A HASNYÁLMIRIGY EREDETŰ TRIPSZIN INHIBITOR (SPINK1) PATHOBIOKÉMIÁJA

A HASNYÁLMIRIGY EREDETŰ TRIPSZIN INHIBITOR (SPINK1) PATHOBIOKÉMIÁJA Doktori értekezés

Király Orsolya Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola Pathobiokémia Doktori Program

Témavezető:

Dr. Sahin-Tóth Miklós

Hivatalos bírálók: Dr. Gál Péter Dr. Mócsai Attila Szigorlati bizottság elnöke:

Dr. Enyedi Péter

Szigorlati bizottság tagjai:

Dr. Vértessy Beáta Dr. Bartha Katalin

Budapest 2007

Az értekezés kísérleti anyaga a Boston University Department of Molecular and Cell Biology tanszékén készült Dr. Sahin-Tóth Miklós laboratóriumában.

2

TARTALOM ÁBRÁK JEGYZÉKE ....................................................................................................... 5 TÁBLÁZATOK JEGYZÉKE .......................................................................................... 5 RÖVIDíTÉSEK JEGYZÉKE ........................................................................................... 6 1 BEVEZETÉS ........................................................................................................... 7 2 IRODALMI ÁTTEKINTÉS................................................................................... 9 2.1 A hasnyálmirigy-gyulladás (pancreatitis)......................................................... 9 2.1.1 Akut pancreatitis....................................................................................... 9 2.1.2.1 Örökletes pancreatitis ......................................................................... 12 2.1.2.1.1 Az örökletes pancreatitis genetikája ............................................. 13 2.2 A hasnyálmirigy eredetű tripszin inhibitor (SPINK1).................................... 16 2.2.1 A SPINK1 és szerepe a hasnyálmirigyben ............................................. 16 2.2.2 A SPINK1 szerepe a hasnyálmirigyen kívül .......................................... 19 2.2.2.1 A SPINK1 expressziós mintázata....................................................... 19 2.2.2.2 A SPINK1 a szérumban...................................................................... 19 2.2.3 A SPINK1 gén ........................................................................................ 21 2.2.3.1 A SPINK családba tartozó további gének .......................................... 21 2.2.3.2 A SPINK1 mutációi és a pancreatitis.................................................. 22 2.2.3.3 A mutációk funkcionális hatása.......................................................... 24 2.3 Az örökletes pancreatitis pathogenezisének modellje .................................... 26 3 CÉLKITŰZÉSEK ................................................................................................. 28 4 FELHASZNÁLT ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ............................................ 29 4.1 Genetikai vizsgálatok ..................................................................................... 29 4.1.1 Vizsgálati személyek .............................................................................. 29 4.1.2 DNS-izolálás és mutációk keresése........................................................ 30 4.2 Plazmidok készítése........................................................................................ 30 4.2.1 SPINK1 cDNS klónozása eukarióta expressziós vektorba .................... 30 4.2.2 Irányított mutagenezis ............................................................................ 31 4.2.3 Glu-Glu epitóp címkével jelölt cDNS-klónok készítése ........................ 32 4.2.4 Szekvenálás ............................................................................................ 32 4.2.5 Transzfektálásra alkalmas plazmidprepreparátumok készítése.............. 32 4.3 Sejttenyésztés és transzfekció......................................................................... 33 4.4 ÖsszRNS-izolálás és RT-PCR........................................................................ 34 4.5 A SPINK1 variánsok szekréciójának vizsgálata ............................................ 34 4.5.1 A szekréció vizsgálata az inhibitoraktivitás alapján............................... 34 4.5.1.1 Reziduális tripszinaktivitás meghatározása ........................................ 34 4.5.1.1.1 Rekombináns humán kationos tripszinogén termelése és tisztítása 34 4.5.1.1.2 Ecotin affinitáskromatográfiás oszlop készítése........................... 35 4.5.1.1.3 Rekombináns humán kationos tripszinogén tisztítása ecotin affinitáskromatográfiával................................................................................ 36 4.5.1.1.4 Humán kationos tripszinogén aktiválása tripszinné ..................... 36 4.5.1.1.5 Tripszinaktivitás mérése és a reziduális tripszinaktivitás meghatározása ................................................................................................ 36 4.5.1.2 A szecernált SPINK1 koncentrációjának meghatározása................... 37 4.5.1.2.1 Kalibrációs görbe.......................................................................... 37

3

4.5.1.2.2 A sejtkivonatok β-galaktozidáz aktivitásának mérése.................. 37 4.5.1.2.3 A sejtkivonatok összfehérje-tartalmának meghatározása............. 38 4.5.2 A szekréció vizsgálata immunoblottal.................................................... 38 4.5.2.1 SDS-poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) ........................... 38 4.5.2.2 Immunoblot (Western blot) ................................................................ 38 4.6 A SPINK1 variánsok inhibitoraktivitásának vizsgálata ................................. 39 4.6.1 A SPINK1 variánsok kifejezése Escherichia coli-ban ........................... 39 4.6.1.1 SUMO fúziós konstrukciók készítése ................................................ 39 4.6.1.2 SUMO fúziós fehérjék expressziója és izolálása................................ 40 4.6.2 A SPINK1 variánsok tísztítása HEK 293T sejtek médiumából ............. 41 4.6.3 A Ki meghatározása progress curve analízissel ..................................... 42 5 EREDMÉNYEK .................................................................................................... 43 5.1 Új mutáció felfedezése a SPINK1 szignálpeptidjében ................................... 43 5.2 A SPINK1 szignálpeptidjében előforduló változatok funkcionális vizsgálata44 5.2.1 A szignálpeptidben található szekvenciavariánsok hatása a gén átíródására............................................................................................................... 45 5.2.2 A szignálpeptidben található szekvenciaváltozatok hatása a fehérje szekréciójára ........................................................................................................... 46 5.2.2.1 A szekréció vizsgálata a reziduális tripszinaktivitás mérésével ......... 46 5.2.2.2 A szekréció vizsgálata immunoblottal................................................ 49 5.3 Az érett SPINK1-ben található missense mutációk funkcionális hatásának vizsgálata .................................................................................................................... 51 5.3.1 Az érett SPINK1 mutációinak hatása a fehérje inhibitoraktivitására ..... 51 5.3.2 Az érett SPINK1 mutációinak hatása a SPINK1 gén transzkripciójára.. 53 5.3.3 Az érett SPINK1 mutációinak hatása a fehérje szekréciójára .................... 53 5.3.3.1 A szekréció vizsgálata a reziduális tripszinaktivitás mérésével ......... 54 5.3.3.2 A szekréció vizsgálata immunoblottal................................................ 56 5.3.4 A HEK 293T sejtekben kifejezett SPINK1 mutánsok inhibitoraktivitásának vizsgálata ............................................................................ 58 6 AZ EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE............................................................ 60 6.1 A szignálpeptid-mutációk hatása.................................................................... 60 6.2 Az érett fehérje missense mutációinak funkcionális hatása............................ 64 7 KÖVETKEZTETÉSEK ....................................................................................... 68 8 ÖSSZEFOGLALÁS .............................................................................................. 69 9 SUMMARY............................................................................................................ 70 10 IRODALOMJEGYZÉK ....................................................................................... 71 11 SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE................................................................ 88 12 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS............................................................................... 89

4

ÁBRÁK JEGYZÉKE 1. ábra. 2. ábra. 3. ábra. 4. ábra.

A tripszin szerepe az emésztőenzimek aktiválásában. ..................................... 15 A SPINK1 fehérje szerkezete. .......................................................................... 18 A SPINK1 gén vázlatos szerkezete. ................................................................. 23 A pancreatitist okozó ill. azzal összefüggésbe hozott fontosabb gének és feltételezett szerepük a betegség kialakulásában.............................................. 27 5. ábra. A munkánk során klónozott cDNS-konstrukciók szekvenciájának összefoglaló vázlata............................................................................................................... 30 6. ábra. Az új L14R mutációt hordozó két család családfája. ....................................... 43 7. ábra. A SPINK1 fehérje vázlatos szerkezete ............................................................. 46 9. ábra. A szignálpeptid mutációkat tartalmazó SPINK1 konstrukciókkal transzfektált sejtek médiumának tripszingátló aktivitása...................................................... 48 10. ábra. A SPINK1 szignálpeptid variánsok szekréciója HEK 293T sejtekből........... 48 11. ábra. A szignálpeptid mutánsok vizsgálata immunoblottal a transzfektált HEK 293T sejtek médiumában és sejtkivonatában............................................................. 49 12. ábra. Az érett SPINK1 fehérjében található missense mutációk. ............................ 51 13. ábra. Az E. coli-ban kifejezett missense mutánsok és a vad típusú SPINK1 inhibitoraktivitásának vizsgálata progress curve analízissel............................ 52 14. ábra. Az érett SPINK1-ben található mutációk transzkripcióra gyakorolt hatásának vizsgálata RT-PCR-rel. .................................................................................... 53 15. ábra. Az érett SPINK1 mutációinak hatása az inhibitor szekréciójára.................... 55 16. ábra. Az érett SPINK1-et érintő mutációk szekrécióra való hatásának vizsgálata immunoblottal. ................................................................................................. 57 17. ábra. A HEK 293T sejtekben kifejezett vad típusú, N34S és R65Q SPINK1 tripszingátló aktivitásának vizsgálata progress curve analízissel. ................... 59 18. ábra. Az Asp50 és a Tyr54 közötti interakció a SPINK1 harmadlagos szerkezetében. ................................................................................................................ 66

TÁBLÁZATOK JEGYZÉKE 1. táblázat. A SPINK1 génben azonosított, aminosavcserét eredményező mutációk. .. 24 2. táblázat. A mutáns SPINK1 cDNS konstrukciók készítéséhez használt primerek.... 31 3. táblázat. A szignálpeptid hidrofób régióját érintő mutációk betegségekkel való kapcsolata .................................................................................................... 62

5

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE BSA CFTR CFTR CHO DHPLC DMEM E. coli EDTA ERCP HEK 293T HPLC GAPDH Glu-Glu IgG IL-6 IMAGE IPTG Ki lacZ LB MRI mOD NTA OD ONPG PBS PCR PRSS1 PRSS1 PRSS2 PVDF RT-PCR SDS SPINK1 SPINK1 SUMO SV40 Tris

marhaszérum-albumin cisztás fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor génje cisztás fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor kínai hörcsög ovárium eredetű sejtvonal denaturáló nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia Dulbecco’s Modified Eagle's Minimal Essential Medium Escherichia coli etiléndiamin-tetraecetsav endoszkópos retrográd cholangio-pancreatográfia humán embrionális vese eredetű sejtvonal nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz epitóp címke (Glu-Tyr-Met-Pro-Met-Glu) immunglobulin G interleukin-6 Integrated Molecular Analysis of Genomes and their Expression Consortium izopropil-β-D-tiogalaktopiranozid inhibitorkonstans β-galaktozidáz gén (Escherichia coli) Luria–Bertani tápoldat mágneses rezonanciás képalkotás milliOD nitrilotriecetsav (fémkelátor) optikai denzitás o-nitrofenil-β-D-galaktopiranozid foszfáttal pufferelt sóoldat polimeráz láncreakció humán kationos tripszinogén génje humán kationos tripszinogén humán anionos tripszinogén génje polivinilidén-fluorid reverz transzkripcióval kapcsolt polimeráz láncreakció nátrium-dodecilszulfát hasnyálmirigy eredetű tripszin inhibitor génje hasnyálmirigy eredetű tripszin inhibitor ubiquitinszerű fehérje (small ubiquitin-related modifier) Simian virus 40 (onkogén poliomavírus) trishidroximetil-aminometán

6

1

BEVEZETÉS A proteázok az összes élőlénycsoportban és a vírusokban is megtalálhatók és

számos biológiai folyamatban játszanak szerepet a sejten kívül és a sejten belül egyaránt.1 Az emberi szervezetben a proteázok a táplálékkal bevitt fehérjék emésztésén kívül olyan életfontosságú folyamatokban vesznek részt, mint a véralvadás, a fibrinolízis vagy a komplementrendszer aktiválódása, intracellulárisan pedig a fehérjék lebontása a proteaszómában és az apoptózis. Életfontosságú szerepük mellett a proteázok fehérjebontó aktivitása komoly veszélyforrást is jelent a szervezetre, így aktivitásukat a sejtben és a szervezetben szigorúan szabályozni kell. A nem megfelelő helyen fellépő proteolitikus aktivitás betegséghez vezethet. A proteázok aktivitásának szabályozása több szinten történik: expressziójuk és szekréciójuk is regulált, a képződött proproteázok csak aktiválás után képesek fehérjebontásra, az érett enzimek pedig lebomolhatnak. A szabályozás másik módja a proteázok aktivitásának inhibitorok általi gátlása. A legtöbb ismert proteázinhibitor maga is fehérjetermészetű molekula.2,3 A proteázokat az általuk katalizált hasítás biokémiai módja alapján csoportosítjuk. Ennek alapján megkülönböztetünk szerin-, cisztein-, treonin-, aszpartát-, metallo- és glutamát-proteázokat. Az utóbbi csoportot csak 2004-ben írták le, míg a szerinproteázok csoportja a legrégebben és legtöbbet vizsgált proteáztípus.4 A szerinproteázok közül könnyű elérhetőségük miatt leggyakrabban a tripszineket vizsgálták. Az első izolált proteázinhibitor a szarvasmarha hasnyálmirigy tripszin inhibitor volt,5 és a fehérjefehérje kölcsönhatásokat hosszú ideig a tripszin és inhibitora(i) közötti kölcsönhatáson tanulmányozták. A tripszinek6 a gerincesek hasnyálmirigyében termelődő emésztőenzimek, amelyek a táplálékkal bevitt fehérjéket a vékonybélben elhasítják. Ez a hasítás lizin és arginin aminosavak után történik. Az emberi szervezetben három tripszin izoforma fordul elő: a kationos tripszin, az anionos tripszin és a mezotripszin.7,8 Nevük onnan származik, hogy az egyes izoformák eltérően viselkednek az izoelektromos fókuszálás során: az anódhoz legközelebb eső enzim az anionos tripszin, a katódhoz közel eső a kationos tripszin, a középső pedig a mezotripszin. Az első két izoforma teszi ki a hasnyálmirigy által szecernált emésztőenzimek nagy részét.

7

Védőmechanizmusok sora van jelen a hasnyálmirigyben e nagy mennyiségű proteáz fehérjebontó aktivitása ellen. A tripszinek a hasnyálmirigy acinussejtjeiben inaktív prekurzorok (zimogének) formájában termelődnek, majd membránnal határolt kompartmentekben (zimogéngranulumok) halmozódnak fel. Aktiválódásuk a duodenum lumenében megy végbe a bélhámsejtek kefeszegélyében található enterokináz (enteropeptidáz) általi proteolitikus hasítással.9 A hasnyálmirigyben esetlegesen megjelenő tripszinaktivitás ellen a zimogénekkel együtt szecernálódó tripszin inhibitor, a hasnyálmirigy eredetű tripszin inhibitor (SPINK1) nyújt védelmet.10,11 Ennek a védőmechanizmusnak az elégtelensége szöveti önemésztődéshez és következményes hasnyálmirigy-gyulladáshoz vezethet. A jelen dolgozatban bemutatott munka a SPINK1 pathobiokémiájával, a hasnyálmirigy-gyulladás (pancreatitis) kialakulásában betöltött szerepével foglalkozik.

8

2

IRODALMI ÁTTEKINTÉS

2.1 A hasnyálmirigy-gyulladás (pancreatitis) A pancreatitis a hasnyálmirigy gyulladásos megbetegedése, amelynek akut és krónikus formája ismert.12,13 Az akut forma hirtelen jelentkező gyulladás, amely az esetek többségében epekő vagy túlzott alkoholfogyasztás miatt alakul ki. A betegség krónikus formája esetében a gyulladás többször visszatér vagy folyamatossá válik és szövetkárosodást,

valamint

a

hasnyálmirigy

funkciójának

visszafordíthatatlan

károsodását eredményezi. A betegség fő tünete mindkét esetben a hasi fájdalom, amely igen erős is lehet. A pancreatitist a hasnyálmirigy által termelt zimogének ektópiás aktiválódása okozza, amely szöveti károsodást, gyulladásos reakciót és nekrózist okozva szisztémás betegséghez vezethet. 1896-ban Hans Chiari ismerte fel elsőként, hogy a pancreatitisben elhunyt betegek hasnyálmirigye „saját emésztési kapacitásának áldozatává válik”, és ugyanő vezette be e folyamat leírására az önemésztődés kifejezést.14

2.1.1

Akut pancreatitis Az akut pancreatitis a hasnyálmirigy heveny gyulladásos megbetegedése, amely a

környező és távoli szervek károsodását okozhatja.12,13 A betegség főbb tünetei a hasi fájdalom, hányinger, hányás, valamint a pancreas eredetű enzimek szintjének emelkedése a vérben és a vizeletben. Az akut pancreatitist leggyakrabban epekő vagy alkoholfogyasztás okozza. Kialakulásának egyéb okai lehetnek bizonyos anatómiai rendellenességek, egyes gyógyszerek, fertőzések, metabolikus zavarok, ischaemia, trauma, valamint iatrogén tényezők, leggyakrabban az endoszkópos retrográd cholangio-pancreatográfia (ERCP). A fellépő nekrózis vérzéshez, fertőzéshez vezethet, súlyos esetben sokszervi elégtelenség léphet fel, amely halált is okozhat. Az akut pancreatitis diagnózisa a súlyos hasi fájdalom jelenlétén és a pancreas károsodásának laboratóriumi vizsgálatokkal és képalkotó eljárásokkal való detekcióján alapul. Specifikus terápiája nem ismert, a szupportív terápia fő elemei a pancreas nyugalomba helyezése, a fájdalom csillapítása és a megfelelő diéta felépítése. Az akut pancreatitis nemzetközi incidenciája 5-80 /100 000/év, emelkedő tendenciát mutat.15 Az incidencia hazánkban is hasonló, 100 000 emberre 10-50 eset

9

Irodalmi áttekintés

évente.12 A betegség mortalitása átlagosan 5-10%, ám a súlyos, nekrotizáló esetekben ennél jóval magasabb is lehet.16 Az akut pancreatitisnek számos állatmodellje ismert, ám az ezekben mesterségesen előidézett betegség nem pontosan modellezi a humán pancreatitist,17,18 így ezek csak korlátozottan használhatók a pathomechanizmus kutatásában. 2.1.2

Krónikus pancreatitis A krónikus pancreatitis a hasnyálmirigy visszatérő vagy folyamatos gyulladásos

megbetegedése, amelyet visszafordíthatatlan morfológiai változások, fájdalom, valamint az exokrin és endokrin pankreatikus funkciók tartós károsodása jellemez.12,13 A jelenleg elfogadott nekrózis-fibrózis hipotézis szerint először akut formában jelentkezik, az egymást követő akut rohamok után a regeneráció nem teljes, a pancreas egyre jobban károsodik, végül krónikus betegség alakul ki.19 A

legfontosabb

hajlamosító

tényező

az

akut

formához

hasonlóan

az

alkoholfogyasztás, mely a fejlett társadalmakban fellépő megbetegedések 70%-át okozza. További okok lehetnek az anatómiai rendellenességek (pancreas divisum), metabolikus zavarok, trauma, cisztás fibrózis és gyulladásos bélbetegségek. A nemzetközi incidencia 3-4/100 000/év,20,21 az incidencia hazánkban is hasonló. A betegség jellemzői a felső hasi fájdalom, a pancreas parenchyma irreverzíbilis pusztulása, kötőszövet-képződés, gyulladásos beszűrődések és a pancreasfunkció károsodása, melynek következtében steatorrhoea, testsúlyvesztés, inzulindependens diabetes mellitus léphet fel. A kialakuló nekrózis a fertőzés veszélyét hordozza. Pseudocysta fejlődhet ki, amely kifakadhat, elfertőződhet, ill. a szomszédos szerveket nyomhatja. A krónikus pancreatitisben szenvedők körében a mortalitás körülbelül 30%kal magasabb, mint a teljes populációban,22 ám maga a pancreatitis csak a halandóság növekedésének egyötödéért felelős. A pancreasrák kialakulásának valószínűsége a krónikus pancreatitisben szenvedő betegek körében jelentősen megnő.23 A diagnózis alapjai a pancreasfunkció károsodásának felmérése funkcionális próbákkal és a morfológiai elváltozások detektálása képalkotó eljárások segítségével. A kezelés célja a fájdalom enyhítése és a kiesett exokrin ill. endokrin funkció pótlása. A krónikus pancreatitis vizsgálatára használt állatmodellek az akut betegség modelljeihez

hasonlóan

mesterséges,

szuprafiziológiás

10

stimuláción

alapulnak.


Használják még a spontán pancreatitist kifejlesztő hím WBN/Kob patkányokat is,24 azonban kimutatták, hogy az ezekben az állatokban kialakuló betegség szövettanilag nem hasonló a humán pancreatitishez.25 A krónikus pancreatitis pathomechanizmusának megismerésében előrelépést jelentett a pancreas csillagsejtjeinek azonosítása és jellemzése.26,27 Megállapították, hogy az aktivált csillagsejtek kulcsfontosságú szerepet játszanak a fibrózis kialakulásában.28 A csillagsejtekre ható egyes vegyületek sejtkultúrában vagy kísérleti állatokban megelőzik vagy fékezik a csillagsejtek aktiválódását és a fibrózis kialakulását, így ezek a sejtek a terápia esetleges célpontjai lehetnek.29 A krónikus pancreatitis kutatásának legújabb eredményeit Witt és munkatársai foglalták össze.19 A betegség elkülönült altípusa az autoimmun pancreatitis.30,31 Ezt a típust csak 10 évvel ezelőtt írták le,32 bár autoimmun folyamatokat már 40 évvel ezelőtt is megfigyeltek.33 Az autoimmun pancreatitisben a laktoferrin és a II-es típusú szénsav anhidráz,34 újabban pedig a SPINK135 elleni autoantitesteket írtak le. A pancreatitisnek ez az egyetlen formája, amely gyógyítható.36 Fejlődő országokban fordul elő a trópusi meszesedő pancreatitis,37 amelynek okaként sokáig a fehérjehiányos táplálkozást és a manióka fogyasztását jelölték meg az irodalomban.38 Az újabb vizsgálatok ezeket az elméleteket cáfolták,39 így a betegség pathomechanizmusát jelenleg ismeretlennek tekintik. A betegek 20%-ánál semmilyen hajlamosító tényező nem állapítható meg, ezeket az eseteket így a betegség idiopátiás formájaként diagnosztizálják. Egyes esetekben az érintett család több tagja is pancreatitisben szenved, ilyenkor familiáris vagy örökletes pancreatitist állapítanak meg. A betegség utóbbi formái kizárólag vagy nagyrészt genetikai eredetűek, a kialakulásukért felelős genetikai faktorok kutatása intenzíven folyik. Az azonosított genetikai faktorokat gyakran az idiopátiás formában szenvedő betegekben is megtalálják, így valószínűsíthető, hogy a betegség ezen formája is jórészt genetikai tényezők következménye. Az irodalomban már megjelent az igény a betegség csoportjainak eredet szerinti összevonására és csak a genetikai eredetű primer ill. az egyéb tényezők kiváltotta szekunder forma megkülönböztetésére.19,40 Az újabb vizsgálatok az alkoholos és a trópusi pancreatitis esetében is megtalálták az örökletes pancreatitist okozó egyes génvariánsokat,41-45 ezért valószínűsíthető, hogy a későbbi kutatások eredménye a pancreatitis kialakulásának új típusú modellje lesz, amelyben az

11


egyes genetikai és környezeti hatások együtt érvényesülnek, sőt interakcióban állnak egymással.19

2.1.2.1 Örökletes pancreatitis Elsőként Comfort és Steinberg ismerték fel 1952-ben, hogy a krónikus pancreatitis egyes családokban halmozottan fordul elő, ami arra utal, hogy a betegség eme formája genetikai eredetű.46 Az örökletes pancreatitis autoszomális domináns módon öröklődik.46 Klinikai definíciója változásokon ment keresztül és jelenleg sem egységes. Az Európai Örökletes Pancreatitis és Familiáris Pancreasrák Regiszter (EUROPAC) jelenlegi definíciója szerint az öröklött pancreatitis diagnózis akkor állítható fel, ha az adott családban legalább két elsőfokú vagy legalább három másodfokú rokon található kettő vagy több nemzedékben, akik visszatérő akut pancreatitisben és/vagy krónikus pancreatitisben szenvednek, külső kiváltó ok pedig nem azonosítható.47 Amennyiben ezen kritériumok nem mindegyike teljesül, de egynél több családtagot érint a betegség (rendszerint ugyanabban a generációban), akkor familiáris krónikus pancreatitisként diagnosztizálandó.47 Az örökletes pancreatitis klinikai megjelenése a betegség egyéb eredetű formáitól nem különbözik,46 ami arra utal, hogy a pathomechanizmus az egyes esetekben hasonló. Az öröklött forma így a pancreatitis modelljeként használható, kialakulásának megismerése hozzásegíthet az egyéb eredetű formák megelőzéséhez és új terápiás módszerek kidolgozásához.

12


2.1.2.1.1 Az örökletes pancreatitis genetikája Az örökletes pancreatitist okozó génváltozatok a herediter forma leírását követő 40 éven át ismeretlenek voltak. A molekuláris biológiai módszerek robbanásszerű fejlődése és a humán genom teljes szekvenciájának ismertté válása lehetővé tette a betegséget okozó genetikai faktorok kutatását. Az irodalomban vizsgált genetikai faktorok részletes áttekintését adják Witt és munkatársainak összefoglalói.19,48 Az alábbiakban az ezidáig leírt, pancreatitist okozó vagy azzal összefüggésbe hozott fontosabb mutációkat foglalom össze.

2.1.2.1.1.1 A humán kationos tripszinogén (PRSS1) mutációi A betegségért felelős gént kapcsoltsági analízissel a 7-es kromoszóma hosszú karjára,49 a 7q35 lokuszra50,51 lokalizálták. Röviddel ezután a Humán Genom Program eredményeként ismertté vált e kromoszómarégió pontos szekvenciája52 és az is kiderült, hogy az itt található T-sejt-receptor β-lánc lokuszban sorakozik a három tripszinogént kódoló

gén

tandem

elrendeződésben.53,54

Whitcomb

és

munkatársai

ezután

szekvenálással mutációkat kerestek ezekben a génekben és azt találták, hogy az általuk vizsgált betegek valamennyien hordoztak egy mutációt a humán kationos tripszinogén génjében55 (PRSS1: protease, serine, 1). Ez az elsőként leírt R122H mutáció azóta is a leggyakoribb

tripszinogénmutáció

örökletes

pancreatitisben.

