Ecsedi Anita Beatrix MSC 1. évfolyam PWIDND
LC*LC rendszerek (Kétdimenziós folyadékkromatográfiás rendszerek rövid ismertetése)
1
1. Bevezetés A kromatográfiás technikáknak egyik fajtája a kétdimenziós kromatográfia. Az injektált minta két különböző szeparációs fázison megy keresztül.
Általában a második kolonna
különböző szeparációs mechanizmus szerint működik, mint az első. Ez lehetővé teszi azt, hogy azok a komponensek, amik nem tudnak szétválni az első dimenzióban, a másodikban más elválasztási mechanizmus segítségével el tudjanak válni egymástól. Általában a két kolonnát két különböző hőmérsékleten is üzemeltetik. A kétdimenziós szeparációt a gázkromatográfiában és a folyadékkromatográfiában is használják. A rengeteg természetes és szintetikus minta komplexitása által elvárt szeparációs hatékonyságot már nem tudja biztosítani egyetlen egy kolonna. A szeparáció szelektivitását befolyásolni tudjuk a mozgó fázis összetételével, a pH-val, ionpár-képző használatával, az áramlási sebességgel és a hőmérséklettel. Ha a két kolonnában szignifikánsan különböző pH értéket alkalmazunk, akkor növelhetjük a szelektivitást. A felbontás maximalizálása fontos az MS-be történő bevezetés előtt az ionszuppresszió miatt is. Különböző stratégiákat fejlesztettek ki az újrainjektáláshoz az első kolonnából a másodikba. A két fő interfész kategória az off-line és az on-line módszerek. Fő célja a kétdimenziós kromatográfiának annak elérése, hogy rengeteg csúcsot el tudjunk választani és azonosítani komplex mintákból, úgy hogy ne legyen szükségünk extrém hatékony szeparációra egyik kolonnában sem. Például egy 100 retenciós tényezővel rendelkező kolonna 10 perces szeparációs idővel és egy 5 retenciós tényezőjű kolonna együtt már k1*k2= 500-as k-val rendelkezik. A 2D-LC szemléltetése az 1. ábrán látható.
1.ábra: 2D-LC
2
2. Felhasználás a.
Proteinek szekvenciájának meghatározása (proteomika) 1
A proteinek mérésében az utóbbi évtizedben az MS egy fontos analitikai eszközzé vált. A proteinek (fehérjék) fontos szerepet játszanak számos biológiai folyamatban. A proteineket az analízis során/előtt lebontják peptidekké, hogy könnyebben kezelhetőek legyenek (bottom up stratégia). Ezt követően a peptideket tandem MS-el kapcsolt LC rendszerekkel határozzák meg. A peptideknek nagyon komplikált a biológia struktúrájuk, ezért szükség van egy hatékony és magas felbontóképességgel rendelkező szeparációs módszerre. A különböző peptidek jobb elválasztásához multidimenziós LC rendszereket fejlesztettek ki az elmúlt években. Ezzel a HPLC rendszerrel az ionforrásban a felmerülő ionszupressziót lecsökkenthetjük és az ionizáció hatékonyságát megnövelhetjük. A proteineket először elemésztették tripszinnel és utána a keletkezett peptideket injektálták a kolonnákra. A molekuláris tömegüket megmérve meglehet jósolni a proteinek szekvenciáját és azonítani is lehet őket. MALDI TOF-MS-t gyakran használnak detektálásra. Főleg amiatt, mert gyorsan végrehajtható a segítségével a detektálás.
Az utóbbi időben
kifejlesztett lineáris ion csapda MS (IT-MS) nagyon érzékeny és gyors detektálási technikát eredményezett. 10MS/MS spektrumot tud gyűjteni 1-2 másodperc alatt 5-ször nagyobb érzékenységgel, mint az azelőtti 3D IT-MS berendezések. Ez a szkennelési sebesség növekedés
azt
eredményezi,
hogy
keskenyebb
csúcsszélességeket
tudunk
mérni.
