EGY AGYI SZERIN PROTEÁZ, A HUMÁN TRIPSZIN 4 FUNKCIONÁLIS VIZSGÁLATA A humán tripszinogén 4 transzkripciójának vizsgálata valamint az enzim aktivációja és működése során bekövetkező szerkezeti átrendeződések gyorskinetikai és termodinamikai elemzése Doktori (PhD) értekezés Tóth Júlia
Biológia Doktori Iskola Iskolavezető: Prof. Erdei Anna, tanszékvezető egyetemi tanár Szerkezeti Biokémia Doktori Program Programvezető: Prof. Gráf László, tanszékvezető egyetemi tanár Témavezetők Dr. Szilágyi László, egyetemi docens Dr. Málnási-Csizmadia András, tudományos főmunkatárs
Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar, Biológiai Intézet, Biokémiai Tanszék Budapest, 2006
TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK........................................................................................................................... 3 RÖVIDÍTÉSEK ......................................................................................................................................... 5 1. BEVEZETÉS.......................................................................................................................................... 6 1.1 SZERIN PROTEÁZOK CSOPORTOSÍTÁSA, MEGHATÁROZÁSA................................................................. 6 1.2 AZ S1 CSALÁDBA TARTOZÓ SZERIN PROTEÁZOK TÉRSZERKEZETE ..................................................... 8 1.3 A KATALITIKUS TRIÁD ....................................................................................................................... 9 1.4 AZ OXIANION LYUK.......................................................................................................................... 10 1.5 A KATALITIKUS MECHANIZMUS ....................................................................................................... 11 1.6 BIZONYÍTÉKOK A KATALITIKUS MECHANIZMUS ÉRVÉNYESSÉGÉRE ................................................. 13 1.7 A SZUBSZTRÁTFELISMERŐ-HELY ÉS A SZUBSZTRÁTSPECIFICITÁST MEGHATÁROZÓ TÉNYEZŐK ....... 14 1.7.1 Az S1 hely ................................................................................................................................ 14 1.7.2 A polipeptidkötő hely............................................................................................................... 15 1.7.3 Az S2-Sn helyek ....................................................................................................................... 15 1.7.4 Az S1’-S3’ helyek..................................................................................................................... 16 1.8 A SZERIN PROTEÁZOK AKTIVÁCIÓJA ................................................................................................ 16 1.9 A HUMÁN TRIPSZIN 4 IRODALMI ÁTTEKINTÉSE ................................................................................. 19 1.9.1 A humán tripszinogén 4 felfedezése......................................................................................... 19 1.9.2 A PRSS3 gén genomi elhelyezkedése és szerkezete ................................................................. 19 1.9.3 A humán tripszinogén 4 mRNS alternatív variánsai................................................................ 20 1.9.4 A humán tripszinogén 4 izoformáinak N-terminális szekvenciája........................................... 21 1.9.5 Transzláció iniciáció nem-AUG kodonokról........................................................................... 23 1.9.6 A humán tripszinogén 4 izoformáinak transzkripciója............................................................ 24 1.9.7 A humán tripszinogén 4 izoformáinak expressziója ................................................................ 25 1.9.8 A humán tripszin 4 általános jellemzői.................................................................................... 26 1.9.9 A humán tripszin 4 térszerkezete ............................................................................................. 27 1.9.10 A humán tripszin 4 inhibitor rezisztenciája........................................................................... 27 1.9.11 A humán tripszin 4 szubsztrátspecificitása............................................................................ 29 1.9.12 Az Arg193 szerepe................................................................................................................. 31 1.9.13 Tripszin inhibitorok hasítása................................................................................................. 33 1.9.14 A humán tripszinogén 4 aktivációja ...................................................................................... 34 1.9.15 A humán tripszin 4 lehetséges funkciói.................................................................................. 34 1.9.15.1 A humán tripszin 4 potenciális fiziológiás és patológiás szerepe a hasnyálmirigyben................... 34 1.9.15.2 A humán tripszin 4 potenciális fiziológiás és patológiás szerepe extrapankreatikus szövetekben . 35
2. CÉLKITŰZÉSEK................................................................................................................................ 37 3. AZ ALKALMAZOTT MÓDSZEREK ELMÉLETI HÁTTERE.................................................... 38 3.1 5’ RACE PCR.................................................................................................................................. 38 3.2 A TRADICIONÁLIS ÉS A REAL-TIME KVANTITATÍV PCR ÖSSZEHASONLÍTÁSA ................................... 40 3.3 STEADY STATE ÉS TRANZIENS (PRE-STEADY STATE) KINETIKA ÖSSZEHASONLÍTÁSA ........................ 42 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK.......................................................................................................... 44 4.1 5’ RACE PCR.................................................................................................................................. 44 4.2 REAL-TIME KVANTITATÍV PCR ........................................................................................................ 45 4.2.1 Totál RNS izolálása agyszövetből ........................................................................................... 45 4.2.2 cDNS szintézis ......................................................................................................................... 45 4.2.3 Külső standardok előállítása................................................................................................... 46 4.2.4 Primer tervezés........................................................................................................................ 47 4.2.5 Real-time kvantitatív PCR ....................................................................................................... 47 4.3 A HUMÁN TRIPSZINOGÉN 4 A ÉS B IZOFORMÁJÁNAK KLÓNOZÁSA ÉS EXPRESSZIÓJA ....................... 48 4.4 A HUMÁN TRIPSZINOGÉN 4 MUTÁNSOK ELŐÁLLÍTÁSA ..................................................................... 50 4.5 A REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK ELŐÁLLÍTÁSÁHOZ HASZNÁLT PET E. COLI EXPRESSZIÓS RENDSZER MŰKÖDÉSE ............................................................................................................................................. 51 4.6 A REKOMBINÁNS HUMÁN TRIPSZINOGÉN 4 IZOFORMÁK ÉS MUTÁNSOK EXPRESSZIÓJA, A FEHÉRJÉK TISZTÍTÁSA ÉS AKTIVÁLÁSA ................................................................................................................... 52 4.7 MEMBRÁNKÖTÉSI KÍSÉRLETEK ........................................................................................................ 53 4.8 STEADY STATE KINETIKAI MÉRÉSEK: A KCAT ÉS A KM MEGHATÁROZÁSA .......................................... 55
3
4.9 TRANZIENS KINETIKAI MÉRÉSEK ...................................................................................................... 56 4.9.1 Gyorskinetikai mérések 4-metilumbelliferil 4-guanidinobenzoát szubsztráton ....................... 56 4.9.2 A 4-metilumbelliferil 4-guanidinobenzoát reakciók kinetikai és termodinamikai elemzése .... 57 4.9.3 pH-ugrásos stopped flow mérések ........................................................................................... 58 4.9.4 Hőugrásos stopped flow pH-ugrás mérések ............................................................................ 58 4.9.5 A sebességi állandók relatív külső viszkozitástól való függésének meghatározása ................. 59 4.9.6 A pH-ugrásos mérések kinetikai és termodinamikai analízise................................................. 59 5. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTELMEZÉSÜK .......................................................................................... 62 5.1 A HUMÁN TRIPSZINOGÉN 4 MRNS 5’ VÉGI SZEKVENCIÁJÁNAK MEGHATÁROZÁSA 5’ RACE PCR-REL ............................................................................................................................................................... 62 5.2 A HUMÁN TRIPSZINOGÉN 4 A, B, ILLETVE REKC IZOFORMA MEMBRÁNKÖTŐ KÉPESSÉGÉNEK VIZSGÁLATA........................................................................................................................................... 67 5.3 A HUMÁN TRIPSZINOGÉN 4 MRNS MENNYISÉGI MÉRÉSE REAL-TIME KVANTITATÍV PCR-REL ......... 70 5.3.1 Real-time kvantitatív PCR reakció körülményeinek optimalizálása........................................ 70 5.3.2 A Ct értékek mRNS mennyiségre való konvertálása és a kalibrálóegyenesek meghatározása 72 5.3.3 A real-time PCR reakciók specificitása ................................................................................... 75 5.3.4 A humán tripszinogén 4 mRNS relatív mennyiségének eloszlása az agyban ........................... 76 5.4 A VAD TÍPUSÚ ÉS AZ R193G MUTÁNS HUMÁN TRIPSZIN 4 ÉS A 4-METILUMBELLIFERIL 4-GUANIDINOBENZOÁT SZUBSZTRÁT ANALÓG REAKCIÓJÁNAK KINETIKAI ÉS TERMODINAMIKAI ELEMZÉSE .............................................................................................................................................. 79 5.4.1. Az időgörbék lefutása ............................................................................................................. 79 5.4.2 A megfigyelt sebességi állandók szubsztrátkoncentráció-függése ........................................... 82 5.4.3 A reakció leírására felállított modell és annak validálása ...................................................... 83 5.4.4 Az elemi reakciólépések sebességi állandóinak származtatása ............................................... 85 5.4.5 A vad típusú és az R193G mutáns humán tripszin 4 katalitikus ciklusának összehasonlítása. 87 5.4.6 A második és harmadik reakciólépés termodinamikai paraméterei ........................................ 88 5.4.7 A vad típusú és R193G mutáns humán tripszin 4 MUGB szubsztráton mért kinetikai és termodinamikai paramétereinek értelmezése ................................................................................... 92 5.4.7.1 Az egyedi reakciólépések szeparálását lehetővé tevő szerkezeti okok ............................................. 92 5.4.7.2 A tranziens kinetikai adatok alapján felállított finomított modell..................................................... 92 5.4.7.3 A G193R mutáció hatása az egyes reakciólépések sebességére ....................................................... 94 5.4.7.4 A G193R mutáció hatása az első tetraéderes intermedier kialakulásának termodinamikájára.......... 95
5.5 A PH-UGRÁSSAL KIVÁLTOTT AKTIVÁCIÓ SORÁN BEKÖVETKEZŐ KONFORMÁCIÓVÁLTOZÁS GYORSKINETIKAI VIZSGÁLATA ÉS TERMODINAMIKÁJÁNAK ELEMZÉSE................................................... 97 5.5.1 A vad típusú és 193-as pozícióban mutáns humán tripszin 4 variánsok steady state aktivitása .......................................................................................................................................................... 97 5.5.2 A pH-ugrással kiváltott aktiváció során bekövetkező konformációváltozás kinetikai elemzése .......................................................................................................................................................... 98 5.5.3 A pH-ugrással kiváltott aktiváció során bekövetkező konformációváltozás termodinamikájának vizsgálata ........................................................................................................ 99 5.5.3.1 A konformációs átmenet sebességének hőmérsékletfüggése ............................................................ 99 5.5.3.2 A konformációs átmenet sebességének függése a reakcióközeg viszkozitásától ............................ 102
5.5.4 A konformációs átmenet kinetikai és termodinamikai paramétereinek értelmezése.............. 105 5.5.4.1 A triptofán alapú detektálás előnyei és a megfigyelt sebességi állandó értelmezése ...................... 106 5.5.4.2 A Gly193 nagyobb oldalláncú aminosavra való cseréjének szerkezeti következményei................ 106 5.5.4.3 A Gly193 nagyobb oldalláncú aminosavra való cseréjének hatása a konformációs átmenet kinetikai és termodinamikai tulajdonságaira ............................................................................................................. 108 5.5.4.4 A G193A mutáció hatása a tripszin belső viszkozitására................................................................ 109
6. ÖSSZEFOGLALÁS........................................................................................................................... 111 7. SUMMARY ........................................................................................................................................ 112 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ............................................................................................................... 113 IRODALOMJEGYZÉK........................................................................................................................ 115 FÜGGELÉK........................................................................................................................................... 125
4
RÖVIDÍTÉSEK 5’ RACE PCR
az mRNS 5’ végének amplifikálására alkalmas PCR módszer
α1AT
alfa-1-antitripszin
APPI
Alzheimer amiloid prekurzor protein inhibitor
CABS
4-(ciklohexilamino)-1-butánszulfonsav
cDNS
mRNS-ről reverz transzkripcióval átírt DNS
Ct érték
amplifikálási ciklus küszöbérték/
DEPC
dietil pirokarbonát
DNS
2’-dezoxiribonukleinsav
dNTP
2’-dezoxinukleotid 5’-trifoszfát
DTT
ditiotreitol
E. coli
Escherichia coli
ER
endoplazmatikus retikulum
EST
expressed sequence tag (gének rövid szakasza, melyek transzkripciója bizonyított)
GFP
zöld fluoreszcens protein
GSP
génspecifikus primer
hPSTI
humán pankreatikus szekréciós tripszin inhibitor
mRNS
messenger (hírvivő) ribonukleinsav
MUGB
4-metilumbelliferil 4-guanidinobenzoát
PAR
proteáz-aktivált receptor
Pfu polimeráz
Pyrococcus furiosusból izolált hőstabil DNS polimeráz
PCR
polimeráz láncreakció
PRSS
szerin proteázt kódoló gén
SDS
nátrium dodecil szulfát
STI
szójabab tripszin inhibitor
Taq polimeráz
Thermus aquaticusból izolált hőstabil DNS polimeráz
TI1
első tetraéderes intermedier
Tricin
N-[2-hidroxi-1,1-bisz(hidroximetil)etil]glicin
Tris
Tris-(hidroximetil)-aminometán
Z-Gly-Pro-Arg-pNA
N-benziloxikarbonil-glicil-prolil-arginil-paranitroanilid
5
1. BEVEZETÉS A humán tripszin 4 a 193-as pozícióban a szerin proteázokban konzervált glicin helyett egy arginint tartalmazó tripszin izoforma, amely a hasnyálmirigyben, az agyban, illetve epitheliális eredetű sejtvonalakban expresszálódik. Az enzim széleskörűen karakterizált, legkülönlegesebb tulajdonsága egyes fehérje típusú inhibitorokkal szemben mutatott rezisztenciája. Ez a tripszin izoforma, bár steady state aktivitása kis szintetikus szubsztrátokon nem marad el a többi tripszin izoformáétól, nem képes autoaktivációra, nem aktivál más pankreatikus zimogéneket sem, és polipeptid szubsztrátokon
fokozott
szubsztrátspecificitást
mutat.
A
humán
tripszin
4
benzamidinnel alkotott komplexének szerkezetvizsgálata és mutagenezis tanulmányok felfedték, hogy ezek a különleges tulajdonságok döntően a Gly193Arg mutáció következményei. Az enzim központi idegrendszerben betöltött potenciális funkciója az elmúlt évek során kezdett körvonalazódni. A humán tripszin 4 szelektíven processzálja a mielin bázikus fehérjét, ezáltal szerepet játszhat a sclerosis multiplex pathogenezisében, illetve képes egyes proteáz-aktiválta receptorok hasítására is, így részt vehet jelátviteli folyamatokban. Doktori munkám során a humán tripszinogén 4 gén agyszövetben való transzkripciójával, a humán tripszinogén 4 különböző izoformáinak membránkötő képességével, illetve az enzim aktivációja és működése során bekövetkező szerkezeti átrendeződések gyorskinetikájával és termodinamikájával foglalkoztam. Dolgozatom bevezető
részében
először
általánosságban
a
szerin
proteázok
legfontosabb
tulajdonságairól írok, majd a humán tripszin 4 irodalmát tekintem át. Ezt követően bemutatom a doktori munkám során alkalmazott módszereket, elért eredményeimet és értelmezem azokat.
1.1 Szerin proteázok csoportosítása, meghatározása A proteázok (más néven proteinázok, peptidázok illetve proteolítikus enzimek) az enzimek egy kiterjedt és fontos csoportja, amelyek peptidkötéseket hidrolizálnak. A Rawlings és Barrett által bevezetett osztályozás szerint a proteázokat elsődleges és harmadlagos szerkezetük alapján családokba, illetve klánokba sorolják, melyek tovább
6
csoportosíthatók a katalitikus mechanizmus szerint (Barrett (szerk.) 1998; Barrett és Rawlings 1995). Egy proteáz családot alkot az enzimek azon csoportja, amelynek minden tagja a katalitikus domén aminosav szekvenciájában szignifikáns rokonságot mutat a család legalább egy másik tagjával. Másképpen megfogalmazva, egy család bármely két tagja egy közös ősi molekulából fejlődött, ezért homológnak tekinthető. A családok neve egy, a katalitikus típusra utaló betűből és az azt követő önkényes számból áll. A családok azon csoportja alkot egy klánt, melyek tagjai egy közös ősből fejlődtek, de olyan mértékben divergáltak egymástól, hogy rokonságuk az elsődleges szerkezet összehasonlításával nem fedhető fel (Barrett és Rawlings 1995; Rawlings és Barrett 1993). A tripszin az endopeptidáz szerin proteázok egyik prototípusa, mely a PA klánba és az S1 családba sorolható (Rawlings és mtsi. 2006). A PA klánba szerin és cisztein proteázok tartoznak, melyek két al-klánt (PA(S) és PA(C)) alkotnak. A legtöbb proteáz az exopeptidázok, illetve az endopeptidázok közé sorolható. Exopeptidáznak nevezzük azokat a proteázokat, amelyek egy vagy néhány aminosavat hasítanak le a polipeptid szubsztrát N-, illetve C-terminálisról, endopeptidáznak pedig azokat, amelyek polipeptid láncokon belül hasítanak peptidkötést. A katalitikus mechanizmus alapján megkülönböztethetünk szerin, treonin, cisztein, aszpartát, glutamát és metalloendopeptidázokat, illetve számos enzimben a mechanizmus egyelőre ismeretlen (Rawlings és mtsi. 2006). A szerin, treonin és cisztein proteázokban az aktív helyen a nukleofil szerepét egy aminosav egy csoportja tölti be (ld. 1.5 fejezet), míg az aszpartát és metalloproteázok esetén egy aktivált vízmolekula, a két csoport katalitikus mechanizmusa tehát jelentősen eltér egymástól. A proteázok mintegy egyharmada a szerin proteázok közé sorolható, melyek nevüket az aktív helyen található nukleofil szerin után kapták. Ezt a csoportot eredetileg az Asp-His-Ser katalitikus triád jelenléte alapján különítették el (Blow 1997). Az AspHis-Ser katalitikus triád legalább négyféle szerkezeti kontextusban található meg, utalva arra, hogy ez a katalitikus gépezet legalább négy különböző alkalommal alakult ki az evolúció során (Dodson és Wlodawer 1998). Ezek az eltérő szerkezetű enzimek négy klánt alkotnak. Az egyik klán prototípusa a tripszin, illetve a kimotripszin. Nemrégiben új katalitikus triádokkal és diádokkal rendelkező szerin proteázokat fedeztek fel, melyekben Ser-His-Glu, Ser-Lys/His, His-Ser-His, és N-terminális Ser játszik szerepet a katalitikus mechanizmusban (Dodson és Wlodawer 1998). Az S1 családba tartozó szerin proteázok megtalálhatók eukariótákban, prokariótákban, archeákban és vírusokban is. Ezek az enzimek számos fiziológiás 7
folyamatban vesznek részt, szerepüket leírták például a táplálék emésztésében, jelátviteli folyamatokban, az immunválaszban, a szaporodásban, a hemostasisban és az apoptózisban (Barros és mtsi. 1996; Coughlin 2000; Johnson 2000; Joseph és mtsi. 2001; Neurath 1984). A véralvadást, a fibrinolízist és a komplement rendszer aktiválódását szerin proteázok egymást követő aktiválódási kaszkádja irányítja (Collen és Lijnen 1986; Davidson és mtsi. 1990; Sim és Laich 2000). Hasonló proteáz kaszkádok
vesznek
részt
fejlődési
folyamatokban,
az
extracelluláris
mátrix
“remodelling” folyamatában, a differenciálódásban és a sebgyógyulásban is (LeMosy és mtsi. 1999; Selvarajan és mtsi. 2001; Van den Steen és mtsi. 2001). A sokféle betöltött fiziológiai szerep az S1 családba tartozó szerin proteázok specificitásának nagyfokú változatosságára utal. A továbbiakban a szerin proteázok szerkezeti és katalitikus sajátosságait az S1 családba tartozó enzimek, illetve döntően a tripszin példáján mutatom be.
1.2 Az S1 családba tartozó szerin proteázok térszerkezete Az S1 családba sorolható szerin proteázok katalitikus doménje két, egymásra merőleges β-hordóból áll, melyeket hat antiparalell β-szál és egy C-terminális α-hélix épít fel (1. ábra). Feltételezések szerint a két hordóból álló szerkezet génduplikációs és fúziós események következében alakult ki, az ősi szerin proteáz gén csak egyetlen β-hordót kódolt (Lesk és Fordham 1996). Az enzim aktív helye a két hordó között helyezkedik el. A proteáz domén mellett számos szerin proteáz N-terminális, szabályozó szereppel bíró doméneket is tartalmaz (pl. kringle, epidermális növekedési faktor szerű (EGF), apple, cisztein-gazdag domén). A többdoménes szerkezet kialakulását az ősi proteáz domént kódoló gén 5’ végén található 1-es fázisú exon-intron határ tette lehetővé, mely az S1 család számos proteázának génjében megőrződött (Patthy 1993). A proteáz domén katalitikus triád (vagy diád), szubsztrát-felismerő és zimogén aktivációs domén részekre tagolható (Kraut 1977). Ezen régiók funkciói azonban nem függetlenek egymástól, hanem összetett módon egymásba fonódnak (Gráf 1995; Hedström 2002).
8
1. ábra A vad típusú humán tripszin 4 térszerkezete az 1h4w Protein Data Bank file alapján a PyMol programmal ábrázolva (DeLano 2002). Az ábrán jól látható a szerkezetet felépítő egymásra merőleges két β-hordó, a köztük húzódó árokban található az enzim aktív helye. A katalitikus triádot alkotó His57 1 -et, Asp102-t és Ser195-öt zöld színnel, az Arg193-at, amely a humán tripszin 4 nem-konvencionális tulajdonságaiért felelős, pirossal és a szubsztrátkötő zsebben elhelyezkedő benzamidint narancssárgával emeltem ki.
A szubsztrátkötés és a katalízis szempontjából funkcionális aminosavak döntően a β-szálakat összekötő hurkokban helyezkednek el. Az S1-specificitási zseb (Schechter-Berger nomenklatúra (Schechter és Berger 1967)), melyet három β-szál épít fel (189-192, 214-216, 226-228-as aminosavak) és az oxianion lyuk (Gly193 és Ser195) is a C-terminális β-hordóhoz tartozik.
1.3 A katalitikus triád Az enzimatikus aktivitáshoz elengedhetetlen aminosavak, a His57, Asp102 és a Ser195 szerkezetileg konzerváltak, és együttesen katalitikus triádnak nevezik őket (Huber 1978). A katalitikus triád egy kiterjedt hidrogén-híd hálózat része (Hedström 2002) amely megfigyelhető a proteáz fehérje inhibitorokkal és transition state 1
A dolgozatban a tripszin aminosavainak számozása a kimotripszinogén konvenciót követi (Shotton és Hartley 1970).
9
analógokkal alkotott komplexeiben, illetve az acil-enzim komplexben is, ami arra utal, hogy ezek a hidrogén hidak jelen vannak a teljes katalitikus ciklus során. A katalitikus triád fontosságát kémiai módosítások (pl. a Ser195 OH csoportjának eltávolítása, a His57 metilálása az Nε2-en) és irányított mutagenezis felhasználásával végzett tanulmányok bizonyítják. Tripszinben a Ser195 vagy a His57 alaninnal való helyettesítése a kcat/Km értékét 105-ed részére csökkenti (Corey és Craik 1992). A katalitikus triád további tagjainak alaninra való cseréje nem okoz további aktivitásvesztést. Ebből az következik, hogy a Ser195 vagy a His57 szubsztitúciója elegendő a katalitikus triád teljes működésképtelenné tételéhez. Az Asp102 aszparaginra való cseréje tripszinben a kcat/Km értékét 104-ed részére csökkenti neutrális pH-n (Craik és mtsi. 1987; Sprang és mtsi. 1987). Fontos azonban megjegyezni, hogy a proteázok katalitikus „erejének” nem kizárólagos forrása a katalitikus triád: ezek a működésképtelen katalitikus triáddal rendelkező mutánsok 103-szor gyorsabban hidrolizálják a szubsztrátokat a nem-katalizált reakció sebességéhez képest (Carter és Wells 1988; Corey és Craik 1992). A megmaradó aktivitás arra utal, hogy az oxianion lyuk, a deszolvatáció és talán a szubsztrát kanonikus konformációja is jelentős mértékben hozzájárul a katalízishez.
1.4 Az oxianion lyuk Az oxianion lyuk egy pozitívan töltött zseb, melyet a Ser195 és a Gly193 peptidgerinc NH csoportjai alkotnak (Robertus és mtsi. 1972). Az oxianion lyuk a Ser195-ön keresztül szerkezetileg kapcsolt a katalitikus triádhoz és az Ile16-Asp194 sóhídhoz. Az oxianion lyuk egyik szerepe az, hogy polarizálja a hasadó amid vagy észter kötést, így a karbonil szénre történő nukleofil támadást elősegíti a részleges pozitív töltés (Whiting és Peticolas 1994). Másik funkciója a hasadó kötés hidrolízise során keletkező tetraéderes intermedierek stabilizálása hidrogén hidas kölcsönhatások által (Kraut 1977; Warshel és mtsi. 1989). Ezekben az interakciókban a Gly193 és a Ser195 amido csoportjai a proton donorok, és a keletkező oxianion intermedier az akceptor (Henderson 1970; Robertus és mtsi. 1972). Egy nemrégiben leírt, a tetraéderes intermedierek kristályszerkezetét elemző tanulmány szerint a Gly193 amid nitrogénje és a P1’ aminosav α-amino csoportja között szintén kialakulhat egy hidrogén híd (Liu és mtsi. 2006), ám a Gly193 által kialakított hidrogén hidak közül ez utóbb említettnek áll 10
közelebb a geometriája az optimálishoz, ami felveti annak a lehetőségét, hogy ez utóbbi kölcsönhatás fontosabb az oxianion stabilizálásához. Annak ellenére, hogy az optimális átmeneti állapot (transition state) stabilizáláshoz a glicin messze a legmegfelelőbb aminosav a 193-as pozícióban, ismertek ritka példák, ahol ezt a pozíciót nem glicin foglalja el. A legalaposabban karakterizált ilyen enzim a humán tripszin 4 (Nyaruhucha és mtsi. 1997; Rinderknecht és mtsi. 1984; Wiegand és mtsi. 1993), melyben egy arginin található a 193-as pozícióban (1. ábra).
1.5 A katalitikus mechanizmus A peptidkötések hidrolízisekor a proteázoknak három akadályt kell leküzdeniük. (1) Az amid kötések igen stabilak az amid nitrogén karbonil felé való elektron donálása miatt. A proteázok általában az amidkötést a karbonil oxigén egy általános savval való kölcsönhatásával aktiválják, illetve torzíthatják is a peptidkötést. (2) A víz egy gyenge nukleofil, a proteázoknak tehát aktiválniuk kell a hidrolítikus vízmolekulát, általában egy általános bázis által. (3) Az aminok rossz távozó csoportok, így a proteázok protonálják az amint, mielőtt az leválik az enzim felszínéről. A peptidkötések hidrolízisének szerin proteázok általi katalízise iskolapéldája a transition state stabilizálásának, az általános sav-bázis katalízisnek és a kovalens katalízisnek.
11
2. ábra A szerin proteázok általánosan elfogadott katalitikus mechanizmusa a kimotripszin peptidhidrolízisén bemutatva. A reakciónak két fázisa van. Az acilezési fázisban (1-4. lépés) a kovalens acil-enzim intermedier kialakulása a peptidkötés elhasításához kapcsolt. A dezacilezési fázisban (5-8. lépés), amely lényegében az acilezés fordítottja (mely során egy vízmolekula helyettesíti a szubsztrát amin-komponensét), az enzim regenerálódik. (Berg (szerk.) 2002 9.8 ábrája alapján)
A katalitikus ciklus első lépéseként az enzim megköti a szubsztrátot, kialakítva a nem-kovalens Michaelis komplexet. A katalitikus szerin hidroxil oxigénje nukleofil támadást intéz a hasadó kötés elektronhiányos karbonil szenére és egy kovalens kötés alakul ki. A His57 a nukleofil támadást általános bázisként segíti elő. A megtámadott szénatom koordinációja tetraéderessé válik, ezért ezt az állapotot első tetraéderes intermediernek (TI1) nevezik. A keletkező His57-H+-t az Asp102-vel kialakított hidrogén híd, az oxianiont pedig az oxianion lyukkal kialakított hidrogén hidak stabilizálják. A következő lépésben a TI1 elbomlik a C-terminális (első) terméket és az acil-enzimet eredményezve. A távozó csoport protonálását a His57-H+ végzi általános savként szerepelve. Az acilezést a mechanizmusát tekintve hasonló dezacilezés követi, amely során az acil-észter kötést egy, ezt megelőzően a His57 által aktivált vízmolekula támadja meg (Bender és Kézdy 1965; Polgár és Bender 1969). A második tetraéderes intermedier elbomlása után a második termék is disszociál az enzim felszínéről, és az enzim regenerálódik.
12
1.6 Bizonyítékok a katalitikus mechanizmus érvényességére A fent leírt katalitikus mechanizmust számos kinetikai, illetve szerkezeti adat támasztja alá. Az acil-enzim intermedier létezésére elsőként a kimotripszin és a p-nitrofenil acetát reakciójának burst kinetikája utalt (Hartley és Kilby 1954). Ezt követően izoláltak acil-enzimeket a kimotripszin és számos észter reakciója során, és bizonyították ezen intermedier kinetikai, illetve kémiai kompetenciáját is (Hess és mtsi. 1970). Számos röntgen krisztallográfiás szerkezet is ismert acil-enzim intermedierekről, mint például a γ-kimotripszin és egy autoproteolítikus peptid komplexe (Dixon és mtsi. 1991; Dixon és Matthews 1989; Harel és mtsi. 1991). A peptid szerkezetét könnyen helyettesíteni lehet fehérje típusú inhibitorok szerkezetével, ami tovább erősíti az acil-enzim kompetens voltát a katalízis szempontjából. Ismert továbbá egy bakteriális proteáz egy peptiddel alkotott acil-enzim komplexének (Blanchard és James 1994), illetve az elasztáz egy heptapeptiddel, a β-kazomorfinnal alkotott acil-enzim komplexének szerkezete is (Wilmouth és mtsi. 1997; Wilmouth és mtsi. 2001). Ez utóbbi tanulmányok szerint az észterkötés planáris, és a karbonil csoport nem torzult a tetraéderes szerkezet irányába, mint ahogy azt korábban megfigyelték. Mivel a tetraéderes intermedier nem stabil, ennek megfelelően életideje is igen rövid, illetve egyéb technikai nehézségek miatt csak kisszámú olyan kristályszerkezet áll rendelkezésre, amelyben valóban a tetraéderes intermedier állapot figyelhető meg (Liu és mtsi. 2006; Wilmouth és mtsi. 2001). A Michaelis komplex szerkezetének ismeretében az acil-enzim és egy tetraéderes intermedier analóg atomi felbontású szerkezetének analízise révén ma már az aktív hely finomszerkezetének változásait és a hidrolítikus víz támadási útvonalát is ismerjük a szarvasmarha tripszin esetében (Radisky és mtsi. 2006). Felmerül a kérdés azonban, hogy olyan szerin proteázokban, ahol természetesen előforduló mutációk következtében az oxianion lyuk egyik eleme, a 193-as pozíciójú aminosav nem glicin (ilyen az általam vizsgált humán tripszin 4 is), a konvencionális tripszinekhez (pl. szarvasmarha tripszin, kimotripszin) képest eltérő-e az egyes reakció intermedierek szerkezete, vagy az egyes reakciólépések termodinamikája (ld. 5.4 fejezet).
13
1.7 A szubsztrátfelismerő-hely és a szubsztrátspecificitást meghatározó tényezők A szubsztrátfelismerő-hely magába foglalja a polipeptidkötő helyet és a peptidszubsztrát oldalláncait befogadó kötőzsebeket. A proteázok specificitására irányuló tanulmányok általában a P1/S1 kölcsönhatásra fókuszálnak, amit a P2-Pn/S2Sn kölcsönhatások figyelembe vétele követ (Schechter-Berger nomenklatúra (Schechter és Berger 1967)). A P1-P1’ a hasadó kötés acil és távozó csoport oldalán található aminosavakat jelöli a szubsztrátban. A szomszédos aminosavakat a hasadó kötéstől távolodva növekvő számok jelölik, és az S1, S1’ stb. a megfelelő kötőhelyeket jelöli az enzim felületén. Az S1’-Sn’ helyeket általában figyelmen kívül hagyják a specificitásvizsgálatoknál a kromofór távozó csoporttal rendelkező szubsztrátok gyakori használata miatt. A következőkben röviden összefoglalva külön tárgyalom az S1 hely, a polipeptidkötő hely, az S2-Sn és S1’-Sn’ helyek szerepét a szubsztrát felismerésében és a specificitásban.
1.7.1 Az S1 hely Az S1 családba tartozó szerin proteázok specificitását általában a P1-S1 kölcsönhatással kapcsolatban osztályozzák. Az S1 hely a Ser195-tel szomszédos zseb, melyet a 189-192, 214-216 és 224-228-as aminosavak alkotnak. A P1 specificitást általában a 189-es, 216-os és a 226-os pozícióban elhelyezkedő aminosavak határozzák meg (a témáról írt összefoglaló tanulmányok: (Czapinska és Otlewski 1999; Perona és Craik 1995) Az Asp189, a Gly216 és a Gly226 egy negatívan töltött S1 zsebet alakít ki, ami magyarázza a tripszin preferenciáját a P1 helyen arginint vagy lizint tartalmazó szubsztrátok felé (Huber és mtsi. 1974; Krieger és mtsi. 1974). A tripszin, a kimotripszin, az elasztáz és a granzim B ezen pozícióit elfoglaló aminosavakat és az említett enzimek specificitását összevetve úgy tűnhet, hogy ezen proteázok specificitását mindössze néhány szerkezeti elem kontrollálja. Azonban a fent említett szerkezeti elemek egyszerű áthelyezése nem kapcsolja át az S1 specificitást (Gráf és mtsi. 1988; Hedström és mtsi. 1992; Hedström 1996), melynek oka többek között az S1 zseb és az aktivációs domén deformációja az S1 zseb-mutáns enzimekben.
14
1.7.2 A polipeptidkötő hely A proteáz-szubsztrát kölcsönhatások túlterjednek az S1 helyen, érintve a polipeptidkötő helyet és gyakran további kötőzsebeket is. A polipeptidkötő hely a 214-216-os aminosav főlánca, mely antiparalell β-lemezt képez a peptid szubsztrát P1-P3 aminosavainak peptidgerincével. Kimotripszinben hidrogén hidak alakulnak ki a Ser214 karbonil oxigénje és a P1 aminosav NH csoportja, a Trp215 NH csoportja és a P3 aminosav karbonil csoportja illetve a Gly216 karbonil csoportja és a P3 aminosav NH csoportja között. Ezek a kölcsönhatások általánosan jellemzők a kimotripszin-szerű szerin proteázokra, és fontos szerepet játszhatnak a hatékony szubsztráthidrolízisben, bár ezen hidrogén hidas kölcsönhatások megszüntetésének csak kis hatása van a szubsztrát hidrolízisére (Coombs és mtsi. 1999). A 214-216-os aminosavak részt vesznek az S1 zseb egyik falának kialakításában is, a Ser214 karbonil csoportja pedig hidrogén hidas kapcsolatban áll a His57-tel. Ezek a szerkezeti kölcsönhatások kommunikációs útvonalat képeznek a polipeptidkötő hely, az S1 hely és a katalitikus triád között. A fehérje típusú szerin proteáz inhibitorok inhibíciós hurokja kinyújtott, úgynevezett kanonikus konformációban rögzített, ami szükséges az inhibitor és a polipeptidkötő hely közötti antiparalell β-lemez kialakításához. A β-lemezes szerkezet következtében a peptidszubsztrát szomszédos oldalláncai alternáló irányba mutatnak. A polipeptid szubsztrátok valószínűleg szintén kanonikus konformációt vesznek fel az enzimhez való kötődéskor, amelyet acil-enzim intermedierek térszerkezetének elemzése is alátámaszt (Katona és mtsi. 2002b; Liu és mtsi. 2006; Radisky és mtsi. 2006).
1.7.3 Az S2-Sn helyek Kimotripszinben az S2-S3 helyek kis szubsztrát-diszkriminációt mutatnak (Schellenberger és mtsi. 1991). Az S2 hely egy sekély hidrofób árok, melyet a His57, a Trp215 és a Leu99 határol; az S2 hely specificitása korrelál a P2 oldallánc hidrofobicitásával (Brady és Abeles 1990). Mivel a P3 aminosav oldallánca túlnyúlik az aktív hely hasadékán, az S3 hely csak kismértékben járul hozzá a specificitáshoz. Az aktív helyet körülvevő hurkokat érintő inzerciók jobban definiált zsebeket hoznak létre az S2-Sn helyeken egyéb szerin proteázokban. Ezek a helyek a specificitás fő
15
meghatározói lehetnek (Bode és mtsi. 1992), mint például az elasztáz (Stein és mtsi. 1987) és az enterokináz esetén (Lu és mtsi. 1999).
1.7.4 Az S1’-S3’ helyek A távozó csoport S1’-Sn’ helyekkel való kölcsönhatásaira általában fehérje inhibitorokkal alkotott komplexek szerkezetéből következtetnek, amelyekben nem a szubsztráthasítási kísérletekben optimálisnak bizonyult P1’-Pn’ aminosavak találhatók, ezért a P’ oldalláncok pontos kölcsönhatásai nem ismertek. A P2’ aminosav főlánc NH csoportja és a Phe41 főlánc karbonil oxigénje között kialakuló hidrogén híd a P’/S’ kölcsönhatások egy állandó jellemzője. A kimotripszin a P1’ helyen arginint vagy lizint tartalmazó szubsztrátokat preferálja, ami az Asp35-tel és az Asp64-el kialakított elektrosztatikus kölcsönhatásoknak tulajdonítható (Schellenberger és mtsi. 1994). A szubsztrát β-lemezzel való illeszkedése következtében a P1’ és P3’ oldalláncok azonos irányba mutatnak, így az S1’ és S3’ helyek átfednek egymással. Az S1’/S3’ helyet határoló hurkokat érintő inzerciók szintén létrehozhatnak jobban definiált S1’-S3’ kötőhelyeket (Bode és mtsi. 1992).
