EKSTRAKSI, KARAKTERISASI DAN APLIKASI ENZIM KOLAGENASE D A N ORGAN DALAM IKAN TUNA (Thunnus sp.)
Oleh:
Riri Kumaila C34103016
PROGRAM STUD1 TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PEPTANIAN BOGOR 2008
FUNGKASAN RlFU KUMAILA. C34103016. Ekstraksi, Karakterisasi dan Aplikasi Enzim Kolagenase dari Organ Dalam Ikan Tuna (Thunnus sp.). Dibimbing Oleh TAT1 NURHAYATI dan ELLA SALAMAH. Kolagenase secara umum didefinisikan sebagai enzim yang mampu mendegradasi ikatan polipeptida dari kolagen tetapi tidak mendenaturasi protein. Tujuan umum penelitian ini adalah memanfaatkan organ dalam ikan tuna (Thunnnus sp.) sebagai salah satu sumber enzim kolagenase. Penelitian ini terdiri dari empat tahap, yaitu ekstraksi enzim kolagenase, pemumian enzim kolagenase secara parsial dengan ammonium sulfat, menentukan karakteristik enzim kolagenase, serta aplikasi enzim kolagenase. Ekstraksi enzim kolagenase bertujuan untuk mendapatkan ekstrak kasar enzim kolagenase. Pemurnian enzim kolagenase secara parsial bertujuan untuk mendapatkan enzim kolagenase yang lebih muini dengan nilai aktivitas enzim yang lebih tinggi daripada ekstrak kasarnya. Penentuan karakteristik enzim kolagenase bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum aktivitas enzim kolagenase yang meliputi: pH d m suhu optimum, dan pengaruh ion logam serta inhibitor terhadap aktivitas enzimnya. Aplikasi enzim kolagenase dalam hidrolisat protein kerang hijau bertujuan untuk mengetahui nilai padatan sisa substrat, kadar a-amino nitrogen bebas, dan derajat hidrolisis dari hidrolisat tersebut. Berdasarkan hasil analisis, nilai aktivitas ekstrak kasar enzim kolagenase sebesar 0,030 Ulml, sedangkan enzim kolagenase yang telah diendapkan dengan ammonium sulfat, aktivitas tertinggi pada konsentrasi 70 % sebesar 0,049 Ulml. Enzim kolagenase bekerja optimal pada pH 8 dan suhu 60 OC, dengan nilai aktivitas masing-masing sebesar 0,024 Ulml dan 0,038 U/ml. Pengaruh ion logam yang meningkatkan aktivitas enzim tertinggi terdapat pada penambahan ca2+ sebesar 233,93 %, sedangkan ion logam yang menurunkan aktivitas enzim sebesar 53,72 %. Penambahan inhibitor PMSF terdapat pada penambahan E%a2+ dapat menghambat aktivitas enzim kolagenase, sedangkan penambahan EDTA dan pepstatin mampu meningkatkan aktivitas enzim kolagenase. Aplikasi enzim kolagenase yang dilakukan adalah hidrolisat protein menggunakan kerang hijau. Hasil penelitian menunjukkan, bahwa padatan sisa substrat tanpa penambahan enzim kolagenase rata-rata berkisar antara 4,02 %2,13 %, kadar a-amino nitrogen bebas sebesar 0,156 g 1100 g dan nilai derajat hidrolisis sebesar 0,5065 pada waktu hidrolisis sembilan jam. Sementara itu, padatan sisa substrat pada proses hidrolisis dengan penambahan enzim kolagenase rata-rata berkisar antara 2,43 %-1,32 %, kadar a-amino nitrogen bebas sebesar 0,184 g 1100 g, dan nilai derajat hidrolisis yang terbentuk sebesar 0,5936 pada waktu hidrolisis selama enam jam.
EKSTRAKSI, KARAKTERISASI DAN APLIKASI ENZIM KOLAGENASE DARI ORGAN DALAM IKAN TUNA (Thbhnus sp.)
Skripsi
Sebagai saiah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjaua Perikanan pada Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertadian Bogor
Oleh: Riri Kumaila C34103016
PROGSTUD1 TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2008
:EKSTRAKSI, KARAKTERISASI DAN APLIKASI
Nama NRP
ENZIM KOLAGENASE DARI ORGAN ~ A L A M IKAN TUNA (Tlzunnussp.) : Riri Kumaila : C34103016
Menyetujui, Pembimbing I
Dr. Tati Nurhavati, S.Pi. M.Si NIP. 132 149 436
Tanggal Lulus: 15 Januari 2008
Pembimbing I1
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi saya yang berjudul
Ekstraksi, Karakterisasi, dan Aplikasi Enzim Kolagenase dari Organ Dalam Ikan Tuna (Tlrniznus sp.) adalah hasil karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau kutipan dari kxya yang diterbitkan maupun yang tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam D&ar Pustaka di bagian akhir skripsi.
Bogor, Januari 2008
Riri Kumaila C34103016
KATA PENGANTAR Puji dan syukw penulis ucapkan kepada Allah SWT atas limpahan rahrnat dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi dengan judul
Ekstraksi, Karakterisasi dan Aplikasi Enzim Kolagenase Dari Organ Dalam Ikan Tuna (TItrt~znussp.).
Skripsi ini merupakan salah satu syarat unhk
memperoleh gelar Sarjana di Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini terlaksana atas bantuan dana dari Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional dalam Program Kreativitas Mahasiswa bidang penelitian pada tahun 2007. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang sebesarbesarnya kepada semua pihak yang telah membantu dalam penulisan skripsi ini, terutama kepada: 1. Ibu Dr. Tati Nurhayati, S.Pi, M.Si dan Ibu Dra. Ella Salamah, M.Si selaku komisi pembimbing, atas segala bimbingan dan pengarahan yang diberikan kepada penulis dalam menyelesaikan tugas akhir ini. 2. Ibu Ir. Hj. Komariah Tampubolon, MS dan Ibu Dr. Ir. Sri Purwaningsih, M.Si, selaku dosen penguji tamu atas masukan dan sarannya kepada penulis. 3. Orang Tua, kakak serta adik-adik tercinta, atas seinua dukungail dan kasih
sayang yang diberikan, baik moril maupun materil serta doa yang selalu mengalir tanpa henti kepada penulis. 4. Ibu Ema, Ibu Ana, Ibu Ika, Ibu Sri, Pak Wahid, Kak Zacky, Kak Ipul dan Mbak Ari selaku laboran atas segala bantuannya.
5. Teman-teman satu bimbingan: Fikri, Indra, Merry, Ditya dan Mbak Elin. Teriina kasih atas kebersamaan dan bantuannya kepada penulis selanla melaksanakan penelitian.
6. Teman-teman terbaikku: Elfira, Anggita, Fenti, Isti, Dian, Rama, Nelly, Chipa, Wiwid, Ikbal, dan Deby. Terima kasih atas persahabatan yang telah terjalin, semoga bisa tetap bertahan sarnpai nanti dan seterusnya.
7. Sahabat-sahabatku: Dian, Merry, Nita, Wida, Lusi, Johan, Pisuko, Angling, Lisda, Andri, dan Bangun. Terima kasih atas bantuannya selama seminar dan sidang. 8. Teman-teman "Mobster Crew". Terima kasih sudah menjadi keluarga kedua buat penulis.
9. THPers 40. Terima kasih atas kekompakan, kebersamaan, dan dukungan selama empat tahun ini. 10. Adik-adik kelasku (THP 41, THP 42 dan THP 43) atas semangat dan dorongan kepada penulis untuk segera menyelesaikan seminar dan sidang. 11. Semua pibak yang telah membantu penulis selama penelitian dan penyusunan skripsi, yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu. Penulis menyadari bahwa di dalam skripsi ini masih terdapat banyak kekurangan. Oleh sebab itu, penulis mengharapkan hitik dan saran yang bersifat membangun demi penyempurnaan skripsi ini.
Semoga skripsi ini dapat
bermanfaat bagi pembaca dan kemajuan Teknologi Hasil Perairan. Bogor, Januari 2008
Riri Kumaila
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bengkulu pada tanggal 23 Mei 1985 dari pasangan Drs. Ahmad Kashmir, SKM dan Magdalena.
Penulis mempakan anak kedua dari empat
bersaudara. Pendidikan formal penulis diawali di Taman KanakKanak Pertiwi I Kotamadya Bengkulu pada tahun 1990, dilanjutkan ke pendidikan dasar di Sekolah Dasar Negeri 01 Kotamadya Bengkulu pada Tahun 1991. Kemudian pada tahun 1997 penulis melanjutkan pendidikan Sekolah Menengah Pertama di SLTP Negeri 1 Kotamadya Bengkulu d m pada tahun 2000 penulis melanjutkan pendidikan Sekolah Menengah Atas di SMA Negeri 5 Kotamadya Bengkulu. Pada tahun 2003, penulis diterima menjadi mahasiswa lnstitut Pertanian Bogor pada Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Selama kuliah, penulis aktif di organisasi Himpunan Profesi Mahasiswa Hasil Perikanan (HIMASILKAN) dan kegiatan kepanitiaan serta mengikuti pelatihan-pelatihan. Selain itu penulis juga aktif sebagai asisten dosen mata kuliall Dasar-Dasar Mikrobiologi Hasil Perikanan (2005-2006) dan Rekayasa Proses Pengolahan Hasil Perairan (2006-2007), Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Penulis pernah mengikuti Program Kreativitas Mahasiswa (PKM) pada tahun 2006 dan tahun 2007. Pada tahun 2006, penulis magang di Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, Departemen Kelautan dan Perikanan. Penulis melakukan penelitian dan penulisan skripsi sdengan judul
Ekstraksi, Karakterisasi dan Aplikasi Enzim Kolagenase Dari Organ Dalam Ikan Tuna (Tltunnus sp.) dibawah bimbingan Dr. Tati Nurhayati, S.Pi, M.Si dan Dra. Ella Salamah, M.Si.
DAFTAR IS1
Halaman
DAFTAR TABEL .........................................................................................
xi
DAFTAR GAMBAR ..........................................................................................
xn
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................
xiii
..
1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ..................................................................................
1
1.2 Tujuan .....................................................................................................
2
2. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Deskripsi dan Klasifikasi Ikan Tuna (Thunnus sp.) ...............................
4
2.2 Limbah Ikan ............................................................................................
5
2.3 Kolagen ...........................................................................................
6
2.4 Enzim .....................................................................................................
7
2.5 Kolagenase .............................................................................................
8
-)
2.6 Ekstraksi dan Pemurnian Enzim ..............................................................
b'
2.7 Kwakteristik Biokimia Enzim ................................................................
11
2.7.1 pH optimum ................................................................................ 2.7.2 Suhu optimum ............................................................................... 2.7.3 Ion logam .................................................................................... . .. 2.7.4 Senyawa lnlnbltor .........................................................................
11 12 13 14
2.8 Aplikasi Enzim dalam Hidrolisis Protein ..............................................
14
3. METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat ..............................................................................
17
3.2 Bahan dan Alat .................................................................................
17
.. 3.3 Metode Penel~tlan......................................................
....................... 18 3.3.1 Pembuatan kolagen sebagai substrat (Modifikasi Lestari 2005) ... 18
3.3.2 Ekstraksi enzim kolagenase dari organ dalam ikan tuna (Thunnus sp.) (Moore dan Stein 1954 diacu dalam Kim et al. 2001) ............................................................................. 3.3.3 Pengendapan (presipitasi) enzim kolagenase (Moore dan Stein 1954 diacu dalam Kim et al. 2001) .............................................. . . 3.3.4 Karaktensasi enzim kolagenase .................................................. (1). Penetapan pH dan suhu optimum aktivitas enzim (Moore dan Stein 1954 diacu dalam Park et al. 2002) ...................... (2). Pengar& kation terhadap aktivitas enzim (Moore dan
18 19 19 19
Stein 1954 diacu dalam Park et a1. 2002) ............................. (3). Pengaruh beberapa senyawa inhibitor terhadap aktivitas enzim .................................................................................... 3.3.5 Aplikasi enzim dalam hidrolisis protein kerang hijau (Modifikasi Hidayat 2005) ............................................................ .. 3.3.6 Analls~s.......................................................................................... (1). Aktivitas enzim kolagenase (Moore dan stein 1954 diacu dalanl Park et al. 2002) ........................................................ (2). Pengukuran konsentrasi protein (Metode Bradford ) (Hanmond dan Krager 1988 diacu dalam Walker 1988) ..... (3). Total nitrogen (AOAC 1995) ............................................... (4). Kadar a- amino nitrogen bebas (Sudarmadji et a1. 1989) .... 3.5 Analisis Data
..........................................................................................
24
4 . HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Ekstraksi dan Pemekatan Enzim dengan Pengendapan Amonium Sulfat .................................................................................
. .
4.2 Karakterisas~Enzim .......................................................................... 4.2.1 pHoptimum ................................................................................. 4.2.2 Suhu optimum ................................................................................ 4.2.3 Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim ............................... 4.2.4 P e n g a d inhibitor terhadap aktivitas enzim .................................
.
.
4.3 Apl~kaslEnzim ........................................................................................ 4.3.1 Aktivitas enzim kolagenase terhadap substrat .............................. 4.3.2 Kadar a-amino nitrogen bebas...................................................... 4.3.3 Derajat hidrolisis protein ...............................................................
25 30 30 32 33 36 39 39 41 43
5. KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan ...........................................................................................
46
5.2 Saran ................................................................................................
46
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................
47
LAMPIRAN ........................................................................................................
51
DAFTAR TABEL Nomor
Teh
Haiaman
1. Komposisi kimia limbah tuna berdasarkan bagian tubuh ............................ 5 2. Parameter nilai aktivitas enzim kolagenase .................................................30
DAFTAR GAMBAR Nomor
Teks
Halaman
2. Presentase rata-rata ikan yang telah disiangi .............................................
6
3. Aktivitas enzim pada berbagai konsentrasi amoniurn sulfat ....................... 26
4 . Konsentrasi protein pada berbagai konsentrasi amonium sulfat ..................26 5. Perbandingan aktivitas enzim antara filtrat kasar dan pengendapan pada 70 % kejenuhan amonium sulfat .................................. 28
..................................................... 31 Nilai aktivitas enzim pada berbagai suhu ................................................... 32 Pengaruh beberapa ion logam terbadap aktivitas enzim ............................ 34 Pengaruh beberapa ion logam terhadap aktivitas relatif enzim ................... 34 Pengaruh inhibitor terhadap aktivitas enzim .............................................. 36 Pengaruh inhibitor terhadap aktivitas relatif enzim .................................. 37 Hasil pengukuran padatan sisa hidrolisis kerang hijau .............................. 40 Kurva peningkatan kadar a-amino nitrogen bebas ...................................... 41 Kurva derajat hidrolisis substrat ................................................................. 43
6. Nilai aktivitas enzim pada berbagai pH 7. 8.
9. 10. 11. 12. 13. 14.
DAFTAR LAMP
1. Bahan-bahan untuk pengukuran aktivitas enzim kolagenase (Moore dan Stein 1954 diacu dalam Park et a1. 2002) .............................. 52 2
Pengendapan amonium sulfat (Bollag dan Edelstein 1991) ...................... 53
................ 54 4. Prosedur pengukuran aktivitas enzim kolagenase ..................................... 54 5. Kurva standar penentuan konsentrasi protein ........................................... 54 6. Grafik uji homogenitas ragam dan analisis statistik untuk nilai aktivitas enzim dalam supematan ................................................................ 57 6a. Grafik uji homogenitas ragam nilai aktivitas enzim dalam supematan ....... 57 6b. Tabel statistik deskriptif nilai aktivitas enzim pada supematan ..................57 6c. Hasil uji ragam (ANOVA) nil& aktivitas enzim pada supematan ..............57 6d. Uji Lanjut Tukey ....................................................................................... 58 3. Pengendapan amonium sulfat yang digunakan dalam penelitian
7. Grafik uji homogenitas ragam dan analisis statistik untuk nilai aktivitas enzim dalam endapan ...................................................................59 7a. Grafik uji homogenitas ragam nil& aktivitas enzim dalam endapan ...........59
7b. Tabel statistik deskriptif nilai aktivitas enzim pada endapan ...................... 59 7c. Hasil uji ragam (ANOVA) nilai aktivitas enzim pada endapan .................. 59
..
7d. Uji Lanjut Tukey
......................................................................................... 60
8. Hasil analisis dan uji statistik (ANOVA) untuk nilai padatan sisa substrat hidrolisis protein kerang hijau .................................................... 61 8a. Grafik uji homogenitas ragam nilai padatan sisa substrat hidrolisis .. protein kerang hqau ....................................................................................61 8b. Rata-rata nilai padatan sisa substrat hidrolisis protein kerang hijau ......... 61 8c. Hasil uji ANOVA padatan sisa substrat pada hidrolisis protein .. kerang hqau .........................................................................................
61
9. Hasil analisis dan uji statistik (ANOVA) untuk nilai a-amino nitrogen bebas hidrolisis protein kerang hijau ...........................................
63
9a. Grafik uji homogenitas ragam nilai a-amino nitrogen bebas hidrolisis protein kerang hijau ................................................................................... 63 9b. Rata-rata nilai a-amino nitrogen bebas hidrolisis protein kerang hijau
.... 63
9c. Hasil uji ANOVA nilai nilai a-amino nitrogen bebas hidrolisis .. protein kerang hqau ....................................................................................63
..
9d. UJI Lanjut Tukey .......................................................................................
64
10. Hasil analisis dan uji statistik (ANOVA) untuk nilai derajat hidrolisis pada hidrolisis protein kerang hijau ..........................................................