Következtetésképpen a proteome lefedettség nőhet. A szeparáció hatékonysága kétségkívül fontos szerepet játszik abban, hogy fel tudjuk venni a megfelelő információval rendelkező spektrumokat. Ha sok peptid eluálódik együtt, akkor ionizációs szupresszió jelentkezhet az ESI-ben a nagyhatékonyságú elválasztási módszer ellenére is. Amikor két különböző szeparációs mechanizmuson alapul az összekapcsolt rendszer, akkor a 2D rendszer ortogonális (derékszögű). A csúcs elválasztási kapacitását P-vel jelöljük, ekkor a rendszer csúcs elválasztási kapacitása egyenlő az egyes kolonnákra érvényes P-k szorzataival. A megfelelő ortogonalitás csak akkor érhető el, ha teljesen különböző mechanizmus alapján működik a két rendszer. Például ha a molekula töltése, hidrofobicitása vagy a molekula mérete alapján szeparálunk. A valóságban ez sohasem érhető el, mert nem létezik olyan elválasztási mechanizmus, mely a másiktól teljes mértékben független. Számos kombinációt írtak le, mely növeli az összegzett kapacitását a rendszernek. Jó néhány kombinációnak az MS rendszerrel történő összekapcsolhatósága szab határt. Az utolsó 3
szeparációs lépés, mely közvetlenül össze van kapcsolva az MS-el, az az RPLC. Az RPLC biztosítani tudja a megfelelő felbontást és a megfelelő mozgó fázist az ESI-vel és az MS-el történő összekapcsolhatósághoz. Az RP kolonnában hidrofób kölcsönhatás alakul ki a peptidek és az állófázis között. A leggyakrabban használt állófázis a C 18-as RP (ODS, oktadecilszilika). A peptideket alacsony szerves oldószer tartalom mellett injektálják a kolonnára. Ahogy növeljük a szerves oldószer tartalmat a peptidek úgy eluálódnak le az állófázisról, a hidrofób kölcsönhatás erősségének sorrendjében. A legfőbb cél a multidimenziós elválasztási rendszer kifejlesztésének az volt, hogy maximalizálják a csúcs elválasztási kapacitást, olyan kolonnák összekapcsolásával, melyek különböző mechanizmus alapján szeparálják a peptideket.
A peptidek meghatározásában általában az RP
kromatográfiát használják második dimenzióként. Első dimenzióként használják:
SEC (méretkizárásos kromatográfia)
SDS-PAGE (sodiumdodecylsulfate polyacrylamide gelelectrophoresis)
SCX (Strong-Cation-Exchange)
IEF (isoelectric-focusing)
Az első dimenzió terhelhetőségi kapacitással kell rendelkezzen. Összeegyeztethető kell legyen a második dimenzióval és a használt oldószer kompatibilis kell legyen a második módszerrel. Jó néhány első dimenziós módszer megfelel ezeknek a kritériumoknak, de van egy pár amelyeket off-line módban szükséges üzemeltetni. Az SDS-PAGE a proteinek szintjén választ el az első dimenzióban, majd a peptidek a második dimenzióban szeparálódnak szét. Az IEF a proteinek és a peptidek szintjén is tud frakcionálni. A legnagyobb körben elterjedt összekapcsolás: az SCX és az RP kolonnákból felépülő multidimenziós rendszerek. Az SCX peptid visszatartása elektrosztatikus kölcsönhatáson alapul. Szulfonil végű csoportokkal vonják be a felületét a gyantának és ezzel kialakítanak egy erős negatív töltést, ami ellenáll a pH változásának. Alacsony pH-n (<4) blokkolva van a peptidek karboxil csoportjának disszociációja és ez elősegíti a kölcsönhatást a protonált aminosav maradékok (pozitívan töltött) és a szulfonát csoportok között az SCX gyantán. A peptideket növekedő sókoncentráció („buffersalt”) erősséggel eluáltatjuk, ami megszünteti a kölcsönhatást a peptidek és a szulfonát csoportok között. A hidrofobicitás csökkentése és a peptidek denaturálódásának elősegítése érdekében 10-15% szerves modifikátort adagolnak az elúciós pufferhez. További lehetséges LC*LC rendszer típusok találhatóak az első táblázatban.
