Druhová diferenciace Rod Leuconostoc Víno a rod Leuconostoc Izolace z vína a uchovávání

OBSAH OBSAH .................................................................................................................................. 1 1. ÚVOD ................................................................................................................................ 5 1.1 Víno.............................................................................................................................. 5 1.2 Historie vína a révy vinné ............................................................................................ 5 1.3 Výroba červeného vína ................................................................................................ 7 1.3.1 Sklizeň................................................................................................................... 7 1.3.2 Doprava a příjem hroznů ...................................................................................... 7 1.3.3 Zpracování hroznů ................................................................................................ 7 1.3.3.1 Odstopkování ................................................................................................. 7 1.3.3.2 Drcení............................................................................................................. 8 1.3.3.3 Síření .............................................................................................................. 8 1.3.4 Kvašení ................................................................................................................. 8 1.3.5 Zrání vína v sudech ............................................................................................... 9 1.3.6 Ošetřování a stabilizace vína ................................................................................ 9 1.3.6.1 Stáčení .......................................................................................................... 10 1.3.6.2 Číření vína.................................................................................................... 10 1.3.6.3 Úprava obsahu oxidu uhličitého .................................................................. 10 1.3.7 Čištění vína a filtrace .......................................................................................... 10 1.4 Vady a choroby vína .................................................................................................. 10 1.4.1 Choroby vína....................................................................................................... 11 1.4.2 Vady vína ............................................................................................................ 11 1.5 Bakterie v procesu výroby vína ................................................................................. 12 1.5.1 Bakterie mléčného kvašení (BMK) a jablečno-mléčné kvašení ......................... 13 1.5.2 Vzájemné vztahy mezi bakteriemi a dalšími mikroorganismy ve víně .............. 17 1.5.2.1 Výskyt mikroorganismů během výroby vína ............................................... 17 1.5.2.2 Vzájemné reakce mezi bakteriemi mléčného kvašení ................................. 17 1.5.2.3 Vzájemné vztahy mezi bakteriemi mléčného kvašení a Saccharomyces .... 18 1.6 Jednotlivé rody bakterií mléčného kvašení ................................................................ 19 1.6.1 Rod Lactobacillus ............................................................................................... 19 1.6.1.1 Víno a rod Lactobacillus.............................................................................. 19 1.6.1.2 Izolace z vína a uchovávání ......................................................................... 21 1.6.1.3 Odlišení rodu Lactobacillus od ostatních bakterií mléčného kvašení ......... 21 1

1.6.1.4 Druhová diferenciace ................................................................................... 22 1.6.2 Rod Leuconostoc................................................................................................. 22 1.6.2.1 Víno a rod Leuconostoc ............................................................................... 23 1.6.2.2 Izolace z vína a uchovávání ......................................................................... 23 1.6.2.3 Odlišení rodu Leuconostoc od ostatních bakterií mléčného kvašení ........... 24 1.6.2.4 Druhová diferenciace ................................................................................... 24 1.6.3 Rod Oenococcus ................................................................................................. 25 1.6.3.1 Víno a rod Oenococcus ................................................................................ 25 1.6.3.2 Izolace z vína a uchovávání ......................................................................... 27 1.6.3.3 Odlišení rodu Oenococcus od ostatních bakterií mléčného kvašení............ 27 1.6.3.4 Druhová diferenciace ................................................................................... 28 1.6.4 Rod Pediococcus................................................................................................. 28 1.6.4.1 Víno a rod Pediococcus ............................................................................... 29 1.6.4.2 Izolace z vína a uchovávání ......................................................................... 29 1.6.4.3 Odlišení rodu Pediococcuss od ostatních bakterií mléčného kvašení ......... 29 1.6.4.4 Druhová diferenciace ................................................................................... 30 1.7 Identifikace bakterií mléčného kvašení ..................................................................... 30 1.8 Schisosacchcaromyces pombe a Saccharomyces cerevisiae .................................... 31 1.9 Bakterie octového kvašení ......................................................................................... 32 1.9.1 Bakterie octového kvašení a víno ....................................................................... 32 1.9.1.1 Bakterie octového kvašení a červené víno ................................................... 34 1.9.1.2 Bakterie octového kvašení a kažení vína ..................................................... 35 1.10 Metoda MALDI -TOF MS....................................................................................... 36 2. CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE .......................................................................................... 39 3. MATERIÁL A METODY ............................................................................................... 40 3.1 Použité vzorky vína.................................................................................................... 40 3.2 Kultivační média ........................................................................................................ 41 3.3.1 Testování citlivosti na antimykotikum nystatin .................................................. 43 3.4 Kultivace mikroorganismů......................................................................................... 44 3.5 Uchovávání mikroorganismů ..................................................................................... 45 3.6 Použité přístroje ......................................................................................................... 45 3.7 Základní diagnostické testy........................................................................................ 46 3.7.1 Makroskopie kolonií ........................................................................................... 46 3.7.2 Barvení dle Grama .............................................................................................. 46 2

