naměřená absorbance vzorků se pohybovala od 0,150 do 0,300. Tyto hodnoty jsou dost vysoké pro přesné kvantitativní stanovení koncentrace IgM v rybí krvi. Hodnota blanku se naopak pohybovala kolem hodnot 0,040. Díky těmto výsledkům při optimalizaci metody jsme přistoupili ke změření všech získaných vzorků z kapra obecného, lína obecného a karase stříbřitého. Získané výsledky jsou dále popsány v kapitole IV. Výsledky.

6.6 Problémy a teoretická řešení Při metodě srážení síranem zinečnatým jsme narazili na problém, kdy při pokusu vysrážet čisté dialýzou izolované kapří IgM, nebylo možné získat jakýkoliv zákal. Tento fakt je přisuzován možnosti, že pokud už jednou byly imunoglobuliny vysráženy síranem amonným, není možné jejich opětovné vysrážení síranem zinečnatým. Pro ujištění se, že síran amonný po vysrážení všech proteinů séra či plasmy již nemůže dále s ničím reagovat, jsme zkoušeli srážet znovu vzniklým supernatantem, ale žádná sraženina již nevznikala. Naopak při pokusu vysrážet roztok lidských IgM vznikl krásný zákal. Dalším problémem byl fakt, že 49

pokud byla změřena absorbance samotného zákalu při 590 nm, tak hodnoty absorbance nekorelovaly s hodnotami získanými stanovením proteinů. Tento problém doposud bohužel nebyl zcela vyřešen, ale je přisuzován možnosti, že při měření zákalu není spektrofotometr plně schopen změřit reálné množství vysrážených bílkovin obsažených ve vzorku. Pro kontrolu, zdali je opravdu srážen pouze rybí IgM, jsme tedy použili další metodu, a to elektroforetické (SDS-PAGGE) měření struktury bílkovin.

7. Elektroforéza (SDS-PAGGE) Pro ověření správného měření metodou srážení síranem zinečnatým byla provedena SDSPAGGE modifikovaná podle Laemmliho (1970) (viz Hyršl, 2004). Jako vzorky byly použity: 60x ředěná (pufr pH 6,8 1:3 dest. H2O) plasma/sérum, supernatant vzniklý centrifugací vysrážených imunoglobulinů síranem zinečnatým a stejným způsobem vzniklá a resuspendovaná sraženina rybích imunoglobulinů. Resuspendace sraženiny imunoglobulinů proběhla v 1 ml pufru pH 6,8 ředěného 1:3 dest. H2O. Všechny vzorky byly vysráženy podle návodu, popsaném v kapitole 7.4 Postup (u metody ZST). Všechen materiál, roztoky a pufry, přístroje a postupy (kromě ředění vzorků) byly provedeny a je možné je podrobně prostudovat v rigorózní práci: Hyršl, 2004.

7.1 Ředění vzorků 1. 60x zředěné sérum/plasma: - 10 µl séra/plasmy - 7 µl merkaptoetanolu - 10 µl Sample pufru - 73 µl pufru pH 6,8 ředěného 1:3

2. Supernatant:

- 20 µl supernatantu - 7 µl merkaptoetanolu - 10 µl Sample pufru - 63 µl pufru pH 6,8 ředěného 1:3

50

3. Resuspendovaná sraženina: - 20 µl nesuspendované sraženiny - 7 µl merkaptoetanolu - 10 µl Sample pufru - 63 µl pufru pH 6,8 ředěného 1:3

7.2 Získaná data Data byla získána pomocí naskenování obarvených gelů a pozdější počítačové analýze v programu Molecular Analyst 1.1.1. Ze získaných výsledků vyplývá, že síran zinečnatý opravdu sráží pouze imunoglobuliny. Na obrázku 13 jsou vidět výsledky 4 nanesených vzorků kapra obecného: a – plné sérum, b – supernatant po vysrážení ZnSO4, c – resuspendovaná sraženina IgM, d - standard). Z obrázku lze snadno a jasně vyčíst, že zatímco v plném séru se nachází bandy všech přítomných proteinů, ve sloupci, kde byl nanesen supernatant, jeden protein chybí. Tento protein se naopak objevuje ve sloupci s napipetovanou resuspendovanou sraženinou IgM a je to námi hledaný imunoglobulin. Jeho molekulová hmotnost (cca 150 kDa) se ovšem nepohybuje v oblasti kolem 80 a 25 kDa, kde bychom jej očekávali, jelikož se měl díky SDS rozštěpit na lehké a těžké řetězce s touto molekulovou hmotností. Tento fakt si vysvětlujeme velkými strukturálními změnami samotného proteinu či polypeptidových řetězců při srážení síranem zinečnatým. Dalším problémem se jeví 2 bandy, které se obarvily ve sloupci, kde by se měl objevit pouze imunoglobulin. Tyto dva bandy (MW kolem 60 kDa) jsou však složky sample pufru a objevily se tedy i ve všech ostatních vzorcích včetně slepého vzorku. Drobné bandy ve sloupci s resuspendovanou sraženinou IgM jsou pozůstatky supernatantu, jelikož není jednoduché získat čistou (suchou) sraženinu, a to i přes její důkladné promytí.

51

Obr. 13: Výsledek SDS-PAGGE, vzorky: a – plné sérum, b – supernatant po vysráženém IgM, c – resuspendované vysrážené IgM, d – standard

52

V. Výsledky

53

8. Výsledky získané metodou ZST Všechny vzorky byly zpracovány metodou srážení síranem zinečnatým. U všech vzorků byla tedy pomocí absorbance změřena koncentrace bílkovin, a to v plném séru a supernatantu po vysráženém IgM a následně vypočítána koncentrace IgM (g/l). Následující tabulky ukazují hodnoty naměřené u jednotlivých ryb. Odběr

Kapr obecný (Cyprinus carpio):

Vzorek Pohlaví č. (M/F)

koncentrace IgM (g/l)

4.6.2007

14

M

24,37

4.6.2007

15

M

17,02

4.6.2007

16

F

14,05

4.6.2007

17

F

16,26

Odběr 4.6.2007

4.6.2007

18

F

30,87

Odběr 20.8.2007

4.6.2007

19

F

17,61

Odběr 5.11.2007

4.6.2007

20

F

27,20

Odběr 19.2.2008

4.6.2007

21

M

21,49

Odběr 14.4.2008

4.6.2007

22

M

17,76

Samci (M - male)

4.6.2007

23

F

15,27

Samice (F - female)

4.6.2007

24

F

21,37

Koncentrace IgM (g/l)

4.6.2007

25

F

20,80

4.6.2007

26

F

10,63

4.6.2007

27

F

17,45

4.6.2007

28

F

20,26

4.6.2007

29

F

32,85

4.6.2007

30

M

16,53

4.6.2007

31

F

24,74

4.6.2007

32

M

17,67

20.8.2007

1

M

5,00

20.8.2007

2

M

5,82

20.8.2007

3

M

11,42

20.8.2007

4

M

4,17

20.8.2007

5

M

13,50

20.8.2007

6

M

7,38

20.8.2007

7

M

9,93

20.8.2007

8

M

12,51

Legenda:

Vzorek Pohlaví č. (M/F) M 4.6.2007 1 Odběr

koncentrace IgM (g/l) 19,29

4.6.2007

2

M

15,41

4.6.2007

3

M

9,93

4.6.2007

4

M

8,15

4.6.2007

5

M

9,41

4.6.2007

6

M

18,77

4.6.2007

7

M

8,52

4.6.2007

8

M

19,53

4.6.2007

9

M

24,77

4.6.2007

10

M

15,42

4.6.2007

11

M

17,18

4.6.2007

12

M

13,26

4.6.2007

13

M

15,07

54

Odběr



Odběr



20.8.2007

9

M

3,48

5.11.2007

12

M

19,33

20.8.2007

10

M

8,10

5.11.2007

13

M

24,35

20.8.2007

11

M

8,77

5.11.2007

14

F

20,62

20.8.2007

12

M

9,45

5.11.2007

15

M

16,74

20.8.2007

13

M

17,88

5.11.2007

16

M

14,50

20.8.2007

14

M

13,12

5.11.2007

17

F

20,69

20.8.2007

15

M

3,44

5.11.2007

18

F

23,68

20.8.2007

16

M

10,07

5.11.2007

19

F

23,41

20.8.2007

17

F

15,29

5.11.2007

20

F

20,38

20.8.2007

18

F

13,36

5.11.2007

21

F

21,52

20.8.2007

19

F

28,01

5.11.2007

22

F

22,21

20.8.2007

20

F

24,30

5.11.2007

23

F

23,23

20.8.2007

21

F

21,08

5.11.2007

24

F

32,06

20.8.2007

22

F

28,19

5.11.2007

25

F

21,20

20.8.2007

23

F

17,28

5.11.2007

26

F

19,44

20.8.2007

24

F

21,35

5.11.2007

27

F

28,34

20.8.2007

25

F

11,77

5.11.2007

28

F

26,76

20.8.2007

26

F

36,90

5.11.2007

29

F

19,43

20.8.2007

27

F

19,04

5.11.2007

30

F

7,61

20.8.2007

28

F

22,63

5.11.2007

31

F

28,10

20.8.2007

29

F

22,05

5.11.2007

32

F

55,12

20.8.2007

30

F

21,16

19.2.2008

1

M

10,99

20.8.2007

31

F

12,28

19.2.2008

2

F

10,32

20.8.2007

32

F

22,04

19.2.2008

3

M

8,47

5.11.2007

1

M

15,18

19.2.2008

4

M

12,71

5.11.2007

2

M

15,77

19.2.2008

5

M

16,21

5.11.2007

3

M

16,48

19.2.2008

6

M

14,22

5.11.2007

4

M

18,59

19.2.2008

7

M

10,98

5.11.2007

5

M

15,68

19.2.2008

8

M

9,57

5.11.2007

6

M

11,66

19.2.2008

9

M

19,90

5.11.2007

7

M

10,94

19.2.2008

10

M

9,14

5.11.2007

8

M

13,10

19.2.2008

11

M

9,21

5.11.2007

9

M

13,65

19.2.2008

12

M

16,88

5.11.2007

10

M

12,02

19.2.2008

13

M

18,94

5.11.2007

11

M

13,02

19.2.2008

14

M

5,74

55

Odběr



Odběr



19.2.2008

15

M

15,07

14.4.2008

18

M

21,91

19.2.2008

16

M

19,50

14.4.2008

19

M

10,88

19.2.2008

17

M

9,15

14.4.2008

20

F

20,00

19.2.2008

18

F

13,80

14.4.2008

21

F

7,26

19.2.2008

19

F

15,25

14.4.2008

22

M

0,00

19.2.2008

20

M

10,35

14.4.2008

23

F

15,00

19.2.2008

21

F

13,74

14.4.2008

24

F

14,57

19.2.2008

22

F

16,09

14.4.2008

25

F

25,24

19.2.2008

23

F

15,09

14.4.2008

26

F

19,07

19.2.2008

24

F

16,85

14.4.2008

27

F

14,29

19.2.2008

25

M

12,20

14.4.2008

28

F

16,72

19.2.2008

26

F

3,00

14.4.2008

29

F

9,65

19.2.2008

27

F

11,10

14.4.2008

30

F

18,43

19.2.2008

28

F

9,98

14.4.2008

31

F

8,10

19.2.2008

29

F

8,25

14.4.2008

32

M

12,28

19.2.2008

30

F

11,06

19.2.2008

31

F

13,04

19.2.2008

32

M

10,65

14.4.2008

1

M

10,28

14.4.2008

2

M

7,70

14.4.2008

3

M

12,78

14.4.2008

4

M

9,66

14.4.2008

5

M

13,80

14.4.2008

6

M

14,14

14.4.2008

7

M

10,74

14.4.2008

8

M

8,14

14.4.2008

9

M

15,46

14.4.2008

10

M

18,24

14.4.2008

11

M

13,80

14.4.2008

12

M

2,36

1

14.4.2008

13

M

0,00

14.4.2008

14

M

14.4.2008

15

14.4.2008 14.4.2008

Lín obecný (Tinca tinca):

Legenda:

Samci (M - male) Samice (F - female) Diploidní jedinci Triploidní jedinci Gynogenní jedinci Koncentrace IgM (g/l) Vzorek Pohlaví č. (M/F)


F

Ploidie 2n/3n/G 2n

2

F

2n

41,02

17,09

3

F

2n

23,04

M

17,69

4

F

2n

12,19

16

M

16,88

5

F

2n

9,26

17

M

22,02

6

M

2n

9,62

56

20,19


Ploidie 2n/3n/G



Ploidie 2n/3n/G


7

M

2n

7,67

42

M

3n

15,14

8

M

3n

16,18

43

M

2n

28,31

9

M

2n

21,47

44

M

3n

27,19

10

M

2n

9,6

45

F

2n

30,39

11

F

G

24

51

M

3n

1,74

12

F

G

40,11

52

M

2n

19,18

13

F

G

10,6

53

F

2n

0

14

F

G

23,16

54

F

3n

45,85

15

F

G

0

55

F

2n

31,97

16

M

G

0

56

M

3n

0

17

M

3n

14,34

57

F

G

41,08

18

M

3n

9,7

58

F

3n

0

19

M

3n

18,51

59

F

2n

32,52

20

M

3n

44,12

60

M

3n

37,38

21

F

3n

2,77

61

F

3n

0

22

F

3n

0

62

F

3n

9,91

23

F

3n

12,87

63

M

2n

0

24

F

3n

10,61

64

F

G

24,84

25

F

3n

2,17

65

M

3n

4,86

26

F

2n

41,14

66

F

G

10,3

27

F

G

44,89

67

F

2n

18,58

28

F

G

41,7

68

F

G

15,63

29

F

G

30,57

69

F

2n

15,21

30

M

3n

7,6

70

M

2n

9,98

31

F

G

37,44

71

M

2n

9,28

32

M

2n

6,4

72

F

G

26,4

33

F

2n

24,36

73

F

2n

35,5

34

F

G

43,6

74

M

3n

33,14

35

F

3n

37,35

75

F

3n

27,48

36

F

2n

32,32

76

M

2n

7,92

37

F

2n

23,39

77

M

2n

12,87

38

M

2n

18,29

78

M

2n

17,95

39

M

2n

29,89

80

F

2n

26,4

40

F

2n

18,75

81

F

2n

8,76

41

M

2n

15,34

82

M

3n

21,93

57


Ploidie 2n/3n/G


Vzorek č.