65
10a. Grafik uji homogenitas ragarn nilai derajat bebas hidrolisis .. protein kerang hgau ...................................................................................65 lob. Rata-rata nilai derajat hidrolisis pada hidrolisis protein kerang hijau ........ 65 10c. Hasil uji ANOVA derajat hidrolisis pada hidrolisis .. protein kerang hqau ...................................................................................66
1.1. Latar Belakang Enzim merupakan senyawa protein yang dihasilkan oleh sel-sel hidup untuk mengkatalis reaksi-reaksi biokimia di dalam sel hidup. Selain itu, enzim juga dapat mempercepat suatu reaksi kimia atau biokimia tanpa mempengaruhi produk akhir sehingga disebut sebagai biokatalisator (Lehninger 1993). Dewasa ini, penggunaan enzim banyak dimanfaatkan dalam industri pangan maupun non-pangan.
Enzim sebagai biokatalisator alami dalam
konsentrasi kecil sudah dapat bekerja terhadap substrat tanpa membentuk produk samping yang tidak diinginkan.
Fungsi enzim dalam mempercepat reaksi
memberikan keuntungan bagi industri, ha1 ini disebabkan oleh sifat kerja enzim yang selektif dan memiliki daya katalitik yang tinggi, sehingga dapat digunakan dalam jumlah yang sedikit, dengan demikian dapat menghemat waktu dan biaya. Sifat enzim yang alami, ekonomis serta penggunaannya yang efektif dan efisien menimbulkan suatu pemikiran dalam mencari dan menemukan enzim barn yang memiliki karakteristik unik terutama yang bersumber dari hasil perairan. Total potensi lestari sumberdaya perikanan Indonesia mencapai 6,19 juta ton per tahun. Sampai saat ini diperkirakan ada 28.400 jenis ikan di dunia, dan yang ditemukan di perairan Indonesia lebih dari 25.000 jenis.
Walaupun
demikian, jenis ikan yang dapat dimanfaatkan sebagai bahan pangan jumlahnya terbatas, yaitu sekitar 1-5 %, ikan hias kurang dari 1 %, dan selebihnya diperkirakan berperan dalam sistem rantai makanan di ekosistem perairan. Salah satu komoditas ikan penting di Indonesia adalah jenis ikan pelagis besar termasuk di dalamnya adalah ikan tuna (Direktorat Pengolahan Hasil2006). Kajian BRKP DKP dan LIP1 pada tahun 2001 menyebutkan bahwa potensi produksi ikan tuna dan cakalang adalah 1.165,36 ribu ton, produksi rata-rata 736.170 ton, serta pemanfaatannya sudah mencapai 78,97 % (Direktorat Pengolahan Hasil 2006). Hingga saat ini, sebagian besar ikan tuna dipasarkan dengan tujuan ekspor.
Ikan tuna nlerupakan komoditi ekspor kedua terbesar
setelah udang dengan nilai total ekspor tuna sebesar 94.221 ton, sedangkan nilai total ekspor udang sebesar 142,097,998 ton pada tahun 2004 (DKP 2005).
Pemanfaatan tuna umumnya diolah menjadi tuna loin, tuna saku, burger tuna, breaded tuna burger, permen tuna, abon tuna, tuna pico, sosis tuna, tuna stick, tuna handloaf, dan tuna kaleng (Direktorat Pengolahan Hasil 2006). Sebagian besar aneka olahan ikan tuna tersebut hanya memanfaatkan bagian daging putih saja, sedangkan bagian tubuh yang lainnya seperti kepala, ekor, sirip, tulang, dan isi perut belum termanfaatkan secara optimal. Salah satu cara untuk mengatasi sisa olal~an tersebut adalah dengan menkonversi limbah menjadi produk yang mempunyai nilai tambah sehingga memiliki nilai jual yang tinggi secara ekonomis. Sebagai bahan pangan hewani, setiap bagian dari ikan merupakan komponen organik yang seharusnya masih bisa dimanfaatkan bagi kepentingan hidup manusia.
Pengembangan teknologi pemanfaatan limbah industri hasil
perikanan sangat dibutuhkan untuk menjawab kebutuhan konsumen pangan masyarakat. Organ dalam ikan tuna merupakan salah satu limbah industri yang masih bisa dimanfaatkan karena banyak mengandung protease, salah satunya adalah sebagai sumber enzim kolagenase. Kolagenase secara m u m didefinisikan sebagai enzim yang mampu mendegradasi ikatan polipeptida dari kolagen tetapi tidak mendenaturasi protein (Kim et al. 2002). Kolagenase merupakan jenis enzim hidrolisis yang mempunyai banyak kegunaan dan aplikasinya dalam industri, obat-obatan, dan riset. Enzim ini dalam pengolallan perikanan digunakan dalam penyamakan kulit ikan, penghilangan membran, dan hidrolisat protein (Bjarnason 2001). Kolagenase yang telah diisolasi diantaranya berasal dari pyloricaeca ikan yellowtail (Yoshinaka et al. 1977 diacu dalam Shahidi dan Botta 1994), dan mackerel (Pan et al. 1986 diacu dalam Shahidi dan Botta 1994), bagian pankreas catfish Parasilarus asotus, (Yoshinaka el al. 1986, 1987 diacu dalam Kim et al. 2002) serta bagian organ pencernaan yang terdapat pada 19 spesies ikan (Yoshinaka et al. 1978 diacu dalam Shahidi dan Botta 1994). 1.2.
Tujuan Tujuan umum penelitian ini adalah memanfaatkan organ dalam ikan tuna
(Thunnus sp.) sebagai salah satu sumber enzim kolagenase.
Tujuan khususnya adalah:
(1). mendapatkan ekstrak kasar enzim kolagenase dari organ dalam ikan tuna (Thunnus sp.);
(2). mendapatkan enzim kolagenase yang telah dimurnikan secara parsial menggunakan amonium sulfat;
(3). mendapatkan informasi tentang karakteristik enzim kolagenase yang telah dimurnikan secara parsial menggunakan amonium sulfat dengan konsentrasi kejenuhan terbaik;
(4). mengaplikasikan enzim kolagenase dalam pembuatan hidrolisat protein kerang hijau.
2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Deskripsi dan Ktasifikasi Ikan Tuna (Thunnus sp.) Ikan tuna mempunyai bentuk tubuh seperti cerutu, dua sirip punggung, sirip depan biasanya pendek dan berpisah dari sirip belakang, mempunyai jari-jari tambahan di belakang sirip dubur. Sirip dada terletak agak ke atas, sirip perut kecil, sirip ekor bercagak agak dalam dengan jari-jari penyokong menutupi seluruh ujung hipural. Tubuh ikan tertutup oleh sisik-sisik kecil berwama biru tua dan agak gelap pada bagian atas tubuhnya.
Sebagian besar meiniliki sirip
tambahan yang berwanla kuning cerah dengan pinggiran yang berwama gelap (Ditjen Perikanan 1983). Ikan tuna termasuk ke dalam kelas teleostei dan termasuk dalam perenang yang cepat, yang dapat meneinpuh 50 W j a m . Tuna memakan ikan-ikan kecil dan plankton yang terdapat disekitarnya. Ikan tuna bidup bergerombol atau pun individual. Klasifikasi ikan tuna menurut Saanin (1984) adalah sebagai berikut: Filum
: Chordata
Subfilunl
: Vertebrata
Kelas
: Pisces
Subkelas
: Actiiiopterygii
Ordo
: Perciformes
Subordo
: Scombroidei
Famili
: Scombridae
Subfamili
: Scombrinae
Genus
: Thunnus
Spesies
: Thunnus sp.
Gambar 1. Thunnus sp.
2.2. Limbah Ikan Sebagian besar
kegiatan perikanan, baik
penangkapan maupun
pengolahan, memberikan hasil samping atau limbah yang masih dapat dimanfaatkan lebih lanjut. L i b a h merupakan suatu hasil samping produksi yang belum mempunyai nilai ekonomi atau dengan kata lain nilai ekonominya masih rendah. Limbah merupakan salah satu komponen pencemar lingkungan, bahkan dapat dikatakan sebagai suatu pemborosan bila tidak dimanfaatkan. Pemanfaatan limbah melalui suatu proses pengolahan lebih lanjut akan memberikan nilai tambah bagi limbah itu sendiri (Poemomo 1992). Limbah perikanan adalah ikan yang terbuang, tercecer, dan sisa olahan yang pada suatu saat di tempat tertentu belum dapat dimanfaatkan secara ekonomis. Oleh karena itu, perlu suatu usaha pengolahan limbah hasil perikanan agar dapat dimanfaatkan bagi manusia baik secara langsung maupun tidak langsung.
Usaha tersebut juga dapat memperkecil dampak negatif limbah
terhadap masalah lingkungan (Poemomo 1992). Limbah pengolahan tuna dihasilkan pada pengolahan pengalengan, pembekuan, dan pengolahan tradisional. Umutnnya industri pengolahan tuna menghasilkan limbah industri yang cukup besar karena tuna terrnasuk komoditas penting setelah udang. Berdasarkan bagian tubuh ikan, komposisi kimia limbah ikan secara umum sangat bervariasi tergantung bagiannya sebagaimana terlihat pada Tabel 1. Tabel 1. Komposisi kimia limbah ikan berdasarkan bagian tubuhnya Bagian tubuh
Air (%)
Abu (%)
Protein (%)
Lemak (%)
Kepala
63,3
7,6
19,9
72
Tulang
56,4
11,4
17,5
12,5
Sirip
47,3
1O,O
26,0
7,6
Organ dalarn
68,l
4,7
26,s
61
Kulit
55,2
4,1
27,5
13,2
Sumber : Bykov 1986 diacu dalam Lestari (2001).
Umumnya industri pengalenagn tuna menghasilkan linlbah industri yang cukup besar. Limbah ikan tuna dapat berupa kepala, daging merah, isi perut, sirip,
d ~ u idan , tulang. Selain itu, juga dihasilkan limbah cair berupa air bekas mencuci ikan tuna, cairan tubuh ikan, dan lelehan es (Santoso 1998). Limbah yang dihasilkan tersebut ada yang dapat dijadikan bahan untuk membuat makanan hewan peliharaan dan juga digunakan untuk produksi tepung ikan @sh meal). Pemanfaatan limbah ini ditujukan untuk mendapatkan hasil guna dan daya guna sebesar mungkm tanpa mengganggu kelestarian lingkungan. Dalam proses pengolahan biasanya ikan disiangi dengan membuang bagian kepala, ekor, sirip, jeroan dan bagian lainnya selain daging. Rata-rata ikan yang telah disiangi tersebut menghasilkan daging (filley) 50 %, kepala 20 %, dan jeroan 13,38 % (Trilaksani dan Riyanto 2006).
Presentase rata-rata yang
dihasilkan dari proses tersebut secara lengkap disajikan pada Gambar 2.
Gambar 2. Presentase hasil rata-rata dari proses penyiangan ikan 2.3. Kolagen Salah satu komponen limbah perikanan adalah kulit. Secara umum di dalam kulit banyak mengandung protein serabut kolagen yang mempunyai daya tenggang amat tinggi. Kolagen merupakan jaringan ikat yang terdiri dari serat protein kolagen dan elastin yang mengandung polisakarida dan bermacam-macam komponen organik dan anorganik. Kolagen memiliki komposisi asam amino yang unik. Sekitar satu pertiga asam amino yang terkandung adalah glisin, 6-10 % hidroksiprolin dan 10-12 % prolin. Glisin, hidroksiprolin dan prolin merupakatl komponen yang memberikan stabilitas termal pada kolagen.
Molekul dasar peinbentuk kolagen disebut
tropokolagen, yang mempunyai struktur batang dengan berat molekul (BM) 300.000 dan di dalamnya terdapat tiga rantai polipeptida yang sama panjang
membentuk struktur heliks. Kolagen terdapat di jaringan dalam bentuk heliks tripel, yaitu molekul tropokolagen yang dideretkan menurut susunan yang bergantian, seperempat panjang tumpang tindih membentuk fibril. Fibril ini kemudian bertumpuk berlapis-lapis membentuk jaringan ikat (de Man 1997). Sifat fisik dan karakteristik dari kolagen adalah kolagen murni bersifat sangat sensitif terhadap reaksi enzim dan kirnia.
Perlakuan alkali dapat
menyebabkan kolagen mengembang dan menyebar, kemudian dapat dikonversi menjadi gelatin. Selain dalam pelarut alkali, kolagen juga larut dalam pelarut asam. Asam mampu merubah serat kolagen tripel heliks menjadi rantai tunggal, sedangkan larutan perendaman basa hanya mampu menghasilkan rantai ganda pada waktu perendaman yang sama Cjumlah kolagen yang terhidrolisis oleh larutan perendaman yang asam lebih baik daripada basa) sehingga waktu yang diperlukan oleh larutan basa untuk menghidrolisis kolagen menjadi lebih lama (Bennion 1980 diacu dalam Wiratmaja 2006) Pemanasan kolagen secara bertahap akan menyebabkan kerusakan struktur dan pemisahan rantai penyusun. Pada saat suhu pemanasan mencapai 40 OC, terjadi pemutusan ikatan hidrogen dan ikatan hidrofobik yang menstabilkan struktur tripe1 heliks kolagen sehingga struktur kolagen tersebut aka11 berubah menjadi satu, dua atau tiga molekul rantai acak (Wong 1989 diacu dalan Wijaya 2001). Berat molekui, bentuk, dan konfom~asilarutan kolagen bersifat sensitif terhadap perubahan temperatur yang dapat menghancurkan makromolekulnya. Proses denaturasi struktur kolagen berlangsung relatif lambat bila dibandingkan dengan protein lainnya. Hal tersebut berhubungan dengan reaksi isomerasi cistrans yang sangat lambat pada prolin (Wong 1989 diacu dalam Wijaya 2001). 2.4. Enzim Enzim merupakan unit fungsional dari metabolisme sel. Unit ini bekerja dengan urutan yang teratur. Enzim nlengkatalis ratusan reaksi bertahap yang mengurai molekul nutrien, reaksi yang menyimpan dan mengubah energi kimiawi, dan yang membuat makromolekul sel dari prekursor sederhana (Lehninger 1993). Enzim bersifat sangat aktif. Pada reaksi-reaksi tertentu hanya diperlukan beberapa molekul enzim saja untuk mengkatalisis sejumlah substrat. Hal ini
dimungkmkan karena protein enzim dapat direaksikan secara berulang-ulang. Kerja enzim dimulai saat molekul enzim berikatan dengan substrat, kemudian mengubahnya menjadi produk dalam waktu yang singkat. Produk yang terbentuk selanjutnya dilepaskan kembali. Enzim yang telah bebas dapat dipakai untuk mengikat molekul substrat lainnya (Suhartono 1989). Enzim adalah suatu protein yang bertindak sebagai katalisator reaksi biologis, atau lebih sering disebut sebagai biokatalisator.
Enziln dapat
mengkatalis suatu reaksi tanpa adanya pembentukan produk samping dan biasanya sifat katalitik enzim lebih besar dari katalisator sintetik (Muchtadi et al. 1992). Enzim sebagai biokatalisator memiliki sifat-sifat tertentu selain sifat alamiah protein yang menyusun enzim, seperti kondisi yang sangat dipengaruhi oleh suhu, pH, pelarut, dan faktor-faktor lingkungan lainnya. Selain itu, karena merupakan protein, maka aktivitas katalitik enzim akan sangat tergantung pada struktur primer, sekunder, dan juga tersiemya. Aktivitas enzim dapat berubah jika terdenaturasi oleh panas, perlakuan pH yang menyimpang, ataupun senyawa perusak lainnya (Lehninger 1993). Enzim dapat meningkatkan kecepatan reaksi tanpa mengubah dirinya sendiri. Enzim dapat terikat secara kovalen dengan substrat untuk sementara waktu dalam reaksi kimia, tetapi pada akhir reaksi, enzim dapat menjadi bahan dan dibentuk kembali dengan sifat-sifat yang sama seperti sebelum terjadi reaksi dengan substrat, sehingga molekul enzim tidak berubah sifatnya (Suhartono 1989). Sifat lainnya dari enzim adalah kemampuannya untuk tidak mengubah konstanta kesetimbangan reaksi kimia.
Enzim hanya dapat meningkatkan
kecepatan reaksi menuju keadaan seimbang, sehingga sifat-sifat termodinamika sistem tidak berubah. Molekul e ~ u i ~sangat n selektif, walaupun spesifitasnya sangat beragam. Beberapa enzim juga memiliki spesifitas yang hampir absolut bagi substrat tertentu, dan tidak akan bekerja terhadap lnolekul yang sangat serupa (Anonim 2006). 2.5. Kolagenase Protease adalah enzim yang bekerja dengan substrat protein, dan karena protein banyak jenisnya maka protease dapat dibagi ke dalam 2 kelompok yaitu
endopeptidase dan eksopeptidase. Endopeptidase dan eksopeptidase terdapat baik sebagai enzim intraseluler maupun ekstraseluler (Affandi 2005). Umumnya protease terdapat di dalam organ dalam (isi perut) ikan terutama pada bagian organ yang berhubungan dengan pencema&' makanan. Organ tersebut misalnya lambung, usus, pyloric caeca dan kelenjar pankreas Salah satu jenis enzim protease yang terdapat di dalam organ dalam (isi perut) ikan adalah enzim kolagenase. Kolagenase secara m u m didefinisikan sebagai enzim yang mampu mendegradasi ikatan polipeptida. Enzim ini dibagi menjadi dua tipe yang berbeda berdasarkan pada fungsi fisiologisnya. Serin kolagenase terlibat dalam produksi hormon dan fmakologi-peptida aktif, sebagai fungsi seluler. Fungsi tersebut meliputi pencemaan protein, penggumpalan darah, fibrinolisis, aktivasi kompleks, dan fertilisasi (Neurath 1984; Bond and Van Wart 1987 diacu dalam Park et al. 2002). Enzim tipe ini juga secara luas digunakan dalam industri kimia, industri obat, makanan dan eksperimen biologi molekuler. Tipe kedua adalah metallokolagenase terdiri dari zinc yang mengandung enzim yang membubhkan kalsium untuk kestabilan (Stricklin et al. 1977 diacu dalam Park et al. 2002). Selain itu, metallokolagenase termasuk dalam enzim ekstraseluler yang terlibat dalam pembentukan kembali matriks ekstraseluler dengan berat molekul yang bervariasi dari 30 hingga 150 kDa. Jenis enzim ini telah banyak dipelajari dari berbagai jaringan mamalia (Sellers dan Murphy 1981; Harris danVater 1982 diacu dalam Park et al. 2002), dari bakteri (Bond and Van Wart 1984; Matsuhita et al. 1994 diacu dalam Park et al. 2002) dan bisa ular (Bjarnason dan Fox 1994 diacu dalam Park et al. 2002). 2.6. Ekstraksi dan Pemumian Enzim Pemisahan medium yang mengandung e ~ u i mdari sel dilakukan dengan cara sentrifugasi dingin untuk mencegah denaturasi enzim. Filtrat media yang illengandung enzim (ekstrak kasar) memiliki aktivitas enzimatik yang rendah dan zat pengotor yang cukup banyak. Tahap pemurnian setelah didapatkan filtrat enzim hasil sentrifugasi atau penyaringan adalah mernisalkan protein dari campuran tersebut.
