Alfa-sugárzás okozta elváltozások él® sejtekben
Selmeczi Dávid
2001. április
TARTALOMJEGYZÉK
1
Tartalomjegyzék
1. Bevezetés
2
2. Célkit¶zések és feltételezések
4
3. Irodalmi áttekintés
5
3.1.
3.2.
3.3.
Biológiai összefoglaló . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
3.1.1.
Sejtbiológia
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
3.1.2.
Radiobiológia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
Ionizáló sugárzás
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.1.
Röntgen és gamma
3.2.2.
Alfa
7
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20
Sejtek alakja és mozgása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
4. Módszerek
32
4.1.
A sejttenyészetek
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
4.2.
Az sugárforrások
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
33
4.3.
Optikai mikroszkóp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
36
4.3.1.
38
Fényképek kiértékelése . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.
Atomi er® mikroszkóp
4.5.
Elektronspin-rezonancia
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
40
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
42
4.6.
Fluoreszcens festés
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
44
5. Eredmények
47
5.1.
Kalibrálás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
47
5.2.
Optikai mikroszkóp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
47
5.3.
AFM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
71
5.4.
ESR
74
5.5.
Fluoreszcens festés
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
79
6. Összefoglalás
81
Hivatkozások
85
1 BEVEZETÉS
2
1. Bevezetés Az elmúlt században a tudomány és a technika hatalmas fejl®désen ment keresztül. Ide, az exponenciálisan fejl®d® területek közé sorolható az orvostudomány is. Mégis hasonlóan a többi tudományhoz rengeteg megoldatlan kérdés maradt, s®t talán nem nagy merészség azt állítani, hogy a megoldatlan dolgok száma nem csökken, mert a megoldott problémák helyére mindig legalább ugyanannyi újabb lép. A többi tudománnyal ellentétben azonban a gyógyítás m¶vészete abban a különleges helyzetben van, hogy közvetlen közelr®l érint valamennyiünket. A legtöbb embert sokkal kevésbé izgatja az, hogy voltak-e baktériumok a Marson vagy hogy mib®l épülnek fel a kvarkok, mint az, hogy meghal-e holnap az édesanyja vagy nem. Gyógyítás azonban manapság nem képzelhet® el a legtöbb modern vizsgálati módszer és beavatkozási technika alapját képez® kiszolgáló tudományok nélkül. Ide sorolhatjuk a bio zikát, mint az egyik fontos alapkutatási területet is. Az orvostudomány megoldatlan problémái közé tartozik a rák gyógyítása is. Sokféle módszert és technikát ismerünk a visszaszorítására, elterjedésének lassítására, azonban néhány különleges és ritka esett®l eltekintve igazi gyógymód nincs rá. Ráadásul az említett technikák egy része is konyhareceptszer¶:
nem tudjuk pontosan, mit®l jó, de az esetek egy részében beválik.
Pedig ha pontosan ismernénk a háttérben zajló mechanizmusokat, akkor jó esély lenne rá, hogy a folyamat megértésével hatékonyabban tudnánk végezni a terápiát. A rák kezelésének a sebészeti beavatkozás és a kemoterápia mellett egyik leginkább elterjedt módja a sugárkezelés:
a rákos területet er®s ra-
dioktív sugárzásnak kitéve a rákos sejtek szaporodása visszaszorítható.
A
folyamat a sugárzás pontos hatása a szövetekre azonban csak részben és nagy vonalakban ismert. Ugyanez a helyzet mivel ugyanaz a zikai folyamat áll a háttérben a természetes sugárzással is. Már régóta tudjuk, hogy a Földön kezdett®l fogva jelen volt a radioaktivitás, s®t régebben sokkal intenzívebb volt, és azóta csak csökken. Az ionizáló sugárzás elleni védekezésre mint minden más rocsoló hatásra úgy vannak felkészülve az él®lények, hogy ha hiba keletkezik a rendszerben, akkor azt észlelik, és megpróbálják javítani. Ha túlságosan gyakran történik ilyen sérülés, akkor a javító apparátus nyilván nem gy®zi az összes hibát kijavítani, és az él®lény vagy megnöveli valamilyen módon a javító kapacitást, vagy véglegesen károsodik. De az csak részben ismert, hogy mi az az intenzitási tartomány, amit az él® anyag elvisel, esetleg mi az optimális? Egyes kutatások szerint a sugárzás teljes hiánya is káros lehet [12, 13, 29, 39]. A gondolatsor folytatásaként felvet®dik, hogy van-e különbség (egészségben,
1 BEVEZETÉS
3
Egyéb természetes 26% Radon 55%
Orvosi diagnosztika 11% Radioaktív gyógyszer 4% Fogyasztási cikkek Egyéb 1% 3%
1. ábra.
Az USA lakosságának átlagos sugárterhelése az NCRP93 jelentés
szerint
várható élettartamban, stb.) az olyan emberek (vagy más él®lények) között, akik alacsony (normális) háttérsugárzású területen élnek és akik magasabb természetes sugárzásnak vannak kitéve (magas urántartalmú k®zetek, stb.). Az ember sugárterhelésének legnagyobb részét (átlagosan 55 %-át, l. 1. ábra) a radon okozza [25]. A
222
Rn a
238
U bomlási sorában szerepl® egyetlen
gáznem¶ elem a nehézfémek között, ezért az egyetlen olyan anyag, amely képes a k®zetb®l kiszabadulni, és diúzióval a felszínre és a házakba kerülni. 3,8 napos felezési idejével lehet®sége van arra, hogy az ember tüdején keresztül akár a véráramba, és így más szövetekbe is bekerüljön. De mivel a vízben (vérben) rosszul oldódik, els®dleges veszélyt csak a tüd®re jelent. Uránbányászok között végzett kutatásákból [3, 14, 34] kiderül, hogy az igen magas radontartalmú környezetben dolgozó emberek között elég gyakori a tüd®rák, amit közvetlenül a radonnak, illetve a bel®le radioaktív bomlással keletkez® leányelemek aktivitásának lehet tulajdonítani. A folyamat részleteit azonban itt is homály rejti: nem tudjuk pontosan, hogy a sejtet ér® ionizáló sugárzás által okozott sérülést®l milyen út vezet a rákos daganat kialakulásáig, illetve hogy a már feltárt mechanizmusok valóban elegend®k-e az elváltozás el®idézéséhez. Az is a kutatások tárgyát képezi, hogy az emberek a túlnyomó részére, akik nem dolgoznak uránbányában, hanem csak a mindenütt jelenlev® radont lélegzik be, hogyan hat ez a természetes sugárzás. Vissza lehet-e számolni a magas dózisokra kimért dózistüd®rák gyakoriság összefüggésb®l a természetes sugárterhelésb®l ered® rákkockázatot?
Ez azért sem látszik valószí-
n¶nek, mert amíg az uránbányászok tüd®-hámsejtjeinek nagy részén egy év alatt több
7
-részecske is áthalad, addig ez az esemény egy átlagembernél csak
1:10 valószín¶séggel fordul el®. Ezért f®leg az utóbbi években fordult sok radioaktivitással foglalkozó kutató az alacsony dózisok felé. Epidemiológiai
2 CÉLKITZÉSEK ÉS FELTÉTELEZÉSEK
4
kutatások (pl. [28]) segítségével már régóta próbálkoznak ennek a természetes dózistartománynak a felderítésével, de még akár az egész Egyesült Államok rákstatisztikáját tanulmányozva is viszonylag kis esetszámok adódnak óriási hibahatárokkal. Ez abból is adódik, hogy a sugárterhelésb®l ered® hatások szorosan kölcsönhatnak más hatásokkal (pl. dohányzás, táplálkozás, stb.) csak nem világos, hogy milyen szabályok szerint. Ez is az oka annak, hogy a sejttenyészeteken, alacsony dózisokkal végzett besugárzások az érdekl®dés középpontjába kerültek.
2. Célkit¶zések és feltételezések Alapfeltételezésem az volt, hogy a sugárzás, ennek roncsoló hatásai nemcsak a sejtben magában, hanem ennek környezetében is változásokat idéznek el®, és így a sugárzás a direkt hatáson kívül, közvetve is befolyásolja a sejt m¶ködését. Dolgozatom témájának irodalmát áttanulmányozva úgy tapasztaltam, hogy a kutatások nagy része a sejtek túlélésére, és mutációk, valamint más biokémiai változások meg gyelésére összpontosít. Véleményem szerint a sugárzás hatására a sejtek mozgásában és alakjában, valamint a környezetükben bekövetkez® változások ugyanolyan fontosak lehetnek a sugárzás biológiai hatásmechanizmusának megértésében. Ezért munkámban a rendelkezésemre álló eszközök segítségével megpróbáltam ezeket a jelenségeket minél alaposabban meg gyelni, és kísérletet tettem arra is, hogy az ezek mögött rejl® lehetséges folyamatokat is megtaláljam.
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
5
3. Irodalmi áttekintés
3.1. Biológiai összefoglaló
3.1.1. Sejtbiológia A sejtek m¶ködésének és a sugárzás esetleges hatásainak megértéséhez fontos tudni, hogy az eukarióta sejtek életciklusa fázisokra tagolódik.
4 f® fázist
szoktak elkülöníteni: [21]
G1 :
A sejt növekszik, DNS tartalma 2C, azaz minden kromoszómapárból 1 van a sejtben.
S:
Replikáció: a DNS tartalom megkett®z®dik.
G2 : M:
Osztódás el®tti pihenés, DNS tartalom: 4C Mitózis: a sejt ketté osztódik, 2C-2C DNS tartalommal.
Ezeken kívül nem osztódó sejteknél van még egy G0 -nak nevezett fázis is: ekkor a sejt általában nem növekszik, hanem valami funkciót tölt be: pl. emészt®nedvet termel, izomsejtként idegrendszeri utasításra összehúzódikelernyed, stb. A kritikus fázisok határán bonyolult ellen®rz® mechanizmusok m¶ködnek, amelyek nem engedik a sejtet a ciklus következ® részébe lépni, ha nincs rendben valami; legf®képpen a DNS állomány integritása a vizsgálat tárgya. Különböz® vegyületek képesek arra, hogy a sejteket megfogják valamelyik ilyen ellen®rz®ponton: ezzel lehet®ség van arra, hogy a sejteket tenyészetben szinkronizálják: minden sejt (legalábbis egy ideig) azonos fázisban marad. Meg gyelték azt is, hogy az ionizáló sugárzás hatása más és más lehet, attól függ®en, hogy a sejt éppen melyik fázisban van (l. 3.2. fejezet). A magasabbrend¶ él®lényeknél a sejtek legnagyobb része szervezetiszerkezeti egységekbe, szövetek be rendez®dik (2. ábra). Így a szövetet differenciált, valamilyen speciális feladat ellátásához alkalmazkodott sejtek alkotják, pl.: a hámsejtek feladata a különböz® terek elválasztása, hasnyálmirigysejtek els®sorban emészt®nedveket termelnek, a vörös csontvel®ben lev® ®ssejtek folyamatosan osztódnak, hogy a vérsejtek utánpótlását megteremtsék. Ezen funkciók ellátásának követelményei közé tartoznak, hogy a sejtek kommunikálhassanak egymással: anyagokat és információkat tudjanak cserélni, valamint az, hogy az azonos feladatot ellátó sejtek együtt maradjanak, rögzítve legyenek. Mindkét dologban kulcsszerepet játszanak a sejtkapcsoló
struktúrák és az extracelluláris mátrix. (2/b. ábra)
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
(a) Köt®szövet elektronmikroszkópos felvétele
6
(b) A sejtek kapcsolatai egymással és a környezettel
2. ábra. Szövetek fotója és modellje
Az él® szervezetben néhány ritka kivételt®l eltekintve minden sejt valamihez rögzítve képes csak m¶ködni. (A ritka kivétel pl. a vörös vérsejt, amely bizonyos kritériumok alapján nem is sejt: nincs sejtmagja.) Még a vérben kering® fehér vérsejtek is kitapadnak az érfalra és a szövetek közötti térben, amikor aktívan ellátják funkciójukat (pl. fagocitózis, ellenanyagtermelés). A kitapadás szükségességének egyik oka az, hogy az endoplazmatikus retikulum (ahol a fehérjeszintézis legnagyobb része folyik) csak akkor tud hatékonyan m¶ködni, ha elegend®en nagy a felülete. Ehhez pedig nem a minimális felület/térfogat arányt adó gömb alak az optimális, hanem például egy lapos, hosszan elnyúló forma. Ezt valósítja meg a sejt, amikor kitapad. [1, 21] A kitapadás összetett, sok fehérjekomplexet igényl® folyamat, sok részlete mindmáig ismeretlen. Annyi bizonyos, hogy a sejt kollagénszálakat és más fehérjéket választ ki, amelyek képesek a környzethez, (akár üveg- vagy m¶anyagfelülethez is) hozzátapadni. (Ezt a réteget nevezik substratum nak.) Ehhez azután a sejtmembránban található speci kus kapcsolófehérjék hozzáköt®dnek, és így létrejön a substratum-sejt kapcsolat.
A sejt úgy képes
mozogni, hogy egyes pontokon a kapcsolatok feloldódnak, és más pontokon újak képz®dnek. A kapcsolatok nagy részének létrejöttéhez mint sok más biokémiai folyamathoz kalcium szükséges, pl. ezt kihasználva lehet a sejteket áthelyezni (passzálni) egyik edényb®l egy másikba: elvonjuk a kalciumot
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
7
(pl. EDTÁ-val), a sejtek szuszpenzióba kerülnek és pipettával felszívhatóak. Más hatások, feltételezésünk szerint az
-sugárzás is képes elroncsolni eze-
ket a fehérjéket, amely folyamat közvetve, a kitapadt állapot módosításával illetve megszüntetésével hatni képes a sejt élettani folyamataira is. Majdnem minden mérésem in vitro kísérlet, azaz él® sejtekkel, de nem él®lényekkel, hanem sejttenyészetekkel dolgoztam.
Ezeket úgy állítják el®,
hogy valamilyen él®lényb®l (egérb®l, patkányból, emberb®l) kivesznek egy szövetdarabot, majd ezt különböz® zikiai és kémiai kezeléseknek vetik alá. Ennek eredményeként megszabadulnak a sejtek közötti kitölt® anyagtól, és tulajdonképpen önálló sejteket kapnak, amelyek aztán típustól függ®en megfelel® körülémények között esetleg képesek újra szövetet alkotni vagy dierenciálódni.
Szokás még ilyenkor immortalizálni a sejteket, azaz úgy
transzformálni, hogy ne pusztuljanak el a szokásos kb. 20 osztódás után, hanem végtelen hosszú ideig osztódhassanak. Az egész eljárás eredménye egy jól kezelhet®, de a kiinduló sejtekkel nagyon sok azonosságot mutató
sejtvonal.
3.1.2. Radiobiológia Az ionizáló sugárzásból valamilyen anyagban vagy sejtben, szövetben tömegegységenként elnyel®d® energiát dózisnak hívják, és 1 J/kg = 1 Gy mértékegységgel jelölik. A különböz® sugárzások egységnyi hosszon különböz® mennyiség¶ energiát képesek átadni, ráadásul ez az energiaátadási tényez® (Linear Energy Transfer, LET) az ionizáló részecske energiájának függvényében változik. A különböz® sugárzásokhoz biológiai hatékonyságot (Relative Biological E ciency, RBE) is szokás hozzárendelni, ez azt jellemzi, hogy pl. az ugyanakkora dózisú
-sugárzás sokkal jobban roncsolja a sejteket, mint a -sugárzás. A
-sugárzás RBE értéke 1, míg az -sugárzás értékét 5-nek vagy
röntgen- és
10-nek szokták venni, de a rák kialakulási kockázatának megbecsüléséhez 20as értékkel is szoktak számolni. Ezt a faktort is gyelembe vev® mennyiség a hatásos dózis, ennek mértékegysége a Sv (1 Sv = 1 J/kg). [16]
3.2. Ionizáló sugárzás Az ionizáló sugárzás el® szervezeteken tapasztalható hatásainak kutatása a röntgen-cs® feltalálása után szinte azonnal beindult. rengeteg változás történt a kutatási technikákban.
Azóta természtesen
Napjainkban az ezzel
a témával foglalkozó publikációkat (mint általában él® rendszereken végzett kísérleteket) két nagy csoportba sorolhatjuk: Mindkett®t tovább lehet bontani:
in vitro és in vivo mérések.
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
8
In vitro: 1. Röntgen- vagy
-sugarakkal történ® besugárzás.
Ezt a fajta sugárzást
gyakran illetik low LET radiaton névvel. El®nye, hogy nem igényel speciális kísérleti elrendezést (a sugarak könnyen áthatolnak a tenyészt®edényeken), valamint a sugárforrás is könnyen kezelhet® (pl. kereskedelmi forgalomban kapható röntgen-berendezés vagy 2.
60
Co forrás).
-részecskékkel vagy gyorsított ionokkal végzett kísérletek (high LET radiation).
Másfajta kísérleti technikákat igényel a részecskék leve-
g®ben is rövid hatótávolsága miatt, valamint speciális (pl. kollimált, monoenergiás) sugárforrás vagy gyorsító szükséges. 3. Tápoldatba kevert radioaktív vegyületek vagy radioaktívan jelölt tápanyagok (beépül® anyagok) használata. Leginkább esetén használják, mert így az
-részecske
-sugárzó anyagok
sokkal nagyobb valószín¶-
séggel ér célba. Hátránya, hogy a radioaktív anyagok jó része toxikus, csak kis mennyiségben adható a tápoldatba. A leggyakrabban alkalmazott in vivo technikák: 4. Kísérleti állatok egész testének, egy testrészének, egy szervének vagy szövetdarabjának célzott besugárzása. 5. Radioaktív vegyületek vagy radioaktívan jelzett, anyagcserében résztvev® anyagok bejuttatása a kísérleti állatba. Az utóbbi esetben lehet olyan anyagot is jelölni, ami nagy speci citással egy célszövetbe fog beépülni, így hatását szinte csak ott tudja kifejteni. A kutatások nagy részében a hajtóer® a bevezet®ben is említett rákkutatás, így meglehet®sen sok publikáció születik a témában. Az alábbiakban röviden összefoglalom az általam érdekesnek gondolt módszereket és fontosnak látszó eredményeket.
3.2.1. Röntgen és gamma Az egyik leggyakrabban alkalmazott technika az 1. csoport alapkísérlete: a sejttenyészetet besugározni különböz® dózisú röntgen- vagy és meg gyelni, hogy a sejtek mekkora része éli túl.
-sugárzással,
Erre példa Yang és
munkatársainak cikke [45]. Ebben a munkában egy rákos betegb®l frissen izolált glióma sejteket használtak. A sejtekb®l petri-csészében egyréteg¶ tenyészetet képeztek, és F12-es
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS tápban tartották ®ket, amit 15% FCS-sel és 20
9
g/ml L-glutaminnal dúsí-
tottak. A tenyészt® termosztátban 5% CO2 -ot tartalmazó 37 telített leveg® volt.
Æ C-os vízg®zzel
Egy id® múlva a sejteket szuszpendálták és klónokat
képeztek bel®lük úgy, hogy egy klón nagy valószín¶séggel egy sejtt®l származzon. A 16 klónt, valamint az eredeti sejtvonalat askákba passzálták, és ezekben végezték el a besugárzást. A besugárzást két forrással: egy 33 TBq és egy 1,7 TBq aktivitású
60
Co
forrással végezték, amelyekkel max. 1,5 Gy/perc, ill. 0,07 Gy/perc dózissebességet értek el. A sejteket besugárzás alatt is 37
Æ C-on
tartották.