További

gyakori

mutációkként írták le az N29I56 és az A16V57 mutációkat. A humán kationos tripszinogén pancreatitisben talált mutációinak körülbelül 70%-a R122H, míg az N29I körülbelül 25%-ot, az A16V pedig körülbelül 4%-ot tesz ki.47,58-60 Ismert még számos ritka mutáció, amelyeket csak néhány betegben vagy családban találtak meg.61 Whitcomb és munkatársai az R122H mutáció hatásaként molekulamodellezés és korábbi kísérleti eredmények alapján a mutáns tripszin gyengébb autolízisét és így megnövekedett stabilitását jelölték meg.55 Később biokémiai módszerekkel többen igazolták, hogy ennek az aminosavnak a mutációja a stabilitás növekedését eredményezi.62,63 A mutáns fehérje alaposabb biokémiai jellemzése azonban azt is kimutatta, hogy az R122H mutáció hatására a tripszinogén tripszin általi aktiválása gyorsabb lesz.62 Az N29I mutáció vizsgálata szintén ezt az eredményt hozta.62,64,65 Az A16V mutáció vizsgálatakor azt találták, hogy a mutáns tripszinogént a kimotripszin C hasítani képes és az így processzált zimogén gyorsabban aktiválódik a tripszin által.66

13


A humán kationos tripszinogént a belőle képződött aktív enzim, a tripszin is képes aktiválni az enteropeptidáz mellett,67-69 mivel a lehasadó aktivációs peptid utolsó aminosava lizin, így a tripszin saját zimogénjét hasítani képes. Ezt a tripszin általi aktiválódást egyszerűsítve autoaktivációnak nevezik. Az autoaktiváció megléte a más fajokból izolált tripszinogéneknél is előfordul és elképzelhető, hogy alsóbbrendű élőlényeknél ez az aktiváció eredeti mechanizmusa.70 A lehasadó aktivációs peptid szekvenciája befolyásolja az autoaktiváció sebességét.70 Mivel az autoaktiváció a duodenumon kívül is megtörténhet, tehát az aktív tripszin általi károsodás veszélyét hordozza, nem meglepő, hogy az aktivációs peptid szekvenciájára erős szelekció hat.70-72 Úgy tűnik azonban, hogy az emberi evolúció során a kationos tripszinogén gyorsabb autoaktiválódása szelektív előnyt jelentett a hasnyálmirigyen belüli aktiválódás veszélye ellenére is.71 Az aktivációs peptid szekvenciájára tehát ellentétes szelekciós erők hatnak, melyek eredményeképpen a lehető leggyorsabb, betegséget még nem okozó aktiválódás zajlik le. Ennek következményeként azonban a szekvencia egyetlen ponton történő megváltozása erős hatással lehet az autoaktiválódás sebességére. Az aktivációs peptid három ritka mutációját találták örökletes pancreatitisben szenvedő betegekben (D19A,70 D22G73 és K23R74), és az R122H ill. N29I mutációkhoz hasonlóan mindhárom mutáció a mutáns tripszinogének gyorsabb autoaktivációját eredményezi.70,73 Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az örökletes pancreatitisben talált

mutációk

közös

pathomechanizmussal,

a

tripszinogén

megnövekedett

autoaktivációján keresztül okozzák a betegséget,62,75 azaz gain-of-function mutációk. Az E79K mutációnak nincs hatása az autoaktiválódásra, azonban a mutáns tripszin gyorsabban aktiválja az anionos tripszinogént, mint a vad típus.76 Ebben az esetben a mutáció következtében megnövekedett „össz-tripszinaktivitás” (kationos és anionos együtt) okozhatja a betegséget. A közelmúltban egy újabb patogén mutációt írtak le: a gént tartalmazó 605 kilobázisos szakasz triplikációját, amelyet öt érintett családban találtak meg.77 E mutáció esetében a háromszoros géndózis lehet a felelős a nagyobb tripszinakivitásért. Élettani

szempontból

rendkívül

jelentős,

hogy

a

hasnyálmirigy

többi 78

emésztőenzimét a már aktiválódott tripszin alakítja zimogénből aktív proteázzá

(1.

ábra). Ez a folyamat fiziológiás körülmények között a duodenumban történik. A korán

14


megjelenő tripszinaktivitás tehát az összes proteolitikus zimogén korai aktiválódásához és az önemésztődés beindulásához vezethet. tripszinogén enteropeptidáz tripszin zimogén

enzim

tripszinogén kimotripszinogén proelasztáz prokarboxipeptidáz A prokarboxipeptidáz B prokolipáz profoszfolipáz A2

tripszin kimotripszin elasztáz karboxipeptidáz A karboxipeptidáz B kolipáz foszfolipáz A2

1. ábra. A tripszin szerepe a hasnyálmirigy emésztőenzimeinek aktiválásában. Az enteropeptidáz (enterokináz) által aktivált tripszin az ábra bal oldalán feltüntetett zimogéneket elhasítja és így aktív enzimmé alakítja. 2.1.2.1.1.2 A cisztás fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor (CFTR) mutációi A cisztás fibrózisban szenvedő betegek gyakran mutatnak a pancreatitishez hasonló tüneteket, ami arra utal, hogy a két kórkép hátterében álló genetikai faktorok átfedhetnek egymással. A cisztás fibrózist a cisztás fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor (CFTR) mutációi okozzák, amely az ABC-transzporterek közé tartozó transzmembrán fehérje. A CFTR klorid- és bikarbonátcsatornaként működik79 és a legtöbb epitéliumsejt felszínén megtalálható. A fehérjét a CFTR gén kódolja, amely a 7q31.2 régióban található. A génben több mint 1000 mutációt írtak le, amelyek a fehérje különböző fokú károsodását okozzák, így súlyos vagy enyhe mutációkat különböztetnek meg.80 Az első vizsgálatok asszociációt mutattak ki a pancreatitis és a gyakori CFTRmutációk között.81-84 A későbbi vizsgálatok már a gén teljes kódoló régióját vizsgálták és azt találták, hogy az idiopátiás pancreatitis rizikófaktora a CFTR gén súlyos és enyhe mutációiból álló összetett (compound) heterozigóta státusz.85-87 Az ilyen idiopátiás pancreatitis tehát intermedier fenotípusnak tekinthető az egészséges állapot és a klinikai cisztás fibrózis között.86 A hasnyálmirigyben a CFTR gén terméke a proximális ductussejtek apikális membránjában fejeződik ki, az acinussejtekben nem vagy alig fordul elő.88 A CFTR

15


bikarbonátionokat transzportál a ductus lumenébe,89 az így kialakuló ozmotikus gradienst a víz passzívan követi.90 A CFTR-mutációk szerepe a pancreatitis kialakulásában pontosan nem ismert. A feltételezett pathomechanizmus az, hogy a CFTR funkció zavara következtében csökkent bikarbonátszekréció a víz lumenbe áramlásának csökkenésén keresztül a szekrétum viszkozitásának növekedését eredményezi. A sűrűbb folyadékból a szecernált fehérjék kicsapódhatnak, ami a ductulus eltömődéséhez vezethet,91 a szekrétum besűrűsödése esetén pedig a zimogének a

ductulusban

bizonyos

idő

után

spontán

autoaktiválódhatnak.

A

CFTR

transzportfunkcióját különböző genotípusú személyekben vizsgálva Noone és munkatársai összefüggést állapítottak meg a funkcionális defektus és a pancreatitis genetikai rizikójának mértéke között.86

2.1.2.1.1.3 A hasnyálmirigy eredetű tripszin inhibitor (SPINK1) mutációi A pancreatitis genetikai vizsgálatai során a vizsgált betegek egy részében nem találtak PRSS1- vagy CFTR-mutációt,82,92-94 amiből arra következtettek, hogy a betegségnek lehetnek egyéb, még ismeretlen genetikai tényezői is. Witt és munkatársai gyermekektől vett mintában vizsgálták a krónikus pancreatitis genetikai faktorait és egyetlen betegben sem találtak PRSS1-mutációt,40 figyelmük ezért a hasnyálmirigy eredetű tripszin inhibitor (SPINK1) felé fordult annak élettani szerepe miatt. A SPINK1 gén direkt szekvenálása során azt találták, hogy a betegek 19%-a hordoz egy mutációt, amely a fehérje 34. aminosavának aszparaginról szerinre cserélődését eredményezi.40 Ez az elsőként talált erős asszociáció elindította a SPINK1 mint genetikai faktor vizsgálatát pancreatitisben.

2.2 A hasnyálmirigy eredetű tripszin inhibitor (SPINK1) 2.2.1

A SPINK1 és szerepe a hasnyálmirigyben A hasnyálmirigy eredetű tripszin inhibitor (SPINK1) specializált inhibitor,

amelynek feladata a hasnyálmirigyben esetlegesen megjelenő tripszinaktivitás semlegesítése és így a további proteázok aktiválódásának megakadályozása.10,11 A SPINK1 tehát kritikus védelmi vonal az önemésztődés és a pancreatitis kialakulása ellen.

16


Az első ilyen inhibitort 1948-ban Kazal és munkatársai fedezték fel és izolálták szarvasmarha pancreasból az inzulin izolálásának melléktermékeként.95 Később a humán formát is izolálták96 és aminosav-sorrendjét meghatározták.97 A fehérje 6,2 kDa molekulasúlyú, poszttranszlációs módosítást nem tartalmaz. A rekombináns forma röntgendiffrakcióval meghatározott szerkezete ismert.98 Angol nevének rövidítéséből (pancreatic secretory trypsin inhibitor) a fehérjét az irodalomban gyakran PSTI-nek nevezik, de ma már elterjedtebb a fehérjetermékre is a gén elnevezésének (serine protease inhibitor, Kazal type 1) rövidítését, a SPINK1-et használni. Jelen dolgozatban az irodalmi nevezéktannal összhangban, valamint az érthetőség kedvéért az inhibitort kódoló gént és a fehérjét is SPINK1-nek nevezzük. A SPINK1-et a pancreas acinussejtjei termelik és választják el. Az inhibitor a sejtekben a szecernálandó proenzimeket tartalmazó zimogéngranulumokba kerül és azokkal együtt hagyja el a sejtet. A szecernált SPINK1 az összfehérje-tartalom 0,10,8%-át teszi ki a hasnyálban.96 Egyes becslések szerint a SPINK1 olyan mennyiségben fejeződik ki a humán acinussejtekben, hogy a potenciálisan képződő tripszinaktivitás akár 20%-át is képes semlegesíteni,11 bár ez az adat vitatott. A SPINK1 (2. ábra) a standard mechanizmusú, kanonikus inhibitorok99 Kazal típusába tartozik.2 A P1-P1’ reaktív helyet a Lys41-Ile42 aminosav-maradékok alkotják.97 Ekvimoláris mennyiségű SPINK1 stabil komplexet képez a tripszinnel, hosszabb inkubálás után azonban a tripszin aktivitása újra megjelenik.100 Ez az átmeneti gátlás a SPINK1 proteolízise által valósul meg, amely az Arg44-Gln45 kötésnél következik be.101 Élettani jelentősége az lehet, hogy a pancreasban vagy a kivezetőcsőben aktiválódott tripszin a SPINK1 átmeneti gátlása után a duodenumban még emésztőenzimként hasznosulhat.102 A SPINK1 a tripszin specifikus inhibitora: nem gátolja az enterokinázt, hiszen akkor a tripszin nem aktiválódhatna a duodenumban, és nem gátolja a többi hasnyálmirigy eredetű proteázt sem.100 Gátolja azonban a spermiumok akroszómáiban található acrosint,103 a közelmúltban pedig egy tanulmány anti-granzim A-aktivitását állapította meg.104

17


A

B

C

2. ábra. A SPINK1 fehérje szerkezete. (A) Az elsődleges szerkezet és a másodlagos szerkezeti elemek sematikus rajza. A szaggatott vonalak a fehérje három diszulfidhídját jelképezik. (B) A SPINK1 harmadlagos szerkezetének sematikus ábrázolása a röntgendiffrakcióval meghatározott szerkezet98 alapján. (C) A SPINK1 Kazaldoménjének vázlata. A α-hélixet henger, a β-redőket pedig nyilak jelképezik, a számok az egyes szerkezeti motívumokat alkotó aminosavakra vonatkoznak. Az ábrák a European Bioinformatics Institute PDBsum adatbázisából (http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/) származnak. A Kazal típusú inhibitorok szerkezeti jellemzője egy vagy több Kazal-domén jelenléte, amelyek egy-egy reaktív helyet tartalmaznak. A Kazal-domént egy három β-

redőből álló antiparallel β-lemez, valamint egy α-hélix alkotja és három diszulfidhíd stabilizálja (2. ábra C). A reaktív hely a felszínből kitüremkedik és a szubsztrátokhoz hasonlóan a proteáz aktív helyébe illeszkedik. A több Kazal-domént tartalmazó inhibitorok esetében a tandem elrendeződésű doménekben a P1 pozícióban különböző aminosavak állhatnak, így ezek az inhibitorok többféle szerinproteázt is képesek gátolni.2,3 Az Kazal típusú inhibitorok közé tartoznak többek között a madártojásokban található ovomukoidok és az emlős acrosin inhibitorok.2,3 A Kazal típusú inhibitorok az állat- és növényvilágban széles körben előfordulnak, a köztük fennálló esetleges evolúciós kapcsolatot korán felvetették.97,105

18


2.2.2

A SPINK1 szerepe a hasnyálmirigyen kívül

2.2.2.1 A SPINK1 expressziós mintázata A SPINK1 a hasnyálmirigyen kívül a bélfal nyálkatermelő sejtjeiben is kifejeződik,106,107 ahol feladata a mucosa védelme a luminális proteázokkal szemben, valamint részt vesz a sérült mucosa regenerálódásában is.108 A SPINK1-et megtalálták továbbá a vékonybél Paneth-sejtjeiben,109 valamint a gyomorban, az epehólyagban, az epevezetékben, a vesében, a tüdőben, a májban, az emlőben és a petefészekben.110-112 A fehérje a fenti szervek daganataiban is expresszálódik,113 nemrégiben pedig a prosztata jó- és rosszindulatú elváltozásaiban is kimutatták.114

2.2.2.2 A SPINK1 a szérumban A SPINK1 megtalálható a szérumban és a vizeletben is, a referenciatartomány a szérumban 3-21 μg/liter, a vizeletben pedig 7-51 μg/liter.113 A szérum SPINK1 szintje teljes pancreatectomia után is e tartományban marad, ami azt jelzi, hogy a szérum SPINK1 csak részben származik a pancreasból, fontos forrása lehet még a máj és a gastrointestinalis mucosa.115 A SPINK1 a vesék kiválasztása útján gyorsan kikerül a keringésből, féléletideje 6-8 perc.116 A

szérum

SPINK1-szintjének

növekedése

számos 117

megfigyelhető. Ezt a jelenséget elsőként pancreatitisben írták le,

klinikai

állapotban

ahol a SPINK1-szint

korrelál a betegség súlyosságával.118 Ebben az esetben a szérum SPINK1 forrása valószínűleg maga a pancreas. Számos tanulmány megállapította a szérum SPINK1szintjének emelkedését súlyos sérülések és gyulladások esetén,119-123 ennek alapján a SPINK1-et az akut fázis fehérjék közé sorolták.124 A II-es típusú felnőttkori citrullinémiában125 szenvedők májában az egészséges szinthez képest jelentően megemelkedik a SPINK1 mRNS és fehérje mennyisége.126 Ennek oka nem ismert. A szérum SPINK1 szintje is jelentősen megemelkedik,127 ezt a betegség diagnosztikai markereként használható.128,129 A II-es típusú felnőttkori citrullinémia kizárólag Japánban fordul elő, a betegség klasszikus formájától eltérően nem az argininoszukcinát-szintetáz (ASS) enzim deficienciája okozza, hanem az ureaciklusban részt vevő SLC25A13 mitokondriális transzporter mutációi.130 A májban azonban

argininoszukcinát-szintetáz hiány lép fel. A pathomechanizmus jelenlegi

modellje szerint a mutációk hatására károsodik az aszpartát mitokondriumból citoszolba

19


való exportja, bár ez sem a csökkent ASS mennyiséget, sem a SPINK1 erősebb expresszióját nem magyarázza meg.131 A szérum és a vizelet SPINK1-szintjének növekedése különböző rosszindulatú folyamatok esetén is előfordulhat. Ebben az összefüggésben egy petefészekrákban szenvedő beteg vizeletéből izolálták elsőként,132 ám később kiderült, hogy a tumorasszociált tripszin inhibitor (TATI) néven leírt fehérje a SPINK1-gyel azonos.133 A klinikumban a SPINK1 bizonyos tumorok diagnosztikus és/vagy prognosztikus markereként használható. A szérum SPINK1-szintje számos tumor jelenléte esetében növekszik, de a specificitás és az érzékenység nem minden esetben jobb, mint a szokásos markereknél.113 A legtöbb esetben a szérum SPINK1 magából a tumorból származik, de előrehaladott álllapotban a tumor inváziója által kiváltott akut fázis reakció is hozzájárulhat a magas értékhez.134 A SPINK1 a petefészekrák, a pancreasrák, a hepatocelluláris karcinóma, a hólyagrák, a vesesejtes karcinóma ill. a fej- és nyakrákok esetén hasznos marker a betegség diagnózisában és monitorozásában.113 A cisztás hasnyálmirigy léziók esetén a pszeudociszták és a cisztás tumorok elkülönítésére a SPINK1 jó differenciáldiagnosztikus marker.135 Prognosztikus markerként a petefészekrák,136 a hepatocelluláris karcinóma,137 a hólyagrák138 és a vesesejtes karcinóma139 esetén a kedvezőtlen prognózist jelzi. A SPINK1 prognosztikus értéke azon alapul, hogy a tumorokban együtt fejeződik ki a tumor eredetű tripszinnel,136 tehát a szérum SPINK1-szintjének növekedése a tumor eredetű tripszin expressziójának növekedését jelzi. A tumor eredetű tripszin egyes invázióban részt vevő proteázok aktiválásával részt vesz a tumorinvázióban szereplő proteázkaszkádokban,140,141 valamint maga is képes számos extracelluláris mátrixfehérje lebontására,140 tehát az agresszív, metasztatizáló tumorok markere. Gyomorrák esetén azonban a tripszinnek tumorszupresszív szerepet tulajdonítanak,142 és ebben a betegségben a magas SPINK1szint a kedvező prognózis jele.143 A SPINK1-nek növekedési faktor szerepet is tulajdonítanak, bár ez a lehetséges szerepe viszonylag ritkán vizsgált és élettani jelentősége sem bizonyított. A SPINK1 fehérje szerkezeti hasonlóságot mutat az epidermális növekedési faktorral (EGF). Aminosav-sorrendjük 50%-os hasonlóságot mutat, azonban az exon-intron határok nem hasonlóak, ami a homológiával szemben konvergens evolúcióra utal.144 A SPINK1 mitogén hatását állapították meg humán fibroblasztokon,145 azonban egy másik

20


tanulmány nem talált ilyen hatást.146 Kimutatták, hogy a SPINK1 humán hepatóma sejtekből szecernálódik és humán endoteliális sejtek proliferációját serkenti.147 Az állítólagos mitogén hatás mechanizmusa nem tisztázott, egyes eredmények az EGFreceptor szerepét,111,148 mások külön receptor jelenlétét valószínűsítik.147,149,150 A SPINK1 fejlődésben betöltött szerepére utal, hogy az emberi SPINK1 egér homológja, a Spink3 kiütése az acinussejtek autofágiával történő pusztulását és az újszülött egerek két héten belüli halálát okozza.151 Hasonló jelenséget csalánozók vizsgálatakor is megfigyeltek,152 bár ennek az eredménynek a gerincesek fejlődésében való jelentősége kérdéses.

2.2.3

A SPINK1 gén A hasnyálmirigy eredetű tripszin inhibitort a SPINK1 gén kódolja, amely az

ötödik kromoszómán, az 5q32 régióban található. A gén 7,5 kilobázis hosszúságú, kódoló régiója négy exonra tagolódik.153 A gén promoter régiója nem tartalmaz TATAvagy CAAT-boxot, a transzkripció pedig valószínűleg több pontról is elindulhat.153 A promoterben

egy

IL-6

reszponzív

elemet154

és

egy

pancreas-specifikus

szabályozóelemet azonosítottak.155

2.2.3.1 A SPINK családba tartozó további gének A SPINK családnak három további tagja ismert az emberi genomban, amelyek terméke a SPINK1-hez hasonlóan Kazal típusú inhibitor. A család összes tagja a proteolízis elleni védelemben vesz részt, ennek helye azonban az egyes fehérjék esetében eltérő. A SPINK2 gén a 4q12 kromoszómarégióban található és a herében, mellékherében és az ondóhólyagban fejeződik ki. Feltételezett szerepe az, hogy antimikrobiális hatásával részt vesz a fertilitás védelmében.156 A SPINK4 gén a 9p13.3 kromoszómarégióban található. A fehérjeterméket elsőként disznóbélből izolálták,157 emberben a Lieberkühn-kripták kehelysejtjeiben fejeződik ki legnagyobb mértékben,158 de monocitákban158 és a központi idegrendszerben is megtalálták.159 A SPINK5 gén a SPINK1-hez hasonlóan az 5q32 régióban található. Terméke a bőrben, a pajzsmirigyben, a mellékpajzsmirigyben, a szájnyálkahártyában, a mandulákban és a nemi utakban található meg, ahol a hámréteg védelmében vesz részt.160 A SPINK5 gén mutációi okozzák a Netherton-szindrómát, amely recesszíven öröklődő, halálos

21


bőrbetegség.161,162 A betegség egérmodelljeiben a bőr proteázai (desmoglein 1, filaggrin) általi károsodás mutatható ki.163,164 A SPINK5 mutációit az asztmával és az atópiás dermatitisszel is összefüggésbe hozták.165 A SPINK1, -2, -4, -5 gének és a coeliákia között végzett vizsgálat azonban negatív eredménnyel zárult.166 A közelmúltban öt újabb, SPINK-szerű gént azonosítottak az 5q32 régióban,167 ahol a SPINK1 és SPINK5 gének is találhatók. Az új gének a SPINK5L2, SPINK5L3, SPINK6, SPINK7 és SPINK9 neveket kapták, funkciójuk egyelőre nem ismert. 2.2.3.2 A SPINK1 mutációi és a pancreatitis A gén leggyakoribb mutációja az elsőként leírt40,168 c.101A>G tranzíció a harmadik exonban, amely a fehérje 34. aminosavának aszparaginról szerinre cserélődését (N34S) eredményezi. A mutációt számos tanulmány hozta összefüggésbe a krónikus pancreatitis idiopátiás, familiáris vagy örökletes formájával.40,85,86,169-174 Ezek az Európában és az Egyesült Államokban végzett asszociációvizsgálatok azt mutatták, hogy a krónikus pancreatitisben szenvedő betegek átlagosan 12,6%-a hordozza az N34S mutációt heterozigóta formában és 3,6%-uk homozigóta a mutációra nézve,40,85,86,169-174 míg az egészséges populációban a heterozigóták aránya is csak 1,9%. Az asszociációvizsgálatok szerint az N34S mutáció komoly rizikófaktor trópusi pancreatitisben42-45 43,175

diabéteszben.

és

különösen

az

annak

szövődményeként

kialakuló

Gyenge asszociációját állapították meg alkoholos krónikus

pancreatitisszel41 és akut pancreatitisszel.176 A génben azonosított többi mutáció ritka, kevesebb, mint 10 családban fordulnak elő. Számos mutáció található a gén promoter régiójában és az intronokban, egyes mutációk pedig a konszenzus splice helyeket érintik.61 Munkánk ideje alatt hét olyan mutáció volt ismert a génben, amely a fehérjében aminosav-cserét eredményez, ezeket a 3. ábrán és az 1. táblázatban foglaltuk össze.

22


c.101A>G (N34S) c.41T>G (L14R) 5’ UTR

1

c.36G>C (L12F)

c.41T>C (L14P)

c.194G>A (R65Q)

2

3

c.150T>G (D50E)

c.160T>C (Y54H)

c.199C>T (R67C) 4

3’ UTR

c.163C>T (P55S)

3. ábra. A SPINK1 gén vázlatos szerkezete. Feltüntettük a számmal jelölt exonokat és az 5’ ill. 3’ nem transzlálódó régiókat (UTR), a promoter régió az ábrán nem szerepel. A munkánk során vizsgált mutációk és polimorfizmusok elhelyezkedését téglalapok jelzik. Az L14P és M1T mutációkat Witt és munkatársai írták le az N34S mutációval egyidőben.40 Az M1T mutációt egy krónikus pancreatitisben szenvedő betegben, valamint a beteg egészséges édesapjában és a pancreatitises nagypapában találták meg, más vizsgálatok során ezt a mutáció nem fordult elő. Az L14P mutációt egy betegben és édesanyjában találták, ez a mutáció szintén nem fordult elő a későbbi analízisekben. A P55S változatot egy időben két kutatócsoport írta le. Witt és munkatársai mintájában egy egészséges kontroll személyben fordult elő40, Chen és munkatársai pedig egy betegben írták le168. Későbbi vizsgálatokban mind kontroll személyekben, mind akut, krónikus és alkoholos pancreatitisben, valamint a trópusi pancreatitis szövődményeként fellépő kötőszövetes-meszesedő diabéteszben szenvedő betegekben megtalálták.43,169,176180

Egyes tanulmányok a P55S-t valamivel nagyobb gyakorisággal találták meg a

betegek körében, mint a kontroll populációban, de az adatok nagy része amellett szól, hogy ez a variáns a betegséggel összefüggésben nem álló polimorfizmus. Az R65Q mutációt egy német betegben írták le, aki a CFTR génben is hordozott egy mutációt,181 a beteg egészséges édesanyja és nővére szintén hordozta e mutációkat. Az R67C mutáció két japán betegnél fordult elő, akik egyike az N34S mutációra is heterozigóta volt.182,183 Az utóbbi beteg két családtagja is hordozta a mutációkat, ám egészségesek voltak. A D50E mutációt szintén az N34S mellett találták meg egy krónikus pancreatitisben szenvedő betegben,169 az Y54H mutáció pedig egy trópusi pancreatitisben szenvedő bangladesi betegben fordult elő, aki nem hordozta az N34S mutációt.43 Az utóbbi négy mutációt igen kis számú vizsgálati alanyban találták meg, így hagyományos asszociációvizsgálat elvégzésére nem alkalmasak. Mivel az

23


allélgyakoriság alacsony és a penetrancia sem teljes, a betegséggel való oksági összefüggésük funkcionális hatásuk ismerete nélkül nem mondható ki egyértelműen. 1. táblázat. A SPINK1 génben azonosított, aminosavcserét eredményező mutációk. Feltüntettük a mutációk helyét a génben ill. a fehérjében, valamint az egyes mutációkkal foglalkozó közleményeket. Aminosavcsere p.L14P p.N34S

Elhelyezkedés 1. exon 3. exon

Nukleotidcsere c.41T>C c.101A>G

p.D50E

3. exon

c.150T>G

p.Y54H

3. exon

c.160T>C

p.P55S

3. exon

c.163C>T

p.R65Q

3. exon

c.194G>A

p.R67C

4. exon

c.199C>T

Első leírás Witt és mtsai, 200040 Witt és mtsai, 2000,40 Chen és mtsai, 2000168 Pfützer és mtsai, 2000169 Schneider és mtsai, 200243 Witt és mtsai, 200040

Ockenga és mtsai, 2001181 Kuwata és mtsai, 2001182

Klinikai jellemzők

Funkcionális vizsgálatok

Számos tanulmány

Kuwata és mtsai, 2002 189

Lempinen és mtsai, 2005 180 ; Tukiainen és mtsai, 2005176

Kuwata és mtsai, 2001 182

2.2.3.3 A mutációk funkcionális hatása A pancreatitis pathogenezisének modellje szerint a betegség iniciátora a tripszinogén ektópiás aktiválódása, amely a többi hasnyálmirigy eredetű zimogén aktiválásához és az önemésztődés beindulásához vezet. E modellbe jól illeszkednek a humán kationos tripszinogén mutációinak vizsgálatával kapott eredmények, melyek a mutációk közös hatásaként gyorsabb autoaktiválódást vagy a tripszinaktivitást közvetve növelő hatásokat mutattak ki. Mivel a hasnyálmirigy eredetű tripszin inhibitor (SPINK1) szerepe az ektópiásan aktiválódott tripszin semlegesítése, a modell szerint a pancreatitisben talált SPINK1-mutációknak az inhibitor funkcióját károsan érintő lossof-function mutációknak kell lenniük. Az inhibitorfunkció defektusa miatt a hasnyálmirigyben normálisan fennálló proteáz–antiproteáz egyensúly felborul, így beindulhat a zimogének aktivációja és az önemésztődés. A humán kationos tripszinogén mutációival szemben azonban a SPINK1-mutációk többsége esetében még nem ismert

24


az a funkcionális hatás, amely a SPINK1 funkció károsodását és a proteáz–antiproteáz egyensúly felborulását okozhatja. A pancreatitisszel összefüggésbe hozott mutációk hatása néhány esetben a mutációknak a génben elfoglalt helyzetéből becsülhető. A gén promoterét is érintő nagy méretű deléció184 a transzkripció elmaradását okozhatja. A konszenzus splice helyek mutációi (IVS3+2T>C,40 c.87+1G>A185) feltehetőleg az érintett exonok kiesését eredményezik az érett mRNS-ből és így a fehérjéből. Az IVS3+2 T>C mutáció esetében a

harmadik

exon

kiesését

gyomorból

származó

SPINK1

mRNS

mintában

kimutatták.186,187 Az iniciátor metionin mutációja (M1T40) a transzláció elmaradását, a nonsense mutációk (c.27delC,185 98insA/Y33stop188) pedig annak korai terminációját okozhatják. Az N34S mutáció funkcionális hatásaként molekulamodellezés alapján az aktív hely konformációjának változását, így az inhibitoraktivitás csökkenését javasolták.169,182 Kuwata és munkatársai összehasonlították az élesztőben termelt vad típusú ill. N34S mutáns SPINK1 inhibitoraktivitását és azt találták, hogy a két forma minden vizsgált kondíció esetén egyformán viselkedett.189 Az N34S mutációt minden eddigi vizsgálat kapcsoltnak találta egyes belső introni mutációkkal,40,183 így az irodalomban felmerült a hipotézis, hogy a funkcionális hatás ezen intronbeli mutációk következménye és abnormális mRNS-splicingot eredményezhet.182,190 Ezt a hipotézist cáfolta az a megfigyelés, hogy a vizeletből izolált N34S SPINK1 a vad típusúval azonos méretű fehérje,191 a közelmúltban pedig kimutatták, hogy az N34S homozigóta betegek hasnyálmirigyéből nyert SPINK1 mRNS is a vad típussal azonos méretű.187 Az irodalomban tehát az aminosavcserét eredményező mutációk közül eddig csak az N34S mutációt vizsgálták és egyik tanulmány sem mutatott ki funkcionális defektust. A további hét mutáció funkcionális hatása még nem volt vizsgálat tárgya. A szignálpeptidben található L14P mutáció, valamint az érett fehérjét érintő P55S polimorf változat, illetve az R65Q, R67C, D50E és Y54H mutációk funkcionális hatása tehát nem ismert. Az utóbbi négy mutáció alacsony gyakorisága miatt a betegséggel való oksági kapcsolat igazolásához is szükséges az okozott funkcionális károsodás kimutatása.