Salah satu
tujuan pemurnian enzim adalah untuk memperoleh preparat mumi protein yang
dapat digunakan untuk menentukan komposisi dan deret asam amino (Lehninger 1993) atau dengan kata lain tujuan dari pemurnian enzim adalah untuk memisahkan enzim yang diinginkan dari enzim lain atau protein lain yang tidak diinginkan. Secara umum pemurnian enzim dilakukan dalam beberapa tahap, yaitu: ekstraksi atau isolasi enzim, pengendapan protein, sentrifugasi, dialisis, kromatografi d m terakhir dilakukan kristalisasi serta imobilisasi enzim (Scope 1987). Presipitasi atau pengendapan merupakan metode yang berguna untuk pemekatan enzim yang didasarkan atas perbedaan kelarutan. Presipitasi dilakukan dengan penambahan garam atau pelarut organik lain pada larutan enzim. Presipitasi menggunakan amonium sulfat memiliki beberapa keuntungan, yaitu mempunyai kelarutan tinggi, tidak bersifat toksik, murah dan stabilitasnya terhadap enzim karena tidak m e m p e n g d i struktur protein (Webb dan Dixon 1979). Presipitasi dilakukan dengan cara menambahkan amonium sulfat ke dalam ekstrak kasar enzim sedikit demi sedikit pada suhu rendah sambil diaduk secara perlahan. Hal ini dilakukan karena pengadukan dapat menyebabkan peningkatan suhu yang dapat berakibat terjadinya denaturasi protein. Pengadukan juga harus dilakukan dengan kecepatan rendah untuk menghindari timbulnya buih yang dapat menyebabkan denaturasi protein.
Kemudian enzim yang telah ditambahkan
amoniunl sulfat tersebut dibiarkan selama semalam pada suhu 4 "C. Enzim yang disiinpan semalam dalam bentuk hasil pengendapan dengan amonium sulfat relatif stabil dan memiliki aktivitas biologis yang tidak berubah. Penambahan garam dengan konsentrasi tertentu akan menyebabkan molekul protein tidak dapat berikatan dengan molekul air, sehingga molekulmolekul protein tersebut saling berikatan satu sama lain, dan tampak membentuk gumpalan-gumpalan. Protein yang telah menggumpal dipisahkan dari supernatan dengan sentrifugasi atau filtrasi. Endapan yang dibasilkan merupakan protein (termasuk enzim) yang bebas dari kontaminan non-protein (Suhartono 1989). Beberapa enzim tidak tahan terhadap pengendapan dengan amonium sulfat. Jenis garam yang lain nlungkin dapat digunakan sebagai pengganti, tetapi alteinatif yang sering digunakan adalah menggunakan larutan organik seperti metanol, etanol dan aseton. Hal tersebut menyebabkan terjadinya penunman
konstanta dielektrik medium dan berakibat pada penurunan kelarutan protein oleh protein-protein Iainnya daripada interaksi larutan protein. Larutan organik tidak secara luas digunakan dalam skala besar karena harganya yang relatif mahal, mudah terbakar, dan kecenderungan protein untuk mengalami denaturasi lebih cepat dari larutan tersebut jika suhu naik dengan cepat diatas 0 OC (Chaplin dan Bucke 1990).
Pengendapan dengan pelarut organik yang d i i i t i dengan
pemumian distilasi menghasilkan produk dengan aktivitas tinggi, tetapi kondisi suhu hams dikontrol, yaitu pada suhu rendah (di bawah -5
OC)
dan hal ini kurang
ekonomis. 2.7. Karakterisasi Biokimia Enzim Agar enzim dapat bekerja secara optimal, perlu diketahui karakterisasi biokimiawi enzim, seperti pH dan suhu optimum, pengaruh ion logam, inhibitor dan lainnya. Hasil karakterisasi enzim walaupun masih bersifat ekstrak kasar namun dapat menggambarkan karakter protease di dalamnya. Kondisi lingkungan harus menunjang kondisi yang dibutuhkan enzim untuk dapat berfungsi sebagai katalis suatu reaksi (Ryta 2001). 2.7.1. pH optimum Seperti protein pada umumnyh struktur ion enzim tergantung pada pH lingkungannya. Enzim dapat berbentuk ion positif, ion negatif, atau ion bemuatan ganda (zwitter ion).
Dengan demikian perubahan pH lingkungan akan
berpengaruh terhadap aktivitas bagian aktif enzim dalam membentuk kompleks enzim substrat. Di samping pengaruh terhadap struktur ion pada enzim, pH rendah atau pH tinggi dapat pula menyebabkan terjadinya proses denaturasi dan ini akan mengakibatkan menurunnya aktivitas enzim (Poedjiadi 1994). Enzim menliliki pH optimum yang khas, yaitu pH yang menyebabkan aktivitas maksimal. Profil aktivitas pH enzim menggambarkan pH pada saat gugus pemberi atau penerima proton yang penting pada sisi katalitik enzim berada dalam tingkat ionisasi yang diinginkan. Nilai pH optimum tidak perlu sama dengan pH lingkungan normalnya, dengan pH yang rnungkin sedikit berada di atas atau di bawah pH optimum. Aktivitas katalitik enzim di dalan sel mungkin diatur sebagian oleh perubahan pada pH medium lingkungan (Lehninger 1993).
Pada umumnya enzim bersifat ampolitik, yang berarti enzim mempunyai konstanta disosiasi pada gugus asam maupun gugus basanya terutama pada gugus residu terminal karboksil dan gugus terminal aminonya. Diperkirakan perubahan keaktifan enzim ini adalah akibat perubahan pH lingkungan. Perubahan pH lingkungan ini terjadi karena adanya perubahan ionisasi pada gugus ionik enzim pada sisi aktifnya atau sisi lain yang secara tidak langsung mempengaruhi sisi aktif. Gugus ionik beiyeran dalam menjaga konformasi sisi aktif dalamSmengikat substrat menjadi produk. Perubahan ionisasi juga dapat dialami oleh substrat atau kompleks enzim-substrat, yang juga berpengaruh terhadap aktivitas enzim (Webb dan Dixon 1979). 2.7.2. Suhu optimum Reaksi enzim umumnya terdiri dari beberapa tahapan reaksi dan respon terhadap suhu dari masing-masing tahap yang berbeda. Setiap enzim memiliki aktivitas pada suhu tertentu. Aktivitas akan meningkat dengan meningkatnya suhu, akan tetapi setelah suhu optimum tercapai maka yang terjadi adalah sebaliknya, yaitu akan menurun dengan peningkatan suhu. Hal ini disebabkan telah terdenaturasinya protein enzim (Pelczar dan Chan 1986). Enzim adalal~suatu protein, maka kenaikan suhu dapat menyebabkan terjadinya denaturasi. Apabila terjadi proses denaturasi, maka bagian aktif enzim akan terganggu dan dengan demikian konsentrasi efektif enzim makin menjadi berkurang dan kecepatan reaksinya juga akan menurun. Kenaikan suhu sebelum terjadinya proses denaturasi dapat menaikkan kecepatan reaksi, akan tetapi kenaikan suhu pada saat mulai terjadinya proses denaturasi akan mengurangi kecepatan reaksi (Poedjiadi 1994). Peningkatan suhu tertentu menyebabkan semakin meningkatnya aktivitas katalitik enzim dan semakin bertambahnya proses kerusakan enzim (Palmer 1991). S h k t u r protein menentukan aktivitas e ~ z i mjika , strukturnya terganggu maka aktivitasnya akan berubah pula. Kenaikan suhu sampai batas tertentu dalam suatu reaksi menyebabkan peningkatan kecepatan reaksi enzim karena bertambahnya energi kinetik yang mempercepat gerak vibrasi, translasi dan rotasi enzim dan substrat sehingga memperbesar peluang keduanya untuk bereaksi. Pada suhu yang lebih besar dari batas reaksi, protein enzim dapat mengalami
perubahan konformasi yang bersifat detrimal, yaitu berubahnya susunan tiga dimensi yang khas dari rantai polipeptida. Hal yang sama juga dapat terjadi pada substrat yang perubahan konformasinya dapat menyebabkan gugus reaktifhya akan mengalami kesulitan pada saat memasuki sisi aktif enzim (Suhartono 1989). 2.7.3. Ion logam Banyak enzim yang memerlukan tambahan komponen kimia bagi aktivitasnya. Komponen ini disebut dengan kofaktor. Kofaktor bisa berupa molekul organik, seperti ion Fe2+, MI?, zn2+, atau mungkin juga suatu molekul organik kompleks yang disebut koenzim, seperti thiamin pirofosfat, FAD, serta koenzim A. Beberapa enzim membutuhkan baik koenzim maupun satu atau lebih ion logam bagi aktivitasnya. Pada beberapa enzim, koenzim atau ion logam lainnya hanya terikat secara lemah atau dalam waktu sementara. Akan tetapi pada enzim lain senyawa ini terikat secara kuat dan permanen. Dalam ha1 ini disebut gugus protetik.
Enzim yang struktumya sempurna dan aktif mengkatalisis
bersama-sama dengan koenzim atau gugus logamnya disebut holoenzim. Koenzim dan ion logam bersifat stabil selama pemanasan, sedangkan bagian protein enzim disebut apoenzi~nakan terdenaturasi oleh pemanasan (Lehninger 1993). Ion logam mempunyai peranan penting dalam menjaga kestabilan enzim. Logam biasanya berperan sebagai pengatur aktivitas enzim (Harper 1979). Ion logam dapat mengaktifkan enzim melalui berbagai kemungkinan seperti: (a) menjaga bagian internal enzim, (b) menghubungkan enzim dengan substrat, (c) meruball konstanta keseimbangan reaksi enzim, (d) merubah tegangan permukaan protein enzim, (e) menglulangkan inhibitor, (f) menggantikan ion logam yang tidak efektif pada sisi aktif enzim maupun substrat, dan (g) merubah konformasi enzim menjadi konformasi yang lebih aktif (Richardson dan Hyslop 1985). Lebih dari 25 % jenis enzim mengandung ion logam yang terikat atau menlerlukan ion logam bagi aktivitasnya. Metaloenzim mengandung ion logam fimgsional dalam jurnlah pasti, yang dipertahankan selama proses pemurnian. Enzim yang diaktifkan oleh logam memperliihatkan ikatan yang lebih lemah dengan logam, dan demikian memerlukan logam tambahan. Oleh karena it4
perbedaan metaloenzim dengan enzim yang diaktifkan oleh logam terletak pada afinitas suatu enzim tertentu terhadap ion logamnya (Harper 1979). 2.7.4. Senyawa inhibitor Telah diketahui bahwa mekanisme enzim dalam suatu reaksi ialah melalui pembentukan kompleks enzim-substrat (ES). Oleh karena itu, hambatan atau inhibisi pada suatu reaksi yang yang menggunakan enzim sebagai katalis dapat terjadi apabila penggabungan substrat pada bagian aktif enzim mengalami hambatan. Molekul atau ion yang dapat menghambat reaksi tersebut dinamakan inhibitor (Poedjiadi 1994). Hambatan yang dilakukan oleh inhibitor dapat berupa hambatan tidak reversibel dan hambatan reversibel. Hambatan tidak reversibel pada umumnya disebabkan oleh terjadinya proses destruksi atau modifikasi sebuah gugus f k g s i atau yang terdapat pada molekul enzim.
Hambatan reversibel dapat berupa
hambatan bersaing atau bambatan tidak bersaing (Poedjiadi 1994). Inhibitor merupakan senyawa yang cenderung menurunkan kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh enzim. Inhibitor dapat bereaksi dengan substrat, kofaktor atau dengan enzim langsung.
Potease logam membutuhkan logam
sebagai kofaktor untuk melakukan fungsi katalitiknya.
Adanya senyawa
pengkelat loganl, seperti ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), merupakan inhibitor bagi protease metal (Aunstrup 1979). Senyawa ini mampu mengkelat berbagai ion logam yang berada di lingkungan, baik yang dibutuhkan maupun yang tidak dibutuhkan oleh enzim. Aktivitas protease serin dapat dihanbat oleh senyawa yang bereaksi dengan gugus -OH pada serin di sisi aktifnya, seperti diisopropylJuoro phosphate (DFP) danphenyl metyl sulfonylJI2toride (PMSF). 2.8. Aplikasi Enzim dalam Hidrolisis Protein Kolagenase mempunyai banyak kegunaan dan apliiasinya dalam industri, obat-obatan, dan riset, salah satunya dapat digunakan dalam hidrolisis protein (Bjarnason 2001). Kata hidrolisis pada unlumnya berhubungan dengan reaksi yang meliputi air dan dua atau lebih komponen produk (Kirk dan Otmer 1953). Senlua protein akan menghasilkan asam-asam amino bila dihidrolisis, tetapi ada beberapa protein yang disamping menghasilkan asam amino juga menghasilkan molekul-molekul
protein yang masih berikatan (West dan Todd 1964). Reaksi hidrolisis dapat dibagi dalam beberapa tipe (Kirk dan Otmer 1953), yaitu : (1). hidrolisis murni, hanya air yang digunakan untuk proses hidrolisis; (2). hidrolisis dengan larutan asam; (3). hidrolisis dengan larutan alkali; (4). hidrolisis dengan peleburan alkali yang menggunakan air atau tanpa air pada tenlperatur tinggi; (5). hidrolisis dengan enzim sebagai biokatalisator. Secara teoritis metode hidrolisis protein yang paling efisien adalah menggunakan enzim, karena enzim menghasilkan peptida-peptida yang kurang kompleks dan mudah dipecah.
Disamping itu, hidrolisis enzim dapat
menghasilkan produk hidrolisat yang terhindar dari perubahan dan kerusakan produk yang bersifat non-hidrolitik.
Hidrolisis protein dipengaruhi oleh
konsentrasi bahan-bahan penghidrolisis, suhu, dan waktu hidrolisis serta tekanan udara (Kirk dan Otmer 1953). Gesualdo Li-Chan (1999) menyatakan bahwa hidrolisis protein untuk menghasilkan peptida dan asam amino dapat dilakukan secara parsial menggunakan penambahan asam atau basa. Mengingat proses penambahan asam maupun basa pada proses hidrolisis dapat merusak beberapa gugus asam amino serta menghasilkan senyawa karsinogenik, maka fungsi asam atau basa digantikan oleh enziin secara spesifik. Akibat sifat enzim yang sangat spesifik tersebut, maka diperlukan pula pemilihan kondisi hidrolisis yang tepat. Kondisi yang perlu diperhatikan selama hidrolisis berlangsung adalah suhu, nilai pH, dan waktu hidrolisis. Hidrolisis menggunakan enzim berlangsung secara spesifik, inaka proses hidrolisis secara ekstensif mampu ineinpengaruhi pembentukan peptida dan asamasam amino. Melalui proses hidrolisis diharapkan terjadi suatu proses modifikasi karakterisasi fungsional protein untuk meningkatkan kualitas protein. Faktorfaktor yang mempengaruhi kecepatan hidrolisis dan kekhasan hidrolisat yang dihasilkan adalah suhu, waktu, pH, konsentrasi dan perbandingan enzim dengan protein.
Sedangkan warna, bau, rasa, dan tingkat kerusakan asam amino
dipengaruhi oleh kemumian protein dari bahan awal, kondisi serta bahan
penghidrolisis yang digunakan. Bila hidrolisis berjalan sempurna maka akan dihasilkan hidrolisat yang terdiri dari campuran 18-20 macam asam amino (Kirk
dan Otmer 1953).
3.
METODOLOGI
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret sampai bulan Juli 2007, bertempat di Laboratorium Kimia dan Biokimia Hasil Perikanan, Laboratorium Bioteknologi
2,
Departemen
Teknologi
Hasil
Perairan;
Laboratorium
Produktivitas Lingkungan Perairan, Departemen Manajemen Surnberdaya Perairan; dan Laboratorium Genetik dan Penyakit Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan; serta Laboratorium Mutu dan Mikrobiologi Pangan, dan Laboratorium Biokimia Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
3.2. Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan adalah organ dalam ikan Tuna (Thunnus sp.) yang terdiri dari bagian hepatopankreas, pyloric caeca dan hati. Bahan kimia untuk pembuatan kolagen adalah kulit ikan tuna dan asam asetat (teknis). Bahanbahan untuk ekstraksi dan pengendapan enzim kolagenase, yaitu Triton-X 100 (Sigma), CaC12 (Merck), buffer Tris-HCI (pH 8,0), dan amonium sulfat ((N&)2S04) (teknis). Bahan kimia yang digunakan untuk analisis aktivitas enzim kolagenase dan konsentrasi protein meliputi Tris-HC1 (pH 7,5), kolagen, CaCl2 (Merck), trychloroacetic acid (TCA) (Merck), tirosin (Merck), ninhydrin (Applichem), 1-propanol (Ajax Finechem), dan pereaksi Bradford. Logam-logan1 yang digunakan untuk karakterisasi enzim kolagenase adalah NaCl (Merck), CaC12 (Merck), BaCI2 (Merck), MnC12 (Merck), dan CoCl2 (Merck), sedangkan inhibitor yang digunakan adalah PMSF (Merck), EDTA (Merck), dan pepstatin (Sigma). Pembuatan pereaksi yang digunakan untuk analisis aktivitas enzim kolagenase disajikan pada Lampiran 1. Bahan kimia yang digunakan untuk analisis total nitrogen dan kadar aamino nitrogen bebas dalanl aplikasi eluim kolagenase antara lain K2S04 (Merck), HgO (Merck), H2S04 (Merck), NaOH (Merck), H3BO3, metil merah, metil biru, HCI, TCA, indikator fenolflatein, kuprifosfat, asam asetat glasial, KI, Na2Sz03,dan indikator kanji.