Ploidie 2n/3n/G / kříženci


83

M

3n

12,65

7

3n

0

84

M

3n

17,86

8

3n

26,77

85

M

3n

10,29

9

3n

4,48

86

F

3n

9,41

10

3n

8,07

87

F

3n

20,83

16

88

F

G

10,96

89

F

G

13,52

90

F

G

0

91

F

G

29,59

92

F

3n

15,45

93

F

2n

18,07

94

M

3n

13,03

95

M

3n

17,93

96

F

G

37,1

97

F

3n

30,67

98

F

2n

14,33

17 18 20 21 22 23 24 25

Karas stříbřitý (Carassius auratus):

kapr obecný x karas stříbřitý kapr obecný x karas stříbřitý kapr obecný x karas stříbřitý kapr obecný x karas stříbřitý karas stříbřitý x karas obecný karas stříbřitý x karas obecný karas stříbřitý x karas obecný karas stříbřitý x karas obecný karas stříbřitý x karas obecný

10,08 0 14,19 14,07 4,6 18,13 6,06 10 2,16

26

2n

13,56

28

2n

15,99

30

2n

11,36

31

3n

8,93

Diploidní jedinci

32

3n

8,44

Triploidní jedinci Kříženci kapra obecného a karase stříbřitého Kříženci karase stříbřitého a karase obecného Koncentrace IgM (g/l)

33

3n

7,55

34

3n

12,22

35

3n

27,51

Legenda:

41 42

Vzorek č.

Ploidie 2n/3n/G / kříženci


44

1

2n

3,97

45

2

2n

1,08

3

2n

9,39

4

2n

0

5

2n

5,14

48 49

58

kapr obecný x karas stříbřitý kapr obecný x karas stříbřitý kapr obecný x karas stříbřitý kapr obecný x karas stříbřitý karas stříbřitý x karas obecný karas stříbřitý x karas obecný

3,76 24,89 0 28,43 3,89 24,63

Naměřené hodnoty všech druhů ryb jsou velmi variabilní, proto jsme při prezentaci výsledků používali průměrné hodnoty pouze pro demonstrativní účely, viz následující grafy v jednotlivých kapitolách výsledků. Pro přesné vyjádření výsledků byla všechna naměřená data statisticky vyhodnocena v programu Statistica 8.0. Byly vybrány a použity dva vhodné neparametrické testy, pro porovnání dvou nezávislých skupin (např. pohlaví) Mann-Whitney U test a pro porovnání více nezávislých skupin (např. porovnání jednotlivých odběrů) Kruskal-Wallis ANOVA test.

8.1 Srovnání - kapr obecný (Cyprinus carpio) Při všech odběrech během celého roku byla sledována a zaznamenávána teplota vody v chovných nádržích VÚRH JU. Vývoj teplot znázorňuje graf 2.

Teplota vody (°C)

Sezónní dynamika teploty vody v chovných nádržích VÚRH JU

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

16 7,5

18,5

4,9

2,5

Graf 2: Sezónní dynamika teploty vody v chovných nádržích VÚRH JU – od června 2007 do dubna 2008

59

U kapra obecného byla zjištěna statisticky významná sezónní dynamika hladiny IgM v krvi (Kruskal-Wallis ANOVA, p < 0,0001). Nejvyšší průměrné hodnoty hladiny IgM byly zaznamenány v červnu (20,15 g/l) a nejnižší průměrné hodnoty v srpnu (12,42 g/l) (graf 3). Průměrné hodnoty v grafu díky variabilitě dat neukazují názorně odlišnost jednotlivých odběrů, ale statistické testy rozdílnost potvrdily.

Sezónní dynamika hladiny IgM u kapra obecného (Cyprinus carpio) 30


25 20 15 10

18,09

20,15 15,02

12,42

5

13,26

0

Graf 3: Sezónní dynamika hladiny IgM u kapra obecného – srovnání průměrných hodnot jednotlivých odběrů, chybové úsečky znázorňují směrodatnou odchylku výběru, byly zjištěny statisticky významné rozdíly mezi jednotlivými skupinami (Kruskal-Wallis ANOVA, p < 0,0001)

60

Rovněž byly u kapra obecného zjištěny statisticky významné rozdíly v produkci IgM mezi pohlavími (Mann-Whitney U test, p < 0,0001), kdy samice kapra měly ve většině odběrů vyšší hladinu IgM v krvi než samci (graf 4). Statistické testy u některých odběrů potvrdily významné rozdíly mezi pohlavími viditelné i při porovnání průměrných hodnot v grafu.

Sezónní dynamika hladiny IgM u kapra obecného (Cyprinus carpio) 35


30 25 20

♂

15

♀

10 5 0

Graf 4: Sezónní dynamika hladiny IgM u kapra obecného – srovnání průměrných hodnot jednotlivých pohlaví, chybové úsečky znázorňují směrodatnou odchylku výběru, u některých odběrů (srpen, listopad) byly zjištěny statisticky významné rozdíly mezi jednotlivými pohlavími (Mann-Whitney U test, p < 0,0001)

61

8.2 Srovnání - lín obecný (Tinca tinca) U lína obecného byly zjištěny statisticky významné rozdíly v produkci IgM mezi diploidní (2n), triploidní (3n) a gynogenní (G) populací (Kruskal-Wallis ANOVA, p = 0,0242). Průměrně mají diploidní a triploidní populace přibližně stejnou hladinu IgM, kdežto gynogenní populace má zmíněnou hladinu mírně zvýšenou (graf 5). Průměrné hodnoty v grafu neukazují zřetelně rozdíly mezi jednotlivými skupinami, jejich přítomnost však dokazuje statistická analýza.

Srovnání hladiny IgM v plasmě lína obecného (Tinca tinca) 45


40 35

30 25 20 15 10

24,07 18,95

17,03

2n

3n

5 0 G

Graf 5: Srovnání hladiny IgM v plasmě lína obecného – srovnání průměrných hodnot různě ploidních populací, chybové úsečky znázorňují směrodatnou odchylku výběru, byly zjištěny statistické rozdíly mezi jednotlivými ploidiemi (Kruskal-Wallis ANOVA, p = 0,0242)

62

Statisticky významné rozdíly však nebyly u lína obecného nalezeny při porovnání jednotlivých pohlaví (Mann-Whitney U test, p = 0,0783). Průměrně však mají samice nepatrně vyšší nebo stejnou hladinu IgM jako samci, a to jak celkově, tak i v jednotlivých populacích (graf 6). Průměrné hodnoty znázorněné v grafu nejsou zcela vyrovnané, statistické testy však nenašly žádné významné rozdíly mezi jednotlivými pohlavími.