25


2.3 Az örökletes pancreatitis pathogenezisének modellje A pancreatitis kialakulásának kezdeti lépése jelenlegi elképzelésünk szerint a tripszinogén(ek) korai aktiválódása, amely a többi zimogén aktiválásához és az önemésztődés beindulásához vezethet. A tripszinogén(ek) korai aktiválódását okozhatják a kationos tripszinogénben leírt patogén mutációk, amelyek az autoaktiváció meggyorsulását vagy a tripszinogén(ek) transzaktiválásának növekedését eredményezik. A mutációk ezen funkcionális hatását számos biokémiai vizsgálat igazolta.62,75 A tripszinogénmutációk tehát gain-of-function mutációk, amelyek dominánsan öröklődő betegséget okozhatnak.46,55 A tripszin pathobiokémiai szerepét alátámasztja az is, hogy az anionos tripszinogén génjében (PRSS2) egy loss-of-function mutációt (G191R) azonosítottak, amely a tripszin autolízissel való lebomlását okozza és a pancreatitis kialakulása ellen védő hatású.192 A tripszinogén(ek) aktiválódásának másik oka lehet a ductus epitélium CFTR funkciójának zavara, amely feltételezések szerint a szekrétum viszkozitásának befolyásolásával indirekt módon hozzájárulhat az aktiváció növekedéséhez. A transzportfunkció csökkenésének mértéke és a pancreatitis rizikója között párhuzamot állapítottak meg.86 A CFTR-mutációk loss-of-function mutációk, a pancreatitis kialakulásához összetett (compound) heterozigócia szükséges és a betegség ilyen eredetű formái recesszíven öröklődnek.86 A pancreatitis rizikófaktoraként írták le a hasnyálmirigy eredetű tripszin inhibitor (SPINK1) mutációit is.61 A SPINK1 funkciója a hasnyálmirigyben az aktiválódott tripszin gátlása,10,11 így a modell szerint a SPINK1 pancreatitisben leírt mutációi az inhibitorfunkciót csökkentő loss-of-function mutációk. A kationos tripszinogén és a CFTR mutációival ellentétben azonban a SPINK1-mutációk funkcionális hatásáról csak nagyon keveset tudunk.61 A proteáz–antiproteáz egyensúlyi elmélet szerint a hasnyálmirigyen belüli tripszinaktivitás a tripszinogén(ek) aktiválódásának és a SPINK1 gátlásának eredője. Ennek alapján, valamint az N34S mutáció vizsgálata nyomán Pfützer és munkatársai a SPINK1-mutációkat „módosító faktorokként” definiálták, amelyek csak másodlagos szerepet játszhatnak a betegségre való hajlamosításban a tripszinogén mutációi után.169 Ez az elképzelés nagy népszerűségre tett szert az irodalomban, a SPINK1-mutációk által okozott pancreatitis öröklésmenetét illetően

26


azonban nincs egységes álláspont.169,171,193,194 A mutációk funkcionális hatásának megismerése ezen kérdések tisztázását is elősegítené. Az újabb tanulmányok már több gén mutációinak egyidejű vizsgálatára irányulnak.85,86,195,196 A fentebb leírt fehérjék közül a kationos tripszinogén, az anionos tripszinogén és a SPINK1 a pancreas acinussejtjeiben, a CFTR transzporter pedig a proximális ductussejtekben fejeződik ki (4. ábra). Emiatt a CFTR-mutációk hatása független a kationos tripszinogén és a SPINK1 mutációinak hatásától és azokkal additív módon érvényesülhet. Ezt a CFTR- és a SPINK1-mutációk esetében ki is mutatták.84,86 A PRSS1- és SPINK1-mutációk esetében egy kis elemszámú vizsgálat nem mutatott ki interakciót.85 Egyes vizsgálatok a pancreatitis külső eredetű formái esetében is kimutatták a genetikai faktorok szerepét41-45,176 és várható, hogy a jövőbeni eredmények a pancreatitis pathomechanizmusának integrált modelljét eredményezik majd, amelyben a genetikai és környezeti faktorok együtt érvényesülnek. acinussejt az anionos tripszinogén protektív mutációja

ductussejt

patogén mutációk a kationos tripszinogénben vagy a SPINK1-ben

mutációk a CFTR-ben

a ductulus eltömődése

tripszinaktivitás

4. ábra. A pancreatitist okozó ill. azzal összefüggésbe hozott fontosabb gének és feltételezett szerepük a betegség kialakulásában. A hasnyálmirigyben fellépő szabad tripszinaktivitás önemésztődést indíthat el. A kationos tripszinogén autoaktivációját vagy az anionos tripszinogén transzaktiválását elősegítő mutációk pancreatitisre hajlamosítanak, míg az anionos tripszin autolízisét okozó mutáció protektív hatású. A CFTR csatorna funkciózavara feltehetőleg közvetett módon segíti elő az aktivációt. A modell szerint a tripszinaktivitást semlegesítő SPINK1 mutációi az inhibitorfunkció csökkenését eredményezik, így a szabad tripszinaktivitás megnő197.

27

3

CÉLKITŰZÉSEK Az örökletes pancreatitis kialakulásában szerepet játszó genetikai faktorok

biokémiai hatásának vizsgálata évek óta folyik laboratóriumunkban. Az utóbbi években a pancreatitis és a hasnyálmirigy eredetű tripszin inhibitor (SPINK1) mutációi közötti összefüggés számos vizsgálat tárgya volt és e vizsgálatok eredményeként jelentős mennyiségű genetikai adat halmozódott fel. Az azonosított genetikai faktorok funkcionális analízise azonban még nem történt meg. A bemutatásra kerülő munka célkitűzései a következők voltak: 1. Új mutációk keresése a SPINK1 génben. Dr. Claude Férec laboratóriumával (Université de Bretagne Occidentale, Brest, Franciaország) és Dr. Heiko Witt laboratóriumával (Charité Egyetemi Klinika, Hepatológiai és Gasztroenterológiai Osztály, Berlin) kollaborációban olyan új mutációk keresését terveztük, amelyek az eddig azonosított mutációknál erősebb asszociációt mutatnak a pancreatitisszel és így funkcionális vizsgálatuk hozzásegíthet a betegség pathomechanizmusának jobb megismeréséhez. 2. A SPINK1-ben található, aminosavcserét eredményező, pancreatitisszel asszociált mutációk funkcionális hatásainak vizsgálata. 2.1.

Az általunk újonnan azonosított L12F, L14R és a korábban ismert L14P szignálpeptid-mutációk esetében a mutációknak a transzkripcióra és az inhibitor szekréciójára való hatásának meghatározása.

2.2.

Az érett fehérje szekvenciáját befolyásoló N34S, R65Q, R67C, P55S, D50E és Y54H mutációk esetében az egyes mutációknak a transzkripcióra, valamint a fehérje inhibitoraktivitására és szekréciójára való hatásának meghatározása.

2.3.

Az L14R, L14P, valamint az igen ritka R65Q, R67C, D50E és Y54H mutációk esetében a funkcionális hatás alapján a betegséggel való oksági viszony igazolása vagy megcáfolása.

28

4

FELHASZNÁLT ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

4.1

Genetikai vizsgálatok A SPINK1 szignálpeptid szekvenciaváltozatainak genetikai vizsgálatát Dr Claude

Férec laboratóriuma (Université de Bretagne Occidentale, Brest, Franciaország) és Dr Heiko

Witt

laboratóriuma

(Charité

Egyetemi

Klinika,

Hepatológiai

és

Gasztroenterológiai Osztály, Berlin) végezték.

4.1.1

Vizsgálati személyek A vizsgálatokba összesen 574 örökletes vagy idiopátiás pancreatitisben szenvedő

beteget vontak be. 320 beteg mintája az Université de Bretagne Occidentale Morvan Klinikájáról ill. a Nancy-i Gyermekkórházból, 254 beteg mintája pedig a berlini Charité Egyetemi Klinika Hepatológiai és Gasztroenterológiai Osztályáról származott. A krónikus pancreatitis klinikai diagnózisát akkor állították fel, ha az alábbi kritériumok közül legalább kettő teljesült: (1) visszatérő gyulladásos epizódok, (2) endoszkópos retrográd cholangio-pancreatográfiával (ERCP) vagy MRI-vel meszesedés és/vagy a kivezetőcső rendellenességei voltak láthatók, (3) az ultrahangvizsgálat patológiás elváltozást mutatott. Az örökletes pancreatitis diagnózisának feltételei a következők voltak: a családban legalább két elsőfokú rokon ill. három vagy több másodfokú rokon szenved visszatérő akut vagy krónikus pancreatitisben és külső kiváltó ok nem azonosítható. Idiopátiás krónikus pancreatitist diagnosztizáltak, amennyiben nem állt fenn a betegség egyetlen ismert kiváltó oka sem (alkoholizmus, trauma, fertőzés, gyógyszerek, metabolikus zavarok, családi halmozódás). Az egészséges kontrollcsoport összesen 589 személyből állt. A Franciaországból származó kontroll mintát 98, egymással rokonságban nem álló bresti csontvelődonor alkotta. A Németországból származó minta összesen 340 egészséges személyből állt. Közülük 162 személy berlini orvostanhallgató illetve egészségügyi dolgozó, 178-an pedig a Berlini Öregedésvizsgálatban vettek részt. Negrid rasszból származó kontrollként 151 afrikai (kameruni) származású egyén mintáját vizsgálták meg, akiket egy népességvizsgálathoz toboroztak a római La Sapienza Egyetem antropológiai szekciójának kutatói. A vizsgálati személyek hozzájárultak DNS-mintájuk analíziséhez, a vizsgálatokat az illetékes helyi etikai bizottságok jóváhagyták.

29

Felhasznált anyagok és módszerek

4.1.2

DNS-izolálás és mutációk keresése A genomiális DNS izolása a vizsgált személyek vérmintájából történt standard

módszerekkel. A SPINK1 új mutációinak keresése Dr. Claude Férec laboratóriumában zajlott denaturáló nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (DHPLC) módszerrel,198 illetve Dr. Heiko Witt laboratóriumában a gén exonjainak direkt szekvenálásával.40

4.2

Plazmidok készítése

4.2.1

SPINK1 cDNS klónozása eukarióta expressziós vektorba A SPINK1 gén cDNS-ét a 1679809. számú IMAGE klónról PCR-rel

fölsokszoroztuk

a

SPINK1_XhoI_sense

5’-CGGTGCTCGAGTCAACTGACCTC

TGGACGCAGAACTTC-3’ és a SPINK1_BamHI_antisense 5’-ATACAGGATCCC AACAATAAGGCCAGTCAGGCCTCGCGG-3’ primerek felhasználásával. A PCRterméket XhoI és BamHI restrikciós enzimekkel emésztettük és az ugyanezen enzimekkel emésztett pcDNA3.1(-) eukarióta expressziós vektorba ligáltuk. A vektorba illesztett cDNS-szakasz és későbbi származékainak vázlata az 5. ábra A részén látható.

A

5’–CTCGAGTCAACTGACCTCTGGACGCAGAACTTCAGCCATGAAGGT AACAGGCATCTTTCTTCTCAGTGCCTTGGCCCTGTTGAGTCTATCTGG TAACACTGGAGCTGACTCCCTGGGAAGAGAGGCCAAATGTTACAATGA ACTTAATGGATGCACCAAGATATATGACCCTGTCTGTGGGACTGATGG AAATACTTATCCCAATGAATGCGTGTTATGTTTTGAAAATCGGAAACG CCAGACTTCTATCCTCATTCAAAAATCTGGGCCTTGCGAATATATGCC TATGGAATGAGAACCAAGGTTTTGAAATCCCATCAGGTCACCGCGAGG CCTGACTGGCCTTATTGTTGGGATCC-3’

B

SPINK1

EYMPME

5. ábra. A munkánk során készített SPINK1 konstrukciók. (A) A klónozott cDNSkonstrukciók szekvenciájának összefoglaló vázlata. A fekete betűk a vad típusú SPINK1 cDNS-t jelölik, a szürke betűk az 5’ és 3’ nem transzlálódó régiókból származnak. A vastagon szedett szekvencia az érett fehérjének megfelelő cDNSszakasz. A beillesztett Glu-Glu epitóp címke szekvenciáját aláhúzással jelöltük, a szürkén kiemelt pozíciók az egyes mutációkhoz tartozó, mutagenezissel módosított nukleotidoknak felelnek meg. (B) A Glu-Glu epitóp címkével (Glu-Tyr-Met-Pro-MetGlu, EYMPME) jelölt SPINK1 fehérje vázlatos szerkezete.

30


4.2.2

Irányított mutagenezis A mutánsokat overlap extension PCR mutagenezissel készítettük el. Ennek során

két mutagén primert és két külső primert használtunk. A mutagén primerek szekvenciáit a 2. táblázat tartalmazza. Az első lépésben felsokszoroztuk a sense külső primer és az antisense mutagén primer, valamit a sense mutagén primer és az antisense külső primer által határolt szakaszokat. A két PCR-terméket megtisztítottuk, összekevertük és a külső primerekkel fölsokszoroztuk a teljes DNS-szakaszt, amely már a mutációt is hordozta. A külső primerek a SPINK1_XhoI_sense és a SPINK1_BamHI_antisense primerek voltak. A mutáns PCR-termékeket XhoI és BamHI restrikciós emésztés után a pcDNA3.1(-) vektorba ligáltuk. 2. táblázat. A mutáns SPINK1 cDNS-konstrukciók készítéséhez használt mutagén primerek. Minden egyes mutáció beviteléhez egy sense és egy antisense mutagén primert használtunk. A mutagenezis leírását lásd a szövegben. A vastag betűvel szedett nukleotidok a mutációk helyét jelzik. Primer neve SPINK1_L12F_sense SPINK1_L12F_antisense SPINK1_L14P_sense SPINK1_L14P_antisense SPINK1_L14R_sense SPINK1_L14R_antisense SPINK1_N34S_sense SPINK1_N34S_antisense SPINK1_ R65Q _sense SPINK1_R65Q_antisense SPINK1_R67C_ sense SPINK1_R67C_antisense SPINK1_P55S_ sense SPINK1_P55S_antisense SPINK1_D50E_ sense SPINK1_D50E_antisense SPINK1_Y54H_ sense SPINK1_Y54H_antisense

Szekvencia

5’-CTCAGTGCCTTCGCCCTGTTGAG-3’ 5’-CTCAACAGGGCGAAGGCACTGAG-3’ 5’-GTGCCTTGGCCCCGTTGAGTCTATC-3’ 5’-GATAGACTCAACGGGGCCAAGGCAC-3’ 5’-GTGCCTTGGCCCGGTTGAGTCTATC-3’ 5’-GATAGACTCAACCGGGCCAAGGCAC-3’ 5’-GCCAAATGTTACAGTGAACTTAATGGA-3’ 5’-TCCATTAAGTTCACTGTAACATTTGGC-3’ 5’-TTTGAAAATCAGAAACGCCAG-3’ 5’-CTGGCGTTTCTGATTTTCAAA-3’ 5’-AATCGGAAATGCCAGACTTCT-3’ 5’-AGAAGTCTGGCATTTCCGATT-3’ 5’-AATACTTATTCCAATGAATGC-3’ 5’-GCATTCATTGGAATAAGTATT-3’ 5’-TGTGGGACTGAGGGAAATACT-3’ 5’-AGTATTTCCCTCAGTCCCACA-3’ 5’-GGAAATACTCATCCCAATGAATGC-3’ 5’-TTCATTGGGATGAGTATTTCC-3’

31


4.2.3

Glu-Glu epitóp címkével jelölt cDNS-klónok készítése A Glu-Glu epitóp címke (Glu-Tyr-Met-Pro-Met-Glu) a polyomavírus közepes

méretű tumorantigénjéből származik.199,200

A SPINK1 variánsok jelölésére azért

választottuk ki, mert nem tartalmaz triptikus hasítóhelyet. A címkét a fehérje Cterminálisára illesztettük (5. ábra B). A vad típusú cDNS-klónból overlap extension PCR-rel készítettük a jelölt formát. Ehhez a jelölés szekvenciáját tartalmazó primerpárt (Glu-Glu_sense

5’-GAATATATGCCTATGGAATGAGAACCAAGGTTTTGAAA

TCCC-3’, Glu-Glu_antisense 5’-TTCCATAGGCATATATTCGCAAGGCCCAGAT TTTTGAATGAG-3’, az aláhúzott szakaszok a Glu-Glu címke szekvenciáját jelölik) és a SPINK1_XhoI_sense / SPINK1_BamHI_antisense külső primerpárt használtuk. Először PCR-rel felsokszoroztuk a GluGlu_sense és SPINK1_BamHI_antisense, illetve a SPINK1_XhoI_sense és a GluGlu_antisense primerek által határolt szakaszokat. A két PCR-terméket összekevertük és a külső primerekkel fölsokszoroztuk a teljes DNSszakaszt, amely már a Glu-Glu címke szekvenciáját is tartalmazta. A PCR-terméket XhoI és BamHI restrikciós emésztés után a pcDNA3.1(-) vektorba ligáltuk. A mutáns cDNS-klónok esetében restrikciós emésztéssel állítottuk elő a jelölt formákat. A vad típusú jelölt klónból PflFI restrikciós emésztéssel kivágtuk a Glu-Glu szekvenciát tartalmazó szakaszt, melyet a szintén PflFI-gyel emésztett mutáns plazmidokba ligáltunk. A vektorként szereplő mutáns plazmidok autoligálódását a szabad DNS-végek 5’ foszfátcsoportjainak eltávolításával akadályoztuk meg. Ehhez a mutáns plazmidokat antarktikus foszfatázzal kezeltük 30 percen át szobahőmérsékleten, majd az enzimet 10 percig tartó 65 °C-os hőkezeléssel inaktiváltuk és ezután használtuk fel a vektort a ligáláshoz.

4.2.4

Szekvenálás A klónozott DNS-szakaszok bázissorrendjét minden esetben szekvenálással

ellenőriztük. A szekvenálás a Boston University Medical Center központi szekvenáló laboratóriumában történt.

4.2.5

Transzfektálásra alkalmas plazmidprepreparátumok készítése A HEK 239T sejtek transzfektálására használt plazmidpreparátumokat a QIAGEN

HiSpeed Plasmid Midi kitjével készítettük, amely a hagyományos alkalikus lízisen

32


alapszik, de a sejtlizátum tisztítása az időigényes centrifugálással szemben szűréssel végezhető, a plazmid DNS izolálása pedig anioncserélő kromatográfiás oszlopon történik. Az elkészült preparátumok koncentrációját 260 nm-en mért abszorbanciájuk alapján határoztuk meg, majd agaróz gélelektroforézissel is ellenőriztük.

4.3

Sejttenyésztés és transzfekció A transzfekciós kísérleteket HEK 293T sejteken végeztük. A HEK 293T

sejtvonal201 a humán magzati veséből származó HEK sejtvonal202 származéka, amely az SV40 vírus nagy méretű T-antigénjét stabilan hordozza. Az SV40 replikációs origóját tartalmazó plazmidok a HEK 293T sejtekben igen magas kópiaszámot érhetnek el,203 így erős expressziót eredményeznek. A sejteket a GenHunter cégtől vásároltuk, tenyésztésükhöz DMEM médiumot használtunk, amely 10% borjúszérumot, 4 mM Lglutamint és 1% penicillin/streptomicin keveréket is tartalmazott. A sejteket 37°C-on, 5% CO2-tartalom mellett, telített páratartalmú inkubátorban tenyésztettük. A transzfekciós kísérletek mindegyike két-két párhuzamos transzfekciót tartalmazott a vad típusú illetve a vizsgált mutáns SPINK1 klónnal. A transzfekciók előtti napon 106 sejtet hatlyukú sejttenyésztő edénybe ültettünk antibiotikummentes médiumban. A transzfekciókat a Lipofectamine 2000 reagenssel (Invitrogen) végeztük. Minden transzfekcióhoz 4 μg SPINK1 plazmidot, 2 μg pSV-β-galaktozidáz plazmidot (transzfekciós belső kontroll) és 10 μl Lipofectamine 2000 reagenst használtunk. A transzfekciókat 2 ml OPTIMEM médiumban végeztük, amelyet 2 mM L-glutaminnal egészítettünk ki. Öt óra inkubálás után a sejtekhez 2 ml etetőmédiumot adtunk (DMEM, 20% borjúszérum, 4 mM L-glutamin) és a sejteket újabb 24 órán át inkubáltuk. Ezután a transzfekciós médiumot eltávolítottuk, a sejteket 1 ml OPTIMEM médiummal mostuk, majd 2 ml, 2 mM L-glutaminnal kiegészített OPTIMEM médiumot adtunk a sejtekhez. A transzfektált sejtekből származó szekréciót ettől a médiumcserétől számítva 48 órán át követtük oly módon, hogy adott időpontokban a 2 ml médiumból 200 μl-t eltávolítottunk és azt 200 μl friss médiummal helyettesítettük. A kísérlet végén a transzfektált sejteket is begyűjtöttük. A sejteket kétszer mostuk PBS-sel, majd sejtkivonat

formájában

begyűjtöttük

a

Reporter

Lysis

Buffer

(Promega)

felhasználásával. Minden lyukba 200 μl lízispuffert mértünk, majd időnkénti óvatos keverés mellett 15 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten. Az inkubációs idő letelte után

33


a feloldódott sejteket sejtkaparóval eltávolítottuk a felszínről, Eppendorf-csövekbe mértük, 15 másodpercig erősen vortexeltük, majd 5 percig centrifugáltuk és a felülúszót –80 °C-on tároltuk. Az így kapott sejtkivonatokat immunoblothoz és β-galaktozidáz enzimaktivitás-méréshez használtuk fel.

4.4

ÖsszRNS-izolálás és RT-PCR Az RNS-izolálás céljából végzett transzfekciókat a szekréciós kísérletekkel

megegyezően végeztük és a reziduális tripszinaktivitások követésével ellenőriztük. A különálló transzfekciókra azért volt szükség, mert a sejteket mindkét esetben sejtkivonat formájában gyűjtöttük be és a kétféle sejtkivonat egymás céljára nem volt alkalmas. Az összRNS-izolálást az RNAqueous kittel (Ambion) végeztük. A sejteket a transzfektálás után 48 órával gyűjtöttük be a kithez tartozó lízispuffer segítségével. Az elkészült RNSpreparátumok koncentrációját 260 nm-en mért abszorbanciájukból számítottuk, minőségüket pedig agaróz gélelektroforézissel ellenőriztük. A reverz transzkripcióhoz 0,75 μg összRNS-t használtunk templátként, a reakciót a Clontech SMART PCR cDNA Synthesis kitjével végeztük. A cDNS templáton végzett PCR primerei a SPINK1_XhoI_sense

és

glicerinaldehid-3-foszfát

a

SPINK1_BamHI_antisense

dehidrogenáz

(GAPDH)

voltak.

génre

Kontrollként

specifikus

a

primereket

használtunk, amelyek nem tapadnak e gén pszeudogénjeihez204.

4.5 4.5.1

A SPINK1 variánsok szekréciójának vizsgálata A szekréció vizsgálata az inhibitoraktivitás alapján

4.5.1.1 Reziduális tripszinaktivitás meghatározása 4.5.1.1.1 Rekombináns humán kationos tripszinogén termelése és tisztítása A pTrap-T7 plazmidba64 klónozott vad típusú, rekombináns humán kationos tripszinogént E. coli Rosetta (DE3) sejtekben fejeztük ki. 200 ml baktériumkultúrát 0,5ös OD600 értékig növesztettünk, majd az expressziót 1 mM IPTG hozzáadásával indukáltuk. A kultúrát további 5 órán át növesztettük, majd a sejteket centrifugálással begyűjtöttük és a további felhasználásig –80 °C-on tároltuk. A sejtekben a termelt tripszinogén zárványtestekben halmozódik fel. A sejtpelletet 0,1 M Tris-HCl (pH 8), 5 mM K-EDTA pufferben szuszpendáltuk, majd szonikálással feltártuk. A zárványtesteket centrifugálással kiülepítettük és kétszer mostuk 0,1 M Tris-

34


HCl (pH 8), 5 mM K-EDTA pufferrel. A zárványtestekben kicsapódott fehérjéket in vitro refolding útján renaturáltuk.64 Ehhez a mosott pelletet 500 μl 4 M guanidin-HCl-t, 0,1 M Tris-HCl-t (pH 8), 2 mM K-EDTA-t és 30 mM ditiotreitolt tartalmazó pufferben feloldottuk és 30 percig 37 °C-on inkubáltuk a tripszinogének denaturálására. A denaturált tripszinogéneket hirtelen kihígítottuk 50 ml refoldoló pufferben (0,9 M guanidin-HCl, 0,1 M Tris-HCl (pH 8), 2 mM K-EDTA, 1 mM L-cisztein, 1 mM Lcisztin), majd az oldatot 5 percig argon alatt kevertük és egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk. A renaturált kationos tripszinogént ecotin affinitáskromatográfiával tisztítottuk. Az ecotin Escherichia coli-ból izolált tripszin inhibitor,205 amely a tripszinogénnel is stabil komplexet képez és annak kromatográfiás tisztítására használható.206

4.5.1.1.2 Ecotin affinitáskromatográfiás oszlop készítése A rekombináns ecotint207 E. coli BL21 (DE3) sejtekben fejeztük ki. 1 liter kultúrát 0,7-es OD600 érték eléréséig növesztettünk ampicillintartalmú LB tápoldatban, majd az ecotin kifejeződését 0,5 mM IPTG hozzáadásával indukáltuk. Újabb 8 óra növesztés után a sejteket centrifugálással begyűjtöttük és mostuk. A periplazmatikus térbe kiválasztott ecotint ozmotikus sokk kiváltásával208 nyertük ki. A sejtpelletet tömény cukoroldattal (0,8 M szacharóz, 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 mM EDTA) kezeltük, majd centrifugálással összegyűjtöttük és jéghideg vízben feloldottuk. A periplazmatikus tér feltárulása után a sejteket centrifugálással újból összegyűjtöttük, majd a periplazmatikus frakciónak megfelelő felülúszót használtuk tovább. A pH beállítása után a felülúszóból az ecotint tripszin affinitáskromatográfiával tisztítottuk. Az ehhez szükséges tripszinoszlop a laboratóriumban rendelkezésre állt. A felülúszó felvitele után az oszlopot 20 mM Tris (pH 8), 0,2 M NaCl pufferrel mostuk, majd az ecotint 50 mM-os HCl oldattal eluáltuk. Az eluátumot dialízis után liofilizáltuk. Az oszlop készítéséhez a termelt ecotint ACTIGEL ALD (Sterogene Bioseparations) gyantához immobilizáltuk reduktív aminálással. Az aldehid-aktivált agaróz gyantát a liofilizált ecotinnal keverve 7-es pH-n, 0,1 M Na-cianoborohidrid jelenlétében 3 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. Az el nem reagált aldehidcsoportokat 0,1 M etanolaminnal és 0,1 M Na-cianoborohidriddel blokkoltuk. A

35


fölösleges reaktánsok eltávolítására a gyantát 2,5 mM sósavoldattal mostuk, majd 2 ml térfogatú oszlopba töltöttük. 4.5.1.1.3 Rekombináns humán kationos tripszinogén tisztítása ecotin affinitáskromatográfiával Az in vitro refolding útján renaturált tripszinogént tartalmazó oldathoz (50 ml) a guanidin kihígítása céljából 50 ml 0,4 M NaCl-oldatot adtunk és az esetlegesen nem renaturálódott fehérjék kiülepítésére 15 percig centrifugáltuk. A tisztított oldatot felvittük az ecotinoszlopra, majd az oszlopot 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,2 M NaCl pufferrel mostuk. Az oszlopra kötődött tripszinogént 50 mM HCl-oldattal eluáltuk. A kapott preparátum koncentrációját 280 nm-en mért abszorbanciájából számítottuk a fehérje számított moláris extinkciós koefficiensének (ε = 36160 M-1 cm-1)64 felhasználásával.