Alat-alat yang digunakan meliputi spektrofotometer (Yamato), sentrifuse regrigerator (Kokusan), inkubator (Termoline), mikropipet (pipetman), alat-alat gelas, tip, eppendrof, tabung reaksi, timbangan analitik, homogenizer, hot plate (Yamato) dan oven (Yamato). 3.3. Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan dalam empat tahap, yaitu (1). ekstraksi enzim kolagenase dari organ dalam ikan tuna, (2). pengendapan (presipitasi) enzim kolagenase dengan ammonium sulfat, dan (3). karakterisasi enzim kolagenase serta (4). aplikasi enzim kolagenase dalam hidrolisis protein pada kerang hijau. 3.3.1. Pembuatan kolagen sebagai substrat (Modifikasi Lestari 2005) Tahap pembuatan kolagen dari kulit ikan tuna meliputi pembersihan dan preparasi, perendaman dalam larutan asam dan ekstraksi. Pada tahap pembersihan dan preparasi, sisa daging, lemak, dan kotoran lainnya dibersihkan kemudian dipotong dengan ukuran 8x5 cm untuk memudahkan homogenisasi saat perendaman dan ekstraksi. Kulit yang telah dipotong direndam dalam larutan asam asetat 1,5 % selama 24 jam dengan perbandingan kulit : asam asetat 1:2. Selanjutnya kulit dicuci hingga keasamannya hilang.
Kulit yang telah
mengembang tersebut diekstrak dalam air dengan perbandingan kulit : air sebesar 2:l.
Ekstraksi dilakukan selama 3 jam pada suhu 40-50 'C.
Cairan hasil
ekstraksi disaring ~nenjadilarutan kolagen. 3.3.2. Ekstraksi enzim kolagenase dari organ dalam ikan tuna (Thunnus sp.) (Moore dan Stein (1954) diacu dalam Kim et a1 (2002)). Organ dalan segar dicuci dengan air dingin, dan ditambahkan dengan 100 mM buffer Tris-HC1 (pH 8,O) yang terdiri dari 0,25 % Triton-X 100 dan 10 mM CaCl*, dengan perbandingan bahan baku : larutan buffer 1:5, kemudian dihomogenkan dengan homogenizer.
Selanjutnya organ dalam yang telah
homogen tersebut, disentrifugasi dengan kecepatan 7.000 rpm selama 20 tnenit. Setelah itu, pelet yang telah dihasilkan disentrifugasi ke~nbalidengan kecepatan 7000 rpm selama 20 menit dengan menggunakan larutan buffer yang sama. Perbandingan antara bahan baku : larutan buffer sebesar 1:3.
Selanjutnya
supernatan yang dihasilkan ditambahkan dengan 20 mM Tris-HC1 (pH 8,O) yang terdii dari 0,36 mM CaC12, dan didiamkan pada suhu rendah
(5
4 OC) selama
48 jam. Larutan yang dihasilkan merupakan ekstrak kasar kolagenase yang akan digunakan untuk pengujian selanjutnya. 3.3.3. Pengendapan (presipitasi) enzim kolagenase (Moore dan Stein (1954) diacu dalam Kim et al. (2002)) Ekstrak kasar kolagenase yang terdapat pada supematan dipekatkan dengan menambahkan amonium sulfat ((NH4)2S04) dengan konsentrasi 30-80 % kejenuhan (metode perhitungan konsentrasi kejenuhan disajikan pada Lampiran 2 dan 3) untuk menentukan konsentrasi garam optimal.
Proses pengendapan
dilakukan dengan cara penambahan ((NH42S04) ke dalam supematan sedikit demi sedikit. Selama proses pengendapan, supernatan dihomogenkan dengan kondisi Iingkungan bersuhu rendah.
Supernatan yang telah dihomogenkan
tersebut, kemudian didiamkan selama 24 jam di dalam refrigerator pada suhu 5 4 0
C. Supematan selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama
30 menit pada suhu 4 "C. Sentrifugasi bertujuan untuk memisahkan supematan dengan endapan yang mengandung enzim. Endapan yang terbentuk dilarutkan dengan 20 mM Tris-HC1 (pH 8,O) yang terdiri dari 0,36 mM CaC12. Selanjutnya dilakukan pengukuran aktivitas enzim dengan metode Moore dan Stein (1954) diacu dalam Park et al. (2002). 3.3.4. Karakterisasi enzim kolagenase Karakterisasi enzim bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum aktivitas enzim sehingga penggunaan enzim dapat disesuaikan dengan karakter tersebut. Dengan penggunaan enzim pada kondisi optimumnya, maka enzim akan bekerja secara optimal dan lebih efisien. Karakterisasi enzim yang dilakukan pada penelitian ini adalah penentuan suhu optimum, pH optimum, dan pengaruh kation ~nonovalendan divalen serta inhibitor terhadap aktivitas enzim kolagenase hasil pengendapan dengan anlonium sulfat 70 %. (1). Penetapan pH dan suhu optimum aktivitas enzim (Moore dan Stein 1954 diacu dalam Park et al.2002) Penentuan pH optimum kolagenase dapat ditentukan dengan cara sebagai berikut: enzim dalam berbagai variasi pH (4,O-9,O) diiiubasi pada suhu 37 OC selama satu jam. Pengaruh suhu pada aktivitas enzim kolagenolitik adalah enzim dalam 50 mnM buffer Tris-HC1 (pH 7,5) yang mengandung 5 mM CaC12
.diinkubasi dalam berbagai variasi suhu (30-70 OC) selama satu jam. Selanjutnya aktivitas enzim tersebut diukur dengan metode Moore dan Stein (1954) diacu dalam Park et al. (2002). (2).
Pengaruh kation terhadap aktivitas enzim (Moore dan Stein 1954 diacu dalam Park et al. 2002) Kation monovalen (Na')
dan divalen (ca2+, ~ a ~ I+d +, , c o 2 3 dalam
bentuk klorida ditambahkan ke enzim sehingga konsentrasi masing-masing ion adalah 1 mM. Campuran enzim kemudian direaksikan pada pH dan suhu optimum.
Selanjutnya dilakukan pengukuran aktivitas enzim dengan metode
Moore dan Stein (1954) diacu dalam Park et al. (2002). (3). Pengaruh beberapa senyawa inhibitor terhadap aktivitas eluim Dalam hal ini, dilihat pengaruh EDTA, PMSF, dan pepstatin. Inhibitor ditambahkan ke enzim hingga konsentrasi akhir inhibitor adalah 1 dan 5 mM. Selanjutnya dilakukan pengukuran aktivitas enzim dengan metode Moore dan Stein (1954) diacu dalam Park et al. (2002). 3.3.5. Apldcasi Enzim dalam Hidrolisis Protein kerang Hijau (Modifdcasi Hidayat 2005) Penelitian terhadap kolagenase banyak dilahtkan dengan latar belakang sebagai salah satu cara untuk inengatasi limbah pengolahan terutama perikanan dan menkonversi limbah tersebut menjadi produk yang mempunyai nilai tambah. Salah satu peng-aaan enzim kolagenase adalah dalam hidrolisis protein. Dalam peneiitian ini dilakukan hidrolisat protein menggunakan kerang hijau. Prosedux pembuatan hidrolisat protein kerang hijau adalah sebagai berikut: daging kerang hijau dicincang, dicampur enziln kolagenase dengan konsentrasi
5 % dengan perbandingan (1:4). Selanjutnya dilakukan proses hidrolisis pada pH 8,O dan suhu 60 OC dengan perlakuan waktu yang dibutuhkan untuk proses hidrolisis tersebut, yaitu 0, 3, 6, 9, dan 12 janl. Pengambilan sampel dilakukan sebanyak lima kali dengan volume 10 ml.
Penganlbilan sampel tersebut
dilakukan setiap tiga jam sekali selama 12 jam. Kemudian dari hasil hidrolisis, masing-masing perlakuan dilakukan pengamatan terhadap padatan sisa hasil hidrolisis dan dianalisis a-amino nitrogen bebas serta total nitrogennya untuk menentukan derajat kesempumaan proses hidrolisis. Sebagai kontrol digunakan
larutan buffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,5) yang mengandung 5 mM CaC12. Parameter yang diukur adalah total nitrogen (AOAC 1995) dan kadar a-amino nitrogen bebas (Sudamiadji et al. 1989). 3.3.6. Analisis Analisis yang dilakukan meliputi pengukuran aktivitas enzim yang telah dimodifikasi oleh Moore dan Stein (1954) diacu dalam Park (2002), dan pengukuran konsentrasi protein metode Bradford. (I). Aktivitas enzim kolagenase (Moore dan Stein 1954 diacu dalam Park et al. 2002) Aktivitas kolagenolitik dapat diukur dengan metode Moore dan Stein (1954) yang telah dimodifikasi dengan cara mereaksikan 5 ml kolagen dengan 1 ml0,05 M Tris-HC1 (pH 7,5) yang mengandung 5 mM CaC12 dan 0,l ml larutan enzim diinkubasi pada suhu 37 OC selama 1 jam.
Reaksi dihentikan dengan
penambahan 0,2 ml 50 % TCA. Setelah 10 menit pada suhu ruang, disaring dengan menggunakan kertas saring. Supernatan (0,2 ml) dicampur dengan 1,O ml larutan ninhydrin, diinkubasi pada suhu 100 OC selama 20 menit, kemudian didinginkan pada suhu kiunar. Campuran tersebut diencerkan dengan 5 ml 50 % 1-propanol untuk ~engukuranabsorbsi dengan panjang gelombang 570 nm. Larutan buffer (50 mM Tris-HC1 pH 7,5) yang mengandung 5 rnM CaCl2 digullakan sebagai pengganti larutan enzim sebagai kontrol, dan larutan tirosin digunakan sebagai larutan standar enzim kolagenase. Prosedur untuk mengukur aktivitas enzim kolagenase secara rinci disajikan pada Lampiran 4. Aktivitas enzim kolagenase dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut : UA= A,, -A,, x P x -1 A,, --A,, T Dimana:
UA
=
Jumlah enzim yang menyebabkan perubahan 1 pmol substrat per menit.
Asp
=
Nilai absorbansi sampel
Abl
=
Nilai absorbansi blanko
Ast
=
Nilai absorbansi standar
P
=
Faktor pengencer
T
=
Waktu inkubasi (60 menit)
(2).
Pengukuran konsentrasi protein (Metode Bradford) (Hamnond dan Krager 1988 diacu dalam Walker 1988) Analisis dilakukan dengan terlebih dahulu membuat larutan bradford dan
larutan standar bovine serum albumin (BSA). Larutan bradford dibuat dengan mereaksikan comassie brilian blue G-250 sebanyak 25 mg dengan 12,5 ml etanol
95 % (v/v). Setelah itu ditambahkan dengan 25 ml asam fosfat 85 % (w/v). Jika telah larut dengan sempurna maka diencerkan dengan akuades sampai 500 ml. Setelah itu larutan disaring dengan kertas saring Whatman no. 1 dan diencerkan lima kali sebelum dipakai untuk pengukuran absorbansi sampel. Larutan standar dibuat dengan cara melarutkan 100 mg protein BSA kedalam 50 ml akuades, sebagai larutan stok dengan konsentrasi 2 mglml. Kemudian larutan stok diencerkan menjadi beberapa larutan dengan konsentrasi yang lebih rendah yaitu 0,l-1,O mglml. Konsentrasi Bradford dan kurva standar yang digunakan untuk menentukan konsentrasi protein disajikan pada Lampiran 5. Pengukuran konsentrasi protein ditentukan menggunakan metode Bradford yang dilakukan dengan cara mereaksikan 0,l ml larutan sampel enzim dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditanbahkan dengan 5 ml larutan Bradford, selanjutnya diinkubasi selama lima menit dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nrn. Nilai absorbansi yang didapat kemudian dimasukkan ke dalam kurva standar bradford untuk menentukan konsentrasi protein yang terkandung dalam sa~npelenzim. (3). Total nitrogen (AOAC 1995) Prinsip analisis total nitrogen adalah proses pembebasan nitrogen dari protein dalam bahan menggunakan asam sulfat dengan pemanasan. Penentuan total nitrogen menggunakan metode mikrokjeldahl. Prosedur analisis total nitrogen adalah sebagai berikut: contoh (0,2 gram) dimasukkan ke dalam tabung kjeldahl 30 ml, lalu ditambahkan tablet kjeldahl yang terdiri dari 1,9 gram K2S04, dan 2,5 ml HzS04. Contoh dididihkan selama 1-1,5 jam sampai cairan menjadi jernih kemudian didinginkan.
Isi labu
dituangkan ke dalam alat destilasi, labu dibilas sebanyak 5-6 kali dengan akuades
Rumus perhitungamya adalah sebagai berikut a-amino nitrogen bebas (grI100 gr) = dimana : a b
3.5
= ml titrasi = ml titrasi
(a-b)xNNa2S20,x0,014xPx100 gram contoh N = normalitas titer P = faktor pengenceran
sampel blank0
Analisis Data Hasil yang diperoleh dari pengukuran aktivitas enzim kolagenase dan
pengukuran konsentrasi protein dihitung nilai rata-ratanya. Nilai rata-rata tersebut dihitung menggnnakan rumus berikut (Walpole 1992):
X = Nilai rata-rata
txi
N = Jumlah data
X='='
n
Xi = Nilai X ke-i
Metode statistika yang digunakan untuk menganalisis nilai padatan sisa substrat, kadar a-amino nitrogen bebas dan nilai derajat hidrolisis adalah uji homogenitas ragam serta rancangan percobaan berupa Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial dengan dua faktor, yaitu faktor konsentrasi enzim kolagenase dengan dua taraf (tanpa penambahan enzim kolagenase dan dengan pena~nbahan enzim kolagenase), serta faktor lamanya waktu hidrblisis dengan lima taraf (0, 3,
6, 9, dan 12 jam) dengan dua kali ulangan. Persamaan umum model RAL faktorial adalah sebagai berikut : Yijk= p + ai + p,
+ (ap)ij + ~ i j k
Keterangan: Yijk
=
nilai pengamatan pada suatu percobaan ke-k yang memperoleh kombinasi perlakuan ij (taraf ke-i dari faktor a dan taraf ke-j dari faktor P)
p
=
nilai tengah populasi
ai
=
pengaruh perlakuan a (konsentrasi e ~ u i mtaraf ) ke-i
p,
=
pengaruh perlakuan 0 (lama hidrolisis) tarafke-j
(ap),
= pengaruh
E O ~
=
interaksi perlakuan a tarafke-i dan perlakuan 0 taraf ke-j
galat dari satuan percobaan ke-k dengan kombinasi perlrtkuan ke-ij
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Ekstraksi dan Pemekatan Enzim dengan Pengendapan Amonium Snlfat Berdasarkan letaknya, enzim dapat dibagi menjadi dua, yaitu enzim intraseluler dan enzim ekstraseluler. Informasi mengenai let& enzim tersebut sangat mempengaruhi teknik yang akan digunakan untuk mengekstraksi dan memumikan enzim (Suhartono 1989). Proses ekstraksi enzim dapat dilakukan dengan cara homogenisasi, sentrifugasi, filtrasi, atau gabungan ketiganya. Tahap pertama dari ekstraksi adalall organ dalam yang telah ditambahkan dengan larutan buffer dihomogenkan, kemudian dilakukan pemisahan medium yang mengandung enzim. Pemisahan ini dilakukan dengan menggunakan sentrifuse bersuhu rendah 4 OC dengan kecepatan 7.000 rpm selama 20 menit. Sentrifugasi dilakukan pada suhu rendah bertujuan untuk mencegah kerusakan enzim akibat panas yang ditimbulkan. Kemudian pelet hasil sentrifuse tersebut diekstrak kembali. Selanjutnya supematan yang dihasilkan ditambahkan dengan larutan buffer, kemudian didiamkan selama
48 jam sehingga diperoleh supernatan bebas sel yang merupakan ekstrak kasar enzim kolagenase. Enzim yang sudah terekstrak dalam supematan masih berupa larutan encer dengan aktivitas enzimatik yang rendah serta masih mengandung banyak zat pengotor. Berdasarkan hasil penelitian diperoleh ekstrak kasar enzim kolagenase dengan aktivitas sebesar 0,030 Ulnli dan aktivitas spesifik sebesar 0,025 Ulmg. Dengan demikian perlu dilakukan pemekatan melalui pengendapan menggunakan amonium sulfat ke dalam ekstrak kasar enzim dengan konsentrasi kejenuhan yang berbeda mulai dari konsentrasi kejenuhan terendah hingga ke konsentrasi kejenuhan tertinggi sesuai dengan perlakuan. Tujuan pengendapan ini adalah untuk me&isalIkan, sekaligus memurnikan secara parsial enzim kolagenase dari protein-protein lain yang terdapat pada ekstrak kasar enzim tersebut, sehingga akan mempunyai aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak kasar. Ekstrak enzim dalam supematan diendapkan dengan menambahkan garam. Garam yang digunakan untuk mengendapkan enzim kasar kolagenase adalah amonium sdfat (NH4)2S04. Garam tersebut dapat menstabilkan protein
dari proses denaturasi, proteolisis maupun kontaminasi bakteri. Presipitasi atau pengendapan protein dapat disebabkan oleh perubahan pH atau kekuatan ion, adanya penambahan pelamt organik atau senyawa lainnya sehingga molekul protein terkumpul
30
40
50
60
70
80
konsentrasi amonium sulfat 1%)
i
i!
