Egy multifunkcionális fehérje: az ALR

ÖSSZEFOGLALÓ KÖZLEMÉNY Ö S S ZEFOGLA LÓ K ÖZLEM ÉN Y

Egy multifunkcionális fehérje: az ALR Balogh Tibor1

■

Szarka András dr.1, 2

1

Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszék, Biokémiai és Molekuláris Biológiai Laboratórium, Budapest 2 Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Orvosi Vegytani Molekuláris Biológiai és Patobiokémiai Intézet, Budapest

Az ALR fehérje egy igazi misztikum. A fehérje egy hosszabb, 22 kDa-os és egy rövidebb, 15 kDa-os formában létezik. A hetvenes években részleges hepatectomián átesett állatokban fedezték fel és kizárólag a májregeneráció egyik kulcsfehérjéjének tartották. A 2000-es évek elején kiderült, hogy a „hosszú” forma a mitokondriális intermembrán terében lokalizálódik és kisméretű fehérjék mitokondriális importjának és oxidatív foldingjának kapcsolt folyamatában  vesz részt. A rendszer szubsztrátjai között több, alapvető mitokondriális folyamatokban nélkülözhetetlen fehérje megtalálható, ezért az ALR génjében bekövetkező mutációk mitokondriális rendellenességekhez vezethetnek. Az  ALR „rövid” formája az emlősök szervezetében szekretált extracelluláris növekedési faktorként funkcionál, és változatos módokon képes elősegíteni a hepatocyták védelmét, regenerációját és proliferációját. A közelmúltban előállított kondicionális ALR-mutáns egereken nyert eredmények arra utalnak, hogy fontos szerepet kaphat az alkoholos és nem alkoholos steatosis kialakulásában is. Tekintve, hogy számos, májat érintő elváltozás során megváltozik szérumszintje, ígéretes markermolekula-jelölt a laboratóriumi diagnosztikában. Orv. Hetil., 2015, 156(13), 503–509. Kulcsszavak: ALR, máj, oxidatív folding, mitokondrium, steatosis

ALR, the multifunctional protein ALR is a mystic protein. It has a so called “long” 22 kDa and a “short” 15 kDa forms. It has been described after partial hepatectomy and it has just been considered as a key protein of liver regeneration. At the beginning of the 21st century it has been revealed that the “long” form is localized in the mitochondrial intermembrane space and it is an element of the mitochondrial protein import and disulphide relay system. Several proteins of the substrates of the mitochondrial disulphide relay system are necessary for the proper function of the mitochondria, thus any mutation of the ALR gene leads to mitochondrial diseases. The “short” form of ALR functions as a secreted extracellular growth factor and it promotes the protection, regeneration and proliferation of hepatocytes. The results gained on the recently generated conditional ALR mutant mice suggest that ALR can play an important role in the pathogenesis of alcoholic and non-alcoholic steatosis. Since the serum level of ALR is modified in several liver diseases it can be a promising marker molecule in laboratory diagnostics. Keywords: ALR, liver, oxidative folding, mitochondria, steatosis Balogh, T., Szarka, A. [ALR, the multifunctional protein]. Orv. Hetil., 2015, 156(13), 503–509.

(Beérkezett: 2015. január 14.; elfogadva: 2015. február 12.)

Rövidítések ALR = augmenter of liver regeneration; ALT = alanin-aminotranszferáz; AP1 = aktivátor protein 1; ATP = adenozin-trifoszfát; EGF = epidermal growth factor; EGFR = epidermal growth factor receptor; ERK1/2 = extracellular signal-regulated kinase 1/2; ERV1/2 = essential for respiration and viability 1/2; GFER = growth factor ERV1 homolog; HGF = hepatocyte growth factor; HSS = hepatocyte stimulator substance; IL-1/6 = interleukin-1/6; IMS = mitokondriális intermembrán tér; DOI: 10.1556/OH.2015.30119

JAB1 = Jun-activating domain-binding protein 1; LPS = lipopoliszacharid; MAPK = mitogen-activated protein kinase; MIA40 = mitochondrial intermembrane space import and assembly protein 40; NF-κB = nuclear factor kappa-light-chainenhancer of activated B cells; NK-sejt = természetes ölősejt; TGF-α/β = transforming growth factor-α/β; TIM = translocase of the inner membrane; TNF-α = tumor necrosis factor-α; TOM = translocase of the outer membrane 503

2015

■

156. évfolyam, 13. szám

■

503–509.

Ö S S ZEFOGLA LÓ K ÖZLEM ÉN Y

A máj regenerációja egészen lenyűgöző jelenség, amelynek mechanizmusa az orvostudomány kezdete óta foglalkoztatja a kutatókat. Jóllehet, már az ókori görögök is tudatában voltak a szerv csodával határos megújulási képességének; gondoljunk csak Prométheuszra, aki a mítosz szerint ellopta Zeusztól a tüzet és a halandóknak adta, ezért büntetésül arra ítélték, hogy máját az örökkévalóságig egy sas marcangolja, míg az újra és újra viszszanő. Az első tudományos bizonyítékot Higgins és Anderson szolgáltatták állatkísérletükkel, amelyben patkányokon részleges hepatectomiát végeztek, majd a májszövet visszaépülését figyelték meg [1]. Azóta a rágcsálókon végzett részleges hepatectomiát követő májregeneráció a sejt-, szerv- és szövetregeneráció egyik leggyakrabban tanulmányozott modelljévé vált [2]. A kitartó kutatások eredményeként mára számtalan, a folyamatban szerepet játszó növekedési faktor, inhibitor és szignálútvonal vált ismertté [2].