Ezután a sejteket szuszpendálták és annyira felhigították, hogy azok leülepedve nagy valószín¶séggel elég távol kerültek egymástól. 2-3 héttel a besugárzás után megszámlálták, hogy hány olyan kolónia képz®dött, amelyik legalább 50 sejtet tartalmaz. Ezt az eljárást elvégezve a kontroll sejteknél is, meghatározták a túlél® hányadot (surviving fraction):
SF =
kolóniaképz® besugárzott sejtek aránya kolóniaképz® kontroll sejtek aránya
A kolóniaképzéses túlélési vizsgálatoknál ez a módszer standardnak tekinthet®. A sugárzás hatásainak vizsgálatához meghatározták a következ® biológiai paramétereket a kontroll és a besugárzott sejtek esetén:
sejttérfogat DNS-tartalom kariotípus meghatározás osztódási id® kitapadási hatásfok morfológiai típus (Bigner után: gliális, broblaszt-szer¶, hám-jelleg¶, köteges)
Az egyes kolóniák esetén a túlél® hányadokat a kapott dózis függvényében
1
ábrázolták és a lineáris-kvadratikus (LQ) modell
szerint görbéket illesztet-
tek rá (3. ábra). Az eredeti sejtvonal görbéje vastagabb vonallal van jelölve, látható, hogy a görbék által befogott tartomány közepe felé helyezkedik el, 1 SF
= exp d d2
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
10
1
SF
0.1
0.01
0.001
0.0001 0
2
4
6
8
10
Dose [Gy] 3. ábra.
A Yang és mtsi. által kapott dózis túlél® hányad görbék 1,5
Gy/perces dózissebesség mellett
tehát a bel®le származó kolóniák között vannak a sugárzásnak kevésbé és jobban ellenállóak is. A tartomány szélességének jellemzésére megállapították, hogy az 1%-os túlélési arány eléréshez a legérzékenyebb és a legellenállóbb kolóniák között másfélszeres dóziskülönbség kellett. A dózisfüggés mellett megvizsgálták az egyes kolóniák válaszát a dózissebesség változtatására is. Ehhez az el®z® mérésb®l kiválasztották a leginkább és a legkevésbé érzékeny kolóniát.
0,02 és 0,07 Gy/perces sebességet vá-
lasztottak, hogy a sejtnek lehet®sége legyen a sugárzás által okozott hibákat javítani, de a besugárzási id® még lényegesen rövidebb legyen az osztódási id®höz képest. Azt tapasztalták, hogy alacsonyabb dózissebesség mellett a túlélés valószín¶sége n®, mégpedig az érzékenyebb sejtvonalnál jobban. Egy másik cikkben [38], 3 intézmény közös tanulmányában egy meglehet®sen gyakori agydaganat, a gliobastoma multiforme (GBM) radioaktivitásra való érzéketlenségét kutatták. (Ez a fajta daganat ugyanis sugárterápiával, és kemoterápiával és sebészeti beavatkozással kombinált terápiával is csak nagyon gyenge hatásfokkal kezelhet®.)
58 GBM-b®l és 17 asztrocitómából
származó sejtvonalat vizsgáltak hasonló kísérleti körülmények között: sejttenyészeteket falaskákban vagy szuszpenzióban besugároztak 0-11 Gy
137
Cs- -
vagy röntgen-sugárzással, 0,67-1,82 Gy/perc dózissebesség mellett. A túléléshez itt is a kolóniaképzésre képes sejteket számolták meg. Az összegy¶lt nagy mennyiség¶ adaton (ANOVA) statisztikai analízist végeztek. Az eredmények áttekinthet® összehasonlításához a 2 Gy kapott dózis esetén túlél® hányadot (SF2 ) meghatározták mindegyik sejtvonalhoz. Sok egyéb
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
11
paraméteren kívül megvizsgálták még ennek a mennyiségnek a sejtvonalak gazdáinak (a daganatos betegeknek) a gyógyulási arányához, ill. túlélési idejéhez való viszonyát. Azt tapasztalták, hogy az SF2 mennyiség igen széles skálán változik (0,120,87), és jó korrelációt mutat a daganat fokozatával (hogy grade III vagy grade IV daganat) és hisztológiai típusával. Viszont az in vitro SF2 mennyiség nem mutatott semmiféle összefüggést a daganat in vivo sugárzásérzékéenységével, tehát azzal, hogy a beteget sikerült-e megmenteni vagy nem. Ezért arra következtettek, hogy a daganatból izolált sejtek klónozásával és besugárzásával információkat lehet kapni a daganat típusáról, viszont a beteg sugárterápiás gyógyulási esélyeit nem lehet megjósolni bel®le. Továbbá ebb®l a tanulmányból is kiderült, hogy egy daganat in vivo sugárzással szembeni ellenállóképességét a sejtek bels®, intrinistic érzékenységén kívül sok más faktor is befolyásolja. Amdur és munkatársai [2] a dózissebesség hatását vizsgálták egy normál és egy rákos sejtvonalon.
Az eajta kutatások f® hajtóereje az a klinikai
meg gyelés, hogy a sugárterápia sok esetben hatékonyabban alkalmazható hiperfrakcionált, azaz napi többszöri, kis dózisú besugárzások formájában, mint ugyanakkora összdózisú, de ritkább, er®sebb impulzusok használatával. A sejteket 15% FCS-sel dúsított, penicillinnel és streptomicinnel adalékolt
2
tápban, 25 vagy 75 cm -es askákban növesztették, 37 talmú atmoszférában tartották. A besugárzást egy
137
Æ C-os
5% CO2 tar-
Cs forrással végezték,
olyan elrendezésben, amely lehet®vé tette, hogy 5 különböz® dózissebesség mellett lehessen használni: 0,38, 1,04, 3,65, 6,12 és 22,6 Gy/perc. A sejteket 0-40 Gy tartományban sugározták be, és ez id® alatt is 37
Æ C-on
tartották
®ket. A sugárkezelés után egy kereskedelemben kapható elektronikus sejtszámálóval számolták meg a sejteket (szuszpenzióban, elhalt sejteket is). Ezután az el®z® kísérlethez hasoblóan felhigították, és úgy osztották askákba, hogy egy edénybe kb. 50 sejt kerüljön. 16-18 nap múlva leszámolták, hogy hány kolónia képz®dött, és ebb®l megállapították a túlél® hányadot (SF). Ebben a publikációban az el®z®eknél több dolgot vettek gyelembe. Az egyik az, hogy a besugárzás után még egy ideig pusztulnak el sejtek az ún. potenciálisan halálos sérülések (potentially lethal damage, PLD) jelenségek miatt, ami azt jelenti, hogy bizonyos sérülések nem okoznak azonnali sejtpusztulást, de a besugárzás utáni körülmények mégis kiválthatják ezt. Ezekben a kísérletekben úgy találták, hogy a besugárzás után 6 órával már nem változik a sejtek száma, ezért a sejtszámlálást csak 8-24 órával a besugárzás után kezdték. A másik, amire gyeltek, az volt, hogy a sejtek lehet®leg ugyanabban a sejtfázisban legyenek. A normál sejteknél ezt könny¶ volt elérni, ugyanis az általuk használt sejtvonalnál a kon uens tenyészet elérésekor a sejtek igen nagy valószín¶séggel G0 fázisba léptek, így elegend® volt a sejt-
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
12
tenyészetet kon uenssé növeszteni. A rákos sejteknél nincsen valódi G0 fázis, viszont a növekedés ütemében meg gyelhet® egy plató-fázis [17], amikor elérik a kon uenciát. Ez ugyan nem valódi G0 fázis, de a sejtek ekkor mégis nagyjából azonos sejtfázisban vannak. A tanulmány eredményeként az el®z®ekhez hasonlóan megállapították, hogy a vizsgált tartományban csökken® dózissebességel n® a sejtek túlélési valószín¶sége.
Ezt a következ® számszer¶ mennyiséggel jellemezték: a két
széls® dózissebesség mellett azoknak a dózisoknak az aránya, amelyek 1 %-os túlélést eredményeztek. Ezt a mennyiséget DRRF0.01-nek (dose rate reduction factor) nevezték el, értéke mindkét vizsgált sejtvonal esetén 2.0 körüli volt. Megvizsgálták azt is, hogy a nem-halálos sérülések javításának (SLDR: sublethal damage repair) mennyi a félideje (amennyi id® alatt a sérülések fele kijavítódik). A normál sejtek esetén ez 154 percnek, míg a rákos sejteknél 31 percnek adódott. Még mindig az 1. kísérletcsoportba tartozik Singh és munkatársai által végzett kutatás [35], melyben emberi tüd®-hámsejtekkel és alacsony dózisokkal kísérleteztek.
Itt els®sorban a dózis túlél® hányad görbének a kezd®
szakaszára, illetve ennek alakjára voltak kíváncsiak. Már korábban is publikáltak olyan eredményeket, amelyek szerint kis dózisok (< 0,51 Gy) után megn® a sejtek ellenállóképessége, ennek alapján elképzelhet®nek tartották, hogy el®állhat az a helyzet, hogy egy kis dózis után kapott nagyobb dózis (> 24 Gy) nagyobb túlél® hányadot eredményez, mintha ugyanekkora dózist egyben kapnának meg a sejtek. Kis dózisoknál, ahol a túlél® hányad 100% körül van komoly kísérleti nehézségeket okoz, hogy a higítási, számlálási és más hibák a mérni kívánt eektus nagyságrendjében vannak. Ennek kiküszöbölésére lehet sok ugyanolyan kísérlet elvégzésével a szórást csökkenteni, vagy alapvet®en más módszert használni. E cikk szerz®i ez utóbbi utat választották: készítettek egy berendezést, aminek a DMIPS
(Dynamic Microscopic Image Processing Scanner)
ne-
vet adták. M¶ködésének lényege, hogy egy számítógépvezérelt tárgyasztallal ellátott mikroszkóppal sok sejtet lefényképeznek, eltárolva az egyes sejtek pozícióját is. Besugárzás és megfelel®en hosszú várakozás után visszamennek a lefényképezett helyekre, újra rögzítik a képet, majd megállapítják, hogy a sejt él-e még vagy nem. Ezzel a módszerrel 0,01 Gy dózis felbontásig képesek voltak felvenni a görbéket. A sejteket a szokásos körülmények között 20% FCS-sel dúsított MEM tápban tartották. A besugárzást 0,49 Gy/perc dózissebesség mellett röntgensugárzással végezték. Az egyes kísérletekben a tenyészetek 0,05-4 Gy dózist kaptak. Az átlagos túlélési hányadokra a már korábban ismertetett (9. oldal)
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
4. ábra.
13
A Singh és mtsi. által kapott dózis túlél® hányad görbék és az
illesztett modellek. (folytonos vonal: IR-modell, pontozott vonal: LQ-modell a
2 Gy dózisokra, szaggatott vonal: LQ-modell az IR-modellb®l kapott r
paraméterrel)
LQ-modellt, illetve az alább leírt IR-modellt (induced repair) illesztették. Az IR-modell egyenlete:
SF = exp
ahol az LQ-modell
r
1 +
s r
1
e
d=dc
d d ; 2
(1)
paraméterét egy bonyolultabb kifejezéssel helyette-
sítettük, amivel azt modellezzük, hogy a teljes sejtpopuláció érzékeny nagyon
s paraméter), ugyanakkor válaszként a kapott dc 1 küszöbdózis paraméter, ami az a dózis, ahol az érzékenység 37%-kal (e ) alacsonyabb. A modell r és paraméterekkel átmegy az LQ-modellbe, ha d dc. kis dózisokra is (ezt írja le az
dózisra, az érzékenység csökken. Ennek a csökkenésnek az ütemét írja le a
A szerz®k úgy találták, hogy az alacsony dózisú tartományban (< 2 Gy) az IR-modell sokkal jobban illeszkedik a felvett görbékre (F-teszt értéke:
;
0 001
< p <
;
0 01),
és ebb®l arra következtettek, hogy a nagyon ala-
csony tartományban a sejtek rendkívül érzékenyek a sugárzásra, a 0,2 és 0,4 Gy közötti átmeneti tartományban ellenállóvá válnak, végül a magasabb tar-
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
14
tományban az eredmények megfelelnek az LQ-modellnek.
Magyarázatként
több lehet®séget vetettek fel:
a kapott dózis els® szakasza stimulálja vagy indukálja a sejt védekez® mechanizmusát, vagy
a sejtpopuláció nem egységes, hanem a tenyészetben van egy nagyon érzékeny alpopuláció is.
Mindkét lehet®ség mellett állást foglalnak korábbi publikációk, és bár a kett®s populációt a sejtek nem szinkronizált volta miatt nem lehet kizárni, ebben a cikkben inkább az els®t részesítik el®nyben, a következ®k miatt:
Hasonló görbéket gyeltek meg más szerz®k, más sejteken nemcsak exponenciálisan növ®, hanem szinkronizált esetben is.
A kétpopulációs modell a két csoport között túlságosan nagy (mintegy kétszeres) küszöbdózis-különbséget jósol.
A cikkben feltételezik, hogy ha a görbe in exiós pontjánál, a kritikus dózisnál alacsonyabb dózist kapnak a sejtek, akkor az nem elég a védekez® rendszer aktiválásához. Ha viszont ennél nagyobbat, akkor a rendszer beindulása miatt védettebbek lesznek a sugárzással szemben. Emiatt a szerz®k lehetségesnek tartják, hogy egy rákos daganatot sokkal hatékonyabban lehet úgy sugárzással kezelni, hogy egyszerre mindig csak a kritikus dózisnál kisebb terhelést kapjanak a sejtek. Egy másik, ehhez sok tekintetben hasonló, alaposabb cikkben [43] is hasonló eredményre jutottak. Ebben a kutatásban négyféle emberi tumorsejt alacsony dózisokra adott válaszát vizsgálták. A sugárforrás itt is röntgen-berendezés volt, a sejteket az el®z®vel azonos körülmények között tartották. A túlélés vizsgálatához itt besugárzás el®tt fénytörésen alapuló m¶szerrel leszámolva, ismert mennyiség¶ sejtet ültettek Petri-csészékbe, majd besugárzás után megszámolták, hogy hány sejt képzett kolóniát. (Az, hogy besugárzás el®tt számolták meg a sejteket, jelent®s szóráscsökkenést eredményezett az adatokban.) A kapott görbéket az
1 Gy tartományban illesztett LQ-mo-
dellel az 5. ábra mutatja. A cikk elemz® részében hosszan taglalja a kis dózisoknál mérhet® hiperszenzitivitás lehetséges magyarázatait. El®ször arra tér ki, hogy a különböz® hibacsökkent® eljárások miatt nem valószín¶, hogy a pusztán a mérni kívánt kis eektus statisztikus hibájából ered® jelenségr®l lenne szó.
Utána
megvizsgálja az el®z® cikknél ismertetett két biológiai- zikai háttérel bíró lehet®seget.
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
15
5. ábra. A Wouters és mtsi. által kapott dózis túlél® hányad görbék emberi tumorsejtekre. A folytonos vonal a
1 Gy dózisokra illesztett LQ-modellt
mutatja. Az alsó gra konok úgy vannak transzformálva, hogy az LQ-modell egyenest adjon.
A szerz®k minden kapott adatsorra illesztettek egy kétpopulációs LQ-modellt: SF =
fe
s d + (1
f )e
r d d2 ;
(2)
ahol f az érzékeny populáció aránya. Az optimális paraméterek megkeresésével nagyon jó (rms=0,51,3%) illesztéseket tudtak elérni. A probléma csak az volt, hogy ezek a paraméterek azt mutatták, hogy az érzékeny hányad mindössze 1-5%, és ezért a görbe megfelel® kezdeti meredekségének eléréséhez ennek a kis populációnak rendkívül érzékenynek kell lennie: 0,1-0,3 Gy dózis már halálos számukra, ami azt jelenti, hogy ezek a sejtek 50-700-szor érzékényebbek a többi sejtnél. (Ráadásul az illesztésnél nem a legjobban illeszked® paramétereket fogadták el, hanem a legkonzervatívabbakat: az illesztés alsó 95%-os kon denciaszintjénél.)
A cikk írója nem tartja valószín¶nek, hogy
a sejtciklus folyamán egyébként bizonyítottan változó érzékenység ekkorát ugorhasson két fázis között. Azt is felhozza ellenérvnek, hogy ha ez így lenne,
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
16
akkor egy folyamatos, alacsony dózissebesség¶ sugárzás hamar végezne az összes sejttel, mert amint belépnek ebbe az érzékeny fázisba, nagy valószín¶séggel rögtön elpusztulnának. Mindazonáltal pusztán a kísérleti eredményei alapján nem tudja kizárni ennek a modellnek a létjogosultságát. A cikk az IR-modellnek két változát és alkalmazását is bemutatja. Mindkett® feltételezi, hogy a sejtek kezdetben hiperszenzitívek és érzékenységük a kapott dózissal arányos csökken. Az els® változat szerint a sejtpopuláció egységes, az LQ-modell
paramétere változik a dózis függvényében, tehát
a sejtek ellenállóképessége növekv® dózissal n®. Ezzel a modellel is nagyon jó illesztéseket lehet kapni. A másik verzió egyenlete azonos a kétpopulációs LQ-modellel, csak
f
itt nem konstans, hanem:
c 1 X ad n e ad ; f n (
=
)
n=0
(ahol
(3)
!
a az 1 Gy által okozott sérülések átlagos száma és c sérülés szükséges
ahhoz, hogy a védettség bekapcsolódjon.) Ez tehát két alpopulációt különböztet meg, az egyikben a radioaktivitással szembeni képzeletbeli ellenállás már bekapcsolódott, a másikban még nem. Az els® populációba azok a sejtek tartoznak, amelyek már elszenvedtek egy bizonyos mennyiség¶ sérülést, a sérülések számát a dózissal lineárisan növekv® mennyiségnek tételezik fel. A modellnek ezzel a változatával egy kissé rosszabb, de még mindig meglehet®sen jó illesztést kaptak. Jó eredményeket értek el, amikor az 1 Gy által okozott sérülések számát 20-nak választották, de a legjobbakat illeszkedést az okozta, ha az ellenállás bekapcsolásához 1 sérülés már elegend® volt és sejtvonalanként különböz® számú sérüléseket okozott 1 Gy dózis (különböz® szuszceptibilitás). Mindkét változat megjósolja ugyan a kezdeti hiperszenzitivitást, de nem olyan széls®séges módon, mint a kétpopulációs LQ-modell.
Eme modellek jósága mellett szól az is,
hogy ugyan a legtöbb sokparaméteres modellel lehet jó illeszkedést elérni, de általában azon az áron, hogy a paraméterek er®sen egymáshoz lesznek kapcsolva. Itt viszont azt vették észre, hogy ezeknek a modelleknek az
és
jól visszaadják az 1 Gy fölötti részre illesztett sima LQ-modell megfelel®
paramétereit. Végül a cikk megemlít az IR-modell biológiai interpretációjára néhány lehet®séget. Egyrészt felsorolja, hogy a fokozott ellenállóképességet mi okozhatja: a sérülés felismerési hatékonyságának javulása, a sérülés kijavításához szükséges id® meghosszabbodása, a javítás hatékonyabbá válása vagy a rendelkezésre álló enzimek számának növekedése.