Srovnání hladiny IgM v plasmě lína obecného (Tinca tinca) 40


35 30 25 20 15 10 5 0 2n

2n

3n

3n

Graf 6: Srovnání hladiny IgM v plasmě lína obecného – srovnání průměrných hodnot jednotlivých pohlaví, chybové úsečky znázorňují směrodatnou odchylku výběru, nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly mezi jednotlivými pohlavími (Mann-Whitney U test, p = 0,0783)

63

8.3 Srovnání karas - stříbřitý (Carassius auratus) Bylo zjištěno, že diploidní (2n) a triploidní (3n) populace karasů se produkcí IgM statisticky významně neliší. (Kruskal-Wallis ANOVA, p = 0,8949). Průměrná hladina IgM 2n (7,56 g/l) je přesto mírně nižší než u 3n jedinců (11,55 g/l) a kříženců (11,93 a 9,92 g/l). Pohlaví tohoto druhu nebylo rozlišováno (graf 7). Z průměrných hodnot zaznamenaných v grafu, stejně jako z výsledků statistických analýz je vidět, že mezi jednotlivými skupinami nejsou významné rozdíly.

Srovnání hladiny IgM v plasmě karase stříbřitého (Carassius auratus)


25 20 15

10 5

11,93

11,55 7,56

9,92

0

karas stříbřitý diploidní

karas stříbřitý triploidní

kříženec kapra kříženec karasa obecného a karasa stříbřitého a karasa stříbřitého obecného

Graf 7: Srovnání průměrných hodnot hladiny IgM v plasmě karase stříbřitého a jeho kříženců, chybové úsečky znázorňují směrodatnou odchylku výběru, nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly mezi jednotlivými populacemi (Kruskal-Wallis ANOVA, p = 0,8949)

64

8.4 Mezidruhové srovnání Při mezidruhovém porovnání byly zjištěny statisticky významné rozdíly v produkci IgM mezi jednotlivými druhy ryb (Kruskal-Wallis ANOVA, p = 0,0002). Průměrně pak má nejvyšší hladinu IgM (19,08 g/l) lín obecný, mírně nižší (15,79 g/l) kapr obecný a nejnižší (10,29 g/l) karas stříbřitý (graf 8). Rozdíly viditelné v grafu znázorňujícím průměrné hodnoty mezi jednotlivými rybami, potvrzuje také provedená statistická analýza.

Mezidruhové srovnání průměrných hodnot hladiny IgM kapra obecného, lína obecného a karase stříbřitého 35


30 25 20 15 10 15,79

19,08 10,29

5 0

Graf 8: Mezidruhové srovnání průměrných hodnot hladiny IgM kapra obecného, lína obecného a karase stříbřitého, chybové úsečky znázorňují směrodatnou odchylku výběru, byly zjištěny statisticky významné rozdíly mezi jednotlivými druhy (KruskalWallis ANOVA, p = 0,0002)

65

Mezidruhovým srovnáním pohlaví kapra obecného a lína obecného nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly v produkci IgM mezi samci (Mann-Whitney U test, p = 0,4649) ani samicemi obou druhů (Mann-Whitney U test, p = 0,5264). Průměrně však mají obě pohlaví lína obecného nepatrně (o 1-2 g/l) vyšší koncentraci IgM v krvi než jedinci kapra obecného a samice obou druhů mají vyšší hodnoty koncentrace IgM než samci (graf 9). Minimální rozdíly, viditelné v grafu znázorňujícím průměrné hodnoty, byly potvrzeny statistickými testy, které nenašly statisticky významné rozdíly mezi samci ani mezi samicemi.

Mezidruhové srovnání průměrných hodnot hladiny IgM samců a samic kapra obecného a lína obecného 40


35

30 25 20 15 10 5

21,47

19,23 14,40

13,11

0

Graf 9: Mezidruhové srovnání průměrných hodnot hladiny IgM samců a samic kapra obecného a lína obecného, chybové úsečky znázorňují směrodatnou odchylku výběru, nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly mezi pohlavími při porovnání druhů (Mann-Whitney U test, p = 0,4649 u samců a p = 0,5264 u samic)

Při mezidruhovém srovnání koncentrace IgM v krvi diploidních a triploidní jedinců lína obecného a karase stříbřitého byly zjištěny statisticky významné rozdíly mezi diploidními jedinci obou druhů (Mann-Whitney U test, p = 0,0049). Při testování triploidních jedinců obou druhů však statisticky významné rozdíly zjištěny nebyly (Mann-Whitney U 66

test, p = 0,2209). Průměrně má v diploidní i triploidní populaci větší hladinu IgM lín obecný. Diploidní populace lína obecného vykazuje vyšší koncentraci IgM v krvi než triploidní, avšak karas stříbřitý má produkci IgM přesně obrácenou – triploidní populace produkuje více IgM než diploidní (graf 10). Velký rozdíl u diploidních jedinců při porovnání průměrných hodnot v grafu byl potvrzen zjištěným statisticky významným rozdílem mezi jednotlivými druhy. Stejně tak byl potvrzen minimální rozdíl viditelný při pohledu na průměrné hodnoty v grafu, jelikož při statistické analýze nebyly nalezeny statisticky významné rozdíly u triploidních jedinců.

Mezidruhové srovnání průměrných hodnot hladiny IgM diploidních a triploidních populací kapra obecného a lína obecného 35


30 25

20 15 10

18,95

17,03 11,55

5

7,56

0

Graf 10: Mezidruhové srovnání průměrných hodnot hladiny IgM diploidních a triploidních populací lína obecného a karase stříbřitého, chybové úsečky znázorňují směrodatnou odchylku výběru, u diploidních jedinců byly zjištěny statisticky významné rozdíly mezi jednotlivými druhy (Mann-Whitney U test, p = 0,0049), u triploidních jedinců statisticky významné rozdíly zjištěny nebyly (Mann-Whitney U test, p = 0,2209) 67

VI. Diskuze

68

Hlavním cílem této práce byla optimalizace ELISA metody pro stanovení hladiny IgM v krvi kapra obecného. Optimalizace metody ELISA byla prováděna s komerčně dostupnými protilátkami firmy Aquatic Diagnostics. Tato firma, téměř jako jediná, nabízí potřebné protilátky, ovšem po dlouhodobějších zkušenostech bylo zjištěno, že není schopna jednoduchého, jasného a rychlého jednání. Pro provedení nejjednodušší sendvičové ELISA metody pro stanovení protilátek, musel být její postup pracně optimalizován a po náročné úpravě se muselo přejít k jiným metodám, zejména z důvodu úzkého rozmezí hodnot vhodných pro stanovení. Pro stanovení celkové hladiny IgM se nakonec osvědčila starší, ale jednoduchá precipitační metoda, která ještě nikdy dle dostupných informací ke stanovení protilátek u ryb použita nebyla. Tato metoda sice není tak citlivá jako metoda ELISA, ale její výsledky by určitě měly stačit pro porovnání jednotlivých skupin či faktorů, na což byl hlavně kladen důraz již při zadávání práce. Přesnému stanovení a potvrzení daných výsledků ELISA metodou pro stanovení rybích IgM bych se proto rád věnoval ve svém dalším studiu. Jak již bylo řečeno, stanovení a porovnání hladiny IgM v kapří krvi během cirkanuálního cyklu se zdařilo, navíc kromě vzorků kapra obecného byly získány, díky spolupráci s oddělením Parazitologie Ústavu botaniky a zoologie PřF MU a Ústavem biologie obratlovců AV ČR, další vzorky různě ploidních populací lína obecného a karase stříbřitého. Ryby jsou jako zástupci studenokrevných živočichů velice vázané na teplotu okolního prostředí. Teplota vody je tedy také jedním z hlavních faktorů ovlivňujících imunitní odpověď daného organismu. Nízká teplota okolí působí imunosupresivně (Morvan a kol., 1998). Avtalion (1969) dokonce tvrdí, že imunizované ryby v prostředí, které má teplotu nižší než 14 °C, zastavují produkci protilátek. Rovněž tvrdí, že pokud jsou ryby imunizovány v prostředí s optimální teplotu (25 °C), nárůst protilátek v séru je možný v teplotním rozmezí od 25 °C až do zmiňované hranice 14 °C. Při našem pokusu srovnání celoroční produkce IgM u kapra obecného jsme tedy vycházeli z předpokladu, že hladina IgM bude nejvyšší v jarních a letních měsících a nižší v zimním období (odpovídá naměřeným teplotám vody v jednotlivých měsících – graf 2). Zmiňovanou roční periodicitu testoval ve svém výzkumu na kaprovi obecném rovněž Saha a kol. (2002) a v jeho práci se tento trend potvrdil (viz graf. 1). Naše výsledky taktéž vykazují nárůst hladiny IgM v letních měsících, ovšem ne tak razantní a jednoznačný jako v Sahově práci. Naopak v našich výsledcích, se objevují hodnoty, které příliš nekorelují s teplotou vody v daném období. Tyto výkyvy jsou s největší pravděpodobností způsobeny jinými faktory, které ovlivňují produkci protilátek, potažmo celý imunitní systém ryb, a to hlavně hormonální stav jedince, vliv dřívějších či aktuálních 69