4
1. táblázat: Lehetséges LC*LC rendszerek a proteomikában6 Off-line vagy on-line üzemeltetés: mindkét variációnak vannak előnyei és hátrányai is. A frakciók gyűjtése az offline multidimenziós elválasztásokra jellemző. Az összegyűjtött frakciókat injektálják a második dimenzióba. Ez a megközelítés akkor ajánlott, amikor nagyon komplex a minta és viszonylag nagyobb mennyiség áll rendelkezésünkre belőle (pl. plazma). Függetlenül egymástól lehet optimalizálni a dimenziókat, emiatt flexibilisebb, mint az online rendszerek. Fontos szempont a második dimenziónak a szerves oldószerrel szembeni tűrőképessége is. Az SCX gyanták használatakor 20-25% szerves modifikátort 5
adagolnak az eluensbe. A nagy szerves koncentráció nem megfelelő az on-line üzemeltetésnél (2. ábra b) és c)), mert megszünteti a hidrofób kölcsönhatást a peptid és az RP állófázisa között. Az oldószert el kell távolítani vagy le kell csökkenteni a szerves oldószer koncentrációját a frakciónak mielőtt a második kolonnába injektálnánk. Az off-line módszer hátránya a nehéz automatizálhatóság, a szennyeződések és a mintavesztések lehetősége. Az on-line analízisnél automatikus az analit transzfer a két dimenzió között és nincsen áramlás megszakítás. A két dimenzió között vagy egy áramlás váltó szelep foglal helyet (2. ábra b)), vagy a kolonnák integrálva vannak (2 ábra c)). A mintaveszteség és a szennyeződés kevésbé lehetséges, mint az off-line rendszereknél. Könnyebben automatizálható.
Az
oldószer-váltó szelep használatakor egy középső kolonnát is behelyezhetnek. Az integrált kolonnákhoz képest ez a megoldás sokkal flexibilisebb. Az oldószer-váltó hátránya, hogy lehetséges szennyeződéshez vagy mintavesztéshez vezethet. Az integrált kétfázisú rendszer egy egyszerű konstrukció. Például: az első 10-15 cm-e a kolonnának RP állófázissal van töltve. Ezt követi 3-5cm ioncserélő állófázis, általában SCX. A végső töltete az RP-nek kiegészítő elválasztási részként viselkedik. Az on-line mód használata akkor javasolt, ha a minta mennyisége kicsi és a veszteségeket minimalizálni kell.1,6
6
2. ábra: Az off-line(a) és az on-line üzemeltetés (b,c)1
7
b. A foszfolipidek analízise2 LC*LC rendszereket használtak foszfolipid molekula fajták jellemzésére. Hat foszfolopid osztályt határoztak meg. HILIC kolonnát használtak első dimenzióként, melyet RP C18-as kolonna követett. A frakciók átviteléhez az első dimenzióból a másodikba egy két-pozíciós 10 beömlőnyílással rendelkező szelepkapcsolót használtak (two-positionen-port switching valve). Az áramlást megállítva működtették (stop-flow üzemmód). Tehéntej és plazma mintákon tesztelték a rendszer szeparációs készségét. A foszfolipidek a zsírok egy különleges csoportjába tartoznak. Tagjainál a molekula egy része (a "fej") erősen poláros és így a legtöbb zsírral ellentétesen vízoldékony (hidrofil). A fennmaradó
hosszú, apoláros szénlánc
nem
vízoldékony
(hidrofób).