1.8 A szerin proteázok aktivációja A
kimotripszin-szerű
szerin
proteázok
inaktív
zimogén
formában
szintetizálódnak. A zimogének az aktivációs peptid proteolítikus hasítása révén aktiválódnak. Az újonnan kialakult N-terminális, az Ile16 -amino csoportja stabilizáló sóhidat képez az Asp194 oldallánc karboxil csoportjával, amely előidézi az aktív enzimhez vezető konformációváltozást (Birktoft és mtsi. 1976; Huber 1978; Kossiakoff és mtsi. 1977). Ez a szerkezeti átrendeződés a fehérje egy jól körülhatárolt régióját érinti, amely a molekula 15%-át teszi ki, míg a zimogén és az aktív enzim szerkezetének 85%-a azonos (3. ábra).
16
3. ábra A szarvasmarha tripszinogén (1tgn) és a humán tripszin 4 (1h4w) egymásra illesztett szerkezete a DeepView-spdv 3.7 programmal (Guex és Peitsch 1997) ábrázolva. A humán tripszin 4 aktivációs doménnek megfelelő peptidszegmense, melynek konformációja eltér a szarvasmarha tripszinogén szerkezetétől (szürke), kék szalagként van kiemelve. Zölddel jelöltük a 193-as aminosav peptidgerincét, amely nagy szögváltozásokon megy keresztül az aktiváció során. A Trp141-et, Trp215-öt és Trp221-et, melyek felelősek lehetnek a konformációváltozás során bekövetkező fluoreszcencia intenzitás változásért (ld. 4.9.3-4.9.5 illetve 5.5 fejezet), piros színnel jelöltük, míg a Trp51 és a Trp237 sárga színű.
Az aktiváció során négy peptidszegmens megy keresztül konformációs átrendeződésen: a 16-19-es szegmens, a 142-152-es szegmens (az autolízis hurok), a 184-194-es és 216-223-as szegmens (ez utóbbi kettő alkotja a szubsztrátkötő zsebet és az oxianion lyukat), melyeket együttesen aktivációs doménnek neveznek (Huber 1978). A konformációváltozás révén válik teljessé a szubsztrátkötő zseb és az oxianon lyuk kialakulása (Bode és mtsi. 1978; Fehlhammer és mtsi. 1977). Az aktiváció során bekövetkező konformációváltozás az aktív konformációjú szerkezetet stabilizáló sóhíd perturbálása révén előidézhető 11,0-esről 8,0-as pH-ra való pH-ugrással is (Fersht és Renard 1974; Heremans és Heremans 1989; Stoesz és Lumry 1978), és követhető az enzim belső fluoreszcenciájának mérésével (Verheyden és mtsi. 2004), amely egy elegáns kísérleti megközelítést nyújt a szerkezeti átrendeződés tanulmányozására (ld. 4.9.3-4.9.5 illetve 5.5 fejezet). Kimotripszin esetén leírták, hogy a pH-ugrásos módszerrel mért sebességi állandó megegyezik a proflavin kötési tanulmányokból nyert adattal (Fersht és Requena 1971; Verheyden és mtsi. 2004).
17
A tripszinogén-tripszin átmenet irányított molekuladinamikai szimulációja (targeted molecular dynamics simulations) azt mutatta, hogy a főláncban a legnagyobb szögváltozások bizonyos glicineknél történnek, melyek közül a Gly19, Gly142, Gly184, Gly193 és a Gly216 határol aktivációs domén peptidet (Brünger és mtsi. 1987). Ezek a glicinek nagyobb Φ és/vagy Ψ szögváltozásokat mutatnak, mint a környező aminosavak. Ez arra utal, hogy ezek a glicinek jól definiált szereppel rendelkeznek: csuklóként működnek a konformációváltozás során, míg a négy peptidszegmens merevebb egységként mozog (Brünger és mtsi. 1987; Mátrai és mtsi. 2004). A glicinek jelenléte az aktivációs domén konzervált pozícióiban elősegíteni látszik a konformációs átmenetet. Ennek következményeképpen az egyik csukló aminosav, a Gly193 helyettesítése egy olyan aminosavval, mely terjedelmes és/vagy töltött oldallánccal rendelkezik (pl. az Arg193 a vad típusú humán tripszin 4-ben), feltehetőleg szignifikáns hatással van az aktiváció során bekövetkező konformációváltozás sebességére és termodinamikájára (ld. 5.5 fejezet). Molekuladinamikai és irányított molekuladinamikai szimulációk alapján levezették az aktiváció legfontosabb al-lépéseinek sorrendjét szarvasmarha és patkány kimotripszinogénben (Mátrai és mtsi. 2004; Wroblowski és mtsi. 1997). Mátrai és munkatársai leírták a Gly193 szerepét is az események sorozatában. A 192-es pozícióban a peptidgerinc konformációváltozása idézi elő a Gly193 szubsztrátkötő zseb felé való orientálódását és az Asp194 ~180°-al való elfordulását a C-C kötés körül. Ennek eredményeképpen egy üreg keletkezik a molekulában, ami szükséges ahhoz, hogy az Ile16 behatolhasson a molekula belsejébe, és lehetővé teszi az Ile16 és az Asp194 között a sóhíd kialakulását. Az események sorozata a hatékony enzimatikus aktivitáshoz szükséges szubsztrátkötő zsebbel és oxianion lyukkal rendelkező aktív enzimkonformáció kialakulásához vezet. A szerin proteázok aktivációjának eseményei tehát jól ismertek, azonban tisztázatlan, hogy milyen kinetikai, illetve termodinamikai következményei vannak a csukló régiók merevebbé tételének, a konformációs szabadság korlátozásának a csukló-glicinek kiterjedtebb oldalláncú aminosavra való cseréje által. Dolgozatomban erre a kérdésre is próbáltam választ találni (ld. 5.5 fejezet).
18
1.9 A humán tripszin 4 irodalmi áttekintése A humán tripszinogén 4 genomikai és transzkriptomikai tulajdonságairól, az enzim inhibitorokkal szembeni viselkedéséről, szubsztrátspecificitásáról és potenciális funkciójáról rendelkezésre álló információkat Szepessy és Sahin-Tóth kitűnő összefoglaló közleményének (Szepessy és Sahin-Tóth 2005) gondolatmenetét követve rendszereztem.
1.9.1 A humán tripszinogén 4 felfedezése 1978-ban Rinderknecht és munkatársai a mezotripszint2 a humán hasnyálmirigy szövetben és hasnyálmirigy folyadékban kis mennyiségben megtalálható, inhibitor rezisztens tripszinként azonosították (Rinderknecht és mtsi. 1978). A humán hasnyálmirigy által szekretált tripszinogének döntő többségét két izoforma adja, melyeket izoelektromos pontjuk után kationos tripszinogénnek (pI = 6,2-6,4) (más néven humán tripszinogén 1) és anionos tripszinogénnek (pI = 4,4-4,9) (humán tripszinogén 2) neveznek (Scheele és mtsi. 1981). A Rinderknecht által felfedezett harmadik tripszinogén izoformát mezotripszinogénnek nevezik a fentebb említett két izoforma közé eső elektroforetikus mobilitása alapján (pI = 5,5-5,7) (Rinderknecht és mtsi. 1979; Rinderknecht és mtsi. 1984).
1.9.2 A PRSS3 gén genomi elhelyezkedése és szerkezete A humán β T-sejt receptor (TCR) elemeket kódoló gének a 7-es kromoszóma q35-ös régiójában helyezkednek el. A régió analízise kimutatta, hogy a lókuszban két különböző típusú kódoló elem található: TCR elemek és nyolc tripszinogén gén (Hood és mtsi. 1995; Rowen és mtsi. 1996). Ezek közül három kódol funkcionális 2
Az irodalomban zavaró módon többféle elnevezése is használatos a PRSS3 gén által kódolt fehérje alternatív variánsainak. A mezotripszinogén, humán tripszinogén 3 és humán tripszinogén 4 C izoforma megjelölések ugyanazt a fehérjét jelölik (ld. 1.9.3 és 1.9.4 fejezet). A fehérje alternatív variánsainak aktiválódása után a proteáz domén szekvenciája már azonos, amit nevezhetünk mezotripszinnek, humán tripszin 3-nak vagy humán tripszin 4-nek is. A dolgozatban a humán tripszinogén 4 A, B és C izoforma illetve humán tripszin 4 megnevezéseket használom.
19
tripszinogént, ezekhez képest fordított transzkripciós irányban pedig kettő pszeudogén és egy reliktum gén található. A tripszinogén gének a β T-sejt receptor Vβ és Dβ elemei közé ékelődve helyezkednek el a régióban, és öt exonból épülnek fel. Ebben a régióban található a PRSS1, mely a humán tripszinogén 1-et kódolja és a PRSS2, mely a humán tripszinogén 2-t kódolja. A régióban megtalálható harmadik, szerkezete alapján funkcionális
tripszinogén
gén
valószínűleg
kis
mennyiségben
a
thymusban
expresszálódik. A tripszinogén gének β lókuszba való interkalálódása konzervált módon megtalálható egérben (Hood és mtsi. 1995) és csirkében is (Wang és mtsi. 1995), ami utalhat közös funkcionális vagy szabályozási kontrollra. A mezotripszinogént kódoló gén, a PRSS3 szoros rokonságot mutat a két fentebb említett tripszinogén génnel, azonban genomi lokalizációja eltér ezekétől. A PRSS3 a 9-es kromoszóma p13-as régiójában helyezkedik el, és 7-es, illetve 11-es kromoszóma eredetű DNS szakaszokat is tartalmaz (4. ábra). A β TCR lókusz 3’ végéről származó, egy funkcionális tripszinogén gént és legalább hét Vβ elemet magába foglaló DNS szegmens duplikálódott majd transzlokálódott a 7-es kromoszómáról a 9-es kromoszómára (Hood és mtsi. 1995; Rowen és mtsi. 1996). A 11-es kromoszóma q24-es régiójából származó DNS szakasz a LOC120224 lókusz nem-kódoló első exonjából származik. Ez a lókusz egy erősen konzervált, ismeretlen funkciójú transzmembrán fehérjét kódol.
1.9.3 A humán tripszinogén 4 mRNS alternatív variánsai A fent leírt génduplikációs és transzlokációs események következtében a PRSS3 mRNS-ek kétféle első exonnal rendelkezhetnek, ami lehetőséget ad a fehérje alternatív variánsainak keletkezésére (4. ábra). Háromféle humán tripszinogén 4 izoforma (A, B és C izoforma a SwissProt adatbázisban) kialakulása prediktálható, melyek másodikötödik exonja azonos, de első exonjuk különböző, így N-terminális szekvenciájukban eltérnek egymástól (5. ábra). A C izoformával szemben, a másik két variáns fúziós mRNS, amelyről a humán tripszinogén 4 A és B izoformája keletkezhet. A humán tripszinogén 4 A és B izoformájának első exonja a 11-es kromoszómáról transzlokálódott LOC120224 lókusz nem-kódoló első exonjából származik. Az alternatív splicing során e szekvencia és a humán tripszinogén 4 második-ötödik exonja, amely az aktivációs peptidet és az aktív enzimet kódolja, fuzionál egymással. Ezek az izoformák egyetlen közös génről átíródó mRNS szövetspecifikus alternatív splicingja 20
és/vagy alternatív promóter használat révén alakulnak ki: a C izoforma a hasnyálmirigyben, míg (az A és) a B izoforma az agyban és epitheliális eredetű sejtekben expresszálódik (Cottrell és mtsi. 2004; Wiegand és mtsi.1993). Az A izoforma esetén a zárójel használatát az indokolja, hogy transzkripcióját egyetlen EST szekvencia bizonyítja, a fehérje expresszióját pedig ezidáig nem tudták igazolni (ld. 1.9.6, 1.9.7. fejezet).
4. ábra A humán tripszinogén 4 három izoformájának kialakulása. Mindhárom izoformát a 9-es kromoszómán elhelyezkedő PRSS3 gén kódolja. A három izoforma második-ötödik exonja (az ábrán lilával jelölve), mely az aktivációs peptidet és az aktív enzimet kódolja, azonos. Szövetspecifikus alternatív splicing és/vagy alternatív promóter használat révén az A és a B izoforma első exonja eltérő lesz a C izoformáétól (piros illetve zöld színnel jelölve), ennek következtében más karakterű N-terminális peptiddel rendelkeznek. A B izoforma az A izoformából származtatható egy belső CUG kodonról induló alternatív transzláció iniciációval.
1.9.4 A humán tripszinogén 4 izoformáinak N-terminális szekvenciája A C izoformát nevezték eredetileg mezotripszinogénnek, amely hasonlóan a legtöbb
szerin
proteázhoz,
a
szekretált fehérjékre jellemző, a fehérjét az
endoplazmatikus retikulum (ER) lumenébe irányító tipikus eukarióta szignálszekvenciát hordoz (Nelson (szerk.) 1998; von Heijne 1986). A szignálszekvencia hossza általában 13-36 aminosav (tripszinogének esetében általában 15 aminosav), és a következő
21
tulajdonságok jellemzik: tartalmaz 10-15 hidrofób oldalláncú aminosavat, az Nterminálishoz közel egy vagy több pozitívan töltött oldalláncú aminosav található, amelyet hidrofób és kisméretű nem-töltött oldalláncú aminosavak követnek, tartalmazza az Ala-Val-Ala szekvenciát követő β-kanyart és a szignál peptidáz hasítóhelyet (Nelson (szerk) 2005; von Heijne 1986). A szignálszekvenciát a szignál peptidáz hasítja le a fehérjéről az ER lumenében. Ebben a kompartmentben a redoxpotenciál viszonyok lehetővé teszik a fehérje szerkezetét stabilizáló diszulfid hidak kialakulását. Innen a fehérje transzport vezikulumokban a Golgi komplexbe kerül, majd szekréciós granulumokon át kerül szekrécióra. A izoforma
MCGPDDRCPARWPGPGRAVKCGKGLAAARPGRVERGGAQRGGAGLELHPLLGGRTWRAAR
B izoforma
--------------------------------------------?ELHPLLGGRTWRAAR
C izoforma
---------------------------------------------------------MNP
A izoforma
DADGCEALGTVAVPFDDDDK
B izoforma
DADGCEALGTVAVPFDDDDK
C izoforma
FLILAFVGAAVAVPFDDDDK
5. ábra A humán tripszinogén 4 három izoformájának N-terminális aminosav szekvenciája a proteáz domén határáig. A neutrális pH-n pozitívan töltött aminosavakat (Lys, Arg, His) lilával, a negatívan töltött aminosavakat (Asp, Glu) pirossal jelöltem. Szembetűnő, hogy a C izoforma szignál szekvenciájához képest, amely kiterjedt hidrofób maggal rendelkezik, az A és B izoforma számos töltött aminosavat tartalmaz. A DDDDK szekvencia az enterokináz felismerőhelye. A kérdőjel arra az ellentmondásra utal, hogy a B izoforma genomi szekvenciák alapján prediktált kezdő aminosava metionin, míg az izolált fehérje leucin iniciátor aminosavval rendelkezik (ld. 5.1 fejezet).
A humán tripszinogén 4 A és B izoformákból hiányzik a szekretált fehérjékre jellemző szignálszekvencia, az első exon által kódolt N-terminális peptidjük számos töltéssel rendelkező aminosav oldallánccal rendelkezik (5. ábra). A genomi szekvenciából prediktált A izoforma esetén a transzláció a -44-es pozíciójú AUG kodonról indul, és a fehérje egy 72 tagú, számos töltéssel rendelkező oldalláncú aminosavat tartalmazó N-terminális peptiddel rendelkezik. A B izoforma az A izoformából származtatható a +1-es pozíciójú CUG kodonról induló alternatív transzláció iniciációval, melynek következtében egy rövidebb, 28 tagú N-terminális peptidet hordoz. A nem-AUG kodonról induló transzláció iniciácó jelenségét néhány eukarióta és virális fehérje esetén már leírták (Acland és mtsi. 1990; Kozak 1991a; Kozak 1991b; Nagpal és mtsi. 1992). Az alternatív transzláció iniciáció szekvenciális feltételeit és mechanizmusát az 1.9.5. fejezetben tárgyalom.
22
A humán tripszinogén 4 N-terminális peptidjében három Arg-X-X-Arg peptidmotívum található, amely a membrán-asszociált Ca-függő furin szerin endopeptidáz felismerőhelye (Bresnahan és mtsi. 1990; Molloy és mtsi. 1992). A processzáló enzim a konszenzus szekvencia C-terminálisán bekövetkező hasítást sejten belüli kompartmentekben és sejten kívül is katalizálja. A furin által processzált prekurzor fehérjék mind szekretált fehérjék. Bár nem zárható ki egy további humán tripszinogén 4 exon megléte, amely egy ilyen szignálpeptidet kódolna, sem Wiegand és munkatársai (Wiegand és mtsi. 1993), sem a munkánk során kutatócsoportunk nem tudta kimutatni az ennek megfelelő mRNS-t. A humán tripszinogén 4 esetleges szekrécióra kerülésére utaló egyetlen jel az, hogy immunhisztokémiai módszereket használva transzfektált és a fehérjét endogén módon termelő epitheliális sejtekben a fehérje vezikulumokként azonosított organellumokkal való asszociáltságát figyelték meg. A szignálszekvencia hiányával összhangban a fehérje szekrécióját nem tudták kimutatni ezekben a sejtvonalakban (Cottrell és mtsi. 2004). A diszulfid hidak kialakulása szempontjából fontos kérdés a fehérje lokalizációja és transzportja a sejten belül, amely eddig még tisztázatlan.
1.9.5 Transzláció iniciáció nem-AUG kodonokról Eukarióták transzláció iniciációja során a riboszóma kis (40S) alegysége, a MettRNSi és az eIF2-GTP komplex általában az mRNS 5’ végén kötődik meg és „végigtapogatja” az 5’ nem-transzlálódó régiót az első AUG kodonig. Az eukarióta mRNS-ek körülbelül 10%-a nem az első AUG-ről kezdődően transzlálódik, amennyiben az nem kedvező szekvenciális környezetben helyezkedik el, hanem a transzláció a második, vagy akármelyik másik 3’ irányban elhelyezkedő AUG kodonról indul. Továbbá létezik néhány olyan jól demonstrált eset is, ahol a transzláció az mRNS-ben az első AUG kodont megelőző vagy azt követő nem-AUG kodonról indul (Cigan és mtsi. 1988; Kozak 1997; Peabody 1989). Eukariótákban a nem-AUG kodonról induló transzláció iniciációt elsőként virális gének esetében írták le (Becerra és mtsi. 1985), de ismertek példák proto-onkogének, transzkripciós faktor kináz és növekedési faktor gének körében is (Acland és mtsi. 1990; Hann és mtsi. 1988; Saris és mtsi. 1991; Touriol és mtsi. 2003). Sokáig azt gondolták, hogy az iniciátor kodon milyenségétől függetlenül metionin az iniciátor aminosav, és abban a néhány esetben, 23
ahol nem metionin a kezdő aminosav, a virális gén tartalmaz a nem-konvencionális start kodontól 5’ irányban egy belső riboszóma bekötési helyet (internal ribosome entry site) (Sasaki és Nakashima 2000; Wilson és mtsi. 2000). Nemrégiben azonban Schwab és munkatársai bebizonyították, hogy a leucin is transzlálódhat iniciátor aminosavként CUG kodonról antigén prezentáló sejtek által szintetizált rövid, rejtélyes peptidekben (Schwab és mtsi. 2003; Schwab és mtsi. 2004). Ebben az esetben a leucin start nem függ belső riboszóma kötő hely-szerű mRNS struktúrától, és a transzláció hatékonyságát a konszenzus Kozak szekvenciától való enyhe eltérés fokozza (Kozak 1986). A transzláció iniciációja nem-AUG kodonoknál egy meghatározott konszenzus szekvenciát igényel, amelyben különösen a -3-as (A vagy G) és a +4-es (G) pozíciójú nukleotidok fontosak az iniciátor kodontól 3’ irányban elhelyezkedő régiók másodlagos szerkezet kialakítására képes szekvenciája mellett (Kozak 1991b). A humán tripszinogén 4 mRNS-ben a -3-as és a +4-es pozíciót is guanin foglalja el, így a belső CUG
kodonról
induló
transzláció
iniciáció
ismert
előfeltételei
teljesülnek.
Tanszékünkön jelenleg is folyamatban lévő ezirányú kísérletek eredményei azt mutatják, hogy a humán tripszinogén 4 B izoformájának CUG kodonról induló transzláció iniciációja során szintén leucin az első beépülő aminosav (ld. 5.1 fejezet).
1.9.6 A humán tripszinogén 4 izoformáinak transzkripciója A C izoformának megfelelő cDNS-t először 1990-ben klónozták meg (Tani és mtsi. 1990), bár a közölt szekvencia tartalmaz néhány hibát. A korrekt cDNS szekvenciát 1993-ban és 1997-ben írták le (Nyaruhucha és mtsi. 1997; Wiegand és mtsi. 1993). A C izoforma a hasnyálmirigyben termelődik (Nyaruhucha és mtsi. 1997; Rinderknecht és mtsi. 1984; Tani és mtsi. 1990). A C izoforma mRNS-ének létezését és pankreatikus előfordulását számos EST klón is bizonyítja (Rowen és mtsi. 2005). Az A és B izoformák transzkripcióját több munkacsoport is vizsgálta, olyan oligonukleotidok segítségével, amely az A és a B izoformát is amplifikálják. Ezen eredmények alapján a B izoforma
(illetve
mindkét
izoforma)
a
központi
idegrendszerben kerül transzkripcióra (Tóth és mtsi. 2006b; Wiegand és mtsi. 1993), termelődését
kimutatták
prosztata,
vastagbél
és
légúti
eredetű
epitheliális
sejtvonalakban, illetve normál vastagbél nyálkahártyában is (Cottrell és mtsi. 2004). A B izoformának megfelelő EST szekvenciákat klónoztak különböző agyi régiókból, 24
szívből, méhből és számos tumoros sejtvonalból is (Rowen és mtsi. 2005). Az A izoformának megfelelő mRNS agyszövetből azonban nem volt kimutatható (Wiegand és mtsi. 1993). A hosszabb mRNS hiányát magyarázhatja RNS degradáció, illetve az, hogy a transzkripció elindul egy belső CUG kodontól 5’ irányban lévő négy GCpromóter valamelyikéről. Az A izoformának megfelelő mRNS létezését egyetlen EST szekvencia (BI823946) bizonyítja, melyet egy agyból, tüdőből és heréből izolált mRNS készlet keverékből klónoztak, azonban a fehérje expressziójára nincs bizonyíték.
1.9.7 A humán tripszinogén 4 izoformáinak expressziója Fehérje szinten a C izoformát gélelektroforézissel izolálták hasnyálmirigyből, és leírták, hogy expressziós szintje a normál pankreatikus folyadékban az össztripszinogén tartalom 3-10%-a (Rinderknecht és mtsi. 1979; Rinderknecht és mtsi. 1984; Rinderknecht és mtsi. 1985; Scheele és mtsi. 1981). Krónikus alkoholisták hasnyálmirigy
folyadékában
megemelkedett
mezotripszinogén
szintet
találtak
(Rinderknecht és mtsi. 1979; Rinderknecht és mtsi. 1985), míg krónikus pankreatitisz esetén csökkent fehérjeszintet írtak le (Rinderknecht és mtsi. 1979). A humán tripszinogén 4 fehérjét immunfestéssel mutatták ki PC-3 és SW480 epitheliális sejtvonalakban (Cottrell és mtsi. 2004). Mivel a munkához egy, a proteáz domént
felismerő
monoklonális
anti-tripszin
ellenanyagot
használtak,
ami
feltételezhetőleg minden tripszin izoformával reagál, nem lehet megmondani, hogy az ilyen módon kimutatott reaktivitás a fehérje A vagy B izoformájának felel-e meg. Kutatócsoportunkban
Siklódi
Erika
vizsgálta
a
fehérje
eloszlását
immunprecipitációval kombinált szendvics ELISA módszerrel a humán agy különböző területeiről származó mintákban (Tóth és mtsi. 2006b). Az immunprecipitáció során az antigének agyi extraktumokból való izolálásához a proteáz domént és a 28 aminosavas N-terminális peptidet felismerő monoklonális ellenanyagokat is használt, melynek révén a zimogén és az aktív enzim mennyiségét külön tudta mérni. A humán tripszinogén/tripszin 4 mennyisége a mintákban 10-30 ng/g nedves szövet volt. Hét agyterületben (frontopolaris cortex, occipitális cortex, hypothalamus, putamen, thalamus, periaqueductális szürkeállomány és nyaki gerincvelő) a teljes mennyiség (zimogén + aktív enzim) nagyjából megegyezett a zimogén mennyiségével, míg a többi agyterületről származó mintákban (bulbus olfactorius, cingulate cortex, somatomotoros 25
cortex, kérgi fehérállomány, hippocampus, substantia nigra, pons, kisagyi kéreg, cerebellaris fehérállomány és nyúltvelő) a zimogén mennyisége jelentősen kisebb volt a teljes mennyiségnél. Ezekből az adatokból arra következtetünk, hogy az aktiváció mértéke függ az adott agyterülettől. A legnagyobb mértékű aktivációt kisagyi kéreg, nyúltvelő és hippocampus mintákban találtuk. A fehérje relatíve magas szintje az agykérgi és kisagyi fehérállomány mintákban arra utal, hogy ez a proteáz gliális elemekben expresszálódik. Kutatócsoportunkban Dr. Medveczky Péter immunhisztokémiai vizsgálatai valóban azt mutatták, hogy a fehérje gliasejtekben és neuronok sejtmag körüli régiójában lokalizálódik (Gráf és Szilágyi 2003; Tóth és mtsi. 2006b). A humán tripszinogén 4 immunreaktivitás lokalizálásához anti-proteáz domén és a 28 aminosavból álló N-terminális peptidet felismerő monoklonális
ellenanyagokat
használtunk.
A
gerincvelő
szarvaiban
erős
immunreaktivitást találtunk a gliasejtekben. Az immunfestett sejtek alakja, mérete és eloszlása megegyező volt alternáló metszetek GFAP-festett (gliális fibrilláris savas protein) sejtjeinek jellegével, utalva arra, hogy a gerincvelő fehérállományában az immunpozitív sejtek nagy valószínűséggel asztrociták. Neuronális sejtek a gerincvelő mellső szarvában és központi szürkeállományában szintén mutattak festődést az anti-humán
tripszin
4
ellenanyagokkal,
de
nem
reagáltak
az
anti-GFAP
ellenanyagokkal. Humán tripszinogén 4 immunpozitív gliasejtek és rostok voltak megfigyelhetők kérgi fehérállományban (frontális kéreg) és a kéreg III-as, IV-es és V-ös rétegének neuronális sejtjeiben is. A gerincvelőhöz hasonlóan, a gliális sejteket egyformán festette az anti-humán tripszinogén 4 és az anti-GFAP ellenanyag, de a sejtek az N-terminális peptidet felismerő ellenanyaggal nem reagáltak.
1.9.8 A humán tripszin 4 általános jellemzői A humán tripszinogén 4 nagyfokú homológiát mutat a korábban leírt humán tripszinogén izoformákkal: aminosav szekvenciája 86%-ban azonos a humán tripszinogén 1-ével és 88%-ban azonos a humán tripszinogén 2-ével (Nyaruhucha és mtsi. 1997). Az izolált cDNS alapján a fehérje aminosav szekvenciájára jellemzőek a szerin proteázok S1 családjának főbb tulajdonságai. A humán tripszinogén 4 rendelkezik az Asp11-Asp14 polianinos csoporttal, melyet az aktivációs hasítóhely (Lys15-Ile16) követ. Az aktív enzim tíz, konzervált pozíciójú (Emi és mtsi. 1986) 26
ciszteint tartalmaz, amelyek öt diszulfid hidat alakítanak ki. A szerin proteázok aktív centrumát képző His57, Asp102, Ser195 katalitikus triád szintén megtalálható a molekulában. A 189-es pozícióban Asp, a 216-os és a 226-os pozícióban pedig glicin található, amely pozícióknak a szubsztrátspecificitás meghatározásában van szerepük (Craik és mtsi. 1985).
1.9.9 A humán tripszin 4 térszerkezete A humán tripszin 4 benzamidinnel alkotott komplexének térszerkezetét 2002-ben Katona Gergely oldotta meg (Katona és mtsi. 2002a) (1. ábra). Az 1,7 Å felbontású szerkezet elemzése megmutatta, hogy a humán tripszin 4 globális szerkezete hasonló a humán tripszin 1-éhez, amely a 193-as pozícióban glicint tartalmaz. A két szerkezetben a Cα atomok pozíciójának eltérése nem nagyobb, mint 0,5 Å. Ez a tanulmány szolgáltatta az első meggyőző bizonyítékot arra, hogy döntő mértékben az Arg193 felelős a humán tripszin 4 különös inhibitor rezisztenciájáért. A Gly193 erősen konzervált a kimotripszin-szerű proteázok körében, beleértve a legtöbb ismert gerinces tripszinogént. A humán tripszin 4-ben az Arg193 az S2’ helyet foglalja el, és kinyújtott pozícióban elhelyezkedő hosszú oldallánca sztérikusan ütközik a fehérje partnerek (inhibitorok vagy szubsztrátok) megfelelő csoportjaival. Az Arg193 nyújtott pozícióban való elhelyezkedéséhez hozzájárulhat a Tyr151 aromás gyűrűje, amely interferál az Arg193 oldalláncának szabad rotációjával. A guanidino csoport töltése szintén befolyásolhatja az inhibitor kötést az elsődleges specificitási zseb környéki pozitív töltéscsoportosuláshoz való hozzájárulásával. Bár az Arg193 Cα pozíciója 0,4-0,8 Å eltolódást mutat a konvencionális tripszinek Gly193 Cα pozíciójához képest, ennek ellenére az oxianion lyuk geometriája megőrzöttnek tűnik. Meg kell jegyeznünk azonban, hogy az apo-enzimben más lehet ezen régió finomszerkezete, mint az S1 zseb benzamidin általi betöltöttsége esetén.
1.9.10 A humán tripszin 4 inhibitor rezisztenciája A humán tripszin 4 egyik legérdekesebb tulajdonsága a természetesen előforduló polipeptid típusú inhibitorokkal szemben mutatott rezisztenciája. A humán tripszin 4 jól
27
gátolható kis molekulasúlyú tripszin inhibitorokkal, mint például a benzamidin, p-amino benzamidin, Nα-p-tozil-L-lizin klórmetil keton, leupeptin, illetve általános szerin proteáz inhibitorokkal, mint a diizopropil fluorofoszfát és a fenilmetilszulfonil fluorid (Katona és mtsi. 2002a; Nyaruhucha és mtsi. 1997; Rinderknecht és mtsi. 1984). Ezzel szemben, az eddig vizsgált standard mechanizmusú proteáz inhibitorok nem tudnak erős komplexet képezni a humán tripszin 4-el. Ezek közé tartozik a szarvasmarha pankreatikus tripszin inhibitor (BPTI), a humán pankreatikus szekréciós tripszin inhibitor (hPSTI), a szójabab tripszin inhibitor (STI), Phaseolus lunatus (limabab) tripszin inhibitor, a csirke ovomukoid, az Alzheimer prekurzor protein inhibitor doménje (APPI) és az ekotin (Katona és mtsi. 2002a; Medveczky és mtsi. 2003; Nyaruhucha és mtsi. 1997; Rinderknecht és mtsi. 1984; Szmola és mtsi. 2003). Az inhibitor rezisztencia kifejezés megtévesztő, hiszen ezek a természetes inhibitorok a G193R mutáció ellenére is nagy affinitást mutatnak az enzim felé, bár egyensúlyi disszociációs állandójuk (Kd) 2-7 nagyságrenddel nagyobb, mint a 193-as helyen glicint tartalmazó tripszinek felé mutatott Kd. A szerpinek egy olyan inhibitor családot alkotnak, melyek a proteáz katalitikus ciklusába belépve, a kovalensen kötött acil-enzim intermediert kinetikailag stabilizálva gátolják a szerin proteázokat (Gettins 2002). A szerpin inhibíciós mechanizmus első lépése – hasonlóan a kanonikus inhibitorokéhoz – a nem-kovalens Michaelis komplex kialakulása. Ezt követően a proteáz – hasonlóan a szubsztrátok hidrolíziséhez – elhasítja a szerpin reaktív helyének peptidkötését szignifikáns konformációs átalakulást indukálva, amely az acilált proteáz torzulásához és inaktiválódásához vezet. A kovalens enzim-inhibitor komplex lassan disszociálhat szabad enzimre és inaktív szerpinre. A leírt inhibíciós útvonal alternatívája lehet az acil-enzim komplex gyors dezacileződése, mielőtt a konformációváltozás és a proteáz becsapdázása megtörténne. Ezen a proteolítikus útvonalon az enzim a szerpint szubsztrátként hasítja és ezáltal inaktiválja. Fiziológiásan
releváns
enzim-szerpin
párok
esetén
a
proteolítikus
útvonal
elhanyagolható. A humán tripszin 4 rezisztens a vad típusú alfa-1-antitripszinnel (α1AT) szemben is (Rinderknecht és mtsi. 1984; Szepessy és Sahin-Tóth 2006; Tóth Júlia nem közölt eredmény). Az R193G mutáns humán tripszin 4-et az inhibitor azonban a humán tripszin 1-hez és humán tripszin 2-höz hasonlóan jól gátolja, mutatva, hogy a rezisztencia kritikus meghatározója az Arg193 (Szepessy és Sahin-Tóth 2006). A humán tripszin 4 azonban szelektíven hasítja a Pittsburgh mutáns (Met358Arg) (Lewis és mtsi. 1978; Owen és mtsi. 1983) α1AT reaktív helyének Arg358-Ser359 28
peptidkötését, és a folyamat az enzim inaktiválódásához vezet (Szepessy és Sahin-Tóth 2006; Tóth Júlia nem közölt eredmény). A humán tripszin 4 csaknem ugyanolyan gyorsan asszociál a Pittsburgh mutáns α1AT-hez, mint a humán tripszin 1 és a humán tripszin 2, és a disszociációs konstans alapján a humán tripszin 4-α1AT Pittsburgh komplex 40-szer stabilabb, mint az inhibitor humán tripszin 1-el illetve humán tripszin 2-vel alkotott komplexe. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a szerpin mechanizmus egy lehetséges stratégia a humán tripszin 4 inhibitor rezisztenciájának legyőzésére, amennyiben a szerpin reaktív helye tartalmazza a humán tripszin 4 által preferált Arg/Lys-Thr/Ser peptidmotívumot (Szepessy és Sahin-Tóth 2006). Ezen információk alapján a glia eredetű nexin (GDN) (Scott és mtsi. 1985), melynek reaktív helyén egy Arg-Ser peptidkötés található, potenciálisan funkcionális inhibitora lehet a humán tripszin 4-nek.
1.9.11 A humán tripszin 4 szubsztrátspecificitása A humán tripszin 4 valódi tripszin-szerű specificitást mutat, és arginin, illetve lizin utáni peptidkötéseket hidrolizál. A kisméretű szintetikus kromogén, illetve fluorogén szubsztrátokat nagy katalitikus hatékonysággal hasítja. A P’ helyekkel kontaktusba nem lépő peptidszubsztrátokat más tripszinekkel összehasonlítható hatékonysággal hidrolizálja (Katona és mtsi. 2002a; Rinderknecht és mtsi. 1984; Szmola és mtsi. 2003): például Z-GPR-pNA szubsztráton a kcat értéke körülbelül háromszorosára, a Km értéke pedig 2-3-szorosára nő, ezért a kcat/Km értéke nem változik szignifikánsan a Gly193 argininre való cseréjének hatására (Medveczky és mtsi. 2003). P2’ oldallánccal nem rendelkező amid szubsztrátokon a vad típusú humán tripszin 4 acilezési lépésének sebessége kisebb, dezacilezési lépésének sebessége pedig nagyobb, mint a humán tripszin 1-é. Munkacsoportunk vizsgálta a Z-Gly-Pro-Arg-Met-Gly-PheNH2 peptid humán tripszin 4 illetve humán tripszin 1 általi hidrolízisét a termék keletkezését HPLC-vel követve, illetve a peptidet “csendes” szubsztrátként alkalmazva egy kompetitív rendszerben, ahol a jelet a Z-Gly-Pro-Arg-pNA kromogén szubsztrát adja. A kapott időgörbéket globális illesztéssel elemeztük. Eredményeink azt mutatják, hogy a Gly193 argininre való cseréje enyhén megnöveli a kcat értékét, míg a Km egy nagyságrenddel csökken, amit valószínűleg a szubsztrátkötéskor fellépő sztérikus interferencia okoz (Gombos Linda, nem közölt eredmény, személyes közlés). 29
Szemben a peptidszubsztrátokon mérhető magas aktivitásával, a humán tripszin 4 a fehérjeszubsztrátokat általában kis hatékonysággal hasítja, de az enzimatikus aktivitás sérültségének mértéke erősen függ a hasítandó célfehérje tulajdonságaitól. Így például a humán tripszin 4 a kimotripszinogént, a tripszinogént és a proelasztázt 500-1000-szer lassabban aktiválja, mint a humán tripszin 1 vagy a humán tripszin 2 (Szilágyi és mtsi. 2001; Szmola és mtsi. 2003). A humán tripszinogén 4 nem mutat autoaktivációt sem. A humán tripszin 1 Arg117-Val118 peptidkötésének humán tripszin 4 általi hasítása szintén 500-szor lassabb, mint a humán tripszin 1 általi hidrolízis (Szmola és mtsi. 2003). A miozin S1 kimotriptikus fragmensének humán tripszin 1, illetve
humán
tripszin
4
általi
emésztését
SDS
gélelektroforézist
követő
denzitometrálással elemezve a humán tripszin 4 körülbelül 200-szor kisebb hatékonysággal hasítja a fehérjét, mint a humán tripszin 1 (Gombos Linda, nem közölt eredmény, személyes közlés). Másfelől viszont a humán tripszin 4 a humán tripszinogén 2-t mindössze 20-szor lassabban degradálja, mint a humán tripszin 1 (Szmola és mtsi. 2003). A kazeinből a humán tripszin 4 mindössze háromszor kisebb sebességgel szabadít fel triklór-ecetsav-szolubilis peptideket, mint a humán tripszin 1 illetve 2 (Szepessy és Sahin-Tóth 2006). Megfigyelték, hogy a humán tripszin 4 ugyan rezisztens a vad típusú α1AT-vel szemben, ám szelektíven hasítja a Lys10-Thr11 peptidkötést az inhibitor N-terminálisán (Szepessy és Sahin-Tóth 2006). α1AT mutáns könyvtár segítségével kimutatták, hogy a humán tripszin 4 relatíve nagy specificitással (kcat/Km ~ 105 M-1s-1) hasít olyan lizil peptidkötéseket, melyekben a P1’ pozícióban treonin vagy szerin található. Ezt a P1’ preferenciát megerősíti a Pittsburgh mutáns α1AT reaktív helyének (Arg358-Ser359) hasítása, egyes PAR receptor izoformák hasítása Arg-Ser illetve Lys-Thr aktiváló hasító helyeken és a mielin bázikus fehérje Arg79-Thr80 és Arg97-Thr98 peptidkötésének szelektív hidrolízise is (ld. 1.9.15.2 fejezet). A humán tripszin 4 tehát nem egy defektív proteáz általában véve a polipeptid szubsztrátokon, hanem relatíve nagy specificitással rendelkezik Lys/Arg-Ser/Thr peptidkötések felé. A fokozott szubsztrátspecificitás megmagyarázza azt is, hogy a humán tripszin 4 nem aktiválja a pankreatikus zimogéneket, melyek aktivációs helyén izoleucin vagy valin található a P1’ pozícióban. A humán tripszin 1-ben az S1’ helyre való kötődést nem akadályozza semmilyen szerkezeti elem, ennek megfelelően az S1’ hely sokféle méretű és polaritású aminosav oldalláncot befogadhat (Gaboriaud és mtsi. 1996). A humán tripszin 1 és a humán tripszin 4 térszerkezetének egymásra illesztése felfedi, hogy az S1’ hely szerkezeti 30
determinánsai azonos konformációjúak a két szerkezetben, és az S1’ hely nem tűnik elzártnak semmiféle szempontból a humán tripszin 4-ben (Szepessy és Sahin-Tóth 2006). Az Arg193 oldallánca egyértelműen az S2’ helyet foglalja el. A rendelkezésre álló szerkezet adatok tehát nem adnak magyarázatot a humán tripszin 4 erősen megnövekedett S1’ specificitására. Sahin-Tóth és munkatársainak feltételezése szerint a szubsztrátkötési lépés konformációváltozással jár, ami mérsékli az ütközés mértékét az Arg193-al az S2’ helyen és az S1’ helyhez való hozzáférés részleges akadályozásához vezet (Szepessy és Sahin-Tóth 2006). A szubsztrátspecificitás azonban nem csak a szubsztrátkötés, hanem az acilezés szelektivitásából is eredhet (Ryan és mtsi. 1976). Jónéhány példa bizonyítja, hogy a kcat/Km értékének, azaz a specificitás növekedése szerin proteázoknál a kcat növekedéséből és nem a Km csökkenéséből ered (Hedström 2002). Az acilezés sebességi állandója jó és rossz szubsztrátok közt több mint ezerszeres különbséget mutat, míg a szubsztrát affinitásából eredő diszkrimináció mindössze 10-100-szoros (Hedström és mtsi. 1992; Stein és mtsi. 1987; Thompson és Blout 1970).