log) is nevezni [14]. A két fehérje nem csak szerkezeti hasonlóságot mutat, azok funkcionálisan is helyettesíthetők egymással [18]. Bár a kezdeti kutatások az ERV1 és az ALR molekula tömegét rendre 14, illetve 15 kDa-ra tették [10, 14], később megfejtették, hogy mind az ALR, mind az ERV1 tartalmazhat egy járulékos N-terminális szekvenciát, amely a mitokondriális importszignál szekvenciáját foglalja magába; ezzel együtt mindkét fehérje molekulatömege 22 kDa-ra tehető [11]. Az ALR „rövid” (15 kDa; 125 AA) és „hosszú” (22 kDa; 198 vagy 205 AA) formája alternatív splicing termékként keletkezik, és nemcsak méretében, hanem funkciójában is eltér egymástól. A „rövid” ALR az emlősökben extracelluláris növekedési faktorként funkcionál [19], amely különböző specifikus sejtfelszíni receptorokkal képes kapcsolódni [20]. A „hosszú” forma viszont – az élesztőhomológ ERV1-hez hasonlóan – a mitokondriális intermembrán terében lokalizálódik, és az oxidatív fehérje folding folyamatában nélkülözhetetlen diszulfid-cserereakciókban vesz részt [21, 22]. Később élesztőből az ERV1/ALR család egy újabb tagját azonosították, az ERV2 fehérjét, amely 30%-os homológiát mutat az ERV1-gyel. Az ERV2 is szulfhidriloxidáz-aktivitással bír, viszont az ERV1-gyel ellentétben nem a mitokondriumban, hanem az endoplasmás reticulumban lokalizálódik [23]. Másik lényeges különbség a két fehérje között, hogy míg az ERV1 mind monomer, mind dimer formában jelen lehet [12], addig az ERV2 N-terminálisáról hiányoznak azok a ciszteinegységek, amelyek lehetővé tennék a dimerizálódását. Ez azért is meglepő, mert a feltételezések szerint az ERV1 dimerizációja szükséges a fehérje in vivo aktivitásához [12]. Az élesztőhomológok mellett fontos megjegyezni, hogy a humán ALR mintegy 90%-ban homológ a rágcsálókban jelen lévő formával, amelyek közül a patkány és egér ALR nukleotidszekvenciája 96, míg aminosavszekvenciája 90%-os homológiát mutat egymással [11]. Ebből következik, hogy a rágcsálókon végzett kísérletek rendkívül jó modellként szolgálhatnak az ALR humán szervezetben betöltött funkcióinak tanulmányozásában. Az ERV1 lokalizációja főként a mitokondrium intermembrán terére korlátozódik, ezzel szemben az ALR az említett szubkompartimentumon kívül megtalálható még a citoszolban és a nucleusban is [24]. Másik lényeges különbség a két fehérje között, hogy míg az ERV1 kizárólag intracellulárisan van jelen [12], addig patkányban a hepatocyták konstitutív ALR-szekrécióját figyelték meg, így az a szérumban is detektálható [24]. Egéren és patkányon végzett kísérletekből tudjuk, hogy az ALR génje számos szövetben kifejeződik: az ALR expresszióját leírták a szívben, az agyban, a lépben, a tüdőben, a vázizmokban, a vesében, a májban és a herékben is [10, 11]. E szervek közül a herékben és a májban figyelhető meg a legintenzívebb ALR-expresszió [10, 11]. A humán ALR expresszióját pedig leírták már veseadenocarcinomában, cisztás vesetubulus-epitheliumban, az agyban és a vázizomzatban is [15, 25].

Az ALR felfedezése LaBresque és Pesch 1975-ben regenerálódó patkánymájból izoláltak egy fehérjefrakciót, amellyel képesek voltak stimulálni hepatectomián átesett patkányok májregenerációját [3]. A fehérjeizolátumot HSS-nek (hepatocyte stimulator substance) nevezték el, és úgy találták, hogy specifikusan stimulálja a hepatocyták proliferációját, illetve segíti a máj regenerációját szervspecifikus, de nem fajspecifikus módon [3, 4]. A következő években különböző kutatócsoportok több másik állatfaj (kutya, sertés, nyúl) regenerálódó májából mutattak ki hasonló hepatocytastimuláló aktivitást [5, 6, 7]. Francavilla és munkatársai a nyers HSS-extraktum további tisztításával egy  hozzávetőlegesen 30 kDa tömegű növekedési faktort izoláltak, amelyet ALR-nek (augmenter of liver regeneration) neveztek el [8, 9]. A fehérjét szekvenálták, génjét klónozták patkányban, egérben és emberben is [10, 11]. Eredményeik szerint az ALR gén egy 22 kDa tömegű fehérjét kódolt, amely hasonló aktivitással bírt a korábbi kísérletekben leírt ALR-frakciókkal.