A
különböző foszfolipidek különböző feji résszel rendelkeznek, melynek következtében komplex mintákhoz jutunk. Számos analitikai módszer fejlesztettek ki a különböző foszfolipid osztályok jellemzésére. Például a TLC-t (vékonyréteg kromatográfia), a GC-t és a HPLC-t is üzemeltették a különböző osztályok azonosításához. A normál fázisú kromatográfiás oszlopok a poláris feji rész alapján választják el a foszfolipideket. A fordított fázisú állófázis az apoláris lánc hosszúsága és a telítettségi szintje alapján szeparálja a molekulákat. Az élelmiszerekben és a biológiai mintákban történő meghatározások detektálásához újabban ESI-MS-t vagy MS/MS-t használnak. A különböző foszfolipidek jobb elválasztási lehetősége, amit a két dimenzió lehetővé tesz, elősegíti az ionizáció hatékonyságának növekedését és csökkenti a minta komplexitását a tömegspektrométerben. Az első dimenzióhoz HILIC kolonnát használtak (15*2,1mm, 2,7 μm). Az injektálási térfogat 10μl volt. Az A mozgó fázisként acetonitrilt áramoltattak, mely 10mM ammóniumformiátot tartalmazott (pH:5,5). B mozgófázisként acetonitril/ metanol/ ammónium-formiát (10mM) 55:33:10 elegyét eluáltatták (pH:5,5). Az A és a B mozgófázist 90:10 arányban áramoltatták. Az áramlási sebesség 0,1 ml/perc volt. A gradiens profilja: 0-5 perc, 0%B, 5-10 perc, 0-100% B, 10-35 perc, 100%B, 36 perc, 0% B. A második dimenzióhoz C18-as kolonnát alkalmaztak (15cm*4,6 mm, 2,7 μm). Az A mozgófázis ammónium formiát (10mM, pH 5,5)/izopropanol/ tetrahidrofurán 30:55:15 arányú elegyéből állt. A B mozgófázis az acetonitril volt és végig izokratikus körülmények között folyt a meghatározás (40% B). Az áramlási sebesség 0,9 ml/perc volt. Egy T-elágazáson keresztül lecsökkentették 0,3ml/perc-re az áramlási sebességet az MS detektálás miatt. ESI ionforrást alkalmaztak. 8
Egymástól függetlenül optimalizálták a két szeparációs rendszert. A két rendszer együtt egyidejűleg szeparálja el a foszfolipid osztályokat (HILIC) és a molekuláris formákat az egyes osztályokon belül (RP). On-line üzemeltették a kétdimenziós rendszert, így nőtt a reprodukálhatóság, a működtetés megbízhatósága és kevesebb volt a veszély az analit degradációjára. Általában a második dimenziónál nagy szeparációs sebesség az elvárt. Stopflow módszer az ajánlott, ha a második dimenzió nem tudja tartani a lépést az első dimenzió sebességével. Mindkét dimenzió kapcsolatban volt a két-pozíciójú 10 beömlőnyílással rendelkező szeleppel/ tárolóval (2-position ten port valve) és egy 100 μl nagyságú minta hurokkal. Itt nincsen „trapping” kolonna. Ennek a rendszernek a feladata a minták gyűjtése és reinjektálása. Az elrendezés a 3. ábrán látható. 2,6
3.ábra. A: töltési pozíció, B: injektálási pozíció2
A töltési pozícióban az első kolonnából a kiömlő anyagokat belevezették a hurokba („loop”-ba). Az injektálási szakaszban a hurkot és a második kolonnát közvetlenül összekapcsolták és az összegyűjtött anyag a hurokból a második kolonnára injektálódott. Amikor a kívánt frakció átvitele befejeződött az interfész visszakapcsolt és az első dimenzió áramlását megszakították, hogy hagyják a frakció szeparálódását végbemenni a második kolonnán. Amikor befejeződött a szeparáció a D2-ben visszakapcsolták a D1mozgófázis áramlását, hogy a következő frakció betöltődjön. Az egész procedúrát annyiszor ismételték meg, amennyiszer csak szükséges volt. A stop-flow technikának a használata sok előnnyel jár. Például hosszabb, hatékonyabb kolonnákat is használhatunk második dimenzióként. A 9
második dimenzióban magasabb hőmérsékletet alkalmaztak, hogy megnöveljék az analízis sebességét (65°C). Hátránya, hogy lassabb, mint a folytonos áramlásos on-line módszerek. 2,6 c. Blokk kopolimerek kromatográfiás analízise3 A kétdimenziós folyadékkromatográfiát egy normál fázisú (NPLC) és egy fordított fázisú (RPLC) kolonnával üzemeltették. A molekuláris tömeg eloszlását térképezték fel a polisztirolblokk-poliizoprén (PS-b-PI) kopolimer egyéni blokkokjainak. Az első dimenzióban az NPLC szeparálta a PS-b-PI-t a PS blokk hosszúsága függvényében, míg a második dimenzióban az RPLC a PI blokk hosszúsága alapján frakcionált. Mielőtt beinjektálták volna a második kolonnába az analitot az elsőből csapdázást alkalmaztak (,,trap” column). Ez a megoldás egy hatékony interfésznek bizonyult, melynek segítségével koncentrálták a mintát a második dimenzióba
juttatása
előtt.