4.5.1.1.4 Humán kationos tripszinogén aktiválása tripszinné A termelt humán kationos tripszinogént humán kationos tripszinnel aktiváltuk. Az aktiválási reakciók 2 μM kationos tripszinogént, 20 nM kationos tripszint, 0,1 M 8-as pH-jú Tris-HCl puffert, 10 mM CaCl2-ot és 2 mg/ml BSA-t tartalmaztak. A BSA szerepe a reakcióban az volt, hogy az inkubálás alatt megakadályozza a fehérjék kitapadását a műanyag felszínhez. A reakciót 37 °C-on addig inkubáltuk, amíg a tripszinaktivitás értéke már nem növekedett.

4.5.1.1.5 Tripszinaktivitás mérése és a reziduális tripszinaktivitás meghatározása A tripszinaktivitást egy kromogén tripszinszubsztrát, az N-CBZ-Gly-Pro-Arg-pnitroanilid (Sigma) hidrolízisének sebességével mértük. A szubsztrátot a tripszin NCBZ-Gly-Pro-Arg tripeptidre és sárga színű para-nitroanilinre bontja. Az utóbbi termék fölhalmozódása a 405 nm-en mért abszorbancia időegység alatti változásából követhető. Méréseinkben a tripszinaktivitás egysége a mOD405 egy perc alatti növekedése volt. A reziduális tripszinaktivitás meghatározásához 40 μl sejtekről származó médiumot 10 μl BSA-val (20 mg/ml) kevertünk, hogy megakadályozzuk a műanyag felülethez való kitapadást, majd 2 μl, 2 μM koncentrációjú humán kationos tripszint adtunk a médiumhoz és keverés után 1 percig inkubáltuk. Ezután 150 μl kromogén

36


szubsztrátot (140 μM végkoncentráció) adtunk az elegyhez és meghatároztuk a tripszinaktivitást. A médiumban levő SPINK1 gátlása után megmaradó tripszinaktivitást a gátlás nélküli aktivitás százalékában fejeztük ki. A gátlás nélküli tripszinaktivitást úgy mértük, hogy friss, inhibitort nem tartalmazó OPTIMEM médiummal kevertük a tripszint.

4.5.1.2 A szecernált SPINK1 koncentrációjának meghatározása 4.5.1.2.1 Kalibrációs görbe A médiumminták mérésével kapott reziduális tripszinaktivitás értékek és a SPINK1 koncentrációja közötti összefüggést ábrázolja a kalibrációs görbe. A görbe felvételéhez élesztőben termelt, tripszinoszlopon tisztított rekombináns SPINK1-et használtunk. A preparátum koncentrációját ismert koncentrációjú humán kationos tripszin elleni titrálással határoztuk meg. A preparátumból ezután felező hígításokat készítettünk és minden hígításhoz 2 μl, 2 μM koncentrációjú kationos tripszint adtunk. A reziduális tripszinaktivitást a fentebb leírtakkal azonos módon határoztuk meg. A reziduális aktivitás értékeket a bemért SPINK1-koncentrációk függvényében ábrázolva kaptuk a kalibrációs görbét. A görbe segítségével a mutációk vizsgálatakor mért reziduális tripszinaktivitás értékeket SPINK1 koncentrációkká alakíthattuk.

4.5.1.2.2 A sejtkivonatok β-galaktozidáz aktivitásának mérése Minden párhuzamos transzfekció 2 μg transzfekciós kontroll plazmidot (pSV-βgalactosidase, Promega) is tartalmazott, mely a bakteriális lacZ gént fejezi ki egy erős promoter (SV40 korai promoter és enhancer) irányítása alatt. A lacZ génről kifejeződő β-galaktozidáz enzim mennyisége a transzfekció hatékonyságától függ. A transzfekció után 48 órával begyűjtött sejtkivonatokban meghatároztuk a β-galaktozidáz aktivitást a β-Galactosidase Enzyme Assay System (Promega) felhasználásával. A mérés azon alapul, hogy az enzim a kromogén o-nitrofenil-β-D-galaktopiranozid (ONPG) szubsztrát hidrolízisekor sárga színű o-nitrofenolt szabadít fel. A méréshez 35 μl Reporter Lysis Bufferbe 5 μl sejtkivonatot kevertünk, majd 40 μl ONPG-tartalmú reakciópuffert adtunk hozzá és a 420 nm-en mért abszorbancia növekedését 5 percig

37


követtük. Az enzimaktivitási ráta egysége a 420 nm-en mért abszorbancia egy perc alatti növekedése (mOD420/perc) volt. 4.5.1.2.3 A sejtkivonatok összfehérje-tartalmának meghatározása A sejtkivonatok összfehérje-tartalmát a Protein Assay kittel (Sigma Diagnostics) határoztuk meg, amely a Lowry-módszeren209 alapul. 10 μl sejtkivonatot 500 μl-re hígítottunk, majd azonos térfogatú Lowry-reagenst (lúgos réz-tartarát/-karbonát oldat) adtunk hozzá és 20 percig inkubáltuk. Ezután 250 μl Folin-reagenst adtunk a csövekhez és azonnali keverés után a reakciót 30 percig inkubáltuk. Ezalatt a foszfomolibdátfoszfowolframát tartalmú reagenst a rézzel kezelt minta fehérjetartalmának tirozinjei és triptofánjai kék színreakciót adva redukálják. Az abszorbanciát 750 nm-en mértük. Vak oldatként a sejtek lízisére használt oldatot használtuk. A mérési rendszert ismert koncentrációjú BSA standard hígítási sorának mérésével kalibráltuk. A sejtkivonatok fehérjekoncentrációja átlagosan 3,5 μg/μl volt. A mért β-galaktozidáz aktivitás értékeket a sejtkivonatok fehérjekoncentrációira vonatkoztattuk és az így kapott specifikus β-galaktozidáz aktivitásokat mOD420/perc/mg protein egységben fejeztük ki. Ezekkel az értékekkel normalizáltuk a médiumba szecernált SPINK1 variánsok koncentrációit.

4.5.2

A szekréció vizsgálata immunoblottal

4.5.2.1 SDS-poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) Az immunoblothoz, valamint az Escherichia coli-ban termelt humán kationos tripszinogén ill. SPINK1 expressziójának és tisztításának vizsgálatához a fehérjéket SDS-poliakrilamid

gélelektroforézisnek

vetettük

alá.

A

kationos

tripszinogén

elektroforéziséhez 13%-os, a SPINK1 variánsokhoz 21%-os poliakrilamid géleket használtunk. A fehérjéket Coomassie Brilliant Blue festéssel tettük láthatóvá.

4.5.2.2 Immunoblot (Western blot) Az immunoblotokhoz a sejtekről származó médiumból 10 μl-t, a sejtkivonatokból pedig 5 μl-t használtunk. A mintákat 21%-os Tris-glicin gélen futtattuk redukálószer jelenlétében, majd PVDF membránra (Immobilon-P, Millipore) blottoltuk 300 mA áramerősség mellett 2 órán át.

38


A Glu-Glu címkével jelölt fehérjék esetében a membránt PBS-Tweenben oldott 5%-os tejporban egy éjszakán át blokkoltuk, majd hozzáadtuk az antitestet (tormaperoxidázzal konjugált, Glu-Glu címke elleni poliklonális kecske antitest, Abcam) 0,1 μg/ml koncentrációban. A membránt egy órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk az ellenanyaggal, majd háromszor mostuk PBS-Tweennel. A jelöletlen fehérjék esetében a blokkolást 5% tejport és 3% BSA-t tartalmazó PBS-Tween oldatban végeztük egy éjszakán át. A natív SPINK1 elleni antitesttel (SPINK1 ellen nyúlban termelt poliklonális antitest, 1:5000 hígítás) egy órán át inkubáltuk a mambránt szobahőmérsékleten. A membránt háromszor mostuk és újra blokkoltuk PBS-Tweenben oldott 5% tejporral és 3% BSA-val. A másodlagos ellenanyaggal (ImmunoPure peroxidázzal konjugált, nyúl IgG elleni kecske antitest, Pierce) egy órán át inkubáltuk a membránt, majd azt megint háromszor mostuk. A peroxidázt mindkét esetben a SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate reagenssel (Pierce) mutattuk ki.

4.6 4.6.1

A SPINK1 variánsok inhibitoraktivitásának vizsgálata A SPINK1 variánsok kifejezése Escherichia coli-ban

4.6.1.1 SUMO fúziós konstrukciók készítése A SPINK1 változatokat SUMO fúziós fehérjékként fejeztük ki Escherichia coli sejtekben. SUMO fehérjének az Smt3-at nevezik, amely a humán SUMO-1 homológja Saccharomyces cerevisiae-ben.210 A SUMO egy kis méretű, ubiquitinszerű fehérje, amely rekombináns fehérjékkel fuzionáltatva erősebb bakteriális expressziót és a fehérjék jobb szolubilitását eredményezi. A tisztított fúziós fehérjéről a SUMO egy specializált ciszteinproteáz, a SUMO-proteáz segítségével eltávolítható211,212 úgy, hogy csak a natív rekombináns fehérje marad vissza. A SUMO fúziós konstrukciókat a Champion pET SUMO Protein Expression System (Invitrogen) felhasználásával készítettük és fejeztük ki. A SPINK1 cDNS érett (szignálpeptidet már nem tartalmazó) fehérjének megfelelő szakaszát PCR-rel felsokszoroztuk a SPINK1_SUMO_sense 5’-GACTCCCTGGGAAGAGAGGCC-3’ és a SPINK1_SUMO_antisense 5’-TGGTT CTCAGCAAGGCCCAGA-3’ primerek és Taq DNS-polimeráz felhasználásával. Az így kapott PCR-termék mindkét végén egy 3’ túlnyúló dezoxiadenozin nukleotidot tartalmaz. A PCR-terméket TA-klónozással a linearizált, mindkét végén 3’ túlnyúló

39


dezoxitimidin nukleotidot tartalmazó pET SUMO vektorba ligáltuk. A kapott plazmidokkal Escherichia coli Mach1TM-T1R sejteket transzformáltunk, amelyekben a háttérként képződő negatív klónok száma minimális. A vektor a SUMO-t kódoló gén 3’ végénél linearizálva érkezik a kitben, így az elkészült fúziós konstrukciókban a SUMO fehérje a rekombináns fehérjéhez N-terminálisan csatlakozik. A vektor szekvenciája a SUMO fehérje N-terminálisán polihisztidin jelölést is tartalmaz, így a sejtekben hisztidin címkét hordozó SUMO fúziós SPINK1 fehérjék fejeződnek ki.

4.6.1.2 SUMO fúziós fehérjék expressziója és izolálása Az ellenőrzött szekvenciájú SUMO fúziós SPINK1 konstrukciókat Escherichia coli BL21(DE3) sejtekbe transzformáltuk és ezekben fejeztük ki. 200 ml baktériumkultúrát 0,6-es OD600 értékig növesztettünk, majd az expressziót 1 mM IPTGvel indukáltuk. További 2 óra növesztés után a sejteket centrifugálással begyűjtöttük és a pelleteket 6 ml foszfátpufferben (50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl) szuszpendáltuk. A sejteket

szonikálással

feltártuk,

majd

a

sejttörmeléket

két

egymást

követő

centrifugálással kiülepítettük. A termelődött fúziós fehérjék a citoplazmában halmozódnak fel, amelyből nikkel affinitáskromatográfiával izolálhatók. Az izolálás azon alapszik, hogy a fehérjében egymást követő hisztidin oldalláncok imidazolgyűrűi koordinációs kötéseket létesítenek a kromatográfiás oszlophoz rögzített Ni2+ ionokkal. A felülúszót 1 ml Ni-NTA agarózt (Qiagen) tartalmazó kromatográfiás oszlopra vittük, amelyet előzőleg 5 ml foszfátpufferrel készítettünk elő. Az oszlopot 2 ml foszfátpufferrel mostuk, majd a fehérjéket három lépésben eluáltuk ugyanezen puffer imidazollal kiegészített származékaival. Az eluensben levő imidazol verseng a hisztidinekkel a Ni2+ kötőhelyeiért és megfelelő koncentrációban a fúziós fehérjéket leszorítja. Három, növekvő imidazolkoncentrációjú eluenst használtunk (50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl-ban 10 mM, 50 mM, ill. 250 mM imidazol). Az eluált fehérjéket koncentráló oszlop felhasználásával töményítettük (Vivaspin 20, MWCO 5000, Vivascience). A SUMO fehérjét SUMO-proteázzal való emésztéssel távolítottuk el a fúziós fehérjékről. Az emésztési reakciók kb. 80 μg fúziós fehérjét, 25 U SUMOproteázt és alacsony sókoncentrációjú SUMO émésztőpuffert tartalmaztak 500 μl végtérfogatban. A reakciót 30 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk. A hasított, natív SPINK1 fehérjéket újabb nikkel affinitáskromatográfiával választottuk el a hasítatlan

40


fúziós fehérjétől és a proteáztól. Ehhez újabb Ni-NTA agaróz oszlopot készítettünk, melyre felvittük az emésztési reakciót, majd az oszlopot foszfátpufferrel mostuk. A hasított, SUMO fehérjét és polihisztidin címkét már nem tartalmazó forma az oszlopon átesik, míg a fúziós fehérjék kötve maradnak. Az áteső fehérjék zöme az első mosási frakcióban volt jelen, így minden preparátumnál ezt a frakciót használtuk az immunoblothoz és az inhibitoraktivitás meghatározásához. A preparátumok koncentrációját humán kationos tripszinnel szembeni titrálással határoztuk meg. A titrálási reakciókban a tripszin koncentrációja 40 nM volt, amely két nagyságrenddel nagyobb, mint a SPINK1 gátlására jellemző Ki. Ilyen körülmények között az inhibitor disszociációja elhanyagolható.

4.6.2

A SPINK1 variánsok tísztítása HEK 293T sejtek médiumából A HEK 293T sejtekből szecernálódó SPINK1 variánsokat az inhibitoros konstans

meghatározása céljából ezekben a sejtekben is kifejeztük és tisztítottuk. A vad típusú SPINK1-et, valamint a szecernálódó N34S és R65Q mutánsokat HEK 293T sejtekben is kifejeztük. A tranziensen transzfektált sejtekből szecernált inhibitort a médiumból affinitáskromatográfiával tisztítottuk. A transzfekciókat 75 cm2-es sejttenyésztő edényekben végeztük. A transzfekció előtti napon 7,5x106 sejtet ültettünk az edényekbe antibiotikumokat nem tartalmazó médiumban. A transzfekciókat 30 μg SPINK1 plazmid és 75 μl Lipofectamine 2000 transzfekciós reagens felhasználásával végeztük a „Sejttenyésztés és transzfekció” című fejezetben leírtak szerint. A transzfekció után két nappal a sejteken levő OPTIMEM médiumot eltávolítottuk és friss médiummal helyettesítettük. A médiumcserét még kétszer megismételtük, a levett médiumot a felhasználásig jégben tároltuk. Az egyes SPINK1 variánsokat tartalmazó összegyűlt médiumból (60 ml) a szecernált inhibitort szarvasmarha tripszin affinitáskromatográfiás oszlopon tisztítottuk, amely a laboratóriumban rendelkezésre állt. A minták felvitele során az átesőt gyűjtöttük, az oszlopot 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,2 M NaCl pufferrel mostuk, majd a SPINK1-et 50 mM HCl-oldattal eluáltuk. Az oszlop újbóli mosása után az átesőt is felvittük az oszlopra, mostuk és eluáltuk. A két eluátumot összeöntöttük és dializáltuk. Végül a tisztított fehérjéket liofilizáltuk és 50 mM-os, 8-as pH-jú Tris pufferben feloldottuk. A kapott preparátumok koncentrációját az előző fejezetben leírtak szerint rekombináns humán kationos tripszinnel szembeni titrálással határoztuk meg.

41


4.6.3

A Ki meghatározása progress curve analízissel A progress curve analíziskor a kezdeti sebességek mérésével ellentétben a reakció

teljes folyamatát felhasználjuk a kinetikai állandók meghatározásához. Az analízis során enzimet, szubsztrátot és inhibitort tartalmazó reakció lefolyását követjük addig, amíg a szubsztrát elfogy. A termék felhalmozódását az idő függvényében ábrázolva kapjuk a progress curve-öt. A reakciókat a következő kinetikai egyenletek írják le:

(1)

E+S

(2)

E+I

k1

[ES]

k2

E+T

k-1 k3

[EI],

k-3

ahol E = enzim, S = szubsztrát, T = termék és I = inhibitor. A k1, k-1 és k2 kinetikai paraméterek inhibitort nem tartalmazó reakciók vizsgálatával meghatározhatók. A k3 ill. k-3 paramétereket úgy kaptuk meg, hogy számítógépes szimuláció segítségével a (2) egyenlet megoldását az inhibitor jelenlétében felvett görbékre illesztettük e két paramétert változtatva, nemlineáris regressziós analízis alkalmazásával.213 Az így kapott k3 és k-3 paraméterek hányadosaként kaptuk a Ki-t. A k1, k-1 és k2 kinetikai paraméterek meghatározására szolgáló reakciók összetétele a következő volt: 10 nM kationos ill. anionos tripszin, 140 μM N-CBZ-GlyPro-Arg-p-nitroanilid kromogén szubsztrát, 0,1 M Tris-HCl (pH 8), 1 mM CaCl2 és a műanyag felületekre történő kitapadás megelőzésére 0,05% Tween-20. A reakció lefolyását 10 percig követtük szobahőmérsékleten. A szubsztrát hidrolízisekor keletkező sárga színű para-nitroanilin felhalmozódását a 405 nM-en mért abszorbancia növekedéseként követtük. Az inhibitort is tartalmazó reakciókban az egyes SPINK1 variánsok koncentrációja az E. coli-ban kifejezett fehérjék esetében 16 nM, a HEK 293T sejtekben kifejezett fehérjéknél 20 nM volt. A kinetikai paraméterek számításához 2 vagy 3 görbe átlagát használtuk fel. A számításokat a KinTekSim programmal (KinTek Corporation) végeztük.

42

5 5.1

EREDMÉNYEK Új mutáció felfedezése a SPINK1 szignálpeptidjében Egy francia betegpopulációban új mutációkat kerestünk a SPINK1 génben

denaturáló HPLC módszerrel.198 Egy bolgár származású családban a gén 41. nukleotidjának T>G transzverzióját tapasztaltuk, amely a SPINK1 propeptid 14. aminosavának leucinról argininre cserélődését eredményezi (p.L14R, 7. ábra). Az érintett család családfája a 6. ábra A paneljén látható. A 20 éves betegnél 10 éves korában diagnosztizáltak pancreatitist, az L14R mutációra nézve heterozigóta. Édesapja egy akut pancreatitiszes rohamban vesztette életét, DNS-mintája nem állt rendelkezésünkre. Az édesanya a genotipizálás szerint nem hordozza a mutációt, az édesapa tehát szintén heterozigóta volt. Az apai nagymamánál 57 éves korában állapítottak meg krónikus pancreatitist és szintén heterozigóta a mutációra nézve. Az L14R mutáció tehát három nemzedéken keresztül együtt öröklődik a betegséggel, a penetrancia teljes.

B

A I

79 (57) L14R / wt

I

L14R / wt

II 49 wt / wt

II

III III

24 wt / wt

20 (10) L14R / wt

IV

L14R / wt

wt / wt

9 (6) L14R / wt

6. ábra. Az új L14R mutációt hordozó két család családfája. A sötét szimbólumok a pancreatitisben szenvedő családtagokat, az üres szimbólumok az egészséges családtagokat jelölik. A nyilak az index esetekre mutatnak. A szimbólumok melletti számok a családtagok életkorát jelentik, zárójelben szerepel a betegek életkora a betegség megjelenésekor. Szintén feltüntettük az L14R genotípust a genotipizált családtagok esetében. (A) A Franciaországban élő bolgár család családfája. (B) A német család családfája. A SPINK1 gén direkt szekvenálásával 254 német beteg DNS-mintáját is megvizsgáltuk és az L14R mutációt egy 9 éves beteg mintájában is megtaláltuk szintén

43

Eredmények

heterozigóta formában (6. ábra B). A mutációt hordozza az egészséges édesapa és a pancreatitisben szenvedő nagymama is. A dédnagymama is krónikus pancreatitisben szenved, ám DNS-mintája nem állt rendelkezésünkre. Ebben a családban tehát szintén együtt öröklődik a mutáció és a betegség, a penetrancia ebben az esetben is igen magas, bár nem teljes. A két család közül egyikben sem találtunk más betegségokozó mutációt sem a SPINK1 génben, sem a PRSS1 (humán kationos tripszinogén) vagy a CFTR (cisztás fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor) génekben. Az L14R mutáció nem volt jelen az egészséges kontrollcsoportban: sem a 98 fős francia mintában, sem a 340 fős német mintában nem találtunk hordozót.

5.2

A SPINK1 szignálpeptidjében előforduló változatok funkcionális vizsgálata A SPINK1 szignálpeptidjében korábban már leírták az L14P mutációt, amelyet a

gén 41. nukleotidjában egy T>C transzverzió okoz.40 A mutációt egy ötéves német betegben találták, akinek a családjában korábban nem fordult elő pancreatitis. A mutációt a beteg egészséges édesanyja is hordozta és a mutáció leírása óta az édesanyánál is pancreatitis alakult ki 41 éves korában. Ebben a családban sem volt jelen egyéb betegségokozó mutáció a sem SPINK1 génben, sem a PRSS1 vagy a CFTR génekben. Az L14P mutáció ugyanazt az aminosavat érinti, mint az általunk újonnan azonosított L14R mutáció. Mindkét mutáció szoros kapcsolatot mutat a pancreatitisszel, ami arra utal, hogy erős hajlamosító faktorok lehetnek. A francia betegpopuláció szűrése során egy újabb szekvenciaváltozatot találtunk a SPINK1 szignálpeptidjében, a 36. nukleoid G>C tranzícióját, amely a 12. aminosav leucinról fenilalaninra cserélődését eredményezi (L12F). Ezt a mutáció 15 idiopátiás pancreatitisben szenvedő betegben fordult elő, akik valamennyien afrikai származásúak voltak. Az L12F változat nem volt megtalálható sem a 98 fős francia, sem a 340 fős német kontrollcsoportban. Mivel azonban az azonosított hordozók afrikai származásúak voltak és az L12F variáns sem a Franciaországban vett minta többi tagjában, sem a 323 fős német mintában nem fordult elő, fennállt annak a lehetősége, hogy az L12F nem a pancreatitisszel asszociált mutáció, hanem a 15 beteg hazájában előforduló polimorfizmus. Ebben az esetben álasszociáció áll fenn annak következtében, hogy az egészséges kontroll minta genetikailag nem illesztett a betegpopulációhoz, mivel csak

44

Eredmények

kaukazoid rasszba tartozó egyénekből áll. Az L12F változat további genetikai elemzésére megvizsgáltunk egy genetikailag illesztett kontroll mintát, amely 151 kameruni személyből állt. A megvizsgált 302 kromoszómából 33 az L12F változatnak megfelelő c.36C allélt hordozta, vagyis ez a változat 11%-os allélgyakorisággal jelen van az egészséges közép-afrikai népességben is, tehát polimorfizmusnak minősül. Az L12F-et a továbbiakban tehát polimorf változatnak fogjuk nevezni. A SPINK1 szignálpeptidjében azonosított szekvenciaváltozatokat a 7. ábra mutatja be. szignálpeptid

érett SPINK1

23 aminosav

56 aminosav

MKVTGIFLLSALALLSLSGNTGA L12F

L14R L14P

7. ábra. A SPINK1 fehérje vázlatos szerkezete. A szignálpeptid aminosavszekvenciáját és a szekvencia változatait ábrázoltuk az aminosavak egybetűs kódolásával. Munkánk során a három ismertetett variáns, a pancreatitisszel szorosan kapcsolt L14P és L14R mutációk, valamint az L12F polimorf változat funkcionális analízisét végeztük el. A szignálpeptid-mutációk hatását HEK 293T sejtekben vizsgáltuk, melyek humán embrionális veséből származnak. A sejtekbe tranziens transzfekció útján juttattuk be a SPINK1 variánsokat kódoló plazmidokat és vizsgáltuk az egyes változatokról történő transzkripciót, valamint a mutáns fehérjék sejtekből való szekrécióját.

5.2.1

A szignálpeptidben található szekvenciavariánsok hatása a gén átíródására Elsőként megvizsgáltuk, hogy a szignálpeptid-mutációk hatással vannak-e a

SPINK1 gén transzkripciójára. A transzfektált sejtekből összRNS-t izoláltunk és azt cDNS-be írtuk. A cDNS templáton génspecifikus primerekkel végzett szemikvantitatív PCR azonos mennyiségű terméket adott a vad típus és a három variáns esetében (8. ábra),

azaz

az

egyes

variánsokról

átíródó

45

mRNS

mennyisége

azonos.

A

Eredmények

szignálpeptidben található szekvenciavariánsok tehát nincsenek hatással a génről történő transzkripció hatékonyságára.

A

B

wt L12F L14P L14R 1200

wt L12F L14P L14R 1000 900 800

1000 900 800 700

700

600 500

600 500

400

400

300 300 200 200 100 100

8. ábra. A szignálpeptid variánsok transzkripcióra gyakorolt hatásának vizsgálata RT-PCR-rel. Vad típusú, valamint L12F, L14P és L14R variánsokat kódoló plazmidokkal HEK 293T sejteket transzfektáltunk. A transzfekció után 48 órával a sejtekből összRNS-t izoláltunk, azt cDNS-be írtuk és génspecifikus primerekkel végzett szemikvantitatív PCR reakcióval vizsgáltuk (A) a SPINK1 gén és (B) kontrollként a glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz gén mRNS-ének mennyiségét. A PCRtermékeket agaróz gélelektroforézissel és etídium-bromiddal való festéssel tettük láthatóvá. 5.2.2

A szignálpeptidben található szekvenciaváltozatok hatása a fehérje szekréciójára A SPINK1 konstrukciókkal transzfektált HEK 293T sejtekben a kifejeződő

fehérjék belépnek a sejtek szekréciós útvonalába és konstitutív módon szecernálódnak. A szecernált inhibitor felhalmozódik a sejtek tápfolyadékában, így a médiumban levő SPINK1 mennyiségének vizsgálata információt nyújt az adott variáns szekréciójának mértékéről. A szecernált SPINK1 mennyiségét kétféle módon vizsgáltuk: a fehérje inhibitoraktivitását felhasználva a tripszin gátlásán keresztül, valamint direkt módon immunoblot felhasználásával.