onemocnění a velký vliv na produkci protilátek má také období spojené s třením a vývojem nového potomstva. Některé z rybích steroidních hormonů (kortizol, testosteron) inhibují tvorbu protilátek, a tak jejich zvýšená produkce razantně snižuje celkovou hladinu imunoglobulinů v krvi (Saha a kol., 2004 b). Při onemocnění naopak hladina imunoglobulinů v krvi stoupá. Nejčastěji se ryby nakazí v chladnějších měsících (,,spring viraemia“ kaprů), kdy nemají dostatek protilátek. Nákaza tak vede ke zvýšení koncentrace IgM, což by se za normálních podmínek v chladné vodě nestalo (Morvan a kol., 1998). Během tření (v dubnu) mají kaprovité ryby zvýšenou hladinu IgM v krvi. Díky tomuto faktu jsou v daném období velice odolné vůči nemocem, to platí pouze pro kaprovité ryby, např. lososovité ryby odolné nejsou, ba naopak jsou velice náchylné k onemocněním (Saha a kol. 2002). Suzuki a kol. (1994) přisuzuje tuto zvýšenou obranyschopnost kaprovitých ryb a nárůst koncentrace protilátek dokázanému faktu, že protilátky přecházejí z matčina těla do oplodněných vajíček pro jejich pozdější obranu. Tímto procesem by vznikl matce nedostatek protilátek a ta jej tedy kompenzuje jejich zvýšenou produkcí. U samců by zvýšená produkce IgM v období páření mohla být vysvětlena zvýšenou koncentrací již jednou popsaných steroidních hormonů. Tyto hormony sice vydatně inhibují produkci protilátek, ovšem tato teze neplatí v období páření ani u samic ani u samců. Proces, kterým se toto ovlivnění vypíná, doposud bohužel není znám (Saha a kol. 2002). Možné vysvětlení by mohlo přijít při výzkumu působení dokázané zvýšené koncentrace steroidních hormonů v období tření (indikuje zvýšená koncentrace hormonů vypnutí jejich funkce?). Vypnutí inhibičního účinku steroidních hormonů na produkci protilátek v období tření by tedy mohlo vysvětlovat prokázané zvýšení hladiny protilátek v jarních měsících jak u samic, tak u samců. Saha a kol. (2002) rovněž potvrzuje, že produkce IgM od jara do podzimu není plně závislá na teplotě vody, proto je i v našich výsledcích velká variabilita v rámci jedné populace ve stejném čase. Výzkumů, porovnávajících celkovou hladinu imunoglobulinů u námi sledovaných ryb (kapr obecný, lín obecný, karas stříbřitý) je jen velice málo. Celková hladina proteinů v krvi ryb by se měla pohybovat v rozmezí od 20 - 50 g/l, podle druhu ryby a aktuálního stavu jedince. Mořské ryby mají spíše vyšší celkovou hladinu proteinů v séru (losos 44 g/l, treska 50 g/l), koncentrace imunoglobulinů by se pak u nich měla pohybovat v rozmezí 15 – 20 % z celkových proteinů séra, tzn. kolem 10 g/l (Magnadottir, 1998). Sladkovodní ryby mají spíše nižší hladinu jak celkových proteinů séra, tak i imunoglobulinů. Collazos a kol. (1998) uvádí sezónní dynamiku celkových proteinů plasmy u lína obecného od cca 26 – 45 g/l. Kaprovitá ryba Labeo rohita má podle výzkumu Swaina a kol. (2007) celkovou koncentraci 70

proteinů séra kolem 37 g/l, přičemž imunoglobuliny by měly zabírat opět asi 20 % z celkových proteinů (přibližně 7,4 g/l) (Vilain a kol., 1984). Vilain a kol. (1984) rovněž stanovil celkové proteiny séra i celkovou hladinu imunoglobulinů u všech tří námi sledovaných druhů (tab. 7). Saha a kol. (2002) zjistil při svých výzkumech sezónních změn koncentrace IgM u kapra obecného průměrné hodnoty hladiny imunoglobulinu od cca 2 – 13 g/l v závislosti na ročním období.

Druh Kapr obecný Lín obecný Karas stříbřitý

Celková koncentrace sérových proteinů (g/l) 26,5 42,1 28,0

Celková koncentrace Ig (g/l)

% Ig z celkových proteinů

9,1 4,8 4,7

21,1 18,1 16,8

Tab. 7: celková koncentrace proteinů séra a celková koncentrace imunoglobulinů u kapra obecného, lína obecného a karase stříbřitého (Vilain a kol., 1984) Z našich výsledků (graf 8) mezidruhového srovnání vyplývá, že největší koncentraci imunoglobulinů v krvi má lín obecný, následuje ho kapr obecný a nejnižší koncentraci má karas stříbřitý. Toto pořadí zcela odpovídá hodnotám naměřeným např. ve výzkumu Vilaina a kol. (1984). Karas stříbřitý nebyl chován ve stejných podmínkách (byl chován v laboratorním akváriu) jako kapr obecný a lín obecný (chováni ve venkovních rybnících) a navíc byli také odebírání jeho v průměru o rok mladší jedinci. Z těchto důvodů jej není zcela vhodné srovnávat s ostatními dvěma druhy. Námi změřené hodnoty koncentrace IgM u lína a kapra obecného se však pohybují v mnohem větších hladinách než je tomu v publikovaných výzkumech. Tento fakt by mohl být způsoben právě způsobem chovu. Vilain a kol. (1984) stejně jako Saha a kol. (2002) zpracovávali vzorky z ryb chovaných v umělých nádržích a krmených jednou denně umělou potravou, kdežto naše vzorky pocházely z volně žijících ryb, které přišly do styku s mnoha faktory ovlivňujícími jejich imunitní systém. Také zde může hrát jistou roli použití krevní plasmy místo séra, kdy by spolu s imunoglobuliny mohl být vysrážen také fibrinogen, tuto hypotézu však nepotvrdila elektroforéza. Vliv pohlaví ryb na produkci IgM dosud nebyl prokázán. Většina výzkumů poukazuje na fakt, že mezi samci a samicemi, ať už mořských či sladkovodních ryb, není rozdíl v hodnotách protilátek v krvi (Davis a kol., 1999; Saha a kol., 2002). Naše výsledky tyto 71