Közel
200
különböző
blokk
kopolimer
fajtát
lehet
megkülönböztetni a 2D-LC kromatogram segítségével. A legtöbb eddig feljegyzett cikkben a szintetikus polimerek szeparáláshoz első dimenzióként olyan állófázist használtak, mellyel a kémiai heterogenitás alapján tudták frakcionálni a polimereket (IC). A második dimenzióként általában méretkizárásos kromatográfiát üzemeltettek (SEC). Ennek az oka egyszerűen az volt, hogy a SEC használata terjedt el széleskörűen a polimerek karakterizálásra. A SEC-el történő analízist gyorsan ellehet végezni. A kémiai összetételre viszont ez a módszer nem volt érzékeny. Az IC használata második dimenzióként már előnyösebb, mivel ez érzékeny a kémiai összetételre a megfelelő körülmények mellett. Például az IC*IC 2D-LC analízis során elválasztották a független blokkokat egymástól az alkohol etoxilát és az etilénoxid-propilénoxid kopolimerben. Az IC*IC rendszerhez NPLC-t és RPLC-t használtak. Ez ilyen IC*IC szeparációs rendszerek gyakran szenvednek a mozgófázisok inkompatibilitásától. Az IC szeparációknál az eluens nem egy erős oldószer. Ha az első dimenzióban az eluens erősebb, mint a másodikban, akkor a polimer minták nem szeparálódnak a második dimenzióban és együtt eluálódnak az injektált oldószerrel, mint egy oldószer dugó. Az egyik megoldás az, hogy gyengébb oldószert adunk az első dimenzióból kiömlő frakcióhoz mielőtt beinjektáljuk a második dimenzióba. A másik módszer arra, hogy kiküszöböljük az eluensek inkompatibilitását az, hogy „trap” kolonnát alkalmazunk arra, hogy kicseréljük az oldószereket. A közvetlen interfész használatakor csak egy kis mennyiséget tudunk átinjektálni az egyik kolonnából a másikba, ezért érzékeny detektálási rendszerre van szükség. Az első dimenzióból kiömlő frakció csapdázása, „trappingelése” hatékonyan tudja koncentrálni a mintát a második dimenzióba történő injektálás előtt. 10
A kopolimerek precíz karakterizálásához szükség van a molekuláris tömeg eloszlásának (MWD) és a kémiai összetétel eloszlásának ismeretére is (CCD). Ez sokkal bonyolultabb, mint a homopolimerek analízise. Az offline NPLC*RPLC képes frakcionálni a PS-b-PI kopolimer független blokkjait. Ebben a cikkben egy online analízist végeztek el. Az online teljes szorpciós/ deszorpciós módszerrel az eluenst lecserélték és koncentrálták a frakciókat a második kolonnába való injektálás előtt. Anionos polimerizációval állították elő a kopolimereket. Az első dimenzióhoz egy 250*7,8 mm-es és 7μm-es szilika állófázissal rendelkező kolonnát használtak. Ez a normál-fázisú kolonna egy hőmérséklet gradiens kölcsönhatás kromatográfiás kolonna volt (TPIC). A mozgófázis izooktán/THF elegye volt (97:3 v/v). Az RPLC-hez C18-asszilika kolonnát alkalmaztak (5μm, 150*4,6mm). A mozgófázisként CH2Cl2/CH3CN 53:47 arányú elegyét áramoltatták. Az első dimenzióban az áramlási sebesség 0,05ml/perc, a második dimenzióban 1,5ml/perc volt. A berendezés sematikus rajza a 4. ábrán látható.
3.