Gambar 3. Aktivitas enzim pada berbagai konsentrasi amonium sulfat (% kejenul~an)
30
40
50
60
70
80
konsentrasi amonium sulfat (91)
Gambar 4. Konsentrasi protein pada berbagai konsentrasi anlonium sulfat (% kejenuhan) Berdasarkan pada Gambar 3 dapat dilihat bahwa nilai aktivitas enzim lebih besar terdapat pada endapan dibandingkan dengan supematannya.
Pada
penambahan amonium sulfat dengan konsentrasi 30 % kejenuhan, nilai aktivitas enzim dalam supematan hasil pengendapan sebesar 0,028 Ulml dengan nilai konsentrasi protein sebesar 1,223 mglml (Gambar 4) dan aktivitas spesifik sebesar 0,023 Ulmg. Kemudian dengan meningkatnya konsentrasi amonitun sulfat yang ditambahkan, maka nilai aktivitas enzim dalam supematan tersebut akan semakin
menurun yakni sebesar 0,014 U/ml dengan nilai konsentrasi protein sebesar 0,962 mg/ml (Gambar 4) dan aktivitas spesifk sebesar 0,014 Ulmg pada konsentrasi 80 % kejenuhan. Rendahnya nilai aktivitas enzim pada supematan tersebut menunjukkan bahwa sebagian besar protein, termasuk enzim kolagenase, telah mengendap dengan penambahan amonium sulfat, sehingga
aktivitas kolagenase pada
supematannya menunjukkan nilai yang rendah. Hal ini dapat dilihat dengan semakin meningkatnya nilai aktivitas enzim pada endapan hingga konsentrasi 70 % kejenuhan dan dihasikan aktivitas enzim yang maksimum yaitn sebesar 0,049 Ulml dengan konsentrasi protein yang telah terendapkan dengan sempurna sebesar 1,917 mg/ml (Gambar 4) dan nilai aktivitas spesifik sebesar 0,026 Ulmg. kemudian aktivitas enzim pada endapan mulai menurun pada konsentrasi 80 % kejenuhan dengan nilai aktivitas enzim 0,027 Ulml, konsentrasi protein sebesar 1,414 mg/ml (Gambar 4), dan aktivitas spesifik 0,018 Ulmg. Dengan demikian, semakin rendah aktivitas supematan maka akan semakin banyak enzim yang mengendap dan sebaliknya semakin tinggi aktivitas supematan maka akan semakin sedikit enzim yang mengendap. Analisis statistika menunjukkan bahwa nilai aktivitas enzim dalam supematan dan endapan menyebar homogen (P-value > 0,05) (Lampiran 6 no a.). Berdasarkan tabel statistik deskriptif (Lampiran 6 no. b) diperoleh hasil bahwa konsentrasi amonium sulfat 30 % kejenuhan menghasilkan nilai aktivitas tertinggi pada supematan.
Sebaliknya konsentrasi amonium sulfat 80 % kejenuhan
menghasilkan nilai aktivitas enzim terendah pada supematan. Hasil uji ragsun (ANOVA) dapat disimpulkan bahwa penambahan amonium sulfat dengan konsentrasi kejenuhan berbeda memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap nilai aktivitas enzim pada supematan pada tingkat kepercayaan 95 % (a > sig) (Lampiran 6 no. c). Oleh karena itu, dilakukan uji lanjut tukey untuk
nlengetahui perlakuan yang berbeda nyata (Lampiran 6 no. d). Hasil uji tukey yang dilakukan (Lampiran 6 no. d) menunjukkan bahwa pengaruh penambahan konsentrasi amonium sulfat 60, 70, dan 80 % kejenuhan berpengaruh nyata terhadap penambahan konsentrasi amonium sulfat 30 %
kejenuhan, sedangkan pada konsentrasi amonium sulfat 40 dan 50 % kejenuhan tidak memberikan pengaruh yang berbeda nyata. Nilai aktivitas enzim dalam endapan memberikan hasil bahwa amonium sulfat dengan konsentrasi 70 % kejenuhan mengbasilkan nilai aktivitas tertinggi. Sebaliknya arnonium sulfat dengan konsentrasi 80 % kejenuhan menghasilkan nilai aktivitas enzim terendah (Tabel statistik deskriptif Lampiran 7 no. a). Hasil uji ragarn (ANOVA) dapat disimpulkan bahwa penambahan konsentrasi arnonium sulfat memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap nilai aktivitas enzim pada endapan dengan tingkat kepercayaan 95 % (a > sig) (Lampiran 7 no. b). Oleh karena itu, dilakukan uji lanjut tukey untuk mengetahui perlakuan mana saja yang berbeda nyata (Lampiran 7 no. c). Hasil uji tukey yang dilakukan (Lampiran 7 n0.d) menunjukkan bahwa pengaruh penambahan anonium sulfat dengan konsentrasi 70 % kejenuhan berpengaruh nyata terhadap penambahan amonium sulfat dengan konsentrasi 30, 40, 50, dan 80 % kejenuhan, sedangkan pada amonium sulfat konsentrasi 60 % kejenuhan tidak memberikan pengaruh yang berbeda nyata. Penggunaan amonium sulfat sebagai garam untuk pengendapan enzim, disebabkan oleh sifat garam tersebut yang sangat efektif dalam pengeluaran Hz0 dari struktur suatu molekul. Amonium sulfat memiliki kelarutan yang tinggi pada suhu rendalt serta ekonomis (Scope 1987). Setiap enzim mempunyai konsentrasi amonium sulfat yang berbeda dalam proses pengendapan, ha1 ini dapat disebabkan oleb
perbedaan
respon
setiap
protein
terhadap
konsentrasi
(Wirahadiiusumah 1989).
I
-
ekstrak kasar
'arnoniurnsulfat konsentrasi 70 %
I
Gambar 5. Perbandingan aktivitas enzim antara filtrat kasar dan pengendapan pada 70 % kejenuhan amonium sulfat
garam
Penambahan garam ke dalam ekstrak kasar dengan tujuan pengendapan enzim dapat meningkatkan nilai aktivitas enzim.
Gambar 4 menunjukkan
perbandingan nilai aktivitas enzim antara ekstrak kasar dan pelet pada pengendapan 70 % kejenuhan. Nilai aktivitas enzim kasar sebelum pengendapan adalah
0,030 Ulml, setelah ditambahkan amonium sulfat dengan konsentrasi
70 % kejenuhan, aktivitas enzim meningkat menjadi 0,049 Ulml atau mengalami kenaikan sebesar 0,019 Ulml atau sekitar 63,33 %. Pengendapan dengan garam amonium sulfat tersebut sangat dipengaruhi oleh adanya residu asam amino hidrofobik pada permukaan tersier protein (Harris dan Angal 1989).
Penambahan garam menyebabkan molekui air yang
mengelilingi protein terlepas dan terikat oleh garam, dan molekul-molekul protein akan saling berikatan satu sama lain, dan tampak membentuk gumpalangumpalan. Protein yang telah menggumpal dipisahkan dari supematan dengan sentrifugasi atau filtrasi. Endapan yang dihasilkan mempakan protein (termasuk enzim) yang bebas dari kontaminan non-protein (Suhartono 1989). Amonium sulfat yang digunakan sebagai garam untuk mengendapkan enzim kolagenase memiliki beberapa keuntungan diantaranya adalah memiliki kelarutan yang tinggi, harganya yang relatif murah, tidak bersifat toksik untuk kebanyakan enzim, dan memiliki efek stabil terhadap beberapa enzim karena tidak inempengaruhi struktur protein (Chaplim dan Bucke 1990). Metode dalam memonitor pemumian enzim adalah dengan mengukur nilai aktivitas spesifik enzim dari masing-masing tahap pemurnian. Tahap pemurnian yang berhasil akan memberikan nilai aktivitas spesifik enzim yang lebih tinggi daripada tahap sebelumnya (Wilson dan Walker 2000). Beberapa parameter yang digunakan antara lain adalah derajat kemumian (perbandingan aktivitas spesifik setelah suatu tahapan proses terhadap aktivitas spesifik pada persiapan awal). Secara lengkap, data aktivitas enzim dari setiap tahapan pemumian disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2. Beberapa parameter nilai aktivitas enzim Akt. Spesifik
Derajat Kemurman
1,179
Wmg) 0,025
1,OO
1,917
0,026
1,04
AM. Enzim Or/ml)
Kons. Protein (mglml)
Ekstrak kasar
0,030
Hasil pengendapan
0,049
Tahapan
Pada Tabel 2 dapat dikatakan bahwa terjadi peningkatan aktivitas spesifk dari nilai derajat kemurnian yang diperoleh. Hal ini menunjukkan efisiensi tahap presipitasi yang dilakukan. Apabila dibandingkan dengan hasil yang diperoleh oleh Kim et al. (2002), derajat kemumian yang dihasilkan enzim kolagenase dari organ d a t a ikan filefish (Novoden modestrus) yang diendapkan dengan amonium sulfat sebesar 1,27 kali, maka derajat kemumian yang diperoleh pada presipitasi kali ini lebih kecil yakni sebesar 1,04 kali. Park et al. (2002) melaporkan bahwa enzim kolagenase dari organ dalam Scomber japonicus yang diendapkan dengan aseton memiliki derajat kemurnian yang lebih tinggi yaitu 2,6 kali lipat dari ekstrak kasarnya. 4.2. Karakterisasi Enzim Kerja enzim sangat tergantung pada kondisi lingkungannya. Peiubahan kondisi lingkungan dapat mempengaruhi kerja enzim secara keseluruhan. Enzirn juga dapat bekerja secara maksimal dan efisien jika berada pada kondisi yang optimum. Kondisi optimal ini berbeda-beda pada setiap enzim. Oleh karena itu, agar enzim dapat bekerja secara optimal, maka perlu diketahui karakteristik secara biokimiawi. Karakterisasi dilakukan pada enzim kolagenase hasil pengendapan dengan amonium sulfat yang meliputi pH dan suhu optimum, pengaruh inhibitor, dan pengaruh ion logam. 4.2.1. pH optimum Karakteristik ini diperlukan karena seperti protein-protein laimya, enziin memiliki banyak grup yang dapat terionisasi sehingga perubahan pH akan merubah konformasi enzim, pengikatan substrat dan daya katalitik dari grup-grup pada sisi aktif enzim. Pengaruh-pengaruh yang mungkin terjadi adalah perubahan kecepatan maksimum, perubahan afintas enzim terhadap substrat (Km) atau perubahan stabilitas enzim (Fogarty dan Kelly 1979).
Enzim memiliki pH
optimum yang &as, yaitu pH yang menyebabkan aktivitas maksimal. Nilai pH optimum enzim tidak perlu sama dengan pH lingkungan normalnya (Lehninger 1993).
Hasil pengujian aktivitas enzim kolagenase dengan berbagai pH
ditunjukkan oleh Gambar 6.
Gambar 6. Nilai aktivitas enzim pada berbagai pH Pada Gambar 6 terlihat bahwa enzim kolagenase hasil pengendapan dengan penambahan amonium sulfat konsentrasi 70 % kejenuhan, ~nemiliki aktivitas tertinggi hingga mencapai optimalnya pada pH 8, yaitu sebesar
0,024 Ulml dan pada pH 9 aktivitas enzim masih ditemukan walaupun kemampuan ezim untuk menghidrolisis mulai Inengalami penurunan. Enzim merupakan protein sehingga dalam kondisi terlarut cenderung mudah berinteraksi dengan pelarutnya, apabila akan terjadi perubahan pH larutan di atas maltpun di bawah pH optimumnya, maka akan langsung bersentuhan dengan sisi aktihya, akibatnya adalah akan terjadi penurunan aktivitas enzim yang cepat (Scope 1987). Di luar pH optimum, aktivitas protease lebih rendah karena sifat enzim sebagai molekul protein yang memiliki muatan positif dan negatif. Ionisasi a s m asam amino pada sisi &if
enzi~n adalah sedemikian rupa sehingga
memungkinkan interaksi elektrostatik antar sisi aktif enzim dengan molekul substrat untuk membentuk kompleks enzim-substrat (Suhartono 1989). Berdasarkan pada Gan~bar6 diketahui bahwa eluim kolagenase yang diekstrak dari organ dalam ikan tuna yang diuji cenderung bekerja pada lingkungan yang netral.
Hal ini tidak berbeda jauh dengan penelitian yang
dilakukan oleh Kim ei al. (2002) yang melaporkan bahwa enzim kolagenase yang diiasilkan dari organ dalam filefish (Novoden modeshus) memiliki pH optimum 7,O-8,O. Scomber japonicus dilaporkan sebagai pH optimumnya berada di pH 7,5 (Park et al. 2002). 4.2.2. Suhu optimum Pengaruh suhu pada reaksi enzimatik merupakan suatu fenomena yang kompleks. Ditambah lagi dengan kenyataan bahwa reaksi enzim umumnya terdiri dari beberapa tahapan reaksi dan respon dari tiap tahap ini terhadap suhu juga akan berbeda (Suhartono 1989). Setiap enzim memiliki aktivitas maksimum pada suhu tertentu, aktivitasnya akan meningkat seiring dengan peningkatan suhu hingga mencapai suhu optimum. Setelah itu kenaikan suhu lebih lanjut akan menyebabkan aktivitas menurun (Pelczar dan Chan 1986). Penentuan suhu optimum dilakukan dengan mereaksikan enzim pada pH optimalnya pada berbagai suhu.
Dalam penelitian ini, variasi suhu yang
digunakan berkisar dari 30 OC hingga 70 OC. Nilai aktivitas enzim kolagenase dengan berbagai suhu disajikan pada Garnbar 7.
I
i
I
30
37
50
60
70
suhu
Gambar 7. Nilai aktivitas enzim pada berbagai suhu Seperti dapat dilihat pada Gambar 7, aktivitas enzim kolagenase dapat bekerja secara optimal pada suhu 60 OC dengan aktivitas 0,038 U/ml, akan tetapi enzim kolagenase hasil pengendapan tersebut masih mempunyai aktivitas sampai suhu 70 OC meskipun aktivitasnya mulai mengalami penurunan.
Sebagai
perbandingannya adalah hasil karakterisasi enzim dari organ dalam ikan makarel yang dilakukan ole11 Park et nl. (2002) menunjukkan bahwa enzim kolagenase
memiliki suhu optimal 55 OC. Suhu optimum ini lebih tinggi daripada suhu optimum yang berasal dari organ dalam atlantik cod (Codus morhua) dan Curcinus rnaenus yakni pada suhu 30
sedangkan suhu optimal yang
OC,
dihasilkan dari organ dalam Novoden rnodestrzrs sebesar 60 O C (Kim et al. 2002). Pada suhu optimum reaksi berlangsung paling cepat. Apabila suhu terus dinaikkan, maka jumlah enzim yang aktif akan berkurang karena mengalami denaturasi. Enzim adalah suatu protein sehingga apabila terdenaturasi, maka bagian aktif enziln &an terganggu dan dengan demikian konsentrasi efektif enzim menjadi berkurang dan aktivitas biologinya mengalami penurunan (Poedjiadi 1994). Reaksi enzimatik dipengaruhi oleh suasana kelistrikan dimana enzim tersebut bekerja. KestabiIan molekul protein dipengaruhi oleh kestabilan ikatanikatan pada molekul enzim.
Kestabilan molekul enzim ini mempengaruhi
pengikatan enzim dengan substrat, baik secara langsung maupun tidak langsung. Suhu mempengaruhi laju reaksi katalisis enzim dengan dua cara. Pertama, kenaikan suhu akan meningkatkan laju reaksi enzim sampai batas tertentu. Disisi lain peningkatan suhu yang berlebih &an
berpengaruh terhadap perubahan
konformasi substrat sehingga sisi aktif substrat mengalami hambatan untuk memasuki sisi aktif enzim sehingga menurunkan aktivitas enzim.
Kedua,
peningkatan energi termal molekd yang membentuk shuktur protein enzim &an menyebabkan terjadinya denaturasi pada enzim, karena rusaknya interaksi nonkovalen yang lnenjaga struktur tiga dimensi enzim tersebut.
Denaturasi
menyebabkan stntktur pada lipatan enzim membuka pada bagian permukaamlya sehingga sisi aktif enzim berubah dan sebagai akibatnya akan terjadi penurunan aktivitas pada enzim (Hanles dan Hooper 2000). 4.2.3. Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim Enzim sebagai katalis tidak selalu dapat bekerja sendiri. Ada beberapa cara untuk meningkatkan stabilitas enzim, salah satunya dengan penarnbahan aditif yang relatif mudah dan murah, diantaranya senyawa pengkelat, larutan garam dan y l a , inhibitor protease dan senyawa pereduksi. Sebagian besar enzim membutuhkan kofaktor nonprotein untuk melakukan katalisis. Kofaktor yang diperlukan dapat berupa ion logam maupun molekul organik yang ikut mengalami transfomasi secara kimia saat reaksi. Sementara kofaktor yang lain berperan
sebagai ko-substrat yang dapat berikatan secara kovalen dengan enzim yang bersangkutan. Hasil pengukuran aktivitas kolagenase terhadap penambahan ion logam menunjukkan perbedaan seperti yang disajikan oleh Gambar 8 dan 9.
