Trypsinum 1
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.3 -
01/2009:0694
TRYPSINUM Tripszin [9002-07-7] DEFINÍCIÓ A tripszin proteolitikus enzim, melyet az egészséges emlõsök hasnyálmirigyébõl kivont tripszinogén aktiválásával nyernek. Szárított anyagra vonatkoztatott hatóértéke legalább 0,5 mikrokatal/mg. Oldatban az enzim aktivitása pH 8-nál maximális; az aktivitás pH 3-nál – ahol a tripszin a legstabilabb – reverzibilisen gátolt.
ELÕÁLLÍTÁS A tripszin elõállítására felhasznált állatoknak meg kell felelniük az emberi fogyasztásra alkalmas állatok egészségi állapotára vonatkozó követelményeknek. Igazolni kell, hogy az elõállítási eljárás milyen mértékben biztosította a szennyezõ vírusok vagy más fertõzõ ágensek inaktiválását, illetve eltávolítását. Az elõállítási módszer validálásával bizonyítani kell, hogy a termék – vizsgálat esetén – megfelelne a következõ vizsgálat követelményének: Hisztamin (2.6.10): legfeljebb 1 g hisztamin bázis/0,2 mikrokatal tripszinaktivitás. A vizsgálandó anyag R 0,0015 M borát–tompítóoldattal (pH 8,0) készült 10 g/l töménységû oldatát használjuk, melyet vízfürdõn 30 percig melegítve inaktiválunk. A hígításokat R nátrium-klorid 9 g/l töménységû oldatával készítjük.
SAJÁTSÁGOK
Trypsinum 2
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.3 -
Fehér vagy csaknem fehér, kristályos vagy amorf por. Vízben mérsékelten oldódik. Az amorf forma nedvszívó.
AZONOSÍTÁS A. Az S oldat 1 ml-ét (lásd „Vizsgálatok”) R vízzel 100 ml-re hígítjuk. A kapott oldat 0,1 ml-éhez egy fehér cseppentõ lemez mélyedésében 0,2 ml R (N-tozil-Larginin-metil-észter)-hidroklorid–oldatot elegyítünk. 3 percen belül vörösesibolya színezõdés keletkezik. B. 0,5 ml S oldatot R vízzel 5 ml-re hígítunk. A hígított oldathoz R (N-tozil-L-lizilklórmetán)-hidroklorid 20 g/l töménységû oldatának 0,1 ml-ét elegyítjük. Az oldat pH-ját 7,0-re állítjuk be, majd két órán keresztül rázatjuk, végül R vízzel 50 ml-re hígítjuk. Az így kapott oldat 0,1 ml-éhez egy fehér cseppentõ lemez mélyedésében 0,2 ml R (N-tozil-L-arginin-metil-észter)-hidroklorid–oldatot elegyítünk. 3 percen belül nem keletkezik vöröses-ibolya színezõdés.
VIZSGÁLATOK S oldat. 0,10 g anyagot R szén-dioxid-mentes vízzel 10,0 ml-re oldunk. Az oldat külleme. Az S oldat opálossága nem lehet erõsebb, mint a III. számú összehasonlító-szuszpenzióé (2.2.1). pH (2.2.3): 3,0 – 6,0. Az S oldatot vizsgáljuk. Abszorbancia (2.2.25): 30,0 mg anyagot 0,001 M sósav–mérõoldattal 100,0 ml-re oldunk. Az oldat spektrumát vizsgálva, 280 nm-en abszorpciós maximum, 250 nmen abszorpciós minimum található. Az abszorpciós maximumon mért fajlagos abszorpciós koefficiens ( A11%cm ): 13,5–16,5, az abszorpciós minimumon mért fajlagos abszorpciós koefficiens legfeljebb 7,0 lehet. Kimotripszin. 1,8 ml R tompítóoldathoz (pH 8,0) 7,4 ml R vizet és 0,5 ml R 0,2 M acetiltirozin-etil-észter–oldatot adunk. Rázogatás közben az oldathoz 0,3 ml S oldatot adunk, és elindítjuk a stopper órát. Pontosan 5 perc múlva megmérjük az oldat pH-ját (2.2.3) (vizsgálati oldat). Az összehasonlító oldatot azonos módon, de az S oldat helyett BRP kimotripszin 0,5 g/l töménységû oldatának 0,3 ml-ét
Trypsinum 3
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.3 -
alkalmazva készítjük el. A kimotripszin hozzáadása után pontosan 5 perccel megmérjük az elegy pH-ját (2.2.3). A vizsgálati oldat pH-ja legyen magasabb az összehasonlító oldat pH-jánál. Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 5,0%. 0,500 g anyagot szárítószekrényben, 670 Pa-t meg nem haladó nyomáson, 2 órán keresztül, 60 °C-on szárítunk. Mikrobiológiai szennyezés TAMC: elfogadhatósági követelmény: 104 CFU /g (2.6.12). TYMC: elfogadhatósági követelmény: 102 CFU /g (2.6.12). Escherichia coli nem lehet jelen (2.6.13). Salmonella nem lehet jelen (2.6.13).