3.7.3 Mikroskopie kolonií ............................................................................................ 47 3.7.4 Identifikace bakterií mléčného kvašení .............................................................. 48 3.7.4.1 KOH test ...................................................................................................... 48 3.7.4.2 Růst v MPB .................................................................................................. 48 3.7.4.3 Katalázový test ............................................................................................. 48 3.7.4.4 Růst při 15 °C a při 45 °C ............................................................................ 49 3.7.4.5 Tvorba NH3 z argininu ................................................................................. 49 3.7.4.6 Hydrolýza eskulinu ...................................................................................... 50 3.7.4.7 Tvorba plynu z glukosy ............................................................................... 51 3.7.4.8 Tvorba plynu z glukonátu ............................................................................ 52 3.8 Metoda MALDI-MS .................................................................................................. 53 3.8.1 Metoda etanolové extrakce ................................................................................. 53 3.9 Typové kultury ........................................................................................................... 54 3.10 Doplňující diagnostické testy................................................................................... 54 3.10.1 Růst při pH 4,8 .................................................................................................. 54 3.10.2 Růst v 10 % etanolu .......................................................................................... 55 3.10.3 Fermentace cukrů .............................................................................................. 55 3.10.4 API 50 CH......................................................................................................... 56 3.11 Identifikace bakterií octového kvašení .................................................................... 58 4. VÝSLEDKY .................................................................................................................... 59 4.1 Izolace bakterií z vína ................................................................................................ 59 4.2 Testování citlivosti na antimykotikum nystatin ......................................................... 59 4.3 Základní diagnostické testy........................................................................................ 60 4.3.1 Makroskopie a mikroskopie kolonií ................................................................... 60 4.3.2 KOH test, růst v MPB, katalázový test, růst při 15 °C a při 45 °C ..................... 64 4.3.3 Tvorba plynu z glukosy a glukonátu................................................................... 67 4.3.4 Tvorba NH3 z argininu a hydrolýza eskulinu ..................................................... 69 4.4 MALDI MS............................................................................................................... 72 4.5 Doplňující diagnostické testy..................................................................................... 82 4.5.1 Růst při pH 4,8 a růst v 10 % etanolu ................................................................. 82 4.5.2 Tvorba kyselin z maltosy a ze sacharosy ............................................................ 83 4.6 API 50CH................................................................................................................... 83 4.7 Bakterie octového kvašení ......................................................................................... 84 5. DISKUSE......................................................................................................................... 85 3

5.1 Izolace kmenů ............................................................................................................ 85 5.2 Optimalizace procesu izolace .................................................................................... 86 5.3 Testy k identifikaci izolovaných kmenů .................................................................... 86 5.4 Identifikace izolovaných kmenů ................................................................................ 88 5.5 Počet a zastoupení jednotlivých kmenů ..................................................................... 91 6. ZÁVĚR ............................................................................................................................ 94 7. SEZNAM LITERATURY ............................................................................................... 96 PŘÍLOHY .......................................................................................................................... 103