1I
Kontrol
Na+
I
Ba2+ Ca2+ kation
Co2+
MnZ+
Gambar 8. Pengaruh beberapa ion logam terhadap aktivitas enzim
Kontrol
Na+
Ba2+
Ca2+
Co2c
Mn2+
Kation
Gambar 9. Pengaruh beberapa ion logam terhadap aktivitas relatif enzim Pengujian ion logam menggunakan semua kation berbentuk klorida. Hal ini dilakukan untuk menghilangkan perbedaan yang lnungkin saja timbul apabila menggunakan bentuk yang berbeda yang dapat berpengaruh terhadap ionisasi. Pengaruh kation terhadap eiuim diuji dengan cara menambahkan ion ke dalam enzim sehingga diperoleh konsentrasi akhir ion sebesar 1 mM. Ion logam mempunyai peranan penting dalam menjaga kestabilan enzim (Harper 1979). Logam biasanya berperan sebagai pengatur aktivitas enzim. Ion logam dapat mengaktifkan e ~ u i m melalui berbagai kcmungkinan seperti: (a) menjaga bagian internal enzim, (b) menghubungkan eluim dengan substrat,
(c) inerubah konstanta keseimbangan reaksi enzim, (d) merubah tegangan permukaan protein enzim, (e) menghilangkan inhibitor,
(0 menggantikan
ion
logam yang tidak efektif pada sisi aktif enzim maupun substrat, dan (g) merubah konformasi enzim menjadi konformasi yang lebih aktif &chardson dan Hyslop 1985). Logam yang dibutuhkan oleh suatu enzim bersifat spesifik dalam hal jumlah dan jenis.
Hal ini terlihat pada beberapa ion logam yang dicobakan,
+ , co2+,dan ~ n ~ Seperti + . yang terlihat pada Gambar 8, seperti ~ a ' , ~ a ~ca2+, penambahan Ba2+ memiliki nilai aktivitas enzim paling kecil dibandingkan dengan kontrol, yaitu sebesar 0,013 Ulml. Dengan demikian penghambatan yang cukup besar ditunjukkan oleh penambahan ion tersebut dengan nilai aktivitas relatif bersentase antara aktivitas enzim setelah penambahan ion kation terhadap kontrol) sebesar 53,72 % (Gambar 9). Ion ini dapat mengurangi aktivitas enzim hampir sebagian dari nilai aktivitas enzim kontrol. Penambahan ion tertentu bisa saja tidak menunjukkan peningkatan aktivitas. Hal ini terjadi karena kebutuhan ion tersebut sudah terpenuhi dari lingkungan enzim yang masih bersifat sebagai ekstrak kasar.
Selain itu juga, adanya perbedaan seperti berat molekul,
keelektronegatifan, dan jari-jari atom suatu logam dapat mempengaruhi nilai aktivitas suatu enzim. Beberapa ion logam seperti Na+, ca2+, co2+, dan bfn2+ memberikan efek kebalikam~ya,yaitu meningkatkan nilai aktivitas enzim. Berdasarkan pengujian ini diperoleh aktivitas enzim tertinggi terdapat pada penambahan ion logam ca2+ sebesar 0,057 Ulml (Gambar 8) dengan nilai aktivitas relatifnya sebesar 233,93 % (Gambar 9) atau hanlpir dita kali lipatnya dari kontrol. Ion logam ini memberikan kestabilan enzim dengan cara menetralkan kelebihan muatan elektrostatik yang melindungi molekul enzim sehingga konformasi enzim dapat dipertahankan. Beberapa enzim memerlukan ion-ion logam tertentu untuk meningkatkan aktivitasnya.
Pada konsentrasi tertentu ion logam dapat bertindak sebagai
aktivator dan dalam konsentrasi tertentu pula dapat bertindak sebagai inhibitor (Palmer 1991). Dengan demikian, secara keseluruhan enzim kolagenase yang dihasilkan dari organ dalam ikan tuna aktivitasnya ditingkatkan oleh adanya ion logarn ca2+
M$+, ~ a + dan , co2+ d m dihambat oleh ion logam Ba2+. Park et al. (2002) menyatakan bahwa ion logam yang dapat menghambat aktivitas enzim kolagenase yang berasal dari organ dalam Scomber japonicus adalah 2n2+, sedangkan ion logam yang dapat meningkatkan aktivitas enzim tersebut adalah sn2+ dengan konsentrasi ion logam sebesar 1 mM. Kim et al. (2002) melaporkan bahwa enzim kolagenase yang diekstrak dari organ dalam Filefish, Novoden modesfrus dapat dihambat aktivitasnya oleh ion logam 2n2+dan aktivitas enzim dapat ditingkatkan dengan penambahan ion logam ca2+ dengan konsentrasi ion logam tersebut sebesar 0,06 rnM. 4.2.4.
Pengaruh inhibitor terhadap aktivitas enzim Inhibitor merupakan senyawa yang cenderung menurunkan kecepatan
reaksi yang dikatalisis oleh enzim. Inhibitor dapat bereaksi dengan substrat, kofaktor atau dengan enzim langsung. Dalam bal ini, dilihat pengaruh senyawa EDTA, PMSF, dan pepstatin. Pengujian inhibitor yang dilakukan secara teknik sama seperti pengujian pengaruh kation, senyawa-senyawa tersebut ditambahkan ke dalam enzim sehingga tercapai konsentrasi akhir 1 dan 5 mM (EDTA dan PMSF) serta 1pM dan 5 pM (pepstatin). Pada penelitian ini konsentrasi pepstatin yang digunakan lebih kecil dibandingkan dengan EDTA dan PMSF karena batas maksimum penggunaan inhibitor pepstatin adalal~sebesar 10 pM. Hasil pengujian menunjukkan baliwa penambahan PMSF menyebabkan penurunan aktivitas enzim yang tidak terlalu besar. Berdasarkan Gambar 10 dan 11 dapat dilihat bahwa aktivitas ekstrak kasar enzim kolagenase dapat dihambat dengan penambahan PMSF.
I
Jenis inhibitor
Gambar 10. Pengaruh inhibitor terhadap aktivitas enzim
i
i
I
Jenis inhibitor
I
Gambar 11. Pengaruh inhibitor terhadap aktivitas relatif enzim Sernakin tinggi kadar PMSF maka akan senlakin besar pula penghambatannya. Penambahan PMSF 1 mM dan 5 mM memiliki nilai aktivitas enzim secara berurutan sebesar 0,009 Ulml dan 0,008 Ulml (Gambar 10) dan menyebabkan penurunan aktivitas enzim sebesar 11,87 % pada penambahan PMSF 1 mM, sedangkan pada konsentrasi 5 mM penurunan aktivitas yang terjadi sebesar 23,64 % (Gambar 11) apabila dibandingkan dengan kontrol. Penambahan senyawa EDTA dan pepstatin dalanl penelitian ini, justru meningkatkan aktivitas enzim kolagenase. Aktivitas enzim dengan penambahan EDTA 1 rnM dan 5 mM dapat menaikkan aktivitas enzim secara berurutan sebesar 0,010 Ulml d m 0,016 Ulml, sedangkan aktivitas relatifnya meningkat 52,96 % dan 15,47 %. Penambahan inhibitor pepstatin 1 pM dan 5 pM dapat meningkatkan aktivitas enzim kolagenase secara berurutan sebesar 0,016 Ulml dan 0,015 Ulml dan memiliki aktivitas relatif sebesar 44,60 % dan 34,90 %. Beberapa senyawa inhibitor seperti PMSF, EDTA, dan pepstatin dikenal sebagai inhibitor spesifik dan dapat digunakan untuk menentukan jenis protease. Senyawa inhibitor merupakan senyawa yang dapat mengubah kemampuan enzim dalam mengikat substrat sehingga menyebabkan perubahan daya katalisator enzun. perubahan ini disebabkan sbuktur enzim mengalami perubahan fisik dan kimiawi sedemikian rupa sehingga aktivitas hayatinya menjadi berubah (Suhartono 1989).
Inhibitor PMSF merupakan senyawa kimia yang bersifat
spesifik terhadap protease golongan serin. Senyawa EDTA inerupakan senyawa pengkelat yang dapat menstabilkan enzim. Pepstatin merupakan salah satu jenis
inhibitor protease
dengan karasteristik ikatan pentapeptida
dan
dapat
mempengaruhi aktivitas enzim protease golongan aspartat. Selain itu, senyawa EDTA dan pepstatin dapat digolongkan ke dalam inhibitor non kompetitif karena inhibitor jenis ini tidak mempunyai struktur yang sama dengan substrat sehingga tidak akan dapat diturunkan aktivitasnya melalui peningkatan konsentrasi substrat dan pengikatan terhadap enzim terjadi di luar sisi aktifnya (Lehninger 1993). Berdasarkan pada Gambar 10 dan 11 dapat diietahui bahwa eiuim kolagenase yang dihasilkan secara keseluruhan belum dapat dihambat dengan baik oleh inhibitor PMSF. Meskipun nilai aktivitas relatif yang dihasilkan sedikit lebih kecil dari kontrol, tetapi daya hambat yang dihasilkan tidak terlalu besar. Hal ini dapat disebabkan oleh enzim kolagenase yang digunakan masih dalam tahap pemurnian secara parsial menggunakan amonium sulfat, sehingga dimungkinkan masih terdapat zat-zat pengotor yang mempengaruhi kerja enzim. Enzim kolagenase hasil pengendapan pada penelitian ini belum bisa digolongkan ke dalam protease serin karena PMSF hanya menghambat sebesar 23,64 %. Park et al. (2002) melaporkan bahwa enzim kolagenase dari organ dalam Scomber japonicus yang dihambat oleh PMSF memiliki aktivitas relatif sebesar 46,s % dengan konsentrasi sebesar 1,O mM. Sebagai perbandingan, penelitian yang dilakukan oleh Park et al. (2002) menunjukkan bahwa inhibitor yang dapat menghambat aktivitas enzim kolagenase yang berasal dari organ dalam Scomber japonicus adalah PMSF (1,O mM), soybean tiypsin (0,Ol mg/ml), chymostatin (0,l mM), dan tosyl phenylalanyl chloromeythyl ketone (TLCK) (0,lmM) yang keseluruhan termasuk ke dalam kelompok inhibitor serin protease;
sedangkan inhibitor jenis
cystatin
(0,01 mglml), EDTA (1,O mM), dan 1,lO-phenanthroline (1,O mM) yang mempakan kelompok inhibitor metalloprotease, tidak dapat menghambat enzim tersebut. Kim et al. (2002) melaporkan bahwa e ~ u i mkolagenase yang diekstrak dari organ dalam Filefish, Novoden modestrus dapat dihambat aktivitasnya oleh inhibitor seperti soybean t ~ p s i n DFP, , dan TLCK dengan konsentrasi masingmasing sebesar 1,OO; 0,50; dan 0,20 mM dan termasuk inhibitor serin protease.
4.3. Aplikasi Enzim Enzim kolagenase dapat digunakan dalam hidrolisis protein. Hidrolisis protein yang dilakukan dalam penelitian ini menggunakan kerang lujau. Kerang hijau merupakan salah satu jenis kerang yang mempunyai kandungan protein yang cukup tinggi. Hidrolisis protein dapat diperoleh dengan cara hidrolisis bas& hidrolisis asam, dan hidrolisis enzimatik. Hidrolisis enzimatik merupakan metode hidrolisis protein yang paling efisien, karena enzim menghasilkan peptida-peptida yang kurang kompleks dan mudah dipecah. Gesualdo Li-Chan (1999) menyatakan bahwa kondisi yang perlu diperhatikan selama hidrolisis berlangsung adalah suhu, nilai pH, dan waktu hidrolisis. Pada penelitian ini, hidrolisis protein kerang hijau dilakukan pada kondisi suhu 60 OC dan nilai pH 8 yang diperoleh dari hasil karakterisasi enzim kolagenase. Konsentrasi enzim kolagenase yang digunakan yaitu sebesar 5 % berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Hidayat (2005) yang menggunakan enzim papain, serta waktu hidrolisis selama 12 jam. 4.3.1. Aktivitas enzim kolagenase terhadap substrat Hidrolisis protein merupakan sumber protein alami yang dihidrolisis secara parsial sehingga lebih mudah diserap oleh makhluk hidup. Hidrolisis secara parsial mampu memecah molekul protein menjadi beberapa gugus asam amino maupun peptida melalui pemutusan ikatan rantai peptida (Rehm dan Reed 1995). Salah satu proses l~drolisisadalah dengan penambahan enzim yang spesifik. Pada saat hidrolisis berlangsung, ikatan peptida terputus dan sebagai gantinya lokasi pernutusan ikatan tersebut berikatan dengan enzim melalui adanya pengikatan oleh ion-ion positif atau negatif dari moleh~lair. Hal inilah yang mengakibatkan pengikatan substrat pada sisi aktif enzim menjadi lebill mudah. Pada proses hidrolisis, substrat yang digunakan mengalami p e n m a n yang memenuhi fungsi waktu.
Hal tersebut berkorelasi dengan peningkatan
jumlah produk hasil hidrolisis. Nilai padatan sisa yang dihasilkan disajikan pada Gambar 12.
0
3
6
9
12
waktu hidroliw's(jarn)
Gambar 12. Hasil pengukuran padatan sisa hidrolisis protein kerang hijau Gambar 12 menunjukkan penurunan padatan sisa substrat terhadap fungsi waktu hidrolisis. Berdasarkan Gambar 12 diatas dapat dilihat bahwa hidrolisis substrat dengan perlakuan tanpa penambahan enzim kolagenase (perlakukan kontrol) menghasilkan padatan sisa yang lebih besar dibandingkan dengan perlakuan menggunakan enzim kolagenase dengan bertambahnya waktu hidrolisis. Pada awal hidrolisis, jumlah padatan sisa yang terdapat pada kontrol adalah sebesar 4,02 %, sedangkan pada akhir hidrolisis jumlah tersebut mengalami penurunan menjadi 2,13 %. Hidrolisis dengan penambahan enzim kolagenase sebesar 5 % pada hidrolisis no1 jam menghasilkan jumlah padatan sisa sebesar 2,43 %, selanjutnya turun hingga menjadi 1,32 % pada waktu hidrolisis 12 jam. Dengan demikian semakin lama waktu hidrolisis, maka akan semakin berkurang pula padatan sisa substrat yang dapat dihidrolisis. Berdasarkan hasil uji homogenitas ragam, nilai padatan sisa substrat memiliki nilai yang menyebar homogen (P-value > 0,05) (Lampiran 8 no. a). Hasil uji ragam (ANOVA) (Lampiran 8 no. c) diperoleh h a i l bahwa faktor konsentrasi enzim, waktu hidrolisis, dan interaksi keduanya tidak memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap nilai padatan sisa substrat pada tingkat kepercayaan 95 %. Secara kimiawi proses hidrolsis ini telah berlangsung yaitu dengan meningkatnya kadar a-amino nitrogen bebas, akan tetapi secara fisik proses hidrolisis tersebut belum mengalami perubahan, yang diindikasikan dengan padatan sisa substrat yang mengalami penurunan tetapi belum maksimal. Hal ini
dikarenakan enzim yang digunakan masih dalam bentuk ekstrak kasar enzim kolagense yang memiliki aktivitas enzim yang sangat kecil yaitu sebesar 0,049 U/ml. Selain itu waktu hidrolisis yang tidak terlalu lama dapat menjadi faktor padatan sisa yang
dihasilkan tidak terlalu besar.
Dengan demikian
diperlukan penamballan waktu hidrolisis yang lebih lama sehingga padatan sisa yang dihasilkan menjadi lehih kecil. 4.3.2. Kadar a-amino nitrogen bebas Protein yang terhidrolisis akan membebaskan asam-asam amino. Jumlah asam amino yang terdapat dalam hidrolisis protein disehut kadar a-amino nitrogen bebas. Oleh karena itu, uji a-amino nitrogen bebas dilakukan untuk mengetahui kadar asam amino yang terdapat dalanl hidrolisat protein kerang hijau. Selain itu juga merupakan indikator pemutus rantai ikatan peptida yang menjadi parameter untuk menentukan kesempurnaan proses hidrolisis.
Kadar a-amino nitrogen
behas hasil hidrolisis protein kerang hijau disajikan pada Gambar 13.
i
0
3
6
9
waktu hidrolisistiam)
12
II
Gambar 13. Knrva peningkatan kadar a-amino nitrogen bebas Hidrolisis protein yang dilakukan selama penelitian ini menghasilkan peningkatan jumlah a-amino nitrogen bebas dengan semakin lamanya waktu hidrolisis. Pada hidrolisis substrat dengan perlakuan tanpa adanya penamhahan enzim kolagenase, a-amino nitrogen bebas yang dihasilkan sebesar 0,102 g /I00 g pada hidrolisis jam ke-nol. Selanjutnya a-amino nitrogen hebas terus mengalami peningkatan hingga mencapai nilai maksimum pada waktu hidrolisis selama sembilan jam, yaitu sebesar 0,156 g I100 g, kemudian nilai tersebut mengalami p e n m a n hingga aWlir hidrolisis. Konsentrasi e i ~ i m kolagenase yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebesar 5 %. Apabila dibandiigkan antara substrat
tanpa penambahan enzim dengan substrat yang ditambahkan enzim, maka nilai aamino nitrogen bebas yang dihasikan pun akan mengalami peningkatan yang lebili besar daripada substrat tanpa penambahan enzim (kontrol). Berdasarkan Gambar 13, hidrolisis substrat dengan perlakuan penambahan enzim sebesar 5 % menghasilkan 0,119 g 1100 g a-amino nitrogen bebas pada waktu hidrolisis no1 jam. Nilai tersebut masih mengalami peningkatan hingga mencapai waktu hidrolisis enam jam. Pada tahap ini terjadi regenerasi enzim, yaitu pelepasan enzim dari kompleks enzim substrat atau deasilasi. Kadar aamino nitrogen bebas dengan nilai tertinggi dicapai pada waktu hidrolisis enam jam, yaitu sebesar 0,184 g 1100 g. Semakin tinggi nilai a-amino nitrogen bebas pada hidrolisis berarti proses hidrolisis berjalan dengan baik. Hidrolisis protein akan menambah kepolaran protein sehingga molekul protein yang tidak larut dalam air akan larut dengan adanya proses hidrolisis. Hal ini akan menyebabkan kenaikan kadar a-amino nitrogen bebas dengan bertambahnya waktu hidrolisis (Harrow Mazur 1971 diacu dalam Hidayat 2005). Selain itu, kecepatan reaksi hidrolisis juga dipengaruhi oleh kestabilan enzim, semakin stabil kondisi enzim maka kecepatan reaksi akan semakin meningkat. Namun dengan semakin bertambahnya waktu, kestabilan enzim akan menurun yang berakibat pada m e n m y a proses hidrolisis. Menurunnya kecepatan reaksi disebabkan oleh beberapa hal, yaitu penurunan ikatan peptida spesifik bagi enzim, inhibisi produk, inaktivasi enzim dan kompetisi antara substrat asli atau protein yang tidak terhidrolisis dengan peptida yang terbentuk selama hidrolisis (Fachraniah 2002 diacu dalam Praptono 2006). Reaksi enzimatik dipengaruhi oleh suasana kelistrikan enzim tersebut bekerja.