Az ERV1/ALR fehérjecsalád Az ALR az ERV1/ALR fehérjecsalád tagja, amely kis molekulatömegű szulfhidril-oxidáz-aktivitású fehérjéket foglal magába [12]. A család elsőként felfedezett és legjobban karakterizált tagja az élesztőeredetű scERV1 (Saccharomyces cerevisiae, essential for respiration and viability 1), amelynek génjét az alacsonyabb és magasabb rendű eukaryoták számos képviselőjében kimutatták [10, 11, 13, 14, 15], sőt néhány kettős szálú DNS-sel rendelkező vírus genomjában is azonosították [16]. Az ERV1 nélkülözhetetlen az élesztő életben maradásához és a funkcióképes mitokondriumok biogeneziséhez [14, 17]. A humán ALR fehérje megközelítőleg 40%-os homológiát mutat az élesztőből izolált ERV1-gyel, ezért az ALR-t szokás GFER-nek (growth factor ERV1 homo2015 ■ 156. évfolyam, 13. szám

504

ORVOSI HETILAP

Ö S S ZEFOGLA LÓ K ÖZLEM ÉN Y

zési oxigénnek átadni (1. ábra). Az ALR tehát a mitokondriális oxidatív folding folyamatát a légzési elektrontranszferlánchoz kapcsolja, ezzel megnöveli az oxidáció hatékonyságát és elkerüli a reaktív hidrogén-peroxid keletkezését [22, 30] (1. ábra). Az ALR egy másik, oxidatív foldingtól független enzimes funkciója, hogy több más mitokondriális fehérjével együtt részt vesz egyes proteinek Fe/S klasztereinek érési folyamataiban. A funkció betöltéséhez az egész ERV1/ ALR szekvencia – beleértve a kevésbé konzervált Nterminálist is – szükséges [31]. Érdekesség, hogy az ERV1 és az ALR kizárólag citoszolikus Fe/S fehérjék érését indukálja, mitokondriális fehérjékét nem [31]. Az ALR mitokondriális oxidatív foldingban betöltött szerepét mi sem mutatja jobban, mint hogy néhány évvel ezelőtt egy marokkói család három, rendkívül súlyos patológiás elváltozásokkal élő gyermekében az ALR gén „missense” mutációját mutatták ki [30]. A mutáció csecsemőkori mitokondriális rendellenességet okozott, amely progresszív myopathiával és részben kombinált respirációslánc-deficientiával, veleszületett cataractával, szenzorineurális hallásvesztéssel, valamint fejlődési rendellenességgel társult. Mitokondriális szinten a mutáció hatására az I, II és IV respirációs komplex aktivitásának csökkenését, a ciszteinben gazdag fehérjék alacsonyabb szintjét, abnormális mitokondriális morfológiát (megnagyobbodott IMS) és a mitokondriális DNS-deletiók akkumulációjának felgyorsulását figyelték meg [30]. A felfedezés nem annyira meglepő, ha figyelembe vesszük, hogy az ALR nagyszámú, mitokondriális funkciókban

Az ALR enzimes funkciói és annak patológiás vonatkozásai Az ERV1/ALR proteincsalád tagjai a szulfhidril-oxidázaktivitású flavoproteinek közé tartoznak, és a diszulfidkötések kialakításában vesznek részt [12]. A fehérjék C-terminálisa hordozza az aktivitáshoz szükséges szekvenciát, így az ALR-nek mind a „rövid”, mind a „hoszszú” formája képes betölteni ezt az enzimes funkciót [26]. Mindkét fehérje (ERV1, ALR) kisméretű proteinek MIA40-függő mitokondriális importjának és oxidatív foldingjának kapcsolt folyamatában vesz részt az intermembrán térben (IMS) [22]. A folyamat során az oxidoreduktáz aktivitású MIA40 a TOM-komplexeken keresztül IMS-be importálódó fehérjék egy speciális csoportjának szerkezetében a szabad ciszteintiolok oxidálásával diszulfidhidakat hoz létre, így hozzájárul azok harmadlagos szerkezetének kialakulásához (1. ábra). A  célfehérjék oxidálásával azonban a MIA40 redukálódik, így annak újbóli oxidációja szükséges, hogy visszanyerje funkcióképességét. Az ALR tulajdonképpen ezért a reoxidációért felel a folyamatban [12, 21], amelynek során elektronokat közvetít a MIA40-ről a folyamat végső elektronakceptora felé (1. ábra). A szulfhidriloxidázok általában molekuláris oxigént használnak fel elektronakceptornak, és a folyamat közben hidrogénperoxid keletkezik [27] (1. ábra). Az ERV1 és az ALR azonban citokróm c reduktáz aktivitásuk révén [28, 29] képesek az oxidatív folding során felvett elektronokat a citokróm c és a citokróm c oxidáz közvetítésével a lég-

1. ábra

Az ALR fehérje szerepe a mitokondriális oxidatív folding folyamatában

ORVOSI HETILAP

505

2015 ■ 156. évfolyam, 13. szám

Ö S S ZEFOGLA LÓ K ÖZLEM ÉN Y

nélkülözhetetlen fehérje MIA40-dependens importjában és oxidatív foldingjában vesz részt. Ezek között megtalálható több, a citokróm-c oxidáz biogenezisében releváns fehérje, illetve a TIM (translocase of the inner membrane) fehérjék teljes családja [32]. A rendszer sérülésével tehát nagy valószínűséggel elégtelenné válik a IV-es respirációs komplex felépítésében és egy sor, eddig ismeretlen mitokondriális folyamatban szerepet játszó fehérje IMS-be, illetve mátrixba irányuló transzportja [30]. A mitokondriális rendellenességek pedig tipikusan a nagy energia- (ATP-) igényű szöveteket, az idegrendszert és a vázizomzatot érintő tünetekkel manifesztálódnak [33].