výzkumy potvrdily u lína obecného (graf 6), avšak u kapra obecného rozdíly mezi samci a samicemi nalezeny byly (graf 4). Největší rozdíly byly u kapra obecného zaznamenány v srpnu a listopadu, tedy v období kdy, jak již bylo řečeno, ovlivňuje imunitní systém každého jedince více faktorů a ne pouze teplota okolní vody. Po zbytek sezóny již rozdíly mezi jednotlivými pohlavími nebyli takřka vůbec zřetelné, což by odpovídalo dosavadním publikovaným vědeckým poznatkům. Vliv různých ploidií na vývoj a stav imunitního systému včetně produkce protilátek doposud nebyl publikován. Většina výzkumů probíhajících na takto geneticky upravených rybách (línech obecných a karasech stříbřitých) zkoumá jejich parazitaci (viz např. Piačková a Flajšhans, 2006). Díky tomuto faktu není možné naše výsledky porovnávat s žádným předchozím výzkumem. Naše data tedy ukazují, že tyto genetické zásahy (diploidie, triploidie, gynogennost) zřejmě nemají žádný vliv na produkci protilátek u karase stříbřitého, ovšem mohou mít účinek na celkovou hladinu imunoglobulinů u lína obecného (graf 5). Z tohoto grafu vyplývá, že gynogenní populace má lehce zvýšenou hladinu IgM v krvi oproti diploidním a triploidním jedincům. U karase stříbřitého bohužel nebyla gynogenní skupina k dispozici, proto nemůžeme tyto dvě skupiny porovnat. Zvýšená hladina IgM u gynogenní populace může být vysvětlena opět jakousi disbalancí v produkci steroidních hormonů (zapříčiněnou tím, že daná ryba má pouze genom matky), které produkci protilátek vysoce ovlivňují. Vzhledem k tomu, že některé výsledky ne zcela korelují s již dříve prováděnými a publikovanými výzkumy, do budoucna uvažujeme o jejich ověření nově navrhnutou a optimalizovanou ELISA metodou pro stanovení IgM. Doufám, že tato práce přinese prospěch nejen čtenářům zjišťujícím potřebné informace pro zavádění či optimalizaci stejných metod a pomůže jim tak dostat se přes začátečnické banální chyby, kterým jsem se bohužel ani já nevyhnul, ale že bude také přínosem pro lepší poznání imunitního systému sladkovodních ryb.

72

VII. Závěr

73

V této práci byla formou teoretického úvodu zpracována tématika týkající se rybích imunoglobulinů a možnosti jejich stanovení včetně hlubšího pohledu na 4 využívané metody. Podrobněji pak byly popsány postupy, materiál a optimalizace tří námi použitých metod (ELISA, imunoturbidimetrie, ZST). Tyto detailní popisy by mohly přispět k rychlému provedení kterékoliv ze zmíněných metod, při vyvarování se popsaných problémů, a to i při použití jiných vzorků, než byly mnou zvolené. Je však nutné mít na paměti, že jakékoliv zásahy ať už do materiálu, postupu či optimalizace, mohou mít za následek nefunkčnost dané metody nebo v lepším případě pouze její novou zdlouhavou optimalizaci. Během tohoto výzkumu byla metodou srážení síranem zinečnatým (u ryb použita tato metoda nejspíše poprvé) změřena celková koncentrace protilátek v krvi u 284 rybích jedinců (kapr obecný 160 vzorků, lín obecný 92 vzorků, karas stříbřitý a jeho kříženci 32 vzorků). U kapra obecného byla zjištěna sezónní dynamika v produkci IgM a rovněž byla zjištěna rozdílnost v produkci imunoglobulinů při porovnání pohlaví. Na rozdíl od kapra obecného u lína obecného nebyla zjištěna rozdílnost při porovnání koncentrace protilátek v krvi samců a samic. Rozdíly však byly nalezeny při porovnání diploidních, triploidních a gynogenních populací. U karase stříbřitého nebyly nalezeny rozdíly mezi jednotlivými ploidiemi (2n,3n), ani při porovnání jeho kříženců s kaprem obecným a karasem obecným. Dále bylo zjištěno, že nejvyšší průměrnou hladinu IgM v krvi měl lín obecný, dále pak kapr obecný a nejnižší hladinu IgM v krvi měl karas stříbřitý. Jeho jedinci však byli mladší, což mohlo pokus ovlivnit. Získaná data, byla velice variabilní, což zapříčinilo nemalé problémy při prezentaci výsledků, proto byla všechna data vyhodnocena také statisticky, aby byla pozvednuta jejich výpovědní hodnota. Při psaní diskuze jsem se také setkal s malým množstvím výzkumů zabývajících se stejným tématem, proto jsou některá vysvětlení pouze na teoretické úrovni. Naměřené výsledky byly prezentovány na vědecké konferenci Zoologické dny 2009 v Brně (12. – 13. února 2009) formou dvou posterů, které jsou v příloze.

74

Shrnutí přínosů této práce:  Byly použity a optimalizovány 4 metody (ELISA, imunoturbidimetrie, srážení síranem zinečnatým, elektroforéza) pro stanovení rybích imunoglobulinů, nejlepší výsledky nalezeny při použití metody srážení síranem zinečnatým, která byla s největší pravděpodobností vůbec poprvé použita pro stanovení imunoglobulinů u ryb  Byla stanovena koncentrace celkových imunoglobulinů v krvi kapra obecného (Cyprinus carpio), lína obecného (Tinca tinca) a karase stříbřitého (Carassius auratus)  Získané výsledky jsou součástí řešení grantového projektu ve spolupráci s oddělení Parazitologie Ústavu botaniky a zoologie PřF MU a Ústavem biologie obratlovců AV ČR a byly prezentovány formou dvou posterů na konferenci Zoologické dny 2009, viz přílohy.

75

VIII. Použitá literatura

76

Použitá literatura  Ahmad R., Khan A., Javed M.T., Hussain I.: The level of immunoglobulins in relation to neonatal lamb mortality in Pak - Karakul sheep, Vet Arhiv 70, 129-139, 2000.  Arkoosh M.R., Kaattari S.L.: Quantification of Fish Antibody to a Specific Antigen by an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). In:

Techniques in Fish

imunology (Fish Immunology Technical Communications no. 1), 2 nd edition 15-24, SOS Publications, Fair Haven, 1993.  Avtalion R.R.: Temperature effect on antipody production and immunological memory, in carp (Cyprinus carpio) immunized against bovine serum albumin, Immunology 17, 927-931, 1969.  Bag M.R., Makesh M., Rajendran K.V., Mukherjee S.C.: Characterization of IgM of Indian major carps and their cross-reactivity with anti-fish IgM antibodies, Fish Shelfish Immunol 26, 275-275, 2009.  Bollag D.M., Rozycki M.D., Edelstein S.J.: Protein methods. John Wiley & sons Inc., Publication, New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore, 2nd edition, 432 pp, 1996.  Collazos M.E., Ortega E., Barriga C., Rodríguez A.B.: Seasonal variation in haematological parameters in male and female Tinca tinca, Mol Cell Biochem 183, 165-168, 1998.  Crowther J.R.: ELISA: Theory and practice, Humana press Inc., New Jersey, 1995.  Davis C.R., Marty G.D., Adkinson M.A., Freiberg E.F., Hedrick R.P.: Association of plasma IgM with body size, histopathologic ganges, and plasma chemistries in adult Paciffic herring Clupea pallasi, Dis Aquat Organ 38 (2), 125-133, 1999.