A felismerési hatékonyságot
a kormatinállomány átrendez®dése is növelheti:
az ionizáló sugárzás töré-
seket idéz el® a kromatinban, aminek következtében a sejt enzimrendszere
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
17
azt a részt szét fogja hajtogatni, miáltal az érzékenység elvileg megváltozhat (ugyanis valószín¶leg a kromatin konformációjának fontos szerepe van az érzékenységben). Másrészt lehetséges, hogy a hiperszenzitivitás nem passzív sejthalál, amit a sugárzás miatti DNS-hibák felszaporodása okoz, hanem, mint sok kísérlet mutatja, általában aktív válasz, programozott sejthalál (apoptózis ) vagy a sejtciklus megállítása (arrest ) egy fázisban, mégpedig rendszerint a kritikus S (DNS-szintetizáló) vagy M (osztódó) fázis el®tti G1 /S vagy G2 /M átmenetnél (checkpoint, l. 3.1.1. fejezet). Arra is egyre több bizonyíték van, hogy az apoptózisért felel®s gének hibája esetén az itt meg gyelt alacsony dózisú érzékenység nem jelenik meg. Tehát a sugárzásérzékenység molekuláris szinten nem egy egyszer¶ zikai hanem összetett biokémiai folyamat. Így az is elképzelhet®, hogy az itt indukált ellenállóképességnek nevezett eektus valójában nem is a javítóenzimek fokozott m¶ködése, hanem a sejt károsodása: a sugárzás elrontja az apoptózis és az arrest normális biokémiai útjait. Ugyanez a szerz®csoport egy nem sokkal kés®bbi publikációjában [41] leírja, hogy a HT-29-es (emberi vastagbélb®l származó) rákos sejtekkel tovább kutattak annak érdekében, hogy nagyobb biztonsággal jelenthessék ki, melyik modell a helyes.
A kísérletet annyiban módosították, hogy a vizsgált sejt-
tenyészetek két alkalommal kaptak besugárzást:
el®ször egy kezd®lökést,
majd 4 óra múlva mérték meg a 04 Gy dózisra adott túlélési választ.
A
besugárzás és a 4 óra várakozási id® alatt is a sejteket szuzpenzióban tartották, hogy a kitapadás és felszedés miatti esetleges mérési hibákat kiküszöböljék. Természetesen összehasonlításhoz használtak a hagyományos módon egyszerre besugárzott és kontroll sejteket is.
A kapott görbéket a 6. ábra
mutatja. Az ábrán jól látható, hogy az el®kezelt sejtek nem tanúsítják a korábban bemutatott hiperszenzitív viselkedést, s®t az illesztett vonal inkább a másik irányba görbül (nem szigni káns). Viszont a 0,5 Gy fölötti tartományban az el®kezelt sejtek egy kissé érzékenyebbek (ez sem szigni káns), mindenesetre biztosan nem ellenállóbbak, mint a hagyományosan besugárzott társaik. Ez ellentmond a kétpopulációs modell jóslatának, miszerint az el®kezelés során az érzékeny populáció elpusztul, és utána csak az ellenállóbb populáció marad meg. Az ellentmondást meg lehet támadni azzal, hogy az érzékeny populáció a sejtciklus egy szakaszához van kötve, és a 4 óra várakozás alatt újabb sejtek léptek ebbe a fázisba, tehát új érzékeny alpopuláció alakult ki. Viszont ekkor látnunk kellene a kezdeti er®s érzékenységet is, ami a kísérlet alapján biztosan ki van zárva. Az eredmények viszont az IR-modellel összhangban vannak. (A szerz®k egy másik tanulmányukban [36] ellenben azt gyelték meg, hogy szélesebb dózisskálán (0-12 Gy) és alacsonyabb túlélési tartományokban vizsgálodva, bizonyos sejteknél igenis jelentkezik a két populácó. A hatás
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
18
6. ábra. A Wouters és mtsi. által kapott dózis túlél® hányad görbék HT29 rákos sejtekre.
Az egyszerre besugárzott sejtek adatait az üres körök
(folytonos vonal) mutatják. Az el®kezelt sejtek (teli kör, szaggatott vonal) esetén az X tengely a másodszor kapott dózist mutatja
úgy mutatkozik, hogy egy kritikus dózis (kb. 4 Gy) alatt egyfajta paraméterpárral illeszthet® az LQ-modell, míg fölötte másikkal, mégpedig a sejtek ellenállóbbakká válnak.) A szerz®k ugyanakkor rámutatnak arra is, hogy az adaptive response (AR) néven emlegetett jelenség nem, vagy csak részben alkalmazható erre a kísérletre. A jelenség az a meg gyelés, hogy egy kis kezd® dózis után megn® a sejt ellenállóképessége, és jobban elviseli a nagyobb challenge dózist. Ez itt csak a 0,8 Gy alatti tartományban gyelhet® meg, 1 Gy fölött (7. ábra) azonban a kétfajta sejttenyészet úgy viselkedik, mintha ugyanolyan körülmények között kapták volna a besugárzást. Ez egyben azt is jelenti, hogy a 4 órás várakozási id® alatt a sejt nem javította ki a nem halálos sérüléseket, és a második dózis által okozott sérülések hozzáadódtak az els® hatásaihoz. Tehát azt lehet mondani, hogy az AR jelenséget, legalábbis ezeknél a sejteknél csak kis dózisoknál lehetett meg gyelni. Ezzel szemben egy másik, nemcsak rákos, hanem normális sejtekkel is foglalkozó cikk [30] határozottan állítja, hogy az AR jelenségével találkozott. A kutatók 6 sejtvonalat használtak vizsgálataikhoz: 2 normális broblaszttípusút (közülük az egyik sugárzásérzékeny), 2 mellrák eredet¶t (azonos érzékenységgel) és 2 melanóma sejtvonalat (er®sen különböz® érzékenység¶t).
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
7. ábra.
19
Teljes dózis túlél® hányad görbék.
Az el®z® ábra adatai azzal
a különbséggel, hogy a vízszintes tengelyen nem a második, hanem a teljes dózis van feltüntetve.
Minden sejtet a plató-fázis eléréséig növesztettek, hogy azonos fázisban legyenek. Besugárzáshoz az el®z® munkákhoz hasonlóan röntgen-sugárzást használtak, 1,42 Gy/perc dózissebességgel. A sugárkezelés el®tt a sejteket 2-4 napig tartották a plató-fázisban, besugárzás alatt pedig jégen tartották ®ket, hogy a sérülések besugárzás alatti javítását csökkentsék. A túlélést a már ismertetett kolóniaképzési képességgel vizsgálták. Az AR jelenségének vizsgálatához a sejtek két alkalommal kaptak sugárzást, el®ször egy 0-4 Gy dózisú kezd®lökést, majd 0-24 óra múlva egy nagyobb dózist. Többfajta mérést végeztek:
Adott második dózisnál a túlél® hányad hogyan módosul annak függvényében, hogy mennyi id® telik el a két besugárzás között.
A dózis túlél® hányad görbék módosulása az kezd®lökés dózisának változtatásával.
Az els® fajta kísérletb®l megállapították (mellrák sejtek, 0,5 Gy els®, 4 Gy második dózis), hogy a túlélési arány már akkor jelent®sen javul (8% 13%), ha 1 órát várnak a második dózissal.
!
Az arány az eltelt id®vel egy
darabig tovább javul (17%), majd 15 óra környékén lassan romlani kezd. A
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
20
további kísérletekhez ennek megfelel®en 6 órás várakozási id®t választottak a két besugárzás között. A második fajta kísérletb®l különböz® eredmények jöttek ki a különböz® sejtvonalakra.
Az egyik fajta broblasztnál a 0,5 Gy, 1 Gy és 2 Gy els®
dózisok esetén a második (2 és 4 Gy) dózisra adott válasz szigni kánsan különböz® volt (meg gyelhet® volt az AR jelenség).
0,2 Gy és 4 Gy els®
dózisok esetén a csak második dózist kapott sejtek viselkedéséhez nagyon hasonló görbét kaptak. A másik broblaszt sejtnél, az egyik mellrák sejtnél, valamint a melanómáknál az AR jelenség egyáltalán nem volt meg gyelhet®. S®t, a sugárzással szemben er®sen ellenálló melanóma vonalnál az ellenkez® eektus volt meg gyelhet®: 4 Gy els® dózis már jelent®sen csökkentette a túlélési arányt. A szerz®k konklúzióként megállapítják, hogy az AR jelentkezése nem labor- vagy kezelési mód függ®, mert minden sejtet ugyanúgy kezeltek, és egyeseknél meg gyelték a jelenséget, másoknál nem. Az ismertett eredmények azt is mutatják, hogy nem függ szövet- vagy sejttípustól, származási él®lényt®l, a szövet radioaktivitásra való érzékenységét®l sem; a saját és mások eredményei alapján egyel®re nem tudják meghatározni, hogy milyen körülmények között lehet az adaptive response jelenségével találkozni.
3.2.2. Alfa Az -részecskék
radiobiológiája cím¶ [19, 31, 32], a Radiation Research
folyóiratban megjelent cikksorozat szerz®csoportja részletes kutatást végzett abban a témában, hogy az
-sugárzásnak
milyen biológiai hatásai vannak,
illetve hogy ezek különböznek-e a korábban
és röntgen-sugárzásra bebizo-
nyított hatásoktól. A besugárzást és a dózisok megállapítását a következ® módszerekkel végezték: forrásként acéllemezre párologtatott
238
Pu izotópot
használtak. A lemez fölé alumíniumból készült kollimátort, nyitható-zárható blendét és (szennyez®dés ellen) Mylar anyagú kilép®ablakot szereltek, így a rendszerb®l jó közelítéssel monoenergiás, egyirányú részecskék léptek ki. A leveg®ben, illetve sejtekben elnyelt dózist többféleképpen is megmérték: kis térfogatú ionizációs kamrával, szcintillációs detektorral és CR39 nyomdetektrorral. Korábban már több cikkben megjelent, hogy a sejtmagon áthaladó
-
részecske (vagy más, nagy LET értékkel rendelkez® részecske) képes a sejt pusztulását okozni (helyesebben: olyan sérülést okozhat, aminek hatására a sejt elpusztítja magát). Különböz® él®lényekb®l származó különböz® sejteket és különböz® energiájú részecskékkel vizsgálva úgy találták, hogy a sejt pusztulásához 2-5 sejtmagon áthaladó részecske szükséges. Ebben a tanulmányban azt is vizsgálták, hogy ez a szám függ-e attól, hogy a sejt, illetve a
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
8. ábra.
21
Raju és munkatársai kutatása alapján a túlélési arányok emberi,
valamint egérb®l és hörcsögb®l származó sejtek esetén. A meredekebb vonal az
, a másik a
eredményeket mutatja.
mag éppen milyen méret¶ vagy alakú, valamint hogy befolyásolja-e az, hogy milyen állatból származik a sejt. A sejttenyésztési körülmények az eddigiekhez nagyon hasonlóak voltak. Az
-részecskés
besugárzáshoz speciális csészéket használtak:
ún. Mylar
anyagból készült az edény alja, ami elég vékony volt ahhoz, hogy átengedje az
-részecskéket (5-15 m).
Minden sejttenyészeten 5 vizsgálatot végeztek el besugárzás után:
Túlélési arány a felületen kapott dózis függvényében. Sejtmagok keresztmetszeti képe uoreszcens mikroszkóppal. A citoplazma vastagságának eloszlása a sejtmag és az edény között. A sejtmag vastagságának pro lja. A vizsgált sejtek keresztmetszeti területének eloszlása.
A túlélési arányokat a 8. ábra mutatja.
TD ),
lemzésére bevezettek egy mennyiséget (
Az eredmények általános jelami azt mutatja meg, hogy az
-részecskék összesen hány m-t tettek meg a mag belsejében. Ezt az értéket 13,8 1,2 m-nek találták a rágcsálók vizsgált sejtjeiben és 3,2 0,2 mnek az emberi sejtekben. Az RBE értékeket vizsgálva megállapították, hogy az 3,8 10%-os túlélés esetén és 5,0, amikor a sejteknek csak a fele pusztul el.
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
22
(a) sejtmagban leadott energia 9. ábra.
(b) RBE
A magban leadott energia illetve az RBE érték változása az ár-
nyékoló fólia vastagságának (a sejtmembrán határán mérhet® függvényében. (
: AG1522, : C3H, : CHO-10B, Æ: HS-23
-energiának)
A hasonló érékek azt mutatják, hogy azok a sejtek, amelyeknek esélyük van az elpusztulásra (elérték a károsodásnak azt a fokát), attól függetlenül el is pusztulnak, hogy
- vagy -sugárzással kezeltük ®ket.
A sorozat következ® részében [31] a kutatócsoport kisebb energiájú, 0,43,5 MeV-es
-részecskékkel végzett kísérleteket annak kiderítésére, hogy ho-
gyan függ a sugárzás biológiai hatásossága (RBE) a sugárzás LET értékét®l, és hogy befolyásolja-e a sejt inaktiválásának valószín¶ségét az, hogy a részecskenyom melyik része esik a sejtmagba.
Az ilyen jelleg¶ méréseket az
inspirálta, hogy az ember tüdejében a szövet szerkezete, illetve árnyékoló hatása miatt az ottani hámsejteket ilyen energiájú sugárzás érheti. A kísérletet az el®z® cikkben ismertetett sejtekkel és módszerekkel végezték annyi különbséggel, hogy az alacsonyabb energiájú részecskéket úgy állították el®, hogy a petri-csésze és a forrás közé plusz réteg, különböz® vastagságú Mylar lmeket helyeztek. Így 0,37, 0,65, 1,0, 1,9, 2,5, 3,0 vagy 3,5 MeV-es
-részecskék érték
a sejteket, 0,038-0,065 Gy/s dózissebesség mellett. A következ® eredmények születtek:
Az RBE érték 2 MeV alatt szigni kánsan alacsonyabb, mint fölötte. Az egyik sejtvonalnál (HS-23) az 1 MeV alatti
-részecskék alig voltak
hatásosak.
Szimulációkból kiderült, hogy a magban az
-részecske
által leadott
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
10. ábra. Az RBE érték 3,5 MeV-es
23
-részecskékhez viszonyított változása az
árnyékoló fólia vastagságának függvényében. Jelmagyarázat az el®z® ábránál.
energia a sejtmembránon mérhet® energia csökkentésével el®ször lassan n®, majd gyorsan csökken (9/a. ábra). A csúcs sejtvonalanként máshol volt, attól függ®en, hogy milyen a sejtmag geometriája és elhelyezkedése a sejten belül.
A magon keresztülmen® részecskék hatásosabbak, mint a magban megállóak. Ez azt is jelentheti, hogy az érzékeny helyek a maghártya közelében vannak, de azt sem zárja ki, hogy egyenletesen elszórva a mag belsejében.
A mért energia-RBE összefüggést a 9/b. ábra mutatja. A különböz® energiájú
-részecskék 3,5 MeV-eshez viszonyított relatív
hatásossága is érdekes struktúrát mutat.
Minden sejtnél általánosan
igaz, hogy a hatásosság el®ször egy ideig n®, majd gyorsan csökken egy minimumig, majd ismét n® (10. ábra). Belyakov és munkatársai [4] egy cikkükben részletes tanulmányt végeztek emberi broblaszt sejtekkel arra vonatkozóan, hogy milyen eektusokat okoz a
- illetve -sugárzás.
A kísérlet kimeneteleként nemcsak a sejtek túlélési
arányát, hanem a mikronukleusz képz®désének és apoptózis bekövetkezésének gyakoriságát is megvizsgálták. Az AGO1522B kódú broblaszt sejteket 20% FCS-sel dúsított, penicillinnel, gombaöl®vel ellátott
MEM tápban tartották, 37 Æ C-on, 5% CO2 -os
atmoszférában. A röntgen-besugárzást 0,73 Gy/perces, az alfát 0,9 Gy/s dózissebesség mellett végezték. Az
-forrás egy 238 Pu izotóp volt, az -részecs-
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
24
11. ábra. Bal oldal: túlélési görbék (röntgen: fent,
:
lent). Jobb oldal: mik-
ronukleusz képz®dési gyakoriság a besugárzás után eltelt id® függvényében.
kék LET értéke 110 keV/ m volt; a besugárzás polivinilidén szür®hártyákon történt, ami után a sejteket rögtön lemosták és petri-csészékbe ültették. A túlélést a szokásos módon, kolóniaképzési képességgel vizsgálták.
A
mikronukleuszt magfestéssel tették láthatóvá, és csak olyan sejteket vettek bele a statisztikába, amik besugárzás után legalább egyszer osztódtak. Az apoptotikus sejtek detektálásához többféle módszert használtak:
magfestés után a mag alakjából, DNS uoreszcens jelölésével, foszfatidil-szerin sejtfelszíni detektálásával (apoptózisra jellemz® esemény).
A kimeneteleket nemcsak kísérlet után rögtön, hanem 8, 14, 24 és 30 nappal kés®bb is megvizsgálták: a kezelt és kontroll sejtekb®l ennyi id®vel a besugárzás után mintát vettek, és megnézték hogy a különböz® események milyen gyakorisággal következtek be a kapott dózis és a besugárzás után eltelt id® függvényében. A 11. ábráról látható, hogy a besugárzott és 8, 14, 24, 30 nap után még él® sejtek közül is kevesebb képes kolóniát képezni (f®leg az kezeltek), mint a kontroll sejtek közül.
-sugárzással
Azt is megállapították, hogy így
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
12. ábra.
25
Bal oldal: apoptózis id®függése (röntgen:
fent,
:
lent).
Jobb
oldal: ugyanaz a dózis függvényében
az
-sugárzás (250 kV-os) röntgen-sugárzáshoz viszonyított relatív biológiai 2
hatékonysága (RBE értéke ) 4,4 és 11,3 között volt, és a várakozási id®vel n®tt. Ezekb®l az is következik, hogy amíg a röntgen-sugárzás által okozott sérülések a 30. napra szinte teljesen elt¶nnek, addig az
-sugárzás sérülései
még ekkor is, kb. 30 sejtosztódás után is örökl®dnek, és életképtelen sejtek születnek. A mikronukleusz képz®désének vizsgálatához olyan dózisokat választottak a kétfajta sugárzáshoz, amelyek nagyjából azonos túlél® hányadot eredményeztek:
1,0, 3,0 és 8,0 Gy röntgen-sugarak esetén, 0,3, 1,0 és 3,0 Gy
-sugárzás esetén.
Az ábrán jól meg gyelhet®, hogy mikornukleusz képz®dés
csak a besugárzás után jelentkezik, mégpedig a csúcs 3-8 napos késéssel, de
-sugárzás esetén még 30 nappal kés®bb is számottev®.
Az RBE értéket erre
a jelenségre számítva 3,2-6,0 számokat kapunk eredményül. Az aptoptózis vizsgálatánál az derült ki, hogy a röntgen-sugárzás kevés apoptotikus sejtet hoz létre: max. 2,6% a 8 Gy dózist kapott sejteknél. Viszont a 3 Gy
-sugárzással kezelt
sejteknél a 8. nap után 11% apoptotikus
hányadot mértek (12. ábra). 2 azonos
dózisú -sugárzás hányszor annyi sejtet pusztít el
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
26
A legutóbbi években kiderült az is, hogy nemcsak a sejtmagon áthaladó
-részecske okozhat sérüléseket, hanem a magot elkerül®, csak a citoplazmán áthaladó is.