5.2.2.1 A szekréció vizsgálata a reziduális tripszinaktivitás mérésével A sejtekből szecernált inhibitor médiumban való felhalmozódását a médium tripszingátló hatásának vizsgálatával követtük. A transzfekciót követő 48 órán át adott időpontokban mintát vettünk a sejtek médiumából, azt humán kationos tripszinnel kevertük és meghatároztuk a SPINK1 gátlása után maradó (reziduális) tripszinaktivitást.

46

Eredmények

Az egyes variánsokkal végzett egy-egy reprezentatív kísérlet eredménye látható a 9. ábrán. A vad típusú inhibitor esetében a reziduális tripszinaktivitás folyamatosan csökken és a kísérlet végére teljesen eltűnik. Hasonló eredményt kaptunk az L12F polimorfizmus esetében is, bár itt a reziduális aktivitások valamivel alacsonyabbak voltak, mint a vad típusnál. Az L14R mutáns esetében a médium alig gátolta a tripszint, a reziduális aktivitás csak kevéssé csökkent a kísérlet időtartama alatt. Az L14P mutánsnál pedig semmilyen tripszingátló aktivitást nem mutatott a médium, a reziduális aktivitás nem csökkent a maximális értékről. A reziduális tripszinaktivitás értékeket SPINK1 koncentrációkká konvertáltuk egy kalibrációs görbe segítségével. A kalibrációs görbét úgy kaptuk, hogy élesztőben kifejezett rekombináns SPINK1-et felező hígításokban humán kationos tripszinnel kevertünk, majd meghatároztuk a reziduális tripszinaktivitás értékeket a médiumok mérésével egyező módon. A kapott reziduális aktivitás értékeket a bemért SPINK1 koncentrációk függvényében ábrázolva kaptuk a kalibrációs görbét. A kalibrációs görbe segítségével kapott SPINK1 koncentrációkat korrigáltuk a transzfekció hatékonyságának esetleges eltéréseire. A SPINK1 konstrukciókkal együtt transzfektált belső transzfekciós kontroll plazmid a β-galaktozidáz gént hordozza. A transzfekció után 48 órával begyűjtött sejtek kivonatában meghatároztuk a βgalaktozidáz aktivitást, majd a SPINK1 koncentrációkat a β-galaktozidáz aktivitásokra normalizáltuk, így a transzfekció hatékonyságával korrigált adatokat kaptunk. A korrigált SPINK1 koncentrációkat a 10. ábra mutatja. A vad típus és az L12F polimorf variáns koncentrációja folyamatosan növekszik a médiumban és a kísérlet végére körülbelül 100 nM-os koncentrációt érnek el. Az L14R mutáns koncentrációja igen alacsony marad, az L14P mutáns pedig egyáltalán nem mutatható ki a médiumban. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az L12F polimorf variáns nem befolyásolja a SPINK1 szekrécióját, azonban az L14P és L14R mutációk a szekréciót teljesen megszüntetik.

47

100 SPINK1 koncentráció (nM)

Reziduális tripszinaktivitás (%)

Eredmények

80 60

vad típus

40 20 0

L12F 0

10

20

30

40

120 100

60 40

L12F

20 0

50

vad típus

80

0

10

80

L14P

60 40

vad típus

20 0

10

20

30

40

120

50

80 60 40

L14P

20 0

50

0

10

100 80

L14R

60 40

vad típus

20 0

10

20

30

20

30

40

50

Idő (óra)

SPINK1 koncentráció (nM)


40

vad típus

100

Idő (óra)

0

30

140

100

0

20

Idő (óra)



Idő (óra)

40

50

Idő (óra)

120 100

vad típus

80 60 40

L14R

20 0

0

10

20

30

40

50

Idő (óra)

9. ábra. A szignálpeptid-mutációkat tartalmazó SPINK1 konstrukciókkal transzfektált sejtek médiumának tripszingátló aktivitása. Az ábrán jelölt időpontokban a médiumból mintát vettünk és meghatároztuk a reziduális tripszinaktivitást, amelyet a gátlás nélküli tripszinaktivitás százalékában fejeztünk ki. Az ábrázolt értékek két párhuzamos transzfekcióból származó adatok átlagai, a hibasávok az átlagtól való eltérést mutatják. A fekete négyzetek a vad típussal, az üres körök a mutánsokkal kapott értékeket jelölik.

10. ábra. A SPINK1 szignálpeptidvariánsok szekréciója HEK 293T sejtekből. A reziduális tripszinaktivitás értékeket SPINK1 koncentrációkká konvertáltuk egy kalibrációs görbe segítségével. A kapott koncentrációkat a transzfekció hatékonyságára normalizáltuk a kotranszfektált β–galaktozidáz aktivitási értékeinek felhasználásával. Az ábrázolt értékek két, egyenként két párhuzamos transzfekciót tartalmazó kísérlet átlagai. A hibasávok az átlagtól való eltérést mutatják. A fekete négyzetek a vad típussal, az üres körök a mutánsokkal kapott értékeket jelölik.

48

Eredmények

5.2.2.2 A szekréció vizsgálata immunoblottal Annak bizonyítására, hogy az L14P és L14R mutánsok esetében a médium tripszingátló aktivitásának hiánya valóban a szekréció elmaradásának a következménye, a sejtekről származó médiummintákat immunoblottal is megvizsgáltuk. Elsőként egy, a humán SPINK1 ellen nyúlban termelt, poliklonális antitestet használtunk, az így kapott immunoblot a 11. ábra A paneljén látható. A vad típusú és az L12F polimorfizmust hordozó inhibitor nagy mennyiségben szecernálódik a sejtekből, míg az L14R mutáns alig, az L14P mutáns pedig egyáltalán nem mutatható ki. Az L14R mutáns esetében látható halvány csík a vad típusnál kisebb mobilitást mutat, ami arra utal, hogy a szignálpeptid lehasítása nem megfelelő helyen történt meg. Ennek vizsgálatára az L14R mutáns szekvenciát a SignalP programmal214 (Center for Biological Sequence Analysis, Technical University of Denmark, http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) elemeztük, amely azt mutatta, hogy ez a mutáns valóban hasadhat a Ser18-Gly19 peptidkötésnél, ez a hasadás pedig azt eredményezi, hogy az érett fehérje öt aminosavval hosszabb lesz.

A

B

Natív SPINK1

Médium

Médium wt L12F L14P L14R

Glu-Glu epitóppal jelölt SPINK1 Sejtkivonat

wt L12F L14P L14R wt L12F L14P L14R

kDa 60 42 30 22 17 6

kDa 60 42 30 22 17 6

11. ábra. A szignálpeptid mutánsok vizsgálata immunoblottal a transzfektált HEK 293T sejtek médiumában és sejtkivonatában. A sejteket tranziensen transzfektáltuk a szignálpeptid mutánsokat kódoló plazmidokkal. A transzfekció után 48 órával a sejtek médiumát és a sejteket begyűjtöttük. A médiumból 10 μl-t, a sejtkivonatból 5 μl-t poliakrilamid gélelektroforézisnek vetettünk alá, majd a fehérjéket PVDF membránra blottoltuk. (A) A médiumba szecernált SPINK1 vizsgálata a natív fehérje ellen termelt antitesttel. (B) A Glu-Glu címkével ellátott SPINK1 vizsgálata a jelölés elleni antitesttel a transzfektált sejtek médiumában és sejtkivonatában. A SPINK1 variánsok sejten belüli vizsgálatához elkészítettük az egyes konstrukciók epitóp címkével jelölt változatát. Ez azért vált szükségessé, mert a natív fehérje ellen termelt antitest erős aspecifikus kötődést mutatott a sejtkivonatokban

49

Eredmények

található egyéb fehérjékkel szemben. Az úgynevezett Glu-Glu címkét (Glu-Tyr-MetPro-Met-Glu) alkalmaztuk a fehérje C-terminálisához csatlakoztatva. A jelölést hordozó fehérjék azonos módon szecernálódtak és ugyanolyan inhibitoraktivitást mutattak, mint a jelöletlen formák. A reziduális aktivitás mérésekben a jelöletlen formákhoz hasonlóan a jelölt vad típusú és L12F fehérjék hasonló mértékű tripszingátlást mutattak, az L14P és L14R formák pedig nem eredményeztek számottevő gátlást. Az immunoblot (11. ábra B) a natív fehérjékkel azonos eredményt adott: a jelölt vad típusú és L12F SPINK1-et tartalmazó médiumok erős szignált adtak, az L14P és L14R mutánsok pedig nem voltak detektálhatók a médiumban. A transzfektált sejtekből készült sejtkivonatok vizsgálata azt mutatta, hogy a vad típusú és L12F formák a sejten belül megközelítőleg egyforma mennyiségben vannak jelen, ám az L14P és L14R mutánsok nem mutathatók ki. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a SPINK1 szignálpeptidjében található új L14R mutáció és a korábban ismert L14P mutáció megakadályozza az inhibitor szecernálódását, a sejtekben rekedt fehérjék pedig lebomlanak. Az L12F polimorf változat a vad típussal megegyező szekréciót mutat.

50

Eredmények

5.3

Az érett SPINK1-ben található missense mutációk funkcionális hatásának vizsgálata Az érett SPINK1-et érintő N34S, R65Q, R67C, D50E és Y54H mutációk,

valamint a P55S polimorf változat (12. ábra) a fehérje inhibitorfunkcióját is befolyásolhatják.

A

leggyakoribb

N34S

mutáció

funkcionális

hatásaként az

inhibitorfunkció csökkenését tételezték fel.169,182 Munkánk második szakaszában elvégeztük a SPINK1 pacreatitisszel összefüggésbe hozott, aminosavcserével járó változatainak szisztematikus funkcionális vizsgálatát: megvizsgáltuk a mutációk hatását a gén transzkripciójára, valamint a fehérje inhibitoraktivitására és szekréciójára. reaktív Lys

N34S N

G C E L N

T

K

I Y D P

V

C COOH G P55S D50E C C L V C T E Y54H P F D N G E G P Y N S T N K R Q K R I Q T S I L

Y C K A E R R65Q G R67C L S D NH2

12. ábra. Az érett SPINK1 fehérjében található missense mutációk. Az ábrán az érett SPINK1 elsődleges szerkezete látható az egybetűs aminosavkód felhasználásával. Feltüntettük a hat ismert missense mutációt, az inhibitor reaktív helyét (Lys41) és a diszulfidhidakat. 5.3.1

Az érett SPINK1 mutációinak hatása a fehérje inhibitoraktivitására Az érett fehérjét érintő mutációk vizsgálatának első lépéseként megvizsgáltuk,

hogy e mutációk befolyásolják-e a SPINK1 inhibitoraktivitását. Ehhez a vad típusú inhibitort és a hat mutánst Escherichia coli-ban, SUMO fúziós fehérjékként fejeztük ki. A SUMO fehérje egy kis, ubiquitinszerű protein, amely rekombináns fehérjékhez illesztve javítja a bakteriális expresszió termelését és a termelődő fehérjék oldékonyságát. A tisztítás után a SUMO fehérje a specifikus SUMO-proteázzal eltávolítható a fúziós fehérjéről, így natív szerkezetű fehérje nyerhető. Fúziós fehérjéink a könnyebb tisztítás érdekében polihisztidin jelölést is hordoztak. A termelt fehérjéket

51

Eredmények

nikkel affinitáskromatográfiával tisztítottuk, majd a fúziós részt lehasítottuk. A kapott preparátumok koncentrációját humán kationos tripszin elleni titrálással határoztuk meg. A rekombináns SPINK1 variánsok inhibitoraktivitását progress curve analízissel vizsgáltuk rekombináns humán kationos tripszinnel szemben. Az analízis során a tripszint

a

kromogén

szubsztrát

N-CZB-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilid

jelenlétében

inkubáltuk. A tripszin a szubsztrátot az arginin után elhasítja, így N-CZB-Gly-Pro-Arg tripeptid és para-nitroanilin képződik. A reakció során a sárga színű para-nitroanilin felhalmozódását követtük addig, amíg a szubsztrát elfogyott. Ha inhibitort is adunk a rendszerhez, a szubsztrát hasítása lassabban történik, az inhibitor kötődését jellemző konstans (Ki) pedig az inhibitor jelenlétében felvett görbék nemlineáris regressziós analízisével számítható. Egy reprezentatív kísérlet görbéi láthatók a 13. ábrán. A számított Ki értékek a szubnanomoláris nagyságrendbe esnek és csak kevéssé térnek el egymástól, a vizsgált mutációk tehát nincsenek jelentős hatással a SPINK1 inhibitoraktivitására. kontroll R67C 0.70 nM N34S 0.55 nM R65Q 0.31 nM Y54H 0.31 nM P55S 0.24 nM D50E 0.19 nM wt 0.17 nM

[p-nitroanilin] (µM)

120 100 80 60 40 20 0 0

100

200

300

400

500

600

Idő (s)

13. ábra. Az Escherichia coli-ban kifejezett missense mutánsok és a vad típusú SPINK1 inhibitoraktivitásának vizsgálata progress curve analízissel. Az ábra bal oldalán egy reprezentatív kísérlet görbéi láthatók. A reakciók 10 nM humán kationos tripszint és 140 μM N-CBZ-Gly-Pro-Arg szubsztrátot tartalmaztak. A kontroll reakció nem tartalmazott inhibitort, a többi reakcióban az egyes SPINK1 variánsok koncentrációja 16 nM volt. A kromogén szubsztrát hidrolízisekor fölszabaduló paranitroanilin felhalmozódását a 405 nm-en mért abszorbancia mérésével követtük szobahőmérsékleten 10 percig. A SPINK1 általi gátlást jellemző kinetikai paramétereket a KinTekSim programmal számítottuk. Az ábra jobb oldalán a két független kísérlet adataiból számított Ki értékeket tüntettük fel.

52

Eredmények

5.3.2

Az érett SPINK1 mutációinak hatása a SPINK1 gén transzkripciójára A transzkripcióra gyakorolt hatás vizsgálatához a szignálpeptid mutánsoknál

használt módszert alkalmaztuk. Az eukarióta expressziós vektorba klónozott SPINK1 variánsokkal HEK 293T sejteket transzfektáltunk, majd 48 óra tenyésztés után szemikvantitatív PCR-rel megvizsgáltuk a SPINK1 mRNS mennyiségét a sejtekben. A génspecifikus primerpárral kapott PCR-termék mennyisége az R65Q mutáns kivételével megközelítőleg egyforma volt a vad típus és a mutánsok körében (14. ábra). A mutációk tehát az R65Q mutáns kivételével nem befolyásolták a génről való transzkripció erősségét. Az R65Q esetében a kevesebb termék valamelyest csökkent transzkripciós hatékonyságra utal. M

1

2

3

4

5

6

7

SPINK1

400 300

GAPDH

200 100

14. ábra. Az érett SPINK1-ben található mutációk transzkripcióra gyakorolt hatásának vizsgálata RT-PCR-rel. A vad típusú és a mutáns SPINK1 variánsokat kódoló plazmidokkal HEK 293T sejteket transzfektáltunk. A transzfekció után 48 órával a sejtekből összRNS-t izoláltunk és azt cDNS-be írtuk. Ezután génspecifikus primerekkel, egy csőben végzett szemikvantitatív PCR reakciókkal vizsgáltuk a SPINK1 gén és kontrollként a glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) gén mRNS-ének mennyiségét. A PCR-termékeket agaróz gélelektroforézis után etídiumbromiddal való festéssel tettük láthatóvá. M: DNS-marker, 1: vad típus, 2: N34S, 3: R65Q, 4: R67C, 5: P55S, 6: D50E, 7: Y54H. 5.3.3

Az érett SPINK1 mutációinak hatása a fehérje szekréciójára Az érett fehérjét érintő mutációk a vártnak megfelelően nem befolyásolták a

transzkripció hatékonyságát, ám a SPINK1 inhibitoraktivitására sem voltak jelentős hatással. A következő lépésben ezért megvizsgáltuk a mutációk hatását az inhibitor szekréciójára

a

szignálpeptid-mutációk

felhasználásával.

53

vizsgálatakor

alkalmazott

metodika

Eredmények

5.3.3.1 A szekréció vizsgálata a reziduális tripszinaktivitás mérésével A mutációk szekréciós rátára gyakorolt hatását a már ismertetett reziduális aktivitás méréssel vizsgáltuk. Az eukarióta expressziós vektorba klónozott variánsokkal HEK 293T sejteket transzfektáltunk, majd a transzfekciót követően 48 órán át követtük a szecernált SPINK1 felhalmozódását a sejtek médiumában. A médiumból vett mintákat humán kationos tripszinnel kevertük és meghatároztuk a SPINK1 gátlása után maradó tripszinaktivitást. Mivel az egyes változatok inhibitoraktivitásai nem különböznek jelentősen, az így mérhető különbségek a szekréció különbségéből adódnak. A reziduális

tripszinaktivitás

értékeket

SPINK1

koncentrációkká

alakítottuk

a

rekombináns SPINK1-gyel felvett kalibrációs görbével, a kapott koncentrációkat pedig a transzfekció hatékonyságára korrigáltuk a kísérletek végén begyűjtött sejtkivonatok βgalaktozidáz aktivitására való normalizálással. A korrigált SPINK1 koncentrációk a 15. ábrán láthatók. A mutánsok szekréciójának vizsgálata azt mutatta, hogy a vad típus, a P55S polimorf változat, valamint az N34S mutáns szekréciós rátája megközelítőleg egyforma. Az R65Q mutáció esetében a szekréció a vad típushoz képest körülbelül a felére, az R67C mutáció esetében pedig az ötödére csökkent. A D50E és Y54H mutációk a szekréció drámai csökkenését eredményezték. Az Y54H mutáció a vad típus szekréciójának tizedrészére csökkentette, a D50E mutáció pedig teljesen megszüntette az inhibitor szekrécióját.

54



Eredmények

100

vad típus

80 60

N34S

40 20 0

0

10

20

30

40

50

100 80

P55S

60

vad típus

40 20 0

0

10


80

vad típus

60 40

R65Q

20 0

0

10

20 30 Idő (óra)

40

50

120




Idő (óra)

100

vad típus

80 60 40

D50E

20 0

0

10

20 30 Idő (óra)

40

50

20 30 Idő (óra)

40

50

100

vad típus

80 60 40

R67C

20 0

0

10

20 30 Idő (óra)

40

50

70 60 50

vad típus

40 30 20

Y54H

10 0

0

10

20 30 Idő (óra)

40

50

15. ábra. Az érett SPINK1 mutációinak hatása az inhibitor szekréciójára. A transzfekciót követően az ábrán jelölt időpontokban mintát vettünk a sejtek médiumából és meghatároztuk a médiumba szecernálódott SPINK1 koncentrációját. A médiummintákat humán kationos tripszinnel kevertük és meghatároztuk a reziduális tripszinaktivitásokat, amelyeket egy rekombináns SPINK1-gyel felvett kalibrációs görbe felhasználásával SPINK1 koncentrációkká alakítottunk. A koncentrációkat a sejtkivonatok β-galaktozidáz aktivitására normalizáltuk. Az ábrázolt értékek két párhuzamos transzfekció átlagai, a hibasávok az átlagtól való eltéréseket mutatják. A fekete négyzetek a vad típussal, az üres körök a mutánsokkal kapott értékeket jelölik.

55

Eredmények

5.3.3.2 A szekréció vizsgálata immunoblottal A reziduális aktivitások mérésével kapott eredmények független megerősítésére a sejtekből szecernálódó SPINK1 mennyiségét immunoblottal is megvizsgáltuk. Elsőként ellenőriztük a szignálpeptid mutánsok vizsgálatánál használt, natív SPINK1 ellen nyúlban termeltetett poliklonális ellenanyag alkalmazhatóságát az érett fehérjét érintő mutációk esetében. Ehhez az Escherichia coli-ban termelt fehérjéket használtuk. A vad típusú ill. mutáns fehérjékkel próba blotot készítettünk, amelyet inkubáltunk a natív SPINK1 elleni nyúl antitesttel. A kísérlet eredménye azt mutatta, hogy az antitest igen eltérő mértékben reagált az egyes variánsokkal: a vad típussal és az N34S ill. R65Q mutánsokkal erős jelet kaptunk, míg az R67C, P55S, D50E, Y54H mutánsokat elhanyagolható mértékben vagy semennyire sem ismerte fel az antitest. Ezt a jelenséget az élesztőből tisztított R67C mutáns esetében is megfigyelték190 és arra utal, hogy az R67C, P55S, D50E és Y54H mutációk azokat az epitópokat érintik, amelyek ellen a poliklonális antitestek termelődtek. A natív SPINK1 elleni antitestet ezért az érett fehérjét érintő mutációk vizsgálatához nem használhattuk. A mutációk immunoblottal történő vizsgálatához így elkészítettük az egyes mutációkat hordozó cDNS-konstrukciók epitóp címkével jelölt változatát. A szignálpeptid mutációk vizsgálatakor használt Glu-Glu címkét alkalmaztuk a fehérje Cterminálisához illesztve. A jelölésnek ebben az esetben sem volt hatása sem a fehérjék szekréciójára, sem azok inhibitoraktivitására: a jelölést hordozó mutánsok vizsgálatakor ugyanolyan hatásokat tapasztaltunk a reziduális aktivitás mérésekben, mint a natív fehérjék esetén. A sejtek által szecernált, jelölt SPINK1-et tartalmazó médiummintákkal és a GluGlu jelölés elleni antitesttel készített immunoblotok (16. ábra A) megerősítették az aktivitásméréssel kapott eredményeket. A vad típus, az N34S mutáns és a polimorf P55S változat közel azonos mennyiségben volt jelen a médiumban. Az R65Q mutánssal kapott jel intenzitása körülbelül feleakkora volt, mint a vad típusé, az R67C, D50E és Y54H mutánsok pedig nem voltak detektálhatók a médiumban. A sejtkivonatok vizsgálata (16. ábra B) azt mutatta, hogy a vad típusú, N34S és P55S SPINK1 körülbelül azonos mennyiségben volt jelen a sejten belül, míg az R65Q mutánssal kapott jel a vad típusénak körülbelül egyharmada volt. Meglepő módon a nem vagy alig szecernálódó R67C, D50E és Y54H mutánsok is jól látható jelet adtak a

56

Eredmények

sejtkivonatokban. Az R67C mutáns által adott jel az R65Q mutánssal egyező erősségű volt, a D50E mutáns gyenge jelet adott, az Y54H mutáns jele viszont közel olyan erősségű volt, mint a vad típusú inhibitoré. Az érett SPINK1 mutációinak vizsgálata során tehát azt találtuk, hogy az N34S mutáns és a P55S polimorf variáns a vad típussal megegyező mértékben szecernálódik a HEK 293T sejtekből. Az R65Q mutáció a szekréció körülbelül felére csökkenését eredményezi, míg az R67C mutáns esetében a szekréció még nagyobb mértékben, ötödére csökken. A D50E és az Y54H mutációk gyakorlatilag megszüntetik az inhibitor szekrécióját. Az R67C, D50E és Y54H mutánsok esetében a szekréció hiánya és a sejtkivonatokban detektálható inhibitor azt jelzi, hogy ezek a mutánsok a sejtekben rekednek és különböző sebességgel degradálódnak. Médium wt N34S R65Q R67C

wt

P55S D50E Y54H

Sejtkivonat wt N34S R65Q R67C

wt

P55S D50E Y54H

16. ábra. Az érett SPINK1-et érintő mutációk szekrécióra való hatásának vizsgálata immunoblottal. A Glu-Glu epitóp címkét hordozó mutáns konstrukciókkal HEK 293T sejteket transzfektáltunk és a médiumba szecernált, valamint az intracelluláris SPINK1 mennyiségét vizsgáltuk. A transzfektált sejtek médiumából 10 μl-t, a transzfekció után 48 órával begyűjtött sejtkivonatokból 5 μl-t használtunk. A mintákat poliakrilamid gélelektroforézisnek vetettük alá, majd PVDF membránra blottoltuk. A jelölt SPINK1-et a jelölés elleni antitesttel mutattuk ki.

57

Eredmények

5.3.4

A HEK 293T sejtekben kifejezett SPINK1 mutánsok inhibitoraktivitásának vizsgálata Az Escherichia coli-ban termelt SPINK1 variánsokkal kapott eredmények humán

sejtekben való megerősítésére a kellő mennyiségben szecernálódó N34S és R65Q, valamint a vad típusú inhibitort HEK 293T sejtek médiumából is tisztítottuk és az egyes variánsok inhibitoraktivitását ezeken a preparátumokon is megvizsgáltuk. A sejtek által elválasztott SPINK1-et a médiumból affinitáskromatográfiás módszerrel izoláltuk szarvasmarha tripszin oszlop segítségével. Az így készült preparátumok inhibitoros konstansát a már ismertetett progress curve módszerrel határoztuk meg a három humán tripszin izoformával, a kationos tripszinnel, az anionos tripszinnel és a mezotripszinnel szemben. A felvett görbék és a számított Ki értékek a 17. ábrán láthatók. A kapott Ki értékek minden esetben 1 nM alatt voltak. Ezek az eredmények megerősítik, hogy a ritka R65Q mutáció és a pancreatitisszel leggyakrabban asszociált N34S mutáció nem befolyásolja a SPINK1 tripszint gátló aktivitását.

58

Eredmények

A

kontroll

120

[p-nitroanilin] (µM )

100

wt − 0.33 nM N34S − 0.26 nM R65Q − 0.19 nM

80 60 40 20

kationos tripszin

0 0

100

200

300

400

500

600

Idő (s)

B

140

kontroll wt − 0.63 nM N34S − 0.52 nM R65Q − 0.25 nM

[p-nitroanilin] (µM )

120 100 80 60 40 20

anionos tripszin

0 0

100

200

300

400

500

600

Idő (s)

C

120

[p-nitroanilin] (µ M )

100 80 60 40 20

mezotripszin

0 0

100

200

300

400

500

600

Idő (s)

17. ábra. A HEK 293T sejtekben kifejezett vad típusú, N34S és R65Q SPINK1 tripszingátló aktivitásának vizsgálata progress curve analízissel. (A) Humán kationos tripszinnel, (B) humán anionos tripszinnel és (C) humán mezotripszinel szemben végzett mérések egy-egy reprezentetív görbéje. A reakciók az egyes tripszin izoformákból 10 nM-t tartalmaztak, a kromogén szubsztrát névleges koncentrációja 140 μM volt. A kontroll reakciók nem tartalmaztak inhibitort, a többi reakcióban az egyes SPINK1 variánsok koncentrációja 20 nM volt. A feltüntetett Ki értékeket két vagy három független mérés adataiból számítottuk a KinTekSim program segítségével.

59

6

AZ EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE A jelen dolgozatban bemutatott munka célja az volt, hogy a humán hasnyálmirigy

eredetű tripszin inhibitor (SPINK1) pancreatitist okozó vagy a betegséggel összefüggésbe hozott mutációi körében meghatározzuk azt a funkcionális defektust vagy defektusokat, amely(ek) a mutációkat hordozó betegekben a pancreatitis kiváltását okozzák. A mutációk funkcionális hatásának megismerése nemcsak a pancreatitis pathogeneziséről való ismereteinket bővíti, hanem hozzásegíthet a ritka mutációk betegséggel való oksági kapcsolatának bizonyításához és a SPINK1 mutációi által okozott pancreatitis öröklésmenetének tisztázásához is.