ábra: NP-TGIC és RPLC használatakor a 2D-LC sematikus elrendezése. 3 4.
Csapdázó (trap) kolonnaként két C18-as szilikával töltött kolonnát alkalmaztak. A komponens átjuttatásának a második kolonnába a kulcsa a két darab váltó (switching valve) és 11
a két darab „trap” kolonna volt. Az első tíz beömlő nyílással rendelkező váltó két 100μl-es hurokkal volt kölcsönhatásban. Mindkettő 2 percig tárolta első dimenzióból kiömlő frakciót. A hurkok méretének kiválasztásakor figyelembe kell venni, hogy a keresett minta frakciója beleférjen. Miközben az első hurok töltődött a második hurokban tárolt frakciót CH3CN-el kimosták és az első csapdázó (trap) kolonnába vezették be, mely a második 10 beömlő nyílással rendelkező váltóhoz csatlakozott. Ugyanekkor a második csapdázó kolonnában tárolt frakciót beinjektálták a második kolonnába. A csapdázást hatszor ismételték meg, mielőtt a második kolonnába injektálták volna a frakciót. A csapdázó kolonnák segítségével oldották meg az oldószer cseréjét is, mivel ha az első kolonnában használt eluens bejutna a második kolonnába, akkor a polimerek az injektált oldószerrel együtt eluálódnának. Az egy dimenziós kromatogrammon egy csúcson belül csak az azonos PS blokk hosszúsággal rendelkező molekulák adnak jelet, de változhat egy csúcson belül a PI blokkok hosszúsága.3,6 d) Zsírok alkohollal alkotott származékainak analízise (felületaktív anyagok analízise) 4 Mosóporokban, tisztítószerekben találhatóak meg a
zsírok alkohollal alkotott
származékai, mint felületaktív anyagok. Négy csoportra lehet osztani őket. Az első az anionos felületaktív
anyagok
csoportja (anionos
tenzidek),
például
az alkilbenzol-
szulfonátok, illetve a zsírsavas szappanok. Ezek a legegyszerűbb felületaktív anyagok. A második csoport a nem ionos felületaktív anyagok (nem ionos tenzidek), például az alkoholetoxilátok és az alkil-fenoxilátok (APEO). A harmadik csoport a kationos felületaktív anyagok (kationos tenzidek) és az utolsó az amfoter felületaktív anyagok csoportja (amfotertenzidek). Mindegyik felületaktív anyagban különböző lehet az alkil és az etoxilát homológok száma. Fordított fázisú kormatográfiával az alkil lánc hosszúsága alapján szeparálódnak a molekulák. Normál fázisú kromatográfiával pedig az etoxilációk számát lehet meghatározni (EO szám). Az etoxilált zsíros alkohol származékokat az alkil lánc hosszúsága alapján ellehet választani folyadék adszorpciós kromatográfiával is (LAC) és az EO szám alapján a méretkizárásos kromatográfiával is. Ezt a multidimenziós kromatográfiás módszer másképpen LEAC-nak hívják. A kétdimenziós LC rendszer két darab HPLC kolonnát és két mintaadagoló hurkot tartalmazott 10 beömlőnyílással rendelkező interfésszel üzemeltették. Amikor az első 12
mintavevő hurok megtelt, akkor áttranszferálták a 10 beömlő nyílású váltóba, mely megtöltötte a második mintavevő hurkot. Különböző elválasztási mechanizmussal rendelkező kolonnákat lehet csak összekapcsolnia megfelelő csúcskapacitás elérése érdekében, ahogy már feljebb is leírtam. A HILIC és az RP kolonnák összekapcsolása megoldott. A HILIC-ben a retenció növekszik az analit polaritásával és csökken a retenciós idő a mozgó fázis polaritásának növekedésével. Az első dimenziót szobahőmérsékleten, a második dimenziót pedig 50°C-on üzemeltették. Az első kolonnában az áramlási sebesség 0,025 ml/perc volt. A hurok mérete 25 és 50 µl volt és1-2 perc modulációs időt választottak 25 µl/perc áramlási sebességnél.