segíti a c-Jun fehérje foszforilációját. A JAB1-mediált foszforiláció pedig lehetővé teszi a c-Jun/AP1 (activator protein 1) fehérjekomplex létrejöttét, amely transzkripciós faktorként funkcionál a sejtekben [41]. Az ALR és a JAB1 közötti kölcsönhatás kialakulásához az ALR Cterminális doménjén lokalizálódó konzervált CXXC motívum megléte feltétlenül szükséges [19], ez a felfedezés viszont azt sugallja, hogy a folyamat esetleg az ALR enzimes redox funkciójához köthető. Az ALR és a JAB1 fehérje kapcsolata azonban jó eséllyel nem májspecifikus. Teng és munkatársai ugyanis megfigyelték, hogy haemopoeticus őssejtekben az ALR gén kiütése a ciklinfüggő kinázinhibitor p27(kip) emelkedett JAB1 általi gátlásához vezet, míg az ALR túltermelése az inhibíció csökkenését okozza, valószínűleg a JAB1 fehérje ALR-hez való kötődése miatt [42, 43]. Az eddigieken kívül az ALR közvetett módon, az immunrendszer egyes elemeinek szabályozásával is támogatja a hepatocyták védelmét és regenerációját. Az ALR több más növekedési faktorhoz hasonlóan képes az NK (natural killer) sejtek gátlására [44], ami azért fontos, mert az egészséges májsejtekkel ellentétben a regenerálódó májsejtek rendkívül érzékenyek az NK-sejtek sejtkárosító hatásával szemben [45]. Azt is megfigyelték, hogy a szérum-ALR-szint negatívan korrelál a perifériás NK-sejt-aktivitással [44]. Patkánymodellben leírták, hogy az extracelluláris ALR hatással van a máj Kupffersejtjeire is, ugyanis azokon G-fehérje-kapcsolt ALR-receptorokat fedeztek fel [20]. A receptorok stimulálásával TNF-α-, IL-6- és nitrogén-monoxid- (NO) felszabadulást figyeltek meg [20], amely mediátorok akut gyulladásban és májregenerációban egyaránt fontos szerepet játszanak [46]. A megfigyelések szerint az ALR okozta TNF-α-, IL-6- és NO-indukció felülmúlta az endotoxinnal (lipopoliszacharid – LPS) kiváltható stimuláció mértékét is [20].

Az ALR szerepe a májregenerációban Figyelembe véve a már említett korai kísérleti eredményeket [3, 5], megalapozottnak tűnik az a következtetés, hogy az ALR komoly szerepet játszik a hepatocyták regenerálódásában. Érdekes módon patkányhepatocyták esetében az ALR „hosszú” (22 kDa) formája képtelen volt a DNS-szintézis stimulálására, és specifikus receptorait sem sikerült azonosítani a sejteken [20, 24]. Ezzel szemben úgy tűnik, hogy az ALR már említett szekretált formája központi szerepet játszik a májregenerációban. Wang és munkatársai a „rövid” formájú (15 kDa) humán rekombináns rhALR magas affinitású receptorait fedezték fel mind patkány-, mind humán hepatocytákon [34]. Az ALR receptorához történő kötése az EGFR foszforilációját váltja ki, amely ezután a MAPK (mitogen-activated protein kinase) jelátviteli kaszkád aktiválódását okozza, amely fontos szerepet tölt be a sejtnövekedés szabályozásában [35]. Ezenkívül az ALR az EGFR-től független módon, az ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinase 1/2) kinázok indukálásával is képes bekapcsolódni a MAPK-útvonalba [36]. Meglepő módon az rhALR nagyobb hatásfokkal képes stimulálni a hepatocyták DNS-szintézisét, mint az erős hepatocyta mitogénként számon tartott EGF vagy TGF-α [34]. Sőt, az rhALR által indukált DNS-szintézis mértéke összemérhető a leghatásosabb hepatocytamitogénként számon tartott HGF hatásával is [37]. Az ALR stimulálja mind az NF-κB [38], mind a c-Myc [37] transzkripciós faktorokat, másrészt fokozza a poliaminok szintézisét is [37], amely vegyületek fontos szerepet játszanak a növekedési faktor indukálta DNS-szintézisben [39] és a májregenerációban [40]. Mindemellett az ALR, sok más növekedési faktorhoz (HGF, EGF) és citokinhez (TNF-α, IL-6, IL-1) hasonlóan, képes gátolni a máj méregtelenítő funkciójában fontos szerepet játszó citokróm P450 enzimeket [38]. Ez a párhuzam is az ALR növekedési faktor mivoltát látszik erősíteni. Az ALR egy MAPK-tól független jelátviteli úton keresztül is támogatja a májregenerációt. A citoszolikus ALR képes kölcsönhatásba lépni a JAB1 (Jun-activating domain-binding protein 1) fehérjével, amely ezáltal elő2015 ■ 156. évfolyam, 13. szám