6.1

A szignálpeptid-mutációk hatása Munkánk során a SPINK1 szignálpeptidjében található mutációk, az általunk leírt

L14R és a már ismert L14P40 mutáció funkcionális hatásait vizsgáltuk. Az analízisbe bevontuk az ugyancsak általunk leírt L12F polimorf változatot is, amely szintén a szignálpeptidben helyezkedik el. Az L14R mutációt két, egymással rokonságban nem álló családban találtuk meg: egy Franciaországban élő bolgár családban és egy német családban. Mindkét családban több

nemzedékben

is

előfordul

pancreatitis,

amely

autoszomális

domináns

öröklésmenetet mutat, így az örökletes pancreatitis klasszikus formájának felel meg.46 Az L14R mutáció az egyes családokban három ill. négy generáción át társul a betegséggel igen magas (bár nem teljes) penetrancia mellett. Az inkomplett penetrancia azonban jellemző a klasszikus autoszomális domináns herediter pancreatitist okozó korábban leírt mutációk esetében is, amelyek a humán kationos tripszinogénben találhatók.55 Az L14R mutációval azonos aminosavat érint a Witt és munkatársai által korábban leírt L14P mutáció.40 Ezt a mutációt egy ötéves, pancreatitisben szenvedő német kisfiúban találták, akinek édesanyja is hordozza a mutációt, ám a családban korábban nem fordult elő a betegség. Később azonban a beteg édesanyjánál is pancreatitis alakult ki, tehát ez a mutáció is autoszomális domináns módon öröklődő pancreatitist okoz.

60

Az eredmények megbeszélése

Az L12F változatot közép-afrikai származású betegekben találtuk meg, az etnikailag illesztett kontrollpopulációban azonban szintén előfordult, így polimorf változatnak minősül. Európai (francia és német) populációkban ezt a változatot sem a betegek, sem az egészséges kontrollok körében nem találtuk meg. Vizsgálatainktól függetlenül az L12F variánst észak-amerikai betegek genetikai szűrése során is leírták,215 a hordozó betegek etnikai hovatartozása azonban nem ismert és kontrollcsoportot sem vizsgáltak. Az L12F variáns kísérleteinkben fontos kontrollként szerepelt: vizsgálata bizonyítja, hogy a szignálpeptid nem minden változata okoz pancreatitist, így közvetlen összefüggés van a mutációk szekréciót megszüntető hatása és a betegség kialakulása között. A

három

változat

funkcionális

hatását

HEK

293T

sejtek

tranziens

transzfekciójával vizsgáltuk. Az egyes változatokkal transzfektált sejtekben a SPINK1 mRNS mennyisége azonos volt, tehát a mutációk nem a transzkripció befolyásolásán keresztül fejtik ki hatásukat. A három változatnak az inhibitor szekréciójára gyakorolt hatását a transzfektált sejtek által a médiumba szecernált SPINK1 mennyiségének meghatározásával vizsgáltuk. Erre kétféle módszert alkalmaztunk: a sejtekből szecernálódó SPINK1 felhalmozódását időben követtük a médium tripszingátló aktivitásának vizsgálatán keresztül, illetve a transzfekció után 48 órával vizsgáltuk a médiumban levő inhibitor mennyiségét immunoblot segítségével. Az immunoblotot kétféleképpen is elkészítettük: natív SPINK1 variánsok és a natív inhibitor elleni antitest, valamint epitóp címkét hordozó SPINK1 variánsok és a jelölés elleni antitest felhasználásával. Az epitóp címke használata azért volt szükséges, mert a natív inhibitor elleni antitestet annak erős aspecifikus reakciója miatt nem használhattuk a sejtkivonatok vizsgálatához. A transzfektált sejtekről származó médium vizsgálata mind a tripszingátló aktivitás mérésekor, mind a két immunoblot esetén azt mutatta, hogy az L14P és L14R mutációk megszüntetik az inhibitor szekrécióját, az L12F változat azonban a vad típussal egyező szekréciót mutat. A transzfektált sejtek kivonatainak vizsgálatakor azt találtuk, hogy míg a vad típusú és L12F SPINK1 erős jelet adott, az L14P és L14R mutánsok nem voltak kimutathatók, azaz a sejten belül lebomlottak. A SPINK1 szignálpeptidjének szerkezete a szignálpeptidekre általánosan jellemző szerkezetet követi. Három régióra osztható, egy pozitív töltésű N-terminális régióra (6 aminosav), egy hidrofób középső régióra (12 aminosav) és egy poláros C-terminális

61


szakaszra (6 aminosav, köztük a szignálpeptid hasítóhelye).216 Az általunk vizsgált változatok mindegyike a hidrofób középső szakaszt érinti, amely az endoplazmás retikulum lumenébe történő transzlokációért felelős. A hidrofób régiót érintő mutációkat már számos betegséggel hozták összefüggésbe (3. táblázat) és funkcionális hatásaikat is megvizsgálták. Ezek a vizsgálatok egybehangzóan azt mutatták, hogy ezek a mutációk úgy akadályozák meg a szekréciót, hogy meggátolják a preprotein transzlokációját az endoplazmás retikulumba. 3. táblázat. A szignálpeptid hidrofób régióját érintő mutációk betegségekkel való kapcsolata. A táblázatban feltüntettük az egyes mutációkat hordozó fehérjéket, a mutációk pontos elhelyezkedését és az általuk okozott betegségeket. A szekvenciákban a vastagon szedett, aláhúzott betűk a mutációk helyét jelölik. Fehérje Preproparathyroid hormon IX-es véralvadási faktor Bilirubin UDPglükuronidtranszferáz VII-es véralvadási faktor

Mutáció Szignálpeptid MIPAKDMAKVMIVMLAICFLTKSDG C18R

Humán sonic hedgehog (SHH) IX-es trombocita glikoprotein (GPIX) Dentin szialofoszfoprotein (DSPP) Kalciumérzékelő receptor (CaSR)

L17P

I17N L15R L13P

L7P

Okozott betegség Familiáris hypoparathyreoidismus217 MQRVNMIMAESPSLITICLLGYLLSA B típusú hemofília218 MAVESQGGRPLVLGLLLCVLGPVVSHA II-es típusú Crigler—Najjarszindróma219 MVSQALRLLCLLLGLQGCLA Örökletes VII-es faktor deficiencia220 MLLLARCLLLVLVSSLLVCSGLA Holoprosencephalia 3221 MPAWGALFLLWATAEA Bernard–Soulierszindróma222

Y6D

MKIITYFCIWAVAWA

II-es típusú dentin diszplázia223

L11S, L13P, T14A

MAFYSCCWVLLALTWHTSA

Hipokalciuriás hiperkalcémia224

Elméletileg lehetséges, hogy a mutációk szekréciót csökkentő hatása a transzláció gátlásán keresztül történik. Ez azonban igen valószínűtlen, mivel a vizsgált változatok 40 nukleotid távolságra vannak a transzláció kezdőpontjától. Vizsgálatainkat HEK 293T sejteken végeztük, amelyek konstitutív szekréciót végeznek. Fölmerülhet a kérdés, hogy ez a konstitutív szekréciót végző sejtvonal használható-e az acinussejtek regulált szekréciójának modelljeként. A regulált szekréció

62


tanulmányozására alkalmas humán acinus eredetű sejtvonal sajnos nem ismert. A patkányból származó AR42J sejtvonal225 csökkent szekréciós aktivitást mutat, ezért kétséges, hogy vizsgálataink céljára alkalmas lenne. A szignálpeptid variánsok vizsgálatára így az epitéliális eredetű, konstitutív szekréciót végző HEK 293T sejtvonalat használtuk. Eredményeink azt mutatják, hogy az L14P és L14R mutációk megszüntetik a SPINK1 szekrécióját és igen valószínű, hogy a korábban vizsgált ilyen típusú mutációkhoz hasonlóan az endoplazmás retikulumba való transzlokációt gátolják meg. Mivel a preprotein irányítása az endoplazmás retikulum felé és a lumenbe való transzlokáció azonos módon zajlik a konstitutív és a regulált szekréció során, a mutációk valószínűleg ugyanilyen hatással járnak az acinussejtek regulált szekréciós útvonalában is. Eredményeink további megerősítést nyerhetnének, ha az L14P és L14R mutációkat hordozó betegek hasnyálmintáiban vizsgálhatnánk a szecernált SPINK1 mennyiségét. Erre azonban a betegektől származó hasnyálminták hiányában nem volt lehetőségünk. Munkánk során kimutattuk, hogy a SPINK1 szekrécióját megszüntető L14P és L14R mutációk dominánsan öröklődő pancreatitist okoznak. A gyakori N34S mutáció vizsgálata nyomán az a vélemény terjedt el az irodalomban, hogy a SPINK1 mutációi csupán a betegség kialakulásának valószínűségét módosító faktorok lehetnek a kationos tripszinogén mutációi után, mivel a SPINK1 gátló kapacitásának csökkenése nem jelenthet problémát a tripszinogén (auto)aktiválódása nélkül. Ez a nézet az újabb mutációk leírásával finomodott és egyes tanulmányok felvetették, hogy a SPINK1mutációk funkcionális hatásuk erősségétől függő mértékben lehetnek képesek a pancreatitis kiváltására.185 Az L14P és L14R mutációk vizsgálata az első az irodalomban, amelyben súlyos SPINK1-mutációk dominánsan öröklődő pancreatitist okoznak a kationos tripszinogén mutációi nélkül is és az inhibitorfunkció defektusa in vitro vizsgálatokkal bizonyított. Ezeket a mutációkat tehát az N34S mutációval szemben nem módosító faktoroknak, hanem betegségokozó mutációknak tekinthetjük. A domináns öröklődés magyarázataként valószínűsíthető, hogy a SPINK1 funkció ilyen erős csökkenése az esetlegesen spontán előforduló, „fiziológiás” tripszinaktiválódás ellen sem nyújt védelmet, így a kationos tripszinogén mutációi nélkül is pancreatitis kialakulásához vezet. A nem teljes penetrancia és az egyes betegekben csak felnőttkorban kialakuló betegség összhangban van ezzel az elképzeléssel.

63


6.2

Az érett fehérje missense mutációinak funkcionális hatása Munkánk második részében az érett SPINK1 fehérjében található, ezidáig leírt hat

mutáció funkcionális hatását vizsgáltuk. E mutációk eltérő gyakorisággal fordulnak elő a betegek körében és klinikai jelentőségük is különböző. Az N34S mutáció a SPINK1 leggyakoribb és leggyakrabban vizsgált mutációja, melynek

a

pancreatitis

különböző

típusaival

való

kapcsolatát

számos

asszociációvizsgálat kimutatta.40,85,86,169-174 Az így felhalmozódott adatmennyiség és a felmerült hipotézisek169,182 ellenére az N34S által okozott funkcionális hatást fehérjeszinten csak egyetlen tanulmány vizsgálta, amely élesztőben termelt fehérjék esetében nem mutatott ki különbséget a mutáns fehérje és a vad típus között.189 Humán sejtekből izolált mutáns fehérje vizsgálata azonban az irodalomban nem ismert. A P55S változatot egymástól függetlenül két tanulmány írta le. Witt és munkatársai40 egy egészséges kontroll személyben, Chen és munkatársai168 pedig egy betegben találták meg. Későbbi vizsgálatokban további P55S-t hordozókat találtak mind az egészséges kontrollok között, mind a vizsgált klinikai populációkban.43,169,176-180 Bár egyes tanulmányok a P55S heterozigóták kis mértékű feldúsulását figyelték meg a betegpopulációban, az adatok többsége amellett szól, hogy a P55S a pancreatitisszel kapcsolatban nem álló polimorf variáns. Ennek ellenére az irodalomban számos helyen és a pancreatitisben leírt mutációk online adatbázisában61 is mutációként szerepel. A P55S variáns egyértelmű besorolásához funkcionális hatásának vizsgálata szükséges. Négy további olyan mutáció ismert az irodalomban, amely az érett fehérjében aminosavcserét eredményez: ezek az R65Q, az R67C, a D50E és az Y54H mutációk. E mutációk esetében a kis mintaszám, az alacsony penetrancia és az R65Q ill. R67C mutációk esetében az egyéb mutációk jelenléte a betegséggel való oksági kapcsolat kimondását is megnehezíti. A mutációk funkcionális hatásának ismerete szükséges a pancreatitisszel való oksági összefüggésük bizonyításához. Az érett fehérje szerkezetét befolyásoló mutációk hatással lehetnek a SPINK1 inhibitoraktivitására.

A

mutációk

funkcionális

vizsgálatának

első

lépéseként

megvizsgáltuk, hogy a mutáns fehérjék inhibitoros konstansa különbözik-e a vad típusétól. Ehhez a vad típust és a hat mutánst Escherichia coli sejtekben fejeztük ki SUMO fúziós fehérjék formájában. Ezzel a módszerrel a baktériumsejtekből natív szerkezetű fehérje nyerhető. A SPINK1 mutánsok és a vad típus inhibitoros konstansát

64


progress curve analízissel hasonlítottuk össze. A kapott Ki értékek a szubnanomólos nagyságrendbe estek és csak kevéssé tértek el egymástól. Ez az eredmény arra utal, hogy nem az inhibitoraktivitás különbségei állnak a mutációk pancreatitisszel való asszociációjának hátterében. A mért Ki értékek jól egyeznek az irodalomban található korábban mért adatokkal.65 A következő lépésben a vad típus és a mutánsok humán sejtvonalból történő szekrécióját hasonlítottuk össze. A vizsgálatokat a szignálpeptid mutánsoknál használt HEK 293T sejtvonalon, azonos metodikával végeztük. Elsőként ellenőriztük az egyes mutáns konstrukciókról átíródó mRNS mennyiségét, amely az R65Q mutáns kivételével egyformának adódott (az R65Q mutáns kis mértékű csökkenést mutatott), a mutációk tehát nem a transzkripció szintjén érvényesítik hatásukat. A mutáns formák szekrécióját ebben az esetben is a médium tripszingátló aktivitásának mérésével, valamint immunoblottal vizsgáltuk. Az immunoblotot csak az epitóp címkét hordozó fehérjékkel végezhettük el, mert a natív SPINK1 elleni antitest az egyes mutánsokat nem egyformán ismerte fel. A szekréció mindkét módszerrel történő vizsgálata azt mutatta, hogy a vad típus, valamint az N34S mutáns és a P55S változat szekréciójának mértéke hozzávetőleg egyforma. Az R65Q mutáns szekréciója körülbelül a vad típus felére, az R67C mutánsé pedig az ötödére csökkent. Az Y54H mutáció a vad típus tizedére csökkentette, a D50E mutáció pedig teljesen megszüntette a szekréciót. A sejtkivonatokon végzett immunoblot azt mutatta, hogy az N34S és P55S SPINK1 a vad típusú inhibitorral közel azonos mennyiségben van jelen a transzfektált sejteken belül, de különböző erősséggel a többi mutáns is kimutatható. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az N34S mutáció és a P55S variáns nincs hatással a szekrécióra, míg az R65Q mutáció erősen csökkenti, az R67C, D50E és Y54H mutációk pedig megszüntetik az inhibitor szekrécióját. A szekréciót csökkentő mutációk feltehetőleg a fehérje hibás feltekeredését eredményezik, a nem megfelelően tekeredett fehérjéket pedig az endoplazmás retikulum minőségellenőrző rendszere visszatartja. A nem szecernálódó fehérjék így a sejtekben rekednek, ahol különböző sebességgel lebomlanak, valószínűleg a endoplazmás retikulummal asszociált degradációs útvonalon (ERAD) keresztül. Munkánk befejezése után Boulling és munkatársai a missense mutánsok szekrécióját CHO sejtek médiumában vizsgálva megerősítették a HEK 293 sejtekkel

65


kapott eredményeinket.226 Ez a tanulmány a mutánsok inhibitoraktivitását és intracelluláris mennyiségét nem vizsgálta. A D50E és Y54H mutációk drámai hatása a fehérje harmadlagos szerkezetében elfoglalt helyükkel magyarázható. A rekombináns humán SPINK1 kristályszerkezetét98 (18. ábra) szemügyre véve látható, hogy az Asp50 és a Tyr54 hidrogénkötést létesít egymással. A mutánsok vizsgálatával kapott eredmények azt mutatják, hogy ez a hidrogénhíd kiemelkedően fontos a fehérje megfelelő feltekeredéséhez és elvesztése a natív térszerkezet felbomlását okozza. Az R67C mutáció egy párosítatlan cisztein megjelenését eredményezi, amely megzavarhatja a fehérje három diszulfidhídjának megfelelő kialakulását és így a fehérje normális feltekeredését. Másrészt a 18. ábrán látható szerkezet azt is mutatja, hogy az Arg67 oldallánc az Asp50-Tyr54 pár felé mutat, így elképzelhető, hogy az Arg67 kölcsönhatásba lép az Asp50-nel és stabilizálja annak Tyr54-gyel való kapcsolatát. Az R67C mutáció így ennek a kölcsönhatásnak a megszüntetésével is kifejtheti hatását.

Lys41

Pro55

Tyr54

C

Asn34 Arg65

Arg67

18. ábra. Az Asp50 és a Tyr54 közötti interakció a SPINK1 harmadlagos szerkezetében. A fehérje térszerkezetét mutató szalagdiagram a rekombináns humán SPINK1 röntgendiffrakcióval meghatározott alapul. A képet a szerkezetén98 DeepView/Swiss-PdbViewer program 3.7-es verziójával készítettük. Kiemeltük a mutációk által érintett aminosavak oldalláncait és a reaktív Lys41 oldalláncot. A diszulfidhidakat az áttekinthetőség kedvéért elhagytuk.

Asp50

N

A P55S variánssal kapott eredmények azt jelzik, hogy ez a változat funkcionális hatást nem fejt ki, tehát valóban a polimorfizmusként való besorolása helyes. Az N34S mutáns esetében eredményeink humán sejtekben is megerősítik az élesztőben termelt inhibitorral kapott eredményeket,189 valamint továbbviszik azokat annak kimutatásával, hogy a mutációt hordozó gén transzkripciójának hatékonysága és a mutáns fehérje

66


szekréciójának sebessége sem tér el a vad típustól. A pancreatitisszel leggyakrabban asszociált mutáció molekuláris fenotípusa tehát még mindig felderítésre vár. Az N34S mutációról több tanulmány megállapította, hogy kapcsoltnak mutatkozik egyes, intronokban elhelyezkedő mutációkkal.40,183 Ennek alapján elképzelhető, hogy a funkcionális hatást ezek a mutációk fejtik ki például az mRNS processzálásának vagy stabilitásának befolyásolásával. Az érett fehérje ritka mutációinak vizsgálatakor kapott eredmények bizonyítják, hogy ezek a mutációk valóban a pancreatitis rizikófaktorai, amelyek a SPINK1 funkció defektusán keresztül hajlamosítanak a pancreatitis kialakulására. A mutánsok a fehérje hibás feltekeredésén keresztül akadályozzák meg az inhibitor szekrécióját, így ezek az esetek az irodalomban leírt olyan protein folding betegségekhez csatlakoznak, mint az α1-antitripszin

deficiencia,

a

cisztás

fibrózis

betegségek.227

67

vagy

egyes

neurodegeneratív

Következtetések

7

KÖVETKEZTETÉSEK A hasnyálmirigy-gyulladás pathogeneziséről alkotott elképzelésünk szerint a

betegséget a tripszinogén ektópiás aktiválódása váltja ki, amely az egyéb hasnyálmirigy zimogének aktiválódásához és az önemésztődés beindulásához vezet. Mivel a hasnyálmirigy eredetű tripszin inhibitor (SPINK1) feladata a hasnyálmirigyen belül aktiválódott tripszin gátlása, a modell szerint a pancreatitisszel összefüggésben álló SPINK1-mutációk az inhibitorfunkció csökkenését eredményezik. A pancreatitisszel összefüggésbe hozott SPINK1 mutációk funkcionális hatásáról munkánk megkezdése előtt igen kevés adat volt ismert. Munkánk során megvizsgáltuk a SPINK1-ben aminosavcserét eredményező mutációk hatását a fehérje transzkripciójára, inhibitoraktivitására és szekréciójára. A kapott eredmények azt mutatják, hogy a szignálpeptidben található L14P és L14R mutációk, valamint az érett fehérjét érintő R65Q, R67C, D50E és Y54H mutációk hatására a SPINK1 szekréciója erősen csökken vagy teljesen megszűnik. Munkánk eredményeképpen tehát bizonyítást nyert, hogy a hasnyálmirigy eredetű tripszin inhibitor (SPINK1) pancreatitisszel összefüggésbe hozott mutációi a feltételezéseknek

megfelelően

funkcióvesztést

eredményező

(loss-of-function)

mutációk. A mutációk szekréciót megszüntető hatásának ismeretében kimondhatjuk, hogy a szignálpeptidben található L14P és L14R, valamint az érett fehérjét érintő ritka R65Q, R67C, D50E és Y54H mutációk oksági összefüggésben állnak a pancreatitis kialakulásával. A szekréció elmaradása pedig egységes pathomechanizmus részévé teszi a szignálpeptid és az érett fehérje mutációit, amelyek így egyazon módon, a szecernált SPINK1 mennyiségének csökkentésén keresztül vezethetnek a proteáz–antiproteáz egyensúly megbomlásához és így a pancreatitis kialakulásához.

68

8

ÖSSZEFOGLALÁS A pancreatitist a hasnyálmirigy által termelt zimogének korai aktivációja és a

következményes önemésztődés váltja ki. Örökletes pancreatitisben a zimogének ektópiás

aktiválódása

genetikai

okok

következménye.

A

betegség

genetikai

rizikófaktorai között szerepelnek a humán kationos tripszinogén gain-of-function mutációi, amelyek a zimogén gyorsabb autoaktivációját okozzák, valamint a hasnyálmirigy eredetű tripszin inhibitor (SPINK1) mutációi, amelyek feltehetően lossof-function mutációk, de funkcionális hatásukról az irodalomban igen kevés adat ismert. Munkánk során a SPINK1 pancreatitisben leírt, aminosavcserét eredményező mutációinak

szisztematikus

funkcionális

analízisét

végeztük

el.

A

fehérje

szignálpeptidjében egy új mutációt (L14R) és egy polimorf variánst (L12F) azonosítottunk. Az L14R és a korábban leírt L14P mutációk dominánsan öröklődő pancreatitist okoznak igen magas penetranciával. A SPINK1 variánsok funkcionális hatását HEK 293T sejtek tranziens transzfekciójával vizsgáltuk. Az L14P és L14R mutációk az inhibitor szekréciójának megszűnését okozták, míg az L12F polimorf variáns nem volt hatással a szekrécióra. Az érett fehérjét érintő missense mutációk (N34S, R65Q, R67C, P55S, D50E, Y54H) nem eredményeztek változást az inhibitor tripszinhez való kötődésében, azonban az R65Q, R67C, D50E és Y54H mutációk a szekréció különböző fokú csökkenését okozták. Ezek a mutánsok a sejtekben rekedtek és különböző sebességgel lebomlottak, ami valószínűleg a mutációk által okozott hibás feltekeredés következménye. Az N34S mutáció és a P55S polimorfizmus sem az inhibitoraktivitást, sem a fehérje szekrécióját nem befolyásolta. Az N34S mutáció hatása így még mindig ismeretlen, lehetséges, hogy a hatást az intronokban található kapcsolt mutációk fejtik ki. Munkánk eredményeképpen bebizonyosodott, hogy a SPINK1 pancreatitisben leírt mutációi valóban loss-of-function mutációk, amelyek a hasnyálmirigy SPINK1 funkciójának

csökkenését

eredményezik.

Az

inhibitoraktivitás

csökkentésével

ellentétben a SPINK1 szignálpeptidjében és az érett fehérjében található mutációk közös pathomechanizmussal, a szecernált SPINK1 mennyiségének csökkentésén keresztül hajlamosítanak a proteáz–antiproteáz egyensúly felborulására és így a pancreatitis kialakulására.

69

9

SUMMARY Pancreatitis is caused by the premature activation of digestive zymogens in the

pancreatic parenchyma and the resulting autodigestion of the pancreas. While most cases of the disease are associated with environmental factors, hereditary pancreatitis is caused by mutations in genes involved in pancreatic function. Pathogenic mutations in human cationic trypsinogen cause a gain of function by increasing autoactivation. Conversely, disease-associated mutations in the pancreatic secretory trypsin inhibitor (SPINK1) are believed to be loss-of-function mutations but their functional effects are largely unknown. The aim of the present study was to undertake a systematic functional analysis of missense SPINK1 mutations associated with pancreatitis. We have identified a new mutation in the signal peptide of SPINK1, L14R, as well as a polymorphic variant, L12F. Mutation L14R and the previously reported L14P mutation cause autosomal dominant hereditary pancreatitis.

We studied the functional effects of SPINK1

variants in transiently transfected HEK 293T cells. Our results show that mutations L14P and L14R abolish SPINK1 secretion, while the L12F variant has no effect. Missense mutations N34S, R65Q, R67C, P55S, D50E and Y54H in the mature protein have no major effect on trypsin inhibitory activity, but mutations R65Q, R67C, D50E and Y54H impair secretion of SPINK1 by causing intracellular retention and degradation of mutant proteins, probably due to mutation-induced misfolding. The most frequently studied mutation in SPINK1, N34S, and the polymorphic variant P55S had no effect on either trypsin inhibitory activity or SPINK1 secretion. Thus, the functional effect of the N34S mutation remains unknown and might be caused by the intronic mutations reported to be in linkage disequilibrium with N34S. Our results show that disease-associated mutations in SPINK1 are indeed lossof-function mutations impairing SPINK1 function in the pancreas.

Missense

mutations in the signal peptide and in the mature protein both result in decreased SPINK1 secretion and thus share a common pathomechanism in generating a protease-antiprotease imbalance that results in susceptibility to pancreatitis.

70

Irodalomjegyzék

10 IRODALOMJEGYZÉK 1.

Neurath H. Proteolytic processing and physiological regulation. Trends Biochem Sci. 1989 14(7):268-71.

2.

Laskowski M Jr, Kato I. Protein inhibitors of proteinases. Annu Rev Biochem. 1980 49:593-626.

3.

Bode W, Huber R. Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinases. Eur J Biochem. 1992 204(2):433-51.

4.

Kraut J. Serine proteases: structure and mechanism of catalysis. Annu Rev Biochem 1977 46: 331-358.

5.

Kunitz M, Northrop JH. Isolation from beef pancreas of crystalline trypsinogen, trypsin, a trypsin inhibitor, and an inhibitor-trypsin compound. J Gen Physiol 1936 19: 991-1007.

6.

Chen JM, Ferec C. Human trypsins. In: Barrett AJ, Rawlings ND és Woessner JF (szerk.), Handbook of Proteolytic Enzymes, Elsevier, London, 2004: 1489-1493.

7.

Rinderknecht H, Geokas M.C. Anionic and cationic trypsinogens (trypsins) in mammalian pancreas. Enzyme 1973 14: 116-130.

8.

Rinderknecht H., Renner IG, Abramson SB, Carmack C. Mesotrypsin: a new inhibitorresistant protease from a zymogen in human pancreatic tissue and fluid. Gastroenterology 1984 86: 681-692.

9.

Mellanby J, Woolley VJ. The ferments of the pancreas: Part I. The generation of trypsin from trypsinogen by enterokinase. J Physiol. 1912 45(5):370-88.

10. Greene LJ, Pubols MH, Bartelt DC. Human pancreatic secretory trypsin inhibitor. Methods Enzymol. 1976 45:813-25. 11. Rinderknecht H. Activation of pancreatic zymogens. Normal activation, premature intrapancreatic activation, protective mechanisms against inappropriate activation. Dig Dis Sci. 1986 31(3):314-21. 12. Pap Á. A pancreas. In: Varró V. (szerk.), Gastroenterologia. Medicina, Budapest, 1998: 577-651. 13. Pap Á. A pancreas betegségei. In: Lonovics J, Tulassay Zs, Varró V. (szerk.), Klinikai gastroenterologia. Medicina, Budapest, 2003: 551-634. 14. Chiari H. Über die Selbstverdauung des menschlichen Pancreas. Z Heilk 1896 17:69-96. 15. Kingsnorth A, O'Reilly D. Acute pancreatitis. BMJ. 2006 332(7549):1072-6. 16. Bank S, Singh P, Pooran N, Stark B. Evaluation of factors that have reduced mortality from acute pancreatitis over the past 20 years. J Clin Gastroenterol. 2002 35(1):50-60.