TARTALMI MEGHATÁROZÁS A tripszin aktivitását úgy határozzuk meg, hogy összehasonlítjuk R benzoilargininetil-észter-hidroklorid-hidrolizáló sebességét, a BRP tripszin ugyanolyan körülmények között ugyanerre az anyagra mért hidrolizáló sebességével. Készülék. Kb. 30 ml térfogatú, a következõ tartozékokkal ellátott reakcióedény:
termosztát, mely a hőmérsékletet 25,0 ± 0,1 °C-on tartja,
keverő (pl. mágneses keverő),
az elektródok, a büretta-hegy és a nitrogén-bevezető cső behelyezésére és a reagensek hozzáadására alkalmas lyukakkal ellátott fedél.
Automatikus vagy kézi titráló eszközt egyaránt lehet alkalmazni. Kézi titrálás esetén a büretta 0,005 ml beosztású legyen, és széles mérési tartománnyal rendelkezõ, üveg-kalomel vagy üveg-ezüst-ezüst-klorid elektródokkal felszerelt pH-mérõt használjunk. Vizsgálati oldat. 0,001 M sósav–mérõoldatban annyi anyagot oldunk, hogy a 25,0 ml-re hígított oldat aktivitása végül milliliterenként megközelítõleg 700 nanokatal legyen.
Trypsinum 4
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.3 -
Összehasonlító oldat. 25,0 mg BRP tripszint 0,001 M sósav–mérõoldattal 25,0 mlre oldunk. Az oldatokat 0–5 °C-on tároljuk. Az oldatok 1–1 ml-ét 15 perc alatt kb 25°C-ra melegítjük, és az egyes titrálásokhoz az oldatokból 50–50 l-t használunk fel. A titrálást nitrogénatmoszférában végezzük. 10,0 ml R 0,0015 M borát tompítóoldatot (pH 8,0) mérünk a reakcióedénybe és keverés közben R benzoilarginin-etil-észterhidroklorid frissen készített 6,86 g/l töménységû oldatának 1,0 ml-ével elegyítjük. Amikor a hõmérséklet 25,0 ± 0,1 °C-ra beállt (kb. 5 perc után), 0,1 M nátriumhidroxid–oldattal pontosan 8,0-ra állítjuk az oldat pH-ját. Ezután 50 µl vizsgálati oldatot mérünk hozzá, és elindítjuk a stoppert. A mikrobüretta hegye merüljön az oldatba, melynek pH-ját 0,1 M nátrium-hidroxid–oldat hozzáadásával pH 8,0-on tartjuk. A hozzáadott mérõoldat-térfogatot 30 másodpercenként feljegyezzük. A reakciót 8 percig figyeljük. Kiszámítjuk a másodpercenként hozzáadott 0,1 M nátrium-hidroxid–mérõoldat-térfogatot. A titrálást – azonos módon – az összehasonlító oldat alkalmazásával is elvégezzük, és kiszámítjuk a másodpercenként hozzáadott 0,1 M nátrium-hidroxid–mérõoldat-térfogatot. A mikrokatal/mg-ban kifejezett aktivitást az alábbi összefüggés alapján számoljuk: m'V A m V'
m m' V V' A
= a vizsgálandó anyag tömege milligrammban, = a BRP tripszin tömege milligrammban, = a vizsgálati oldat esetében a másodpercenként hozzáadott 0,1 M nátrium-hidroxid–mérőoldat térfogata, = az összehasonlító oldat esetében a másodpercenként hozzáadott 0,1 M nátrium-hidroxid–mérőoldat térfogata, = a BRP tripszin mikrokatal/mg-ban kifejezett aktivitása.
ELTARTÁS Légmentesen záró tartályban, fénytõl védve, 2–8 °C-on.
Trypsinum 5
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.3 -
FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni a aktivitást, mikrokatal/mg-ban kifejezve.