A második dimenzióban az áramlási sebesség 3 ml/perc volt. Az első
dimenzióban ACN és ammonium-acetát elegyének gradiensét alkalmazták. A második kolonnában metanol/ NH4OAc elegyét áramoltatták gradiens üzemmódban. A gradiens 5-10% MeOH-tól haladt 95% MeOH-ig 30 perc alatt. A teszt minta 5 analit osztályt tartalmazott (AS, AES, AE, AG és betaint). Az optimalizáláshoz
először
egydimenziós
analíziseket
hajtottak
végre,
ahol
9
féle
kromatográfiás kolonnát próbáltak ki első dimenzióként. 5 db fordított-fázisú kolonnát, 3 db HILIC oszlopot és egy felületaktív kolonnát fordított fázisú anyaggal. A HILIC-el az EO szám alapján tudtak elválasztani (ZIC-HILIC, 250mm*2,1mm, 5 µm), míg a fordított fázisú kolonnával az alkil lánc hosszúsága szerint (Reprospher C8-Aqua 50mm*4,6mm, 5 µm vagy 30mm*4,6mm, 3 µm). Az MS detektáláskor az ESI ionforrást pozitív és negatív üzemmódban is használták. Az ESI negatív üzemmódban való futtatása az AES és az AE molekulák intenzitásának növeléséhez volt elengedhetetlen. A detektáláshoz QTOF MS rendszert alkalmaztak. 4 5. Az MS detektálás lehetséges kialakításai6 A tömegspektrométerek lehetővé teszik a pontos, precíz és nagy érzékenységű kvantitatív detektálást izotópokkal dúsított belső standard-ek használatának segítségével. Az UV detektorokkal ellentétben nem abszorbeáló mintákat is lehet detektálni. Használhatjuk teljes scan módban (TIC) vagy, amit leggyakrabban alkalmaznak, tandem MS-ként (MS/MS) vagy a kiválasztott ion monitorázásával (SIM). A tandem MS használata szerkezeti információt nyújt, ami segít az ismeretlen minták elemzésében. A nagy és ultra-nagy érzékenységű tömegspektrométerekkel a tömeg pontosság 1 ppm alá süllyedt és a felbontás 100000 fölé emelkedett. Ilyen készülékek például a TOF, a triplequadrupole, a lineáris ioncsapda Fourier transzformációs ion ciklotron-rezonancia (FT-ICR), a Q-TOF és az IT-TOF készülékek. 6-10 felvételi pontot kell felvegyenek legalább 13
csúcsonként. A kvadrupol típusokat használják a legelterjedtebben, mert egyszerű a használatuk. A tömegtartomány felső határa 4000 m/z. A triple-quadrupole és az IT-típusú készülékek jelenleg lassúak az LC*LC-MS rendszerekhez. A repülési idő analizátorok (TOF) előnye a nagy szkennelési sebességben rejlik (több mint 20000 scan/ perc). A tömegtartománynak virtuálisan nincs felső határa. A modern TOF készülékek képesek femtogramm szinten mérni és a mérési tömegtartományuk 25-20000 m/z felső határig terjedhet. Ezeket az új analizátorokat, melyek helyettesítik a régieket (mint a két-fókuszálású mágneses szektor készülékeket) lágy ionizációs technikákkal üzemeltetik. Ilyen ionizációs technika lehet az ESI, a MALDI, az APCI, és az APPI. Az ESI-t általában az on-line kapcsolt készülékekhez, míg a MALDI-t az off-line kialakítású készülékekhez használják. Az ESI-t nagy polaritású komponensek ionizálásához használják. A molekuláris tömeg tartomány 100től 150*103 Da-ig terjedhet. Általában több mint egy töltést kapnak a molekulák, míg a MALDI-ban általában csak egyszeresen töltött kvázi molekuláris ionok keletkeznek. Az APCI-t közepesen poláris analitokhoz érdemes üzemeltetni. A 2D szeparációs rendszerekkel minimalizálható a komplex minták okozta ion szupresszió, növelhető az ionizációs hatékonyság és a mátrixhatás is csökkenhet. Az LC pumpának pulzus mentesnek kell lennie, hogy a mozgó fázist konstans áramlási sebességgel tudja szállítani. A mozgó fázis felületi