71

Irodalomjegyzék

17. Banerjee AK, Galloway SW, Kingsnorth AN. Experimental models of acute pancreatitis. Br J Surg. 1994 81(8):1096-103. 18. Lerch MM, Adler G. Experimental animal models of acute pancreatitis. Int J Pancreatol. 1994 15(3):159-70. 19. Witt H, Apte MV, Keim V, Wilson JS. Chronic pancreatitis: challenges and advances in pathogenesis, genetics, diagnosis, and therapy. Gastroenterology. 2007 132(4):1557-73. 20. Etemad B, Whitcomb DC. Chronic pancreatitis: diagnosis, classification, and new genetic developments. Gastroenterology. 2001 120(3):682-707. 21. Otsuki M. Chronic pancreatitis in Japan: epidemiology, prognosis, diagnostic criteria, and future problems. J Gastroenterol. 2003 38(4):315-26. 22. Levy P, Milan C, Pignon JP, Baetz A, Bernades P. Mortality factors associated with chronic pancreatitis. Unidimensional and multidimensional analysis of a medical-surgical series of 240 patients. Gastroenterology. 1989 96(4):1165-72. 23. Lowenfels AB, Maisonneuve P. Risk factors for pancreatic cancer. J Cell Biochem. 2005 95(4):649-56. 24. Ohashi, K, Kim J-H, Hara H, Aso R, Akimoto T, and Nakamura N. WBN/Kob rats. A new spontaneously occurring model of chronic pancreatitis. Int J Pancreatol 1989 6:231-247. 25. Suda K, Takase M, Fukumura Y, Suzuki F, Jim A, Kakinuma C, Tanaka T, Matsugu Y, Miyasaka K, Funakoshi A. Histopathologic difference between chronic pancreatitis animal models and human chronic pancreatitis. Pancreas. 2004 28(3):e86-9. 26. Bachem MG, Schneider E, Gross H, Weidenbach H, Schmid RM, Menke A, Siech M, Beger H, Grunert A, Adler G. Identification, culture, and characterization of pancreatic stellate cells in rats and humans. Gastroenterology 1998 115:421–32. 27. Apte MV, Haber PS, Applegate TL, Norton ID, McCaughan GW, Korsten MA, Pirola RC, Wilson JS. Periacinar stellate shaped cells in rat pancreas—identification, isolation, and culture. Gut 1998 43:128–33. 28. Apte MV, Wilson JS. Mechanisms of pancreatic fibrosis. Dig Dis. 2004 22(3):273-9. 29. Omary MB, Lugea A, Lowe AW, Pandol SJ. The pancreatic stellate cell: a star on the rise in pancreatic diseases. J Clin Invest. 2007 117(1):50-9. 30. Kloppel G, Luttges J, Lohr M, Zamboni G, Longnecker D. Autoimmune pancreatitis: pathological, clinical, and immunological features. Pancreas. 2003 27(1):14-9. 31. Okazaki K. Autoimmune pancreatitis: etiology, pathogenesis, clinical findings and treatment. The Japanese experience. JOP. 2005 6(1 Suppl):89-96. 32. Ectors N, Maillet B, Aerts R, Geboes K, Donner A, Borchard F, Lankisch P, Stolte M, Luttges J, Kremer B, Kloppel G. Non-alcoholic duct destructive chronic pancreatitis. Gut. 1997 41(2):263-8.

72

Irodalomjegyzék

33. Sarles H, Sarles JC, Muratore R, Guien C. Chronic inflammatory sclerosis of the pancreas–an autonomous pancreatic disease? Am J Dig Dis. 1961 6:688-98. 34. Okazaki K, Uchida K, Ohana M, Nakase H, Uose S, Inai M, Matsushima Y, Katamura K, Ohmori K, Chiba T. Autoimmune-related pancreatitis is associated with autoantibodies and a Th1/Th2-type cellular immune response. Gastroenterology. 2000 118(3):573-81. 35. Asada M, Nishio A, Uchida K, Kido M, Ueno S, Uza N, Kiriya K, Inoue S, Kitamura H, Ohashi S, Tamaki H, Fukui T, Matsuura M, Kawasaki K, Nishi T, Watanabe N, Nakase H, Chiba T, Okazaki K. Identification of a novel autoantibody against pancreatic secretory trypsin inhibitor in patients with autoimmune pancreatitis. Pancreas. 2006 33(1):20-6. 36. Czako L, Hegykozi E, Palinkas A, Lonovics J. Autoimmune pancreatitis: functional and morphological recovery after steroid therapy. World J Gastroenterol. 2006 12(11):1810-2. 37. Balakrishnan V, Nair P, Radhakrishnan L, Narayanan VA. Tropical pancreatitis – a distinct entity, or merely a type of chronic pancreatitis? Indian J Gastroenterol. 2006 25(2):74-81. 38. Pitchumoni CS, Thomas E. Chronic cassava toxicity: possible relationship to chronic pancreatic disease in malnourished populations. Lancet. 1973 2(7842):1397-8. 39. Narendranathan M, Cheriyan A. Lack of association between cassava consumption and tropical pancreatitis syndrome. J Gastroenterol Hepatol. 1994 9(3):282-5. 40. Witt H, Luck W, Hennies HC, Classen M, Kage A, Lass U, Landt O, Becker M. Mutations in the gene encoding the serine protease inhibitor, Kazal type 1 are associated with chronic pancreatitis. Nat Genet. 2000 25(2):213-6. 41. Witt H, Luck W, Becker M, Bohmig M, Kage A, Truninger K, Ammann RW, O'Reilly D, Kingsnorth A, Schulz HU, Halangk W, Kielstein V, Knoefel WT, Teich N, Keim V. Mutation in the SPINK1 trypsin inhibitor gene, alcohol use, and chronic pancreatitis. JAMA. 2001 285(21):2716-7. 42. Rossi L, Pfutzer RH, Parvin S, Ali L, Sattar S, Kahn AK, Gyr N, Whitcomb DC. SPINK1/PSTI mutations are associated with tropical pancreatitis in Bangladesh. A preliminary report. Pancreatology. 2001 1(3):242-5. 43. Schneider A, Suman A, Rossi L, Barmada MM, Beglinger C, Parvin S, Sattar S, Ali L, Khan AK, Gyr N, Whitcomb DC. SPINK1/PSTI mutations are associated with tropical pancreatitis and type II diabetes mellitus in Bangladesh. Gastroenterology. 2002 123(4):1026-30. 44. Bhatia E, Choudhuri G, Sikora SS, Landt O, Kage A, Becker M, Witt H. Tropical calcific pancreatitis: strong association with SPINK1 trypsin inhibitor mutations. Gastroenterology. 2002 123(4):1020-5. 45. Chandak GR, Idris MM, Reddy DN, Bhaskar S, Sriram PV, Singh L. Mutations in the pancreatic secretory trypsin inhibitor gene (PSTI/SPINK1) rather than the cationic trypsinogen gene (PRSS1) are significantly associated with tropical calcific pancreatitis. J Med Genet. 2002 39(5):347-51.

73

Irodalomjegyzék

46. Comfort MW, Steinberg AG. Pedigree of a family with hereditary chronic relapsing pancreatitis. Gastroenterology. 1952 21(1):54-63. 47. Howes N, Lerch MM, Greenhalf W, Stocken DD, Ellis I, Simon P, Truninger K, Ammann R, Cavallini G, Charnley RM, Uomo G, Delhaye M, Spicak J, Drumm B, Jansen J, Mountford R, Whitcomb DC, Neoptolemos JP; European Registry of Hereditary Pancreatitis and Pancreatic Cancer (EUROPAC). Clinical and genetic characteristics of hereditary pancreatitis in Europe. Clin Gastroenterol Hepatol. 2004 2(3):252-61. 48. Witt H, Becker M. Genetics of chronic pancreatitis. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2002 34(2):125-36. 49. Le Bodic L, Bignon J.-D, Raguenes O, Mercier B, Georgelin T, Schnee M, Soulard F, Gagne K, Bonneville F, Muller J.-Y, Bachner L, Ferec C. The hereditary pancreatitis gene maps to long arm of chromosome 7. Hum. Molec. Genet. 1996 5:549-554. 50. Whitcomb DC, Preston RA, Aston CE, Sossenheimer MJ, Barua PS, Zhang Y, WongChong A, White GJ, Wood PG, Gates LK Jr, Ulrich C, Martin SP, Post JC, Ehrlich GD. A gene for hereditary pancreatitis maps to chromosome 7q35. Gastroenterology 1996 110:1975-1980. 51. Pandya A, Blanton SH, Landa B, Javaheri R, Melvin E, Nance WE, Markello T. Linkage studies in a large kindred with hereditary pancreatitis confirms mapping of the gene to a 16-cM region on 7q. Genomics 1996 38:227-230. 52. Rowen L, Koop BF, Hood L. The complete 685-kilobase DNA sequence of the human beta T cell receptor locus. Science 1996 272:1755-1762. 53. Emi M, Nakamura Y, Ogawa M, Yamamoto T, Nishide T, Mori T, Matsubara K. Cloning, characterization and nucleotide sequences of two cDNAs encoding human pancreatic trypsinogens. Gene. 1986 41(2-3):305-10. 54. Tani T, Kawashima I, Mita K, Takiguchi Y. Nucleotide sequence of the human pancreatic trypsinogen III cDNA. Nucleic Acids Res. 1990 18(6):1631. 55. Whitcomb DC, Gorry MC, Preston RA, Furey W, Sossenheimer MJ, Ulrich CD, Martin SP, Gates LK Jr, Amann ST, Toskes PP, Liddle R, McGrath K, Uomo G, Post JC, Ehrlich GD. Hereditary pancreatitis is caused by a mutation in the cationic trypsinogen gene. Nat Genet. 1996 14(2):141-5. 56. Gorry MC, Gabbaizedeh D, Furey W, Gates LK Jr, Preston RA, Aston CE, Zhang Y, Ulrich C, Ehrlich GD, Whitcomb DC. Mutations in the cationic trypsinogen gene are associated with recurrent acute and chronic pancreatitis. Gastroenterology. 1997 113(4):1063-8. 57. Witt H, Luck W, Becker M. A signal peptide cleavage site mutation in the cationic trypsinogen gene is strongly associated with chronic pancreatitis. Gastroenterology. 1999 117(1):7-10. 58. Applebaum-Shapiro SE, Finch R, Pfutzer RH, Hepp LA, Gates L, Amann S, Martin S, Ulrich CD 2nd, Whitcomb DC. Hereditary pancreatitis in North America: the PittsburghMidwest Multi-Center Pancreatic Study Group Study. Pancreatology. 2001 1(5):439-43.

74

Irodalomjegyzék

59. Keim V, Witt H, Bauer N, Bodeker H, Rosendahl J, Teich N, Mossner J. The course of genetically determined chronic pancreatitis. JOP. 2003 4(4):146-54. 60. Otsuki M, Nishimori I, Hayakawa T, Hirota M, Ogawa M, Shimosegawa T, Research Committee on Intractable Disease of the Pancreas. Hereditary pancreatitis: clinical characteristics and diagnostic criteria in Japan. Pancreas. 2004 28(2):200-6. 61. A Lipcsei Egyetem adatbázisa a krónikus pancreatitisben leírt genetikai változatokról: http://www.uni-leipzig.de/pancreasmutation/db.html 62. Sahin-Toth M, Toth M. Gain-of-function mutations associated with hereditary pancreatitis enhance autoactivation of human cationic trypsinogen. Biochem Biophys Res Commun. 2000 278(2):286-9. 63. Varallyay E, Pal G, Patthy A, Szilagyi L, Graf L. Two mutations in rat trypsin confer resistance against autolysis. Biochem Biophys Res Commun. 1998 243(1):56-60. 64. Sahin-Toth M. Human cationic trypsinogen. Role of Asn-21 in zymogen activation and implications in hereditary pancreatitis. J Biol Chem. 2000 275(30):22750-5. 65. Szilagyi L, Kenesi E, Katona G, Kaslik G, Juhasz G, Graf L. Comparative in vitro studies on native and recombinant human cationic trypsins. Cathepsin B is a possible pathological activator of trypsinogen in pancreatitis. J Biol Chem. 2001 276(27):24574-80. 66. Nemoda Z, Sahin-Toth M. Chymotrypsin C (caldecrin) stimulates autoactivation of human cationic trypsinogen. J Biol Chem. 2006 281(17):11879-86. 67. Vernon HM. The conditions of action of the pancreatic secretion. J Physiol 1902 28:375394. 68. Davie EW, Neurath H. Identification of a peptide released during autocatalytic activation of trypsinogen. J Biol Chem. 1955 212(2):515-29. 69. Kay J, Kassell B. The autoactivation of trypsinogen. J Biol Chem. 1971 246(21):6661-5. 70. Chen JM, Kukor Z, Le Marechal C, Toth M, Tsakiris L, Raguenes O, Ferec C, Sahin-Toth M. Evolution of trypsinogen activation peptides. Mol Biol Evol. 2003 20(11):1767-77. 71. Szepessy E, M. Sahin-Toth M. An evolutionary dilemma: digestion versus pancreatitis. The positively selected Arg101 stimulates autoactivation of human cationic trypsinogen. Előadás az American Pancreatic Association 2005. évi kongresszusán, Chicago, 2005. november 4. Összefoglaló: Pancreas 2005 31(4):473. 72. Nemoda Z, Sahin-Toth M. The tetra-aspartate motif in the activation peptide of human cationic trypsinogen is essential for autoactivation control but not for enteropeptidase recognition. J Biol Chem. 2005 280(33):29645-52. 73. Teich N, Ockenga J, Hoffmeister A, Manns M, Mossner J, Keim V. Chronic pancreatitis associated with an activation peptide mutation that facilitates trypsin activation. Gastroenterology. 2000 119(2):461-5. 74. Ferec C, Raguenes O, Salomon R, Roche C, Bernard JP, Guillot M, Quere I, Faure C, Mercier B, Audrezet MP, Guillausseau PJ, Dupont C, Munnich A, Bignon JD, Le Bodic L.

75

Irodalomjegyzék

Mutations in the cationic trypsinogen gene and evidence for genetic heterogeneity in hereditary pancreatitis. J Med Genet. 1999 36(3):228-32. 75. Sahin-Toth M. Biochemical models of hereditary pancreatitis. Endocrinol Metab Clin North Am. 2006 35(2):303-12, ix. 76. Teich N, Le Marechal C, Kukor Z, Caca K, Witzigmann H, Chen JM, Toth M, Mossner J, Keim V, Ferec C, Sahin-Toth M. Interaction between trypsinogen isoforms in genetically determined pancreatitis: mutation E79K in cationic trypsin (PRSS1) causes increased transactivation of anionic trypsinogen (PRSS2). Hum Mutat. 2004 23(1):22-31. 77. Le Marechal C, Masson E, Chen JM, Morel F, Ruszniewski P, Levy P, Ferec C. Hereditary pancreatitis caused by triplication of the trypsinogen locus. Nat Genet. 2006 38(12):1372-4. 78. Halfon S, Craik CS. Trypsin. In: Barrett AJ, Rawlings ND, Woessner JF (szerk.) Handbook of proteolytic enzymes. Academic Press, London, 1998: 12–21. 79. Schwiebert EM, Benos DJ, Egan ME, Stutts MJ, Guggino WB. CFTR is a conductance regulator as well as a chloride channel. Physiol Rev. 1999 79(1 Suppl):S145-66. 80. A The Hospital for Sick Children (University of Toronto) adatbázisa a CFTR mutációiról: http://www3.genet.sickkids.on.ca/cftr/app 81. Ravnik-Glavac M, Glavac D, di Sant' Agnese P, Chernick M, Dean M. Cystic fibrosis gene mutations detected in hereditary pancreatitis. Pflugers Arch. 1996 431(6 Suppl 2):R191-2. 82. Sharer N, Schwarz M, Malone G, Howarth A, Painter J, Super M, Braganza J. Mutations of the cystic fibrosis gene in patients with chronic pancreatitis. N Engl J Med. 1998 339(10):645-52. 83. Cohn JA, Friedman KJ, Noone PG, Knowles MR, Silverman LM, Jowell PS. Relation between mutations of the cystic fibrosis gene and idiopathic pancreatitis. N Engl J Med. 1998 339(10):653-8. 84. Cohn JA, Neoptolemos JP, Feng J, Yan J, Jiang Z, Greenhalf W, McFaul C, Mountford R, Sommer SS. Increased risk of idiopathic chronic pancreatitis in cystic fibrosis carriers. Hum Mutat. 2005 26(4):303-7. 85. Weiss FU, Simon P, Bogdanova N, Mayerle J, Dworniczak B, Horst J, Lerch MM. Complete cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene sequencing in patients with idiopathic chronic pancreatitis and controls. Gut. 2005 54(10):1456-60. 86. Noone PG, Zhou Z, Silverman LM, Jowell PS, Knowles MR, Cohn JA. Cystic fibrosis gene mutations and pancreatitis risk: relation to epithelial ion transport and trypsin inhibitor gene mutations. Gastroenterology. 2001 121(6):1310-9. 87. Lamprecht G, Mau UA, Kortum C, Raible A, Stern M, Riess O, Gregor M. Relapsing pancreatitis due to a novel compound heterozygosity in the CFTR gene involving the second most common mutation in central and eastern Europe [CFTRdele2,3(21 kb)]. Pancreatology. 2005 5(1):92-6.

76

Irodalomjegyzék

88. Marino CR, Matovcik LM, Gorelick FS, Cohn JA. Localization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in pancreas. J. Clin. Invest. 1991 88:712-716. 89. Steward MC, Ishiguro H, Case RM. Mechanisms of bicarbonate secretion in the pancreatic duct. Annu Rev Physiol. 2005 67:377-409. 90. Burghardt B, Nielsen S, Steward MC. The role of aquaporin water channels in fluid secretion by the exocrine pancreas. J Membr Biol. 2006 210(2):143-53. 91. Scheele GA, Fukuoka SI, Kern HF, Freedman SD. Pancreatic dysfunction in cystic fibrosis occurs as a result of impairments in luminal pH, apical trafficking of zymogen granule membranes, and solubilization of secretory enzymes. Pancreas. 1996 12(1):1-9. 92. Dasouki MJ, Cogan J, Summar ML, Neblitt W 3rd, Foroud T, Koller D, Phillips JA 3rd. Heterogeneity in hereditary pancreatitis. Am J Med Genet. 1998 77(1):47-53. 93. Ferec C, Raguenes O, Salomon R, Roche C, Bernard JP, Guillot M, Quere I, Faure C, Mercier B, Audrezet MP, Guillausseau PJ, Dupont C, Munnich A, Bignon JD, Le Bodic L. Mutations in the cationic trypsinogen gene and evidence for genetic heterogeneity in hereditary pancreatitis. J Med Genet. 1999 36(3):228-32. 94. Creighton J, Lyall R, Wilson DI, Curtis A, Charnley R. Mutations of the cationic trypsinogen gene in patients with chronic pancreatitis. Lancet. 1999 354(9172):42-3. 95. Kazal LA, Spicer DS, Brahinsky RA. Isolation of a crystalline trypsin inhibitor anticoagulant protein from pancreas. J Amer Chem Soc. 1948 70:3034-3040. 96. Pubols MH, Bartelt DC, Greene LJ. Trypsin inhibitor from human pancreas and pancreatic juice. J Biol Chem. 1974 249(7):2235-42. 97. Bartelt DC, Shapanka R, Greene LJ. The primary structure of the human pancreatic secretory trypsin inhibitor. Amino acid sequence of the reduced S-aminoethylated protein. Arch Biochem Biophys. 1977 179(1):189-99. 98. Hecht HJ, Szardenings M, Collins J, Schomburg D. Three-dimensional structure of a recombinant variant of human pancreatic secretory trypsin inhibitor (Kazal type). J Mol Biol. 1992 225(4):1095-103. 99. Krowarsch D, Cierpicki T, Jelen F, Otlewski J. Canonical protein inhibitors of serine proteases. Cell Mol Life Sci. 2003 60(11):2427-44. 100. Laskowski M, Wu FC. Temporary inhibition of trypsin. J Biol Chem 1953 204:797-805. 101. Kikuchi N, Nagata K, Shin M, Mitsushima K, Teraoka H, Yoshida N. Site-directed mutagenesis of human pancreatic secretory trypsin inhibitor. J Biochem (Tokyo). 1989 106(6):1059-63. 102. Tschesche H. Biochemistry of natural proteinase inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 1974 13(1):10-28. 103. Huhtala ML. Demonstration of a new acrosin inhibitor in human seminal plasma. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1984 365(7):819-25.

77

Irodalomjegyzék

104. Tsuzuki S, Kokado Y, Satomi S, Yamasaki Y, Hirayasu H, Iwanaga T, Fushiki T. Purification and identification of a binding protein for pancreatic secretory trypsin inhibitor: a novel role of the inhibitor as an anti-granzyme A. Biochem J. 2003 372(Pt 1):227-33. 105. Odani S, Koide T, Ono T. A possible evolutionary relationship between plant trypsin inhibitor, alpha-amylase inhibitor, and mammalian pancreatic secretory trypsin inhibitor (Kazal). J Biochem (Tokyo). 1983 93(6):1701-4. 106. Shibata T, Ogawa M, Matsuda K, Miyauchi K, Yamamoto T, Mori T. Purification and characterization of pancreatic secretory trypsin inhibitor in human gastric mucosa. Clin Chim Acta. 1986 159(1):27-36. 107. Freeman TC, Playford RJ, Quinn C, Beardshall K, Poulter L, Young J, Calam J. Pancreatic secretory trypsin inhibitor in gastrointestinal mucosa and gastric juice. Gut. 1990 31(11):1318-23. 108. Marchbank T, Freeman TC, Playford RJ. Human pancreatic secretory trypsin inhibitor. Distribution, actions and possible role in mucosal integrity and repair. Digestion. 1998 59(3):167-74. 109. Bohe M, Borgstrom A, Lindstrom C, Ohlsson K. Pancreatic endoproteases and pancreatic secretory trypsin inhibitor immunoreactivity in human Paneth cells. J Clin Pathol. 1986 39(7):786-93. 110. Fukayama M, Hayashi Y, Koike M, Ogawa M, Kosaki G. Immunohistochemical localization of pancreatic secretory trypsin inhibitor in fetal and adult pancreatic and extrapancreatic tissues. J Histochem Cytochem. 1986 34(2):227-35. 111. Marchbank T, Chinery R, Hanby AM, Poulsom R, Elia G, Playford RJ. Distribution and expression of pancreatic secretory trypsin inhibitor and its possible role in epithelial restitution. Am J Pathol. 1996 148(3):715-22. 112. Shibata T, Ogawa M, Takata N, Matsuda K, Niinobu T, Uda K, Wakasugi C, Mori T. Distribution of pancreatic secretory trypsin inhibitor in various human tissues and its inactivation in the gastric mucosa. Res Commun Chem Pathol Pharmacol. 1987 55(2):2438. 113. Stenman UH. Tumor-associated trypsin inhibitor. Clin Chem. 2002 48(8):1206-9. 114. Paju A, Hotakainen K, Cao Y, Laurila T, Gadaleanu V, Hemminki A, Stenman UH, Bjartell A. Increased Expression of Tumor-Associated Trypsin Inhibitor, TATI, in Prostate Cancer and in Androgen-Independent 22Rv1 Cells. Eur Urol. 2007 Feb 5 (elektronikus verzió) 115. Halila H, Huhtala ML, Schroder T, Kiviluoto T, Stenman UH. Pancreatic secretory trypsin inhibitor-like immunoreactivity in pancreatectomized patients. Clin Chim Acta. 1985 Dec 153(3):209-16. 116. Marks WH, Ohlsson K. Elimination of pancreatic secretory trypsin inhibitor from the circulation. A study in man. Scand J Gastroenterol. 1983 18(7):955-9.

78

Irodalomjegyzék

117. Eddeland A, Ohlsson K. A radioimmunoassay for measurement of human pancreatic secretory trypsin inhibitor in different body fluids. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1978 359(6):671-5. 118. Pezzilli R, Billi P, Plate L, Barakat B, Bongiovanni F, Miglioli M. Human pancreatic secretory trypsin inhibitor in the assessment of the severity of acute pancreatitis. A comparison with C-reactive protein. J Clin Gastroenterol. 1994 19(2):112-7. 119. Matsuda K, Ogawa M, Shibata T, Nishibe S, Miyauchi K, Matsuda Y, Mori T. Postoperative elevation of serum pancreatic secretory trypsin inhibitor. Am J Gastroenterol. 1985 80(9):694-8. 120. Ogawa M, Matsuda K, Shibata T, Matsuda Y, Ukai T, Ohta M, Mori T. Elevation of serum pancreatic secretory trypsin inhibitor (PSTI) in patients with serious injury. Res Commun Chem Pathol Pharmacol. 1985 50(2):259-66. 121. Tanaka H, Ogawa M, Yoshioka T, Sugimoto T. Serum pancreatic secretory trypsin inhibitor (PSTI) in seriously injured and septic patients. Adv Exp Med Biol. 1988 240:4938. 122. Shibata T, Ogawa M, Takata N, Niinobu T, Uda K, Ukai T, Ohta M, Mori T. Elevation of serum pancreatic secretory trypsin inhibitor following serious injury. Resuscitation. 1988 16(3):163-8. 123. Lasson A, Borgstrom A, Ohlsson K. Elevated pancreatic secretory trypsin inhibitor levels during severe inflammatory disease, renal insufficiency, and after various surgical procedures. Scand J Gastroenterol. 1986 21(10):1275-80. 124. Ogawa M. Pancreatic secretory trypsin inhibitor as an acute phase reactant. Clin Biochem. 1988 21(1):19-25. 125. Saheki T, Kobayashi K, Inoue I. Hereditary disorders of the urea cycle in man: biochemical and molecular approaches. Rev Physiol Biochem Pharmacol. 1987 108:21-68. 126. Kobayashi K, Nakata M, Terazono H, Shinsato T, Saheki T. Pancreatic secretory trypsin inhibitor gene is highly expressed in the liver of adult-onset type II citrullinemia. FEBS Lett. 1995 372(1):69-73. 127. Kobayashi K, Horiuchi M, Saheki T. Pancreatic secretory trypsin inhibitor as a diagnostic marker for adult-onset type II citrullinemia. Hepatology. 1997 25(5):1160-5. 128. Maruyama H, Ogawa M, Nishio T, Kobayashi K, Saheki T, Sunohara N. Citrullinemia type II in a 64-year-old man with fluctuating serum citrulline levels. J Neurol Sci. 2001 182(2):167-70. 129. Tsuboi Y, Fujino Y, Kobayashi K, Saheki T, Yamada T. High serum pancreatic secretory trypsin inhibitor before onset of type II citrullinemia. Neurology. 2001 57(5):933. 130. Kobayashi K, Sinasac DS, Iijima M, Boright AP, Begum L, Lee JR, Yasuda T, Ikeda S, Hirano R, Terazono H, Crackower MA, Kondo I, Tsui LC, Scherer SW, Saheki T. The gene mutated in adult-onset type II citrullinaemia encodes a putative mitochondrial carrier protein. Nature Genet. 1999 22:159-163.