1.9.12 Az Arg193 szerepe Először a más tripszinekkel való szekvencia-összehasonlítás alapján merült fel az az elgondolás, hogy az Arg193 a fő meghatározója a humán tripszin 4 fehérje típusú inhibitorokkal szembeni rezisztenciájának (Nyaruhucha és mtsi. 1997). Később ezt az elképzelést megerősítette a humán tripszin 4 kristályszerkezetének elemzése (Katona és mtsi. 2002a). Végül, az Arg193 szerepét bizonyító direkt kísérleti adatokat az Arg193 irányított mutagenezissel glicinre való cseréje szolgáltatta (Medveczky és mtsi. 2003; Szmola és mtsi. 2003). Az R193G mutáns3 humán tripszin 4 érzékennyé vált az STI-vel és a hPSTI-vel szemben. Továbbá az R193G mutáns enzim majdnem ugyanolyan hatékonysággal aktiválta a kimotripszinogént mint a humán tripszin 1 és a humán tripszin 2, utalva arra, hogy az enzim teljes mértékben visszanyerte emésztő funkcióját. Az R193G mutáns humán tripszin 4 tehát gyakorlatilag azonos katalitikus tulajdonságokat és kanonikus inhibitorokkal szembeni érzékenységet mutat, mint a 3
Az R193G mutáns elnevezése megtévesztő lehet, mert a szerin proteázokban a 193-as pozícióban alapesetben glicin található. Ennek ellenére, az arginint hordozó humán tripszin 4 egy természetesen előforduló izoforma, ezért vad típusnak nevezzük. Az R193G variánst nevezhetjük back-mutánsnak illetve revertánsnak, utalva az ebben a pozícióban egyébként konzervált glicinre.
31
humán tripszin 1 (Szmola és mtsi. 2003). Kutatócsoportunk közelmúltbeli eredményei megerősítik ezt a megállapítást. A kanonikus inhibitorok felé mutatott egyensúlyi disszociációs konstans a vad típusú humán tripszin 4-ben 2-3 nagyságrenddel nőtt a humán tripszin 1-hez képest. Ezeket a megváltozott kinetikai paramétereket az Arg193 glicinre való visszacserélése helyreállította. Mindezen adatok alapján az R193G mutáns humán tripszin 4 a pankreatikus tripszin izoforma modelljének tekinthető. Levonhatjuk tehát a következtetést, miszerint kizárólag az Arg193 evolúciós szelekciója felelős a humán tripszin 4 inhibitor rezisztenciájáért és fokozott szubsztrátspecificitásáért. A 193-as pozícióban a nem-glicin aminosav egy másik hatása lehet, hogy a 192-193-as peptidkötés geometriája torzult, ezért az S1 kötőhely és az oxianion lyuk perturbált az aktív enzimben, mint ahogy azt a XI-es faktor Gly555Glu (Gly193Glu a kimotripszin számozás szerint) mutánsa esetében leírták (Schmidt és mtsi. 2004). Ugyan a humán tripszin 4 benzamidinnel alkotott komplexének kristályszerkezete alapján az oxianion lyuk nem tűnik torzultnak, nem tudjuk, milyen az apo-enzim szerkezete ebben a tekintetben. A humán tripszin 4 kromogén szubsztrátokon mutatott, a humán tripszin 1-hez képest nem csökkent kcat/Km értéke mögött állhat az S1 kötőzseb és az oxianion lyuk optimális térszerkezete, de állhat az is, hogy ezek a szerkezeti elemek, bár az apo-enzimben torzultak, a szubsztrát S1 helyre való bekötődése visszaállítja korrekt geometriájukat. Nemrég jelent meg egy másik közlemény, amely trombinban, illetve patkány tripszinben a 193-as pozíciójú glicint érintő mutációk szerkezeti és energetikai következményeivel foglalkozik (Bobofchak és mtsi. 2005). Ebben a tanulmányban kinetikai és szerkezeti adatokból arra következtettek, hogy a Gly193 az alapállapotot (ground state) és az átmeneti állapotot (transition state) is stabilizálja, ezáltal járulva hozzá a szubsztrátkötéshez, annak ellenére, hogy nem találtak drasztikus szerkezeti peturbációt még a G193P mutáns esetén sem. Doktori munkám során azzal a kérdéssel is foglalkoztam, hogy a Gly193Arg pontmutációnak milyen hatása van a szubsztráthidrolízis egyes lépéseinek sebességére és termodinamikájára (ld. 5.4 fejezet). Vizsgáltam továbbá, hogy a Gly193-at nagyobb térkitöltésű oldallánccal rendelkező aminosavra cserélve hogyan módosul az aktiváció során bekövetkező szerkezeti átrendeződés kinetikája illetve termodinamikája (ld. 5.5 fejezet).
32
1.9.13 Tripszin inhibitorok hasítása A proteázok standard mechanizmusú inhibitorokkal alkotott komplexében az inhibitor reaktív helyének peptidkötése lassú hidrolízisen megy keresztül, kétláncú hasított és egyláncú intakt inhibitor egyensúlyi keverékéhez vezetve (Laskowski és Qasim 2000). Konvencionális tripszinek esetén ez a folyamat rendkívül lassú, és csak hónapok alatt áll be az egyensúly. Ezzel szemben, a humán tripszin 4 a standard mechanizmusú inhibitorokat szubsztrátként ismeri fel, és gyorsan hidrolizálja az STI és az APPI inhibitor domén reaktív helyének peptidkötését (Szepessy és Sahin-Tóth 2006; Szmola és mtsi. 2003; Tóth Júlia nem közölt eredmény). Az SDS poliakrilamid gélelektroforézis és az N-terminális szekvenálás megerősítette, hogy mindkét esetben a humán tripszin 4 a reaktív hely peptidkötését hasítja. Az egyensúly beálltakor az STI esetén az inhibitor molekuláknak kb. 40%-a intakt és 60%-a hasított, az APPI esetében ez az arány 20%-80%. A kanonikus inhibitorok reaktív helyén lévő peptidkötés gyors, szubsztrát-szerű elhasítása vezetett ahhoz az elgondoláshoz, hogy a humán tripszin 4-et gátolhatják egyes szerpinek, hiszen a reaktív hely peptidkötésének hidrolízise kruciális pontja a szerpin inhibíciós mechanizmusnak. A hPSTI szintén a standard mechanizmusú inhibitorok közé tartozik, ám ellentétben az STI-vel, ami stabil komplexet képez a tripszinnel, a szekretált inhibitorok úgynevezett
ideiglenes
(temporary)
inhibitorok,
mert
idővel
irreverzibilisen
disszociálnak az enzim felszínéről (Laskowski és Wu 1953). Az ideiglenes inhibitorok mechanizmusa egymást követő triptikus hasítások sorozatából áll (Schneider és mtsi. 1973; Schneider és Laskowski; 1974). A humán tripszin 4 az ideiglenes inhibíció mechanizmusa szerint hasítja a hPSTI-t, ám szignifikánsan nagyobb sebességgel (Szepessy és Sahin-Tóth 2006; Szmola és mtsi. 2003), mint a 193-as pozícióban glicinnel rendelkező tripszinek. További különbség, hogy míg a konvencionális tripszinekkel
való
hasításnál
a
sebesség-meghatározó
lépés
a
reaktív
hely
peptidkötésének hidrolízise, addig a humán tripszin 4 esetén a reaktív hely elhasítását követő inaktiváló hasítások sokkal lassabbak a reaktív hely hidrolízisénél, és ezek határozzák meg az inhibitor degradáció sebességét.
33
1.9.14 A humán tripszinogén 4 aktivációja A humán tripszinogén 4 fiziológiás aktivátora az enterokináz, amely a vékonybélben az enterociták kefeszegély membránjában lokalizált, és minden szekretált pankreatikus tripszinogént képes aktiválni. Az enterokináz transzkripcióját kimutatták a humán tripszinogén 4-et is termelő különböző epitheliális sejtvonalakban is. Szemben a humán tripszinogén 1-el és humán tripszinogén 2-vel, a humán tripszinogén 4 nem képes autoaktivációra (Medveczky és mtsi. 2003; Szmola és mtsi. 2003). A humán tripszin 1 és humán tripszin 2 általi aktiváció szintén lassú és kis hatékonyságú, és a humán tripszinogén 4 jelentős mértékű degradációjához vezet (Szmola és mtsi. 2003). A humán tripszinogén 4-et a lizoszómális cisztein proteáz, a katepszin B is aktiválja, amely kísérletes pankreatitiszben a tripszinogén aktiválásáért felelős (Halangk és mtsi. 2000; Kukor és mtsi. 2002). Humán agyszövetből immunaffinitás kromatográfiával izolálható a humán tripszinogén 4 és a felaktivált enzim is (Tóth és mtsi. 2006b) ami arra utal, hogy az aktiváció a központi idegrendszer szöveteiben is megtörténhet.
1.9.15 A humán tripszin 4 lehetséges funkciói 1.9.15.1 A humán tripszin 4 potenciális fiziológiás és patológiás szerepe a hasnyálmirigyben A pankreaszban expresszálódó humán tripszin 4 valószínűleg nem játszik jelentős szerepet a táplálék fehérjéinek degradálásában, egyrészt, mert emésztési funkciója sérült, másrészt, mert a humán tripszin 1 és a humán tripszin 2 sokkal nagyobb tömegben fordul elő a pankreatikus folyadékban, és katalitikus hatékonyságuk is nagyobb polipeptid típusú szubsztrátok esetén. Sokáig az enzim egyetlen funkciójának a táplálék fehérje típusú tripszin inhibitorainak degradálása tűnt (Szmola és mtsi. 2003). A humán tripszin 4 általi inhibitor degradáció azonban csak magas inhibitor koncentrációk esetén válhat szignifikánssá, hiszen alacsony koncentrációk esetén az inhibitorok komplexálva lesznek a humán tripszin 1 és a humán tripszin 2 által. Hasonló érvelés alapján az ideiglenes inhibitorok degradálását is valószínűleg inkább a humán tripszin 1 és a humán tripszin 2 végzi.
34
A pankreatikus humán tripszin 4 patológiás szerepe kapcsán két, egymással ellentmondó elmélet is született, melyek szerint a humán tripszin 4 a pankreaszban való idő előtti felaktiválódása pankreatitiszt okozhat, illetve megakadályozhatja a pankreatitisz kialakulását, mivel az inhibitor rezisztens tripszin szabadon aktiválhat, illetve degradálhat egyéb pankreatikus zimogéneket (Nyaruhucha és mtsi. 1997; Rinderknecht és mtsi. 1984). Kísérletes adatok egyértelműen mutatják, hogy a humán tripszin 4 nem képes a pankreatikus zimogének aktiválására, és a humán tripszinogének degradációjára való képessége is sérült (Rinderknecht és mtsi. 1984; Szilágyi és mtsi. 2001; Szmola és mtsi. 2003). Ezen adatok szerint nem valószínű, hogy a humán tripszin 4 szerepet játszana pankreatikus zimogének aktiválásában vagy degradálásában. Másfelől az a megfigyelés, miszerint a humán tripszin 4 elhasítja a standard mechanizmusú inhibitorokat, felveti a lehetőséget, hogy az enzim pankreaszban való felaktiválódása hozzájárulhat a pankreatitisz pathogeneziséhez a hPSTI védő szintjének lecsökkentése révén. A betegség ily módon való kialakulásához szükséges egy relatíve specifikus humán tripszinogén 4 aktivátor jelenléte a pankreasz acinus sejtjeiben. In vitro a katepszin B gyorsan és a humán tripszinogén 1-gyel és humán tripszinogén 2-vel szemben preferált módon aktiválja a humán tripszinogén 4-et (Szmola és mtsi. 2003). A humán tripszin 4 által indukált pankreatitisz modell biokémiai háttere tehát elvben létezik, a mechanizmus gyakorlati jelentőségét azonban még nem igazolták. 1.9.15.2 A humán tripszin 4 potenciális fiziológiás és patológiás szerepe extrapankreatikus szövetekben Az extrapankreatikus humán tripszin 4 agonistája lehet egyes proteáz-aktivált receptoroknak. A PAR család egy olyan G-protein kapcsolt receptor család, melyek szerin proteázok általi hasítást követően aktiválnak jelátviteli útvonalakat (Macfarlane és mtsi. 2001; Ossovskaya és Bunnett 2004). A receptorhoz „kipányvázott” ligand domének a hasítás révén válnak kitetté és a hasított receptorhoz kötődnek, ami ezáltal aktiválódik. A PAR-ok szerepet játszanak a hemosztázis szabályozásában, gyulladási és gyógyulási folyamatokban. Epitheliális sejtekben a humán tripszin 4 szubsztrátjaként azonosították a PAR-2-őt és a PAR-4-et (Cottrell és mtsi. 2004). Később ezeket az eredményeket kétségbe vonták, és kimutatták, hogy a PAR-1-et képes aktiválni a humán tripszin 4 az agyban (Grishina és mtsi. 2005; Wang és mtsi. 2006). A hasítási helyen túl a proteáz és a receptor közötti egyéb kölcsönhatások is befolyásolják, hogy a humán 35
tripszin 4 aktivál-e egy adott PAR izoformát. Továbbá a PAR-ok faj- és szövetspecifikus glikozilációja szintén megváltoztathatja az aktiválási tulajdonságokat, ami magyarázhatja a közölt ellentmondó adatokat. Tisztázatlan továbbá, hogy a humán tripszin 4 szekretált izoformája expresszálódik-e extrapankreatikus szövetekben, illetve a valószínűleg intracelluláris humán tripszinogén 4 A és B izoformájának tulajdonságai még ennél is homályosabbak. A humán tripszin 4-ről nemrég munkacsoportunk leírta, hogy az enzim in vitro szelektíven processzálja az Arg79-Thr80 és Arg97-Thr98 peptidkötéseknél a mielin bázikus fehérjét, amely a legnagyobb mennyiségben előforduló membránfehérje a központi idegrendszerben (Medveczky és mtsi. 2006). Az enzim proteolítikus hasítása során egy olyan peptidfragmens keletkezik, mely magába foglalja azt a szekvenciát, melyet a sclerosis multiplexben szenvedő betegekből izolálható fő ellenanyagok felismernek. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a humán tripszin 4 egyike lehet ezen neurodegeneratív betegség pathomechanizmusában potenciálisan részt vevő proteázoknak. A humán tripszinogén 4 transzgenikus expressziója egér agyi neuronokban a GFAP megnövekedett termelését okozta az asztrocitákban, utalva ezen sejtek megnövekedett aktivációjára, amely jelenség általában megfigyelhető Alzheimer kórban és egyéb típusú agyi sérüléseknél (Minn és mtsi. 1998). A transzgén egerekben azonban neurodegenerációra utaló jeleket nem találtak. Megfigyelték viszont a β-amiloid intracelluláris szintjének megnövekedését, bár extracelluláris lerakódásokat vagy plakkokat nem tudtak kimutatni. Ezen megfigyelés jelentősége még nem tisztázott. Tumor eredetű epitheliális sejtvonalak mellett (Cottrell és mtsi. 2004) a humán tripszinogén 4 mRNS-ét kimutatták nyelőcső squamosa sejtes karcinómákban és gyomor adenómákban is, és korrelációt találtak a PRSS3 gén promóter hipermetiláció általi downregulációja és a magasabb fokú tumor invázió között (Yamashita és mtsi. 2003). Ezekből az eredményekből arra következtettek, hogy a tripszinnek ezekben a sejtvonalakban tumor-szuppresszív szerepe van. Ezzel szemben, nem-kissejtes tüdőrák esetében kimutatták, hogy a kalcium-függő válaszban sokféle szerepet betöltő kalciumkötő S100-as fehérjék és a humán tripszinogén 4 expressziója asszociált a metasztázissal: e fehérjék túltermelése fokozta a tumoros sejtek transzepitheliális migrációját (Diederichs és mtsi. 2004).
36
2. CÉLKITŰZÉSEK Doktori munkám során számos izgalmas, a humán tripszin 4-el kapcsolatos kérdésre kerestem választ, melyek a gén alternatív izoformáinak transzkripciójával, a különböző izoformák membránkötő képességével, illetve az enzim aktivációja és működése
során
termodinamikai
bekövetkező
tulajdonságaival
szerkezeti
átrendeződések
kapcsolatosak.
Munkám
gyorskinetikai öt
fő
kérdés
és köré
csoportosítható. (I) A humán tripszinogén 4 gén transzkripciójának vizsgálatával célom az volt, hogy meghatározzam, mely izoformák kerülnek transzkripcióra humán agyszövetben, illetve célom volt az mRNS 5’ végi szekvenciájának elemzése is 5’ RACE PCR technikával. (II) Célul tűztem ki a humán tripszinogén 4 A és B izoformájának klónozását és heterológ
rendszerben
történő
expresszióját.
Ezen
izoformák
különlegességét
nem-konvencionális, a szekréciós szignálszekvenciáktól eltérő karakterű N-terminális peptidjük
adja.
Mivel
a
fehérjék
N-terminális
szekvenciái
sok
esetben
membránhorgonyzó funkciót töltenek be, megvizsgáltam, mutat-e a humán tripszinogén 4 A és B izoformája affinitást biológiai membránok felé. (III)
Célom
volt
a
humán
tripszinogén
4
mRNS-ének
mennyiségi
meghatározására alkalmas real-time PCR módszer beállítása, a reakciókörülmények optimalizálása, hogy meghatározhassam a transzkriptum relatív mennyiségét különböző humán agyi területekről származó szövetmintákban. Az mRNS regionális eloszlása a humán agyban információval szolgálhat a fehérje központi idegrendszerben betöltött további szerepéről. (IV) Bár a humán tripszin 4 széleskörűen karakterizált és számos szempontból vizsgált enzim, a konzervált Gly193 argininre való cseréjének termodinamikai következményei a szubsztráthidrolízis során jelenleg nem ismertek. Doktori munkám ezen részének célja az volt, hogy azonosítsam azokat az enzimatikus lépéseket, amelyeket befolyásol a Gly193Arg mutáció a humán tripszin 4-ben. Továbbá fényt próbáltunk deríteni a vad típusú és az R193G mutáns humán tripszin 4 szubsztráthidrolízisének termodinamikája közti különbségekre. Ebből a célból expresszáltam a vad típusú, illetve az R193G mutáns humán tripszin 4-et és tanulmányoztam a reakciójukat 4-metilumbelliferil 4-guanidinobenzoát (MUGB)
37
fluorogén szubsztrát analógon stopped flow készüléket használva. Ez a szubsztrát azért alkalmas a munkához, mert ismert, hogy a dezacilezés a MUGB esetén lassabb, mint az acilezés,
és
az
meghatározásához
egyes
reakciólépések
előfeltétel,
hogy
az
sebességi utolsó
állandóinak reakciólépés
egyértelmű legyen
a
sebesség-meghatározó. (V) Doktori munkámnak további célja volt, hogy tanulmányozzam a 193-as pozícióban elhelyezkedő csukló régiót érintő pontmutációk hatását az aktiváció során bekövetkező konformációváltozás sebességére, és karakterizáljam ennek a szerkezeti átrendeződésnek a termodinamikáját. A szerin proteázok aktivációs doménjének átrendeződése az aktiváció során egy pH-ugrással kiváltható, egylépéses elsőrendű átmenet, melyet a fehérjében belső jelváltozás kísér, ami egy elegáns kísérleti megközelítést nyújt a konformációs átmenet vizsgálatához. Expresszáltam a vad típusú és az R193G/A/Y/F mutáns humán tripszin 4-et és követtem az aktiváció során történő konformációváltozásukat a hőmérséklet és az oldat viszkozitásának függvényében pH-ugrásos stopped flow kísérletekben a belső fluoreszcenciaváltozást detektálva.
3. AZ ALKALMAZOTT MÓDSZEREK ELMÉLETI HÁTTERE 3.1 5’ RACE PCR A RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) PCR technika alkalmas mRNS templátról egy meghatározott belső hely és az mRNS 5’ illetve 3’ végi ismeretlen szekvenciája közti nukleinsav szekvenciák amplifikálására (Frohman és mtsi. 1988). Ezt a technikát, melyben csak az egyik oligonukleotid gén-specifikus, „egy-oldalú”, illetve „horgonyzott” PCR-nek is nevezik. Általában egy komplex keverékben lévő kisszámú célmolekula PCR amplifikálásához két szekvencia-specifikus primer szükséges, amelyek a sokszorozandó szekvenciát határolják. Ismeretlen szekvenciák amplifikálása esetén a megoldást az 5’ illetve 3’ RACE technikák jelentik. Az 5’ RACE egy olyan technika, amely lehetővé teszi 5’ végek izolálását és karakterizálását alacsony kópiaszámú mRNS-ekről (6. ábra).
38
6. ábra Az 5’ RACE folyamatának áttekintése
A technikáról több összefoglaló cikket is publikáltak (Frohman 1990; Frohman 1993). Ennél a technikánál a cDNS első szálának szintézise egy génspecifikus antiszensz primerrel (GSP1) történik. Ezáltal a specifikus mRNS vagy rokon mRNS-ek cDNS-sé írhatók át. A cDNS szintézist követően az egyszálú termék mellől el kell távolítani a szintéziskor be nem épített dNTP-ket és GSP1 oligonukleotidokat. Ezután terminális dezoxinukleotidil transzferáz enzimmel a cDNS 3’ végére homopolimer farkat szintetizálunk. A „farkazott” cDNS ezután PCR reakcióval sokszorozható egy „fészkelt” (nested) génspecifkus primerrel (GSP2), mely egy, a GSP1-től 3’ irányban lévő hellyel komplementer, illetve a homopolimer farokra komplementer szekvenciát tartalmazó „horgony” oligonukleotiddal. Ezáltal lehetővé válik a GSP2 és az mRNS 5’ vége közé eső ismeretlen szekvenciák amplifikálása. A kapott 5’ RACE PCR termék megfelelő vektorba ligálható karakterizálás céljából, amely lehet szekvenálás, restrikciós térképezés, próbák szintézise vagy in vitro RNS szintézis. A RACE termékek
39
karakterizálása sokszor megkívánja a specificitás megerősítését. Ez elvégezhető további PCR reakciók futtatásával, a horgonyzó primerre anelláló oligonukleotidok (ld. az ábrán AUAP, Abridged Universal Amplification Primer, az 5’ RACE PCR során a reamplifikáláshoz
használható
rövidített
horgonyzó
primer;
UAP,
Universal
Amplification Primer, az 5’ RACE PCR során a reamplifikáláshoz használható általános horgonyzó primer) és egyéb „fészkelt” génspecifikus oligonukleotidok segítségével. A „fészkelt” PCR reakciókat alkalmazni lehet a klónozáskor a PCR termék feldúsítása érdekében is. Az optimális eredmény eléréséhez legfontosabb lépések az RNS izolálása, a primerek tervezése és az amplifikáció körülményeinek meghatározása. A homopolimer primerek olvadási hőmérséklete magasabb (poli(dG) vagy poli(dC) esetén) vagy alacsonyabb (poli(dA), illetve poli(dT) esetén), mint egy tipikus génspecifikus primeré. Specificitásuk is alacsony, ami belső szekvenciákhoz való párosodást okozhat. Ezen problémák megoldására az alkalmazott 5’ RACE rendszerben az AAP (Abridged Anchor Primer, az 5’ RACE PCR-hez használt rövidített horgonyzó primer) primer a poli(dG) szakaszában dezoxiinozin nukleotidokat tartalmaz (ld. Függelék). A dezoxiinozin bázispárosodásra képes mind a négy bázissal, bár eltérő affinitással. A dezoxiinozin bázisok 3’ végen való szelektív elhelyezésének következtében az AAP olvadási hőmérséklete (66,6 °C) hasonló lesz egy tipikus húsztagú, 50% GC tartalmú primer olvadáspontjához (Rychlik és Rhoads 1989). Ez maximalizálja az anellálást az oligo-dC farokhoz, minimalizálja a félre-anellálást belső C-gazdag régiókhoz a cDNS-ben, és kiegyenlített olvadási hőmérsékletet biztosít a horgony régió és a génspecifikus primer között, ami szükséges a hatékony PCR reakcióhoz.
3.2 A tradicionális és a real-time kvantitatív PCR összehasonlítása Hagyományos PCR reakciók esetében a keletkezett terméket a reakció lezajlása után detektáljuk. A reakcióelegy agaróz gélen történő megfuttatását és a gél (általában etídium bromiddal történő) megfestését követően tehát végpontdetektálás történik. Az eredmény értékelése méret apján történő elválasztáson alapszik, aminek kicsi a pontossága. A módszer felbontóképessége alacsony, a kimutatás érzékenysége szintén alacsony, dinamikus tartománya (az a tartomány, amin belül a termék mennyisége és a detektált jel intenzitása egyenes arányosságban áll egymással) igen szűk (<2 log). 40
Mindezeken felül a módszer nem automatizálható, és az etídium bromiddal történő festés nem kvantitatív. A végpontdetektálással nyert adatokból mennyiségi információ csak korlátozottan nyerhető, aminek megértéséhez szükséges a PCR egyes fázisainak főbb jellemzőit áttekintenünk. Egy átlagos PCR reakció három fázisra bontható: az exponenciális, a lineáris és a plató fázisra. Az exponenciális fázis során minden ciklusban a termék mennyisége megkétszereződik, az amplifikálás hatásfoka 100%. A reakció nagyon specifikus és pontos. A lineáris fázisban (avagy a nagy variabilitású fázisban) a reakció komponensei fogynak, a reakció lassul és a termékek degradálódni kezdenek. A komponensek fogyása
reakcióelegyenként
más
és
más
lesz,
így
az
azonos
kiindulási
templátmennyiségű párhuzamos mintákban a keletkező termék mennyisége kezd eltérni egymástól. A plató fázisban (végpont, amelyben a tradicionális PCR során a detektálás történik) a reakció leáll, nem keletkeznek újabb termékek, és ha kellő ideig hagyjuk a reakcióelegyet állni, a termékek degradálódnak is. Mindezek eredményeképpen a végpontban a párhuzamos minták jelentősen eltérnek egymástól. Kvantitatív információ tehát csak akkor nyerhető, ha a reakció exponenciális fázisában detektálunk, ahol a párhuzamos mintákban a termékek mennyisége közel azonos. Real-time PCR esetében a termék keletkezését folyamatosan detektáljuk a reakció során. Az adatokat ezután az exponenciális fázis elemzésével kapjuk. A detektálási stratégia többféle is lehet. Munkám során a SYBR Green I festéket használtam a detektáláshoz, mely a kettős szálú DNS kisárkához köt, és ekkor megnő fluoreszcencia emissziójának intenzitása. A mért jel intenzitása az exponenciális fázisban egyenesen arányos a keletkezett PCR termék mennyiségével, és a dinamikus tartomány jóval szélesebb, mint az etídium bromiddal való kimutatás esetén. Ezen detektálási mód hátránya, hogy szekvenciától függetlenül a festék minden kettős szálú DNS-hez köt, így a reakció specificitását a detektált fluoreszcens jel közvetlenül nem bizonyítja. Ennek ellenőrzésére a reakció lezajlása után a reakcióelegy felfűthető, miközben folyamatosan detektáljuk a fluoreszcencia intenzitását. A fluoreszcencia intenzitás hirtelen csökkenése a DNS két szálának hő hatására történő szétválását jelzi. A hőmérséklet függvényében ábrázolva a mért fluoreszcencia negatív első deriváltját megkapjuk a DNS olvadási görbéjét (-dF/dT vs. T), melynek csúcsa megadja a PCR termék olvadási hőmérsékletét (Ririe és mtsi. 1997), a görbe alatti terület pedig arányos a termék mennyiségével. Specifikus reakció esetén egyetlen olvadási hőmérsékletet
41
kapunk. A PCR termék vektorba ligálható, és szekvenálásával a reakció specificitása egyértelműen igazolható.
3.3
Steady
state
és
tranziens
(pre-steady
state)
kinetika
összehasonlítása Mikor egy enzimet nagy feleslegű szubsztráttal keverünk össze, a reakciónak lesz egy kezdeti szakasza, a pre-steady state, amely alatt az enzim-kötött intermedierek koncentrációja beáll a steady state értékre. Definíció szerint a steady state a reakció azon szakasza, melyben az enzim-kötött intermedierek (enzim-szubsztrát komplex) keletkezésének és elbomlásának sebessége azonos, tehát az enzim-kötött intermedierek (enzim-szubsztrát komplex) koncentrációja időben állandó. Tradicionálisan a reakciók sebességét a steady state alatt szokták mérni. A steady state kinetikai mérések általánosan alkalmazottak, de közvetett módszerek, mellyel információt kaphatunk az adott enzim katalitikus konstansáról (kcat) és Michaelis konstansáról (Km), melyek hányadosából számolható az enzim katalitikus hatékonysága (kcat/Km). Ez igen fontos információ az enzim működéséről. Steady state kinetikai mérési módszerekkel is lehetséges intermedierek detektálása, vagy akár egyedi sebességi állandók mérése, de ezek nem általánosan alkalmazható módszerek, és függenek a mechanisztikus interpretációtól. Ilyen módszer például a steady state kinetikával mért enzimreakció egyes lépéseinek szelektív megváltoztatása bizonyos reagensek segítségével (Berezin és mtsi. 1971). Az egyedi reakciólépések sebességi állandójának méréséhez és tranziens intermedierek detektálásához azt a sebességet kell mérnünk, amivel a rendszer eléri a steady state-et (Fersht 1985). Az egyedi sebességi állandókat a reakció azon szakaszában lehet mérni, amelyben a steady state kialakul. A pre-steady state kinetika a reakció korai fázisa során a tranziens enzim-kötött speciesek keletkezésének és elbomlásának detektálásával és elemzésével foglalkozik. A megfigyelt folyamat általában egy enzim species egy másik állapotba való átmenetének elsőrendű sebessége. Ezek időgörbéje általában exponenciális, szemben a steady state lineáris ábrázolásaival. A pre-steady state eseményei alatt az enzim egyetlen turnoveren megy keresztül, míg a steady state alatt többszörös turnover történik. Steady state kinetikai méréssel a reakciómechanizmusra az egyes reakciókomponensek (enzim, szubsztrát, termék) 42
steady state-beli koncentrációjának egymáshoz képesti arányából lehet következtetni. Ezzel szemben, a tranziens kinetikában az egyes komponensek koncentrációjának időbeli
változásából
következtetünk
a
reakció
mechanizmusára.
Mivel
az
enzimreakciókban az egyedi lépések sebességi állandójának értéke általában 1 és 107 s-1 közötti, a pre-steady state méréseket az 1-10-7 s időtartományban kell végezni. Gyorskeveréses technikákkal az enzim és a szubsztrát (vagy egyéb reaktáns) a milliszekundum törtrésze alatt összekeverhető egymással (az enzimek többségének turnover száma kisebb 1000 s-1-nél). Az egyik gyorskeveréses módszer az általam is alkalmazott stopped flow (megállított áramlásos) technika.
43
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1 5’ RACE PCR Az 5’ RACE PCR-hez a totál RNS-t 30-100 mg agyszövet mintákból izoláltam TRI-reagenssel (Sigma), a gyártó leírása szerint. Az RNS csapadékot 20 µl DEPCkezelt nukleázmentes desztillált vízben (Fermentas) oldottam fel és 20 egység RNáz inhibitort (Fermentas) adtam a mintákhoz. A cDNS első szálát génspecifikus primer (GSP1) segítségével szintetizáltam (Az Anyagok és módszerek című fejezetben szereplő oligonukleotidok szekvenciáját lásd a Függelék című fejezetben). 20 pikomól GSP1-et anelláltattam 6 µg totál RNS-hez 70 °C-on való 5 perces inkubálást követő jégen való hűtéssel. A reverz transzkripciót RT puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM DTT végkoncentrációk), 20 egység RNáz inhibitor, 1 mM dNTP keverék és 200 egység egér leukémia vírus reverz transzkriptáz (RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas) hozzáadásával végeztem 20 µl végtérfogatban. A keveréket 37 °C-on 5 percig, végül 42 °C-on 60 percig inkubáltam. A reakciót 70 °C-on való 10 perces inkubálással állítottam le. A szintetizált cDNS-t szilika oszlopon (PCR-M Kit, Viogene) tisztítottam, hogy eltávolítsam a felesleges, be nem épült nukleotidokat, illetve GSP1-et, majd homopolimer farkat szintetizáltam hozzá, hogy kötőhelyet állítsak elő a rövidített horgonyzó primer (Abridged Anchor Primer, AAP) számára a cDNS 3’ végén. 0,25 mM 2’-dezoxicitidin 5’-trifoszfátot (dCTP) adtam TdT pufferben 10 µl cDNS-hez, 3 percet 95 °C-on inkubáltam, majd lehűtöttem jégen, és 20 egység terminális dezoxinukleotidil transzferázt (TdT) (Fermentas) adtam hozzá. A reakciót 37 °C-on 10 percig hagytam zajlani, majd 70 °C-on történő 10 perces inkubálással állítottam le. Az így előállított “C-farkazott” cDNS-t PCR reakcióban amplifikáltam a rövidített horgonyzó primerrel (AAP, 5’RACE System, Gibco BRL) és egy “fészkelt” génspecifikus primerrel (GSP2). A PCR reakcióhoz Taq polimeráz enzimet és a következő hőprofilt alkalmaztam: 3 perc 95 °C, majd 35 ciklus 45 másodperc 95 °C, 45 másodperc 55 °C és 60 másodperc 72 °C.
A
kapott
PCR
terméket
standard
protokollok alapján végzett agaróz
gélelektroforézissel (Sambrook (szerk.) 1989) 1%-os agaróz gélen futtattam meg, gélből
44
izoláltam, majd pBluescript II KS-T vektorba klónoztam TA-ligálással. A klónokat a BigDye 3.0 szekvenáló kit (Applied Biosystems) segítségével szekvenáltam. A pBluescript II KS-T vektor előállításához a pBluescript II KS vektort tompa végeket generáló restrikciós endonukleázzal, az EcoRV-tel (Fermentas) nyitottam fel, majd a linearizált vektort 2,5 térfogat abszolút etanollal való kicsapással tisztítottam. A linearizált vektor 5’ végeire az egybázisos túlnyúló timidint 20 egységnyi terminális dezoxinukleotidil transzferázzal (Fermentas) szintetizáltam ~1,5 µg felnyitott vektor, 200 mM kálium kakodilát, 25 mM Tris, pH 7,2, 0,01% (v/v) Triton X-100, 1 mM CoCl2, 0,33 mM ddTTP (Fermentas) összetételű reakcióban 30 °C-on való 30 perces inkubálással. A reakcióelegyet 1%-os agaróz gélen futtattam, majd a nagy fragmenst gélből izoláltam, megkapva a pBluescript II KS-T vektort.
4.2 Real-time kvantitatív PCR
4.2.1 Totál RNS izolálása agyszövetből A különböző agyterületekről „punch” technikával izolált agymintákat Prof. Palkovits Miklós (Semmelweis Orvostudományi Egyetem, Anatómia tanszék, Neuromorfológiai Laboratórium) bocsátotta rendelkezésemre. A mintákat az RNS preparálásig -80 °C-on tároltam. A totál RNS-t 30-100 mg szövetmintából izoláltam TRI reagenssel (Sigma) a gyártó utasításai szerint. Az RNS csapadékot 20 µl DEPCkezelt nukleáz-mentes desztillált vízbe (Fermentas) oldottam vissza, és 20 egység RNáz inhibitort (Fermentas) adtam a mintákhoz, hogy minimalizáljam az RNS degradációt. Az RNS mintákat azonnal felhasználtam cDNS szintéziséhez.