S®t egyes tanulmányok azt is kimutatták, hogy pl. mutációk
kialakulásához az is elég, ha a közeli sejtek sérülnek meg.
Erre egy példa
Nagasawa és Little [24] cikke, akik CHO hörcsög sejteket sugároztak be nagyon alacsony dózisú
-sugárzással.
A sejteket a szokásos körülmények
között tartották, besugárzás el®tt szinkronizálták ®ket (G1 fázisba), a besugárzáshoz a korábban már bemutatott Mylar alapanyagú csészéket használták. Sugárforrásként egy 296 MBq aktivitású
238
PuO2 -ot tartalmazó lemezt
használtak, a besugárzást egy réteg héliumon, leveg®n és a Mylar csészén keresztül végezték. A dózist egy fényképez®gép zárszerkezetének segítségével tudták nagyon pontosan szabályozni. Összehasonlításhoz kontroll tenyészeteken kívül használtak még 100 kV-os röntgen-sugárzást is. Kimenetelként a szokásos kolóniaképzési képességgel jellemzett túlélési görbékket, valamint mutációs gyakoriságot vizsgáltak. A túlélési vizsgálatoknál úgy találták, hogy az
-sugárzás röntgenhez vi-
szonyított RBE értéke a 0,051,2 Gy tartományban kb. 18. 0,1 Gy alatt a sejtek túlélési valószín¶sége >95% volt. goknak csak egy részén haladt át
Ebben a tartományban a sejtma-
-részecske.
Itt vizsgálva a mutációs gya-
koriságot úgy találták, hogy az határozottan nemlineáris, kétfázisú jelleget mutat, 3 cGy kritikus ponttal (13/a. ábra). Az adatokat ábrázolták oly módon is, hogy a mutációs gyakoriságot elosztották a magon áthaladó részecskék számával (13/b. ábra). Ebb®l már jól látható, hogy a nagyon alacsony dózisú tartományban az egy áthaladó részecskére jutó mutációs gyakoriság jóval nagyobb, mint ahogy azt a nagyobb dózisoknál tapasztalt linearitásból várnánk. Magyarázatként a szerz®k felvetik a 3.2.1. fejezetben már leírt érzékeny alpopuláció feltevést, de megjegyzik, hogy ez itt sem túl valószín¶, mert itt ha egy sejtet találat ér, akkor az kap egy 0,17 Gy nagyságú dózist, amelyiket pedig nem talál el egy részecske sem, az nem kap semmit. Itt tehát a röntgen-sugárzással szemben a növekv® dózis nem minden sejtre nézve azonosan növekv® terhelést, hanem több eltalált sejtet jelent. Másik lehet®ség, hogy lehetséges, hogy nemcsak a magot, hanem a citoplazmát ért találat is mutagén, ezzel pedig a célterület sokkal nagyobb, mintha csak a magokat vennénk gyelembe.
Viszont más kutatásokból [18, 44] kiderül, hogy
a citoplazma eltalálása ugyan mutációt hozhat létre, de sokkal kisebb valószín¶séggel, mint ebb®l a kísérletb®l következne, ráadásul a vizsgált CHO sejteknek a citoplazma nagy részét kitölt® magjuk van. A szerz®k ezek helyett inkább a bystander-eect néven emlegetett jelenség mellett foglalnak állást, aminek az a lényege, hogy az eltalált sejtb®l, esetleg magából a besugárzott extracelluláris térb®l kémiai jelek szabadulnak
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
27
13. ábra. Nagasawa által talált mutációs gyakoriságok illetve egy magon átmen® részecskére vonatkoztatott mutációs gyakoriságok a dózis függvényében
fel, ami által a sértetlen sejtben is megváltoznak a biokémiai folyamatok. A leírt kísérlet eredményeit is jól magyarázza ez a modell: nagyobb dózisoknál sok sejt megsérül, így ez a hatás nem érvényesül, kis dózisoknál viszont ez dominál. A felismerés, hogy alacsony dózisoknál érdekes dolgok történnek, és az a tény, hogy ilyen tartományban technikai nehézségek vannak (pl. kis részecskeszám
! rossz statisztika) új ötletek és módszerek bevetésére ösztönözte a
kutatókat. Egy ilyen új módszer Søyland és munkatársai [47] által kifejlesztett
-besugárzó összeállítás.
A szerz®k nem gyorsítóból származó részecskéket, hanem egy
212
Pb tar-
talmú radioaktív forrást használnak, amib®l 3 fajta 3 MeV alatti, valamint 6,1 MeV és 8,8 MeV energiájú
-részecskék lépnek ki.
A forrás és a besugárzó
edény közé egy 6 cm hosszú, leveg®t és a részecskék elérni kívánt irányával párhuzamos lemezeket tartalmazó kollimátort helyeztek.
(Ezen csak a két
nagyobb energiájú és jó irányba haladó részecske jut túl.) talmazó edények speciális kialakításúak: az aljuk 12
m
A sejteket tar-
vastag LR115-ös
nyomdetektor- lmb®l készült, amin besugárzás és maratás után láthatóvá tehet®k azok a helyek, ahol részecskék haladtak át. A 6 cm légrésen és a 12
m
fólián csak a legnagyobb energiájú részecskék jutnak át, így a sejteket
egyfajta energiájú sugárzás éri. A forrással a kísérletek a következ®képpen néznek ki: 1. Sejtek passzálása az edénybe, majd a ki nem tapadt sejtek eltávolításához 3-6 óra után tápcsere. Ezután a vizsgálni kívánt területr®l digitális fényképek készítése motorral mozgatható mikroszkóp-tárgyasztalon. Képek tárolása a pontos motorpozíciókkal együtt.
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
28
2. A felvételek készítése után azonnali, el®re megbecsült ideig tartó besugárzás. 3. Sejtek visszakerülnek a termosztátba, egészen addig, amíg a kísérlethez szükséges (a vizsgálni kívánt eektus, pl. mutáció detektálható hatása kialakulhasson). Ekkor egy újabb felvételsorozat (2.) készítése a korábbi helyeken. Az eektus értékelése a képek alapján. Az edény alját képez® LR115 maratása. 4. Két újabb sorozatfelvétel készítése a maratott edényr®l: egy normál módban, amin az
-nyomok jól látható pontként jelentkeznek; egy pe-
dig fáziskontraszt módban: ezen az LR115 lm vastagságkülönbségei egyéni mintázatokat eredményeznek: ezt fel lehet használni az els® sorozat és nyomok képeinek nagyon pontos illesztéséhez. Mint látható, az eljárás további el®nye, hogy nem volt szükség az él® sejtek megfestésére, ami esetleg befolyásolhatta volna a vizsgálni kívánt eektust. A másik, eszközigényesebb módszert választotta Hei csoportja [18] a sejtek pontos besugárzásához. A Columbia egyetemen épített microbeam-et használták a következ® módon: alján 3,8
a sejteket speciálisan kiképzett, az edény
m vastag polipropilén fóliát tartalmazó csészékbe
ültették, majd
megfestették a magokat. Besugárzás el®tt számítógéppel felvételeket készítettek a besugározni kívánt területr®l, egy szoftver felismerte a sejteket, illetve magokat, és a képekkel együtt ezeknek a pontos pozícióját is eltárolta. Besugárzásnál egy mozgató automatika pontosan a kezelni kívánt sejt magjára irányította a mikrosugarat, és meghatározott számú 5,5 MeV-es (LET=90
keV/ m) részecskét küldött bele.
Ezután a sejteket átültették rendes csé-
székbe, és megvizsgálták a túlélési valószín¶ségeket, illetve a mutációs fajtákat és gyakoriságokat. A kutatócsoport ezekben a kísérletekben egy speciális sejtvonalat, AL hörcsög-ember hibrid sejteket használtak.
Ezek a teljes hörcsög génállo-
mányt, valamint egy 11-es emberi kromoszómát tartalmaztak. Ezeknek az az el®nyük, hogy mivel ebben a sejtben ez az emberi kromoszóma nem létfontosságú, csak néhány speci kus sejtfelszíni struktúráért felel®s, nagyon egyszer¶en, oureszcens ellenanyagokkal meg lehet állapítani, hogy ezek a markerek megjelennek-e sejtfelszínen, vagy nem.
Így könnyen eldönthet®,
hogy az emberi kromoszóma megsérült-e, és ha igen, akkor melyik részén. További, PCR vizsgálatokkal részletes mutáció-spektrum is készíthet®. Ennél a fajta mérésnél azért is fontos az mutációk pontos feltárása, mert mivel a sejteket egyesével sugározzák be, naponta csak kb. 10000 sejtet tudnak kezelni, ezért nagy hibák nem engedhet®ek meg.
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
(a) Túlél® hányad
29
(b) S1 mutációs gyakoriság
14. ábra. Hei és munkatársai által mért összefüggések a sejtmagon áthaladó
-részecskék függvényében
A túlél® hányadra vonatkozó mérési eredmények a 14/a. ábrán láthatóak. Jól látszik, hogy még 8, magon keresztülhaladó
-részecske esetén is a kezelés
után a sejtek 10%-a képes volt kolóniát létrehozni.
Ezek az eredmények
összhangban vannak más, hagyományos besugárzásos módszerekb®l kapott adatokkal. A mutációs gyakoriságot egy bizonyos S1 lókusz sértetlenségét jelz® marker segítségével vizsgálták. A kapott mérési pontokat és az illesztett görbét a 14/b. ábra mutatja. Ezekb®l az derül ki, hogy amit a hagyományos módon (hogy a sejtek mindegyike átlagosan kap 1 találatot) nem lehetett bizonyítani, az itt jól látszik: egyetlen magon áthaladó
-részecske a spontán esetnél
kétszer gyakrabban okoz mutációt. A kutatócsoport egy kés®bbi tanulmányában [44] azt vizsgálta meg, hogy milyen jelenségeket lehet akkor meg gyelni, ha nem a sejtmagra, hanem a citoplazmára irányítják a mikrosugarat. A feltételek és eszközök ugyanazok voltak, mint az el®z® cikkben. Az eredmények a 15. ábrán láthatóak. Meg gyelhet®, hogy a túlél® hányad még 32
-részecske esetén is igen magas, szemben azzal, hogy a magon
áthaladó 8 részecske már szinte biztosan elpusztítja a sejtet. A (CD59 lókuszon meg gyelt) mutációs gyakoriságok viszont er®s növekedést mutatnak a citoplazmán áthaladó részecskék számával: 8 részecske esetén 3-szor annyi a mutáns, mint amennyi természetes körülmények között is el®fordul. (Ez az arány további találatok esetén már nem n® tovább.)
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
(a) Túlél® hányad
30
(b) CD59 mutációs gyakoriság
15. ábra. Wu és munkatársai által mért összefüggések a citoplazmán áthaladó
-részecskék függvényében
A szerz®k feltételezték, hogy a meg gyelt mutagén hatást a citoplazmában keletkez® és a magba bejutó szabad oxigéngyökök közvetítik. ellen®rzésére két módszert is felhasználtak: után DMSO-val kezelték:
Ennek
a sejteket besugárzás el®tt és
ez a vegyület megköti az oxigéngyököket.
sejteket besugárzás után BSO-val kezeltek: oxigéngyökfogó mechanizmusát.
Más
ez pedig megköti a sejt saját
Eredményül az adódott, hogy a DMSO-s
kezelés a mutánsok számát kb. ötödére csökkentette, míg a BSO-s kezelés kb. ötszörösére növelte. Ezekb®l elég valószín¶nek látszik, hogy a mutációkat valóban a sugárzás keltette szabadgyökök okozzák, ami pedig ellentmond a korábbi feltevéseknek, miszerint a sugárzás okozta mutációkat közvetlenül a DNS állomány sérülése, ezen belül is a kett®s lánctörés okozza. A cikk rámutat arra is, hogy ugyan a citoplazmát ér® sugárzás csak kb. negyedannyi mutációt idéz el®, mintha ugyanannyi
-részecske a magot éri,
a jelenség mégis nagyon fontos lehet a rák és más betegségek szempontjából: ugyanis a citoplazmát ér® sugárzás úgy mutagén, hogy közben a sejt nagy valószín¶séggel nem pusztul el, míg a magot ért találatnál ennek esélye sokkal nagyobb.
Számszer¶en: 90% túlélés mellett a citoplazmát ér® sugárzásnál
7-szer több mutáció történik.
3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
31
3.3. Sejtek alakja és mozgása Az atomi er® mikroszkóp megalkotása után hamar rájöttek arra, hogy ez az eszköz nagyon is alkalmas biológiai, s®t él® minták vizsgálatára. Már 1990 el®tt megjelentek az els® ilyen témával foglalkozó cikkek (pl. [11]), nem sokkal kés®bb pedig már él® mintákon is végeztek méréseket (pl. [22]). Parpura és munkatársai [27] patkány hipokampuszából származó idegés gliasejteket vizsgáltak AFM segítségével.
Sikerült megmérniük a sejtek
különböz® részeinek átlagos magasságait, de nom felbontású felvételeket is készítettek róluk. Azt is felfedezték, hogy a sejt különböz® területei, pl. sejtmag, mitokondriumok szkennelés közben kitapogathatóak, így meglep®en élesen rajzolódnak ki a számítógép képerny®jén. Ugyanarról a területr®l készített ismételt felvételek segítségével a sejtek mozgásáról is készítettek képeket, és azt is bemutatták, hogy nagyobb letapogató er® használatával egy-egy sejt célzottan eltávolítható a vizsgált területr®l (nanosurgery). Le Grimellec és csoportja [15] olyan módszert dolgoztak ki, amelyik lehet®vé tette, hogy a szokásos 0,5-5 nN helyett 20-60 pN er® alkalmazása mellett készítsenek él® sejtekr®l felvételeket. Ennek a kis er®nek az a nagy el®nye, hogy nagyobb laterális felbontás érhet® el vele (6-7 nm a szokásos 50-500 nm-rel szemben), és a sejtfelszín részleteir®l is több információ nyerhet® vele. Ezért meg tudtak gyelni a sejtfelszínen id®ben változó nom sturktúrákat is. Korábban feltételezték azt, hogy a sejt belsejében meg gyelhet® objektumok úgy válnak láthatóvá, hogy a t¶ átszakítja a membránt. Ilyen kis er® alkalmazásával azonban ez az eshet®ség kizárható, mégis a sejt egyes részein meg gyelhet®k ezek a struktúrák (máshol sima a sejtfelszín). Ez arra enged következtetni, hogy a sejt bizonyos részein a membrán drapéria-szer¶en ráborul pl. a sejtvázra. Ugyanazon a területen végzett ismételt, de növekv® er®vel történ® mérés segítségével még több információt lehet kapni a sejt belsejében található szerkezetekr®l. Másfajta érdekes méréseket végeztek Zimmermann és munkatársai [49] egér broblaszt sejtek által a hordozó felületén hagyott nyomokról. Ezeket a puha és nagyon sérülékeny struktúrákat nem-érintkez® (non-contact) módban vizsgálták.
Ezek a vizsgálatok azért lehetnek fontosak, mert a sejtek
által otthagyott anyagok értékes információkat adhatnak a sejt és a hordozó anyag kapcsolatairól, a kitapadás-elszakadás folyamatáról, a sejt mozgásának mechanizmusairól, de a sejtváz szerkezetér®l is.
4 MÓDSZEREK
32
4. Módszerek
4.1. A sejttenyészetek A könnyebb kezelhet®ség érdekében nem primer sejttenyészeteket hoztunk létre, hanem az irodalomban is b®ségesen jellemzett, immortalizált sejtvonalakat használtunk a kísérletekhez. Els®ként a C6 [5] sejtvonallal kísérleteztem. Ezek patkány agyából származó (rákos) glioma sejtek. El®nyük, hogy rendkívül gyorsan szaporodnak, fert®zéseknek is jól ellenállnak. Vizsgálatukkal információt szerezhetünk arról, hogy egyes ráktípusok sejtjei hogyan reagálhatnak az ®ket ér® sugárzásra. A másik sejtvonal a 3T3 nev¶ [20] volt, amit egérb®l származó, broblaszt típusú sejtek alkotnak. Ezek normális, nem rákos, az el®z®nél nagyobb, lassabb anyagcseréj¶ és lassabb mozgású sejtek. Tulajdonságaiban valószín¶leg lényegesen közelebb áll a normális testi sejtekhez. A sejtek tenyésztéséhez m¶anyag petri-csészéket vagy tenyészt® askákat (Greiner) használtunk.
A tápoldat MEM vagy DMEM volt 10% FCS-sel,
4 mM glutaminnal, valamint (100 egység/ml) penicillinnel és (0,75 amphotericin B-vel (gombaöl®). A tenyészeteket 37
Æ C-os,
g/ml)
100% relatív pá-
ratartalmú, 5% CO2 tartalmú leveg®j¶ inkubátorban tartottuk. A gyorsabban szaporodó sejteket 2-3 naponta, a lassabakat körülbelül hetente (illetve a kísérletekhez igazodva) passzáltuk, azaz ültettük át egy részüket másik tenyészt®edénybe. A passzálást vagy a 3.1.1. fejezetben leírt módon, vagy pedig tripszin segítségével végeztük.
Mindkett®nek az a lé-
nyege, hogy megszünteti a kapcsolatot a sejt és a hordozó anyag között az el®bbi kalciumelvonással, az utóbbi a fehérjék degradálásával , így a sejtek az aljzatról a folyadékba kerülnek. A besugárzásos kísérletekhez speciális Petri-csészéket készítettem (16. ábra bal oldala): 35 mm-es edényeket 3 helyen kifúrtam (ø = 3 mm), majd az edények alját egy 20
m vastag TVK-tól származó, KS-23 típusú,
(felü-
letén módosított polipropilén) fóliával borítottam be, hogy a tápoldat benne maradjon az edényben. A fóliát úgy rögzítettem az edényhez, hogy a csésze anyagát egy kör mentén kloroformmal feloldottam, majd ehhez hozzányomtam a fóliát. Így a kloroform elpárolgása után a fólia és az edény között a folyadék nem tudott kiszivárogni, esetlegesen mérgez® anyagot (ragasztót) nem kellett felhasználni, ráadásul a besugárzás befejeztével a fólia könnyedén eltávolítható (pl. atomi er® mikroszkópos méréshez a csészét nem lehet berakni a készülék alá, csak a fóliát). Az ESR mérésekhez több besugárzott sejt kellett, ezért itt nem volt elegend® furatokat készíteni.
Ezért 60 mm-es csészék aljának nagy részét ki-
vágtam úgy, hogy középen küll®k maradjanak (16. ábra jobb oldala), amik
4 MÓDSZEREK
33
megakadályozzák, hogy a fólia a folyadék súlya alatt kidudorodjon, és ezáltal a sejtek középen gy¶ljenek össze. A fólián a sejtek ugyanolyan jól kitapadtak, mint a tenyészt®edényben, viselkedésükben meg gyelhet® különbség nem volt.
16. ábra. A besugárzáshoz használt csészék A besugárzás el®tt 1-2 nappal mind a besugárzandó, mind a kontroll sejteket ilyen csészékbe ültettem át. Mivel a hagyományos (MEM) tápban tartott sejtek normális m¶ködéséhez (7,3-as pH értékhez) 5% CO2 tartalmú környezetet kell teremteni, és ezt sem az optikai mikroszkópos, sem az atomi er® mikroszkópos vizsgálatoknál nem volt lehet®ségem biztosítani, így a besugárzáshoz és az azt követ® vizsgálatokhoz ún. CO2 -független tápot használtam, ugyanazokkal az adalékokkal, mint amit a másik tápnál ismertettem.