ALR és a mitokondriális diszfunkció Az ALR fehérje májélettanban betöltött szerepének tisztázása érdekében a közelmúltban ALR-hiányos (ALR null/null) mutáns egértörzs létrehozását kísérelte meg egy amerikai kutatócsoport. A kísérlet kudarccal zárult, az egérembriók az embriogenezis igen korai szakaszában elpusztultak, ami egyértelműen arra utal, hogy az ALR igen fontos szerepet tölt be az embrionális fejlődésben [47]. A problémát áthidalandó egy májspecifikus kondicionális ALR-mutáns (ALR-L-KO) egértörzs létrehozásával próbálkoztak. A születést követő hepaticus ALR-depléció jelentős mértékű steatosishoz, mitokondriális diszfunkcióhoz és a hepatocyták fokozott mértékű  apoptózisához vezetett 2 hét leforgása alatt. Ezt követően állandósult a fokozott mértékű sejthalál és -regeneráció, a gyulladás, majd kialakult a ductus proliferációja, végül a hepatocellularis carcinoma (több mint 70%-ban jelentkezett). Egy korábbi tanulmány szerint is 506

ORVOSI HETILAP

Ö S S ZEFOGLA LÓ K ÖZLEM ÉN Y

a 30–40%-os celluláris és mitokondriális ALR-depléció apoptotikus sejtpusztuláshoz vezetett [48]. Az ALR-depléció oxidatív stresszhez és mitokondriális károsodáshoz vezetett. A kéthetes ALR-L-KO állatok májsejtjei jóval alacsonyabb számú, abnormális alakú és károsodott DNS-tartalmú mitokondriumot tartalmaztak, illetve alacsonyabb respirációs aktivitást mutattak. Mindezek mellett a hepaticus ATP-szint is meglehetősen alacsony volt, minden bizonnyal az apoptózis ATPigénye és/vagy a mitokondriális diszfunkció miatt [47]. A kéthetes ALR-L-KO állatokból származó májak esetében megfigyelt jelentős mértékű trigliceridakkumuláció is betudható a mitokondriális károsodásnak és/vagy csökkent mértékű zsírsav-béta-oxidációnak [49]. Itt érdemes megjegyezni, hogy az ALR-L-KO egerek májában jelentős mértékben csökkent a zsírsavak mitokondriális β-oxidációhoz szállításának szabályozását végző karbamoil-palmitoil transzferáz expressziója és aktivitása. Az ALR-deficientia tehát erős negatív hatást gyakorol a β-oxidációra, ugyanakkor a zsírsav szintetázaktivitása változatlan, tehát a zsírsav-akkumuláció hátterében a csökkent mértékű lebontás és nem az emelkedett mértékű szintézis áll. Ezen a ponton érdemes megemlítenünk, hogy egy egyelőre nem túl nagy elemszámú vizsgálat során 48 különböző ALR-szekvencia-variánst találtak a vizsgált 100 humán minta esetében, ami felveti annak a lehetőségét, hogy néhány variáns talán megtalálható azon emberek esetében, akik hajlamosabbak az alkoholos és/vagy a nem alkoholos zsírmáj kialakulására [47]. A második hetet követően fokozatosan nőtt az ALR szintje, igaz, még így sem érte el a vad típus esetén tapasztalható szintet, mindenesetre a 4. hétre a hepaticus steatosis visszafejlődött és a 8. héten csak mindössze néhány sejt esetében lehetett lipidakkumulációt látni az ALR-L-KO egerek májában. Könnyen elképzelhető, hogy az ALR esetében létezik egy küszöbszint és ebben az esetben elérte azt, amely már elegendő a megfelelő mitokondriális és hepatocytaműködéshez. A steatosis visszafejlődése ellenére komoly gyulladásos válasz alakult  ki neutrofil infiltrációval és emelkedett proinflamatorikus citokinexpresszióval. Az a folyamatos gyulladás, hepatocytasejt-halál és -regeneráció megelőzte a dysplasiát és tumorfejlődést az ALR-L-KO egerekben [47]. Az ALR-mutáns állatokon nyert eredmények talán felhasználhatók az alkoholos és a nem alkoholos zsírmáj mechanizmusának megértéséhez, mivel mindkét betegség komoly mitokondriális diszfunkcióval jár együtt, illetve gyulladásba, fibrosisba/cirrhosisba és hepatocellularis carcinomába torkolhat [50].

Csökkent ALR-szintet mértek alkoholos és nem alkoholos zsírmájban szenvedőkben. Viszont meg kell jegyeznünk, hogy a korábbiakban ismertetett ALR-L-KO egerekben egy év elteltével, amikor a hepatocellularis carcinoma kialakult, az ALR szintje megegyezett a mutáns és a vad típusú egerekben [47]. Egy másik tanulmány emelkedett ALR-szintről számolt be cirrhosisban, hepatocellularis carcinomában és cholangiocarcinomában szenvedő betegekben [51], illetve hasonló ALRexpressziót lehetett megfigyelni HCV-s és egészséges májakban [47]. Ezek alapján azt sem lehet kizárni, hogy az emelkedett ALR-szint esetleg támogathatja neoplasztikus hepatocyták replikációját, túlélését. Emellett patkányokon végzett részleges hepatectomiát, illetve porta-cava sönt kialakítását követően szintén ALR-felszabadulást figyeltek meg a keringésben [24, 52, 53]. Az eredmények alapján megállapították, hogy a  szérum ALR-szintje a májkárosodások jó indikátora lehet. Ugyancsak patkányon végzett kísérletek szerint a szérum-ALR-szint gyorsabban reagál az LPS indukálta endotoxaemiára, mint a máj labordiagnosztikájában igen elterjedten alkalmazott alanin-aminotranszferáz (ALT), de mesterségesen létrehozott bakteriális szepszis esetében is a TNF-α-val és az IL-6-tal szinte megegyező időben detektálták szintemelkedését [53]. Egyelőre terápiás oldalon igencsak gyerekcipőben jár az ALR alkalmazása. Igaz, hogy az ALR a többi emelkedett szintű növekedési faktorral (HGF, TGF-α, TGF-β) együtt sem képes megakadályozni patkányban a portacava sönt okozta májatrófiát [52], egy korábbi kísérletben exogén ALR, HGF és TGF-α adagolásával sikerült megelőzni azt [13]. Az ALR génterápiás alkalmazásának lehetőségét is tesztelték már patkánymodellen [54], és biztató eredményeket értek el. Az ALR génterápia képes volt enyhíteni a CCl4-dal indukált májkárosodást és fibrinogenesist, méghozzá a mitokondriális diszfunkció és az oxidatív stressz tompítása, valamint a májcsillagsejtek aktivációjának gátlása révén [54].