4.2.2 cDNS szintézis A cDNS első szálát random hexamer primer segítségével szintetizáltam 5 µl RNS mintát használva templátként. A reverz transzkripciót 20 µl végtérfogatban végeztem. 0,2 µg random hexamer primert anelláltattam az RNS templáthoz 12 µl térfogatban 70 °C-on való 5 perces inkubálással majd a minta 4 °C-ra való lehűtésével.
45
A reverz transzkripciót RT puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM DTT végkoncentrációk), 20 egység RNáz inhibitor, 1 mM dNTP keverék és 200 egység RevertAid
TM
H Minus egér leukémia vírus reverz transzkriptáz
hozzáadásával végeztem (RevertAid
TM
H Minus First Strés cDNA Synthesis Kit,
Fermentas). A reakcióelegyet a random hexamer primer relatíve gyenge kötődése miatt először 10 percet inkubáltam 25 °C-on, majd a primerek enzim általi meghosszabbítása után 60 percet inkubáltam 42 °C-on. A reakciót 70 °C-on való 10 perces inkubálással állítottam le. A szintetizált cDNS mintákat -80 °C-on tároltam a real-time PCR elvégzéséig, amit általában 24 órán belül elvégeztem. Egy adott kísérlethez használt RNS mintákat általában egyszerre írtam át cDNS-re, hogy minimalizáljam a reverz transzkripcióval asszociált varianciát a minták között. Mivel az RT pufferben lévő DTT interferál a SYBR Green festék DNS-hez való kötődésével, illetve a fluoreszcenciával (Lekanne Deprez és mtsi. 2002), a cDNS mintákat úgy mértem be a PCR reakcióba, hogy a DTT maximális koncentrációja a reakcióelegyben 100 µM legyen.
4.2.3 Külső standardok előállítása A humán agyból preparált cDNS-ről amplifikáltam a humán tripszinogén 4 és a humán β-aktin kódoló szekvenciáinak szegmenseit Taq polimerázzal a hTry4_F, hTry4_R, hβAct_F, hβAct_R oligonukleotidok segítségével. A kapott PCR termékeket TA ligálással pBluescript II KS-T vektorba klónoztam. Egyszálú RNS szintézise céljából a templát hTry4-fragmens-pBluescript plazmidot SacI, az aktin-fragmens-pBluescript plazmidot pedig HindIII restrikciós endonukleázzal linearizáltam. 0,5 µg felnyitott plazmidról in vitro transzkripciós reakciót végeztem 50 µl végtérfogatban transzkripciós puffer (40 mM Tris-HCl, pH 7,9, 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 10 mM NaCl és 2 mM spermidin), 2 mM dNTP keverék, 50 egység RNáz inhibitor és az inzert irányultságától függően 30 egység T7, illetve T3 RNS polimeráz (Fermentas) hozzáadásával. A reakcióelegyet 2 órán át inkubáltam 37 °C-on, majd 1 egység RNáz-mentes DNázI-et (Fermentas) adtam hozzá, amellyel 37 °C-on 30 percig inkubáltam a mintát, hogy degradálja a templát DNS-t. A standard RNS oldatokat RNS kötő oszlopra vittem fel (Total RNA Mini Kit, Viogene), hogy eltávolítsam a be nem épült nukleotidokat és a DNázI-et, majd 50 µl DEPC kezelt desztillált vízzel (Fermentas) eluáltam. 20 egység RNáz inhibitor hozzáadását követően 46
a mintákat -80 °C-on tároltam. A tisztított RNS standardok koncentrációját az optikai denzitás 260 nm-en való mérésével az OD260 1 = 40 µg/ml összefüggés segítségével határoztam meg. A 0,225 ng aktin fragmens illetve 0,675 ng humán tripszinogén 4 fragmens
RNS
felhasználásával
szintetizált
cDNS-eket
használtam
standard
törzsoldatokként a real-time PCR kísérletekhez.
4.2.4 Primer tervezés A real-time PCR reakcióhoz használt oligonukletidokat a Primer Express v2.0 (Applied Biosystems) programmal terveztem GenBank szekvenciák alapján (humán tripszinogén 4: X71345, humán β-aktin: V01217). A primereket a program az alábbi kritériumok szerint szelektálja: az optimális primer 20 bázis hosszúságú, GC tartalma 30-80%, olvadási hőmérséklete 58-60 °C, nem tartalmaz azonos bázisból álló sorozatot és a 3’ végi öt nukleotid között nincs kettőnél több G és vagy C. Az 5’ oligonukleotidok egyaránt exon-exon határokat átfedve anellálnak a templátra, hogy a genomi DNS szennyeződésről amplifikálás ne történhessen. A valósidejű PCR reakcióhoz a hTry4_RT_F,
hTry4_RT_R,
hβAct_RT_F,
hβAct_RT_R
oligonukleotidokat
használtam. Az amplikon mérete a humán tripszinogén 4 esetében 154 bázispár, a humán β-aktin esetén pedig 163 bázispár. A kiválasztott primerek negatívak voltak a másodlagos szerkezeti és a primer dimer képződési tesztben. A primerekből steril TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) oldattal 100 µM-os koncentrációjú törzsoldatokat készítettem, a PCR reakcióhoz tovább higítottam 1,25 µM-os koncentrációjúra, és -20 °C-on tároltam. A primerek specificitását a PCR termék olvadási görbéjének analízisével, illetve néhány PCR termék klónozásával és szekvenálásával igazoltam.
4.2.5 Real-time kvantitatív PCR A real-time kvantitatív PCR reakciókat ABI Prism Sequence Detection System 7000 (Applied Biosystems) készülékkel végeztem SYBR™ Green I kettősszálú DNShez kötő fluoreszcens festéket használva a detektáláshoz. Minden mintát három párhuzamos reakcióban futtattam, melyek 2,5 µl cDNS templátot, 12,5 µl SYBR™
47
Green reakció keveréket (SYBR™ Green Master Mix, Applied Biosystems), 50 nM humán tripszinogén 4, illetve humán β-aktin-specifikus oligonukleotidot tartalmaztak 25 µl reakció-térfogatban. A kétlépcsős PCR reakció hőprofilja a következő volt: 95 °C 10 perc a kémiailag módosított DNS polimeráz aktiválásához, majd 40 ciklus 95 °C 15 másodperc és 60 °C 1 perc. Minden reakcióra meghatároztuk az amplifikálási küszöbértéket (threshold cycle, Ct érték), amely definíció szerint az a PCR ciklusszám, amelynél a ∆Rn (normalizált riporter változás) átlépi a fluoreszcens jel küszöböt. A méréshez használt reagens tartalmaz egy passzív referenciaként használt fluoreszcens festéket is, a ROX-ot. A PCR reakció folyamán a készülék folyamatosan detektálja mindkét festék fluoreszcenciájának intenzitását. Az adatok analízise során a program a riporter festék, a SYBR Green fluoreszcencia intenzitását automatikusan normálja a passzív referencia festék fluoreszcencia intenzitásával, ezáltal korrigálhatóak az adatok a koncentráció, illetve térfogatbeli eltérésekre nézve. Ez a normalizált riporter (Rn) érték. A kiértékelés során a normalizált riporter változás (∆Rn) adatokat használjuk, mely az adott PCR körülmények között generált jel nagysága, ami a templátot is tartalmazó reakció Rn +
-
értékének (Rn ) és a templátot nem tartalmazó reakció Rn értékének (Rn ) a különbsége +
-
-
(∆Rn = (Rn ) – (Rn ). Az Rn értéket megadja a reakció korai ciklusainak (általában az 1-15. ciklus) Rn értéke is, ahol detektálható fluoreszcencia intenzitás növekedés még nem történik. A mért jel tehát a normalizált fluoreszcencia változás (∆Rn) a ciklusszám függvényében. A Ct értékeket a standard görbék segítségével intrapolálással RNS mennyiségre számoltam át. Az utolsó PCR ciklust követően felvettem az olvadási görbéket, hogy igazoljam, hogy az amplifikáció során keletkezett PCR termék homogén.
4.3 A humán tripszinogén 4 A és B izoformájának klónozása és expressziója A humán tripszinogén 4 szekréciós peptiddel rendelkező izoformája humán hasnyálmirigy cDNS könyvtárból klónozva a rendelkezésemre állt pET-17c vektorban. A klónozás folyamata és a konstrukció részletes leírása megtalálható Katona Gergely és munkatársai munkájában (Katona és mtsi. 2002a). A termelt fehérje N-terminális
48
aminosavai a proteáz domén határáig a következők: MSTQAFPVDDDDK. Ez nem azonos
a
C
izoforma
(FLILAFVGAAVAVPFDDDDK),
természetes de
karakterében
aktivációs
peptidjével
ez
szekréciós
is
egy
szignálszekvenciának felel meg (az AFPVDDDDK a patkány tripszinogén 2 propeptid szekvenciája). A továbbiakban ezt a fehérjét rekC izoformaként említem. A humán tripszinogén 4 B izoformáját humán agyi cDNS-ből klónoztam a hTry4B_F és a hTry4B_R oligonukleotidok segítségével. A PCR terméket 1%-os agaróz gélen futtattam meg, majd 2,5 térfogat jéghideg abszolút etanollal való kicsapással tisztítottam. A kicsapott PCR termékeket 70%-os alkohollal mostam, majd szárítás után 18 µl desztillált vízben oldottam fel. Mivel az amplifikáláshoz használt Pfu polimeráz tompa végeket generál, és a tompa végek ligálási hatékonysága kisebb, mint a túlnyúló végeké, a PCR termék 3’ végére egy egybázisos túlnyúló adenozint szintetizáltam Taq polimeráz segítségével. A reakcióelegy összetétele a következő volt: 18 µl visszaoldott PCR termék, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1% (v/v) Triton X-100, 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP keverék (Fermentas) és 5 egység Taq polimeráz (Zenon). A reakciót 10 percet hagytam zajlani 72 °C-on, majd a PCR termékeket 1%-os agaróz gélből való izolálással tisztítottam (Viogene Gel-M Gel Extraction System). A PCR terméket TA-ligálással az egybázisos 5’ túlnyúló timidint hordozó pBluescript II KS-T vektorba ligáltam T4 DNS ligáz enzim segítségével. A hTry4B_F és a hTry4B_R primerek egy NdeI restrikciós endonukleáz hasítóhelyet visznek be a PCR termék 5’, illetve egy BamHI helyet a 3’ végére, ami lehetővé teszi a gén szubklónozását a T7 promóterrel hajtott pET-15b E. coli expressziós vektorba (Novagen). Ez a konstrukció egy, az N-terminálisán egy hisztidin affinitás címkét hordozó fúziós fehérjét eredményez, mely trombinnal lehasítható a fehérjéről. A klónozott B izoforma szekvenciáját automata didezoxi szekvenálással ellenőriztem, a BigDye Terminator 3.0 Kit-et (ABI Prism) használva. Mivel a humán tripszinogén 4 A izoformájának megfelelő mRNS-t nem tudtam izolálni az 5’RACE technikával, ezen izoforma első exonját kódoló DNS szekvenciát genomi DNS-ről amplifikáltam a hTry4A_F és hTry4A_R oligonukleotidok segítségével, melyek az első exon 5’ illetve 3’ végére illeszkednek. A genomi DNS-t 200 µl friss teljes vérből izoláltam a GenElute™ Blood Genomic DNA Kit (Sigma) segítségével a gyártó utasításai szerint. A PCR reakciót Taq polimerázzal végeztem, ami lehetővé tette, hogy a PCR terméket TA ligálással pBluescript II KS-T vektorba klónozzam. A humán tripszinogén 4 A izoformájának első 44 aminosavát kódoló 5’ 49
szekvenciát fuzionáltattam a klónozott B izoformával, ezáltal megkaptam az A izoformát kódoló teljes hosszúságú gént. A fúziót egy természetesen előforduló AlwNI restrikciós endonukleáz felismerőhely tette lehetővé, amely az első exon 3’ végén helyezkedik el. Az 5’ primer egy NdeI restrikciós endonukleáz felismerőhelyet visz be a PCR termék 5’ végére, amit ezáltal ki lehet hasítani a pBluescript vektorból NdeI és AlwnI enzimekkel (Fermentas) történő restrikciós emésztéssel. A kapott fragmenst agaróz gélből való izolálással tisztítottam (Viogene Gel-M Gel Extraction System). A humán tripszinogén 4 B izoformáját hordozó pET-15b vektort AlwNI-gyel emésztettem, majd a keletkező 360, illetve 4000 bázispáros fragmenseket agaróz gélből izoláltam (mivel a gén kettő, a vektor pedig egy további AlwNI hasítóhelyet tartalmaz, ez az enzim három fragmensre hasítja a konstrukciót, melyek mérete 360, körülbelül 2100 és 4000 bázispár). Az izolált AlwNI-NdeI hasított első exont, a 360 bázispáros és a 4000 bázispáros fragmenst egy éjszakán keresztül ligáltam T4 DNS ligáz enzimmel (Fermentas), és az A izoformát kódoló teljes hosszúságú gént Pfu polimerázzal amplifikáltam a hTry4A_F és a hTry4B_R primerek segítségével. A PCR termék 3’ végeire Taq polimerázzal egy-egy adenozint szintetizáltattam, majd a terméket TA ligálással pBluescript II KS-T vektorba klónoztam. A primerek által bevitt NdeI és BamHI hasítóhelyek segítségével a gént pET-15b expressziós vektorba szubklónoztam, ezáltal a gén N-terminálisához fuzionáltattam egy hisztidin affinitás címkét. A klónozott A izoforma szekvenciáját automata didezoxi szekvenálással ellenőriztem.
4.4 A humán tripszinogén 4 mutánsok előállítása A humán tripszin 4 R193G és R193A mutánst Medveczky Péter, míg az R193Y és R193F mutánsokat Gombos Linda bocsátotta rendelkezésemre. Az inaktív humán tripszin 4 mutánst, melyben a katalitikus Ser195-t egy alanin helyettesíti, én állítottam elő. A mutációkat megaprimer PCR mutagenezissel vittük be a génbe a hTry4_R193G, hTry4_R193A,
hTry4_R193F,
hTry4_R193Y,
hTry4_S195A
oligonukleotidok
segítségével. A PCR reakció során templátként a klónozott humán tripszinogén 4-et használtam pET-17c vektorban. Az első PCR reakcióhoz a mutációt hordozó oligonukleotidot és a gén 3’ végére anelláló hTry4_3’primert használtam, amely egy SacI restrikciós endonukleáz hasítóhelyet visz be a termékbe. A PCR reakció összetétele a következő volt: 0,2 mM dNTP keverék, 0,2 µM mutációt hordozó primer, 50
0,2 µM hTry4_3’ primer, ~ 1 ng miniprep templát DNS, 2,5 egység Pfu polimeráz (Fermentas) 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 0,1% (v/v) Triton X-100, 0,1 mg/ml marha szérum albumin, 2 mM MgSO4 összetételű pufferben. A PCR reakció hőprofilja a következő volt: 95 °C 3 perc kezdeti hődenaturáció, majd 27 ciklus 95 °C 45 másodperc hődenaturáció, 55 °C 45 másodperc anelláció, 72 °C 30 másodperc lánchosszabbítás, az utolsó ciklust követően pedig 72 °C 3 perc. A szintetizált, mutációkat hordozó megaprimereket 2%-os agaróz gélből való izolálással tisztítottam (Viogene Gel-M Gel Extraction System), és a második PCR reakcióban primerként használtam a gén 5’ végére anelláló hTry4_5’ oligonukleotid mellett, amely egy HindIII restrikciós endonukleáz hasítóhelyet visz be a PCR termék 5’ végére. A teljes, mutáns gén amplifikálásakor a reakció összetétele (a primerek kivételével) megegyezett az első PCR összetételével. A hőprofilt annyiban módosítottam, hogy a lánchosszabbítás 72 °C-on 60 másodperc volt, tekintettel a hosszabb PCR termékre. A PCR termékeket 1%-os agaróz gélen futtattam, majd 2,5 térfogat jéghideg abszolút etanollal való kicsapással tisztítottam. A kicsapott PCR termékeket 70%-os alkohollal mostam, majd szárítás után 18 µl desztillált vízben oldottam fel. A PCR termékek 3’ végeire Taq polimerázzal egy-egy adenozint szintetizáltattam, majd a terméket TA ligálással pBluescript II KS-T vektorba klónoztam. A primerek által a gén 5’ illetve 3’ végére bevitt HindIII illetve SacI restrikciós endonukleáz hasítóhelyek felhasználásával a mutáns géneket pET-17c expressziós vektorba szubklónoztam T4 DNS ligáz enzim segítségével. Az előállított konstrukciókat E. coli DH5α törzsébe transzformáltam, majd a 2YT médiumban felnövesztett kultúrákból plazmid DNS-t alkalikus lízist követően szilikagél oszlopon tisztítottam (Viogene Mini-M Kit).
4.5 A rekombináns fehérjék előállításához használt pET E. coli expressziós rendszer működése A munkához használt rekombináns fehérjéket a pET expressziós rendszerrel állítottam elő E. coliban. A rendszerben a célgént az erős bakteriofág T7 transzkripciós és transzlációs szignál által kontrollált pET plazmidba klónozzuk. Az expresszió a gazdasejtben a T7 RNS polimeráz forrás biztosításával indukálható. A célgént hordozó pET plazmidot expressziós gazdasejtbe visszük be, amely a T7 RNS polimeráz génjét a 51
lacUV5-ös promóter kontrollja alatt hordozza a kromoszómális DNS-ében (λDE3 lizogén gazda), és az expresszió izopropil-β-D-tiogalaktopiranoziddal (IPTG) indukálható. A legáltalánosabban használt λDE3 lizogén törzs a BL21, amely deficiens a lon és az ompT proteázra nézve. A humán tripszinogén 4 rekC izoforma termeléséhez az E. coli BL21(DE3)pLysS törzsét, az A és B izoforma expresszálásához pedig a Rosetta™(DE3)pLysS (Novagen) törzset használtam a magasabb kitermelés érdekében. Ez utóbbi törzs egy kloramfenikol rezisztenciát okozó plazmidon hordoz 6 ritka kodont (AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA) felismerő tRNS génjét, ezáltal nagyobb mennyiségben képes olyan eukarióta fehérjék termelésére, amelyek ritka kodonokat tartalmaznak. A pLys plazmid a T7 lizozimet kódolja, ami természetes inhibitora a T7 RNS polimeráznak, így csökkenti az RNS polimeráz transzkripcióját a nem-indukált állapotban.
4.6 A rekombináns humán tripszinogén 4 izoformák és mutánsok expressziója, a fehérjék tisztítása és aktiválása A magnéziumklorid-kalciumklorid kezelés hatására kompetenssé tett E coli BL21(λDE3)pLysS
és
Rosetta™
(λDE3)pLysS
sejteket
hősokk
segítségével
transzformáltam a konstrukciókkal. A transzformált sejtekből 500 ml kultúrát növesztettem 37 °C-on Luria-Bertani médiumban 200 µg ampicillin mellett, amíg a 600 nm-en mért optikai denzitás értéke elérte a 0,6-et. Ekkor a sejtkultúrákat indukáltam 0,4 mM izopropil-β-D-tiogalaktopiranozid hozzáadásával, majd további 4 órán át inkubáltam őket a 37 °C-os rázótermosztátban. A sejteket centrifugálással gyűjtöttem össze (8000 RPM, 20 perc), majd 40 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA 1% Triton X-100 oldatba szuszpendáltam fel és szonikálással segítettem elő a sejtek lízisét. Az expresszált fehérjék zárványtest formájában termelődtek. A zárványtesteket háromszor mostam a fenti oldat 50 ml-ével, majd kétszer detergens nélküli pufferrel. A kapott csapadékot 4 ml 30 mM DTT, 6 M guanidin-hidroklorid, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5 és 2 mM EDTA összetételű oldatban oldottam fel, és egy órán át redukáltam 37 °C-on. A fel nem oldódó szennyeződéseket (pl. sejtfal törmelék) ultracentrifugálással távolítottam el (45000 RPM, 30 perc). A denaturált és redukált tripszinogéneket cseppenként higítottam ki 125 ml 4 °C-os, levegőtlenített renaturáló pufferbe (0,9 M guanidin hidroklorid, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5, 2 mM EDTA, 1 mM L-cisztein, és 1 mM 52
L-cisztin). Az A és a B izoforma esetén a renaturáló pufferből elhagytam az EDTA-t, hogy a továbbiakban az affinitás kromatográfiát el tudjam végezni a nikkel-oszlopon. A fehérjét tartalmazó renaturáló puffert lassan kevertettem N2 gáz alatt egy éjszakán át 4 °C-on. A tripszinogén oldatokat 2,5 mM sósavval szemben dializáltam, majd a kicsapódott fehérjéket centrifugálással távolítottam el. A humán tripszinogén 4 A és B izoformáját az N-terminális hisztidin címke segítségével nikkel-nitrilotriecetsav oszlopon tisztítottam natív körülmények között (NiNTA His-Bind Superflow oszlop, Novagen) a gyártó utasításai szerint. A fehérjéket imidazollal eluáltam az oszlopról. Szükség szerint a zimogéneket átdializáltam 2,5 mM sósavba. A hisztidin affinitás címkét a célfehérjéhez milligrammonként 0,5 egység trombint adva (Thrombin Cleavage Capture Kit, Novagen) 20 mM Tris-HCl, pH 8,4, 150 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2 összetételű pufferben hasítottam le szobahőmérsékleten 2 órán át való inkubálással. A zimogének koncentrációját a 280 nm-en mért elnyelésük alapján számoltam az elvi moláris extinkciós koefficiensek segítségével (A izoforma: ε280 = 52785 M-1cm-1, B izoforma: ε280 = 47035 M-1cm-1, rekC izoforma és 193-as pozícióban mutáns variánsai: ε280 = 41535 M-1cm-1). A zimogének korrekt térszerkezetének kialakulását redukáló és nem redukáló közegben végzett 15%-os SDS poliakrilamid gélelektroforézissel (Laemmli 1970) ellenőriztem. A tripszinogéneket 1:1000 moláris arányban hozzáadott sertés enterokinázzal (Sigma) aktiváltam 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2 pufferben 37 °C-on 1 órán át, affinitás kromatográfiával tisztítottam benzamidin-Sepharose oszlopon majd 10 mM sósavval eluáltam. A fehérjét tartalmazó frakciókat egyesítettem, ultraszűréssel töményítettem, és aliquotokban -20 °C-on tároltam. A pH-ugrásos kísérletekhez az enzimeket 500 térfogatnyi hideg 2,5 mM sósavval szemben dializáltam egy éjszakán át. A fehérjék koncentrációját MUGB-al történő aktívhely titrálással (Jameson és mtsi. 1973), illetve a 280 nm-en mért elnyelésük alapján számoltam az ε280 = 41535 M-1cm-1 elvi moláris extinkciós koefficiens segítségével. A preparátumok tisztaságát 15% SDS poliakrilamid gélelektroforézissel ellenőriztem (Laemmli 1970).
4.7 Membránkötési kísérletek A humán tripszinogén 4 A, B, illetve rekC izoformájának membránkötő képességét precipitációs kísérletekkel vizsgáltam. A preparált membránfrakciókat 53
Énekes Vilmosné bocsátotta rendelkezésemre. A membránfrakció preparálásához egy kb. 2 g súlyú patkányagyat elhomogenizált 4 ml 35 mM Tris-HCl, pH 7,2-7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10,2% (m/m%) szacharóz pufferben. A puffer tartalmazott 50 µg/ml fenilmetilszulfonil fluorid, 2 µg/ml benzamidin, 2 µg/ml cisztatin, 2 µg/ml aprotinin összetételű inhibitorkoktélt is. A szövethomogenizátum térfogatát kiegészítette a fenti pufferrel 10 ml-re, majd 600 g-vel 10 percet centrifugálta. A kapott felülúszót tovább centrifugálta 7500 g-vel 10 percet, majd ezt a lépést megismételte. A kapott felülúszót 100000 g-vel centrifugálta 45 percet. Az így megkapott csapadék a mikroszóma frakció, amely tartalmazza a plazmamembránt, a Golgi apparátust, a sima és a durva ER-t. Ez a membránfrakció tovább frakcionálható sűrűséggradiens centrifugálással. Ebből a célból a kapott mikroszóma csapadékot 3-5 térfogat homogenizáló pufferben szuszpendálta fel, majd centrifugacsőben alárétegzett 4-4 ml 45, 40, 35, 30 és 25% szacharózt tartalmazó puffert. A mintát a cukorgradiensen 16 órán át fugálta 100000 g-vel, majd a szétvált membránfrakciókat külön centrifugacsövekbe szedte, és a megfelelő koncentrációjú szacharózt tartalmazó pufferrel, majd ezután 25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl oldattal mosta. Az így kapott 25%-os szacharózt tartalmazó frakcióban található az izolált plazmamembrán. Membránkötési kísérleteimet a mikroszóma frakcióval, illetve az ebből tovább frakcionált plazmamembrán preparátummal végeztem, mivel ELISA mérések (ld. 1.9.7 fejezet) alapján ezek a frakciók tartalmaztak endogén módon humán tripszinogén 4-et. 50-100 µl izolált mikroszóma illetve plazmamembrán frakcióhoz 3-25 µg rekombináns humán tripszinogén 4 A, B illetve rekC izoforma fehérjét adtam 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 pufferben. A fehérje kontroll mintákban a membrán frakciót desztillált víz helyettesítette, a mikroszóma kontroll mintába pedig a rekombináns fehérje helyett desztillált vizet tettem. A mintákat 1,5 órán át inkubáltam 37 °C-on, majd 55000 RPM-el centrifugáltam 1 órán át. A csapadékban megkapott membrán frakciót 15 µl desztillált vízben szuszpendáltam fel, majd nem-redukáló SDS-mintapufferrel (125 mM Tris-HCl, pH 6,5, 20% glicerin, 2% SDS, 0,01% brómfenolkék) kezeltem. A felülúszóból a fehérjéket egynegyed térfogat 100%-os triklórecetsavval kicsaptam, a csapadékot kétszer mostam acetonnal, szárítás után 15 µl desztillált vízbe oldottam vissza, majd nem-redukáló SDS-mintapufferrel kezeltem. Hogy megvizsgáljam, nagy ionerejű oldattal eluálhatók-e a megkötődött fehérjék a membránokról, a csapadékot 1 mintatérfogat 0,1 illetve 1 M NaCl oldatban szuszpendáltam fel, majd a fentiekhez hasonlóan centrifugáltam, csaptam ki és kezeltem a mintákat. A mintákat 5 percig 54
forraltam, majd 10-15 µl mintát 15%-os SDS poliakrilamid gélen futtattam diszkontinuus pufferrendszerben (Laemmli 1970). A megfuttatott géleket nitrocellulóz membránra blottoltam át 25 mM Tris, 188 mM glicin, 20% (v/v) metanol összetételű blottpufferben. A nitrocellulóz membránt ezután 30 percig inkubáltam 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20 pufferben, hogy blokkoljam a detergenssel az aspecifikus kötőhelyeket a nitrocellulóz membránon. Az ellenanyagokat ugyanilyen összetételű pufferben higítottam. Az egyes ellenanyagokkal 1-1 órát inkubáltam a membránt szobahőmérsékleten. Az egyes ellenanyagok között a nitrocellulóz membránról háromszori mosással távolítottam el a meg nem kötődött, feleslegben lévő ellenanyag molekulákat. Az elsődleges ellenanyag egy monoklonális anti-proteáz domén ellenanyag volt, melyet 1000-szeres hígításban alkalmaztam. Kétlépcsős Western blot esetén a másodlagos ellenanyag peroxidáz konjugált anti-egér IgG ellenanyag (Sigma) volt 2000-szeres hígításban alkalmazva. Háromlépcsős rendszer esetén a másodlagos ellenanyag biotinilált anti-egér IgG (Sigma) volt 1/2000-szeres hígításban, majd a harmadik lépcsőben 2000-szeres hígításban adott sztreptavidin konjugált peroxidázt (Sigma) alkalmaztam. A blot előhívása előtt a membránokat 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl pufferrel mostam, hogy eltávolítsam a detergenst. A blot hívását 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl pufferben 25 µl hidrogén peroxid, 0,4 mM NiCl2 és 0,5-1 mg/ml diamino benzidin kromogén szubsztrát hozzáadásával végeztem. A színreakciót addig hagytam zajlani, míg kellően erős jeleket kaptam, majd a reakciót a fenti puffert desztillált vízre cserélve állítottam le.
4.8 Steady state kinetikai mérések: A kcat és a Km meghatározása A kcat és a Km mérési adatait Medveczky Péter bocsátotta rendelkezésemre. A méréseket 0,5-2 nM enzimmel végezte Z-Gly-Pro-Arg-pNA szubsztráton 50 mM Tricin, pH 8,0, 10 mM CaCl2 pufferben 20,0 °C-on. A szubsztrát törzsoldatokat dimetilformamiddal készítette, és a dimetilformamid végkoncentrációja a reakciókban kisebb volt, mint 1%. A szubsztrát hidrolízisét a paranitroanilin termék keletkezésnek 405 nm-en való mérésével követte egy Shimadzu UV-2101PC spektrofotométeren. A kezdeti sebességet hat különböző szubsztrátkoncentrációnál mérte meg a 5-250 µM-es koncentráció tartományban. Minden adatpont esetében három párhuzamos mérés 55
történt. A mért kezdeti sebességeket ábrázolta a szubsztrátkoncentráció függvényében, majd a kcat, Km és kcat/Km értékeket az ábrázolt pontokra illesztett hiperbolák paramétereiből számolta.
4.9 Tranziens kinetikai mérések
4.9.1
Gyorskinetikai
mérések
4-metilumbelliferil
4-guanidinobenzoát
szubsztráton A stopped flow tranzienseket egy 450 wattos “super-quiet” Hg-Xe lámpával (Hamamatsu) felszerelt KinTek SF-2004 készülékkel (KinTek) vettem fel. A gerjesztési hullámhossz 365 nm volt 0,5 nm résszélességgel, az emissziós oldalon egy WG420 nm-es vágószűrőt (Comar Instruments) használtam. 8 ml/másodperc áramlási sebességet alkalmaztam, 40 µl térfogatú mintákat keverve össze 1:1 keverési arányban. A
fluoreszcencia
emisszió
fotoelektronsokszorozóval
intenzitását
mértem.
A
egy
700
V
feszültségre
stopped
flow
készülék
állított
holtideje
1,0
milliszekundum. A szubsztráttelítés vizsgálatához 0,1 µM enzimet kevertem össze 0,94500 µM illetve 0,94-200 µM 4-metilumbelliferil 4-guanidinobenzoát szubsztrát analóggal a vad típusú, illetve az R193G mutáns humán tripszin 4 esetén (a megadott koncentrációk a keverés után a reakciótérben kialakuló végső koncentráció értékek). A reakciót 20 mM Tricin pH 8,0, 10 mM CaCl2 összetételű pufferben mértem 20,0 °C-on. Az adatokat logaritmikus időskálán vettem fel, így biztosítva, hogy elegendő adatpontot gyűjtsek akár többfázisú folyamat analíziséhez is. Többfázisú reakció esetén a logaritmikus időskálán való adatgyűjtéskor az egyes fázisok kiegyensúlyozottabban lesznek reprezentálva a mérési pontok által. Az analizált görbék 4-7 felvett időgörbe átlagai. A reakció termodinamikai tulajdonságainak vizsgálatához 0,1 µM enzimet kevertem össze telítési koncentrációjú szubsztráttal (500 µM-lal a vad típusú enzim esetén és 200 µM-lal az R193G mutáns enzimnél) és a reakció lefolyását különböző hőmérsékleteken 3 °C-onként követtem a 6-36 °C-os hőmérsékleti tartományban. A reakciót 20 mM Tricin, pH 8,0 ± 0,1, 10 mM CaCl2 pufferben végeztem. A ∆pKa/10 ºC = -0,21 összefüggés ismeretében a Tricin pufferek pH-ját szobahőmérsékleten 7,6-8,2-
56
re állítottam be, hogy a különböző mérési hőmérsékleteken a pH értéke 8,0 ± 0,1 legyen. A továbbiakban a nem 20 °C-on történt méréseknél a pH értékét ± 0,1-es pontossággal adom meg.
4.9.2 A 4-metilumbelliferil 4-guanidinobenzoát reakciók kinetikai és termodinamikai elemzése A reakciókat a felvett görbékre való kettős exponenciális függvények illesztésével elemeztem a KinTek szoftver és az OriginLab v7.5 program (MicroCal Software) segítségével. Az adatokat korrigáltam a szubsztrát spontán hidrolízisével, ami magas hőmérsékleteken jelentős volt. Az elemi sebességi állandók számolásának levezetését az 5.4.4 fejezetben tárgyalom. Az aktivációs paramétereket az ln (k/T) 1/T függvényében való ábrázolásának (Eyring ábrázolás) elemzéséből számoltam az 1. egyenlet szerint (Keleti 1983), ahol k a sebességi állandó, R az univerzális gázállandó (8,314 Jmol-1K-1), T az abszolút hőmérséklet, NA az Avogadro szám, h a Planck állandó, az aktiválási entalpia ∆H‡ = -meredekség × 8,314 Jmol-1 és az aktiválási entrópia ∆S‡ = (tengelymetszet – 23,76) × 8,314 Jmol-1K-1. Az aktiválási szabadenergiát (∆G‡) a 2. egyenlet segítségével számoltam.
ln (k/T) = ln (R/NAh) + ∆S‡/R - ∆H‡/RT
1. egyenlet
∆G‡ = ∆H‡ - T∆S‡
2. egyenlet
Az egyensúlyi standard szabadenergia változást (∆G°) a 3. egyenletből számoltam ki. A standard entalpia (∆H°) és entrópia (∆S°) változásokat a linearizált van’t Hoff ábrázolásokból vezettem le a 4. egyenletnek megfelelően.
∆G° = - RTln K
3. egyenlet
ln K = ∆S°/R - ∆H°/RT
4. egyenlet
57
4.9.3 pH-ugrásos stopped flow mérések A triptofánokat 297 nm-en gerjesztettem 2 nm-es résszélességgel, és a fluoreszcencia emissziót egy 700 V feszültségre állított fotoelektronsokszorozóval detektáltam egy 340 nm-es interferenciaszűrőn (Comar Instruments) keresztül. 12 ml/sec áramlási sebességet alkalmaztam, és 40 µl térfogatú mintákat kevertem össze 1:1 arányban. 1-4 µM 20 mM CABS, pH 11,0, 10 mM CaCl2 pufferben lévő enzimet összekevertem 100 mM Tricin, pH 8,0, 10 mM CaCl2 pufferrel, és követtem a fluoreszcencia emisszió intenzitásának növekedését. A konformációváltozás sebességét a 6-38 °C-os hőmérsékleti tartományban 3 °C-onként a hagyományos stopped flow készülékkel mértem. A pufferek pH-ját szobahőmérsékleten különböző értékekre állítottam be úgy, hogy a pH 8,0 ± 0,1 (illetve pH ≥ 11,0) legyen a különböző mérési hőmérsékleteken.
4.9.4 Hőugrásos stopped flow pH-ugrás mérések A méréseket a Málnási-Csizmadia András laborjában kifejlesztett hőugrásos stopped flow készülékkel mértem (Kintses és mtsi. 2006). Az enzimet 20 °C-on tartottam a pH 8,0-es pufferrel való összekeverésig, mely egy fűtött csövön folyik át. A küvetta hőmérsékletét egy másik fűtőelem szabályozza (Supertech Kft), biztosítva, hogy a keverék és a reakciótér hőmérséklete azonos legyen. 20 µl 20 mM CABS, pH 11,0, 10 mM CaCl2 pufferben lévő enzimet kevertem össze 100 µl 100 mM Tricin, pH 8,0, 10 mM CaCl2 pufferrel, és detektáltam a fluoreszcencia emisszió intenzitásának változását. A pufferek pH-ját szobahőmérsékleten állítottam be úgy, hogy az adott mérési hőmérsékleten a kívánt értéket adják. Az 1:5 arányú keverés nagyobb hőmérsékletugrást tesz lehetővé, ugyanakkor az enzim nem-denaturáló hőmérsékleten tartható a reakció kezdetéig. Az alkalmazott hőmérsékleti tartományban a fűtött csövet és a küvettát is magasabb hőmérsékletűre fűtöttük az elvi képlet alapján számolható értékhez képest ((1× 20 °C + 5 × T
cső)/6
= T
küvetta),
hogy kompenzáljuk a rendszer
hőveszteségét. A készülék hőmérsékleti kalibrálását az N-acetil L-triptofán amid (NATA)
fluoreszcencia
intenzitásának
a
hőugrással
előállított
különböző
hőmérsékleteken való mérésével végeztük. A fűtött cső és a küvetta hőmérsékletét úgy 58
állítottuk be, hogy a keverés után a NATA fluoreszcenciájának intenzitása ne változzon, ami arra utal, hogy a keverék hőmérséklete azonos volt a küvetta hőmérsékletével. A készülék legfőbb előnye, hogy a gyors hőugrás egyidőben történik a reaktánsok összekeverésével, ezáltal a holtidő nem nő meg egy konvencionális stopped flow készülékhez képest. Az új hőugrásos stopped flow készülékkel tanulmányozható a reakciók kinetikája magas hőmérsékleten, akár a fehérje denaturációs hőmérséklete felett is, ha a követett reakciólépések gyorsabbak, mint az általában lassú hődenaturációs reakció.
4.9.5 A sebességi állandók relatív külső viszkozitástól való függésének meghatározása A stopped flow méréseket 20 °C-on végeztem 10 mM CABS, pH 11,0, 5 mM CaCl2, és 50 mM Tricin, pH 8,0, 5 mM CaCl2, pufferekben, melyeket maltózzal egészítettem ki, hogy különböző relatív viszkozitású oldatokat kapjak. Maltózt alkalmaztam a viszkozitás növelésére 0-1,46 M-os koncentrációban, ami 1-8,2-es relatív viszkozitást eredményez (Wheast (szerk.) 1988). A maltóz növeli meg a legnagyobb mértékben a relatív viszkozitást az oldat dielektromos állandójának legenyhébb (17,5%-al való) csökkentése mellett, összehasonlítva más, gyakran használt viszkozitásnövelő anyagokkal, pl. a fruktózzal, illetve az etilén glikollal. A pufferek koncentrációját csökkentettük az egyéb mérésekben alkalmazott pufferekéhez képest, mivel az ionerősség befolyásolja a viszkozitást. A többi kísérleti beállítás azonos volt a 4.9.3 fejezetben leírtakkal.