4.2. Az sugárforrások A besugárzásokhoz általáben egy füstdetektorból kiszerelt, tartalmazó, 3 mm aktív terület¶, 37 kBq aktivitású
241
Am izotópot
-forrást
használtam
(19. ábra). Az amerícium 432 éves felezési idej¶ mesterséges izotóp, amely
-bomlással 237 Np-má alakul, miközben 84,5 % valószín¶séggel egy 5,49 MeVes -, majd 35,9 % valószín¶séggel egy 59,5 keV energiájú -részecskét bocsát ki. (A teljes sugárzási spektrum további elemei ennél legalább egy nagyságrenddel kisebb intenzitásúak.) Mivel a
-aktivitás csak feleakkora, mint az ,
sugárzás csak nagyon kis
és a vizsgált vékony (< 1 mm) vizes mintában a valószín¶séggel nyel®dik el, a forrás elhanyagolható.
sugárzásának hatása a kísérletekben
4 MÓDSZEREK
34
0.14
0.15
0.12
Gyakoriság
Gyakoriság
0.10
0.10
0.08
0.06
0.05
0.04
0.02
0.00 4.48
4.50
4.52
4.54
4.56
4.58
4.60
4.62
1.5
1.6
1.7
Energia [MeV]
1.8
1.9
2.0
2.1
2.2
Energia [MeV]
(a) A leveg®réteg után
(b) Ami a sejteket éri
17. ábra. A füstdetektor-forrásból származó
-részecskék energiaeloszlásai
A besugárzási id® meghatározásához, illetve a sejteket ér® sugárzás intenzitásának megállapításához a fent ismertetett edénybe sejtek helyett egy CR39 alapanyagú
-nyomdetektort
(77 Elektronika, Budapest) tettem.
detektort 6N-os NaOH oldatban kimarattam (70
Æ C,
A
15 perc), majd atomi
er® mikroszkóp segítségével értékeltem ki. (A nyomok hagyományos mikroszkóppal is láthatóak, de kis méretük és nagy s¶r¶ségük miatt megszámlálásuk nehéz.) Az 1 óra alatt keletkezett nyoms¶r¶ség 3,5 dott. A forrásból származó
-részecskék
6
10
2
nyom/cm -nek adó-
energiáját a sejtekbe való becsapó-
dáskor Monte-Carlo szimulációval, a TRIM95 [9, 48] program segítségével becsültem meg. Ehhez a következ® szimulációt futtattam le: pontszer¶ forrásból 5,49 MeV energiájú cm-es légrésen és egy 20
-részecskék
lépnek ki, majd áthaladnak egy 1
m vastag polipropilén fólián (18. ábra).
A szimu-
láció eredményeként az adódott, hogy az 1 cm leveg®n való áthaladás után
0,022 MeV energiával rendelkeznek (eloszlásuk: 17/a. 0,043 MeV-re csökken (17/b. ábra). Így a szövetben az -részecskék átlagos úthossza 9,5 0,5 m lehet, ami azt a részecskék 4,544
ábra), majd ez a fólián áthaladva 1,849
jelenti, hogy kitapadt sejtnél a részecskék nagy része nem nyel®dik el magában a sejtben, hanem átmegy rajtuk. Ezért lehet úgy számolni a sejtet ér®
4 MÓDSZEREK
18. ábra.
35
A füstdetektor-forrásból származó
-részecskék
szimulált útja a
sejtekig
dózist, hogy a sejtben leadott energia a sejtet ér® részecskék számának, LET értékének és a sejt átlagos vastagságának szorzata. A LET érték [32] ilyen
energiánál 160-180 keV/ m. Így a sejtek álal elnyelt energia, illetve dózis a használt geometriánál:
E = F LAd; ahol
F
érték,
az áthaladó
A
D=
E Ad
=
FL
-részecskék száma egységnyi id® (1 óra) alatt, L a LET d a vastagsága, a sejt anyagának s¶r¶sége (kb.
a sejt területe,
azonos a vízével). A fenti adatok alapján a sejteket ér® dózissebesség 0,95 Gy/óra (0,016 Gy/perc), így 2 óra alatt 1,9 Gy dózist kapnak. Ez a természetes sugárterheléshez képest soknak t¶nik, mégis az irodalomban [2, 40, 42, 43] ezt alacsony dózisnak szokás nevezni, mivel a sejtek legnagyobb része túléli a besugárzást. A dózis megválasztásánal a sejtek túlélésén kívül azt vettem gyelembe, hogy az okozott eektus meg gyelhet® és reprodukálható legyen. Az ismertetett összeállítás el®nye, hogy alacsony dózissebesség¶ besugárzásokat lehet vele végezni, továbbá a bel®le származó és a sejteket ér® részecskék nagyjából olyan energiájúak, mint amilyenek természetes körülmények között az ember tüdejét érik ([31], l. 22. oldal). Tehát a besugárzó rendszer jól alkalmazható a radontól ered® természetes sugárterhelés modellezésére. Az ESR méréseknél sok sejtet egyidej¶leg kellett besugározni, ezért itt ezt a forrást kis aktív felülete miatt nem tudtam használni. Ezért uránsó U(NO3 )3 felhasználásával készítettem egy másik forrást is. Ebben az uránsót nom por alakban vékony rétegben egy Petri-csésze aljába szórtam, de mivel méréseim szerint a rendszer még így is er®sen inhomogén módon sugár-
4 MÓDSZEREK
36
zott, a következ® megoldást alkalmaztam: a csésze aljára excentrikusan egy mágnest ragasztottam és egy nagyobb, vízzel telt üvegedénybe helyeztem úgy, hogy a víz tetején ússzon. Az egészet egy mágneses kever®re raktam, amely bekapcsolás után egyenletesen forgatta a csészét.
A besugárzandó mintát
a rendszer fölé helyeztem, amely most már sokkal homogénebb besugárzást kapott. (20. ábra) A sejtek helyett a fóliára nyomdetektorokat helyezve ebben az esetben is megmértem a nyoms¶r¶séget: 1 óra alatt átlagosan 10 nyom/cm zett. Mivel az urán
2
keletke-
-részecskéi kisebb energiájúak (4,2 és 4,15 MeV), és az
itt használt légrés is nagyobb volt, a kis nyoms¶r¶séget az okozta, hogy a részecskék nagy része már a fóliában elnyel®dött. Ami átjutott, az is csak igen alacsony energiával került a sejtekbe. forrásból a sejtek óránként kb. 3
10
6
A fenti képlet alapján ebb®l a
Gy dózist kaptak.
Ez az el®z®höz képest rendkívül alacsony dózisnak látszik, valószín¶leg semmilyen meg gyelhet® változást nem okozna, ha optikai vagy atomi er® mikorszkóppal próbálnánk vizsgálódni. Biológiai érdekessége azonban van: a
3
tüd® kb. 3,5 literes térfogatában 30 Bq/m -es radon aktivitáskoncentrációt feltételezve óránként kb. 360 bomlás történik. letén ez ennyi id® alatt 0,00036 nyom/cm
2
2
A tüd® 100 m -es összfelü-
nyoms¶r¶séget jelent, tehát a
forrás által adott dózissebesség még mindig 5 nagyságrenddel nagyobb, mint a természetes. Ezért ez a forrás megfelel® kompromisszumnak látszik ahhoz, hogy a természetes sugárterhelés, alacsony dózisok hatásait vizsgálni tudjuk úgy, hogy miközben nem használunk túlságosan er®s részecskeáramot, mégis nem túl hosszú id® alatt akkora dózist kapjanak a sejtek, hogy egy olyan érzékeny technikával, mint az ESR, detektálhassunk valami változást.
4.3. Optikai mikroszkóp Az alapkísérleteket egy Leica DM-IRB típusú inverz fáziskontraszt-mikroszkópon végeztem. Általában a 20-as (fázisgy¶r¶vel ellátott) objektívet hasz-
650 m2 méret¶ látómez®ket eredményezett.
náltam, ami a fényképeken 840
Ezzel a nagyítással már jól láthatók voltak a sejtek, jó beállításnál a sejtmagok is, és elegend®en nagy terület is látszott ahhoz, hogy a sejtek mozgását gyelemmel lehessen kísérni.
A képek rögzítéséhez egy Nikon Coolpix700
típusú digitális fényképez®gépet használtam, amely egy speciális (házilag gyártott) adapteren keresztül csatlakoztt a mikroszkóp megfelel® (eredeti-
1200 képpontból álló
leg TV-kamerához készült) portjához. A kamera 1600
JPEG eljárással tömörített képeket készített, amelyeket soros kábelen keresztül lehetett számítógépre vinni. A fényképez®gép lehet®séget nyújt arra is, hogy a számítógép távvezérléssel exponálhasson, így tudtam írni egy olyan
4 MÓDSZEREK
37
19. ábra. A füstdetektor-forrás
20. ábra. Az uránsó-forrás
4 MÓDSZEREK
38
programot, ami beállítható id®közönként exponál, majd letölti a készített képet a számítógép merevlemezére. Ezzel megteremtettem a lehet®séget arra, hogy hosszú idej¶, akár többnapos folyamatos mérést végezhessek egy sejttenyészeten. Kezdetben sajnos sok problémát okozott, hogy a kamera rengeteg automatikával van felszerelve, viszont az ilyen szokatlan helyzetekre hogy mikroszkópra van felszerelve nincs felkészítve. Az id® haladtával kitapasztaltam, hogy milyen beállításokkal lehet jó eredményt elérni, de az ehhez vezet® úton sajnos sok olyan sorozatfelvétel készült, amin utólag kellett korrekciókat végezni, és olyanok is, amelyek használhatatlanok voltak. A mérésekhez a sejttenyészetet tartalmazó Petri-csészét egy kisméret¶, átvilágítható, szabályozható h®mérséklet¶ termosztátba helyeztem, és az egészet a mikroszkóp tárgyasztalára helyeztem (21. ábra).
Æ C-ra állítottam.
A termosztátot 37
A sugárforrást a mikroszkóp revolverének egyik szabad pozíciójára er®sítettem fel (19/b. ábra), így el tudtam érni, hogy besugárzás közben is tudjak fotózni oly módon, hogy a sejteket rendesen a forrást nézte, csak az exponálás idejére, maximum 10 másodpercre forgattam be a minta alá az objektívet.
4.3.1. Fényképek kiértékelése A fényképeket el®ször egymáshoz igazítottam, hogy a felvételek közötti esetleges elmozdulásokat korrigáljam. Ezután összef¶ztem ®ket, hogy folyamatos lm legyen bel®le (AniGIF vagy MPEG formátumba). Ez jelent®sen megkönnyítette a sejtek mozgásának, viselkedésének tanulmányozását, mert a mozgó képen sokkal könnyebb felismerni bármilyen rendellenességet vagy a megszokottól eltér® dolgot, mint az egymás mellé rakott fényképeken.
A
könnyebb követhet®ség érdekében az egyes képkockákat a felvétel idejét jelz® feliratokkal láttam el, amelyek más-más szín¶ek, attól függ®en, hogy a forrás a sejtek alatt van-e vagy nem (kék, ha nincs forrás, piros, ha van). Numerikus információk gy¶jtéséhez a tanszéken készült
3
xtrack nev¶
programot használtam, illetve alakítottam az igényeimhez. A program segítségével követni tudtam az egyes sejtek trajektóriáját, a kimenet egy olyan le volt, ami tartalmazta az egyes sejtek különböz® id®pontokban mérhet® koordinátáit.
Ezeken az adatsorokon a kés®bbiekben lehetett m¶veleteket
végrehajtani, pl. meg lehetett bel®lük határozni az objektumok sebességeloszlását vagy kiindulási pontjukhoz viszonyított átlagos távolságukat az id® függvényében. A követéshez olyan sejteket választottam ki, amelyek legalább id®nként mozogtak, és a mérés nagy részén a látómez®ben tartózkodtak. Az 3 Czirók
András
4 MÓDSZEREK
21. ábra.
39
Az optikai mikroszkópos mérésekhez használt termosztát a mik-
roszkóppal
4 MÓDSZEREK
40
eredményként kapott számoszlopokból sejtenként gra konokat készítettem, melyeken megvastagított vonallal jelöltem azokat a szakaszokat, ahol a besugárzást kapták. A haladás irányát minden gra konon nyilakkal jelöltem (l. 27. ábrától).
4.4. Atomi er® mikroszkóp Az atomi er® mikroszkóp [10, 11, 22, 26] nagyon jól alkalmazható biológiai minták vizsgálatára, mert nem szükségel semmilyen az élettel össze nem egyeztethet® el®készítési eljárást (vákuumot, hideget, szemben a hagyományos elektronmikroszkópos technikákkal). A rendszer lehet®séget ad a sejtek felületének 500-50 nm-es, s®t akár még nomabb felbontására is. S®t AFM segítségével vizes mintán, tehát a sejtek normális közegében is lehet mérni, akár 37
Æ C-on
is.
Így az AFM tökéletes eszköz az in vivo mérésekhez.
(Természetesen méréseim nem tekinthet®k valódi in vivo mérésnek, mivel a vizsgált minta nem igazi él®lény, hanem Petri-csészében nevelt sejttenyészet.) Az (contact-mode) AFM technika lényege, hogy egy kis rugólapkára szerelt, nagyon kis görbületi sugarú t¶vel (< 50 nm) végigtapogatjuk a mintát (pl. 500 sorban, soronként 500 mintavétellel), közben egy érzékeny elektronika segítségével detektáljuk a t¶ le- és felhajlását, és ennek megfelel®en igazítunk a t¶ minta fölötti magasságán.
A t¶ felhajlásának mértékéb®l,
illetve a kiigazított magasságokból topográ át lehet készíteni a vizsgált területr®l. A nom mozgásokat piezo-kristályok segítségével lehet el®állítani, a lehajlás detektálását lézerrel és fotodiódákkal végezzük. (A tanszéken egy
m m-es területet letapogatni képes folyadékban is használható szkennert
TopoMetrix típusú AFM készülék van (22. ábra), méréseimhez egy 150 150
használtam.) A könnyebb kezelhet®ség és gyorsabb eredmény érdekében a vizsgálatok egy részénél a sejteket besugárzás után paraformaldehidben xáltam. Ezzel a sejtek elpusztultak ugyan, de megtartották xálás el®tti alakjukat, ezáltal az AFM-mel végzett vizsgálathoz tökéletesen alkalmasak maradtak. A rögzítés nagy el®nye, hogy míg él® mintás mérésnél nagy a veszélye annak, hogy a t¶ a sejtet károsítja, ebben az esetben ez csak rossz beállításnál fordul el®. A mérések egy részét másik technikával, él® sejteken, CO2 -független tápban végeztem. A tápot és sejteket tartalmazó fóliát szilikongy¶r¶k és m¶anyag lapkák segítségével helyeztem el a mintatartón (23. ábra).
A sejtek
mozgását most is megkíséreltem sorozatfelvételek segítségével nyomon követni. Ebben az esetben ez nehézségekbe ütközik, mert egy jó felbontású és min®ség¶ felvétel elkészítése 7-15 percet vesz igénybe, és ezen id® alatt a sejt számottev® mértékben elmozdulhat. Ráadásul nem könny¶ elérni azt sem, hogy a t¶ a sokadik mintavételre se tegyen kárt a sejtben.
4 MÓDSZEREK
22. ábra. Az atomi er® mikroszkóp mér®feje a mintatartóval
23. ábra. Az él® sejtes AFM-mérésekhez használt eszköz
41
4 MÓDSZEREK
42
Tovább nehezíti a mérést, hogy egy olyan sejttenyészeten, amelyen szép (jól értékelhet®, sok részlettel) optikai felvételeket lehet készíteni, annyira ritkásan találhatóak a sejtek, hogy szinte reménytelen ®ket belátható id®n belül megtalálni. Ennek megoldására készíttettünk egy feltétet a Leica mikroszkópra, amelyre rá lehet helyezni az AFM-et oly módon, hogy egyszerre lehet látni vele a mintát és az AFM-t¶t, és közben még szkennelni is lehet (24. ábra). Ennek azonban az a hátránya, hogy bár a sejteket könny¶ megtalálni, és lehet el®re tudni, hogy a mikroszkóp látómez®jének melyik része lesz látható az AFM felvételen, eddig még nem sikerült igazán jó felvételt készíteni vele, mert valamiért nagyon zajos a rendszer, ami er®sen rontja a kép felbontását.
4.5. Elektronspin-rezonancia Az elektronspin-rezonancia (ESR) [6, 7, 8, 37] spektroszkópiai módszer, alapja, hogy a mágneses térben az elektron energianívói felhasadnak (Zeeman-effektus). A mérend® anyagot változtatható er®sség¶, statikus mágneses és váltakozó, nagyfrekvenciás (mikrohullám tartományban) elektromágneses térbe helyezzük, és vizsgáljuk, hogy milyen frekvenciájú teret (annak is a mágneses komponensét) mennyire nyel el a minta. Gyakorlati okokból állandó frekvenciájú elektromágneses teret és változó er®sség¶ mágneses teret szokás használni. A mérés során a rezonancia feltételének teljesülésekor átmenetek alakulnak ki a felhasadt nívók között, ez a spektrumban csúcsként jelentkezik. A felhasadás mértéke, a jel intenzitása, szélessége alakja érzékeny a kémiai környezetre, illetve ennek rendkívül nom változásaira. Az ESR gyakorlati alkalmazásai között szerepel átmeneti fémek komplexei, szerves szabad gyökök, triplett állapotú molekulák, félvezet®k szennyezéseinek, vezetési elektronok fémekben és félvezet®kben való vizsgálata. Dolgozatom szempontjából az a fontos, hogy az ESR biológiai minták vizsgálatakor olyan információkat képes adni, amelyeket más jelenlegi módszerekkel nem lehet megkapni, nevezetesen:
spinjelz®k (lipidmolekulákba épített oxigén-
szabadgyökök) segítségével a sejt membránjának szerkezetét vizsgálhatjuk. A spinjelz®k egy része beépül a membránba, így az ottani gyökök a membránbeli állapotokat fogják közvetíteni. A szabadon, oldatban maradt spinjelz®k a spektrumban máshol adnak csúcsot, így a mobil és a kötött spinjelz®k arányát is megtudhatjuk (l. 55. ábra a 74. oldalon). Ezen kívül felvilágosítást kaphatunk a sejt oxigéngyök-fogyasztó apparátusának m¶ködésér®l is: a sejtek normál körülmények között a bennük található szabadgyököket minimális szinten tartják, mert különben ezek a molekulák az élettani folyamataikat er®sen zavarnák. Ha a spinjelz®k által okozott spektrum-csúcs intenzitásának változását id®ben követjük, akkor információt kaphatunk ennek a gyökreduk-
4 MÓDSZEREK
24. ábra. A mikroszkóp és az AFM egybeépítve
43
4 MÓDSZEREK
44
ciónak a kinetikájáról, ezen belül a sejt fogyasztóapparátusának m¶ködésér®l is. Az ESR mérés el®készítése és folyamata a következ® volt: 1. Besugárzás. 2. Sejtek felszedése EDTÁ-val, majd feloldásuk 5 ml PBS-ben. 3. Sejtek leülepítése centrifugálással. 4. PBS leöntése, spinjelz® hozzáadása: 125
l
5-doxyl-sztearinnsav.