Kestabilan molekul protein
dipengaruhi oleh kestabilan ikatan-ikatan pada molekul enzim.
Kestabilan
molekul enzim ini inempengaruhi pengikatan enzim dengan substrat, baik secara langsung maupun tidak langsung. Berdasarkan uji homogenitas ragam, dapat dikatakan bahwa nilai a-amino nitrogen bebas menyebar homogen (P-value > 0,05) (Lampiran 9 no. a). Hasil analisis statistika menggunakan RAL faktorial dua kali ulangan dengan selang kepercayaan 95 % (a > sig) meilunjukkan bahwa konsentrasi enzim dan waktu hidrolisis memberikan pengarull yang berbeda nyata terhadap nilai a-amino
nitrogen bebas pada tingkat kepercayaan 95 % (Lampiran 9 no. c). Oleh karena itu dilak~kanuji lanjut yaitu uji Tukey untuk mengetahui perlakuan mana saja yang berbeda nyata (Lampiran 9 no. d). Sedangkan interaksi antara konsentrasi enzim dengan waktu hidrolisis tidak memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap nilai a-amino nitrogen bebas. Hasil uji Tukey yang dilakukan (Lampiran 9 no. d) menunjukkan bahwa pengaruh waktu hidrolisis 6 jam dan 9 jam berbeda nyata dengan waktu hidrolisis
0 jam terhadap nilai a-amino nitrogen bebas. Hal ini menunjukkan bahwa waktu hidrolisis 6 jam dan 9 jam lebih baik karena menghasilkan nilai a-amino nitrogen bebas yang lebih tinggi dibandingkan dengan waktu hidrolisis 0, 3, dan 12 jam (Gambar 12).
4.3.3. Derajat hidrolisis protein Derajat hidrolisis merupakan suatu parameter yang menunjukkan kemampuan protease untuk menguraikan protein dengan membandingkan jumlah a-amino nitrogen bebas terl~adaptotal nitrogen. Derajat hidrolisis digunakan untuk menentukan derajat kesempurnaan proses hidrolisis. Salah satu faktor yang mempengaruhi hidrolisis adalah waktu. Semakin lama proses hidrolisis maka nilai derajat hidrolisis akan meningkat. Hal ini diketahui dengan nilai perbandingan antara a-amino nitrogen bebas terhadap total nitrogen yang terukur selama proses hidrolisis berlangsung.
Gambar 14.
menunjukkan bahwa derajat lidrolisis substrat dengan perlakuan tanpa penambahan enzim kolagenase memiliki nilai cukup kecil apabila dibandingkan dengan perlakuan dengan penambahan enzim kolagenase.
Gambar 14. Kurva derajat hidrolisis substrat
Berdasarkan Gambar 14. dapat dilihat bahwa derajat hidrolisis yang terbentuk pada kontrol adalah sebesar 0,349 yang dicapai pada waktu hidrolisis jam ke-nol. Selanjutnya, nilai tersebut meningkat berturut-turut secara bertahap hingga waktu hidrolisis mencapai maksim~unpada jam ke sembilan, yaitu sebesar 0,507. Nilai derajat hidrolisis yang terbentuk untuk substrat dengan penambahan enzim kolagenase adalah sebesar 0,394 pada hidrolisis jam ke- nol. Peningkatan nilai derajat hidrolisis terus terjadi sampai batas maksimum, pada waktu hidrolisis selama enam jam, yaitu sebesar 0,594. Kisaran nilai untuk derajat hidrolisis yang ditetapkan oleh Food Chemical
Codex (Hidayat 2005), yaitu berada pada kisaran 0,02 sampai 0,67. Nilai derajat hidrolisis yang dihasilkan pada penelitian ini berkisar antara 0,349-0,594. Dengan demikian dapat dikatakan bahwa nilai derajat hidrolisis yang dihasilkan masih berada dalam kisaran yang telah ditentukan. Peningkatan kadar a-amino nitrogen bebas akan meningkatkan nilai derajat hidrolisis. Derajat hidrolisis merupakan indikator seberapa besar proses hidrolisis dapat memecah ikatan protein pada substrat menjadi asam amino dan peptida yang terlarut dalam air. Hal tersebut dapat dilihat pada Gambar 13 dan Gambar 14.
Kadar a-amino nitrogen bebas dari proses hidrolisis tanpa
penambahan enzim kolagenase meningkat pada waktu hidrolisis sembilan jam. Demikian pula halnya yang tejadi pada proses hidrolisis menggunakan penambahan enzim kolagenase 5 % dengan kadar a-amino nitrogen bebas tertinggi pada waktu hidrolisis enam jam. Hal yang serupa juga tejadi pada nilai derajat hidrolisis, yaitu derajat hidrolisis memiliki nilai maksimum pada hidrolisis jam ke sembilan (kontrol) dan jam ke enam (enzim kolagenase konsentrasi 5 %). Dengan demikian dapat dikatakan bahwa semakin tinggi kadar a-amino nitrogen bebas yang dihasilkan, maka derajat hidrolisis akan semakin besar, sebaliknya apabila kadar a-amino nitrogen bebas yang dihasilkan mengalami p e n m a n , maka derajat hidrolisis yang dihasilkan akan semakin kecil. Uji homogenitas ragam terhadap nilai derajat bebas pada proses hidrolisis menunjukkan bahwa nilai derajat bebas menyebar secara homogen (P-value > 0,05) (Lampiran 10 no. a).
Dari hasil analisis ragam (Lampiran 10 no. c)
diketahui bahwa konsentrasi enzim memberikan pengamh yang berbeda nyata
terhadap nilai derajat hidrolisis pada selang kepercayaan 95 %. Akan tetapi uji lanjut Tukey tidak dapat dilakukan karena variabel konsentrasi enzim tidak dapat dilakukan test Post Hoc karena hanya terdiri dari dua nilai, yaitu tanpa penambahan enzim kolagenase (konsentrasi 0 %) dan dengan penambahan enzim kolagenase (5 %), sedangkan agar lest Post Hoc dapat dianalisis minimal terdiri dari tiga nilai.
Meskipun demikian, secara deskriptif, penambahan enzim
kolagenase dengan konsentrasi 5 % memiliki nilai derajat hidrolisis yang lebih tinggi dibandingkan dengan tanpa penambahan enzim kolagenase (Gambar 14).
5. KESIMPULAN DAN SARAN
5.1
Kesimpulan Bagian organ dalam ikan tuna (hepatopankreas, pyloric caeaca dan hati) dapat
digunakan sebagai sumber enzim kolagenase.
Ekstrak kasar enzim kolagenase yang
dihasilkan memiliki aktivitas enzim sebesar 0,030 Ulml. Ekstrak kasar enzim kolagenase tersebut kernudian diendapkan dengan ammonium sulfat pada konsentrasi 70 % kejenuhan dengan aktivitas tertinggi sebesar 0,049 Ulml. Karakteristik biokimia enzim kolagenase yang dihasilkan dari hasil pengendapan ammonium suifat konsentrasi 70 % kejenuhan, yaitu memiliki pH optimum 8,O; suhu , Co2+, dan ~ optimum 60 OC; ion logam ~ a + Ca2+,
n dapat ~ +meningkatkan aktivitas
~ + menurunkan aktivitas enzim enzim kolagenase, sebaliknya ion logam ~ a dapat kolagenase; serta PMSF 5 mM dapat menghambat aktivitas enzim kolagenase sebesar 23,64 %. Hidrolisat kerang hijau yang dihidrolisis menggunakan enzim kolagenase menghasilkan padatan sisa rata-rata berkisar antara 2,43 %-1,32 %; kadar a-amino nitrogen bebas 0,184 g 1100 g, dan nilai derajat hidrolisis sebesar 0,5936 pada waktu hidrolisis enatn jam. Berdasarkan analisis statistik dapat disimpulkan bahwa parameter tersebut berbeda nyata dibandingkan dengan kontrol. 5.2
Saran Perlu dilakukan penelitian yang serupa menggunakan bagian organ dalam yang
lebih spesifik dari jenis ikan yang berbeda. Penelitian ini masih membutuhkan penelitian lanjutan yaitu pemurnian enzim menggunakan tahapan yang lebih lanjut, seperti zimogram atau kromatografi sehingga dapat diperoleh enzim kolagenase yang lebih murni.
Selain itu juga perlu dilakukan karakterisasi dari enzim kolagenase seperti
kestabilan terhadap panas, spesifitas terhadap substrat, dan lainnya. Penambahan waktu hidrolisis dalam aplikasi dari enzim kolagenase perlu dilakukan sehingga padatan sisa substrat yang dihasilkan lebih kecil.
DAPTAR PUSTAKA [AOAC] Association of Analytical Chemist Publisher. 1995. Oficial Methods of Analysis. Washington DC: AOAC Publisher Affandi R, Sjafei DS, Rahardjo MF, Sulistiono. 2005. Fisiologi I h n . Bogor: Departemen Manaajeinen Sumberdaya Perairan. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor. Anonim. 2006. Sifat-sifai enzim. http://www.wikivedia.co.id [4 September 20071 Aunstrup K. 1979. Production isolation and economic of extracellular enzymes. Di dalam: Wingard LB., Katzie EK., dan Golstein L, editor. Applied Biochemishy and Bioengineering. Volume. 11. New York: Academic Press. Bjarnason JB. 2001. Biotechnological applications of Jish offal in Iceland. Science Institute. University of Iceland. Island. Chaplin M.F, Bucke C. 1990. Enzyme Technology. Cambridge: Cambridge University Press. deMan JM. 1997. Kimia Mahnan Edisi Kedua. Panduwinata K, penerjemah. Bandung: Penerbit ITB. [DKP] Departemen Perikanan dan Kelautan. 2005. http://www.dkv.oo.id [23 Mei 20071
Revitalisasi Perikanan.
-
Direktorat Pen~olahanHasil. 2006. Peninakatan Nilai Tambah Tuna Melalui Teknologi Penangunan dun Pengolahan. Direktorat Jendral Pengolahan dan Pemasaran Hasil Perikanan. Departemen Kelautan dan Perikanan. Jakarta . 2
Direktorat Jenderal Perikanan. 1983. Buku Petunjuk Teknis Pengalengan Ikan Seri I Ikan Tuna. Jakarta. Fogarty WM, Kelly CT. 1979. Development in ~nicrobialextracellular enzyme. Di dalanl: Wiseman, A, editor. Topics in Enzyme and Fermentation Biotechnology. Volume 111. New York: John Wiley and Sons. Gesualdo AML, Li-Chan ECY. 1999. Functional properties of fish protein hydrolysate from herring (Clupe harengus). Journal of Food Science 64 (6) : 1000-1004. Hames BD, Hooper NM. 2000. Biochemistry: The Instant Notes. Hongkong : Springer-Verlag.
z " edition. ~
Harris ELV, Angal S. 1989. Protein puriJication methods a practical approach. New York: IRL Press
Harper H, Rodwell VM, Mayes PA. 1979. Bioki~nia.Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Terjemahan dari: Harper's Biochemistry. Hidayat T. 2005. Pembuatan hidrolisat protein dari ikan selar kuning (Caranx leptolepis) dengan menggunakan enzim papain [skripsi]. Bogor: Program studi Teknologi Hasil Perikanan. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor. Kim SK, Park PJ, Kim JB, Shahidi F. 2002. Purification and characterization of
the collagenase from the tissue of filefish, Novoden modestrus. Journal of Biochemistery and Molecular Biology. 35 (2) : 165-171. Kirk RE, Othmer DF. 1953. Encyclopedia of Chemical Technology. Volume IX. New York: The Interscience Publishing, Inc. Lehninger AL. 1993. Dasar-dasar Biokimia Jilid I. Thenawidjaya M, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: The Foundations of Biochemistry. Lestari S. 2001. Pemanfaatan tulang ikan tuna (limbah) untuk pembuatan tepung tulang. [skripisi]. Bogor: Fakultas Perikanan dan Ihnu Kelautan. Institut Pertanian Bogor. Lestari SD. 2005. Analisis sifat fisika, kimiawi, dan rheologi gelatin kulit hiu gepeng (Alopis sp.) dengan penambahan MgS04, sukrosa dan gliserol. [skripsi]. Bogor: Program studi Teknologi Hasil Perikanan. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor. Muchtadi D, Palupi NS, Astawan M. 1992. Enzim dalam Zndustri Pangan. Bogor: PAU-IPB. Palmer T. 1991. UnderstandingEnzymes. Ellis Hormood Limited. England: West Sussex Park PJ, Lee SH, Byun HG, Kim SH, Kim SK. 2002. Purification and characteristization of a collagenase from the Mackerel, Scomber japonicus. Journal of Bioche7nistery and Molecular Biology. 35 (6): 576-582. Pelczar MJJr, Chan ECS. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Volume 1. Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah. Jakarta: Universitas Indonesia Press. Tejemahan dari: Elements of Microbiology Poedjiadi A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Universitas Indonesia Press. Poemomo D. 1992. Pemanfaatan limbah udang di pengolahan hasil perikanan tradisional (PHPT) Muara Angke, Jakarta Utara. [Laporan Praktik Lapangan]. Bogor: Program Studi Pengolahan Hasil Perikanan. Institut Pertanian Bogor.
Praptono B. 2006. Produksi peptone ikan gulamah (Argyrosonzun sp.) sebagai sumber nitrogen media pertumbuhan mikroba [skripsi]. Bogor: Program studi Teknologi Hasil Perikanan. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. lnstitut Pertanian Bogor. Richardson T, Hyslop DB . 1985. Enzyme. Di dalam: Owen R Fennema editor. Food Chemistery, 2nded, Hal. 371. New York dan Base1 : Marcel Dekker Inc Ryta. 2001. Karakterisasi enzim protease pemecah keratin dari isolat teimofil OB. [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian. Institut Pertanian Bogor. Saanin H. 1984. Tahonotni dun Kunci IdentiJkasi Ikan. Vol I dan 11. Bandung: Binacipta Santoso TB. 1998. Pengaruh waktu pemanasan, pH, dan jenis gula pereduksi pada pembentukan flavor dari hidrolisat protein daging merah ikan tuna (Thunnus sp.) [sk~ipsi].Bogor: Program studi Teknologi Hasil Perikanan. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor. Scopes RK. 1987. Protein Purzjkation, Priciple dun Practice,. New York, Heidenburg, Berlin: Springer-Verlag. Shahidi F, Botta JR. 1994. Seafood : Chemistry, Processing Technology and Quality. Glasgow : Blackie academic and professional. Sudarmadji S, Haryono B, Suhardi. 1989. Analisa Bahan Makanan dun Pertanian. Yogyakarta : Penerbit Liberty Yogyakarta bekerja sama dengan Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi Universitas Gadjah Mada. Suhartono MT. 1989. Enzim dun Bioteknologi. Bogor: Dirjen Dikti, PAU Bioteknologi IPB. Trilaksani W, Riyanto B. 2006. Pengenalan Awal dun Potensi Hasil Samping dun Limbah Industri Hasil Perikanan. [diktat kuliah] Bogor: Departemen Teknologi Hasil Perairan. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor. Walker JM. 1988. Methods in Molecular Biology New protein Techniques. Volume 111. New Jersey: Humana Press. Walpole. 1992. Pengantar Statistik. Sumantri B, penerjemah. Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama. Terjemahan dari: The Introduction of Statislics. Webb EC, Dixon M.. 1979. Enzymes. New York: Academic Press.
West ES, Todd WC. 1964. Text Book of Biochemisiry. New York: the Mac Millan Co. Wilson K, Walker J. 2000. Principle and Techiques of Practical Biochemistery. 5" Edition. Cambrige: Cambrige University Press. Wijaya H. 2001. Pengaruh konsentrasi asam asetat dan lama perendaman kulit ikan pari (Trygon spp.) pada pembuatan gelatin. [skripsi]. Bogor: Program studi Teknologi Hasil Perikanan.Faku1tas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor. Wirahadikusunah M. 1989. Biokimia, Protein, Enzim, dun Asam Nukleat. Bandung: ITB Press. Wiratmaja H. 2006. Perbaikan nilai tambah limbah tulang ikan tuna (Thunnus sp.) menjadi gelatin serta analisis fisika-kimia. [skripsi]. Bogor: Program studi Teknologi Hasil Perikanan. Fakultas Perikanan dan I l m Kelautan. Institut Pertanian Bogor.
Lampiran 1.