4.9.6 A pH-ugrásos mérések kinetikai és termodinamikai analízise 5-8 felvett időgörbét átlagoltam és egyszeres vagy kettős exponenciális függvénnyel való illesztéssel elemeztem a KinTek (KinTek Corp.) illetve az OriginLab v7.5 (MicroCal Software) program segítségével. A megfigyelt sebességi állandókat (observed rate constants) (k) ábrázoltam a hőmérséklet (T) függvényében, majd a termodinamikai profilokat az y = a exp(b / x ) exponenciális függvény illesztésével
59
elemeztem. Az illesztett függvény egyes paraméterei közvetlenül megfeleltethetők az Arrhenius egyenlet paramétereinek linearizálás nélkül (y = k, a = A, b = -Ea/R, x = T). A reakciók sebességi állandójának hőmérsékletfüggését az Arrhenius egyenlet írja le (Arrhenius 1889):
k = A exp( − Ea / RT )
5. egyenlet
ahol k a sebességi állandó, A a preexponenciális tag, Ea a folyamat aktiválási energiáját jelöli, R a gázállandó és T az abszolút hőmérséklet. A Kramers elmélet egy konvencionális megközelítés a súrlódás (friction) egymolekulás reakciók sebességi állandóira való hatásának jellemzésére a folyadék fázisban (Kramers 1940). Ebben a modellben a kémiai reakciót egy olyan részecske modellezi, amely diffúziós egydimenziós mozgást végez egy potenciálgödörből egy energiagáton keresztül. A Kramers elmélet alapján az Arrhenius egyenlet preexponenciális tagja tartalmaz egy súrlódási (friction) paramétert, amelyet döntően a viszkozitás határoz meg, és a sebességi állandó fordítottan arányos ezzel a súrlódási paraméterrel. Ansari és munkatársai (Ansari és mtsi. 1992) ezt a megközelítést módosították fehérjékre vonatkoztatva a súrlódást felosztva két forrásra. A két tagból az egyik az oldószer súrlódása (külső súrlódás) (friction of the solvent, external friction) ami mérsékli az atomok mozgását a fehérje felszínén. A másik tag pedig a fehérje belső súrlódása (internal friction), ami akadályozza a fehérje atomjainak mozgását egymáshoz képest. A modell leírására a következő egyenletet állították fel:
k=
C exp( − Ea / RT ) σ +η
6. egyenlet
ahol η a külső (oldószer) viszkozitás és σ egy viszkozitás dimenziójú paraméter, amely meghatározza a fehérje belső súrlódását (internal friction). A továbbiakban ezt a paramétert belső viszkozitásként (internal viscosity) említem. C pedig magába foglalja a viszkozitás-független paramétereket. Az oldószer súrlódása a Stokes törvény alapján arányos az oldószer viszkozitásával. Ennek az analógiának az alapján a molekula belső súrlódását (internal molecular friction) nevezhetjük a fehérje belső viszkozitásának, és ennek a viszkozitás-szerű paraméternek viszkozitás-dimenziója van (Tóth és mtsi.
60
2006c). Mindazonáltal ez nem tekinthető a fehérje egy általános paraméterének, hanem mindig egy specifikus konformációváltozáshoz kapcsolt a fehérjében. Feltételezve, hogy az aktiválási energia nem függ a viszkozitástól állandó hőmérsékleten, a 6. egyenlet a következőképpen módosul:
k=
C' σ +η
7. egyenlet
melyben C’ magába foglalja a C exp( − Ea / RT ) kifejezést. A 7. egyenlet linearizált alakja a következő lesz:
1 η σ = + k C' C'
8. egyenlet
Ennek következményeként az 1/k-t ábrázolva a külső viszkozitás függvényében egy lineáris függvényt kapunk, és a fehérje lokális belső viszkozitása levezethető az egyenes tengelymetszetéből azt megszorozva a meredekség reciprokával (Tóth és mtsi. 2006c). Másképpen megfogalmazva, állandó hőmérsékleten a belső súrlódás kiszámolható a sebességi állandó nulla külső viszkozitásra (η = 0 cP) való extrapolálásával:
σ=
C' −η k
9. egyenlet
Ezért a konformációváltozás sebességét megmérve a puffer relatív viszkozitásának függvényében a fehérje lokális belső viszkozitása meghatározható.
61
5. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTELMEZÉSÜK 5.1 A humán tripszinogén 4 mRNS 5’ végi szekvenciájának meghatározása 5’ RACE PCR-rel Humán frontális kéreg, hippocampus és kisagykéreg mintákból a humán tripszinogén 4 mRNS 5’ végi szekvenciájának meghatározása céljából totál RNS-t izoláltam, amit templátként használtam cDNS szintéziséhez. A kapott cDNS-t 5’ RACE technikával amplifikáltam. Egy, a kísérletek során kapott tipikus PCR termék gélelektroforetikus képe a 7. ábrán látható.
7. ábra Egy agyszövetből izolált 5’ RACE PCR termék gélelektroforetikus képe. A molekulasúly marker (GeneRuler™ 1kb DNA Ladder, Fermentas) melletti számok az egyes fragmensek bázispárjainak számát jelölik.
A kapott PCR termékeket agaróz gélből izoláltam, majd pBluescript vektorba klónoztam és szekvenálással karakterizáltam. Az izolált leghosszabb szekvenciák közül néhányat a 8. ábrán mutatok be.
62
-44 N-term. peptid
M
C
G
P
D
D
R
C
P
A
R
W
P
G
P
G
R
A
V
K
1.
------------------------------------------------------------
2.
------------------------------------------------------------
3.
------------------------------------------------------------
4.
------------------------------------------------------------
N-term. peptid
C
ATGTGCGGACCTGACGACAGATGCCCCGCACGCTGGCCGGGACCGGGAAGGGCGGTCAAG 60
G
K
G
L
A
A
A
R
P
G
R
V
E
R
G
G
A
Q
R
TGTGGAAAGGGTCTGGCGGCTGCCAGGCCTGGCAGAGTGGAGCGGGGCGGGGCGCAGCGG 120 1.
------------------------------------------------------------
2.
------------------------------------------------------------
3.
------------------------------------------------------------
4.
-----------------------------------------------------------+1
N-term. peptid
G
G
A
G
L
E
L
H
P
L
L
G
G
R
T
W
R
A
A
R
GGCGGGGCGGGCCTGGAGCTGCACCCGCTTCTGGGTGGACGCACTTGGCGAGCGGCGCGG 180 1.
---------GGCCTGGAGCTGCACCCGCTTCTGGGTGGACGCACTTGGCGAGCGGCGCGG
2.
-----------------------------------------CACTTGGCGAGCGGCGCGG
3.
---------------------------------------------TGGCGAGCGGCGCGG
4.
------------------------------------------------------------
N-term. peptid
G
C
D
A
D
E
A
L
G
T
V
A
V
P
F
D
D
D
D
K
GATGCAGACGGCTGCGAGGCGCTGGGCACAGTTGCTGTCCCCTTTGACGATGATGACAAG 240 1.
GATGCAGACGGCTGCGAGGCGCTGGGCACAGTTGCTGTCCCCTTTGACGATGATGACAAG
2.
GATGCAGACGGCTGCGAGGCGCTGGGCACAGTTGCTGTCCCCTTTGACGATGATGACAAG
3.
GATGCAGACGGCTGCGAGGCGCTGGGCACAGTTGCTGTCCCCTTTGACGATGATGACAAG
4.
-----------CTGCGAGGCGCTGGGCACAGTTGCTGTCCCCTTTGACGATGATGACAAG
8. ábra Néhány agyi mintából izolált humán tripszinogén 4 cDNS 5’ végi szekvencia (1-4.) összerendezve a prediktált teljes hosszúságú cDNS-el (N-terminális peptid). A legfelső sorban az Nterminális peptid szekvenciája és a propeptid aminosavsorrendje látható az aktivációs domén határáig. Vastag betűkkel kiemelve a potenciálisan transzlációs startkodonként szolgáló tripleteket, illetve az általuk kódolt kezdő aminosavat ábrázoltam. Pirossal kiemeltem az alternatív starthelyként szolgáló +1-es pozíciójú leucint, és az azt kódoló CTG bázishármast. A szekvenciákat ClustalW programmal (Thompson és mtsi. 1994) rendeztem össze.
A bemutatott tipikus szekvenciák különböző hosszúságú szakaszt tartalmaznak a humán tripszinogén 4 N-terminális szekvenciájából. A leghosszabb izolált cDNS (1. szekvencia) tartalmazza a potenciális alternatív transzkripció iniciációs starthelyként szolgáló CUG kodont (az ábrán pirossal kiemelve), mely egy leucint kódol (Leu+1). Eredményeimet megerősíti a Wiegand és munkatársai által izolált szekvencia, amely gyakorlatilag azonos az általam karakterizált cDNS 5’ végével (Wiegand és mtsi. 1993). A prediktált 72 aminosav hosszúságú, metioninnal (Met-44) kezdődő N-terminális peptiddel rendelkező A izoformának megfelelő cDNS-t többszöri próbálkozás ellenére sem tudtam izolálni. Az izolált cDNS 5’ vége (8. ábra 1. szekvencia) nem egy valódi 63
eukarióta mRNS 5’ vég, hiszen nem tartalmazza az 5’ nem-transzlálódó régiót. Bár post mortem szöveti mintákkal való munkák esetén nem zárható ki az RNS degradáció lehetősége, az izolálást elvégezve a humán tripszinogén 4-et endogén módon termelő Caco2 humán vastagbél adenokarcinóma sejtvonalból (Cottrell és mtsi. 2004), ahol élő sejtekből késleltetés nélkül végezhető el az RNS izolálás, hasonló szekvenciákat kaptam. Eredményeimet alátámasztják kutatócsoportunk más tagjainak munkája is, melynek célja az agyszövetben expresszált fehérje N-terminális aminosavainak azonosítása volt. Kutatócsoportunkban Medveczky Péter humán agyi extraktumból immunaffinitás kromatográfiával a humán tripszin 4 és a humán tripszinogén 4 B izoformájának 28 tagú aminoterminális peptide ellen termelt monoklonális antitestekkel reagáló fehérjéket izolált, majd azokat N-terminális aminosav analízissel azonosítottuk (Németh és mtsi. 2006, kézirat bírálat alatt). Ezen kísérletekben szintén a B izoformát tudtuk izolálni, a hosszabb A izoformának megfelelő fehérje nem volt kimutatható. A B izoforma A izoformából proteolítikus hasadással való keletkezését kontroll kísérlet segítségével kizártuk. Tehát mRNS és fehérje szinten egyaránt az agyszövetben nagy valószínűséggel a rövidebb, leucin kezdő aminosavval rendelkező izoforma a domináns, illetve kizárólagos előfordulású. A CUG kodonról való alternatív transzláció iniciáció emlős sejtekben megtörténik, és a kezdő aminosav valóban leucin, ahogy azt munkacsoportunkban Németh Attila igazolta HeLa epitheliális adenokarcinóma illetve U87 glioblasztóma sejteket tranziensen transzfektálva a humán tripszinogén 4 különböző konstrukcióival (9. ábra) (Németh és mtsi. 2006, kézirat bírálat alatt). A transzfektált sejtek által termelt fehérjéket immunaffinitás kromatográfiát követő N-terminális aminosav szekvenálással azonosítottuk. Ez a kísérleti rendszer lehetővé tette az alternatív transzkripció iniciáció vizsgálatát jelentősen kisebb valószínűségű RNS, illetve fehérje degradáció mellett, ami komoly technikai problémát jelent a post mortem humán agyszöveti mintákkal való munkáknál. Továbbá, mivel irányított mutagenezis segítségével pontmutációkat, illetve deléciókat lehet bevinni a konstrukciókba, vizsgálhatóvá válik az egyes tripletek, illetve génszakaszok szerepe a humán tripszinogén 4 expressziójában.
64
9. ábra A: Az eukarióta sejtek transzfekciójához használt konstrukciók vázlatos felépítése, kiemelve a transzláció iniciációs helyként szolgáló kodonokat és a 28, illetve 72 aminosav hosszúságú N-terminális peptidet (piros). Az aktivációs peptidet és a proteáz domént kódoló génszakaszt lilával jelöltük. p72MT4: a 72 tagú N-terminális peptidet hordozó, a -44-es pozícióban AUG startkodonnal, a +1-es pozícióban CUG kodonnal rendelkező humán tripszinogén 4-et kódoló konstrukció. p28LT4: a 72 tagú N-terminális peptidet hordozó, a +1-es pozícióban CUG kodonnal rendelkező humán tripszinogén 4-et kódoló konstrukció, melyből a -44-es pozícióban az AUG startkodot delécióval eltávolítottuk. A deléció miatt nem transzlálódó régiót fehér színnel jelöltük. B: a p72MT4 konstrukcióról expresszált, izolált fehérje N-terminális szekvenciája C: a p28LT4 konstrukcióról expresszált, izolált fehérje N-terminális szekvenciája. Az ábra Németh és mtsi. kéziratában (2006) található ábra módosításával készült.
Az A izoformát kódoló konstrukcióval (p72MT4) (9. ábra) való transzfektálás esetén az immobilizált ellenanyag segítségével izolálni lehetett a hosszabb, 72 aminosavból álló N-terminális peptiddel rendelkező szekvenciát is a B izoforma mellett (9. ábra B). Ez esetben az első AUG-ről történő transzláció iniciáció oka lehet az, hogy a transzfektált sejtekben a transzkripció igen erős virális promóterről (humán citomegalovírus promóter) történik, így olyan fehérje is termelődhet, ami fiziológiás körülmények között nem expresszálódik. Eltérőek lehetnek a sejtvonalakban, illetve az agyszövetben jelen lévő transzkripciós faktorok és a transzkripcióhoz, illetve a transzlációhoz szükséges egyéb fehérjekészletek is. A B izoformát kódoló konstrukcióval (p28LT4) transzfektált sejtekből izolálható fehérje a vártnak megfelelően leucin kezdő aminosavval rendelkezett (9. ábra C). Számos különböző C-terminális GFP-fúziós humán tripszinogén 4 konstrukció készült, melyekben ATG, illetve CTG triplettel kezdődő 72, illetve a 28 tagú N-terminális szekvencia előzte meg a proteáz domént kódoló génszakaszt. A következőkben leírt kísérletekhez használt konstrukciók vázlatos felépítését a 10. ábrán mutatom be. 65
10. ábra Az emlős sejtek transzfektálásához használt néhány GFP-fúziós humán tripszin 4 konstrukció vázlatos felépítése, kiemelve a transzláció iniciációs startként szolgáló bázishármasokat (-44ATG, +1CTG/ATG) és az N-terminális peptidet kódoló génszakaszt (piros). Az aktivációs peptidet és a proteáz domént kódoló DNS szekvenciát lilával, a GFP-t kódoló szakakaszt pedig zölddel jelöltem. p72MT4-GFP: a -44-es pozícióban ATG tripletet tartalmazó C-terminális GFP-fúziós humán tripszinogén 4 A izoforma; p28LT4-GFP: C-terminális GFP-fúziós humán tripszinogén 4 A izoforma, melyben a -44-es pozíciójú ATG bázishármast delécióval eltávolították; p28MT4-GFP: C-terminális GFPfúziós humán tripszinogén 4 A izoforma, melyben a -44-es pozíciójú ATG tripletet delécióval eltávolították, és a +1-es pozícióban lévő CTG bázishármast ATG-re mutáltatták; p28Ldel 125 T4-GFP: C-terminális GFP fúziós humán tripszinogén 4 A izoforma, melyben az első 125 bázist delécióval eltávolították, a +1-es pozícióban pedig CTG tripletet tartalmaz. Az ábra Németh és mtsi. kéziratában (2006) található ábra módosításával készült.
Ezen konstrukciók által kódolt fúziós fehérjék fluoreszcencia intenzitás alapján becsült expresszió szintjének elemzése azt mutatta, hogy nagyobb mennyiségű fehérje termelődik, ha a B izoformában a CTG start-tripletet (p28LT4-GFP) visszamutáltatják konvencionális start ATG bázishármasra (p28MT4-GFP). A vad típusú A izoformát (p72MT4-GFP) a sejtek nagyobb mennyiségben termelték, mint az ATG start-triplettel rendelkező B izoformát (p28MT4-GFP). Készültek olyan konstrukciók is, melyekben különböző hosszúságú szakaszok a +1-es pozíciójú CTG triplet előtt lévő szekvenciából, mint 5’ nem-transzlálódó régió (a 72 tagú peptid N-terminálisa, a start ATG bázishármast deletálva) előzték meg a CTG kódot (p28LT4-GFP, p28Ldel 125 T4GFP). Ezen konstrukciókkal transzfektált sejteket vizsgálva megállapították, hogy a B izoforma szintézise akkor is megtörténik, ha a CTG kód előtt egy mindössze 7 bázisnyi szakaszt hagynak meg a vad típusú szekvenciából (p28Ldel 125 T4-GFP), ám a fehérjeexpresszió szintje függ az 5’ nem-transzlálódó régió hosszától. Ezek az
66
eredmények arra utalnak, hogy az alternatív transzláció iniciáció in vivo elindul a CUG kodontól, az így keletkező fehérje valóban leucin kezdő aminosavval rendelkezik, továbbá ez a nem-konvencionális mechanizmus szerepet játszhat a fehérje expresszió erősségének szabályozásában.
5.2 A humán tripszinogén 4 A, B, illetve rekC izoforma membránkötő képességének vizsgálata A humán tripszinogén 4 A és B izoformája szokatlan N-terminális peptiddel rendelkezik, mely karakterében eltér a szekretált fehérjék szignálpeptidjétől. Ezen peptidek potenciális szerepe lehet, hogy membránba horgonyozzák a zimogént, ezáltal járulva hozzá a fehérje sejten belüli transzportjához. Hogy megvizsgáljam, alkalmasak-e ezek a peptidek biológiai membránokkal való interakcióra, precipitációs kísérleteket végeztem a humán tripszinogén 4 mindhárom izoformájával. A fehérjéket egyensúlyba hoztam agyszövetből izolált membrán frakciókkal, majd ultracentrifugálást követően SDS poliakrilamid gélelektroforézis és Western blot segítségével vizsgáltam, hogy mely izoformák kötődtek a membránpreparátumokhoz (11. ábra).
67
11. ábra A humán tripszinogén 4 különböző izoformáinak membránkötő képessége. A rekombináns fehérjéket patkány agyszövetből izolált plazmamembrán (A), illetve mikroszóma (B) frakcióval inkubáltam. A kötődő és nem kötődő fehérjéket centrifugálással választottam szét, majd SDS poliakrilamid gélelektroforézist követően Western blottal mutattam ki. A molekulasúly marker (Prestained Protein Molecular Weight Marker, Fermentas) melletti számok az egyes standard fehérjék molekulasúlyát jelzik kilodaltonban megadva. A: 1. rekC izoforma k 2. rekC izoforma m, cs 3. rekC izoforma m, f 4. B izoforma k 5. B izoforma m, cs 6. B izoforma m, f 7. A izoforma k 8. A izoforma m, cs 9. A izoforma m, f 10. plazmamembrán frakció k, cs 11. plazmamembrán k, f. B: 1. rekC izoforma k, 2. rekC izoforma m, f 3. B izoforma k 4. B izoforma m, f 5. B izoforma m, 0,1 M NaCl-os mosás, f 6. B izoforma m, 1 M NaCl-os mosás, f 7. A izoforma k, 8. A izoforma m, f 9. A izoforma m, 0,1 M NaCl-os mosás, f, 10. A izoforma m, 1 M NaCl-os mosás, f k: kontroll, m: membrán frakcióval inkubált, f: felülúszó, cs: csapadék
Eredményeim szerint a humán tripszinogén 4 rekC izoformája nem mutat affinitást agyszövetből izolált mikroszóma, illetve plazmamembrán frakció felé, tehát a szekréciós szignál peptid, illetve a proteáz domén nem elegendő ahhoz, hogy a fehérje biológiai membránokhoz kötődni tudjon. Ezzel szemben, a szokatlan N-terminális szekvenciával rendelkező A és B izoforma egyaránt képes kötődni ezekhez a membránokhoz. Ez a kölcsönhatás nem bontható meg nagy ionerejű oldattal való mosással (9.B ábra), tehát az interakcióban nemcsak ionos kölcsönhatások, hanem egyéb másodlagos kötőerők is fontosak. Ez az eredmény arra is utalhat, hogy a humán tripszinogén 4 nem egy transzmembrán fehérjéhez kötődve kapcsolódik a membránhoz, hanem direkt módon N-terminális peptidje segítségével beépül a membránba. A kölcsönhatás specificitásának bizonyítására leszorítási kísérleteket végeztem. A
68
rekombináns B izoformát az N-terminális peptidnek megfelelő, szilárd fázisú szintézissel előállított 28 tagú peptid a rekombináns fehérjéhez képest 10-szeres moláris feleslege jelenlétében inkubáltam a membránfrakcióval. A hozzáadott peptiddel részlegesen le tudtam szorítani a kötődő fehérjét (be nem mutatott adatok). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a humán tripszinogén 4 A és B izoformájának N-terminális peptidjei betölthetnek membránhorgonyzó funkciót. Ugyanakkor cirkuláris dikroizmus spektroszkópiai méréseim alapján sem a 28, sem a 72 tagú peptid nem tartalmaz helikális elemeket, amit transzmembrán peptidek esetén várhatnánk, bár trifluor ecetsav és SDS hozzáadásával indukálni lehetett ezen peptidekben helikális struktúra kialakulását (be nem mutatott adatok). Ezen előkísérletek alapján ezek az N-terminális peptidek szerepet játszhatnak abban, hogy a sejten belül membránok közelébe irányítsák a humán tripszinogén 4-et. Ez fontos lehet ahhoz, hogy a tripszinogén a diszulfid hidak kialakulását lehetővé tevő kémiai környezetbe kerülhessen a sejten belül. A humán tripszin 4 ugyanis tíz ciszteint tartalmaz, melyekből kialakuló öt diszulfid híd stabilizálja a fehérje szerkezetét. A diszulfid hidak csak oxidáló redoxpotenciálú közegben alakulhatnak ki. Szekretált fehérjék esetén ez az ER-ben történik meg. Ebben a kompartmentben a redoxpotenciál erősebben oxidáló jellegű, mint a citoszolban, és a glutation az egyik fő redox puffer komponens a szekréciós útvonalban (Hwang és mtsi. 1992). Amennyiben a fehérje nem kerül szekrécióra, a korrekt térszerkezetű tripszin csak a sejten belüli olyan régiókban alakulhat ki, ahol ezt a redoxpotenciál lehetővé teszi. Ilyen lehet sejtmembránok, pl. az ER közvetlen közelében a citoplazma is. Virális fehérjék esetén találtak már példát arra, hogy a fehérjében stabil diszulfidhidak tudnak kialakulni a citoplazmában, a folyamathoz kedvezőtlen redox környezet ellenére (Senkevich és mtsi. 2000). A citoplazmatikus fehérjékben szokatlan diszulfid híd található hipertermofil archeák egyes fehérjéiben is (Littlechild és mtsi. 2004), köztük egy cisztein proteázban is (Singleton és mtsi. 1999), sőt van példa eukarióta fehérje, egy chaperonin esetében is citoplazmában kialakuló diszulfid hídra (Pappenberger és mtsi. 2002). Mindazonáltal ezen különleges N-terminális peptideknek a szekréció, illetve az expresszió szabályozásában, a fehérje sejten belüli elhelyezkedésben in vivo játszott szerepe egyelőre tisztázatlan.
69
5.3 A humán tripszinogén 4 mRNS mennyiségi mérése Real-time kvantitatív PCR-rel
5.3.1 Real-time kvantitatív PCR reakció körülményeinek optimalizálása A munka folytatásaként meghatároztam a humán tripszinogén 4 mRNS-ének relatív mennyiségét különböző agyi régiókban, neurológiailag normál egyénekből származó, rövid post mortem idejű mintákból. Előkísérletekben optimalizáltam a kvantitatív PCR reakció körülményeit. Kiválasztottam a humán tripszinogén 4 génjére tervezett három oligonukleotid-párból a leghatékonyabban amplifikáló párt (a Függelékben csak ennek a szekvenciáját tüntettem fel). Az alkalmazott primerpár a proteáz domén egy szakaszához anellál. Bár a specificitást legbiztosabban az N-terminális peptidre anelláló primer biztosítaná, 5’ RACE PCR eredményeim azt mutatják, hogy e peptidnek megfelelő mRNS hosszának varianciája nagy, így kevésbé alkalmas templátnak a mennyiségi meghatározáshoz. Meghatároztam a primerek optimális koncentrációját is a reakcióelegyben, ami 50 nM-nak bizonyult. Előkísérleteim szerint a kétlépcsős hőprofil (az anelláció és a lánchosszabbítás azonos hőmérsékleten, 60 °C-on történik) alkalmasabb a mérésre, mint a háromlépcsős (az anelláció a lánchosszabbításhoz képest 15-20 °C-kal alacsonyabb hőmérsékleten történik). Kritikusnak bizonyult az amplikon hossza is: reprodukálható eredményeket a gyártó által ajánlott kb. 150-160 bázisnyi amplifikált DNS szakasz esetén kaptam. Előkísérleteim szintén rávilágítottak arra, hogy az ismert koncentrációjú templátot tartalmazó standard mintának nem alkalmas a plazmid DNS, hanem ismert mennyiségű RNS-ről szintetizált cDNS-t kell alkalmazni. Plazmid DNS esetén a hígítási sor egyes tagjainak Ct értékei nem a koncentrációjuknak megfelelő sorrendben követték egymást. A Ct érték az a PCR ciklusszám, amely szükséges ahhoz, hogy egy adott templátmennyiséget tartalmazó reakcióelegy az amplifikáció során egy meghatározott fluoreszcenciaértéket elérjen. Valószínűleg cirkuláris kettősszálú DNS templát esetén az anelláció és a hődenaturáció eltérő módon megy végbe, illetve más az amplifikáció hatásfoka is, mint amikor a templát egyszálú lineáris DNS. Tapasztalataim szerint azonban a standard cDNS-ek sem a várt Ct értékeket mutatták, ha a PCR reakcióban mindössze 20-80-szorosra hígultak. Ennek oka lehet az, hogy a cDNS szintézishez 70
használt puffer 10 mM DTT-t tartalmaz, ami ha nem hígul ki kellő mértékben a PCR reakcióban, zavarja a SYBR Green I festékkel való detektálást (Lekanne Deprez és mtsi. 2002). Ezért a mérésnél cDNS mintákat a reakcióban általában 100-szoros hígításban alkalmaztam, ahol a DTT hatása már elhanyagolható. Ezenfelül be kellett állítanom az aktin és a tripszin standard sorok koncentrációtartományát is, hogy a mért minták beleessenek a kalibrálóegyenes által lefedett tartományba. Minden mérés során futtattam templát nélküli kontroll mintát is. Az optimalizálás során vizsgáltam a minták tárolhatóságát is. Azonos mintából izolált RNS-ről szintetizált cDNS-t templátként használva elvégeztem a PCR reakciót a cDNS szintézist követő napon, illetve 8 hét múlva. A 12. ábrán látható, hogy a későbbi mérésnél lényegesen, mintegy 6-szor kisebb humán tripszinogén mRNS relatív mennyiséget tudtam mérni. Ez azt mutatja, hogy a humán tripszinogén cDNS gyorsabban degradálódik, mint az aktin cDNS, továbbá csak a cDNS szintézist követően a lehető legrövidebb időn belül elvégzett PCR reakció ad releváns eredményt. A továbbiakban bemutatott méréseket ennek megfelelően végeztem el. Ugyanakkor az azonos mintából újból RNS-t preparálva, arról cDNS-t szintetizálva és azt 24 órán belül megmérve nagyon hasonló eredményt kaptam. Ez mutatja az RNS izolálás, cDNS szintézis és a kvantitatív PCR reprodukálhatóságát.
71
12. ábra A szintetizált cDNS minták tárolhatósága, illetve a mérési módszer megbízhatósága egy példán bemutatva. A mérések ugyanabból az agymintából készített cDNS-ről készültek. 1.: az RNS izolálást követően frissen szintetizáltam a cDNS-t, majd 24 órán belül használtam templátként a PCR reakcióhoz. 2.: ugyanerről a cDNS-ről 2 hónapos -80 °C-on való tárolást követően készült mérés. 3.: ugyanebből az agymintából újbóli RNS izolálást, cDNS szintézist és 24 órán belüli mérést követő eredmény.
5.3.2 A Ct értékek mRNS mennyiségre való konvertálása és a kalibrálóegyenesek meghatározása A real-time PCR reakció során a normalizált riporter változást (∆Rn) mérjük a ciklusszám függvényében. A 13. ábrán tipikus amplifikálási ábrázolások láthatók humán agyi mintákból izolált, illetve standard cDNS templátokról.
72
13. ábra 1,4 x 10-2 - 1,12 x 10-4 pikogramm mRNS-ről szintetizált humán tripszinogén 4 mRNS standard cDNS minták (lila), egy kisagyi kéreg (narancssárga) és egy nyaki gerincvelő (zöld) minta amplifikálási ábrázolása, azaz a normalizált riporter fluoreszcencia intenzitás változás ábrázolva a PCR ciklusszám függvényében. A vízszintes vonal az exponenciális fázison belül önkényesen választott fluoreszcencia küszöbérték (∆Rn = 0,2), az ehhez tartozó PCR ciklusszám az amplifikálási ciklus küszöbérték (Ct). A detektált Ct értékek a kalibrálóegyenes segítségével kiindulási templát mRNS mennyiségre konvertálhatók.
A Ct érték exponenciális fázison belül való önkényes megválasztása után az egyes mintákban a kiindulási templátkoncentráció a Ct értékből a kalibrálóegyenes egyenletének ismeretében visszaszámolható. A mintákból a humán tripszinogén 4 és a β-aktin mRNS mennyiségét is megmértem. Mivel a β-aktin génje konstitutívan expresszálódik, belső kontrollként alkalmazható (Sturzenbaum és Kille 2001; Suzuki és mtsi. 2000). A β-aktin mRNS mennyiségével való normálással korrigálni lehet a reakcióba bemért össz-RNS (össz-cDNS) mennyiségének varianciáját.
73
14. ábra Kalibrálóegyenesek a β-aktin (A) és a humán tripszinogén 4 (B) mRNS mennyiségének meghatározásához. A standard sor egyes tagjai in vitro szintetizált, ismert mennyiségű β-aktin illetve humán tripszinogén 4 mRNS templátról szintetizált cDNS minták. Minden pont 3 párhuzamos mérés átlagát és hibáját reprezentálja. Ct: az a PCR ciklusszám, ami alatt a normalizált fluoreszcencia intenzitás változás (∆Rn) eléri a küszöbértéket.
A kalibrálóegyenesekhez a standard mintákat ismert mennyiségű in vitro szintetizált RNS-ről cDNS-t szintetizálva állítottam elő, majd az így kapott cDNS-ből készített hígítási sor egyes tagjait használtam templátként a PCR reakcióhoz. A Ct értékeket a kiindulási templátmennyiség logaritmusának függvényében ábrázolva megkapjuk a kalibrálóegyenest (14. ábra). Az ábrán jól látható, hogy a standard minták által lefedett koncentrációtartományban a mért jel (Ct érték) egyenesen arányos a 74
kiindulási templátmennyiség logaritmusával, tehát az amplifikáció hatásfoka állandó a tartományon belül. A kalibrálóegyenes meredekségéből kiszámolható a PCR amplifikáció hatásfoka az alábbi egyenlet segítségével (Lekanne Deprez és mtsi. 2002):
A = (10−1 / a ) − 1
10. egyenlet
ahol A az amplifikálás hatékonysága, a pedig a kalibrálóegyenes meredeksége, ami elvileg nem lehet nagyobb -3,3-nél, mert ekkor a PCR amplifikálás hatásfoka nagyobb lenne, mint 100%. Az aktin kalibrálóegyenesek esetén az amplifikálás hatásfoka átlagosan 97,1 ± 2,9 % volt, míg a humán tripszinogén 4 kalibrálóegyenesekből számolt hatékonyság 87,4 ± 8,5%. Ez azt mutatja, hogy az amplifikálási hatékonyság függ a templát-primer pártól.
5.3.3 A real-time PCR reakciók specificitása A PCR reakciók specificitását az olvadási görbe analízisével erősítettem meg. A PCR reakció utolsó ciklusát követően a mintákat felfűtöttem 60 °C-ról 92 °C-ra 0,1 °C/másodperc fűtési sebességgel a SYBR Green I festék fluoreszcencia intenzitásának folyamatos detektálása mellett. Az intenzitás hirtelen csökkenése az amplifikált DNS két szálának szétválását jelzi. A fluoreszcencia intenzitás hőmérséklet szerinti első negatív deriváltját ábrázolva a hőmérséklet függvényében megkapjuk a PCR termék olvadási görbéjét, melynek csúcsa megadja az olvadási hőmérsékletet. Mindkét oligonukleotid-pár
esetén
a
görbék
egyetlen
olvadási
hőmérséklettel
voltak
jellemezhetők (15. ábra), tehát az amplifikálás során csak egyféle hosszúságú és szekvenciájú, azaz homogén PCR termék keletkezett. A görbe alatti terület arányos a PCR termék mennyiségével, ami közel azonos az aktinspecifikus primerek esetében, míg a humán tripszinogén 4-specifikus oligonukleotidokkal végzett reakciónál nagy varianciát mutat. A humán tripszinogén 4 specifikus primerpár estén néhány random módon kiválasztott PCR terméket klónoztam és megszekvenáltam. Mindegyik klón szekvenciája megfelelt a humán tripszinogén 4 szekvenciájának, ami igazolja a reakció specificitását.
75
15. ábra A humán tripszinogén 4 (narancssárga) és β-aktin (lila) specifikus primerekkel amplifikált PRC termékek olvadási görbéje. Mindkét PCR termék esetén az olvadási görbe egyetlen olvadási hőmérséklettel jellemezhető, ami bizonyítja a termékek homogenitását. A humán tripszin 4 esetén az olvadási hőmérséklet 82,0 °C, a β-aktin esetén pedig 84,2 °C. Egyik reakcióban sem keletkezik primer dimer, amelynek olvadási hőmérséklete jóval alacsonyabb, kb. 75 °C lenne.
5.3.4 A humán tripszinogén 4 mRNS relatív mennyiségének eloszlása az agyban A méréseket agyterületenként három párhuzamos mintából is elvégeztem. Tapasztalataim szerint a mérési adatok az egyazon agyterülethez tartozó egyedi mintákból, bár bizonyos esetekben nagyon hasonlóak (pl. kisagy kéreg), más esetekben jelentősen eltérnek egymástól (pl. amygdala, kisagyi fehérállomány, nyaki gerincvelő, kérgi fehérállomány, hippocampus, nyúltvelő, parahippocampalis kéreg, plexus choroideus, temporalis cortex), akár tízszeres különbség is lehet a humán tripszinogén 4 mRNS relatív mennyiségében (16. ábra). Ez arra utal, hogy az agyterület milyenségén kívül számos egyéb faktor is meghatározza az RNS-ek mennyiségét, amelyekre nézve egyes minták jelentősen eltérhetnek. Az agymintákról rendelkezésemre álló háttérinformációk alapján is elemeztem az adatokat. Az elemzés azt mutatta, hogy a humán tripszinogén 4 mRNS relatív mennyisége nem függ a post mortem időtől, a minta kivételétől eltelt tárolási időtől, sem az egyén korától. A párhuzamos minták közti jelentős eltéréseket tehát valamely egyéb tényező vagy tényezők okozhatják, mint például az egyén fiziológiás vagy patológiás állapota.
76
16. ábra A humán tripszinogén 4 mRNS relatív mennyiségének összehasonlítása azonos agyterületekből származó párhuzamos mintákban. Az amygdala minták esetén a különbség tizennégyszeres, míg a kisagy kéreg egyedi mintái közt csak másfélszeres különbség van. Az eltérés oka lehet a minták eltérő egyénből való származása, az egyének eltérő fiziológiás vagy patológiás állapota, illetve számos egyéb faktor.
Az azonos agyterületekből származó párhuzamos minták adatait átlagolva a 17. ábrán bemutatott eloszlási képet kaptam. A humán tripszinogén 4 mRNS relatív mennyisége a vizsgált agyterületekben a β-aktin mRNS mennyiségéhez viszonyítva 37,4%. A legnagyobb különbség a kérgi fehérállomány és a kisagy kéreg minták között figyelhető meg, itt az eltérés 24-szeres. Az adatokat variancia analízissel elemeztem az Origin v7.5 software segítségével. A nullhipotézis az volt, hogy az egyes agyterületekben mért relatív mennyiségek átlagai azonosak, míg az alternatív hipotézis szerint egy vagy több agyterületben a mért relatív arány átlaga eltér a többi terület átlagától. 0,01-os szignifikancia szint mellett az egyes agyterületekben a humán tripszinogén 4 mRNS relatív mennyisége szignifikánsan eltérő. Megfigyelhető továbbá, hogy az evolúciósan ősibb agyterületeken, például a bulbus olfactoriusban, nyaki gerincvelőben, nyúltvelőben a humán tripszinogén 4 mRNS-ének relatív mennyisége alacsonyabb, mint a filogenetikai szempontból fiatalabb agyi régiókban, mint például a kisagy kéregben, occipitalis cortexben (17. ábra). Ez utalhat arra, hogy a humán tripszin 4 funkciója inkább az evolúciósan újabb agyterületekkel asszociált. Meg kell jegyeznünk azonban, hogy a központi idegrendszerben betöltött funkció szempontjából a fehérje mennyisége a releváns, amiről az mRNS mennyisége nem feltétlenül ad információt. 77
17. ábra A humán tripszinogén 4 mRNS-ének β-aktinhoz viszonyított mennyisége különböző agyterületekben. Az evolúciósan ősibb agyi régiókban kisebb a humán tripszinogén 4 mRNS relatív mennyisége, mint az evolúciósan újabb területekben.