77

 Faldyna M., Pechova A., Krejci J.: Chromium Supplementation Enhances Antibody Response to Vaccination with Tetanus Toxoid in Cattle, J Vet Med B50, 326-331, 2003.  Ferenčík M.: Imunochémia, ALFA, Bratislava, 2. Vydání, 1989.  Hořejší V., Bartůňková J.: Základy imunologie, Triton, Praha, 2. vydání, 2001.  Hyršl P.: Změna proteinového spektra zavíječe voskového (Galleria mellonella) a bource morušového (Bombyx mori) během vývoje, rigorózní práce PřF. MU, Brno, 2004.  Kaattari S.L., Piganelli J. D.: The specific immune system: Humoral defense. In: The fis immune system: Organism, Pathogen, and Environment (Iwama G., Nakanishi T.), 207-254. Academic Press, San Diego, 1996.  Kim W.S., Nishizawa T., Yoshimizu M.: Non-specific adsorption of fish immunoglobulin M (IgM) to blocking reagents on ELISA plate wells, Dis Aquat Organ 78 (1), 55-59, 2007.  Lee S.H., Jaekal J., Bae C.S., Chung B.H., Yun S.C., Gwak M.J., Noh G.J., Lee D.H.: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, Single Radial Immunodiffusion, and Indirect Methods for the Detection of Failure of Transfer of Passive Immunity in Dairy Calves, J Vet Intern Med 22, 212-218, 2008.  Lobb C.J., Clem L.W.: Phylogeny of imunoglobulin structure and fiction. In: Fish immunity and parasite infections: from innate immunity

to immunoprophylactic

prospects (Alvarez-Pellitero P.), Vet Immunol Immunopathol 126, 171-198, 2008.  Magnadottir B.: Comparison of imunoglobulin (IgM) from four fish species, Icel Agr Sci 12, 47-59, 1998.  Mančal P.: Metody enzymové imunoanalýzy, Ústav sér a očkovacích látek, Praha, 1987. 78

 Marchalonis J.J.: Isolation and Partial Characterization of Immunoglobulins of Goldfish (Carassius auratus) and Carp (Cyprinus carpio), Imunology 20, 161-173, 1971.  McEwan A.D:, Fisher E.W., Selman I.E., Penhale W.J.: A turbidity test for the estimation of immune globulin levels in neonatal calf serum, Clin Chim Acta 27, 155163, 1970.  Mix E., Goertsches R., Zettl U.K.:Immunoglobulins- Basic Considerations, J Neurol 253, Suppl 5: V9-V17, 2006.  Morvan L.C., Troutaud D., Deschaux P.: Differential effects of temperature on specific and nonspecific immune defences in fish, J Exp Biol 201, 165-168, 1998.  Piačková V., Flajšhans M.: Dlouhodobé sledování zdravotního stavu v monokultuře společně testovaných amfimiktických diploidních, gynogenetických diploidních

a

triploidních línů obecných, Tinca tinca L., Bulletin VÚRH Vodňany 42 (3), 133-141, 2006.  Polson C., Sarkar P., Incledon B., Raguvaran V., Grant R.: Optimization of protein precipitation based upon effectiveness of protein removal and ionization effect in liquid chromatogramy – tandem mass spektrometry, J Chromatogr B785, 263-275, 2003.  Randelli E., Buonocore F., Scapigliati G.: Cell markers and determinants in fish immunology, Fish Shelfish Immunol 25, 326-340, 2008.  Ratcliffe M.J.H.: Antibodies, imunoglobulin genes and the bursa of Fabricius in chicken B cell development, Dev Comp Immunol 30, 101-118, 2006.  Richter C., Lohmann K.: Failure of passive transfer in foals: A review, Large Animal Veterinary Rounds 5 (10), 2005

79

 Saha N.R., Suetake H., Kikuchi K., Suzuki Y.: Fugu imunoglobulin D: a highly unusual gene with unprecedent duplications in its constant region, Immunogenetics 56, 438-447, 2004 a.  Saha N.R., Usami T., Suzuki Y.: In vitro effects of steroid hormones on IgM-secreting cells and IgM secretion in common carp (Cyprinus carpio), Fish Shelfish Immunol 17, 149-158, 2004 b.  Saha N.R., Usami T., Suzuki Y.: Seasonal changes in the immune activities of common carp (Cyprinus carpio), Fish Physiol Biochem 26, 379-387, 2002.  Savan R., Aman A., Nakao M., Watanuki H., Sakai M.: Discovery of a novel immunoglobulin heavy chain gene chimera from common carp (Cyprinus carpio L.), Immunogenetics 57, 458-463, 2005.  Stanček D.: Princípy a aplikácie metódy ELISA při detekcii antigénov a protilátok, Pulsus 3, 39-41, 1993.  Suresh Babu P.P, Shankar K.M., Honnananda B.R., Vijaya Kumara Swamy H.V., Prasanna Shama K., Suryanarayana V.V.S., Dechamma H.J.: Isolation and characterization of immunoglobulin of the Indian major carp, rohu [Labeo rohita (Ham.)], Fish Shelfish Immunol 24, 779 – 783, 2008.  Svobodová Z., Pravda D., Paláčková J.: Jednotné metody hematologického vyšetřování ryb, Výzkumný ústav rybářský a hydrobiologický, Vodňany, 1986.  Suzuki Y., Orito M., Furukawa K., Aida K.: Existence of low molecular weight immunoglobulin M in carp eggs, Fish Sci 60: 159-162, 1994.  Swain P., Dash S., Sahoo P.K., Routray P., Shoo S.K., Gupta S.D., Meher P.K., Sarangi N.: Non-specific immune parameters of brood Indian major carp Labeo rohita and their seasonal variations, Fish Shellfish Immunol 22, 38-43, 2007.

80

 Šmarda J., Doškař J., Pantůček R., Růžičková V., Koptíková J.: Metody molekulární biologie, Masarykova univerzita, Brno, 1. Vydání, 2005.  Štern P.: Současné možnosti turbidimetrie a nefelometrie, Klin Biochem Metab 14 (35), 146-151, 2006.  Toman M. a kol.: Veterinární imunologie, Grada Publishing. spol. s.r.o., Praha, 2000.  Turner R. J.: Immunology – A Comparative Approach, John Wileyand and sons, Ltd., Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore, 101-172, 1994.  Van Muiswinkel W.B.: A history of fis imunology and vaccination I. The early days, Fish Sellfish Immunol 25, 397-408, 2008.  Vejražka M.: Optické metody používané v biochemii, Ústav lékařské biochemie 1. LF UK, Praha, 2008.  Vilain C., Wetzel M.C., Pasquier L.D., Charlemagne J.: Structural and functional analysis of spontaneous anti-nitrophenyl antibodies in three cyprinid fish species: Carp (Cyprinus Carpio), goldfish (Carassius auratus) and tench (Tinca tinca), Dev Comp Immunol Vol. 8, 611-622, 1984.  Zhao Y., Pan-Hammarstrom Q., Yu S., Wertz N., Zhang x., Li N., Butler J. E., Hammorstrom L.: Identification of IgF, a hinge-region-containing Ig class, and IgD in Xenopus tropicalis, PNAS 103 (32), 12087-19092, 2006.