Következtetések A folyamatos kutatásoknak köszönhetően egyre részletesebb képet kapunk az ALR májregenerációban betöltött igen összetett szerepéről, és a fehérje gyakorlati alkalmazásának lehetőségéről is újabb és újabb közlemények látnak napvilágot. Az ALR terápiás alkalmazását, ezek kisebb hányada vizsgálja. Patkánykísérletekben a fehérje külső forrásból történő adagolásával, illetve génterápiás alkalmazásával is biztató eredményeket értek el a  májkárosodások kezelésében. A terápiás célú kutatások  azonban még nagyon kezdeti stádiumban vannak. Ezzel szemben az ALR-nek mint biomarkernek a májbetegségek diagnosztikájában való alkalmazhatóságát már számos kísérletben igazolták. A szöveti ALR-expresszió növekedését megfigyelték már cirrhosisos, illetve különböző típusú májcarcinomában szenvedő páciensekben is. Patkányokon végzett kísérletek alapján megállapították,

Diagnosztikai és terápiás kísérletek Számos májbetegségben leírták már mind a szöveti, mind a szekretált ALR szintjének változását, amely segítséget nyújthat egyes betegségek diagnosztikájában, illetve az ALR-szint monitorozása hozzájárulhat ezen betegségek lefolyásának prognosztikájához. ORVOSI HETILAP

507

2015 ■ 156. évfolyam, 13. szám

Ö S S ZEFOGLA LÓ K ÖZLEM ÉN Y [9] Francavilla, A., Barone, M., Van Thiel, D. H., et al.: Further steps of hepatic stimulatory substance purification. Dig. Dis. Sci., 1991, 36(5), 674–680. [10] Hagiya, M., Francavilla, A., Polimeno, L., et al.: Cloning and sequence analysis of the rat augmenter of liver regeneration (ALR) gene: expression of biologically active recombinant ALR and demonstration of tissue distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1994, 91(17), 8142–8146. Erratum in Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1995, 92(7), 3076. [11] Giorda, R., Hagiya, M., Seki, T., et al.: Analysis of the structure and expression of the augmenter of liver regeneration (ALR) gene. Mol. Med., 1996, 2(1), 97–108. [12] Lee, J., Hofhaus, G., Lisowsky, T.: Erv1p from Saccharomyces cerevisiae is a FAD-linked sulfhydryl oxidase. FEBS Lett., 2000, 477(1–2), 62–66. [13] Francavilla, A., Hagiya, M., Porter, K. A., et al.: Augmenter of liver regeneration: its place in the universe of hepatic growth factors. Hepatology, 1994, 20(3), 747–757. [14] Lisowsky, T.: Dual function of a new nuclear gene for oxidative phosphorylation and vegetative growth in yeast. Mol. Gen. Genet., 1992, 232(1), 58–64. [15] Lisowsky, T., Weinstat-Saslow, D. L., Barton, N., et al.: A new human gene located in the PKD1 region of chromosome 16 is a  functional homologue to ERV1 of yeast. Genomics, 1995, 29(3), 690–697. [16] Senkevich, T. G., White, C. L., Koonin, E. V., et al.: A viral member of the ERV1⁄ALR protein family participates in a cytoplasmic pathway of disulfide bond formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97(22), 12068–12073. [17] Becher, D., Kricke, J., Stein, G., et al.: A mutant for the yeast scERV1 gene displays a new defect in mitochondrial morphology and distribution. Yeast, 1999, 15(12), 1171–1181. [18] Hofhaus, G., Stein, G., Polimeno, L., et al.: Highly divergent amino termini of the homologous human ALR and yeast scERV gene products define species specific differences in cellular localization. Eur. J. Cell Biol., 1999, 78(5), 349–356. [19] Chen, X., Li, Y., Wei, K., et al.: The potentiation role of hepatopoietin on activator protein-1 is dependent on its sulfhydryl oxidase activity. J. Biol. Chem., 2003, 278(49), 49022–49030. [20] Gandhi, C. R., Murase, N., Starzl, T. E.: Cholera toxin-sensitive GTP-binding protein-coupled activation of augmenter of liver regeneration (ALR) receptor and its function in rat Kupffer cells. J. Cell. Physiol., 2010, 222(2), 365–373. [21] Mesecke, N., Terziyska, N., Kozany, C., et al.: A disulfide relay system in the intermembrane space of mitochondria that mediates protein import. Cell, 2005, 121(7), 1059–1069. [22] Szarka, A., Bánhegyi, G.: Oxidative folding: recent developments. BioMol Concepts, 2011, 2(5), 379–390. [23] Stein, G., Lisowsky, T.: Functional comparison of the yeast scERV1 and scERV2 genes. Yeast, 1998, 14(2), 171–180. [24] Gandhi, C. R., Kuddus, R., Subbotin, V. M., et al.: A fresh look at augmenter of liver regeneration in rats. Hepatology, 1999, 29(5), 1435–1445. [25] Polimeno, L., Pesetti, B., Giorgio, F., et al.: Expression and localization of augmenter of liver regeneration in human muscle tissue. Int. J. Exp. Path., 2009, 90(4), 423–430. [26] Gandhi, C. R.: Augmenter of liver regeneration. Fibrogenesis Tissue Repair, 2012, 5, 10. [27] Coppock, D. L., Thorpe, C.: Multidomain flavin-dependent sulfhydryl oxidases. Antioxid. Redox Signal., 2006, 8(3–4), 300–311. [28] Allen, S., Balabanidou, V., Sideris, D. P., et al.: Erv1 mediates the Mia40-dependent protein import pathway and provides a functional link to the respiratory chain by shuttling electrons to cytochrome c. J. Mol. Biol., 2005, 353(5), 937–944. [29] Farrell, S. R., Thorpe, C.: Augmenter of liver regeneration: a flavin-dependent sulfhydryl oxidase with cytochrome c reductase activity. Biochemistry, 2005, 44(5), 1532–1541.