4
(A
zsírsavlánc 5-ös szénatomján van a jelet adó csoport .) 5. Inkubálás h¶t®szekrényben (min. 15 perc): spinjelz® beépül a membránba, de a sejt ilyen alacsony h®mérsékleten nem fogyasztja a gyököket (nagyon lassú az enzimm¶ködés). 6. Minta betöltése a mér®kapillárisba, ülepítés rövid centrifugálással. 7. Mérés különböz® h®mérsékleteken.
4.6. Fluoreszcens festés Sejtbiológiai méréseknél gyakran alkalmaznak uoreszcens festési eljárásokat (25. ábra) [1]. Ezeknek az a lényege, hogy ha egy uoreszcens festékkel megjelölt anyag speci kusan képes hozzáköt®dni a sejt bizonyos alkotóelemeihez, akkor ezek az alkotóelemek jól láthatóak lesznek és jól elkülönülnek a környezetükt®l. A megfestett részek lehetnek pl. a sejtmag, a mikrotubulusok, az aktin- vagy intermedier lamentumok, de más fehérjék vagy fehérjecsaládok is, stb. A módszert továbbfejlesztették úgy is, hogy egyszerre több különböz® speci kus festékkel festenek, amelyeknek mindegyikük különböz® színt ad a képen. Így elérhet®, hogy egyetlen képen különböz® színekkel látható legyen például a sejt mindhárom fajta vázrendszere. További el®nyökkel jár és nagyon látványos, ha ezt a technikát konfokális lézer szkenning mikrószkóppal együtt alkalmazzák. Mi ezeknek a módszereknek az egyik legegyszer¶bb változatát próbáltuk ki: arra voltunk kíváncsiak, hogy a sejt aktinvázában okoz-e valami meg gyelhet® változást a sugárzás. Ezért a Phalloidin-FITC nev¶ festéket alkalmaztuk a következ® protokoll szerint: 1. Besugárzás. 4 Doxyl:
4,4-dimetiloxazolidin-N-oxil
4 MÓDSZEREK
45
2. Fixálás: PBS-ben oldott 4%-os paraformaldehiddel (pH 7,4), 20 percen keresztül, szobah®mérsékleten. 3. Mosás PBS-sel. 4. A sejtmembrán permeábilitásának növelése: a sejtekre PBS-ben (pH 7,4) oldott 0,1%-os TritonX-100-at tettünk, ezt 5 percig hagytuk rajta, szintén szobah®mérsékleten. 5. Ötszöri mosás PBS-sel. 6. A festék hozzáadása: 60 perc inkubálás szobah®mérsékleten megfelel® töménység¶ (10-50
g/ml) Phalloidin-FITC-ben.
7. Mosás 5-ször PBS-sel. 8. A minát tárgylemezre helyeztük, glicerin és PBS 1:1 arányú keverékével rögzítettük, majd a fed®lemezt ugyanezzel az anyaggal er®sítettük a mintához.
4 MÓDSZEREK
25. ábra. Kétfajta uoreszcens festéssel láthatóvá tett sejtvázak
46
5 EREDMÉNYEK
47
5. Eredmények
5.1. Kalibrálás Az optikai mikroszkópos mérésekhez el®ször kalibráltam a mikroszkóp látómezejét.
10
m-es
rácsot helyeztem a tárgyasztalra, lefotóztam különböz®
nagyításokkal, és megszámoltam, hogy a képeken hány vonal látszik. A mez®k méreteit az alábbi táblázat foglalja össze (minden adat
Nagyítás
5 30 40 5 60 20
x
y
840
650
550
425
425
325
280
210
m-ben):
Ezután meghatároztam a sejtek méretét. Ehhez egy rajzprogramba beolvastam egy fényképet, és leolvastam a sejtet befoglaló téglalap két átellenes sarkának koordinátáit, majd megbecsültem, hogy a téglalap területének hányadrészét tölti ki a sejt. (A módszer nyilvánvalóan pontatlan, de mivel a sugárzás statisztikus jelenség, valamint a sejt meglehet®sen széles korlátok között változtatja a területét, a méretmeghatározás hibájának nincs nagy jelent®sége.) A következ® eredményeket kaptam (méretek sejtvonal
tartomány
3T3
500 800
640
C6
200 550
360
m2 -ben):
átlagos
115 120
5.2. Optikai mikroszkóp Els® méréseimet C6-os sejteken végeztem. Egy tipikus felvétel a 26. ábrán látható. A fotókat 5 percenként vettem fel, a besugárzás 3 órával a sorozat elkezdése után indult és 90 percig tartott.
Ezután még 8 órán keresztül
készültek használható felvételek. A kiértékelést a már említett xtrack (4.3.1. fejezet) programmal kezdtem. Beszámoztam a sejteket, és végigkövettem mozgásukat a teljes felvett tartományon. (Csak minden második képet használtam, mert a 10 perces id®skála 5A
vel.
mikroszkóp rendelkezik egy 1,5 -es nagyításnövekedést okozó beforgatható lencsé-
5 EREDMÉNYEK
48
26. ábra. Egy felvétel egy besugárzott C6-os sorozatból: a sejtek sorszáma (0925)
b®ségesen elegend® volt az észlelt mozgási sebességek mellett.) Egyes sejtek kiúsztak a látómez®b®l a kísérlet folyamán, néhány elpusztult; a további feldolgozásnál csak azokat vettem gyelembe, amelyek az id® legnagyobb részét a meg gyelt terület határain belül töltötték, és legalább id®nként elmozdultak. Az áttekinthet®ség kedvéért minden sejt trajektóriáját külön gra konon ábrázoltam. A sejtek eltér® sebességgel mozogva különböz® méret¶ területeket jártak be, így a gra konok skálái sem azonosak, de minden esetben fel
-os na-
vannak tüntetve (a mértékegység 1 pixel). Ennél a mérésnél a 30
-os digitális nagyítást, hogy a kép-
gyítást használtam, majd további 1,25
nek csak a közepe látszódjon a kör alakú keret nélkül. A képeket továbbá 640
480 pixel méret¶re skáláztam le, így egy pixel 0,70 m-nek felel meg.
Hogy lássam, hogy valóban a sugárzás okoz-e változást, csináltam egy kontrollmérést: minden paraméter azonos volt (edény, fólia, táp, h®mérséklet). Egy dologban volt eltérés: ez a sorozat röviddel a passzálás után készült; míg az el®z® mérés el®tt 1 nappal ültettem át a sejteket, itt ez az id® csak 4 óra volt. Ez helyenként látszik is a trajektóriákon: egyes sejtek csak kés®bb kezdenek mozogni. Ezen kívül valószín¶leg ez a paraméter csak annyi változást okozhatott, hogy a sejtek kezdetben csomókban voltak, és innen indultak el sugárirányban, míg egy régebben letapadt tenyészetnél nincs ilyen
5 EREDMÉNYEK
49
-40 -60
-50 -60
-80 -70 -80 -100 -90 -100
-120
-110 -70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
-100
-50
(a) 1. sejt
0
50
(b) 2. sejt 40
-120 -130
30 -140 -150 20 -160 -170 10 -180 -190 -100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
0 -120
60
-100
-80
(c) 3. sejt
-60
-40
-20
(d) 4. sejt
200
150
-80
100
-100
50 -120 0 -140 -50 -160 -100 -40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
200
210
(e) 5. sejt
220
230
240
250
(f) 6. sejt
-120
-80
-130 -90
-140 -150
-100
-160 -110
-170 -180
-120 -190 -130
-200 -210 -260
-240
-220
-200
-180
-160
-140
(g) 7. sejt
-120
-100
-80
-60
-140 -280
-270
-260
-250
-240
-230
-220
(h) 8. sejt
27. ábra. Besugárzott C6 trajektóriák (0925)
-210
-200
-190
-180
5 EREDMÉNYEK
50
-30 0 -40 -50
-20
-60 -40
-70 -80
-60 -90 -230
-220
-210
-200
-190
-180
-170
-160
-150
-300
-280
(a) 9. sejt
-260
-240
-220
-200
(b) 10. sejt 40 30
100
20
50
10 0 0 -50
-10
-100
-20 -30 -80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
60
80
100
(c) 12. sejt
120
140
160
180
200
220
(d) 14. sejt
60
0 -10
50
-20 40 -30 30 -40 20
-50
10
-60 -70
0
-80 -10 100
150
200
250
300
350
400
450
260
270
280
(e) 15. sejt
290
300
310
320
330
(f) 16. sejt
-70 -80 -90 -100 -110 -120 -130 -140 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
(g) 18. sejt 28. ábra. Besugárzott C6 trajektóriák folytatás (0925)
340
350
5 EREDMÉNYEK
51
29. ábra. Egy felvétel a kontroll C6-os sorozatból: a sejtek sorszáma (1106)
korreláció. A sejtek sorszámai a 29. ábrán, a trajektóriák a 30-31. ábrákon láthatóak. A nagyítás itt és a legtöbb további mérésnél (ahol külön nem jelzem)
-os volt, nem használtam digitális zoomot, meghagytam a képek fekete 480,
20
keretét. A követéshez használt képek mérete ebben az esetben is 640 tehát itt egy pixel 1,3
m-nek felel meg.
5 EREDMÉNYEK
52
20
80
10 70 0 60
-10 -20
50
-30 40 -40 -50 -180
-170
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
30 -130
-90
-120
-110
(a) 2. sejt
-100
-90
-80
-70
-60
(b) 3. sejt -70
120
-80
100
-90 80
-100
60
-110
40
-120 -130
20
-140 0
-150
-20
-160
-210
-200
-190
-180
-170
-160
-150
-140
-130
-120
-200
-190
-180
-170
(c) 4. sejt
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
110
120
130
140
180
190
200
210
(d) 5. sejt 160
-130 150 140 -140
130 120
-150
110 100
-160
90 80 -130
-120
-110
-100
-90
40
50
60
(e) 6. sejt
70
80
90
100
(f) 12. sejt -60
-10 -80 -20
-100 -120
-30 -140 -160
-40
-180 -50
-200 -220
-60 60
70
80
90
100
110
(g) 14. sejt
120
130
140
150
-240 110
120
130
140
150
160
170
(h) 15. sejt
30. ábra. Kontroll C6 trajektóriák (1106)
5 EREDMÉNYEK
53
-120
-80
-130
-140 -90 -150
-160
-100
-170 -30
-20
-10
0
10
20
-50
-40
(a) 17. sejt
-30
-20
-10
0
10
(b) 18. sejt 90
60 50
80
40 70
30 20
60
10 50
0 -10 60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
40 -250
170
-240
(c) 19. sejt
-230
-220
-210
-200
-190
-180
(d) 21. sejt
-20
110
-30 100 -40 90 -50
-60
80
-70 70 -20
-10
0
10
20
30
40
50
-20
-10
(e) 23. sejt
0
10
20
30
(f) 25. sejt
0 -20 -40 -60 -80 -100 -120 -140 -160 -220
-210
-200
-190
-180
-170
-160
-150
-140
-130
-120
(g) 26. sejt 31. ábra. Kontroll C6 trajektóriák folytatás (1106)
40
5 EREDMÉNYEK
54
32. ábra. Egy felvétel a kontroll 3T3 sorozatból: a sejtek sorszáma (0330)
A következ® méréssorozatomat 3T3-as tenyészeten végeztem. A kontroll tenyészetet a mérés el®tt 1, a besugárzottat 2 nappal passzáltam a fóliás Petri-csészékbe (l. 32. oldal), ebben az esetben rögtön CO2 -független tápban szuszpendáltam ®ket. (A sejtek max. 3-4 óra alatt teljesen kitapadnak, ezért az 1 nap különbség nem okozhat lényeges változást.) A kontroll kísérletben (0330-as) 48 órán keresztül készítettem folyamatosan felvételeket.
Ennek egy 24 órás darabjából készítettem el a kontroll
trajektóriákat: 34-35 ábrák.
A 32.
ábrán található, hogy melyik sorszám
melyik sejthez tartozik. Néhány esetben osztódást is sikerült egyértelm¶en meg gyelni, ezeknél a sejteknél az osztódás helyét körrel jelöltem, az utódsejteket pedig közös gra konon ábrázoltam (az egyiket négyzettel, a másikat háromszöggel). A besugárzásos kísérletet (0301) 11:00-kor kezdtem. A besugárzás 13:10t®l 14:10-ig és 15:15-t®l 16:15-ig tartott. (A kett® között technikai okok miatt tartottam egy órás szünetet.) A fényképek 10 percenkénti felvételét másnap délig folytattam automata üzemmódban. 15 kiválasztott sejt trajektóriája a 36-37. ábrákon látható. A számozást a 33. ábra tartalmazza. Egy másik besugárzás (1016) sorszámait és trajektóriáit a 38-39 ábrák
5 EREDMÉNYEK
55
33. ábra. Egy felvétel a besugárzott 3T3 sorozatból: a sejtek sorszáma (0301)
5 EREDMÉNYEK
56
240 120
220 200
100 180 160
80
140 60
120 100
40 80 60
20
40 -20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0
20
40
(a) 4. és 33. sejt
60
80
100
120
140
(b) 5. sejt
220
260 240
200
220 180 200 160
180 160
140
140 120 -40
-20
0
20
40
60
80
100
120 -200
-180
-160
(c) 6. és 34. sejt
-140
-120
-100
-80
-60
-40
(d) 8. sejt
250 240 220 200
200
180 160 150 140 120 100
100
80 60 50 -50
0
50
100
150
-40
-20
0
(e) 9. sejt
20
40
60
80
100
120
140
160
180
(f) 10. sejt 20
250
0 -20
200
-40 -60 150 -80 -100 100 -120 -140 50 50
100
150
200
250
(g) 11. és 36. sejt
300
350
60
80
100
120
140
160
180
(h) 12. sejt
34. ábra. Kontroll 3T3 trajektóriák (0330)
200
220
240
260
5 EREDMÉNYEK
57
0
-20
-20
-40
-40
-60
-60
-80
-80
-100
-100
-120
-120
-140
-140
-160
-160
-180
-180 -100
-200 -80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
(a) 13. és 35. sejt
0 -20 -40 -60 -80 -100 -120 -40
-20
0
20
40
60
80
100
120
-80
-60
-40
-20
0
(b) 14. sejt
20
-60
-140 -120 -100
140
160
180
20
40
60
80
100
5 EREDMÉNYEK
58
-60
-40
-80
-50
-100
-60
-70
-120
-80
-140
-180
-160
-140
-120
-100
-80
-60
-40
-20
-160
-150
(a) 4. sejt
-140
-130
-120
-110
(b) 5. sejt 100
-50
50
-55
-60
0
-65 -50
-70 -100 -75 -110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
(c) 7. sejt
-20
-10
0
(d) 8. sejt
-120 -120 -140 -140 -160 -160 -180 -180 -200 -200 -220 -40
-20
0
20
40
60
80
100
-180
-160
-140
(e) 9. sejt
-120
-100
-80
-60
-40
-20
(f) 10. sejt
-220
-180
-200 -240
-220
-260 -240
-280
-260
-40
-20
0
(g) 11. sejt
20
-160
-140
-120
-100
-80
(h) 12. sejt
36. ábra. Besugárzott 3T3 trajektóriák (0301)
-60
-40
0
5 EREDMÉNYEK
59
-140 -140
-160
-160
-180
-180
-200 -200 -220
-220
-240
-20
0
20
40
60
40
60
80
100
(a) 14. sejt
120
140
160
180
200
220
(b) 15. sejt -80
-160
-100 -120 -140 -180 -160 -180 -200 -220
-200
-240 -260 100
120
140
100
120
140
(c) 16. sejt
160
180
200
220
240
(d) 17. sejt -60
-100
-80
-120
-100 -140
-160 120
-120 140
160
180
200
-60
-40
(e) 18. sejt
-20
0
20
(f) 19. sejt
20
0
-20
-40
-60
-80 -20
0
20
40
60
80
(g) 20. sejt 37. ábra. Besugárzott 3T3 trajektóriák folytatás (0301)
40
240
5 EREDMÉNYEK
60
38. ábra. Egy felvétel a besugárzott 3T3 sorozatból: a sejtek sorszáma (1016)
mutatják. Ennél a mérésnél kivételesen 30 xelméret ezért 0,87
m.
-os nagyítást használtam, a pi-
A 0330-as jel¶ kontroll tenyészetet a felvétel után a rendes termosztátban tartottam, kicseréltem a tápot, majd 4 nap múlva újabb kísérletet végeztem vele: a szokásostól eltér®en most 180 perces besugárzást kapott. A 22 órás felvételsorozat (0403) után ismét tápot cseréltem, majd ugyanezt a területet újabb 2 nap múlva ismét besugároztam, most 2 óra hosszan (0405). A 0403-as sorozat eredményei A 42-41. ábrákon, a 0405-ös eredményei A 45-44. ábrákon láthatóak.
5 EREDMÉNYEK
61
-30
-70
-35
-75
-40
-80
-45 -85 -50 -90 -55 -95
-60
-100
-65 -70
-105 40
50
60
70
80
90
100
110
120
220
230
240
(a) 1. sejt
250
260
270
280
290
300
(b) 3. sejt -130
20
-135 10
-140 -145
0 -150 -155
-10
-160 -20
-165 -170
-30
-175 -40
-180 -185
-50 120
130
140
150
160
170
180
190
200
90
100
110
120
(c) 4. sejt
130
140
150
160
170
180
190
200
210
220
(d) 5. sejt
125
-140
120 -160 115 -180
110
105
-200
100 -220 50
60
70
80
90
(e) 6. sejt
100
110
120
250
260
270
280
290
(f) 7. sejt
39. ábra. Besugárzott 3T3 trajektóriák (1016)
300
310
320
5 EREDMÉNYEK
62
150 160 140
140
120 100
130
80 60
120
40 20
110
0 -20 -200
-180
-160
-140
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
100 -100
-90
-80
(a) 1. sejt
-70
-60
-50
-40
-30
(b) 2. sejt 60
20 10
40
0 20
-10 -20
0 -30 -40
-20
-50 -60 80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
180
-40 200
220
240
(c) 4. sejt
260
280
300
320
(d) 5. sejt -70
-80
-80
-90 -100 -100 -120
-110
-120 -140 -130 160
180
200
220
240
260
280
10
20
30
40
(e) 6. sejt
50
60
70
80
90
100
(f) 8. sejt
100 20
80 60
0 40 20
-20
0 -40
-20 -40
-60
-60 -80 -140
-120
-100
-80
-60
-40
(g) 10. sejt
-20
0
20
40
-80 -200
-180
-160
-140
-120
-100
(h) 12. sejt
40. ábra. Besugárzott 3T3 trajektóriák (0403)
-80
-60
5 EREDMÉNYEK
63
-40 90 80
-50
70 -60 60 50
-70
40 -80 30 20 -50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
-90 100
110
(a) 13. sejt
120
130
140
150
160
170
(b) 14. sejt
140 120
100 80
60 40
20 -200
-180
-160
-140
-120
-100
-80
-60
(c) 15. sejt 41. ábra. Besugárzott 3T3 trajektóriák folytatás (0403)
42. ábra. Egy felvétel a besugárzott 3T3 sorozatból: a sejtek sorszáma (0403)
5 EREDMÉNYEK
64
30
130
20
120
10
110
0
100
-10 90 -20 80 -30 70 -120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
30
40
50
60
(a) 1. sejt
70
80
90
100
110
(b) 2. sejt
260 220
240 220
200
200 180 180 160 160 140
140 120
120 -100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
-180
-160
-140
(c) 3. sejt
-120
-100
-80
-60
-40
(d) 4. sejt -70
20
-80
10
-90 0 -100 -10 -110 -20 -120 -30
-130
-40
-140 -40
-20
0
20
40
60
80
100
120
-30
-20
-10
(e) 5. sejt
0
10
20
30
40
50
(f) 7. sejt
-120 250
-130 -140
240 -150 -160
230
-170 -180
220
-190 -200
210
-210 -90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
(g) 8. sejt
-20
-10
0
10
20
60
70
80
90
100
(h) 10. sejt
43. ábra. Besugárzott 3T3 trajektóriák (0405)
110
120
5 EREDMÉNYEK
65
0 120 -20
100 80
-40 60 -60
40
20 -80 0 40
60
80
100
120
140
(a) 11. sejt
160
180
200
-160
-140
-120
-100
-80
-60
-40
(b) 12. sejt
44. ábra. Besugárzott 3T3 trajektóriák folytatás (0405)
45. ábra. Egy felvétel a besugárzott 3T3 sorozatból: a sejtek sorszáma (0405)
5 EREDMÉNYEK
66
A felvételeken több eseményt próbáltam meg gyelni:
a sejt besugárzás alatt vagy néhány órával utána mozgásirányt változtatott,
a sejt besugárzás alatt vagy utána 180 fokkal megváltoztatta haladási irányát,
a sejt mozgása besugárzás alatt vagy utána kuszává vált, a sejt alakja megváltozott.