79

Irodalomjegyzék

131. Saheki T, Kobayashi K. Mitochondrial aspartate glutamate carrier (citrin) deficiency as the cause of adult-onset type II citrullinemia (CTLN2) and idiopathic neonatal hepatitis (NICCD). J. Hum. Genet. 2002 47:333-341. 132. Stenman UH, Huhtala ML, Koistinen R, Seppala M. Immunochemical demonstration of an ovarian cancer-associated urinary peptide. Int J Cancer. 1982 30(1):53-7. 133. Huhtala ML, Pesonen K, Kalkkinen N, Stenman UH. Purification and characterization of a tumor-associated trypsin inhibitor from the urine of a patient with ovarian cancer. J Biol Chem. 1982 257(22):13713-6. 134. Stenman UH, Koivunen E, Itkonen O. Biology and function of tumor-associated trypsin inhibitor, TATI. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 1991 207:5-9. 135. Raty S, Sand J, Alfthan H, Haglund C, Nordback I. Cyst fluid tumor-associated trypsin inhibitor may be helpful in the differentiation of cystic pancreatic lesions. J Gastrointest Surg. 2004 8(5):569-74. 136. Paju A, Vartiainen J, Haglund C, Itkonen O, von Boguslawski K, Leminen A, Wahlstrom T, Stenman UH. Expression of trypsinogen-1, trypsinogen-2, and tumor-associated trypsin inhibitor in ovarian cancer: prognostic study on tissue and serum. Clin Cancer Res. 2004 10(14):4761-8. 137. Lee YC, Pan HW, Peng SY, Lai PL, Kuo WS, Ou YH, Hsu HC. Overexpression of tumour-associated trypsin inhibitor (TATI) enhances tumour growth and is associated with portal vein invasion, early recurrence and a stage-independent prognostic factor of hepatocellular carcinoma. Eur J Cancer. 2007 43(4):736-44. 138. Kelloniemi E, Rintala E, Finne P, Stenman UH, Finnbladder Group. Tumor-associated trypsin inhibitor as a prognostic factor during follow-up of bladder cancer. Urology. 2003 62(2):249-53. 139. Paju A, Jacobsen J, Rasmuson T, Stenman UH, Ljungberg B. Tumor associated trypsin inhibitor as a prognostic factor in renal cell carcinoma. J Urol. 2001 165(3):959-62. 140. Koivunen E, Ristimaki A, Itkonen O, Osman S, Vuento M, Stenman UH. Tumorassociated trypsin participates in cancer cell-mediated degradation of extracellular matrix. Cancer Res. 1991 51(8):2107-12. 141. Sorsa T, Salo T, Koivunen E, Tyynela J, Konttinen YT, Bergmann U, Tuuttila A, Niemi E, Teronen O, Heikkila P, Tschesche H, Leinonen J, Osman S, Stenman UH. Activation of type IV procollagenases by human tumor-associated trypsin-2. J Biol Chem. 1997 272(34):21067-74. 142. Yamashita K, Mimori K, Inoue H, Mori M, Sidransky D. A tumor-suppressive role for trypsin in human cancer progression. Cancer Res. 2003 63(20):6575-8. 143. Wiksten JP, Lundin J, Nordling S, Kokkola A, Stenman UH, Haglund C. High tissue expression of tumour-associated trypsin inhibitor (TATI) associates with a more favourable prognosis in gastric cancer. Histopathology. 2005 46(4):380-8.

80

Irodalomjegyzék

144. Scheving LA. Primary amino acid sequence similarity between human epidermal growth factor-urogastrone, human pancreatic secretory trypsin inhibitor, and members of porcine secretin family. Arch Biochem Biophys. 1983 226(2):411-3. 145. Ogawa M, Tsushima T, Ohba Y, Ogawa N, Tanaka S, Ishida M, Mori T. Stimulation of DNA synthesis in human fibroblasts by human pancreatic secretory trypsin inhibitor. Res Commun Chem Pathol Pharmacol. 1985 50(1):155-8. 146. Ohmachi Y, Murata A, Matsuura N, Yasuda T, Uda K, Mori T. Overexpression of pancreatic secretory trypsin inhibitor in pancreatic cancer. Evaluation of its biological function as a growth factor. Int J Pancreatol. 1994 15(1):65-73. 147. McKeehan WL, Sakagami Y, Hoshi H, McKeehan KA. Two apparent human endothelial cell growth factors from human hepatoma cells are tumor-associated proteinase inhibitors. J Biol Chem. 1986 261(12):5378-83. 148. Fukuoka S, Fushiki T, Kitagawa Y, Sugimoto E, Iwai K. Competition of a growth stimulating-/cholecystokinin (CCK) releasing-peptide (monitor peptide) with epidermal growth factor for binding to 3T3 fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 1987 145(2):646-50. 149. Freeman TC, Curry BJ, Calam J, Woodburn JR. Pancreatic secretory trypsin inhibitor stimulates the growth of rat pancreatic carcinoma cells. Gastroenterology. 1990 99(5):1414-20. 150. Niinobu T, Ogawa M, Murata A, Nishijima J, Mori T. Identification and characterization of receptors specific for human pancreatic secretory trypsin inhibitor. J Exp Med. 1990 172(4):1133-42. 151. Ohmuraya M, Hirota M, Araki M, Mizushima N, Matsui M, Mizumoto T, Haruna K, Kume S, Takeya M, Ogawa M, Araki K, Yamamura K. Autophagic cell death of pancreatic acinar cells in serine protease inhibitor Kazal type 3-deficient mice. Gastroenterology. 2005 129(2):696-705. 152. Chera S, de Rosa R, Miljkovic-Licina M, Dobretz K, Ghila L, Kaloulis K, Galliot B. Silencing of the hydra serine protease inhibitor Kazal1 gene mimics the human SPINK1 pancreatic phenotype. J Cell Sci. 2006 119(Pt 5):846-57. 153. Horii A, Kobayashi T, Tomita N, Yamamoto T, Fukushige S, Murotsu T, Ogawa M, Mori T, Matsubara K. Primary structure of human pancreatic secretory trypsin inhibitor (PSTI) gene. Biochem Biophys Res Commun. 1987 149(2):635-41. 154. Yasuda T, Ogawa M, Murata A, Ohmachi Y, Yasuda T, Mori T, Matsubara K. Identification of the IL-6-responsive element in an acute-phase-responsive human pancreatic secretory trypsin inhibitor-encoding gene. Gene. 1993 131(2):275-80. 155. Yasuda T, Yasuda T, Ohmachi Y, Katsuki M, Yokoyama M, Murata A, Monden M, Matsubara K. Identification of novel pancreas-specific regulatory sequences in the promoter region of human pancreatic secretory trypsin inhibitor gene. J Biol Chem 1998 273:34413-34421. 156. Rockett JC, Patrizio P, Schmid JE, Hecht NB, Dix DJ. Gene expression patterns associated with infertility in humans and rodent models. Mutat Res. 2004 549(1-2):225-40.

81

Irodalomjegyzék

157. Agerberth B, Soderling-Barros J, Jornvall H, Chen ZW, Ostenson CG, Efendic S, Mutt V. Isolation and characterization of a 60-residue intestinal peptide structurally related to the pancreatic secretory type of trypsin inhibitor: influence on insulin secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989 86(21):8590-4. 158. Metsis M, Cintra A, Solfrini V, Ernfors P, Bortolotti F, Morrasutti DG, Ostenson CG, Efendic S, Agerberth B, Mutt V, Persson H, Fuxe K. Molecular cloning of PEC-60 and expression of its mRNA and peptide in the gastrointestinal tract and immune system. J Biol Chem. 1992 267(28):19829-32. 159. Norberg A, Gruber S, Angelucci F, Renlund S, Wadensten H, Efendic S, Ostenson CG, Jornvall H, Sillard R, Mathe AA. Identification of the bioactive peptide PEC-60 in brain. Cell Mol Life Sci. 2003 60(2):378-81. 160. Magert HJ, Standker L, Kreutzmann P, Zucht HD, Reinecke M, Sommerhoff CP, Fritz H, Forssmann WG. LEKTI, a novel 15-domain type of human serine proteinase inhibitor. J Biol Chem. 1999 274(31):21499-502. 161. Bitoun E, Chavanas S, Irvine AD, Lonie L, Bodemer C, Paradisi M, Hamel-Teillac D, Ansai S, Mitsuhashi Y, Taieb A, de Prost Y, Zambruno G, Harper JI, Hovnanian A. Netherton syndrome: disease expression and spectrum of SPINK5 mutations in 21 families. J Invest Dermatol. 2002 118(2):352-61. 162. Bitoun E, Micheloni A, Lamant L, Bonnart C, Tartaglia-Polcini A, Cobbold C, Al Saati T, Mariotti F, Mazereeuw-Hautier J, Boralevi F, Hohl D, Harper J, Bodemer C, D'Alessio M, Hovnanian A. LEKTI proteolytic processing in human primary keratinocytes, tissue distribution and defective expression in Netherton syndrome. Hum Mol Genet. 2003 12(19):2417-30. 163. Descargues P, Deraison C, Bonnart C, Kreft M, Kishibe M, Ishida-Yamamoto A, Elias P, Barrandon Y, Zambruno G, Sonnenberg A, Hovnanian A. Spink5-deficient mice mimic Netherton syndrome through degradation of desmoglein 1 by epidermal protease hyperactivity. Nat Genet. 2005 37(1):56-65. 164. Hewett DR, Simons AL, Mangan NE, Jolin HE, Green SM, Fallon PG, McKenzie AN. Lethal, neonatal ichthyosis with increased proteolytic processing of filaggrin in a mouse model of Netherton syndrome. Hum Mol Genet. 2005 14(2):335-46. 165. Blumenthal MN. The role of genetics in the development of asthma and atopy. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2005 5(2):141-5. 166. Wapenaar MC, Monsuur AJ, Poell J, van 't Slot R, Meijer JW, Meijer GA, Mulder CJ, Mearin ML, Wijmenga C. The SPINK gene family and celiac disease susceptibility. Immunogenetics. 2007 59(5):349-57. 167. NCBI Map Viewer, Build 36.2: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=9606 168. Chen JM, Mercier B, Audrezet MP, Ferec C. Mutational analysis of the human pancreatic secretory trypsin inhibitor (PSTI) gene in hereditary and sporadic chronic pancreatitis. J Med Genet. 2000 37(1):67-9.

82

Irodalomjegyzék

169. Pfutzer RH, Barmada MM, Brunskill AP, Finch R, Hart PS, Neoptolemos J, Furey WF, Whitcomb DC. SPINK1/PSTI polymorphisms act as disease modifiers in familial and idiopathic chronic pancreatitis. Gastroenterology. 2000 119(3):615-23. 170. Plendl H, Siebert R, Steinemann D, Grote W. High frequency of the N34S mutation in the SPINK1 gene in chronic pancreatitis detected by a new PCR-RFLP assay. Am J Med Genet. 2001 100(3):252-3. 171. Chen JM, Mercier B, Audrezet MP, Raguenes O, Quere I, Ferec C. Mutations of the pancreatic secretory trypsin inhibitor (PSTI) gene in idiopathic chronic pancreatitis. Gastroenterology. 2001 120(4):1061-4. 172. Drenth JP, te Morsche R, Jansen JB. Mutations in serine protease inhibitor Kazal type 1 are strongly associated with chronic pancreatitis. Gut. 2002 50(5):687-92. 173. Threadgold J, Greenhalf W, Ellis I, Howes N, Lerch MM, Simon P, Jansen J, Charnley R, Laugier R, Frulloni L, Olah A, Delhaye M, Ihse I, Schaffalitzky de Muckadell OB, Andren-Sandberg A, Imrie CW, Martinek J, Gress TM, Mountford R, Whitcomb D, Neoptolemos JP. The N34S mutation of SPINK1 (PSTI) is associated with a familial pattern of idiopathic chronic pancreatitis but does not cause the disease. Gut. 2002 50(5):675-81. 174. Truninger K, Witt H, Kock J, Kage A, Seifert B, Ammann RW, Blum HE, Becker M. Mutations of the serine protease inhibitor, Kazal type 1 gene, in patients with idiopathic chronic pancreatitis. Am J Gastroenterol. 2002 97(5):1133-7. 175. Hassan Z, Mohan V, Ali L, Allotey R, Barakat K, Faruque MO, Deepa R, McDermott MF, Jackson AE, Cassell P, Curtis D, Gelding SV, Vijayaravaghan S, Gyr N, Whitcomb DC, Khan AK, Hitman GA. SPINK1 is a susceptibility gene for fibrocalculous pancreatic diabetes in subjects from the Indian subcontinent. Am J Hum Genet. 2002 71(4):964-8. 176. Tukiainen E, Kylanpaa ML, Kemppainen E, Nevanlinna H, Paju A, Repo H, Stenman UH, Puolakkainen P. Pancreatic secretory trypsin inhibitor (SPINK1) gene mutations in patients with acute pancreatitis. Pancreas. 2005 30(3):239-42. 177. Schneider A, Pfutzer RH, Barmada MM, Slivka A, Martin J, Whitcomb DC. Limited contribution of the SPINK1 N34S mutation to the risk and severity of alcoholic chronic pancreatitis: a report from the United States. Dig Dis Sci. 2003 48(6):1110-5. 178. Perri F, Piepoli A, Stanziale P, Merla A, Zelante L, Andriulli A. Mutation analysis of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene, the cationic trypsinogen (PRSS1) gene, and the serine protease inhibitor, Kazal type 1 (SPINK1) gene in patients with alcoholic chronic pancreatitis. Eur J Hum Genet. 2003 11(9):687-92. 179. Chandak GR, Idris MM, Reddy DN, Mani KR, Bhaskar S, Rao GV, Singh L. Absence of PRSS1 mutations and association of SPINK1 trypsin inhibitor mutations in hereditary and non-hereditary chronic pancreatitis. Gut. 2004 53(5):723-8. 180. Lempinen M, Paju A, Kemppainen E, Smura T, Kylanpaa ML, Nevanlinna H, Stenman J, Stenman UH. Mutations N34S and P55S of the SPINK1 gene in patients with chronic pancreatitis or pancreatic cancer and in healthy subjects: a report from Finland. Scand J Gastroenterol. 2005 40(2):225-30.

83

Irodalomjegyzék

181. Ockenga J, Dork T, Stuhrmann M. Low prevalence of SPINK1 gene mutations in adult patients with chronic idiopathic pancreatitis. J Med Genet. 2001 38(4):243-4. 182. Kuwata K, Hirota M, Sugita H, Kai M, Hayashi N, Nakamura M, Matsuura T, Adachi N, Nishimori I, Ogawa M. Genetic mutations in exons 3 and 4 of the pancreatic secretory trypsin inhibitor in patients with pancreatitis. J Gastroenterol. 2001 36(9):612-8. 183. Kuwata K, Hirota M, Nishimori I, Otsuki M, Ogawa M. Mutational analysis of the pancreatic secretory trypsin inhibitor gene in familial and juvenile pancreatitis in Japan. J Gastroenterol. 2003 38(4):365-70. 184. Masson E, Le Marechal C, Chen JM, Frebourg T, Lerebours E, Ferec C. Detection of a large genomic deletion in the pancreatic secretory trypsin inhibitor (SPINK1) gene. Eur J Hum Genet. 2006 14(11):1204-8. 185. Le Marechal C, Chen JM, Le Gall C, Plessis G, Chipponi J, Chuzhanova NA, Raguenes O, Ferec C. Two novel severe mutations in the pancreatic secretory trypsin inhibitor gene (SPINK1) cause familial and/or hereditary pancreatitis. Hum Mutat. 2004 23(2):205. 186. Kume K, Masamune A, Kikuta K, Shimosegawa T. [-215G>A; IVS3+2T>C] mutation in the SPINK1 gene causes exon 3 skipping and loss of the trypsin binding site. Gut. 2006 55(8):1214. 187. Masamune A, Kume K, Takagi Y, Kikuta K, Satoh K, Satoh A, Shimosegawa T. N34S mutation in the SPINK1 gene is not associated with alternative splicing. Pancreas. 2007 34(4):423-8. 188. Gaia E, Salacone P, Gallo M, Promis GG, Brusco A, Bancone C, Carlo A. Germline mutations in CFTR and PSTI genes in chronic pancreatitis patients. Dig Dis Sci. 2002 47(11):2416-21. 189. Kuwata K, Hirota M, Shimizu H, Nakae M, Nishihara S, Takimoto A, Mitsushima K, Kikuchi N, Endo K, Inoue M, Ogawa M. Functional analysis of recombinant pancreatic secretory trypsin inhibitor protein with amino-acid substitution. J Gastroenterol. 2002 37(11):928-34. 190. Hirota M, Kuwata K, Ohmuraya M, Ogawa M. From acute to chronic pancreatitis: the role of mutations in the pancreatic secretory trypsin inhibitor gene. JOP. 2003 4(2):83-8. 191. Valmu L, Paju A, Lempinen M, Kemppainen E, Stenman UH. Application of proteomic technology in identifying pancreatic secretory trypsin inhibitor variants in urine of patients with pancreatitis. Clin Chem. 2006 52(1):73-81. 192. Witt H, Sahin-Toth M, Landt O, Chen JM, Kahne T, Drenth JP, Kukor Z, Szepessy E, Halangk W, Dahm S, Rohde K, Schulz HU, Le Marechal C, Akar N, Ammann RW, Truninger K, Bargetzi M, Bhatia E, Castellani C, Cavestro GM, Cerny M, Destro-Bisol G, Spedini G, Eiberg H, Jansen JB, Koudova M, Rausova E, Macek M Jr, Malats N, Real FX, Menzel HJ, Moral P, Galavotti R, Pignatti PF, Rickards O, Spicak J, Zarnescu NO, Bock W, Gress TM, Friess H, Ockenga J, Schmidt H, Pfutzer R, Lohr M, Simon P, Weiss FU, Lerch MM, Teich N, Keim V, Berg T, Wiedenmann B, Luck W, Groneberg DA, Becker M, Keil T, Kage A, Bernardova J, Braun M, Guldner C, Halangk J, Rosendahl J, Witt U, Treiber M, Nickel R, Ferec C. A degradation-sensitive anionic trypsinogen (PRSS2) variant protects against chronic pancreatitis. Nat Genet. 2006 38(6):668-73.

84

Irodalomjegyzék

193. Witt H, Hennies HC, Becker M. Gastroenterology. 2001 120(4):1060-1.

SPINK1 mutations in chronic pancreatitis.

194. Witt H. The SPINK in chronic pancreatitis: similar finds, different minds. Gut. 2002 50(5):590-1. 195. Tzetis M, Kaliakatsos M, Fotoulaki M, Papatheodorou A, Doudounakis S, Tsezou A, Makrythanasis P, Kanavakis E, Nousia-Arvanitakis S. Contribution of the CFTR gene, the pancreatic secretory trypsin inhibitor gene (SPINK1) and the cationic trypsinogen gene (PRSS1) to the etiology of recurrent pancreatitis. Clin Genet. 2007 71(5):451-7. 196. Audrezet MP, Chen JM, Le Marechal C, Ruszniewski P, Robaszkiewicz M, Raguenes O, Quere I, Scotet V, Ferec C. Determination of the relative contribution of three genes-the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene, the cationic trypsinogen gene, and the pancreatic secretory trypsin inhibitor gene-to the etiology of idiopathic chronic pancreatitis. Eur J Hum Genet. 2002 10(2):100-6. 197. Keim V. Genetisch determinierte Pankreatitis: Ein Modell für die Entstehung von Pankreaserkrankungen? Klinikarzt 2004 33(8+9):232–235 198. Le Marechal C, Audrezet MP, Quere I, Raguenes O, Langonne S, Ferec C. Complete and rapid scanning of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene by denaturing high-performance liquid chromatography (D-HPLC): major implications for genetic counselling. Hum Genet. 2001 108(4):290-8. 199. Schaffhausen B, Benjamin TL, Pike L, Casnellie J, Krebs E. Antibody to the nonapeptide Glu-Glu-Glu-Glu-Tyr-Met-Pro-Met-Glu is specific for polyoma middle T antigen and inhibits in vitro kinase activity. J Biol Chem. 1982 257(21):12467-70. 200. Grussenmeyer T, Scheidtmann KH, Hutchinson MA, Eckhart W, Walter G. Complexes of polyoma virus medium T antigen and cellular proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 1985 82(23):7952-4. 201. DuBridge RB, Tang P, Hsia HC, Leong PM, Miller JH, Calos MP. Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system. Mol Cell Biol. 1987 7(1):37987. 202. Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J. Gen. Virol. 1977 36:59-72. 203. Lebkowski JS, Clancy S, Calos MP. Simian virus 40 replication in adenovirus-transformed human cells antagonizes gene expression. Nature. 1985 317(6033):169-71. 204. Harper LV, Hilton AC, Jones AF. RT-PCR for the pseudogene-free amplification of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene (GAPD). Mol Cell Probes. 2003 17(5):261-5. 205. Chung CH, Ives HE, Almeda S, Goldberg AL. Purification from Escherichia coli of a periplasmic protein that is a potent inhibitor of pancreatic proteases. J Biol Chem. 1983 258(18):11032-8. 206. Lengyel Z, Pal G, Sahin-Toth M. Affinity purification of recombinant trypsinogen using immobilized ecotin. Protein Expr Purif. 1998 12(2):291-4.

85

Irodalomjegyzék

207. Pal G, Sprengel G, Patthy A, Graf L. Alteration of the specificity of ecotin, an E. coli serine proteinase inhibitor, by site directed mutagenesis. FEBS Lett. 1994 342(1):57-60. 208. Neu HC, Heppel LA. The release of enzymes from Escherichia coli by osmotic shock and during the formation of spheroplasts. J Biol Chem. 1965 240(9):3685-92. 209. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951 193(1):265-75. 210. Saitoh H, Pu RT, Dasso M. SUMO-1: Wrestling with a new ubiquitin-related modifier. Trends Biochem. Sci. 1997 22:374-376. 211. Li SJ, Hochstrasser M. A new protease required for cell-cycle progression in yeast. Nature 1999 398:246-251. 212. Mossessova E, Lima CD. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory essential for cell growth in yeast. Molecular and Cellular Biology 2000 20:2367-2377. 213. London JW, Shaw LM, Garfinkel D. Progress curve algorithm for calculating enzyme activities from kinetic assay spectrophotometric measurements. Anal Chem. 1977 49(12):1716-9. 214. Nielsen H, Engelbrecht J, Brunak S, von Heijne G. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Eng. 1997 10:1-6. 215. Keiles S, Kammesheidt A. Identification of CFTR, PRSS1, and SPINK1 mutations in 381 patients with pancreatitis. Pancreas. 2006 33(3):221-7. 216. von Heijne G. The signal peptide. J Membr Biol. 1990 115(3):195-201. 217. Arnold A, Horst SA, Gardella TJ, Baba H, Levine MA, Kronenberg HM. Mutation of the signal peptide-encoding region of the preproparathyroid hormone gene in familial isolated hypoparathyroidism. J Clin Invest. 1990 86(4):1084-7. 218. Green PM, Mitchell VE, McGraw A, Goldman E, Giannelli F. Haemophilia B caused by a missense mutation in the prepeptide sequence of factor IX. Hum Mutat. 1993 2(2):103-7. 219. Seppen J, Steenken E, Lindhout D, Bosma PJ, Elferink RP. A mutation which disrupts the hydrophobic core of the signal peptide of bilirubin UDP-glucuronosyltransferase, an endoplasmic reticulum membrane protein, causes Crigler-Najjar type II. FEBS Lett. 1996 390(3):294-8. 220. Ozawa T, Takikawa Y, Niiya K, Ejiri N, Suzuki K, Sato S, Sakuragawa N. Factor VII Morioka (FVII L-26P): a homozygous missense mutation in the signal sequence identified in a patient with factor VII deficiency. Br J Haematol. 1998 101(1):47-9. 221. Kato M, Nanba E, Akaboshi S, Shiihara T, Ito A, Honma T, Tsuburaya K, Hayasaka K. Sonic hedgehog signal peptide mutation in a patient with holoprosencephaly. Ann Neurol. 2000 47(4):514-6. 222. Lanza F, De La Salle C, Baas MJ, Schwartz A, Boval B, Cazenave JP, Caen JP. A Leu7Pro mutation in the signal peptide of platelet glycoprotein (GP)IX in a case of

86

Irodalomjegyzék

Bernard-Soulier syndrome abolishes surface expression of the GPIb-V-IX complex. Br J Haematol. 2002 Jul;118(1):260-6. 223. Rajpar MH, Koch MJ, Davies RM, Mellody KT, Kielty CM, Dixon MJ. Mutation of the signal peptide region of the bicistronic gene DSPP affects translocation to the endoplasmic reticulum and results in defective dentine biomineralization. Hum Mol Genet. 2002 11(21):2559-65. 224. Pidasheva S, Canaff L, Simonds WF, Marx SJ, Hendy GN. Impaired cotranslational processing of the calcium-sensing receptor due to signal peptide missense mutations in familial hypocalciuric hypercalcemia. Hum Mol Genet. 2005 14(12):1679-90. 225. Jessop NW, Hay RJ. Characteristics of two rat pancreatic exocrine cell lines derived from transplantable tumors. In Vitro 1980 16:212. 226. Boulling A, Le Marechal C, Trouve P, Raguenes O, Chen JM, Ferec C. Functional analysis of pancreatitis-associated missense mutations in the pancreatic secretory trypsin inhibitor (SPINK1) gene. Eur J Hum Genet. 2007 15(9):936-42. 227. Chaudhuri TK, Paul S. Protein-misfolding diseases and chaperone-based therapeutic approaches. FEBS J. 2006 273(7):1331-49.

87

11 SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Az értekezés anyagát képező közlemények: I.

Király O, Wartmann T, Sahin-Tóth M. Missense mutations in pancreatic secretory trypsin inhibitor (SPINK1) cause intracellular retention and degradation. Gut 2007 56(10):1433-38. (IF.: 7,692)

II.

Király O, Boulling A, Witt H, Le Maréchal C, Chen J-M, Rosendahl J, Battaggia C, Wartmann T, Sahin-Tóth M, Férec C. Signal peptide mutations that impair secretion of pancreatic secretory trypsin inhibitor (SPINK1) cause autosomal dominant hereditary pancreatitis. Human Mutation 2007 28(5):469-76. (IF.: 7,923)

Az értekezés témájához szorosan nem kapcsolódó közlemények: III.

Király O, Guan L, Szepessy E, Tóth M, Kukor Z, Sahin-Tóth M. Expression of human cationic trypsinogen with an authentic N terminus using intein-mediated splicing in aminopeptidase P deficient Escherichia coli. Protein Expr Purif. 2006 48(1):104-11. (IF.: 1,553)

IV.

Kereszturi E, Király O, Csapó Z, Tárnok Z, Gádoros J, Sasvári-Székely M, Nemoda Z. Association between the 120-bp duplication of the dopamine D4 receptor gene and Attention Deficit Hyperactivity Disorder: Genetic and molecular analyses. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2007 144(2):231-6. (IF.: 3,521)

V.

Kereszturi E, Király O, Barta C, Molnár N, Sasvári-Székely M, Csapó Z. No direct effect of the -521 C/T polymorphism in the human dopamine D4 receptor gene promoter on transcriptional activity. BMC Mol Biol. 2006 7:18. (IF.: 4,485)

VI.

Szántai E, Király O, Nemoda Z, Kereszturi E, Csapó Z, Sasvári-Székely M, Gervai J, Rónai Z. Linkage analysis and molecular haplotyping of the dopamine D4 receptor gene promoter region. Psychiatr Genet. 2005 15(4):259-70. (IF.: 2,366)

88

12 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Szeretném köszönetemet kifejezni: Prof. Mandl Józsefnek, a Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézete igazgatójának, amiért tanulmányaimat a Pathobiokémia doktori programban folytathattam és az általa vezetett intézetben dolgozhattam; Dr. Sahin-Tóth Miklósnak, témavezetőmnek, amiért tézismunkámat laboratóriumában végezhettem, valamint tanácsaiért, humoráért és kritikájáért; Dr. Sasvári Máriának, amiért PhD-hallgatóként a Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézetében laboratóriumába felvett és munkacsoportjában, az ő irányítása alatt kezdhettem meg doktoranduszi munkámat; A Sahin-Tóth-laboratórium volt és jelenlegi tagjainak: Sahin-Tóth Verának, Dr. Nemoda Zsófiának, Dr. Szepessy Editnek, Ózsvári Bélának és Dr. Szmola Richárdnak szakmai segítségükért és a mindennapi jó hangulatért; A Sasvári-laboratórium tagjainak: Dr. Rónai Zsoltnak és Dr. Barta Csabának tanácsaikért és humorukért, Dr. Kereszturi Évának és Dr. Csapó Zsoltnak a jó hangulatú közös munkáért és barátságukért, Virga Sándornénak és Dr. Szpaszokukockaja Tatjánának kedvességükért és segítségükért; Kollaborációs partnereinknek a genetikai adatokért, valamint a vizsgálati személyeknek a vizsgálatokban való részvételért; Valamint Dr. Keszler Gergelynek és Dr. Wunderlich Liviusnak (Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani Intézet) illetve Mihai Nita-Lazarnak és Sheede Khalilnak (Boston University) barátságukért, biztatásukért és tanácsaikért.

89

A HASNYÁLMIRIGY EREDETŰ TRIPSZIN INHIBITOR (SPINK1) PATHOBIOKÉMIÁJA

Recommend Documents