hogy szepszis esetében a szérum-ALR-szint a TNF-α és az IL-6 gyulladási citokinekkel megegyező időben emelkedett meg, indukált endotoxaemiára pedig gyorsabban  reagált, mint a máj labordiagnosztikájában elterjedten alkalmazott alanin-aminotranszferáz (ALT). Ezek a kísérleti eredmények megalapozzák a szérum-ALR biomarkerként történő alkalmazásának létjogosultságát, ezért a továbbiakban mindenképpen ajánlott alkalmazhatóságát humán páciensek esetében is vizsgálni. Ha  pedig humán esetben is hasonló teljesítményt mutat, érdemes fontolóra venni a szérum-ALR-szint meghatározásának rutin-májdiagnosztikába történő bevezetését is.

Anyagi támogatás: A kézirat megírása anyagi támogatásban nem részesült. Szerzői munkamegosztás: B. T.: Bevezetés, Az ALR felfedezése, Az ERV1/ALR fehérjecsalád, Az ALR szerepe a májregenerációban, Diagnosztikai és terápiás kísérletek  fejezetek összeállítása. Sz. A.: A kézirat ötlete, felépítése, absztrakt, Az ALR enzimes funkciói és annak patológiás vonatkozásai, ALR és a mitokondriális diszfunkció, Következtetések fejezetek elkészítése. A kézirat végleges változatát a szerzők elolvasták és jóváhagyták. Érdekeltségek: A szerzőknek nincsenek érdekeltségeik.

Köszönetnyilvánítás A szerzők ezúton szeretnének köszönetet mondani Lőrincz Tamásnak az ábra elkészítésében nyújtott segítségéért.

Irodalom [1] Higgins, G. M., Anderson, R. M.: Experimental pathology of the liver. I. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch. Pathol., 1931, 12, 186–202. [2] Michalopoulos, G. K.: Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. Am. J. Pathol., 2010, 176(1), 2–13. [3] LaBrecque, D. R., Pesch, L. A.: Preparation and partial characterization of hepatic regenerative stimulator substance (SS) from rat liver. J. Physiol., 1975, 248(2), 273–284. [4] LaBrecque, D. R.: Hepatic stimulator substance. Discovery, characteristics and mechanism of action. Dig. Dis. Sci., 1991, 36(5), 669–673. [5] Starzl, T. E., Jones, A. F., Terblanche, J., et al.: Growth-stimulating factor in regenerating canine liver. Lancet, 1979, 1(8108), 127–130. [6] Van Hoorn-Hickman, R., Kahn, D., Green, J., et al.: Is there a regeneration stimulator substance in the effluent from perfused partially hepatectomized livers? Hepatology, 1981, 1(4), 287– 293. [7] Fleig, W. E., Lehmann, H., Wagner, H., et al.: Hepatic regenerative stimulator substance in the rabbit. Relation to liver regeneration after partial hepatectomy. J. Hepatol., 1986, 3(1), 19–26. [8] Francavilla, A., Ove, P., Polimeno, L., et al.: Extraction and partial purification of hepatic stimulatory substance in rats, mice and dogs. Cancer Res., 1987, 47(21), 5600–5605. 2015 ■ 156. évfolyam, 13. szám