Külön eseményként kezeltem azt, amikor a sejt lényegében nem változtatott irányt, hanem csak tolatni kezdett ugyanazon az útvonalon, ahol érkezett (b®vebb magyarázatot l. alább). Az alábbi táblázat összefoglalja, hogy melyik esemény melyik sejtnél volt meg gyelhet®.
: : ::
(I
K: : :,
besugárzott sorazotok,
vastag bet¶:
kontroll
sorozatok.) C6
ellenkez® irány irányváltoztatás kusza mozgás összes rendellenes irányváltás v. kusza összes sejt
3T3
I0925
K1106
I0301
I1016
I0403
I0405
K0330
20%
27%
13%
17%
-
10%
38%
7%
7%
40%
50%
73%
50%
19%
40%
7%
33%
17%
-
10%
-
67%
40%
87%
83%
73%
70%
56%
47%
13%
73%
67%
73%
60%
19%
15
15
15
6
11
10
16
Ha összehasonlítjuk a besugárzott és a kontroll sejteknél azt, hogy a sejt irányt váltott vagy kaotikusan kezdett mozogni, láthatjuk, hogy ezek az események sokkal gyakrabban fordulnak el® a sugárzást kapott sejteknél (C6: 47%-13%), 3T3: 69%-19%). Többször el®fordul a trajektóriákon, hogy egy sejt hirtelen nagy ugrást tesz, majd sokáig egy helyben marad. Ezt szinte mindig az okozza, hogy a sejt elveszti a kapcsolatot a substratummal, és felgömbölyödve a tápfolyadékba kerül. Az ugrás egyrészt látszólagos: az optikai síkból kikerül a sejt, másrészt valódi is: ahol a kapcsolat a leger®sebb volt és a legtovább tartott (pl. egy hosszú nyúlvány végén), oda rántódik be a sejt. A felgömbölyödés
5 EREDMÉNYEK
67
lehet programozott is, ezután általában osztódás következik, de bizonyos esetekben ez a sejt elpusztulásának el®jele. Máskor egyszer¶en csak a fóliának olyan részére tévedt a sejt, ahol nem tudott elegend® kapcsolatot létesíteni az aljzattal. Nemcsak a táblázat adataiból, hanem a trajektóriákból is látható, hogy a besugárzott sejteknél sokkal gyakoribb az, hogy besugárzás alatt, de inkább néhány órával utána hirtelen irányt változtatnak, míg a kontroll sejteknél ilyen esemény még hosszabb idej¶ mérést végezve is sokkal ritkábban gyelhet® meg. A mozgás jellemzésére megvizsgáltam azt is, hogy a sejtek átlagosan mi-
p
lyen messzire kerülnek kiindulási helyükt®l az id® függvényében. tatható, hogy véletlen bolyongás esetén ez a távolság
t-vel
Megmu-
arányos, ha a
sejtek valami felé céltudatosan és egyenletesen haladnak, akkor lineárishoz közelít. A kapott gra konok a 46-47. ábrákon láthatóak. A besugárzott C6 sejtek esetén jól meg gyelhet® a görbén egy plató nagyjából a besugárzás közbeni-utáni id®szaknál, míg a kontroll sejteknél ilyen lassulás, majd ismételt felgyorsulás nincs. A 3T3 sejteknél ez csak a 1016-os mérésnél látszik, de itt csak kevés sejtet tudtam követni, ezért ez nem tekinthet® reprezentatív mérésnek. Viszont egy másik érdekes dolog gyelhet® meg: a 0330, 0403, 0405 csoportnál a ami ugyanannak a tenyészetnek rendre a kontroll mérése, els® és második besugárzása a kezd® meredekség mindhárom kísérletnél azonos. Kés®bb azonban a kontroll minta az elvárható gyökös viselkedést mutatja, míg a besugárzottak inkább ennél messzebbre kerülnek kiindulási helyükt®l. Normális esetben a kitapadt, de mozgó sejteknek két pólusuk van (48. ábra), azaz a központi részükb®l két, nagyjából átellenes irányban nyúlványok (vezet® él, ún. lamellipodium és követ® él) ágaznak ki.
Sok esetben
meg gyelhet®, hogy a nyúlvány egyik irányban el®renyomul, mintegy kitapogatva az el®tte lev® területet (valójában itt gyors aktinpolimerizáció folyik, és ez a rész kapcsolatokat létesít a substratumban lev® kollagénekkel és más fehérjékkel), majd egy id® után a sejt maga is követi a nyúlványt. Ez a követés néha igen gyorsan, ugrásszer¶en zajlik le, máskor vagy más sejteknél a mozgás nagyjából egyenletes. A mozgás irányával átellenes oldalon található követ® él valószín¶leg azért van ott, mert azon a helyen a kapcsolatok még nem oldódtak fel vagy szakadtak el. Ahogy a sejt halad el®re, ez a nyúlvány általában követi. El®fordul az is, hogy a sejt valamiért nem tud el®re haladni, (pl. nem tud megfelel® kapcsolatot létesíteni, mert túl sima a fólia,) ilyenkor meg gyelhet® (a trajektóriákon is), hogy a sejt visszatér a pályája korábbi részére.
S®t, ilyenkor néha az is megtörténik, hogy a sejt haladási iránya
véglegesen ez az irány lesz. Besugárzott tenyészeteknél id®nként meg gyelhet® az, hogy a sejtek nem kett®, hanem több nyúlványt növesztenek, több irányban. Ilyen esemény a
5 EREDMÉNYEK
68
70 ’i000925.d’ ’k001106.d’
elmozdulás [
m]
60
kontroll
50
40
besug.
30
20
10
0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
id® [óra]
46. ábra. A C6 sejtek átlagos elmozdulásai az id® függvényében.
kontroll esetekben is látható, de csak igen rövid ideig, a letapadás folyamatának kezdetén. Ezután a sejt általában hamar elindul valamelyik irányba, és csak két nyúlványa marad.
Ezzel szemben a besugárzott mintáknál ez
a multipoláris állapot akár órákig fennmaradhat, miközben a nyúlványok folyamatosan n®nek-visszahúzódnak, változtatják helyüket (49-50. ábrák). A fenti két meg gyelés: a hirtelen irányváltoztatás és a multipoláris sejtek megjelenése alátámaszthatja azt a feltételezést, hogy az extracelluláris mátrix sérülései miatt a sejt lamellipodiuma nem talál megfelel® kapcsolódási pontokat, ezért többfelé próbál tapogatózni, illetve kénytelen megváltoztatni haladási irányát. (Kísérlteteim nem bizonyítják egyértelm¶en az állítás igaz voltát.
Ugyanilyen jó magyarázat lehet pl. a sejt membránjának sérülése
vagy az ionizáló sugárzás következtében megváltozott küls®-bels® biokémiai folyamatok hatása.)
5 EREDMÉNYEK
69
140 ’i001016.d’ ’i010301.d’ ’i010403.d’ ’i010405.d’ ’k010330.d’
elmozdulás [
m]
120
100
kontroll 80
60
40
20
0 0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
id® [óra]
47. ábra.
A 3T3 sejtek átlagos elmozdulásai az id® függvényében.
A nem
jelölt görbék különböz® besugárzások adatsoraiból származnak.
(a) (Nem követett sejt)
(b) 12. sejt
48. ábra. Két bipoláris 3T3 sejt a 0330-as kontroll tenyészetb®l
5 EREDMÉNYEK
(a) 8. sejt
70
(b) (Nem követett sejt)
49. ábra. Két multipoláris 3T3 sejt a 0403-as besugárzott tenyészetb®l
(a) 2 óra
(b) 3 óra
(c) 4 óra
(d) 5 óra
(e) 6 óra
(f) 7 óra
50. ábra. Egy 3T3 sejt alakváltozásai besugárzás után (0403-as tenyészet)
5 EREDMÉNYEK
71
5.3. AFM A besugárzásos kísérletek egyik részénél, ahol nem volt célom a sejtek mozgásának hosszú idej¶ követése, közvetlenül a besugárzás után xálva vagy élve AFM-es mérést kezdtem el. Ezeket nagyobbrészt C6 sejtekkel végeztem, mert kisebb méretük miatt sokkal kényelmesebb volt velük dolgozni. (A 3T3 sejtek legnagyobb része olyan nagy, hogy a t¶t tartó rugólapka ráül a sejtre ez több felvételen látszik is. Így csak speciális esetekben vagy csak bizonyos irányokból lehetett jó képeket készíteni ezekr®l a sejtekr®l.) Megpróbáltam a sejtek közvetlen környezetét felderíteni, hogy nem látható-e valami olyan topográ ai változás, ami az optikai mikroszkóppal nem gyelhet® meg. Több esetben sikerült a multipoláris sejtekr®l jó min®ség¶ felvételt készíteni (néhány C6 sejtr®l készült példa az 51. ábrán látható). Egy esetben sikerült a két 3T3-as sejt közvetlen közelében érdekes objektumokat felfedezni: kis mélyedések bels® struktúrával (52. ábra). A lyukak s¶r¶sége nagyságrendileg megegyezik a becsapódott
-részecskék s¶r¶ségével.
Sajnos
ezt az eredményt nem sikerült reprodukálni, pedig ez bizonyító erej¶ lehetne az extracelluláris mátrix sérüléseire vonatkozóan.
(Az
-részecskék
önma-
guktól természetesen nem lennének képesek ekkora mélyedéseket el®idézni. Viszont ha valamiféle enzimreakciót indukálnának, akkor a meg gyelt eektust már lehetne a sugárzás hatásának tulajdonítani. Természetesen ehhez még rengeteg további kísérletet kellene végezni különböz® dózisokkal és energiákkal, stb.) Kontroll tenyészetekr®l készült felvételek az 53. (C6) és az 54. ábrán (3T3) láthatóak. A mátrix sejtekt®l független sérülésének bizonyításához próbálkoztam a következ® kísérlettel is: a speciális, fóliás Petri-csészében kon uenssé növesztettem egy sejttenyészet.
Így minden valószín¶ség szerint elegend®en sok
mátrixalkotó szabadult fel. Ezután a sejteket EDTÁ-val leoldottam. (Ebben az esetben nem használhattam tripszint, mert az elroncsolta volna a mátrixfehérjéket is, az EDTA viszont csak a kapcsolatokat szünteti meg.)
A
látszólag üres, de remélhet®leg sok extracelluláris mátrixot tartalmazó fóliát PBS alatt, szobah®mérsékleten, 2 órán keresztül besugároztam. Sajnos használahtó eredmény nem született, aminek az esetlegesen hibás feltételezésen kívül az is lehet az oka, hogy a meg gyelhet® méret¶ lyukak kialakulásához a sejtek jelenléte, illetve az általuk kiválasztott anyagok is kellenek.
(Az
AFM-et nagyobb felbontásban használva a fóliát alkotó polimerek csíkjai dominálnak és meg gyelhetetlenné tesznek minden hasonló skálán lev® eektust.) Csináltam egy olyan méréssorozatot is, amiben a meg gyelhet® hatások esetleges dózisfüggését próbáltam felderíteni. Egy nagyobb tenyészt®edény-
5 EREDMÉNYEK
51. ábra. Besugárzott multipoláris C6 sejtek
52. ábra. Mélyedések egy besugárzott 3T3 sejt közelében
72
5 EREDMÉNYEK
73
53. ábra. Kontroll C6 sejtek
54. ábra. Kontroll 3T3 sejt
5 EREDMÉNYEK
74
b®l 8 saját készítés¶ csészébe passzáltam C6 sejteket.
Az egyes edényeket
rendre 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 és 120 perces besugárzásnak vetettem alá. A besugárzás befejezése után fél órán belül mindegyik tenyészetet le xáltam, majd AFM-mel megvizsgáltam. Sajnos ebben az esetben sem sikerült használható eredményeket produkálni. (A kudarcban az is közrejátszhatott, hogy ennél a kísérletnél üzemeltük be a Leica mikroszkópra szerelhet® AFM-feltétet, l. 24. ábra a 43. oldalon és a képek rendre rossz felbontásúak lettek az ekkor még nem ismert zaj miatt.)
5.4. ESR A SOTE Bio zikai Intézetében két méréssorozatot végeztünk, egyet-egyet mindkét sejtvonallal.
membránba épült gyök 12000
mobilis gyök
8000
s tái
4000
z n et ni
0
-4000
-8000 3360
3380
3400
3420
3440
3460
mágneses térerõsség 55. ábra. ESR spektrum 10
Æ C-on kontroll C6 sejteken
A fent ismertetett (4.5. fejezet) protokollt követve el®ször C6 kontroll sej-
Æ
teket vizsgáltunk. Felvettük a spektrumot 10 C-on (55. ábra), majd mértünk egy kinetikát a kötött gyök jelének legnagyobb csúcsára állítva a mágneses tér er®sségét.
Ezután a h®mérsékletet 20, majd 30
Æ C-ra
emeltük, és újra
felvettük a spektrumot és a kinetikát. A besugárzást a 4.2. fejezetben ismertetett, uránsóforrással végeztük. A C6 sejteket 2 órán kersztül tartottuk a forrás fölött, a kapott dózis kb. 0,006 mGy volt.
5 EREDMÉNYEK
75
8000
6000
4000
s át iz
2000
n et ni
0
-2000
-4000
3360
3380
3400
3420
3440
3460
mágneses térerõsség 56. ábra. ESR spektrum 10
Æ C-on besugárzott C6
sejteken
Æ
A besugárzás befejeztével az egész eljárást (a 10 C-os kinetika kivételével) a besugárzott C6 sejtekre is megismételtük. A zajosabb, kisebb intenzitású felvételek oka az, hogy a sejteket nem sikerült rövid idej¶ centrifugálással a kapilláris aljára tömöríteni. kevesebb sejt került. A 10
Ezért az ESR berendezés aktív térfogatába
Æ C-on mért spektrumot
az 56. ábra mutatja.
A kinetikákat egy közös gra konon tüntettem fel (57. ábra). Az alsó vonalak a besugárzott tenyészethez, a fels® a kontrollhoz tartozik. Az id®skálán úgy mozgattam el az egyes méréseket, hogy az a valós id®viszonyokat tükrözze. Az intenzitástengely skálája minden mérésnél kissé más lehet, mert ez egyrészt az er®sít® beállításaival együtt változik, másrészt a spektrum csúcsa minden h®mérsékleten egy kissé eltolódhat. Ezért úgy módosítottam az egyes adathalmazok Y koordinátáit, hogy az adatpontok (a zajt leszámítva) monoton sorozatot alkossanak. Ahol ez lehetséges volt, az egyes szakaszokra exponenciális függvényt illesztettem, a kapott paramétereket az ábrán feltüntettem. Az illesztést rögzített
x0 paraméterrel végeztem úgy, hogy értéke
annyi legyen, amennyivel a mérés a h¶t®b®l való kiszedés után kezd®dött. A 3T3 sejtek 3,5 órás besugárzást, azaz kb. 0,01 mGy dózist kaptak. Néhány alacsonyabb (10, 16, 25
Æ C-os) h®mérséklet¶ mérés után kiderült, hogy
ezek a sejtek csak magasabb h®mérsékleten aktívak, így a kinetikákat csak 30, 35 és 38
Æ C-on
mértük meg. Minden további paraméter megegyezett a
C6-os méréssel, most mindkét mintát sikerült azonosan bes¶ríteni a kapilláris aljára. A spektrumokat és a kinetikákat az 58-60. ábrák mutatják. (Itt a
5 EREDMÉNYEK
76
10 °C
50000
20 °C
40000
30000
s
Besugárzott 30 °C
át
Chi^2 = 85829
iz
20000
n et ni
10000
y0
-12080
12.28
x0
953
****
A1
11132
****
t1
259.0
1.305
Kontroll 30 °C
30 °C
Chi^2 = 97155
20 °C
0
y0
-12991
34.58
x0
1285
66E6
A1
33814
4.2E8
t1
535.0
1.46
30 °C
-10000
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
idõ [s]
57. ábra. ESR kinetikák a C6 sejteken
kontrollmérés adatpontjai vannak alul!) A C6-os mérésnél egyértelm¶en és hibahatáron messze túl az derül ki, hogy a besugárzott sejtek kétszer gyorsabban fogyasztják a gyököket, mint kontroll társaik. Sajnos nem volt alkalmam a mérést ugyanezzel a sejttípussal megismételni, ezért elképzelhet®, hogy a jelenség pusztán mérési hiba. De a különbség annyira szembeötl®, hogy néhány lehetséges magyarázatot érdemes megemlíteni:
Az ionizáló sugárzás maga is gyökképz® hatás. Elképzelhet®, hogy az ilyen módon keletkezett gyökök elreagálnak az általunk beépített gyökökkel, ezáltal ez a zikai folyamat er®síti a biológiai gyökfogyasztást. Ennek ellentmond, hogy ennek a zikai folyamatnak az id®skálája sokkal rövidebb, mint a biológiainak, tehát a reakciók dönt® része már a kapillárisba kerülés el®tt lejátszódott.
Az ionizáló sugárzás stimulálhatja a sejt védekez® enzimrendszerét, intenzívebb m¶ködést vagy er®sebb expressziót okozva (adaptive response, l. 12. oldal).
A 3T3 sejteknél ilyen szembeötl® különbséget nem lehet felfedezni. Sajnos ezek a sejtek annyival lassabb anyagcseréj¶ek, hogy nagyon sokáig kellett volna várni, amíg az exponenciális id®állandója jó pontossággal megállapítható lett volna.