feszültsége, forráspontja és a vezetőképessége befolyásolja a választott ionizációs forrást. A kálium és nátrium- foszfát pufferek használatával vigyázni kell, mert kiválhatnak a kapilláris cső belső falára a mozgófázis elpárologtatása közben, így eltömődés keletkezhet. Az ESI-MS forrásnak a proteinek analízisekor felléphet ion szupresszió és szennyeződés lehetősége, mivel a protein enzimatikus bontása előtt olyan anyagokat használnak (a fehérjék redukálására és alkilálására), amik ilyen problémákat okozhatnak. Az ionforrások magas ionizációs képességgel kell rendelkezzenek, megismételhető kvantitatív információt kell tudjanak nyújtani ( a detektálási határtól széles dinamikus mérési tartomány), nem reagálhatnak a mintával és széles molekulatömeg tartományban kell képesek legyenek az ionok előállítására.6
14
6. Összefoglalás A kétdimenziós szeparációs rendszerek kifejlesztésével lehetőség nyílt komplex minták analízisére. Különböző elválasztási technikákkal lehet a nagy diverzitási fokkal rendelkező analitokat szeparálni. Fontos, hogy a két mechanizmus különbözzön egymástól, különben a rendszer nem fog optimálisan működni. Az első dimenzióban használt oldószer kompatibilis kell legyen a második dimenzióban használttal. Ha ez nem lehetséges, akkor meg kell oldani az első dimenzióból származó mozgófázis koncentrációjának lecsökkentését, mielőtt a második dimenzióba injektálnánk a frakciót. A felépítés kérdésében megkülönböztetjük az off-line és az on-line technikákat. Az on-line módszerek egyik alkalmazásánál (2. ábra c)) összeköthetjük közvetlenül a két kolonnát. Ilyenkor nincs lehetőség a felmerülő oldószer inkompatibilitás kiküszöbölésére. Egy másik lehetséges megoldásnál köztes kolonnát és hurkokat alkalmaznak. Az LC*LC rendszerekhez kapcsolt MS készülékeknek, pontosnak, precíznek és nagy felbontásúnak kell legyenek (Q-TOF, FT-ICR). A leggyakrabban használt ionforrások az ESI és a MALDI. Az LC*LC rendszerek utat nyitottak komplex protein, foszfolipid, felületaktív anyagok és blokk-kopolimerek analízisének megoldásához, sok más előnyük mellett. 7. Irodalomjegyzék
1:
Akira
Motoyama,
Schseido
Co.,
John
R.
Yates:Multidimensional
LC
separationsinshotgunprotemics (Anal. Chem., 2008, 80, 7187-7193)
2:Pola Dugo, Nermeen Fawzy, Filomena Cichello, Francesco Cacciola, Paola Donato, Luigi Mondello: Stop-flow comprehensive two-dimensional liquid chromatography combined with mass spectrometric detection for phospholipid analysis (Journal of ChromatographyA, 1278 (2013 (46-53)
3: KyuhyunIm, Hae-Woong Park, Qoungtak Kim, Bonghoon Chung, Moonhor Ree and TaihyunChang: Comprehensivetwo-dimensional liquid chromatography analysis of a blockcopolymer (Anal.Chem. 2007, 79, 1067-1072)
15
4: Victoria Elsner, SabrinaLaun, David Melchior, Michael Köhler, Oliver J. Schmitz: Analysis of fatty alcohol derivatives with comprehensive two-dimensional liquid chromatography coupled with mass spektrometry (Journal of Chromatography A, 1268 (2012) 22-28)
5: P. Donato, F. Cacciola, P. Q. Tranchida, P. Dugo L. Mondello: Mass spectrometry detection in comprehensive liquid chromatography: basic concepts, instrumental aspects, applications and trends
6: P. Donato, F. Cacciola, P. Q. Tranchida, P. Dugo, L. Mondello: Mass specktrometry detection in comprehensive liquid chromatography: basic concepts, instrumental aspects, applications and trends Mass spectrometry Reviews 2012,31, 523-559
16