Internetové zdroje  URL1 pathmicro.med.sc.edu/mayer/IgStruct2000.htm  URL2 www.cehs.siu.edu/fix/medmicro/igs.htm  URL3 www.invivogen.com/ressource.php?ID=33  URL4 www.alerchek.com/IgM.htm 81

 URL5 www.indianjournals.com/showdocument.aspx?target=publication&type=article image &id=afcf-2004-1-chap003-fig001.jpg  URL6 http://ciselniky.dasta.mzcr.cz/hypertext/200610/hypertext/ILACB.htm  URL7 http://www.cortecnet.com/stable-isotopes/other/sodium-dodecyl-d25-sulfate98-d.html  URL8 http://www.oaz.cz/web3/dokumenty/u3v/spurny_rybarstvi_v_cr.pdf

82

Přílohy a prezentace výsledků Data získaná během výzkumu byla publikována formou následujících dvou posterů na vědecké konferenci Zoologické dny 2009 (12. – 13. února 2009).

Stanovení celkové hladiny IgM u sladkovodních ryb Vojtek L.1, Vostal K. 1, Šimková A.2, Vetešník L.3, Lamková K.2, Hyršl P. 1 1 Oddělení fyziologie a imunologie živočichů, Ústav experimentální biologie, PřF MU, Brno 2 Parazitologie, Ústav botaniky a zoologie,PřF MU, Brno 3 Ústav biologie obratlovců AV ČR, v.v.i., Brno Imunitní systém ryb je stejně jako imunitní systém obratlovců složen ze specifických a nespecifických složek buněčné a humorální imunity. Hlavní součástí specifické humorální imunity jsou protilátky - imunoglobuliny (Ig). Ig se specificky váží na antigen a zpřístupňují jej ostatním složkám imunitního systému. U ryb se na rozdíl od vyšších obratlovců nachází pouze IgM, kdy tetramerní molekula je nejčastěji tvořena 4 monomery. Pro stanovení Ig ryb se používá velké množství metod (RIA, FIA, EIA, imunoprecipitace,…), které jsou složité na přípravu, časově náročné a díky velké spotřebě monoklonálních protilátek drahé (pro mnoho druhů ryb ani nejsou protilátky dostupné). Srážení síranem zinečnatým (ZnSO4 . 7H2O) je jednoduchá, levná a časově nenáročná metoda, která využívá fyzikálně – chemických vlastností ZnSO4 . 7H2O. Metoda je běžná ve veterinární praxi. ZnSO4 . 7H2O odebírá selektivně imunoglobulinům v roztoku vodu a ty poté z roztoku vypadávají – vzniká sraženina. Metoda je doplněna stanovením bílkovin, kdy se výsledná koncentrace IgM rovná rozdílu mezi bílkovinami obsaženými v celém vzorku a v supernatantu po vysrážení IgM. Pro naše experimenty byla použita plasma kapra obecného (Cyprinus carpio) odebíraná v různých ročních obdobích, lína obecného (Tinca tinca) s různými ploidiemi a karasa stříbřitého (Carassius auratus) s různými ploidiemi včetně kříženců. U kapra obecného byla zjištěna statisticky významná sezónní dynamika hladiny IgM s nejvyššími hodnotami v červnu 20,15 g/l a nejnižšími v srpnu 12,42 g/l. Rovněž byly zaznamenány statisticky významné rozdíly mezi pohlavími, s vyššími průměrnými hodnotami IgM u samic kapra. Diploidní (2n), triploidní (3n) a gynogenní (G) skupiny lína se statisticky neliší, i když G ryby mají průměrně vyšší hladinu IgM než 2n a 3n. 2n a 3n karasi se opět statisticky neliší, i když průměrná hladina IgM 2n je nižší než 3n a kříženců. Tato práce byla podpořena granty GAČR 524/07/0188 a 524/09/P620.

83

Příloha 1: poster Stanovení celkové hladiny IgM u sladkovodních ryb

84

Stanovení vybraných parametrů imunitního systému ryb Buchtíková S., Vojtek L., Hyršl P. Ústav experimentální biologie, Oddělení fyziologie a imunologie živočichů, PřF, MU,Brno Imunitní systém ryb můžeme rozdělit na složku buněčnou a humorální. Buněčná složka nespecifická je tvořena fagocyty a cytotoxickými buňkami, specifická T a B lymfocyty. Humorální imunitu nespecifickou zastupují lektiny, lytické enzymy (např. lysozym) a komplement, specifickou protilátky třídy IgM. Na našem pracovišti měříme z nespecifických složek imunity oxidativní vzplanutí fagocytů v plné krvi, aktivitu komplementového systému v plasmě a koncentraci lysozymu v kožním mukusu. Ze složek specifické imunity stanovujeme koncentraci protilátek IgM. Oxidativní vzplanutí fagocytů se provádí luminiscenční metodou. Plná heparinizovaná krev je po naředění smíchána s luminolem a aktivátorem, který se váže na receptory fagocytů a způsobuje jejich aktivaci. Nejdůležitějšími ukazateli oxidativního vzplanutí fagocytů jsou vrchol luminiscenční kinetické odpovědi, čas jeho dosažení a celkové vyprodukované množství reaktivních metabolitů kyslíku. Ke stanovení aktivity komplementu v plasmě se používá luminiscenční metoda. Využívá rekombinantní bioluminiscenční bakteriální kmen E. coli. Světelná emise vyžaduje přítomnost ATP, produkovaného pouze živými buňkami. Intenzita produkovaného světla odpovídá viabilitě bakterií. Z grafu závislosti luminiscence na čase je odečtena doba potřebná pro usmrcení 50% bakterií. Množství lysozymu lze stanovit in vitro radiální difúzí v agaróze. Na agarové plotny obsahující Micrococcus luteus se nanesou vzorky kožního mukusu nebo kalibrační roztok lysozymu. Průměry projasněných difúzních zón se přepočítají podle kalibrační křivky na mg/ml vzorku. Celkové množství protilátek IgM v rybí plasmě lze stanovit precipitací síranem zinečnatým, který specificky dehydratuje proteiny, ty se odpojí od roztoku a jsou odděleny centrifugací. Množství IgM ve vzorku (v g/l) je pak vypočítáno jako rozdíl mezi celkovým obsahem proteinů a proteinů obsažených v supernatantu po precipitaci a centrifugaci. Tato práce byla podpořena grantem GAČR 524/07/0188.

85

Příloha 2: metodický poster Imunologie ryb

86

Stanovení imunoglobulinů (IgM) u ryb

Recommend Documents