78
5.4 A vad típusú és az R193G mutáns humán tripszin 4 és a 4-metilumbelliferil 4-guanidinobenzoát szubsztrát analóg reakciójának kinetikai és termodinamikai elemzése Doktori munkám ezen részének célja az volt, hogy azonosítsam azokat az enzimatikus lépéseket, amelyeket befolyásol a Gly193Arg mutáció a humán tripszin 4-ben, továbbá célunk volt a vad típusú és az R193G mutáns humán tripszin 4 szubsztrát hidrolízise közti termodinamikai különbségek vizsgálata is. Ebből a célból expresszáltam a vad típusú, illetve az R193G mutáns humán tripszin 4-et és tanulmányoztam a reakciójukat 4-metilumbelliferil 4-guanidinobenzoát (MUGB) fluorogén szubsztrát analógon stopped flow készüléket használva. A választott szubsztrát analóg azért alkalmas a méréshez, mert a dezacilezés a MUGB esetén lassabb, mint az acilezés, és az egyedi sebességi állandók egyértelmű meghatározásának feltétele, hogy az utolsó reakciólépés legyen a sebesség-meghatározó.
5.4.1. Az időgörbék lefutása A 18. ábrán tipikus stopped flow mérési görbék láthatók a vad típusú és az R193G mutáns humán tripszin 4 MUGB-bal való reakciójáról pszeudo-elsőrendű reakciókörülmények között (Tóth és mtsi. 2006a). A reakciók során a fluoreszcencia változás időgörbéje egy burst fázist követő lineáris fázissal jellemezhető mindkét enzim esetén.
79
80
18. ábra Stopped flow mérések a vad típusú (A) és az R193G mutáns (B) humán tripszin 4 4-metilumbelliferil 4-guanidinobenzoát észter szubsztráttal való reakciójáról 36 és 12 °C-on. 0,1 µM vad típusú és R193G mutáns humán tripszin 4-et gyorskeveréssel reagáltattam 60 µM, illetve 200 µM szubsztráttal, és 365 nm-es gerjesztés mellett követtem a fluoreszcencia emissziót egy 420 nm-es vágószűrőn keresztül. Az itt bemutatott adatokat logaritmikus időskálán vettem fel. Az analizált görbék 4-7 időgörbe átlagai. Az időgörbéket kettős exponenciális függvénnyel lehet leírni (folyamatos vonal), melyet egy lineáris fázis követ. A lineáris fázis (steady state) meredekségét 30-100 másodperces mérésekből határoztam meg (pl. C), és levontam a tranziensekből a kétfázisú burst jobb láthatóvá tételéhez. (F(t) = A gyors × e-k obs gyors× t + A lassú × e-k obs lassú × t + F∞), ahol F(t) a fluoreszcencia a t időpontban, A az amplitúdó, k a megfigyelt sebességi állandó (observed rate constant) és F∞ a végső fluoreszcencia intenzitás. A mérési adatokra illesztett egy exponenciálisokat (szaggatott vonal) is bemutatom, hogy kiemeljem a tranziensek jellegének eltérését egy egyfázisú burst-től. C: Lineáris időskálájú mérések 0,1 µM vad típusú (●) illetve R193G mutáns (○) humán tripszin 4 és 15 µM 4-metilumbelliferil 4-guanidinobenzoát szubsztrát analóg reakciójáról. A méréseket 20 mM Tricin, pH 8,0, 10 mM CaCl2 összetételű pufferben végeztem 20 °C-on.
A burst fázis egy kettős exponenciálissal írható le, melyhez egy gyors és egy lassú megfigyelt sebességi állandó (observed rate constant, kobs) rendelhető. Ezen sebességi állandók függése a szubsztrátkoncentrációktól hiperbolikus (19. ábra), ami arra utal, hogy a reverzibilis szubsztrátkötési lépést legalább egy további lépés követi. A fluoreszcens jel ezen további lépések, azaz a kémiai reakció során keletkezik. A burst kétfázisú jellege két különböző, kinetikailag szétválasztható eseményre utal a MUGB hidrolízise során, és azt is mutatja, hogy ezek közül az első egy reverzibilis lépés. Végül, a burstöt követő lineáris szakaszt a dezacilezés következtében felszabaduló regenerált enzim keletkezése eredményezi.
81
5.4.2 A megfigyelt sebességi állandók szubsztrátkoncentráció-függése
19. ábra A kettős exponenciális függvények illesztéséből származó sebességi adatok a vad típusú (A), illetve az R193G mutáns (B) humán tripszin 4 MUGB szubsztráttal való reakciójáról, a szubsztrátkoncentráció függvényében ábrázolva. Az időgörbéket egy kétfázisú burstöt követő lineáris fázis jellemzi. A reakcióprofilokat kettős exponenciális függvények illesztésével elemeztem. Az ábrán a burst gyors (●) és lassú fázisához (▲) rendelhető megfigyelt sebességi állandók láthatók a vad típusú (A) és az R193G mutáns (B) humán tripszin 4 esetén. A megfigyelt sebességi állandók hiperbolikusan függtek a szubsztrátkoncentrációtól. Az elemi sebességi állandókat az illesztett hiperbolák paramétereiből számoltuk.
A
megfigyelt
sebességi
állandók
hiperbolikusan
függtek
a
szubsztrátkoncentrációtól. A megfigyelt sebességi állandókat a szubsztrátkoncentráció 82
függvényében ábrázolva eltérő profilt eredményezett a két enzim esetében (19. ábra). A gyors fázis 148 µM MUGB-nál érte el a fél-telítést és maximális sebessége 9,95 ± 0,4 s-1 a vad típusú enzim esetében, és 23,9 ± 1,4 s-1-os értéket ért el 58 µM-os féltelítéssel az R193G mutáns enzim esetén 20 °C-on. A gyors fázis megfigyelt sebességi állandóját ábrázolva a szubsztrátkoncentráció függvényében, majd ennek kezdeti szakaszára egy egyenest illesztve annak tengelymetszete 0,23 ± 0,04 s-1, meredeksége pedig 0,068 ± 0,0004 µM-1s-1 a vad típusú enzim esetén, míg ezek értéke 0,042 ± 0,006 s-1 és 0,38 ± 0,019 µM-1s-1 az R193G mutáns esetében. A lassú fázist jelentősen alacsonyabb szubsztrátkoncentrációnál lehetett telíteni, és maximális sebessége 0,42 ± 0,03 s-1 volt a vad típusú enzimnél és 1,44 ± 0,27 s-1 a 193-as pozícióban glicinnel rendelkező enzimvariánsnál. A gyors fázis amplitúdója növekvő hiperbolikus, míg a lassú fázisé csökkenő hiperbolikus függést mutatott a szubsztrátkoncentrációtól a vad típusú humán tripszin 4 esetében. Ezzel szemben az R193G mutánsnál a gyors és a lassú fázis amplitúdója állandó volt a vizsgált szubsztrátkoncentráció
tartományban.
Mindazonáltal,
telítési
szubsztrátkoncentrációknál a gyors fázis a domináns mindkét enzim esetében: a gyors fázis relatív amplitúdója 20 °C-on a teljes amplitúdó (jelváltozás) 95%-át teszi ki a vad típusú enzim esetében és a 85%-át az R193G mutáns esetén.
5.4.3 A reakció leírására felállított modell és annak validálása A
burst
kétfázisú
jellege
és
a
megfigyelt
sebességi
állandók
szubsztrátkoncentrációtól való hiperbolikus függése alapján a következő négylépéses sematikus modellt feltételeztük a reakció jellemzésére:
1. modell
melyben E a szabad enzimet, S a szubsztrátot (MUGB) jelöli, C a kovalens enzimszubsztrát komplex, P1 és P2 az első (4-metilumbelliferon) és a második (guanidinobenzoát) terméket jelenti. A fluoreszcens jelet adó specieseket csillaggal jelöltem meg.
83
A feltételezett mechanizmus igazolására megvizsgáltam, hogy a fluoreszcens jel a szubsztrát kötése közben, vagy az ezt követő reakciólépések során keletkezik. Ezen kísérletekhez az S195A mutáns humán tripszin 4-et használtam, amely képes a MUGB megkötésére, de nem katalizálja az acilezést. A MUGB és a katalitikusan inaktív enzimvariáns gyors összekeverésekor nem tudtunk fluoreszcencia változást detektálni. Ez arra utal, hogy a fluoreszcens jel túlnyomó része nem a kötési lépéskor keletkezik. Az időgörbék kezdeti szakaszán egy „lag” fázis megjelenése volt várható, mivel azt a lépést, amely során a fluoreszcens jel keletkezik, megelőzi egy másik lépés, a szubsztrát megkötése. Azonban a tranziensekben nem volt detektálható a lag fázis. A teljes fluoreszcens szignál 5%-ának megjelenése a MUGB-nak az enzim aktív helyéhez való kötésére egy lehetséges magyarázat a lag fázis hiányára. Ezt a feltételezést megerősítettük a reakció modellezésével a Berkeley Madonna v.8.0.1 szoftver (www.berkeleymadonna.com) segítségével, ami azt mutatta, hogy a kötési lépés során megjelenő kismértékű fluoreszcencia intenzitás növekedés képes kompenzálni a lag fázist,
ami
ezáltal
detektálhatatlanná
válik.
Azt
is
feltételeztük,
hogy
a
4-metilumbelliferon fluoreszcencia intenzitása nem változik jelentősen az enzim felszínéről való disszociáció hatására. A detektált jel kettős exponenciálissal írható le, ha a reakció során a jelváltozás kialakulása megoszlik két populáció között (E•S → C* →E-P2 + P1**, ahol a csillag a fluoreszkáló specieseket jelzi, a csillagok száma pedig a fluoreszcencia intenzitására utal, tehát a séma második lépésében is történik jelváltozás). Azonban kettős exponenciálist kapunk akkor is, ha a jel kialakulása ugyan nem oszlik meg két populáció között, viszont a jel egy gyors előegyensúllyal keletkezik, amit egy lassabb irreverzibilis lépés követ (k3) (E•S
C* → E-P2 + P1*). Ekkor az egyensúly, amivel
a jel keletkezik, gyorsan beáll, ez adja a gyors fázis amplitúdóját. Mivel azonban az egyensúlyt követi egy irreverzibilis lépés, ez “elszívja” az előegyensúlyban keletkezett C* populációt, ezáltal újra keletkezhet a jelet még nem szolgáltató E•S készletből jeladó populáció, amelynek populáltságát az előegyensúlynak a termék visszaalakulása irányába mutató sebességi állandója (k-2) határozza meg. Ez adja a lassú fázis amplitúdóját. A jelkeletkezés ezen mechanizmusát támasztja alá az is, hogy a szubsztrátkoncentráció növelésével a jel kialakulását megelőző reverzibilis lépés egyre irreverzibilisebbé válik, ezért a gyors fázis relatív amplitúdója (amplitúdó gyors/(amplitúdó gyors
+ amplitúdó
lassú)
nő. A gyors és a lassú fázis amplitúdójának
84
arányát tehát a kovalens enzim-szubsztrát komplex képződésének egyensúlyi állandója (K2) határozza meg (K2 = amplitúdó gyors fázis/amplitúdó lassú fázis).
5.4.4 Az elemi reakciólépések sebességi állandóinak származtatása A gyors és a lassú fázis amplitúdójának arányát tehát a kovalens enzimszubsztrát komplex képződésének egyensúlyi állandója (K2) határozza meg (K2 = amplitúdó
gyors fázis/amplitúdó lassú fázis).
Mivel a második reakciólépés egy elsőrendű
reverzibilis reakció, melyek esetében a megfigyelt sebességi állandó a termékképződés és a termék visszaalakulása irányába mutató sebességi állandó (forward és reverse rate constant) összegével egyenlő (kobs = kforward + kreverse), a gyors fázis megfigyelt sebességi állandója egyenlő lesz a második reakciólépés termékképződés irányába és a termék visszaalakulása irányába mutató sebességi állandójának összegével (kobs gyors fázis = k2 + k-2). Ebből a k2-t behelyettesítve K2 × k-2-vel és a kifejezést átrendezve kapjuk a következő összefüggést: kobs gyors fázis = k2 × (K2 + 1)/K2. A szubsztrátkötési lépés egyensúlyi
állandója
(Kd
=
k-1/k1)
a
gyors
fázis
megfigyelt
sebességi
állandó-szubsztrátkoncentráció függvény meredekségéből származtatható (kobs gyors fázis kezdeti meredekség = k2/Kd). Mivel a harmadik reakciólépést egy előegyensúly előzi meg, ez befolyásolja a reakciólépés sebességét. A lassú fázis megfigyelt sebességi állandója a második reakciólépés egyensúlyi állandójából (K2) és a harmadik lépés sebességi állandójából számolható (kobs lassú fázis = k3 × K2/(K2 + 1). Könnyen belátható, hogy miért kell a sebességi állandók egyszerű összegzése (kobs lassú fázis = k3 + k-3) helyett a lépést megelőző előegyensúly egyensúlyi állandójával is számolnunk. Abban az esetben, ha k2 >> k-2, azaz az előegyensúly erősen el van tolva a termékkeletkezés irányába, a K2/(K2 + 1) hányados 1-hez tart, tehát nem limitálja a harmadik reakciólépés megfigyelt sebességi állandóját. Ezzel szemben, ha k2 << k-2, a K2/(K2 + 1) hányados értéke egynél kisebb lesz, összhangban azzal, hogy az előegyensúly limitálja a harmadik lépés sebességét. A k-3-at elhanyagoljuk a számolás során, mivel a termék (E-P2) mennyisége a szubsztrátéhoz képest elhanyagolhatóan kicsi, illetve az első termék (P1) disszociál az enzimről, tehát a harmadik reakciólépés irreverzibilis. A második reakciólépés esetén a K1/(K1 + 1) hányados értéke egyhez tart, mivel a második reakciólépést megelőző esemény a MUGB megkötése, ami erősen el van tolva a termékképződés irányába. 85
Ezért a második reakciólépés megfigyelt sebességi állandójának (kobs 2) számolásakor az előegyensúly korrigáló hányadosa kiesik. Végezetül, a burstöt követő lineáris fázis a steady state-nek felel meg. A burst nagysága egyenlő a gyors és a lassú fázis amplitúdójának összegével. Továbbá, ha a termék enzimhez való visszakötődése elhanyagolható, és ha a termékfelszabadulás legalább egy nagyságrenddel lassabb, mint az ezt megelőző lépések sebessége, egy enzimatikus ciklus alatt ugyanannyi termék keletkezik, mint amennyi enzim volt a reakcióban, tehát a burst nagysága egyenlő a bemérési enzimkoncentrációval. A dezacilezés sebessége a fluoreszcencia változása az időben a lineáris fázisban, azaz a lineáris fázis meredeksége. A dezacilezés sebességi állandóját a sebességet a guanidinobenzoil tripszin koncentrációjával elosztva kapjuk meg, ami nagy szubsztrátfelesleg esetén egyenlő a bemérési enzimkoncentrációval. Mivel a bemérési enzimkoncentráció a két fázis amplitúdójának összegével azonos, a dezacilezés sebességi állandóját a k4 = steady state meredeksége/(amplitúdó lassú fázis)
gyors fázis
+ amplitúdó
összefüggésből számolhatjuk. Az elemi sebességi állandókat a fentiekben
levezetett és az I. táblázatban bemutatott 11.-15. egyenletekkel számoltam, és a II. táblázatban foglalom össze.
K2 = amplitúdó gyors fázis/amplitúdó lassú fázis
11. egyenlet
k2 = K2 × kobs gyors/(K2 + 1)
12. egyenlet
k-2 = kobs gyors - k2 = k2/K2
13. egyenlet
k3 = kobs lassú × (K2 + 1)/K2
14. egyenlet
k4 = steady state meredeksége/(amplitúdó gyors + amplitúdó lassú)
15. egyenlet
I. táblázat Az elemi sebességi állandók és a második reakciólépés egyensúlyi állandójának számolására használt 11.-15. egyenlet
86
5.4.5 A vad típusú és az R193G mutáns humán tripszin 4 katalitikus ciklusának összehasonlítása Doktori munkám ezen részében a humán tripszin 4-ben az R193G szubsztitúció hatását tanulmányoztam a katalízis folyamatára 4-metilumbelliferil 4-guanidinobenzoát szubsztráton. Tranziens kinetikai módszerrel azt vizsgáltam, hogy melyik reakciólépést, illetve reakció állapotot befolyásolja ez a mutáció. A szubsztráttelítési kísérletekből származó adatokat a II. táblázatban mutatom be.
hTry4WT
hTry4R193G
k2 (s-1)
9,19 ± 0,01
20,22 ± 1,4
k-2 (s-1)
0,81 ± 0,05
3,56 ± 0,006
k3 (s-1)
0,46 ± 0,02
1,70 ± 0,3
k4 (s-1)
(1,85 ± 0,51) × 10-3
(3,28 ± 3,1) × 10-4
K2
11,4 ± 0,7
5,68 ± 0,4
II. táblázat A vad típusú, illetve az R193G mutáns humán tripszin 4 és a 4-metilumbelliferil 4-guanidinobenzoát szubsztrát reakcióját leíró elemi sebességi állandók (k2, k-2, k3, k4) és a második reakciólépés egyensúlyi állandója (K2) 20 °C-on. 0,1 µM enzimet reagáltattam gyorskeveréssel stopped flow készülékben növekvő koncentrációjú szubsztráttal a telítés eléréséig. A fluoreszcencia intenzitás változását követtem 365 nm-es gerjesztés mellett az emissziót egy 420 nm-es vágószűrőn keresztül detektálva. A tranziensekre kettős exponenciálist követő lineáris függvényt illesztettem. Az elemi sebességi állandókat az I. táblázatban összefoglalt 11.-15. egyenlettel számoltam. Az értékek 3 illetve 2 független adatsor átlagai és standard hibái a vad típusú és az R193G mutáns enzim esetében, és minden elemzett mérési görbe 5-7 felvett időgörbe átlaga.
Az egyensúlyi disszociációs állandó a két enzim esetében 2-3-szoros különbséget mutat (Kd
hTry4WT
= 136 ± 1 µM, Kd
hTry4R193G
= 53,6 ± 6,6 µM) ami arra
utal, hogy energetikailag az R193G mutációnak nincs jelentős hatása a MUGB kötésének erősségére (293 K-en ∆G°
kötési hTry4WT
= -11,9 kJmol-1, ∆G°
kötési hTry4R193G
=
-9,7 kJmol-1). A kovalens enzim-szubsztrát komplex képződése mindkét enzim esetében reverzibilisnek bizonyult. Ezen reakciólépés termékképződés irányába mutató sebességi állandója kétszer kisebb a vad típusú enzim esetén (k2 hTry4R193G
hTry4WT
= 9,19 ± 0,01 s-1, k2
= 20,2 ± 1,4 s-1) a termék visszaalakulása irányába mutató sebességi állandója
pedig 4-szer kisebb (k-2 hTry4WT = 0,81 ± 0,05 s-1, k-2 hTry4R193G = 3,56 ± 0,006 s-1), ezért a második reakciólépés egyensúlya erősebben el van tolva a termékképződés irányába a
87
vad típusú enzim esetében (K2
hTry4WT
= 11,4 ± 0,7, K2
hTry4R193G
= 5,7 ± 0,4). A
következő esemény 3-4-szer lassabb a vad típusú enzimben (k3 hTry4WT = 0,46 ± 0,02 s-1, k3 hTry4R193G = 1,70 ± 0,29 s-1). Mindkét enzim esetén a szubsztrátnak turnovere van, tehát a termék disszociál az enzim felszínéről. A vad típusú enzim általi dezacilezés kissé (5-6-szor) gyorsabb, mint az R193G mutáns esetében (k4 hTry4WT = (1,85 ± 0,51) × 10-3 s-1, k4 hTry4R193G = (3,28 ± 3,06 )× 10-4 s-1).
5.4.6 A második és harmadik reakciólépés termodinamikai paraméterei A szubsztráthidrolízis termodinamikájának vizsgálata céljából a 6-36 ºC-os hőmérsékleti tartományban követtem a vad típusú, illetve az R193G mutáns humán tripszin 4 és a MUGB reakcióját. A sebességi állandók és a második reakciólépés egyensúlyi állandójának (K2) hőmérsékletfüggését a linearizált Eyring illetve van’t Hoff ábrázolásokkal elemeztem (III. táblázat, 20. és 21. ábra).
88
20. ábra A második reakciólépés termékképződés irányába mutató (k2) (■) és a termék visszaalakulása irányába mutató sebességi állandójának (k-2) (○) Eyring ábrázolása a vad típusú (A) és az R193G (B) mutáns humán tripszin 4 esetében. 0,1 µM enzim reakcióját vizsgáltam telítési koncentrációjú 4-metilumbelliferil 4-guanidinobenzoát szubsztráttal 3 °C-onként a 6-36 °C-os hőmérsékleti tartományban. A reakciókat 20 mM Tricin, pH 8,0 ± 0,1, 10 mM CaCl2 pufferben végeztem. Az elemi sebességi állandókat a 11.-13. egyenletek segítségével számoltam, majd az ln (k/T) értékeket ábrázoltam az 1000/T függvényében. Az aktiválási paramétereket az adatokra illesztett lineáris függvények meredekségéből és tengelymetszetéből számoltam az 1. és 2. egyenlet alapján.
89
21. ábra A második reakciólépés egyensúlyi állandójának (K2) van’t Hoff ábrázolása a vad típusú (●) és az R193G mutáns (○) humán tripszin 4 esetében. A reakciósebességek hőmérsékletfüggését 0,1 µM enzim telítési koncentrációjú MUGB szubsztráttal való reakcióján vizsgáltam 3 °C-onként a 6-36 °Cos hőmérsékleti tartományban. A reakciókat 20 mM Tricin, pH 8,0 ± 0,1, 10 mM CaCl2 pufferben végeztem. Az elemi sebességi állandókat és egyensúlyi állandókat a 11.-13. egyenlet alapján számoltam, majd az ln K2 értékeket ábrázoltam az 1000/T függvényében. A termodinamikai paramétereket az adatokra illesztett lineáris függvények meredekségéből és tengelymetszetéből számoltam a 3. és 4. egyenlet segítségével.
A standard szabadentalpia (∆Hº), entrópia (∆Sº) és standard szabadenergia (∆Gº)
változás
értékeket
a
van’t
Hoff
ábrázolás
meredekségéből
illetve
tengelymetszetéből származtattam, mivel a K2-t közvetlenül meghatározza a gyors és a lassú fázis amplitúdójának aránya, míg a k-2 a K2-ből származtatott paraméter (I. táblázat). A második, reverzibilis reakciólépés standard szabadenergia változása (∆Gº) 293 K-en negatív mindkét enzimre nézve. Meg kell jegyezni azonban, hogy a van’t Hoff ábrázolások lefutása feltűnően különböző a két enzim esetében. Ez a reakciólépés a vad típusú humán tripszin 4-ben erősen exoterm (∆H° nagy standard entrópia csökkenés kíséri (∆S°
hTry4WT
hTry4WT
= -74,1 kJmol-1), és
= -0,23 kJmol-1K-1) ami biztosítja
ezen reakciólépés reverzibilitását 293 K-en. Ezzel szemben, az R193G mutánsban a második reakciólépés endoterm (∆H° hTry4R193G
hTry4R193G
= 22,1 kJmol-1) és entrópia-hajtott (∆S°
= 0,09 kJmol-1K-1). Összehasonlítva a második reakciólépés aktiválási
paramétereit, feltűnő különbséget találunk a két enzim között (III. táblázat). A termék visszaalakulása irányába mutató reakciólépés (k-2) Eyring ábrázolásának meredeksége és tengelymetszete a vad típusú enzim esetében nagymértékben eltér a mutáns enzimétől. Ennek megfelelően, az aktiválási szabadentalpia értékei ∆H‡ -2 hTry4R193G =
90
55,0 kJmol-1 és ∆H‡
-2 hTry4WT
= 165 kJmol-1, az aktiválási entrópia értékei
∆S‡ 2 hTry4R193G = -0,05 kJmol-1K-1 és ∆S‡ 2 hTry4WT = 0,32 kJmol-1K-1 a két enzim esetén. A harmadik reakciólépés (k3) kissé lassabb a vad típusú enzimben, mint az R193G mutánsban, amelyet a termodinamikai paraméterek között talált csekély különbségek tükröznek (III. táblázat).
hTry4WT k2
a
k-2
a
hTry4R193G
K2
b
k3
a
k2
a
k-2 a
K2 b
k3 a
meredekség
-10,9 ± 0,5
-19,9 ± 1,4
8,9 ± 1,6
-7,1 ± 1,1
-9,3 ± 0,6
-6,6 ± 0,7
-2,7 ± 0,3
-2,6 ± 1,3
tengelymetszet
33,6 ± 1,8
61,8 ± 4,6
-28,1 ± 5,4
18,3 ± 3,9
28,5 ± 2,2
18,1 ± 2,3
10,3 ± 0,9
3,7 ± 4,4
∆H‡ (kJmol-1)
91,0
165
-
58,9
77,1
55,0
-
21,6
∆S‡ (kJmol-1K-1)
0,08
0,32
-
-0,05
0,04
-0,05
-
-0,17
∆G‡ (kJmol-1)
67,0
72,5
-
72,1
65,7
68,8
-
70,5
∆H° (kJmol-1)
-
-74,1
-
-
22,1
-
∆S° (kJmol-1K-1)
-
-0,23
-
-
0,09
-
∆G° (kJmol-1)
-
-5,6
-
-
-3,1
-
III. táblázat A vad típusú, illetve az R193G mutáns humán tripszin 4 és a 4-metilumbelliferil 4-guanidinobenzoát reakciójának aktiválási és termodinamikai paraméterei. Az aktiválási és termodinamikai paramétereket az 1-4. egyenlet alapján számoltam. A meredekségek és tengelymetszetek értékei az illesztett lineáris függvények átlagait és standard hibáit reprezentálják. A ∆H‡, ∆H○, ∆G‡ és ∆G○ értékek 293 K-re vonatkoznak. a b
ezen paraméterek értékei az Eyring ábrázolásból származnak ezen paraméterek értékei a van’t Hoff ábrázolásból származnak
91
5.4.7 A vad típusú és R193G mutáns humán tripszin 4 MUGB szubsztráton mért kinetikai és termodinamikai paramétereinek értelmezése 5.4.7.1 Az egyedi reakciólépések szeparálását lehetővé tevő szerkezeti okok
Doktori dolgozatom ezen részében a humán tripszin 4-ben az R193G mutáció hatását vizsgáltam gyorskinetikai módszerekkel 4-metilumbelliferil 4-guanidinobenzoát fluorogén
szubsztrátot
használva.
Egy
korábbi
tanulmányban
leírták
a
guanidinobezoil-tripszin térszerkezetét, amely az acil-enzim intermediernek felel meg (Mangel és mtsi. 1990). E munka betekintést enged a lassú dezacilezés szerkezeti alapjaiba. A guanidinobenzoil-tripszin szerkezete néhány régióban feltűnően eltér a natív enzim szerkezetétől, és az észterkötés karbonil szénatomja körüli geometria szintén torzult. Ennek következményeként az enzim aktív helyénél elhelyezkedő rendezett hidrolítikus vízmolekulák nincsenek elég közel a hasadó észterkötéshez ahhoz, hogy nukleofil támadást indítsanak. Az a tény, hogy a reakciómechanizmus utolsó lépése, azaz a dezacilezés a sebesség-meghatározó lépés, illetve egy tranziens kinetikai technika alkalmazása együttesen tette lehetővé, hogy az egyes elemi reakciólépéseket megbízhatóan szeparálhassam és meghatározhassam sebességi állandójukat. 5.4.7.2 A tranziens kinetikai adatok alapján felállított finomított modell
A szubsztráttelítési adatok alapján egy finomított modellt javaslunk a humán tripszin 4 illetve ennek R193G mutánsa és a MUGB szubsztrát reakciójának leírására. Korábbi tanulmányokban (Payne és mtsi. 1996; Urano és mtsi. 1988) különböző szerin proteázok MUGB-al való reakcióját steady state kinetikával vizsgálták, és a mechanizmust egy reverzibilis szubsztrátkötési lépésből, és az azt követő két irreverzibilis lépésből, az acilezésből és a dezacilezésből építették fel. A tranziens kinetikai módszerek alkalmazása lehetővé tette a folyamat részletesebb kinetikai elemzését, és feltárta, hogy a burst kétfázisú. Ezt a jelenséget már megfigyelték szarvasmarha tripszin és humán trombin esetében 4-nitrofenil 4-guanidinobenzoát szubsztrát analógon (Ryan és mtsi. 1976; Vajda és Náray-Szabó 1988), melynek más ugyan a távozó csoportja, de az acilező rész azonos a MUGB-éval, ám a jelenséget nem
92
vizsgálták részleteiben. A kétfázisú burst egy a szubsztrátkötést követő reverzibilis és egy irreverzibilis lépés elkülöníthetőségére utal a mechanizmusban. Annak alapján, hogy a MUGB kötése az S195A mutánshoz nem okozott fluoreszcencia intenzitás növekedést, és ismerve, hogy az első felszabaduló termék (4-metilumbelliferon) fluoreszcens, ezen két lépést a kötési lépés és a dezacilezés közötti eseményekhez kell kötnünk. Következésképpen két lehetséges magyarázatot kell megfontolnunk ezekre a kinetikailag
szeparálható
reakciómechanizmusban
az
lépésekre:
(i)
acilezés,
és
a a
második, harmadik,
reverzibilis
lépés
a
irreverzibilis
lépés
a
4-metilumbelliferonnak az enzim felszínéről való disszociációjának felel meg, vagy (ii) a második, reverzibilis lépés az első tetraéderes intermedier (TI1) kialakulása, a harmadik lépés pedig az acilezés, amely a távozó csoportnak az enzim felszínéről való gyors disszociációjához kapcsolt, ezért irreverzibilis lépésként jelentkezik. Az a megfigyelés, hogy az umbelliferil távozó csoporttal rendelkező tripeptid szubsztrát analógok kitűnő szubsztrátjai a tripszinnek (Kuromizu és mtsi. 1985), arra utal, hogy a 4-metilumbelliferon nagyon gyorsan disszociál az enzim felszínéről, ezért az első feltételezést kizárhatjuk. Egy finomított reakciómechanizmust javaslunk tehát, melyben a szubsztrát kötését a TI1 reverzibilis keletkezése követi, a harmadik, irreverzibilis esemény az acilezés, az utolsó reakciólépés pedig a dezacilezés. A sémában csillaggal jelöltem meg a fluoreszkáló specieseket.
2. modell
A katalitikus ciklus első történése a MUGB reverzibilis kötése (k1, k-1) a szubsztrátkötő helyhez, mely a nem-kovalens enzim-szubsztrát Michaelis komplex kialakulásához vezet. A kötési eseményt a Ser195 hidroxil csoportjának nukleofil támadása követi a hasadó észterkötésre, mely a TI1 reverzibilis kialakulásához vezet (k2, k-2). A harmadik lépés a TI1 felbomlása (k3a) az első termékre (a 4-metilumbelliferonra, MU) és az acil-enzimre (a guanidinobenzoil-tripszinre, E-GB). Ez a lépés szorosan kapcsolt a fluoreszcens csoport gyors disszociációjával (k3b), ezért irreverzibilis lépésként jelentkezik. Az utolsó esemény a dezacilezés (k4) egy aktivált vízmolekula által, amikor is a második termék (a guanidinobenzoát, GB) szintén távozik, és az enzim
93
visszanyeri aktív konformációját. A reakciómechanizmus utolsó lépése az enzim regenerálódásához vezet, amely beléphet a következő katalitikus ciklusba. 5.4.7.3 A G193R mutáció hatása az egyes reakciólépések sebességére
Adataim arra utalnak, hogy a katalitikus ciklus minden lépését valamelyest érinti a mutáció. A Kd értéke a harmadára csökken a mutáns enzimben, tehát a mutáció hatására nem változik meg jelentősen a szubsztrátkötés erőssége. Ezt az eredményt alátámasztja, hogy egy hasonló szerkezetű molekula, a benzamidin inhibíciós konstansa azonos ezen enzimek esetében (Medveczky és mtsi. 2003). Azt találtuk, hogy a tripszin MUGB-al való reakciója során az első tetraéderes intermedier (TI1) (definícióját ld. 1.5 fejezet) kialakulása reverzibilis. Ezen reakciólépés egyensúlya 20 °C-on erősebben el van tolva a termékképződés irányába, ha a 193-as pozíciót egy arginin foglalja el a glicin helyett. Meg kell azonban jegyeznünk, hogy mindkét enzimben a TI1 kialakulása gyorsabb, mint az acilezési lépés. Ez nem egyedi reakciómechanizmus a proteázok között. A kimotripszin specifikus észter és tioészter szubsztrátok általi acilezésén alapuló kinetikai bizonyítékok (Hiroara és mtsi. 1974) és kvantumkémiai számolások is (Ishida és Kato 2003) a TI1 reverzibilis képződősére utalnak. Azonban ezekben a tanulmányokban a TI1 sebesség-meghatározó képződését írták le, melyet az acil-enzim azonnali képződése követ. Másfelől viszont egy nemrégiben megjelent, szubtilizin variánsokról szóló közleményben (Bott és mtsi. 2003) és egy másik, elasztázzal és αlítikus proteázzal foglalkozó tanulmányban (Hunkapiller és mtsi. 1976) a TI1 lebomlásának sebesség-meghatározó voltát írták le a hidrolítikus lépés során. A guanidinobenzoil-tripszin szerkezetének elemzéséből (1gbt, Mangel és mtsi. 1990) egyértelműen levonható a következtetés, hogy az acil-enzim kialakulása során a Ser195 β szénatomjának pozíciója számottevően (~0,7 Å-mel) elmozdul a szubsztrátkötő zseb felé, mivel a guanidinobenzoil csoport körülbelül 0,5 Å-mel rövidebb, mint egy P1 arginil oldallánc. Ezt az elmozdulást számos egyéb kisebb torzulás kíséri a fehérje szerkezetében, amelyek következtében az acil-enzim extrém stabillá válik. Felvetésünk szerint ezek a szerkezeti átrendeződések tükröződnek a k3 alacsony értékében (a lassú acilezésben) és az acil-enzim komplex extrém stabilitásában mindkét enzim esetén. Az acilezés kissé (3-4-szer) lassabb a vad típusú enzimben. Az acil-enzim komplex mindkét enzim esetében elbomlik, és a dezacilezés kismértékben (5-6-szor) gyorsabb a hTry4WT-ben, mint az R193G mutáns esetében. Az acil-enzim 94
komplex lassabb kialakulása és gyorsabb elbomlása miatt a MUGB nem használható a humán tripszin 4 aktívhely titrálására, és valószínűleg más, a 193-as pozícióban nemglicint hordozó szerin proteázok titrálására sem. Mivel az enzim szerkezete torzult az acil-enzim komplexben, vissza kell nyernie a natív konformációt a dezacilezés során. Ez a relaxáció gyorsabb a vad típusú enzimben, mert valószínűleg elősegítik olyan, a 193as pozícióban glicinnel rendelkező variánsban meglévőhöz képest nagyobb mechanikai feszültségek, amelyek inherens módon jelen vannak a fehérjében, ha ezt a pozíciót egy arginin foglalja el. 5.4.7.4 A G193R mutáció hatása az első tetraéderes intermedier kialakulásának termodinamikájára
Egy
nemrégiben
megjelent
tanulmányban
leírták
a
193-as
pozíció
perturbálásának következményeit trombinban és patkány tripszinben (Bobofchak és mtsi. 2005). Ebben a munkában a reakciók profilját steady state körülmények között elemezték a kcat és Km Michaelis-Menten paraméterek meghatározásával, az elemi sebességi állandókat pedig ezen összetett paraméterek hőmérsékletfüggéséből vezették le. Ezzel szemben, tranziens kinetikai módszerek alkalmazásával az egyedi reakciólépések megbízhatóan szeparálhatók, közvetlenül detektálhatók, és sebességi állandójuk közvetlenül meghatározható. A legfontosabb különbég a vizsgált enzimek közt a TI1 kialakulásának termodinamikájában van. A második reakciólépés energetikáját a termékképződés irányába mutató (k2) és a termék visszaalakulása irányába mutató (k-2) sebességi állandók és az egyensúlyi állandó (K2) hőmérsékletfüggésének vizsgálatával határoztam meg (20. és 21. ábra). Az adatok alapján a TI1 kialakulásának egyensúlyi folyamata az R193G mutáns humán tripszinben egy endoterm folyamat és az entrópia kismértékű növekedése hajtja. Ez arra utal, hogy csak mérsékelt szerkezeti és dinamikai átrendeződések történnek az R193G mutáns enzimben a TI1 keletkezése során. Ezzel szemben, a vad típusú enzimben ez a reakciólépés erősen exoterm és nagy entrópiacsökkenés kíséri, ami kiterjedt szerkezeti átrendeződésekre utal a TI1 kialakulásának egyensúlyi lépése során. A feltételezett szerkezeti átrendeződések vonatkozhatnak az enzimen túl a ligandra, illetve az enzim hidrátburkára is. Mivel a termékképződés irányába mutató reakciólépés (k2) termodinamikája hasonló a két
95
enzimben, a különbség főként a termék visszaalakulása irányába mutató reakció (k-2) eltéréséből ered. Az arginin jelenléte a 193-as pozícióban feszültséget vihet be az aktív tripszin peptidgerincébe, ami magyarázatul szolgálhat a TI1 képződés termodinamikájában talált különbségért. Egy korábbi, a XI-es faktorról készült tanulmányban a vad típusú enzim szerkezetét összehasonlították a G193E mutáns homológia modelljének szerkezetével (Schmidt és mtsi. 2004). Bemutatták, hogy a 193-as pozícióba a glutaminsav könnyedén beilleszkedik a N-Cα és Cα-C’ kötések körül való elfordulás révén szignifikáns szerkezeti változás okozása nélkül, mégis perturbálva az S1 kötőhelyet és az oxianion lyukat. Hasonló magyarázat a humán tripszin 4-re is érvényes lehet. Felvetésünk szerint egy nem-glicin aminosav ebben a pozícióban nem okoz jelentős változásokat az aktív enzim
szerkezetében,
de
mechanikai
feszültséget
ébreszt,
amely
felfedhető
termodinamikai elemzéssel. Továbbá erre a feltételezésre utalnak azon kísérleteimben kapott eredmények is, melyekben pH-ugrásos tranziens kinetikai mérésekkel a vad típusú humán tripszin 4 inaktív konformációból az aktív konformációba való szerkezeti átmenetének sebességi állandója kisebbnek bizonyult, mint az R193G mutánsé (ld. 5.5 fejezet). Mivel az aktiváció során a 193-as pozíció körül nagy elfordulás történik, a kisebb sebességi állandó szerkezeti vagy mechanikai feszültség jelentétére utal a peptidgerinc 192-194-es szakaszában. Következtetésünk szerint a vad típusú humán tripszin 4-ben kiterjedt szerkezeti átrendeződések történnek a TI1 kialakulása során, új kölcsönhatások alakulnak ki, melyek korlátozzák az intermedier dinamikáját, ezáltal csökkentik az entrópiát. A humán
tripszin
4
nem-konvencionális
szerkezeti
és
kinetikai
tulajdonságai
hozzájárulhatnak ezen enzim funkciójához a központi idegrendszerben fiziológiás és/vagy patológiás folyamatokban.