Bahan-bahan untuk pengukuran aktivitas enzim kolagenase (Moore dan Stein 1954 diacu dalam Park et al. 2002)
1. Buffer Tris-HC10,05 M pH 7,5 yang terdiri dari 5 mM CaC12 Tris base sebanyak 6,057 gram ditambahkan CaClz sebanyak 1,4702 gram. Kemudian bahan tersebut dilarutkan ke dalam 995 ml akuades. Lalu ditepatkan pHnya hingga 7,5 dengan penambahan HCl pekat sedikit demi sedikit. Kemudian ditepatkan volumenya hingga satu liter. 2. Tirosin standar Tirosin sebanyak 0,2 g dilarutkan ke dalam 220 ml buffer Tris-HC1 0,2 M pH 8. Selanjutnya larutan diaduk perlahan dengan magnetic stirrer. Larutan ini disimpan pada suhu 0-4 OC dan dapat digunakan selama satu minggu.
3. Asam trikloro asetat (TCA) 50 % (wlv) Sebanyak 50 gram TCA dilarutkan dalam akuades hingga volume akhirnya 100 ml. Selanjutnya diaduk dengan magnetic stirer hingga larut dan disimpan pada suhu 0-4 OC. 4. Larutan nynhydrin 0,l % (wlv) Sebanyak 0,l gram Larutan nynhydrin dilarutkan dalam akuades hingga volume akhirnya 100 ml. Selanjutnya diaduk dengan magnetic stirer hingga larut dan disimpan pada suhu 0-4 OC. 5. 1-propanol50 % (vlv) Sebanyak 50 ml 1-propanol dilarutkan dalam akuades hingga volume akhirnya 100 ml. Selanjutnya diaduk dengan magnetic stirrer hingga larut dan disimpan pada suhu 0-4 OC
Lampiran 2. Tabel pengendapan ammonium sulfat (Bollag dan Edelstein 1991) Gram ammonium sulfat yang ditambahkan per liter larutan enzim Starting Concentration 0% 5% 10 % 15 % 20 % 25 % 30 % 35 % 40 % 45 % 50 % 55 % 60 % 65 % 70 % 75 % 80 % 85 % 90 % 95 %
5% 27
10% 55 27
15% 20% 84 113 56 85 28 57 28
25% 144 115 86 58 29
30% 176 146 117 88 59 29
35% 208 179 149 119 89 60 30
40% 242 212 182 151 121 91 61 30
Final Concentration: 45% 50% 55% 60% 277 314 351 390 246 282 319 357 216 251 287 325 185 219 255 292 154 188 223 260 123 157 191 227 92 126 160 195 62 94 128 163 31 63 96 130 31 64 97 32 65 33
65% 430 397 364 331 298 265 232 199 166 132 99 66 33
70% 472 439 405 371 337 304 270 236 202 169 135 101 67 34
75% 516 481 447 413 378 344 309 275 241 206 172 138 103 69 34
80% 561 526 491 456 421 386 351 316 281 245 210 175 140 105 70 35
85% 608 572 537 501 465 429 393 358 322 286 250 215 179 143 107 72 36
90% 657 621 584 548 511 475 438 402 365 329 292 256 219 183 146 110 73 37
95% 708 671 634 596 559 522 485 447 410 373 335 298 261 224 186 149 112 75 37
100% 761 723 685 647 609 571 533 495 457 419 381 343 305 266 228 190 152 114 76 38
Lampiran 3.
Tabel pengendapau ammonium sulfat (Bollag dan Edelstein 1991)
Garam ammollium sulfat yang ditambahkan per ml larutan enzim (yang digunakan pada saat penelitian)
Konsentrasi . .keienullani%) 30
Ainonium sulfat Gram) 0.176
Lampiran 4. Prosedur uutuk menguknr aktivitas protease Pereaksi Sampel (ml) Blanko (ml) Standar (mi) Buffer Tris-HCI (0,05 M, pH 7,5) 1,OO 1,OO 1,OO Substrat kolagen 5,OO 5,OO 5,OO Enzim 0,10 . . 0,lO Tirosin standar Buffer Tris-HCI (0,05 M, pH 7 3 ) 0,IO diinkubasi pada suhu 37 OC seialna 60 menit TCA 50 % 0,20 0,20 0,20 diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit, lalu disaring dengan menggunakan kertas saring Suoernatan 0,20 0,20 0,20 ~ a i u t a nnynhydrin 0,l % 1,OO 1,OO 1,00 diinkubasi pada suhu 100 "C selama 20 menit 1-propano150 % 5,OO 5,OO 5,OO Diukur dengan spektrofotometer pada jL = 570 nm
Lampiran 5. Kurva standar penentuan konseutrasi protein menurut Bradford (1976) Konsentrasi BSA ( m d ~ n l ) 0.1
Volume BSA (ml) 0.05
Volunir akuades (ml) 0.95
Standar BSA (Ekstrak kasar enzim kolagenase) Konsentrasi (X)
Absorbansi
y_Blanko
IY 1
Kuwa standar BSA (Ekstrak kasar enzim kolagenase)
Contoh perhitungan kadar protein ekstrak kasar enzim kolagenase: Y
= 0,0769X
+ 0,0508
Jadi, kadar protein crude enzim kolagenase yang dihasilkan sebesar 1,179 mg/ml.
Standar BSA (Enzim kolagenase hasil pengendapan dengan amonium sulfat)
Konsentrasi (X) 0,1 0,2 0,3 0,4 02 0,6 0,7 0,s 0,9 18
Absorbansi (Y) 0,086 0,09 0,095 0,098 0,101 0,104 0,11 0,118 0,126 0,132
Y-Blanko 0,036 0,04 0,045 0,048 0,05 1 0,054 0,06 0,068 0,076 0,082
Kurva standar BSA (Enzim kolagenase hasil pengendapan dengan amonium sulfat)
Lampiran 6. Grafik Uji Homogenitas Ragam dan Analisis statistik untuk nilai aktivitas enzim dalam supernatan (a). Graiik uji homogenitas ragam nilai aktivitas enzim dalam supematan Test for Equal Variances for aktivitas supernatan
I,"
11- &--12-
p-va1ue
0.538
I
$
13- 1 -
3 1P
k 1415- 9---i 160,O
0,l
0,2
0,3
0,4
0,s
0.6
0.7
0.8
0,9
95% BonferroniConfdence Intervals for StDevs
(b). Tabel statistik deskriptif nilai aktivitas enzim pada supematan
total
1
12
1 ,021182 1 ,0058460 /
,0016876
1
,017468
/
,024896
1
,0134
1
(c). Hasil uji ragam (ANOVA) nilai aktivitas enzim pada supernatan ANOVA
Between Groups Within Groups Total
Sum of Squares ,000 ,000 ,000
Jika Sig > a, maka terima HO Jika Sig
5 6 11
Mean Square ,000 ,000
F 12,652
Sig. ,004
,0292
Hipotesis : HO = Tidak ada perlakuan yang memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap nilai aktivitas enzim pada supematan.
HI
= Ada
perlakuau yang memberikan pengaruh yang berbeda nyata
terhadap nilai aktivitas enzim dalam supematan. Kesimpulan : Nilai sig < a, maka penambahan konsentrasi amonium sulfat inemberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap nilai aktivitas enzim dalam supernatan. (d). Uji Lanjut Tukey
Lampiran 7. Grafik Uji Homogenitas Ragam dan Analisis statistik untuk nilai aktivitas enzim dalam endapan (a). Grafik uji homogenitas ragam nilai aktivitas enzim dalam endapan.
-
Test for Equal Variances for aktivitas endapan
11-
P-V*~
12- I 13-
3 2
0.869
I
-
k 14- w 1516-
I
49
0.0
0,l
0,2
0,3
0,4
0,s
0,6
0,7
0.8
0.9
950hBonferroniConfdence Intervals for StDevs
(b). Tabel statistik deskriptif nilai aktivitas enzim pada endapan
(c). Hasil uji ragarn (ANOVA) nilai aktivitas enzim pada endapan ANOVA
Between Groups Within Groups Total
Sum of Squares ,001 ,000 ,001
df 5
6 11
Mean Square ,000 ,000
F 24,750
Sig. ,001
Jika Sig > a, maka terima HO Jika Sig < a, maka terima H1 Hipotesis : HO = Tidak ada perlakuan yang memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap nilai aktivitas enzim pada endapan H1
= Ada
perlakuan yang memberikan pengaruh yang berbeda nyata
terhadap nilai aktivitas enzim pada endapan. Kesimpulan : Nilai sig < a, maka penambahan konsentrasi amoniurn sulfat lnemberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap nilai aktivitas enzim dalam endapan. (d). Uji Lanjut Tukey
I
I
. ..
I
Mean
I
1
I
Selana keuercayaan
I
Lampiran 8. Hasil analisis dan uji statistik (ANOVA) untuk nilai padatan sisa substrat hidrolisis protein kerang hijau (a). Grafik uji homogenitas ragam untuk nilai padatan sisa substrat hidrolisis protein kerang hijau
Test for Equal Variances for padatan sisa
1112-
-
M
P-Value
13- w 14r
3
a21-
.
I
'B
22-
r
23-
*
24-
W
25-
M
0
I
I
z
100 200 300 400 500 600 95% BOnferroni Confrlence Intervak for StDevs
@). Rata-rata nilai padatan sisa substrat hidrolisis protein kerang hijau
pH
8,o
konsentrasi
5%
Waktu (Jam)
0 3 6 9 12
Padatan Sisa (%) Sampel Kontrol 1 2 1 2 2,34 2,53 5,16 2,88 1,99 2,78 4,67 2,13 2,39 2,23 3,23 2,33 2,63 1,44 2,23 2,28 1,54 1,09 2,23 2,03 -
Rataan Sampel
Kontrol
2,435 2,385 2,31 2,035 1,315
4,02 3,4 2,78 2,255 2,13
(c). Hasil uji ANOVA padatan sisa substrat pada hidrolisis protein kerang hijau Jumlah Derajat Sumber keraga~nan kuadrat bebas 10 Model 135,469(a) perlakuan 1 3,428 4 5,658 waktu perlakuan * 4 1,082 waktu 10 7,395 Sisa 20 142,863 Total a R kuadrat = ,948 (R kuadrat biasa = ,896)
Kuadrat tengah 13,547 3,428 1,415
,271 ,739
F hitung
1
Sig.
18,320 4,636 1,913
,000 ,057 ,185
,366
,828
Jika Sig > a, maka terima HO Jika Sig < a, maka terima H1 Hipotesis : HO = Tidak ada perlakuan yang memberikan pengai-uh yang berbeda nyata terhadap nilai padatan sisa substrat. HI
=
Minimal ada satu perlakuan yang memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap nilai padatan sisa substrat
Kesimpulan : nilai Sig > a (0,057 > 0,05; 0,185 > 0,05; dan 0,366 > 0,828)-
Terima HO
Berarti perlakuan konsentrasi enzim, waktu hidrolisis dan interaksi keduanya tidak memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap nilai padatan sisa substrat pada tingkat kepercayaan 95 %. Dengan demikian tidak dilakukan uji lanjut Tukey.
Lampiran 9. Hasil analisis dan uji statistik (ANOVA) untuk nilai a-amino nitrogen bebas hidrolisis protein kerang hijau (a). Grafik uji homogenitas ragam untuk nilai a-amino nitrogen bebas hidrolisis protein kerang hijau Test for Equal Variances for alpha amino nitogen bebas
~~I
11j.-----I
14-
@
15-
5-
$ 21-
s3
I
,
22- M c
232425-
x
5
0
2 4 6 8 10 12 95% Bonferroni Confnlence Ilttewals for StDevs
(b). Rata-rata nilai a-amino nitrogen bebas hidrolisis protein kerang hijau
PH
8.0
konsentrasi
a-amino nitrogen bebas Sampel Kontrol
Waktu (Jam)
2 1 2 0.115 0,123 0,091 0,113 0,167 0,128 0,117 0,112 0,197 0,172 0,122 0,148 0,149 0.203 0,152 0,160 0,165 0,167 0,114 0,152 -
0 3 6 9 12
5%
Rataan Sarnpel
Kontrol
0,119 0,147 0.184 0,176 0,166
0,102 0,114 0,135 0.156 0.133
(c).Hasil uji ANOVA a-amino nitrogen bebas pada hidrolisis protein kerang hijau Sumber keragaman Model konsentrasi waktu konsentrasi* waktu Galat Total
1
Jumlah kuadrat ,425(a) ,005 ,008
Derajat bebas
4
Kuadrat tengah ,042 ,005 ,002
,001
4
,000
,004 ,428
10 20
,000
'(l'
a R Kuadrat = ,991 (R Kuadrat biasa = ,982)
1
F hitung
Sig.
108,528 11,891 5,245
,000 ,006 ,015
,426
,787
Jika Sig > a, maka terima HO Jika Sig < a, maka terima HI Hipotesis : HO
= Tidak
ada perlakuan yang memberikan pengaruh yang berbeda
nyata terhadap nilai a-amino nitrogen bebas. H1
=
Minimal ada satu perlakuan yang memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap nilai a-amino nitrogen bebas.
Kesimpulan : Nilai Sig < a (0,006 <0,05; 0,015 <0,05)
Tolak HO
Berarti perlakuan konsentrasi enzim dan waktu hidrolisis memberikan penganth yang berbeda nyata terhadap nilai a-amino nitrogen bebas pada tingkat kepercayaan 95 %. Dengan demikian dilakukan uji lanjut Tukey, Nilai Sig > a (0,787 > 0,05)
----t
Terima HO
Berarti interaksi antara konsentrasi enzim dengan waktu hidrolisis tidak memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap a-amino nitrogen bebas pada tingkat kepercayaan 95 %. Dengan demikian tidak dilakukan uji lanjut Tukey. (d).Uji lanjut Tukey (variabel waktu) (I) waktu
Selisih ratarata (1-J)
(J) waktu
Selang kepercayaan 95 % Std. Error
Sig.
Batas Batas atas bawah 0 jam 3 jam -.02050 ,013985 ,604 -,06653 ,02553 6 jam -,04925(') -,09528 -,00322 ,013985 ,035 9 jam -,05550(') -.lo153 -,00947 ,013985 ,018 12 jam -,03900 -.08503 ,00703 ,013985 ,108 3 jam 0 jam ,02050 -,02553 ,06653 ,013985 ,604 6 jam -.02875 -,07478 ,01728 ,013985 ,309 9 jam -,03500 -,08103 ,01103 ,013985 ,166 ,02753 12 jam -,01850 -,Of3453 ,013985 ,685 ,09528 6 jam 0 jam ,04925(') ,00322 ,013985 ,035 3 jam ,02875 -.01728 ,07478 ,013985 ,309 9 jam -.00625 -,05228 ,013985 ,990 ,03978 12 jam ,01025 ,013985 ,944 -,03578 ,05628 9 jam 0 jam ,05550(3 ,013985 ,018 ,00947 ,10153 3 jam ,166 -,01103 ,08103 ,03500 ,013985 ,00625 6 jam -,03978 ,990 ,05228 ,013985 12 jam ,01650 -,02953 ,762 ,06253 ,013985 I 2 jam 0 jam -,00703 ,108 ,08503 ,03900 ,013985 ,01850 3 jam -,02753 ,685 ,06453 ,013985 6 jam -,01025 -,05628 ,013985 ,03578 ,944 9 jam -,01650 -013985 ,762 -,06253 ,02953 Tanda * menunjukkan adanya pengamh yang berbeda nyata antara perlakuan dengan nilai a= 0,05
I
1 1
/
1
1
1
1
Lampiran 10. Hasil analisis dan uji statistik (ANOVA) untuk nilai derajat hidrolisis pada hidrolisis protein kerang hijau (a). Grafk uji homogenitas ragam untuk nilai derajat hidrolisis pada hidrolisis protein kerang hijau Test for Equal Variances for derajat hidrolisis
12 13
0
10
20
30
40
50
60
95% Bonferroni Confdence Intervak for StDevs
(b). Rata-rata nilai derajat bebas pada hidrolisis protein kerang hijau Sampel 0
alpha-amino nitrogen bebas (gr1100gr) 0,119
Total nitrogen(%) 0,302
DH 0,39404
Kontrol 0
alpha-amino nitrogen bebas (gr1100gr) 0,102
Total nitrogen(%) 0,292
DH 0,34932
(c). Hasil uji ANOVA nilai derajat bebas pada hidrolisis protein kerang hijau Sumber keragaman Model konsentrasi waktu konsentrasi* wakhl Galat Total
Jumlah kuadrat 4,553(a) ,039 ,077
Derajat bebas 10 1 4
Kuadrat tengah ,455 ,039 ,019
F 58,042 5,026 2,457
Sig. ,000 ,049 ,I 14
,006
4
,001
,185
,941
,078 4,632
10 20
,008
a R Kuadrat = ,983 (R kuadrat biasa = ,966)
Jika Sig > a, maka terima HO Jika Sig < a, maka terima H1 Hipotesis : HO
= Tidak
ada perlakuan yang memberikan pengaruh yang berbeda
nyata terhadap nilai a-amino nitrogen bebas. H1
=
Minimal ada s a t - perlakuan yang memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap nilai a-amino nitrogen bebas.
Kesimpulan : Nilai Sig < a (0,049 <0,05)
-
Tolak HO
Berarti perlakuan konsentrasi enzim memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap nilai derajat bebas pada tingkat kepercayaan 95 %. Variabel konsentrasi enzim tidak dapat dilakukan test Pos Hoe karena hanya terdiri dari dua nilai (0 % dan 5 %). Dengan demikian uji lanjut T u h y tidak dapat dianalisis. Nilai Sig > a (0,114 > 0,05; 0,941 > 0,05) +Terima HO Berarti waktu hidrolisis dan interaksi antara konsentrasi enzim dengan waktu ludrolisis tidak memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap nilai derajat bebas pada tingkat kepercayaan 95 %. Dengan demikian tidak dilakukan uji lanjut Tukey. .