Annyi azonban bizonyos, hogy itt nincs egy 2-es faktor
5 EREDMÉNYEK
77
30000
s
20000
10000
át et
n
iz 0
ni
-10000
-20000
3360
3380
3400
3420
3440
3460
mágneses térerõsség 58. ábra. ESR spektrum 30
Æ C-on
kontroll 3T3 sejteken
30000
s
20000
10000
áti ni
et
n
z 0
-10000
-20000
3360
3380
3400
3420
3440
3460
mágneses térerõsség 59. ábra. ESR spektrum 30
Æ C-on
besugárzott 3T3 sejteken
5 EREDMÉNYEK
78 Besugárzott 35 °C Chi^2 = 183400
90000
y0
43453
3844
x0
720
****
A1
25592
3791
t1
546.4
98.69
80000
Besugárzott 38 °C
35 °C
70000
Chi^2 = 144000
30 °C
60000
s
át 50000 i z n
et 40000 ni
30000
y0
15334
x0
1140
****
A1
39410
5023
t1
1114
160.9
Kontroll 35 °C Chi^2 = 150000
Kontroll 38 °C
y0
-30419
8430
Chi^2 = 92400
x0
480
****
y0
-7477
361.6
A1
101491
8396
x0
1320
****
t1
2135
196.1
A1
40174
343.1
t1
1077
14.13
20000 10000 0
5063
38 °C 0
500
1000
1500
2000
2500
idõ [s]
60. ábra. ESR kineteikák 3T3 sejteken
különbség az id®állandók között. (A 35
Æ C-os
illesztés eredményét nem ér-
demes komolyan venni, mert az exponenciális annyira egyenes, hogy egy nagyságrenddel megváltoztatott
t1
értékkel nem sokkal nagyobb
lehet elérni.) Szigni káns különbség egyedül a 30
Æ C-os
2
értéket
mérésben van, itt a kontroll
gra konjának lényegesen alacsonyabb kezdeti (lináris illesztésb®l származó) meredeksége 22, a besugárzott 34-esével szemben. Ez ugyan pont az a h®mérséklet, aminél a C6 sejtek meggy®z® különbségét sikerült produkálni, de amíg a C6-ok ezen a h®mérsékleten néhány perc alatt elfogyasztották az összes gyököt, addig a 3T3 sejteknél alig volt valami intenzitáscsökkenés. Ez esetleg azt a feltételezést er®síti, hogy a különbséget valami zikai vagy kémiai folyamat okozza, ami független a sejtek eltér® biológiai tulajdonságaiból ered®, az anyagcsere sebességében jelentkez® radikális különbségt®l.
5 EREDMÉNYEK
(a) fáziskontraszt módban
79
(b) uoreszcens módban
61. ábra. Fluoreszcensen jelölt besugárzott sejtek
5.5. Fluoreszcens festés A 71. oldalon ismertetett AFM méréshez készített mintát használtuk fel ehhez a kísérlethez.
A 105 perces besugárzást kapott C6-os sejteket a 4.6.
fejezetben leírt módon preparáltuk, kétféle koncentrációval: 10 és 50
g/ml.
Sajnos a hígabb festékkel jelölve is túl er®s színez®dést kaptunk, így a sejtváz nem vehet® ki tisztán. Azonban alakbeli különbségeket meg lehet gyelni, az eddig ismertett eredményekkel összhangban. A felvett képek közül a következ® oldalakon látható néhány. (A képek különböz® nagyításokkal és kivágásokkal készültek, a sejtek mérete ezért látszik eltér®nek.) A hagyományos és a uoreszcens mód összevetésére készítettem egy képpárt is (61. ábra a és b). A besugárzott sejtekr®l készített képeken meg gyelhet® néhány olyan sejt, aminek a szokásostól eltér® alakja van hasonlóan a korábban leírtakhoz.
5 EREDMÉNYEK
62. ábra. Fluoreszcensen jelölt kontroll sejtek
80
6 ÖSSZEFOGLALÁS
81
6. Összefoglalás Munkám f® célja a természetes radioaktivás, illetve ennek nagy részét adó
-sugárzás hatásainak él® sejtkultúrákon való vizsgálata volt.
A természetes
f®ként radonból erede® dózisterhelés modellezéséhez kis aktivitású forrást alkalmaztam, melynek sugárzása a sejtek nagy részét nem pusztította el. Másrészt az irodalom tanulmányozása során felt¶nt, hogy a témával foglalkozó kutatások nagy része a sejtek túlélésének valószín¶ségével vagy biokémiai és genetikai elváltozások keresésével foglalkozik. Mivel lehet®ségem volt néhány új, vagy ezen a területen még nem használt módszer alkalmazására, én nem ezekre koncentráltam, hanem inkább a sejtek alakjában és mozgásuk dinamikájában kerestem a sugárzás hatására meg gyelhet® különbségeket, arra is gyelve, hogy ezek esetleg nem direkt hatások következményei, hanem a sejtek környezetének, az extracelluláris mátrixnak a sérüléseib®l erednek. Ezt a feltételezést a következ® módszerek kombinálásával próbáltam alátámasztani:
Optikai mikroszkóp és digitális fényképez®gép használatával sorozatfelvételek készítése automata üzemmódban. Ez az összeállítás lehet®séget ad arra, hogy a sejtek mozgását hosszú id®n keresztül gyelemmel kísérjük, valamint lehet®vé teszi, hogy alakjuk változásának id®beli lefolyását végigkövessük.
Ezt a módszert sugárbiológiai kutatásokhoz
eddig még nem használták.
Atomi er® mikroszkópia alkalmazása nomabb felbontáshoz és topográ ához. A kutatott terület szintén új alkalmazási területe az AFM-nek.
Elektronspin-rezonancia spektroszkópia használata a membránszerkezet esetleges megváltozásának felderítéséhez.
Fluoreszcens festés a sejt vázának tanulmányozásához.
Kísérleteim körülményei, az alkalmazott sejttenyésztési protokollok és módszerek, valamint a besugárzási eljárások nagyon hasonlóak voltak a világon máshol is sok helyen alkalmazottakhoz. Ezért lehet®ségem van arra, hogy az általam meg gyelt jelenségeket más publikációkban közölt tapasztalatokkal összevessem. Eredményeim röviden összefoglalva a következ®k: 1. Az alkalmazott alacsony dózisoknál (< 2 Gy) a sejtek túlnyomó többsége nem pusztul el. Ez megfelel az irodalomban publikált adatoknak.
6 ÖSSZEFOGLALÁS
82
2. Új meg gyelés, hogy a sejtek egy része besugárzás hatására másképpen mozog, mint ugyanolyan körülmények között tartott ugyanolyan kontroll sejtek. Míg ez utóbbiakra jellemz®, hogy akár sok órán keresztül is képesek nagyjából egy irányba haladni, addig a sugárzással kezelt sejteknél gyakran meg gyelhet® kusza, rendszertelen mozgás és hirtelen irányváltoztatás. 3. Néhány besugárzott sejt alakja jelent®sen eltér attól, mint ami normál körülmények között meg gyelhet®. Err®l a jelenségr®l több független kísérlet is számot ad (optikai mikroszkóp, AFM, uoreszcens aktinjelölés).
A vizsgált sejtekre általában jellemz® az, hogy kétpólusúak
( broblaszt jelleg¶ alak), ezzel szemben a besugárzott tenyészetben viszonylag gyakran fordul el® ett®l eltér® forma, például kett®nél több, rendszertelen, többszörösen elágazó nyúlvány. Ezek a meg gyelések ugyan nem bizonyítják egyértelm¶en, de meger®sítik azt a feltételezést, hogy az
-sugárzás
nemcsak a sejteket, hanem azok
környezetét, így az extracelluláris mátrixot is károsítja. A korábban publikált munkák tanulmányozása és a saját eredményeim kiértékelése közben sok olyan területet érintettem, amelyeken érdemes lenne alaposabb kutatásokat végezni:
Kísérleteim során csak két fajta energiájú és intenzitású forrást használtam, hangolást leginkább csak a légrés változtatásával lehetett elérni. Érdemes lenne az elvégzett kísérletekhez hasonlókat végezni többféle energiájú sugárzással, többféle dózissebességgel, többféle dózissal. Továbbá érdekes lenne meg gyelni, hogy hogyan befolyásolja az eredményeket, ha a sugárzás
/ / -összetételét megváltoztatjuk.
A mikroszkópos képek kiértékelésénél csak kevés szempontot tudtam gyelembe venni. Érdemes lenne a meg gyeléseket további paraméterekkel b®víteni, pl.: sejt bipoláris/multipoláris voltának változásai, területének (térfogatának) változása az id® függvényében, osztódási gyakoriság, stb.
A mikroszkópos képek kiértékelése nagyon lassú és fáradságos. Érdemes lenne a számítógép által elvégezhet® részeket automatizálni.
Felvételek készítésének javítása: az élesség elállítódásának megoldása számítógép-vezérelt autofókusz segítségével.
A sejtek viselkedésének meg gyelése szén-dioxidos termosztátban, hagyományos (nem CO2 -independens) tápban.
6 ÖSSZEFOGLALÁS
83
Más sejtvonalak vizsgálata, összehasonlításuk az eddigi eredményekkel. Az extracelluláris mátrix feltételezett változásainak direkt bizonyítása AFM vagy más eszköz segítségével.
ESR mérések különböz® módokon besugárzott sejteken: membránszerkezet és a sejt gyökredukáló kinetikájának mélyebb vizsgálata.
Köszönetnyilvánítás Dologzatom megírását rengeteg tényez® és sok ember is segítette. Közülük szeretnék néhányat felsorolni. Köszönöm
Dr. Rozlosnik Noéminek
az érdekes témát és a minden
szinten hozzáférhet® segítségforrást,
Vicsek Tamás professzor úrnak a szakmai támogatáson kívül azt, hogy használhattam a tanszék eszközeit,
Sajó-Bohus László professzor úrnak és Szabó Bálintnak a sokféle kérdéseimre adott válaszokat és a dolgozat lektorálását,
Dr. Madarász Emíliának és Dr. Környei Zsuzsának a sejteket,
Nemes Csillának, Heged¶s Balázsnak és Méhes El®dnek hiányos biológiai ismereteim kiegészítését,
Méhes El®dnek a uoreszcens festési kísérletet, Haiman Ottó tanár úrnak a számtalan optikai probléma megoldását,
Dr. Czirók Andrásnak és Kovács Jánosnak a fényképek kiértékelésben nyújtott szó- és programkódbeli segítségüket,
Szabó Zsó nak és Dr. Gróf Pálnak az ESR méréseket, Csiszér Miklósnak az elektronikai hátteret, Ru Mariannak a mindig jó munkakörülményeket és eszközöket,
Dr. Tóth Eszternek azt, hogy végül zikus lettem.
HIVATKOZÁSOK
85
Hivatkozások [1] B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Ra, K. Roberts, and J. D. Watson.
Molecular Biology of the Cell. Garland Publishing, Inc., New York & London, 1994. [2] R. J. Amdur and J. S. Bedford. Dose-rate eects between 0.3 and 30 Gy/h in a normal and a malignant human cell line. Int. J. Radiat. Oncol.
Biol. Phys., 30(1):8390, 1994. [3] F. Behounek. History of the exposure of miners to radon. Health Phys., 19(1):5657, 1970. [4] O. V. Belyakov, K. M. Prise, K. R. Trott, and B. D. Michael. Delayed lethality, apoptosis and micronucleus formation in human broblasts irradiated with X-rays or alpha-particles. Int. J. Radiat. Biol., 75(8):985 993, 1999. [5] P. Benda, J. Lightbody, G. Sato, L. Levine, and W. Sweet. Dierentiated rat glial cell strain in tissue culture. Science, 161(839):370371, 1968. [6] L. J. Berliner, editor. Spin Labeling: Theory and Applications. Academic Press, New York, 1976. [7] L. J. Berliner and J. Reuben, editors. Biological Magnetic Resonance. Plenum Press, New York, 1978. [8] M. Bersohn and J. C. Baird. An Introduction to Electron Paramagnetic
Resonance. W. A. Benjamin, New York, 1966. [9] J. P. Biersack and J. F. Ziegler. The Transport of Ions in Matter. IBM Research, Yorktown, NY, 10598, 1994. [10] G. Binnig, C. F. Quate, and C. Gerber. Atomic force microscope. Phys.
Rev. Lett., 56:930933, 1986. [11] H.-J. Butt, E. K. Wol, S. A. C. Gould, B. D. Northern, C. M. Peterson, and P. K. Hansma. Imaging cells with the atomic force microscope. J.
Struct. Biol., 105:5461, 1990. [12] B. L. Cohen.
The cancer risk from low-level radiation.
Radiat. Res.,
149(5):525528, 1998. [13] N. Daunt.
Lack of evidence of risk from low-level radiation.
Aust., 172(7):351352, 2000.
Med. J.
HIVATKOZÁSOK
86
[14] J. I. Fabrikant. Radon and lung cancer: the BEIR IV Report. Health
Phys., 59(1):8997, 1990. [15] C. Le Grimellec, E. Lesniewska, M.-C. Giocondi, E. Finot, V. Vié, and J.-P. Goudonnet.
Imaging of the surface of living cells by low-force
contact-mode atomic force microscopy. Biophys. J., 75:695703, 1998. [16] Marx György. Atommagközelben. Mozak Oktatási Stúdió, Szeged, 1996. [17] G. M. Hann and J. B. Little.
Plateau-phase cultures of mammalian
cells: An in vitro model for human cancer. Curr. Topics Radiat. Res.
Q., 8:3983, 1972. [18] T. Hei, L. J. Wu S. X. Liu, D. Vannais, , and C. A. Waldren. Mutagenic eects of a single and an exact number of
particles in mammalian
cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:37653770, 1997. [19] W. C. Inkret, Y. Eisen, W. F. Harvey, A. M. Koehler, and M. R. Raju. Radiobiology of
particles. I. Exposure system and dosimetry.
Radiat.
Res., 123:304310, 1990. [20] J. L. Jainchill, S. A. Aaronson, and G. J. Todaro. Murine sarcoma and leukemia viruses:
assay using clonal lines of contact-inhibited mouse
cells. J. Virol., 4(5):549553, 1969. [21] Kovács János. Sejttan. ELTE Eötvös Kiadó, Budapest, 1999. [22] S. V. Kasas, V. Gotzos, and M. Celio. Observation of living cells using the atomic force microscope. Biophys. J., 64:539, 1993. [23] B. Marples and M. C. Joiner. The response of Chinese hamster V79 cells to low radiation doses: evidence of enhanced sensitivity of the whole cell population. Radiat. Res., 133:4151, 1993. [24] H. Nagasawa and J. B. Little. Unexpected sensitivity to the induction of mutations by very low doses of alpha-particle radiation: evidence for a bystander eect. Radiat. Res., 152(5):552557, 1999. [25] National Council on Radiation Protection and Measurements. Ionizing Radiation Exposure of the Population of the United States Report No. 93. Technical report, Natl. Acad. Sci. USA, Washington, DC, 1987. [26] F. M. Ohnesorge, J. K. H. Hörber, C.-P. Czerny, D. P. E. Smith, and G. Binnig. AFM review study on pox viruses and living cells. Biophys.
J., 73:21832194, 1997.
HIVATKOZÁSOK
87
[27] V. Parpura, P. G. Haydon, and E. Henderson. Three-dimensional imaging of living neurons and glia with the atomic force microscope. J. of
Cell Sci., 104:427432, 1993. [28] H. Peterson, Cohen, H. W. Berk, and H. G. Petrow. Epidemiological follow-up of the New Jersey radium cases. NYO-2181-4.
NYO Rep.,
1:1108, 1968. [29] M. Pollycove and L. E. Feinendegen. Molecular biology, epidemiology, and the demise of the linear no-threshold (LNT) hypothesis. C. R. Acad.
Sci. III., 322(2-3):197204, 1999. [30] G. P. Raaphorst and S. Boyden. Adaptive response and its variation in human normal and tumour cells. Int. J. Radiat. Biol., 75(7):865873, 1999. [31] M. R. Raju, Y. Eisen, S. Carpenter, and W. C. Inkret. Radiobiology of
particles. III. Cell inactivation by
particle traversals of the cell
nucleus. Radiat. Res., 128:204209, 1991. [32] M. R. Raju, Y. Eisen, S. Carpenter, K. Jarrett, and W. F. Harvey. Radiobiology of
particles. IV. Cell inactivation by particles of energies
0.4-3.5 mev. Radiat. Res., 133:289296, 1993. [33] J. C. Roeske and T. G. Stinchcomb. Tumor control probability model for alpha-particle-emitting radionuclides. Radiat. Res., 153(1):1622, 2000. [34] J. M. Samet and R. W. Hornung. Review of radon and lung cancer risk.
Risk. Anal., 10(1):6575, 1990. [35] B. Singh, J. E. Arrand, and M. C. Joiner. Hypersensitive response of normal human lung epithelial cells at low radiation doses. Int. J. Radiat.
Biol., 65(4):457464, 1994. [36] L. D. Skarsgrad and B. G. Wouters. Substructure in the cell survival response at low radiation dose: eect of dierent subpopulations. Int.
J. Radiat. Biol., 71(6):737749, 1997. [37] H. M. Swartz, J. R. Bolton, and D. C. Borg. Biological Applications of
Electron Spin Resonance. Wiley-Interscience, New York, 1972. [38] A. Taghian, J. Ramsay, J. Allalunis-Turner, W. Budach, D. Gioioso, F. Pardo, P. Okunie abd N. Bleehen, R. Urtasun, and H. Suit. Intrinistic radiation sensitivity may not be the major determinant of the poor clinical outcome of gliobastoma multiforme. Int. J. Radiat. Oncol. Biol.
Phys., 25(2):243249, 1993.
HIVATKOZÁSOK [39] E. W. Webster.
88
Hormesis and radiation protection.
Invest. Radiol.,
28(5):451453, 1993. [40] R. C. Wilkins, C. E. Ng, and G. P. Raaphorst. Comparision of high dose rate, low dose rate, and high dose rate fractioned radiation for optimizing dierences in radiosensitivity in vitro. Radiat. Oncol. Investig., 6(5):209 215, 1998. [41] B. G. Wouters and L. D. Skarsgard. Low-dose radiation sensitivity and induced radioresistence to cell killing in ht-29 celss is distinct from the adaptive response and cannot be explained by a subpopulation of sensitive cells. Radiat. Res., 148:435442, 1997. [42] B. G. Wouters and L. D. Skarsgrad. The response of human cell line to low radiation doses: evidence of enhanced sensitivity. Radiat. Res., 138(1 Suppl):7680, 1994. [43] B. G. Wouters, A. M. Sy, and L. D. Skarsgrad. Low-dose hypersensitivity and increased radioresistance in a panel of human tumor cell lines with dierent radiosensitivity. Radiat. Res., 146(4):399413, 1996. [44] L. J. Wu, G. Randers-Pehrson, A. Xu, C. A. Waldren, C. R. Geard, Z. L. Yu, and T. K. Hei. Targeted cytoplasmic irradiation with alpha particles induces mutations in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 96:49594964, 1999. [45] X. Yang, L. J. Darling, T. J. McMillan, J. H. Peacock, and G. G. Steel. Heterogenity of radiosensitivity in a human glioma cell line.
Int. J.
Radiat. Oncol. Biol. Phys., 22(1):103108, 1992. [46] C. Søyland and S. P. Hassfjell. Survival of human lung epithelial cells following in vitro alpha-particle irradiation with absolute determination of the number of alpha-particle traversals of individual cells.
Int. J.
Radiat. Biol., 76(10):13151322, 2000. [47] C. Søyland, S. P. Hassfjell, and H. B. Steen. A new alpha-particle irradiator with absolute dosimetric determination. Radiat. Res., 153(1):915, 2000. [48] J. F. Ziegler, J. P. Biersack, and U. Littmark. The Stopping and Range
of Ions in Solids. Pergamon Press, 1995. [49] H. Zimmermann, R. Hagedorn, E. Richter, and G. Fuhr. Topography of cell traces studied by atomic force microscopy. 28:516525, 1999.
Eur. Biophys. J.,