96
5.5
A
pH-ugrással
kiváltott
aktiváció
során
bekövetkező
konformációváltozás gyorskinetikai vizsgálata és termodinamikájának elemzése Az
aktiváció
során
a
szerin
proteázok
aktivációs
doménje
konformációváltozáson megy keresztül, amely a stabilizáló sóhíd perturbálása révén kiváltható pH-ugrással. A folyamat jól követhető, mivel a fehérjében belső jelváltozás kíséri. Célom volt, hogy tanulmányozzam a 193-as pozícióban elhelyezkedő csukló régiót érintő pontmutációk hatását az aktiváció során bekövetkező konformációváltozás sebességére és termodinamikájára. Expresszáltam a vad típusú és a 193-as pozícióban különböző méretű oldalláncú aminosavval rendelkező mutáns humán tripszin 4 variánsokat és követtem az aktiváció során történő konformációváltozásukat a hőmérséklet és az oldat viszkozitásának függvényében pH-ugrásos stopped flow kísérletekben a triptofán fluoreszcencia változást detektálva.
5.5.1 A vad típusú és 193-as pozícióban mutáns humán tripszin 4 variánsok steady state aktivitása Doktori dolgozatom ezen részében a kísérletekhez a vad típusú humán tripszin 4-et és ennek mutánsait használtam, melyekben a 193-as pozíciójú arginint glicin, alanin, fenilalanin illetve tirozin helyettesítette. Hogy megvizsgáljuk, ezek a mutációk befolyásolják-e az enzimatikus aktivitást, megmértük ezeknek a variánsoknak a katalitikus aktivitását amid kötés hidrolízise során Z-Gly-Pro-Arg-pNA szubsztráton. A Michaelis-Menten paraméterek értékeit a IV. táblázatban foglalom össze.
97
kcat (s-1)
Km (µM)
kcat/Km (s-1µM-1)
R193G
110 ± 10
13,5 ± 2,5
8,17 ± 1,68
R193A
124 ± 4
19,8 ± 3,2
6,23 ± 1,02
WT
158 ± 8
25,2 ± 0,6
6,27 ± 0,36
R193F
162 ± 5
27,4 ± 6,7
5,90 ± 1,45
R193Y
133 ± 6
21,3 ± 6,1
6,21 ± 1,80
IV. táblázat A vad típusú és 193-as pozícióban mutáns humán tripszin 4 Z-Gly-Pro-Arg-pNA amid szubsztrát hidrolízisének Michaelis-Menten paraméterei. A méréseket 50 mM Tricin, pH 8,0, 10 mM CaCl2 pufferben végeztem a 4.8 fejezetben leírtak szerint. A Michaelis-Menten paraméterek értékei három mérés átlagát és standard hibáját reprezentálják.
Adataink azt mutatják, hogy a mutációk csak enyhe változásokat okoztak a kcat és a Km értékében. A Km értékben a legnagyobb változás 50%-on belül van, a kcat érték esetében pedig nem haladja meg a 30%-ot. A glicin nagyobb oldalláncú aminosavra való cseréjének hatására a kcat értéke nő, és a növekedés mértéke korrelál az oldallánc méretével. Ugyanez a megfigyelés igaz a Km értékre is. Az aminosavcserék hatására a legnagyobb változás a kcat/Km értékben 30%, ezért ezek a 193-as pozícióban mutáns variánsok mind aktív enzimnek tekinthetők. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Z-Gly-Pro-Arg-pNA
szubsztrát
kötését
és
hidrolízisének
katalízisét
is
csak
kismértékben befolyásolják ezek a mutációk.
5.5.2
A
pH-ugrással
kiváltott
aktiváció
során
bekövetkező
konformációváltozás kinetikai elemzése Az aktiváció során bekövetkező konformációs átrendeződés sebességét pH-ugrásos stopped flow kísérletekben vizsgáltam a fehérjék belső fluoreszcenciájának követésével. Ezekben a kísérletekben a stopped flow egyik fecskendője tartalmazta az enzimet egy relatíve kis pufferkapacitású 11-es pH-jú pufferben, a másik fecskendőbe pedig erős pufferkapacitású 8-as pH-jú puffert töltöttem. A keverés után az oldat pH-ja 8,0 ± 0,1 volt. Ez a pH-ugrás váltotta ki a szerkezeti átrendeződést, melyet a triptofán fluoreszcencia változásának mérésével követtem. Adataim azt mutatják, hogy a konformációváltozás sebességét befolyásolják a 193-as pozíciót érintő mutációk. A
98
193-as variánsok sebességi állandói 20 °C-on a következők: k R193G = 1,66 s-1, k R193A = 0,20 s-1, k WT = 0,077 s-1, k R193Y = 0,13 s-1, k R193F = 0,090 s-1. Itt jegyzem meg, hogy a vad típusú, az R193Y és az R193F mutánsok esetén egy burst fázist is detektáltunk, melynek amplitúdója a teljes fluoreszcenciaváltozás 11-16% között volt, sebességi állandója pedig 7-17-szer nagyobb volt, mint az analizált domináns fázisé.
5.5.3
A
pH-ugrással
kiváltott
aktiváció
során
bekövetkező
konformációváltozás termodinamikájának vizsgálata 5.5.3.1 A konformációs átmenet sebességének hőmérsékletfüggése
Az aktiváció során bekövetkező konformációváltozás termodinamikájának tanulmányozása céljából megmértem a sebességi állandók hőmérsékletfüggését. A konformációváltozás
termodinamikai
paramétereit
a
nem-linearizált
Arrhenius
ábrázolásból (k ábrázolva a T függvényében) származtattam, és az V. táblázatban foglalom össze.
99
22. ábra A vad típusú () és az R193G (■ és □), R193A (● és ○), R193F (%) és R193Y (0) mutáns humán tripszin 4 aktivációja során bekövetkező konformációváltozás sebességi állandójának Arrhenius ábrázolása (ln k ábrázolva az 1/T függvényében). A sebességi állandókat stopped flow, illetve hőugrásos stopped flow kísérletekkel határoztam meg. A konformációváltozás sebességét a 5-38 °C-os hőmérsékleti tartományban egy konvencionális készülékkel határoztam meg 3 °C-onként (teli szimbólumok). 12 ml/sec áramlási sebességet alkalmaztam, és 40 µl térfogatokat kevertem össze 1:1 arányban. 1-4 µM 20 mM CABS, pH 11,0 ± 0,1, 10 mM CaCl2 pufferben oldott enzimet kevertem össze 100 mM Tricin, pH 8,0 ± 0,1, 10 mM CaCl2 pufferrel, és követtem a fluoreszcencia emisszió intenzitásának változását. A 34-60 °C-os hőmérsékleti tartományban egy új, Málnási-Csizmadia András laborjában kifejlesztett hőugrásos stopped flow készülékkel mértem, hogy kiterjesszem az R193G és az R193A variáns Arrhenius ábrázolását (nyitott szimbólumok). A hőugrásos méréseknél 20 µl 20 mM CABS, pH 11,0 ± 0,1, 10 mM CaCl2 pufferben oldott enzimet kevertem össze 100 µl 100 mM Tricin, pH 8,0 ± 0,1, 10 mM CaCl2 pufferrel. A termodinamikai paramétereket az adatokra illesztett y = a exp(b / x ) exponenciális függvények paramétereiből határoztam meg a 4.9.6 fejezetben leírtak szerint.
Az Arrhenius ábrázolások (ln k ábrázolva az 1/T függvényében) lineárisak voltak az 5-45 °C-os hőmérsékleti tartományban (22. ábra). Az adatokat Eyring ábrázolással is elemeztük, melyben a preexponenciális faktor hőmérsékletfüggő, és az illesztés “megbízhatósága” (χ négyzete) nem változott szignifikánsan. Ezenkívül nem találtunk jelentős különbséget az illesztés megbízhatóságában akkor sem, mikor a víz viszkozitásának hőmérsékletfüggésével korrigált Kramers egyenletet illesztettük az adatokra. Legfontosabb felismerésünk az, hogy az Arrhenius ábrázolások lefutása párhuzamos a humán tripszin 4 193-as variánsai esetén. Ez azt mutatja, hogy a konformációs átmenet aktiválási energiáját (Ea) nem befolyásolják az aminosavcserék. Ezért az illesztett exponenciális függvények ‘b’ kitevője (a linearizált Arrhenius ábrázolások meredeksége) gyakorlatilag azonos (22. ábra, V. táblázat). A legnagyobb
100
különbséget az aktiválási energiákban a vad típusú és az R193F mutáns humán tripszin között találtam, mely 4%-ot tesz ki. A többi mutáns aktiválási energiája mindössze 0,82%-kal tért el egymástól. Ezzel szemben, a linearizált Arrhenius ábrázolások tengelymetszete jelentősen eltérő a vizsgált enzimvariánsoknál, ami arra utal, hogy ezek a mutációk szelektíven megváltoztatják az Arrhenius egyenlet preexponenciális tagját. A legnagyobb különbség az R193G és az R193F mutáns között található, az eltérés 26-szoros (V. táblázat).
b
R193G
R193A
WT
R193F
R193Y
-(10,4 ± 0,4)
-(10,7 ± 0,2)
-(10,8 ± 0,3)
-(10,3 ± 0,2)
-(10,5 ± 0,3)
×10
3
×10
3
×10
3
×10
3
×103
Ea (kJmol-1)
86,5 ± 3,4
88,7 ± 1,6
89,5 ± 2,4
85,7 ± 1,9
87,2 ± 2,7
a=A
3,95 × 1015
1,12 × 1015
6,50 × 1014
1,49 × 1014
4,40 × 1014
V. táblázat A vad típusú és a 193-as pozícióban mutáns humán tripszin 4 variánsok nem-linearizált Arrhenius ábrázolásokból származtatott termodinamikai paraméterei. A pH-ugrással kiváltott aktiváció során bekövetkező konformációváltozás sebességét stopped flow készülékkel mértem meg a fehérjék belső fluoreszcencia emisszió változását követve. A kísérleti körülményeket a 4.9.3 és 4.9.4 fejezetben írtam le. A reakciósebességeket az 5-38 °C-os (illetve az R193G és az R193A mutáns esetében a 6-60 °C-os) hőmérsékleti tartományban 3 °C-onként mértem meg. A sebességi állandókat ábrázoltam a hőmérséklet függvényében, majd az y = a exp(b / x ) függvényt illesztettem az adatokra. A termodinamikai paramétereket az illesztett függvény ‘a’ és ‘b’ paraméteréből származtattam a 4.9.6 fejezetben leírtak szerint. Az értékek az illesztett függvények paramétereinek átlagát és standard hibáját reprezentálják.
Az új hőugrásos stopped flow készülék kifejlesztése (Kintses és mtsi. 2006) lehetővé tette, hogy kiterjesszem az Arrhenius ábrázolásokat 60 °C-ig. A lineáris függvénytől való eltérés figyelhető meg 45 °C felett (22. ábra), ami egy másik reakciólépés jelenlétére utal. Meg kell jegyezni azonban, hogy a hődenaturáció 45-60 °C-on a tízmásodperces időskálán történik, amit a fluoreszcencia intenzitás csökkenéseként lehetett detektálni, míg az aktiváció ezeken a hőmérsékleteken több mint egy nagyságrenddel gyorsabb folyamat.
101
5.5.3.2 A konformációs átmenet sebességének függése a reakcióközeg viszkozitásától
A mutációk preexponenciális tagra való hatásának részletesebb vizsgálata céljából
kísérleteket
végeztem,
melyben
a
pufferek
relatív
viszkozitását
megváltoztattam. Kérdésem az volt, hogy a konformációváltozás sebességi állandója csökken-e az oldószer viszkozitásának növekedésével, mint ahogyan azt a Kramers elmélet jósolja. Hogy megválaszoljam a kérdést, pH-ugrásos stopped flow kísérleteket végeztem az R193G és az R193A mutánsokon különböző relatív viszkozitású pufferekben 1-től 8,2-ig 20 °C-on. A megnövekedett oldószer viszkozitásnak drámai hatása volt a konformációváltozás sebességére mindkét mutáns esetében (23. ábra): 2-es relatív külső viszkozitásnál a sebességi állandó 45, illetve 36%-al csökkent az R193G illetve az R193A mutáns esetén.
102
23. ábra Stopped flow mérések a humán tripszin R193G (A) és R193A (B) mutánsának pH ugrással kiváltott aktivációjáról, különböző relatív viszkozitású pufferekben. 1-4 µM 10 mM CABS, pH 11,0, 5 mM CaCl2 pufferben oldott enzimet kevertem össze 50 mM Tricin, pH 8,0, 5 mM CaCl2 pufferrel 20 °C-on. Mindkét puffert adott koncentrációjú maltózzal egészítettem ki, hogy különböző relatív viszkozitású oldatokat kapjak. Követtem a fluoreszcencia emisszió változást és a felvett görbékre egyszeres exponenciálisokat illesztettem. A konformációs átmenet sebességi állandója csökkent az oldószer megnövelt viszkozitása hatására. A bemutatott görbék megfigyelt sebességi állandója a következő: kR193G relatív viszkozitás 1 = 1,65 s-1, kR193G relatív viszkozitás 4,4 = 0,39 s-1, kR193A relatív viszkozitás 1 = 0,22 s-1 és kR193A relatív viszkozitás 2,2 = 0,095 s-1.
A megfigyelt sebességi állandók és a külső viszkozitás között hiperbolikus összefüggést találtam mindkét mutáns esetén, ami megerősíti a Kramers elmélet erre a két
103
meghatározott
konformer
közötti
konformációváltozásra
való
alkalmazásának
érvényességét. A sebességi állandók reciprokát ábrázoltam a relatív külső viszkozitás függvényében, és lineáris függvényeket illesztettem az adatokra (24. ábra).
24. ábra Az aktiváció során bekövetkező konformációváltozás sebességi állandójának függése a külső viszkozitástól az R193A (■) és az R193G (●) mutáns humán tripszin 4 esetén. A stopped flow méréseket 20 °C-on végeztem 10 mM CABS, pH 11,0, 5 mM CaCl2, és 50 mM Tricin, pH 8,0, 5 mM CaCl2, puffereket használva, melyeket 0-1,46 M maltózzal egészítettem ki, hogy különböző relatív viszkozitású oldatokat kapjak 1-től 8,2-ig. Az 1/k értékeket ábrázoltam a relatív külső viszkozitás függvényében, majd lineáris függvényeket illesztettem a mérési adatokra. A relatív belső viszkozitásokat az illesztett egyenesek tengelymetszetéből és meredekségéből számoltam a 8. egyenlet szerint.
Az illesztett egyenesek paramétereit és a 9. egyenlet alapján ezekből számolt relatív belső viszkozitás értékeket a VI. táblázatban mutatom be.
104
R193G
R193A
meredekség
0,575 ± 0,05
3,07 ± 0,25
tengelymetszet
0,156 ± 0,187
2,48 ± 0,67
relatív belső viszkozitás
0,27
0,81
VI. táblázat Az R193G és R193A mutáns humán tripszin 4 relatív belső viszkozitása az aktiváció során bekövetkező konformációváltozás reakciósebességének viszkozitásfüggéséből származtatva. Az aktiváció során történő konformációváltozás sebességét pH-ugrásos stopped flow kíséretekben határoztam meg különböző viszkozitású puffereket használva. A kísérleti körülményeket a 4.9.3-4.9.5 fejezetekben írtam le. Az oldatok viszkozitásának növelésére maltózt alkalmaztam 0-1,46 M-os koncentrációban, ami 1-8,2-es relatív külső viszkozitást eredményezett. Az 1/k értékeket ábrázoltam a relatív külső viszkozitás függvényében, és lineáris függvényeket illesztettem az adatokra. A fehérjék belső viszkozitását a 8. egyenlet alapján számoltam. A sebességi állandók viszkozitásfüggését 20 °C-on mértem. Mivel a víz viszkozitása 20 °C-on 1 cP, a számolt belső viszkozitások értéke centiPoise-ban (cP) megadva azonos a relatív értékkel. A tengelymetszetek és a meredekségek értékei az illesztett egyenes paramétereinek átlagait és standard hibáit reprezentálják.
Adataim azt mutatják, hogy az R193A mutáns relatív belső viszkozitása 3-szor nagyobb, mint az R193G mutánsé (σ R193G = 0,27, σ R193A = 0,81). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a csukló régióban egy nagyobb oldalláncú aminosav lokálisan megnöveli a molekuláris súrlódást (friction) a fehérjében, ami megnövekedett sztérikus gátat eredményez a specifikus konformációváltozás során.
5.5.4 A konformációs átmenet kinetikai és termodinamikai paramétereinek értelmezése Doktori munkám ezen részének célja az volt, hogy meghatározzam, milyen hatással van a pH-ugrással indukált aktiváció során bekövetkező konformációváltozás sebességére és termodinamikájára az egyik csukló régióban elhelyezkedő aminosav oldalláncának mérete. Ezért vizsgáltam az aktiváció során történő konformációváltozás hőmérséklet és viszkozitásfüggését a vad típusú és R193G/A/F/Y mutáns humán tripszin 4-ben pH-ugrásos stopped flow kísérletekben. Ezek az aminosavak a 193-as pozícióban különböző fokú szabadságot engedtek meg a csukló régiónak, amely körül a konformációs átrendeződés történik.
105
5.5.4.1 A triptofán alapú detektálás előnyei és a megfigyelt sebességi állandó értelmezése
A humán tripszin 4-ben öt triptofán található. A Trp221 a 216-223-as peptidszegmensben helyezkedik el, míg a Trp141 és a Trp215 a 145-152 és 216-223-as szegmensek közelében található, mely peptidszakaszok részt vesznek az aktiváció során történő konformációs átmenetben (1. ábra). Ezek a natív triptofánok alkalmas jeladók a pH-ugrás
indukálta
szerkezeti
átrendeződés
követésére,
mivel
fluoreszcencia
emissziójuk intenzitása jelentősen nő a folyamat során (Verheyden és mtsi. 2004). A triptofán-alapú detektálási módszernek számos előnye van a ligand-kötési tesztekhez képest (pl. proflavin kötési teszt): ez a reakció elsőrendű kinetikájú, a belső fluoreszcencia detektálása közvetlen eredményt ad, továbbá az érzékenysége is nagyobb, ezért kevesebb fehérjét igényel. A tripszin reverzibilis konformációváltozáson megy keresztül a pH-ugrás során pH 11-esről egy inaktív zimogén-szerű szerkezetből az aktív konformációba 8-as pH-n. Ezért a fehérje belső fluoreszcenciaváltozásának követésével mért megfigyelt sebességi állandó a reakció a termékképződés irányába és a termék visszaalakulása irányába mutató sebességi állandójának az összege. Az egyensúly pH 8-on erősen el van tolva a termékképződés irányába, mint ahogy azt patkány tripszin esetében meghatározták (Hedström és mtsi. 1996), ezért a termék visszaalakulása irányába mutató sebességi állandó hozzájárulása a megfigyelt sebességi állandóhoz elhanyagolható. Ennek következményeképpen az átmenet gyakorlatilag irrevezibilis, és a megfigyelt sebességi állandót tekinthetjük a folyamat termékképződés irányába mutató sebességi állandójának. 5.5.4.2 A Gly193 nagyobb oldalláncú aminosavra való cseréjének szerkezeti következményei
Az aktivációs domén peptideket glicinek határolják (Gly19, Gly142, Gly184, Gly193 és Gly216), melyek csuklóként működnek az aktiváció folyamata során, amit az ezekben a pozíciókban történő nagy Φ és/vagy Ψ szögváltozások jeleznek (Brünger és mtsi. 1987). Szarvasmarha tripszinogénben (1tgb) a Gly193-nál a peptidgerinc szögeinek értékei Φ = -148,7° és Ψ = 18,1°, míg szarvasmarha tripszinben (2ptn) ezek az értékek Φ = 105,4° és Ψ = -19,1°-ra változnak. A humán tripszin 4 benzamidinnel
106
alkotott komplexének térszerkezetét megoldották, és leírták, hogy a G193R mutáció ellenére a molekula globális szerkezete nagyon hasonló a humán tripszin 1-éhez, amelyben ebben a pozícióban egy glicin található (Katona és mtsi. 2002a). A G193A mutáció hatását tanulmányozták trombinban, és ezen mutáns atomi szerkezete alapján ez a mutáció sem okozott szerkezeti perturbációt a peptidgerinc globális konformációjában, csupán enyhe változások voltak megfigyelhetők a mutáció helyén (Bobofchak és mtsi. 2005). Hasonlóan, a G193E (G555E) mutáns XI-es faktorral foglalkozó számítógépes modellezési tanulmányban sem találtak szignifikáns konformációváltozást a peptidgerincben (Zivelin és mtsi. 2004). Ezek az adatok azt sugallják, hogy a glicin193 nagy oldallánccal rendelkező aminosavra való cseréje nem perturbálja jelentősen a molekula globális konformációját. Annak ellenére, hogy a peptidgerinc konformációjában csak enyhe szerkezeti változás történik, azt feltételeztük, hogy valamely más, karakterizálandó, dinamikával összefüggő fizikai paraméter befolyásolhatja a tripszin 193-as pozíciót érintő mutánsaiban az aktiváció során bekövetkező konformációváltozás sebességét. Doktori munkám ezen részében irányított mutagenezissel a humán tripszin 4-ben az arginin193-at glicinre, alaninra, fenilalaninra és tirozinra cseréltem. Ezek a mutációk nem okoztak nagy perturbációt a steady state enzimkinetikai paraméterekben Z-GlyPro-Arg-pNA szubsztráton (IV. táblázat). Amellett, hogy az aktiváció során az egyik csuklóként működik, a 193-as aminosavnak fontos szerepe van a szubsztrátkötésben és az enzimkatalízisben is. A 193-as pozícióban elhelyezkedő aminosav amido csoportja része az oxianoin lyuknak, ami stabilizálja a katalízis során kialakuló tetraéderes intermediereket (Henderson 1970; Robertus és mtsi. 1972), ezért a 193-as glicin cseréje enyhén befolyásolja a kcat értékét. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a szubsztrátkötő zsebet és az oxianion lyuk geometriáját nem perturbálják ezek a mutációk, vagy hogy ezek a szerkezeti elemek, bár az apo-enzimben némileg torzultak, korrekt szerkezetüket a szubsztrát S1 helyre való bekötődése visszaállítja. Eredményeinket megerősítik korábbi tanulmányok is, melyekben leírták, hogy a G193R pontmutáció csak kismértékben változtatja meg az enzim steady state aktivitását kis szintetikus szubsztráton (Medveczky és mtsi. 2003; Szmola és mtsi. 2003).
107
5.5.4.3 A Gly193 nagyobb oldalláncú aminosavra való cseréjének hatása a konformációs átmenet kinetikai és termodinamikai tulajdonságaira
A pH-ugrással indukált aktiváció során bekövetkező konformációs átmenet sebességét vizsgáltam a vad típusú és az R193G/A/F/Y mutáns humán tripszin 4-ben a fehérje belső fluoreszcencia intenzitásának változását követve stopped flow kísérletekben. A konformációváltozás sebességét befolyásolták a 193-as pozíciót érintő pontmutációk, és a sebességi állandók értékei korreláltak az oldallánc méretével. Meghatároztam a pH-indukált aktiváció sebességének hőmérsékletfüggését is. Eredményeim szerint a sebességi állandók Arrhenius ábrázolásanak lefutása párhuzamos az összes vizsgált mutáns esetében. A jelenséget széles hőmérsékleti tartományban vizsgáltam (5 °C és 60 °C között) egy új hőugrásos stopped flow készüléket alkalmazva (Kintses és mtsi. 2006). A széles hőmérsékleti tartomány lehetővé tette, hogy megnöveljük az Arrhenius ábrázolások párhuzamos lefutásának megbízhatóságát. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy ezekben a tripszin mutánsokban a folyamat aktiválási energiája azonos, és ezeknek a variánsoknak a termodinamikai paraméterei csak a preexponenciális tagban térnek el egymástól. További fontos megfigyelés, hogy minél nagyobb a 193-as pozícióban lévő aminosav oldallánca, annál kisebb a preexponenciális tag értéke. Az eredmények ezen aspektusa azt mutatja, hogy a csukló konformációs szabadságának korlátozása a preexponenciális tagot érinti, és az aktiválási energiát nem befolyásolja. Az Eyring-Polányi átmeneti állapot elmélet (transition state theory) egy általános modell, és csak gázfázisú reakciók sebességének hőmérsékletfüggésének jellemzésére alkalmas. A biomolekuláris reakciók folyadékfázisban mennek végbe és összetett többdimenziós potenciális energiafelszínnel jellemezhetők (Frauenfelder és mtsi. 1991), ezért szükséges bevezetni a transzmissziós koefficinest a generalizált átmeneti állapot elmélet preexponenciális tagjába (Garcia-Viloca és mtsi. 2004). A Kramers elmélet egy megfelelő és relatíve egyszerű megközelítés komplex molekulák folyadékfázisú reakcióinak jellemzésére (Frauenfelder és Wolynes 1985). Mint azt Frauenfelder és munkatársai leírják, ha a reakciósebesség erősen függ az oldószer viszkozitásától, az adatokat a Kramers elmélet alkalmazásával értékelhetjük ki. Beece és munkatársai a protohem és a mioglobin ligand kötését tanulmányozta olyan oldószerekben, melyeknek a viszkozitását széles tartományban változtatták, posztulálva, hogy az oldószer a fehérje reakcióját főként az oldószer viszkozitásán keresztül befolyásolja (Beece és mtsi. 1980). 108
Ez a kísérleti megközelítés összhangban van azzal az elgondolással, amely szerint a fehérjék két állapota közti átmenetet irányító energiagátaknak dinamikai eredete van. A transition state elmélet csak egy limitált oldószer viszkozitás régióban érvényes, 1mP alatt, ezért ennek az elméletnek az alkalmazása akár vízben végbemenő reakciókra is kétséges, és inkább a Kramers elmélet a megfelelő. A doktori dolgozatom ezen részében leírt jelenség, mely szerint egy reakció sebességi állandója fordítottan arányos az oldószer viszkozitásával, összeegyeztethető a Kramers elmélettel. A preexponenciális tagnak a szerkezeti átrendeződés sebességére gyakorolt hatásának részletesebb elemzése céljából megvizsgáltam, hogy a konformációs átmenet sebességét befolyásolja-e az oldószer viszkozitása. A Kramers egyenlet a sebességi állandó hiperbolikus függését jósolja az oldószer viszkozitásától (8. egyenlet). Megmértem a konformációváltozás sebességét különböző viszkozitású pufferekben, maltózt használva a viszkozitás növelésére. Adataim egyértelműen mutatják, hogy a sebességi állandók függenek az oldószer viszkozitásától (22. ábra), még relatíve alacsony maltózkoncentrációnál is, ahol a töltött csoportok kölcsönhatásának az enyhén csökkent dielektromos állandó általi perturbálása elhanyagolható. Továbbá azt találtam, hogy az összefüggés hiperbolikus, ezért az 1/k-t ábrázolva a relatív külső viszkozitás függvényében egy lineáris függvényt kapunk (23. ábra), ami erősen arra utal, hogy a Kramers elmélet egy megfelelő keret a natív körülmények között végbemenő enzim konformációs átmenetek sebességének jellemzésére. 5.5.4.4 A G193A mutáció hatása a tripszin belső viszkozitására
Ansari és munkatársainak tanulmánya alapján (6. egyenlet) (Ansari és mtsi. 1992) egy fehérje belső súrlódása (internal friction) kiszámolható a sebességi állandó külső viszkozitástól való függéséből nulla külső viszkozitásra való extrapolálással (9. egyenlet). Meghatároztam a sebességi állandó viszkozitásfüggését az R193G és az R193A mutáns esetén, ábrázoltam az 1/k értékeket a relatív külső viszkozitás függvényében, majd lineáris függvényt illesztettem az adatokra. Azt találtam, hogy ezeknek a lineáris függvényeknek a meredeksége és a tengelymetszete is különbözik a két mutáns esetén (23. ábra). Az alanin mutáns számolt belső viszkozitása (definíciót ld. a 4.9.6 fejezetben) háromszor nagyobb, mint az R193G mutánsé (VI. táblázat). Ezekből az eredményekből arra következtettünk, hogy az alanin nagyobb kiterjedésű oldallánca kisebb konformációs szabadságot enged a peptidgerincnek a konformációs átmenet 109
során, mint a glicin, ami egy viszkozitás-szerű paraméter megnövekedéseként fedhető fel, melyet belső viszkozitásként definiálunk. Szintén érdekes, hogy ennek a viszkozitás-jellegű paraméternek az értéke enyhén alacsonyabb, mint a víz viszkozitása, ami
arra
utal,
hogy
a
csukló
régió
relatíve
kismértékben
korlátozza
a
konformációváltozást. Ansari és munkatársai a σ értékét 4,1 cP-nak határozták meg mioglobinban a ligand disszociációját követő konformációváltozáshoz kapcsolva (Ansari és mtsi. 1992). Ez az érték magasabb, mint az általunk meghatározott, a tripszin aktivációja során történő konformációváltozáshoz kapcsolt érték. A mioglobin hem zsebében elhelyezkedő relatíve rendezett vízmolekulák fontos szerepet játszhatnak a tanulmányozott
reakcióban,
ami
megnövelheti
a
belső
viszkozitás
értékét.
Mindazonáltal hangsúlyoznunk kell, hogy a belső viszkozitás nem egy általános paramétere a fehérjének, hanem mindig asszociált egy specifikus konformációs átrendeződéssel. Összefoglalva eredményeink azt szemléltetik, hogy egy enzim specifikus konformációs átmenete Kramers típusú reakció natív körülmények között. Továbbá adataink azt mutatják, hogy a belső viszkozitást mutációkkal specifikusan módosítani lehet, ezúton változtatva a csukló mobilitását, amely körül a szerkezetváltozás történik.
110
6. ÖSSZEFOGLALÁS (I) 5’ RACE PCR kísérleteim bizonyítják a humán tripszinogén 4 CUG startkodonnal rendelkező B izoformájának transzkripcióját humán agyszövetben. A leucin kezdő aminosavval rendelkező B izoforma a domináns expresszált variáns az agyban, ami megerősíti ezt az eredményt. (II) A rekombináns humán tripszinogén 4 A és B izoforma affinitást mutat agyból izolált membránok felé, ami arra utal, hogy nem-konvencionális N-terminális peptidjüknek szerepe lehet a fehérje sejten belüli lokalizációjában. (III) Meghatároztam a humán tripszinogén 4 mRNS relatív mennyiségét különböző agyterületekben real-time PCR-rel. Az eredmények arra utalnak, hogy a transzkripció szintje magasabb az evolúciósan fiatalabb agyi régiókban. (IV) Vizsgáltam a vad típusú illetve az R193G mutáns humán tripszin 4 és a 4-guanidinobenzoát
4-metilumbelliferil
(MUGB)
reakcióját
tranziens
kinetikai
módszerekkel, hogy tanulmányozzam a Gly193Arg aminosavcsere hatását. Egy finomított modellt javaslunk a reakció leírására, melyben az acilezés kinetikailag elválasztható az első tetraéderes intermedier (TI1) reverzibilis kialakulásától. Adataink azt mutatják, hogy a Gly193Arg mutáció hatására a TI1 kialakulásának egyensúlyi lépése erősebben a termékképződés irányába tolódik el, az acilezés sebessége csökken, a dezacilezés sebessége pedig megnő a MUGB szubsztráton. A termodinamikai elemzés felfedte, hogy a TI1 kialakulásának egyensúlyi lépése során a vad típusú humán tripszin 4 kiterjedt szerkezeti és/vagy dinamikai átalakulásokon megy keresztül, míg az R193G mutáns enzimben más jellegű átrendeződés történik. (V) Különböző méretű oldalláccal rendelkező aminosavakat vittünk be az egyik csukló régióba (193-as pozíció) hogy módosítsuk
a
tanulmányoztuk
csukló a
merevségét
mutációk
és
stopped
hatását
az
flow
készüléket
alkalmazva
aktiváció
során
bekövetkező
konformációváltozás sebességére humán tripszin 4-ben. Megfigyelésünk szerint a 193-as pozciójú aminosav oldallánc méretének növekedése korrelál a sebességi állandó csökkenésével. A termodinamikai elemzés kimutatta, hogy a mutációk szelektíven megváltoztatják az Arrhenius egyenlet preexponenciális tagját. A sebességi állandók viszkozitásfüggéséből számolt belső viszkozitás értéke az R193A mutánsban háromszorosa az R193G mutánsénak. Következtetésünk szerint ezen konformációs átmenet reakciósebességét a belső molekuláris súrlódás (friction) szabályozza, amelyet specifikusan módosítani lehet a csukló régiót érintő mutációkkal.
111
7. SUMMARY (I) My 5’ RACE PCR experiments prove that isoform B of human trypsinogen 4 with a CUG start codon is transcribed in human brain tissue. Isoform B that possesses a leucine initiator amino acid is the predominant variant expressed in the brain, which confirms this finding. (II) The recombinant isoform A and B of human trypsinogen 4 were shown to have significant affinity towards membranes isolated from the brain, indicating that their non-conventional N-terminal peptides might play a role the intracellular localization of the protein. (III) The relative quantity of human trypsinogen 4 mRNA in different areas of the brain was determined with real-time PCR. The results suggest that the level of transcription is higher in regions that developed later during evolution. (IV) The reaction of 4-methylumbelliferyl 4-guanidinobenzoate (MUGB) with wild type human trypsin 4 and its R193G mutant was examined using transient kinetic methods to study the effect of the Gly193Arg substitution. Based on our data we propose a refined model describing the reaction, in which acylation can be kinetically separated from the reversible formation of the first tetrahedral intermediate (TI1). Our data show that upon replacing Gly193 with an arginine the equilibrium of the formation of the TI1 is shifted more towards the forward direction, the rate of acylation decreases and the rate of deacylation increases on MUGB substrate. Thermodynamic analysis revealed that during the equilibrium step of formation of the TI1 wild type human trypsin 4 goes through extended structural and/or dynamic changes, while rearrangements of different character occur in the R193G mutant. (V) We introduced amino acid side chains of different size at one of the hinges (position 193) to modify the rigidity of the hinge and studied their effects on the rate of the conformational change during activation of human trypsin 4 using a stopped flow apparatus. We found that an increase in the size of the side chain at position 193 is associated with the decrease of the reaction rate constant. Thermodynamic analysis showed that the mutations do not affect the activation energy of the reaction, but they significantly alter the preexponential term of the Arrhenius equation. The value of internal viscosity calculated from viscosity dependence of the rate constant is 3-fold greater for the R193A mutant than that of the R193G mutant. Based on this we propose that the reaction rate of this conformational transition is regulated by the internal molecular friction which can be specifically modulated by mutagenesis in the hinge region.
112
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönettel tartozom Prof. Gráf Lászlónak, aki lehetővé tette doktori munkámat a tanszék proteáz-csoportjában. Figyelemmel kísérte és támogatta munkámat tanácsaival, laborasszisztensének segítségét felajánlva és anyagiakban is. Külön köszönöm, hogy támogatta Dr. Málnási-Csizmadia Andrással való közös munkámat; a gyümölcsöző kollaboráció által a proteázos csoport új aspektusból vizsgálhatta ezeket az enzimeket, és számos izgalmas eredménnyel és publikációval is gazdagodott. Szeretném megköszönni témavezetőmnek, Dr. Szilágyi Lászlónak, hogy elhívott dolgozni a laborjába. Itt nyertem betekintést a molekuláris biológia és a biokémia világába, amely azóta is vonz. Tőle tanultam meg többek között az alapvető rekombináns DNS technikákat, amely nélkül elképzelhetetlen a biokémia területén dolgozni. A laborjában töltött évek során tapasztaltam meg azt is, hogy a sikerhez – sok egyéb dolog mellett – a kitartás elengedhetetlen. Hálával tartozom másik témavezetőmnek, Dr. Málnási-Csizmadia Andrásnak is, akitől nagyon sokmindent tanultam kérdésfeltevésről és kísérlettervezésről, amelyek kulcsfontosságúak a jelenségek megközelítésénél, és sokat tanultam az adatok értelmezéséről, cikkírásról és persze a tranziens kinetikáról. Szeretném megköszönni labortársaimnak az itt töltött évek alatt nyújtott segítségüket és barátságukat. Köszönöm Gombos Lindának a közös munkáink során tanúsított értékes segítségét és a számtalan őszinte beszélgetést. Dr. Medveczky Péter humorával, Dr. Németh Attila természetes kedvességével és nyugalmával teremtett jó hangulatot a laborban. Ezúton fejezem ki hálámat labortársaimnak a dolgozat gondos átolvasásáért és tett javaslataikért. A laboron kívül is számos barátot találtam, szívesen gondolok vissza szakmai és baráti beszélgetéseinkre Tóth Judittal és Dr. Kovács Mihállyal. Köszönöm Szenthe Borbála és Fodor Krisztián kedves, önzetlen segítségét is, akármilyen kérdéssel vagy kéréssel is fordultam hozzájuk. A stopped flow mérések során mindig számíthattam Simon Zoltán, Kintses Bálint és Gyimesi Máté technikai segítségére, amire nagy szükségem volt a kezdeti időkben. Zoltánnak külön köszönöm rengeteg segítségét közös méréseink során. A dolgozatban szereplő térszerkezeti ábrák elkészítéséért Fodor Krisztiánt és Jelinek Balázst illeti köszönet. Köszönettel tartozom továbbá Dr. Kardos Józsefnek is, aki őszinte érdeklődéssel követte készülő kézirataimat, és kérdéseivel, konstruktív kritikáival sokszor elgondolkodtatott egyes problémákon. Munkámat szintén segítette 113
két ügyes és precíz, a fehérjék és egyéb anyagok preparálásában első osztályú technikai segítséget nyújtó asszisztens, Papp Mónika és Énekes Vilmosné. Köszönöm a Tanszék valamennyi nem nevesített dolgozójának is, hogy munkám során bártan fordulhattam hozzájuk tanácsért, segítségért. A humán agymintákat Prof. Palkovits Miklós bocsátotta rendelkezésemre. Köszönöm
Édesanyámnak
és
Nővéremnek,
hogy
végig
támogattak
tanulmányaim során szeretetükkel, ösztönzésükkel, áldozatkészségükkel, hogy lehetővé tették, hogy azzal foglalkozhassak, ami igazán érdekel. Köszönöm továbbá barátaimnak, Gyöngyinek és Tamásnak a lelki támogatást és bíztatást. Dolgozatomat Édesapám emlékének ajánlom.