508

ORVOSI HETILAP

Ö S S ZEFOGLA LÓ K ÖZLEM ÉN Y [30] Di Fonzo, A., Ronchi, D., Lodi, T., et al.: The mitochondrial disulfide relay system protein GFER is mutated in autosomal-recessive myopathy with cataract and combined respiratory-chain deficiency. Am. J. Hum. Genet., 2009, 84(5), 594–604. [31] Lange, H., Lisowsky, T., Gerber, J., et al.: An essential function of the mitochondrial sulfhydryl oxidase Erv1p/ALR in the maturation of cytosolic Fe/S proteins. EMBO Rep., 2001, 2(8), 715– 720. [32] Sideris, D. P., Tokatlidis, K.: Oxidative protein folding in the mitochondrial intermembrane space. Antioxid. Redox Signal., 2010, 13(8), 1189–1204. [33] DiMauro, S., Schon, E. A.: Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu. Rev. Neurosci., 2008, 31, 91–123. [34] Wang, G., Yang, X., Zhang, Y., et al.: Identification and characterization of receptor for mammalian hepatopoietin that is homologous to yeast ERV1. J. Biol. Chem., 1999, 274(17), 11469–11472. [35] Li, Y., Li, M., Xing, G., et al.: Stimulation of the mitogen-activated protein kinase cascade and tyrosine phosphorylation of the epidermal growth factor receptor by hepatopoietin. J. Biol. Chem., 2000, 275(48), 37443–37447. [36] Ilowski, M., Putz, C., Weiss, T. S., et al.: Augmenter of liver regeneration causes different kinetics of ERK1/2 and Akt/PKB phosphorylation than EGF and induces hepatocyte proliferation in an  EGF receptor independent and liver specific manner. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2010, 394(4), 915–920. [37] Dayoub, R., Thasler, W. E., Bosserhoff, A. K., et al.: Regulation of polyamine synthesis in human hepatocytes by hepatotrophic factor augmenter of liver regeneration. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, 345(1), 181–187. [38] Thasler, W. E., Dayoub, R., Mühlbauer, M., et al.: Repression of cytochrome P450 activity in human hepatocytes in vitro by a novel hepatotrophic factor, augmenter of liver regeneration. J. Pharmacol. Exp. Ther., 2006, 316(2), 822–829. [39] Higaki, I., Matsui-Yuasa, I., Hirohashi, K., et al.: The role of polyamines in growth factor induced DNA synthesis in cultured rat hepatocytes. Hepatogastroenterology, 1999, 46(27), 1874– 1879. [40] Luk, G. D.: Essential role of polyamine metabolism in hepatic regeneration. Inhibition of deoxyribonucleic acid and protein synthesis and tissue regeneration by difluoromethylornithine in the rat. Gastroenterology, 1986, 90(5 Pt 1), 1261–1267. [41] Lu, J., Xu, W. X., Zhan, Y. Q., et al.: Identification and characterization of a novel isoform of hepatopoietin. World J. Gastroenterol., 2002, 8(2), 353–356. [42] Teng, E. C., Todd, L. R., Ribar, T. J., et al.: Gfer inhibits Jab1mediated degradation of p27kip1 to restrict proliferation of hematopoietic stem cells. Mol. Biol. Cell, 2011, 22(8), 1312–1320.

[43] Fischer, M., Riemer, J.: The mitochondrial disulfide relay system: roles in oxidative protein folding and beyond. Int. J. Cell Biol., 2013, 2013, 742923. [44] Tanigawa, K., Sakaida, I., Masuhara, M., et al.: Augmenter of liver regeneration (ALR) may promote liver regeneration by reducing natural killer (NK) cell activity in human liver diseases. J. Gastroenterol., 2000, 35(2), 112–119. [45] Vujanovic, N. L., Polimeno, L., Azzarone, A., et al.: Changes of liver-resident NK cells during liver regeneration in rats. J. Immunol., 1995, 154(12), 6324–6338. [46] Michalopoulos, G. K.: Liver regeneration. J. Cell. Physiol., 2007, 213(2), 286–300. [47] Gandhi, C. R., Chaillet, J. R., Nalesnik, M. A., et al.: Liver-specific deletion of augmenter of liver regeneration accelerates development of steatohepatitis and hepatocellular carcinoma in mice. Gastroenterology, 2015, 148(2), 379–391.e4. [48] Thirunavukkarasu, C., Wang, L. F., Harvey, S. A., et al.: Augmenter of liver regeneration: an important intracellular survival factor for hepatocytes. J. Hepatology, 2008, 48(4), 578–588. [49] Fromenty, B., Pessayre, D.: Inhibition of mitochondrial beta-oxidation as a mechanism of hepatotoxicity. Pharmacol. Ther., 1995, 67(1), 101–154. [50] Brunt, E. M.: Nonalcoholic steatohepatitis. Semin. Liver Dis., 2004, 24(1), 3–20. [51] Thasler, W. E., Schlott, T., Thelen, P., et al.: Expression of augmenter of liver regeneration (ALR) in human liver cirrhosis and carcinoma. Histopathology, 2005, 47(1), 57–66. [52] Gandhi, C. R., Murase, N., Subbotin, V. M., et al.: Portacaval shunt causes apoptosis and liver atrophy rats despite increases in endogenous levels of major hepatic growth factors. J. Hepatol., 2002, 37(3), 340–348. [53] Vodovotz, Y., Prelich, J., Lagoa, C., et al.: Augmenter of liver regeneration (ALR) is a novel biomarker of hepatocellular stress/ inflammation: in vitro, in vivo, and in silico studies. Mol. Med., 2013, 18, 1421–1429. [54] Song, M., Yi, X., Chen, W., et al.: Augmenter of liver regeneration (ALR) gene therapy attenuates CCl4-induced liver injury and fibrosis in rats. Biochem. Bophys. Res. Commun., 2011, 415(1), 152–156.

(Szarka András dr., Budapest, Pf. 260, 1444 e-mail: [email protected])

ELADÓ PRAXIS Nyugdíjba vonulás miatt, Veszprém belvárosában, felnőtt háziorvosi körzet praxisjoga 2015-ben eladó. Érdeklődni: +36-30-526-1990

ORVOSI HETILAP

509

2015 ■ 156. évfolyam, 13. szám