114
IRODALOMJEGYZÉK Acland P, Dixon M, Peters G, and Dickson C 1990 Subcellular fate of the int-2 oncoprotein is determined by choice of initiation codon; Nature 343 662-665 Ansari A, Jones C M, Henry E R, Hofrichter J, and Eaton W A 1992 The role of solvent viscosity in the dynamics of protein conformational changes; Science 256 17961798 Arrhenius S 1889 Über die Reaktionsgeschwindigkeit bei der Inversion von Rohzucker durch Säuren; Zeitschrift für Physikalische Chemie 4 226-248 Barrett A J and Rawlings N D 1995 Families and clans of serine peptidases; Arch. Biochem. Biophys. 318 247-250 Barrett A J, Rawlings N D, and Woessner J F (eds) 1998 Serine Peptidases; in Handbook of Proteolytic Enzymes (London: Academic Press) pp 3-541 Barros C, Crosby J A, and Moreno R D 1996 Early steps of sperm-egg interactions during mammalian fertilization; Cell Biol. Int. 20 33-39 Becerra S P, Rose J A, Hardy M, Baroudy B M, and Anderson C W 1985 Direct mapping of adeno-associated virus capsid proteins B and C: a possible ACG initiation codon; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 82 7919-7923 Beece D, Eisenstein L, Frauenfelder H, Good D, Marden M C, Reinisch L, Reynolds A H, Sorensen L B, and Yue K T 1980 Solvent viscosity and protein dynamics; Biochemistry 19 5147-5157 Bender M L and Kézdy J 1965 Mechanism of action of proteolytic enzymes; Annu. Rev. Biochem. 34:49-76. 49-76 Berezin I V, Kazanskaya N F, and Klyosov A A 1971 Determination of the individual rate constants of alpha-chymotrypsin-catalyzed hydrolysis with the added nucleophilic agent, 1,4-butanediol; FEBS Lett. 15 121-124 Berg J M, Tymoczko J J, Stryer L (ed) 2002 Biochemistry (New York: W. H. Freeman and Company) Birktoft J J, Kraut J, and Freer S T 1976 A detailed structural comparison between the charge relay system in chymotrypsinogen and in alpha-chymotrypsin; Biochemistry 15 4481-4485 Blanchard H and James M N 1994 A crystallographic re-investigation into the structure of Streptomyces griseus proteinase A reveals an acyl-enzyme intermediate; J Mol. Biol. 241 574-587 Blow D M 1997 The tortuous story of Asp ... His ... Ser: structural analysis of alphachymotrypsin; Trends Biochem. Sci. 22 405-408 Bobofchak K M, Pineda A O, Mathews F S, and Di Cera E 2005 Energetic and structural consequences of perturbing Gly-193 in the oxyanion hole of serine proteases; J. Biol. Chem. 280 25644-25650 Bode W, Schwager P, and Huber R 1978 The transition of bovine trypsinogen to a trypsin-like state upon strong ligand binding. The refined crystal structures of the bovine trypsinogen-pancreatic trypsin inhibitor complex and of its ternary complex with Ile-Val at 1.9 Å resolution; J. Mol. Biol. 118 99-112 Bode W, Turk D, and Karshikov A 1992 The refined 1.9-Å X-ray crystal structure of DPhe-Pro-Arg chloromethylketone-inhibited human alpha-thrombin: structure analysis, overall structure, electrostatic properties, detailed active-site geometry, and structure-function relationships; Protein Sci. 1 426-471
115
Bott R R, Chan G, Domingo B, Ganshaw G, Hsia C Y, Knapp M, and Murray C J 2003 Do enzymes change the nature of transition states? Mapping the transition state for general acid-base catalysis of a serine protease; Biochemistry 42 10545-10553 Brady K and Abeles R H 1990 Inhibition of chymotrypsin by peptidyl trifluoromethyl ketones: determinants of slow-binding kinetics; Biochemistry 29 7608-7617 Bresnahan P A, Leduc R, Thomas L, Thorner J, Gibson H L, Brake A J, Barr P J, and Thomas G 1990 Human fur gene encodes a yeast KEX2-like endoprotease that cleaves pro-beta-NGF in vivo; J Cell Biol. 111 2851-2859 Brünger A T, Huber R, and Karplus M 1987 Trypsinogen-trypsin transition: a molecular dynamics study of induced conformational change in the activation domain; Biochemistry 26 5153-5162 Carter P and Wells J A 1988 Dissecting the catalytic triad of a serine protease; Nature 332 564-568 Cigan A M, Feng L, and Donahue T F 1988 tRNAi(met) functions in directing the scanning ribosome to the start site of translation; Science 242 93-97 Collen D and Lijnen H R 1986 The fibrinolytic system in man; Crit Rev. Oncol. Hematol. 4 249-301 Coombs G S, Rao M S, Olson A J, Dawson P E, and Madison E L 1999 Revisiting catalysis by chymotrypsin family serine proteases using peptide substrates and inhibitors with unnatural main chains; J Biol. Chem. 274 24074-24079 Corey D R and Craik C 1992 An investigation into the minimum requirements for peptide hydrolysis by mutation of the catalytic triad of trypsin; J Am. Chem. Soc. 114 1784-1790 Cottrell G S, Amadesi S, Grady E F, and Bunnett N W 2004 Trypsin IV, a novel agonist of protease-activated receptors 2 and 4; J. Biol. Chem. 279 13532-13539 Coughlin S R 2000 Thrombin signalling and protease-activated receptors; Nature 407 258-264 Craik C S, Largman C, Fletcher T, Roczniak S, Barr P J, Fletterick R, and Rutter W J 1985 Redesigning trypsin: alteration of substrate specificity; Science 228 291-297 Craik C S, Roczniak S, Largman C, and Rutter W J 1987 The catalytic role of the active site aspartic acid in serine proteases; Science 237 909-913 Czapinska H and Otlewski J 1999 Structural and energetic determinants of the S1-site specificity in serine proteases; Eur. J Biochem. 260 571-595 Davidson D J, Higgins D L, and Castellino F J 1990 Plasminogen activator activities of equimolar complexes of streptokinase with variant recombinant plasminogens; Biochemistry 29 3585-3590 DeLano W L, 2002 The PyMOL Molecular Graphics System. San Carlos, CA, USA, DeLano Scientific. http://www.pymol.org Ref Type: Computer Program Diederichs S, Bulk E, Steffen B, Ji P, Tickenbrock L, Lang K, Zanker K S, Metzger R, Schneider P M, Gerke V, Thomas M, Berdel W E, Serve H, and Muller-Tidow C 2004 S100 family members and trypsinogens are predictors of distant metastasis and survival in early-stage non-small cell lung cancer; Cancer Res 64 5564-5569 Dixon M M, Brennan R G, and Matthews B W 1991 Structure of gamma-chymotrypsin in the range pH 2.0 to pH 10.5 suggests that gamma-chymotrypsin is a covalent acyl-enzyme adduct at low pH; Int. J Biol. Macromol. 13 89-96 Dixon M M and Matthews B W 1989 Is gamma-chymotrypsin a tetrapeptide acyl-enzyme adduct of alpha-chymotrypsin?; Biochemistry 28 7033-7038 Dodson G and Wlodawer A 1998 Catalytic triads and their relatives; Trends Biochem. Sci. 23 347-352
116
Emi M, Nakamura Y, Ogawa M, Yamamoto T, Nishide T, Mori T, and Matsubara K 1986 Cloning, characterization and nucleotide sequences of two cDNAs encoding human pancreatic trypsinogens; Gene 41 305-310 Fehlhammer H, Bode W, and Huber R 1977 Crystal structure of bovine trypsinogen at 1.8 Å resolution. II. Crystallographic refinement, refined crystal structure and comparison with bovine trypsin; J. Mol. Biol. 111 415-438 Fersht A R 1985 Measurement and magnitude of enzymatic rate constants; in Enzyme Structure and Mechanism (ed) A R Fersht (New York: W. H. Freeman and Company) pp 193-220 Fersht A R and Renard M 1974 pH dependence of chymotrypsin catalysis. Appendix: substrate binding to dimeric alpha-chymotrypsin studied by x-ray diffraction and the equilibrium method; Biochemistry 13 1416-1426 Fersht A R and Requena Y 1971 Equilibrium and rate constants for the interconversion of two conformations of γ-chymotrypsin. The existence of a catalytically inactive conformation at neutral pH; J Mol. Biol. 60 279-290 Frauenfelder H, Sligar S G, and Wolynes P G 1991 The energy landscapes and motions of proteins; Science 254 1598-1603 Frauenfelder H and Wolynes P G 1985 Rate theories and puzzles of hemeprotein kinetics; Science 229 337-345 Frohman M A 1993 Rapid amplification of complementary DNA ends for generation of full-length complementary DNAs: thermal RACE; Methods Enzymol. 218 340-356 Frohman M A 1990 PCR Protocols: A guide to Methods and Applications (San Diego: Academic Press) Frohman M A, Dush M K, and Martin G R 1988 Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85 8998-9002 Gaboriaud C, Serre L, Guy-Crotte O, Forest E, and Fontecilla-Camps J C 1996 Crystal structure of human trypsin 1: unexpected phosphorylation of Tyr151; J Mol. Biol. 259 995-1010 Garcia-Viloca M, Gao J, Karplus M, and Truhlar D G 2004 How enzymes work: analysis by modern rate theory and computer simulations; Science 303 186-195 Gettins P G 2002 Serpin structure, mechanism, and function; Chem. Rev. 102 47514804 Gráf L 1995 The structural basis of serine protease action: the fourth dimension; in Natural Sciences and Human Thought (ed) R Zwilling (Heidelberg: SpringerVerlag) pp 139-148 Gráf L, Jancsó A, Szilágyi L, Hegyi G, Pintér K, Náray-Szabó G, Hepp J, Medzihradszky K, and Rutter W J 1988 Electrostatic complementarity within the substrate-binding pocket of trypsin; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85 4961-4965 Gráf L and Szilágyi L 2003 Trypsin: Is there anything new under the Sun?; Journal of Molecular Structure (Theochem) 666-667 481-485 Grishina Z, Ostrowska E, Halangk W, Sahin-Tóth M, and Reiser G 2005 Activity of recombinant trypsin isoforms on human proteinase-activated receptors (PAR): mesotrypsin cannot activate epithelial PAR-1, -2, but weakly activates brain PAR-1; Br. J. Pharmacol. 146 990-999 Guex N and Peitsch M C 1997 SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modeling; Electrophoresis 18 2714-2723 http://www.expasy.org/spdvb Halangk W, Lerch M M, Brandt-Nedelev B, Roth W, Ruthenbuerger M, Reinheckel T, Domschke W, Lippert H, Peters C, and Deussing J 2000 Role of cathepsin B in
117
intracellular trypsinogen activation and the onset of acute pancreatitis; J Clin Invest 106 773-781 Hann S R, King M W, Bentley D L, Anderson C W, and Eisenman R N 1988 A nonAUG translational initiation in c-myc exon 1 generates an N-terminally distinct protein whose synthesis is disrupted in Burkitt's lymphomas; Cell 52 185-195 Harel M, Su C T, Frolow F, Silman I, and Sussman J L 1991 Gamma-chymotrypsin is a complex of alpha-chymotrypsin with its own autolysis products; Biochemistry 30 5217-5225 Hartley B S and Kilby B A 1954 The reaction of p-nitrophenyl esters with chymotrypsin and insulin; Biochem. J 56 288-297 Hedström L 2002 Serine protease mechanism and specificity; Chem. Rev. 102 45014524 Hedström L 1996 Trypsin: a case study in the structural determinants of enzyme specificity; Biol. Chem. 377 465-470 Hedström L, Lin T Y, and Fast W 1996 Hydrophobic interactions control zymogen activation in the trypsin family of serine proteases; Biochemistry 35 4515-4523 Hedström L, Szilágyi L, and Rutter W J 1992 Converting trypsin to chymotrypsin: the role of surface loops; Science 255 1249-1253 Henderson R 1970 Structure of crystalline alpha-chymotrypsin. IV. The structure of indoleacryloyl-alpha-chyotrypsin and its relevance to the hydrolytic mechanism of the enzyme; J Mol. Biol. 54 341-354 Heremans L and Heremans K 1989 Raman spectroscopic study of the changes in secondary structure of chymotrypsin: effect of pH and pressure on the salt bridge; Biochim. Biophys. Acta 999 192-197 Hess G P, McConn J, Ku E, and McConkey G 1970 Studies of the activity of chymotrypsin; Philos. Trans. R. Soc. Lond B Biol. Sci. 257 89-104 Hiroara H, Bender M L, and Stark R S 1974 Acylation of alpha-chymotrypsin by oxygen and sulfur esters of specific substrates: kinetic evidence for a tetrahedral intermediate; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 71 1643-1647 Hood L, Rowen L, and Koop B F 1995 Human and mouse T-cell receptor loci: genomics, evolution, diversity, and serendipity; Ann. N. Y. Acad. Sci. 758 390-412 Huber R, Kukla D, Bode W, Schwager P, Bartels K, Deisenhofer J, and Steigemann W 1974 Structure of the complex formed by bovine trypsin and bovine pancreatic trypsin inhibitor. II. Crystallographic refinement at 1.9 Å resolution; J Mol. Biol. 89 73-101 Huber R B W 1978 Structural basis of the activation and action of trypsin; Acc. Chem. Res. 11 114-122 Hunkapiller M W, Forgac M D, and Richards J H 1976 Mechanism of action of serine proteases: tetrahedral intermediate and concerted proton transfer; Biochemistry 15 5581-5588 Hwang C, Sinskey A J, and Lodish H F 1992 Oxidized redox state of glutathione in the endoplasmic reticulum; Science 257 1496-1502 Ishida T and Kato S 2003 Theoretical perspectives on the reaction mechanism of serine proteases: the reaction free energy profiles of the acylation process; J Am. Chem. Soc. 125 12035-12048 Jameson G W, Roberts D V, Adams R W, Kyle W S, and Elmore D T 1973 Determination of the operational molarity of solutions of bovine alpha-chymotrypsin, trypsin, thrombin and factor Xa by spectrofluorimetric titration; Biochem. J. 131 107-117 Johnson D E 2000 Noncaspase proteases in apoptosis; Leukemia 14 1695-1703
118
Joseph K, Ghebrehiwet B, and Kaplan A P 2001 Activation of the kinin-forming cascade on the surface of endothelial cells; Biol. Chem. 382 71-75 Katona G, Berglund G I, Hajdu J, Gráf L, and Szilágyi L 2002a Crystal structure reveals basis for the inhibitor resistance of human brain trypsin; J. Mol. Biol. 315 12091218 Katona G, Wilmouth R C, Wright P A, Berglund G I, Hajdu J, Neutze R, and Schofield C J 2002b X-ray structure of a serine protease acyl-enzyme complex at 0.95-Å resolution; J Biol. Chem. 277 21962-21970 Keleti T 1983 Errors in the evaluation of Arrhenius and van't Hoff plots; Biochem. J. 209 277-280 Kintses, B., Simon, Z., Gyimesi, M., Tóth, J., Jelinek, B., Niedetzky, Cs., Kovács, M., and Málnási-Csizmadia, A. Enzyme kinetics above denaturation temperature: a temperature-jump/stopped-flow apparatus. Biophysical Journal . 2006. Ref Type: In Press Kossiakoff A A, Chambers J L, Kay L M, and Stroud R M 1977 Structure of bovine trypsinogen at 1.9 Å resolution; Biochemistry 16 654-664 Kozak M 1997 Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6; EMBO J 16 2482-2492 Kozak M 1986 Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes; Cell 44 283-292 Kozak M 1991a An analysis of vertebrate mRNA sequences: intimations of translational control; J Cell Biol. 115 887-903 Kozak M 1991b Structural features in eukaryotic mRNAs that modulate the initiation of translation; J Biol. Chem. 266 19867-19870 Kramers H A 1940 Brownian motion in a field of force and the diffusion model of chemical reactions; Physica 7 284-304 Kraut J 1977 Serine proteases: structure and mechanism of catalysis; Annu. Rev. Biochem. 46 331-358 Krieger M, Kay L M, and Stroud R M 1974 Structure and specific binding of trypsin: comparison of inhibited derivatives and a model for substrate binding; J Mol. Biol. 83 209-230 Kukor Z, Mayerle J, Kruger B, Tóth M, Steed P M, Halangk W, Lerch M M, and Sahin-Tóth M 2002 Presence of cathepsin B in the human pancreatic secretory pathway and its role in trypsinogen activation during hereditary pancreatitis; J Biol. Chem. 277 21389-21396 Kuromizu K, Shimokawa Y, Abe O, and Izumiya N 1985 New fluorogenic substrate for esterase activity of alpha-chymotrypsin and related enzymes; Anal. Biochem. 151 534-539 Laemmli U K 1970 Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4; Nature 227 680-685 Laskowski M and Qasim M A 2000 What can the structures of enzyme-inhibitor complexes tell us about the structures of enzyme substrate complexes?; Biochim. Biophys. Acta 1477 324-337 Laskowski M and Wu F C 1953 Temporary inhibition of trypsin; J Biol. Chem. 204 797-805 Lekanne Deprez R H, Fijnvandraat A C, Ruijter J M, and Moorman A F 2002 Sensitivity and accuracy of quantitative real-time polymerase chain reaction using SYBR green I depends on cDNA synthesis conditions; Anal. Biochem. 307 63-69
119
LeMosy E K, Hong C C, and Hashimoto C 1999 Signal transduction by a protease cascade; Trends Cell Biol. 9 102-107 Lesk A M and Fordham W D 1996 Conservation and variability in the structures of serine proteinases of the chymotrypsin family; J. Mol. Biol. 258 501-537 Lewis J H, Iammarino R M, Spero J A, and Hasiba U 1978 Antithrombin Pittsburgh: an alpha-1-antitrypsin variant causing hemorrhagic disease; Blood 51 129-137 Littlechild J A, Guy J E, and Isupov M N 2004 Hyperthermophilic dehydrogenase enzymes; Biochem. Soc. Trans. 32 255-258 Liu B, Schofield C J, and Wilmouth R C 2006 Structural analyses on intermediates in serine protease catalysis; J Biol. Chem. 281 24024-24035 Lu D, Futterer K, Korolev S, Zheng X, Tan K, Waksman G, and Sadler J E 1999 Crystal structure of enteropeptidase light chain complexed with an analog of the trypsinogen activation peptide; J Mol. Biol. 292 361-373 Macfarlane S R, Seatter M J, Kanke T, Hunter G D, and Plevin R 2001 Proteinase-activated receptors; Pharmacol. Rev. 53 245-282 Mangel W F, Singer P T, Cyr D M, Umland T C, Toledo D L, Stroud R M, Pflugrath J W, and Sweet R M 1990 Structure of an acyl-enzyme intermediate during catalysis: (guanidinobenzoyl)trypsin; Biochemistry 29 8351-8357 Mátrai J, Verheyden G, Krüger P, and Engelborghs Y 2004 Simulation of the activation of alpha-chymotrypsin: analysis of the pathway and role of the propeptide; Protein Sci. 13 3139-3150 Medveczky P, Antal J, Patthy A, Kékesi K, Juhász G, Szilágyi L, and Gráf L 2006 Myelin basic protein, an autoantigen in multiple sclerosis, is selectively processed by human trypsin 4; FEBS Lett. 580 545-552 Medveczky P, Tóth J, Gráf L and Szilágyi L 2003 The Effect of Arg193 on The Enzymatic Properties of Human Brain Trypsin.; in Protein Structure-Function Relationship (eds) Abbasi A and Ali S. A. (Karachi, Pakistan: BCC&T Press) pp 41-53 Minn A, Schubert M, Neiss W F, and Müller-Hill B 1998 Enhanced GFAP expression in astrocytes of transgenic mice expressing the human brain-specific trypsinogen IV; Glia 22 338-347 Molloy S S, Bresnahan P A, Leppla S H, Klimpel K R, and Thomas G 1992 Human furin is a calcium-dependent serine endoprotease that recognizes the sequence ArgX-X-Arg and efficiently cleaves anthrax toxin protective antigen; J Biol. Chem. 267 16396-16402 Nagpal S, Zelent A, and Chambon P 1992 RAR-beta 4, a retinoic acid receptor isoform is generated from RAR-beta 2 by alternative splicing and usage of a CUG initiator codon; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 89 2718-2722 Nelson D L and Cox M M (eds) 2005 Protein Targeting and Degradation; in Lehninger Principles of Biochemistry (New York: W. H. Freeman and Company) pp 10681069 Németh A, Medveczky P, Tóth J, Siklódi E, Schlett K, Patthy A, Palkovits M, Ovádi J, Tőkési N, Németh P, Szilágyi L and Gráf L 2006 Alternative translation initiation of trypsinogen 4 with a Leu N-terminus at a CUG codon: a possible means to regulate the expression of a curious protease in human brain; FEBS J bírálat alatt Neurath H 1984 Evolution of proteolytic enzymes; Science 224 350-357 Nyaruhucha C N, Kito M, and Fukuoka S I 1997 Identification and expression of the cDNA-encoding human mesotrypsin(ogen), an isoform of trypsin with inhibitor resistance; J. Biol. Chem. 272 10573-10578
120
Ossovskaya V S and Bunnett N W 2004 Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease; Physiol Rev. 84 579-621 Owen M C, Brennan S O, Lewis J H, and Carrell R W 1983 Mutation of antitrypsin to antithrombin. Alpha-1-antitrypsin Pittsburgh (358 Met leads to Arg), a fatal bleeding disorder; N. Engl. J Med. 309 694-698 Pappenberger G, Wilsher J A, Roe S M, Counsell D J, Willison K R, and Pearl L H 2002 Crystal structure of the CCTgamma apical domain: implications for substrate binding to the eukaryotic cytosolic chaperonin; J Mol. Biol. 318 1367-1379 Patthy L 1993 Modular design of proteases of coagulation, fibrinolysis, and complement activation: implications for protein engineering and structure-function studies; Methods Enzymol. 222 10-21 Payne M A, Neuenschwander P F, Johnson A E, and Morrissey J H 1996 Effect of soluble tissue factor on the kinetic mechanism of factor VIIa: enhancement of p-guanidinobenzoate substrate hydrolysis; Biochemistry 35 7100-7106 Peabody D S 1989 Translation initiation at non-AUG triplets in mammalian cells; J Biol. Chem. 264 5031-5035 Perona J J and Craik C S 1995 Structural basis of substrate specificity in the serine proteases; Protein Sci. 4 337-360 Polgár L and Bender M L 1969 The nature of general base-general acid catalysis in serine proteases; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 64 1335-1342 Radisky E S, Lee J M, Lu C J, and Koshland D E, Jr. 2006 Insights into the serine protease mechanism from atomic resolution structures of trypsin reaction intermediates; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 103 6835-6840 Rawlings N D and Barrett A J 1993 Evolutionary families of peptidases; Biochem. J. 290 205-218 Rawlings N D, Morton F R, and Barrett A J 2006 MEROPS: the peptidase database; Nucleic Acids Res. 34 D270-D272 http://merops.sanger.ac.uk Rinderknecht H, Renner I G, Abramson S B, and Carmack C 1984 Mesotrypsin: a new inhibitor-resistant protease from a zymogen in human pancreatic tissue and fluid; Gastroenterology 86 681-692 Rinderknecht H, Renner I G, and Carmack C 1979 Trypsinogen variants in pancreatic juice of healthy volunteers, chronic alcoholics, and patients with pancreatitis and cancer of the pancreas; Gut 20 886-891 Rinderknecht, H., Renner, I. G., Carmack, C., Friedman, R., and Koyama, P. A new protease in human pancreatic juice. Clin Res 26. 1978. Ref Type: Abstract Rinderknecht H, Stace N H, and Renner I G 1985 Effects of chronic alcohol abuse on exocrine pancreatic secretion in man; Dig. Dis. Sci. 30 65-71 Ririe K M, Rasmussen R P, and Wittwer C T 1997 Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction; Anal. Biochem. 245 154-160 Robertus J D, Kraut J, Alden R A, and Birktoft J J 1972 Subtilisin; a stereochemical mechanism involving transition-state stabilization; Biochemistry 11 4293-4303 Rowen L, Koop B F, and Hood L 1996 The complete 685-kilobase DNA sequence of the human beta T cell receptor locus; Science 272 1755-1762 Rowen L, Williams E, Glusman G, Linardopoulou E, Friedman C, Ahearn M E, Seto J, Boysen C, Qin S, Wang K, Kaur A, Bloom S, Hood L, and Trask B J 2005 Interchromosomal segmental duplications explain the unusual structure of PRSS3, the gene for an inhibitor-resistant trypsinogen; Mol. Biol. Evol. 22 1712-1720
121
Ryan T J, Fenton J W, Chang T, and Feinman R D 1976 Specificity of thrombin: evidence for selectivity in acylation rather than binding for p-nitrophenyl alpha-amino-p-toluate; Biochemistry 15 1337-1341 Rychlik W and Rhoads R E 1989 A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA; Nucleic Acids Res 17 8543-8551 Sahin-Tóth M 2005 Human mesotrypsin defies natural trypsin inhibitors: from passive resistance to active destruction; Protein Pept. Lett. 12 457-464 Sambrook J, Fritsch E F, and Maniatis T (eds) 1989 Gel Electrophoresis of DNA; in Molecular cloning - a laboratory manual (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) Saris C J, Domen J, and Berns A 1991 The pim-1 oncogene encodes two related protein-serine/threonine kinases by alternative initiation at AUG and CUG; EMBO J 10 655-664 Sasaki J and Nakashima N 2000 Methionine-independent initiation of translation in the capsid protein of an insect RNA virus; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97 1512-1515 Schechter I and Berger A 1967 On the size of the active site in proteases. I. Papain; Biochem. Biophys. Res. Commun. 27 157-162 Scheele G, Bartelt D, and Bieger W 1981 Characterization of human exocrine pancreatic proteins by two-dimensional isoelectric focusing/sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis; Gastroenterology 80 461-473 Schellenberger V, Braune K, Hofmann H J, and Jakubke H D 1991 The specificity of chymotrypsin. A statistical analysis of hydrolysis data; Eur. J Biochem. 199 623636 Schellenberger V, Turck C W, and Rutter W J 1994 Role of the S' subsites in serine protease catalysis. Active-site mapping of rat chymotrypsin, rat trypsin, alpha-lytic protease, and cercarial protease from Schistosoma mansoni; Biochemistry 33 42514257 Schmidt A E, Ogawa T, Gailani D, and Bajaj S P 2004 Structural role of Gly(193) in serine proteases: investigations of a G555E (Gly193 in chymotrypsin) mutant of blood coagulation factor XI; J. Biol. Chem. 279 29485-29492 Schneider S L and Laskowski M, Sr. 1974 Occurrence of two cleavages preceding inactivation of bovine temporary trypsin isoinhibitor A; J Biol. Chem. 249 20092015 Schneider S L, Stasiuk L, and Laskowski M, Sr. 1973 Sequence of tryptic cleavages in porcine pancreatic secretory inhibitor II; J Biol. Chem. 248 7207-7214 Schwab S R, Li K C, Kang C, and Shastri N 2003 Constitutive display of cryptic translation products by MHC class I molecules; Science 301 1367-1371 Schwab S R, Shugart J A, Horng T, Malarkannan S, and Shastri N 2004 Unanticipated antigens: translation initiation at CUG with leucine; PLoS. Biol. 2 e366 Scott R W, Bergman B L, Bajpai A, Hersh R T, Rodriguez H, Jones B N, Barreda C, Watts S, and Baker J B 1985 Protease nexin. Properties and a modified purification procedure; J Biol. Chem. 260 7029-7034 Selvarajan S, Lund L R, Takeuchi T, Craik C S, and Werb Z 2001 A plasma kallikreindependent plasminogen cascade required for adipocyte differentiation; Nat. Cell Biol. 3 267-275 Senkevich T G, White C L, Koonin E V, and Moss B 2000 A viral member of the ERV1/ALR protein family participates in a cytoplasmic pathway of disulfide bond formation; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97 12068-12073
122
Shotton D M and Hartley B S 1970 Amino-acid sequence of porcine pancreatic elastase and its homologies with other serine proteinases; Nature 225 802-806 Sim R B and Laich A 2000 Serine proteases of the complement system; Biochem. Soc. Trans. 28 545-550 Singleton M, Isupov M, and Littlechild J 1999 X-ray structure of pyrrolidone carboxyl peptidase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus litoralis; Structure 7 237-244 Sprang S, Standing T, Fletterick R J, Stroud R M, Finer-Moore J, Xuong N H, Hamlin R, Rutter W J, and Craik C S 1987 The three-dimensional structure of Asn102 mutant of trypsin: role of Asp102 in serine protease catalysis; Science 237 905-909 Stein R L, Strimpler A M, Hori H, and Powers J C 1987 Catalysis by human leukocyte elastase: mechanistic insights into specificity requirements; Biochemistry 26 13011305 Stoesz J D and Lumry R W 1978 Refolding transition of alpha-chymotrypsin: pH and salt dependence; Biochemistry 17 3693-3699 Sturzenbaum S R and Kille P 2001 Control genes in quantitative molecular biological techniques: the variability of invariance; Comp Biochem. Physiol B Biochem. Mol. Biol. 130 281-289 Suzuki T, Higgins P J, and Crawford D R 2000 Control selection for RNA quantitation; Biotechniques 29 332-337 Szepessy E and Sahin-Tóth M 2006 Human mesotrypsin exhibits restricted S1' subsite specificity with a strong preference for small polar side chains; FEBS J 273 29422954 Szilágyi L, Kénesi E, Katona G, Kaslik G, Juhász G, and Gráf L 2001 Comparative in vitro studies on native and recombinant human cationic trypsins. Cathepsin B is a possible pathological activator of trypsinogen in pancreatitis; J. Biol. Chem. 276 24574-24580 Szmola R, Kukor Z, and Sahin-Tóth M 2003 Human mesotrypsin is a unique digestive protease specialized for the degradation of trypsin inhibitors; J. Biol. Chem. 278 48580-48589 Tani T, Kawashima I, Mita K, and Takiguchi Y 1990 Nucleotide sequence of the human pancreatic trypsinogen III cDNA; Nucleic Acids Res. 18 1631 Thompson J D, Higgins D G, and Gibson T J 1994 CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice; Nucleic Acids Res 22 4673-4680 Thompson R C and Blout E R 1970 Evidence for an extended active center in elastase; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 67 1734-1740 Tóth J, Gombos L, Simon Z, Medveczky P, Szilágyi L, Gráf L, and Málnási-Csizmadia A 2006a Thermodynamic analysis reveals structural rearrangement during the acylation step in human trypsin 4 on 4-methylumbelliferyl 4-guanidinobenzoate substrate analogue; J Biol. Chem. Tóth J, Medveczky P, Szilágyi L, and Gráf L 2006b Serine proteases; in Neural Protein Metabolism and Function, volume 7 of Handbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology 3rd edition (ed) A Lajtha (Springer) pp 2-27 Tóth J, Simon Z, Medveczky P, Gombos L, Jelinek B, Szilágyi L, Gráf L and Málnási-Csizmadia A 2006c Site directed mutagenesis at position 193 of human trypsin 4 alters the rate of conformational change during activation: role of local internal friction in protein dynamics. Proteins bírálat alatt
123
Touriol C, Bornes S, Bonnal S, Audigier S, Prats H, Prats A C, and Vagner S 2003 Generation of protein isoform diversity by alternative initiation of translation at non-AUG codons; Biol. Cell 95 169-178 Urano T, Urano S, and Castellino F J 1988 Reaction of tissue-type plasminogen activator with 4-methylumbelliferyl-p-guanidinobenzoate hydrochloride; Biochem. Biophys. Res. Commun. 150 45-51 Vajda T and Náray-Szabó G 1988 Role of counter ions in trypsin acylation. NaCl effect; Acta Biochim. Biophys. Hung. 23 195-202 Van den Steen P E, Opdenakker G, Wormald M R, Dwek R A, and Rudd P M 2001 Matrix remodelling enzymes, the protease cascade and glycosylation; Biochim. Biophys. Acta 1528 61-73 Verheyden G, Mátrai J, Volckaert G, and Engelborghs Y 2004 A fluorescence stopped-flow kinetic study of the conformational activation of alpha-chymotrypsin and several mutants; Protein Sci. 13 2533-2540 von Heijne G 1986 A new method for predicting signal sequence cleavage site; Nucleic Acids Res 14 4683-4690 Wang K, Gan L, Lee I, and Hood L 1995 Isolation and characterization of the chicken trypsinogen gene family; Biochem. J. 307 ( Pt 2) 471-479 Wang Y, Luo W, Wartmann T, Halangk W, Sahin-Tóth M, and Reiser G 2006 Mesotrypsin, a brain trypsin, activates selectively proteinase-activated receptor-1, but not proteinase-activated receptor-2, in rat astrocytes; J Neurochem. Warshel A, Naray-Szabo G, Sussman F, and Hwang J K 1989 How do serine proteases really work?; Biochemistry 28 3629-3637 Wheast R C (ed) 1988 CRC Handbook of Chemistry and Physics (Boca Raton, Florida: CRC Press) Whiting A K and Peticolas W L 1994 Details of the acyl-enzyme intermediate and the oxyanion hole in serine protease catalysis; Biochemistry 33 552-561 Wiegand U, Corbach S, Minn A, Kang J, and Müller-Hill B 1993 Cloning of the cDNA encoding human brain trypsinogen and characterization of its product; Gene 136 167-175 Wilmouth R C, Clifton I J, Robinson C V, Roach P L, Aplin R T, Westwood N J, Hajdu J, and Schofield C J 1997 Structure of a specific acyl-enzyme complex formed between beta-casomorphin-7 and porcine pancreatic elastase; Nat. Struct. Biol. 4 456-462 Wilmouth R C, Edman K, Neutze R, Wright P A, Clifton I J, Schneider T R, Schofield C J, and Hajdu J 2001 X-ray snapshots of serine protease catalysis reveal a tetrahedral intermediate; Nat. Struct. Biol. 8 689-694 Wilson J E, Pestova T V, Hellen C U, and Sarnow P 2000 Initiation of protein synthesis from the A site of the ribosome; Cell 102 511-520 Wroblowski B, Diaz J F, Schlitter J, and Engelborghs Y 1997 Modelling pathways of alpha-chymotrypsin activation and deactivation; Protein Eng 10 1163-1174 Yamashita K, Mimori K, Inoue H, Mori M, and Sidransky D 2003 A tumor-suppressive role for trypsin in human cancer progression; Cancer Res 63 6575-6578 Zivelin A, Ogawa T, Bulvik S, Landau M, Toomey J R, Lane J, Seligsohn U, and Gailani D 2004 Severe factor XI deficiency caused by a Gly555 to Glu mutation (factor XI-Glu555): a cross-reactive material positive variant defective in factor IX activation; J Thromb. Haemost. 2 1782-1789
124
FÜGGELÉK GSP1
5’ GGCTTTACACTCAGCCTGGG 3’
AAP
5’ GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG 3’
GSP2
5’ GGAGAGTTTGATCAGCATGATGTC 3’
hβAct_F
5’ ACAATGAGCTGCGTGTGGCT 3’
hβAct_R
5’ TCTCCTTAATGTCACGCACGA 3’
hTry4_F
5’ CGCATATGGAGCTGCACCCGCTTCTG 3’
hTry4_R
5’ GACTGCAGAGCTCCCGGGGGCTTTAGC 3’
hTry4_RT_F
5’ CTGCTACAAGACCCGCATCC 3’
hTry4_RT_R
5’ GGAGAGTTTGATCAGCATGATGTC 3’
hβAct_RT_F
5’ GCGAGAAGATGACCCAGATCA 3’
hβAct_RT_R
5’ CGTAGATGGGCACAGTGTGG 3’
hTry4B_F
5’ CGCATATGGAGCTGCACCCGCTTCTG 3’
hTry4B_R
5’ GACTGCAGGGATCCCGGGGGCTTTAGC 3’
hTry4A_F
5’ CTGCATATGTGCGGACCTGACGACAGATGC 3’
hTry4A_R
5’ CTGCAGCAACTGTGCCCAGCGCCTCGC 3’
hTry4_R193G
5’ TCCTGCCAGGGTGACTCCGGTGGC 3’
hTry4_R193A
5’ TCCTGCCAGGCTGACTCCGGTGGC 3’
hTry4_R193F
5’ TCCTGCCAGTTTGACTCTGGTGGCCC 3’
hTry4_R193Y
5’ TCCTGCCAGTATGACTCTGGTGGCCC 3’
hTry4_S195A
5’ CCTGCCAGCGTGACGCTGGTGGCCCTGTG 3’
hTry4_3’
5’ GACTGCAGAGCTCCCGGGGGCTTTAGC 3’
hTry4_5’
5’ GCTGAAGCTTTCCCCGTTGACGATGATGAC 3’
VII. táblázat A CDNS szintézisekhez és PCR reakciókhoz használt oligonukleotidok szekvenciája a szövegben való előfordulásuk sorrendjében feltüntetve. Az AAP primer szekvenciájában az I az inozint jelöli. A hTry4_RT_F és a hβAct_RT_F primerekben az aláhúzott bázisok az exon-exon határokat jelölik. A klónozáshoz használt oligonukleotidokban a restrikciós endonukleázok hasítóhelyeit aláhúzással emeltem ki (Try4B_F: NdeI, hTry4B_R: BamHI, hTry4A_F: NdeI, hTry4A_R: AlwNI, hTry4_3’: SacI, hTry4_5’: HindIII). A megaprimer mutagenezishez használt primerekben az aláhúzás a mutációt hordozó tripletet jelöli.
125