4

1. ÚVOD 1.1 Víno

Víno je alkoholický nápoj vyrobený prokvašením moštu nebo rmutu révy vinné Vitis vinifera. Je to přirozený produkt, který není výsledkem vědecké práce. Staří Řekové jej nazývali „darem Bohů“ (Priewe, 2003). Přiměřené pití vína příznivě působí na lidský organismus. Mnohé látky obsažené ve víně působí kladně na pevnost a průchodnost cév a vhodně upravují krevní tlak. Zaznamenány byly také antiseptické a baktericidní účinky (Cibulka, 2003). Pití červeného vína způsobuje tzv. „francouzský paradox“. Francouzská strava obsahuje 2-3 krát více nasycených tuků než americká strava, avšak poměr kardiovaskulárních chorob ve Francii je třetinový oproti Spojeným Státům. Jedním z vysvětlení je příznivé působení složek červeného vína (Araim a kol., 2002). Na nepřímou vazbu mezi konzumací alkoholu a kardiovaskulárními chorobami poprvé upozornil Cabot v roce 1904. Avšak snížení výskytu kardiovaskulárních chorob je omezeno na lidi ve středním věku a starší jedince. Také je známo, že ženy jsou chráněny proti kardiovaskulárním chorobám méně než muži (Vogel, 2003). Charakteristická chuť vína je ovlivňována spoustou složek a faktorů, mezi které patří odrůda révy vinné, způsoby obdělávání, složení půdy a hroznů a v nemalé míře také podmínky alkoholového kvašení. Při tomto kvašení se tvoří estery, které udávají charakteristickou ovocnou vůni vína. Patří mezi ně hexylacetát, etylkaproát, etylkaprylát (vůně po jablcích), isoamylacetát (vůně po banánech) a 2-fenyletylacetát (vůně po ovoci s medovým nádechem) (Lilly a kol., 2000).

1.2 Historie vína a révy vinné

Nejstarší známky výskytu vína pocházejí z Gruzie, kde byly nalezeny džbány s reliéfy hroznů z doby kolem 6000 let před Kristem. Důkazy, že lidé uměli vyrábět víno již v ranných dobách, existují mezi Eufratem a Tigridem, na jižním Kavkaze a Nilu. Objev vína je zřejmě dílem náhody. V Přední Asii byla hroznová šťáva uchovávána ve džbánech nebo měších z kozí nebo velbloudí kůže, kde při vysoké teplotě začala rychle kvasit. Existence vína v těchto končinách svědčí o tom, že hrozny měly vysoký obsah

5

cukru a šťáva mohla zkvasit. Proto botanici tuto evropsko-blízkovýchodní révu později nazvali Vitis vinifera – réva vhodná pro výrobu vína. Řecká civilizace pěstovala ve Středomoří révu od roku 1600 před Kristem. Hlavními středisky produkce vína byly Mykény a Sparta. Víno bylo kultovním nápojem, kterým se oslavovalo vítězství, uctívali bohové a slavily slavnosti. Metody výroby vína byly již tenkrát hodně pokročilé, k vínu byla přidávána mořská voda, aby bylo víno vláčnější. Řečtí kolonizátoři přinesli víno do Sýrie, Egypta, Cádizu a Marseille, později na Sicílii. Po úpadku Řecka se kult vína rychle rozšířil do Římské říše. Nejznámější odrůdou antiky bylo Bílé Falernské. Z Říma se znalost pěstování vína dostala do jižní Francie, na Moselu, do Porýní a některých částí Španělska. I v Itálii musel být tento nápoj znám již v době předřímské, alespoň ve střední Itálii. Zde totiž žili Etruskové, u kterých bylo víno symbolem blahobytu a hýřivého života již ve 3. století před Kristem. Ve stoletích po Kristu se pěstování révy šířilo po Evropě velmi rychle, hlavně díky mnichům, kteří dosáhli vysoké úrovně znalosti výroby vína. V době renesance byli průkopníky vinohradnictví osvícení panovníci a zámožní občané. Své největší rozšíření zažila réva v 16. století, kdy byla pěstována na čtyřnásobku dnešních ploch. Spotřeba vína tehdy musela činit 200 litrů na osobu za rok. Poté zlatá éra vína skončila. Války a nemoci, ale i ochlazení klimatu způsobily, že pěstování vína se omezilo na několik málo center, která jsou totožná s dnešními vinařskými oblastmi. Své nezapomenutelné místo v historii a zlepšování kvality vína má francouzský chemik Louis Pasteur (1822-1895). Jako první přesně popsal pochod alkoholového kvašení. V roce 1856 jej požádal císař Napoleon III. o pomoc, neboť kažení vína způsobovalo vinařskému průmyslu značné hospodářské ztráty. Pasteur jel do vinice v Arbois problém studovat. Zjistil, že kažení způsobují kvasné mikroorganismy, které se dostanou do vína z tekutin a ze vzduchu. Roku 1865 přišel na to, že tyto potraviny stačí po krátkou dobu zahřát na určitou teplotu a nežádoucí zárodky jsou zničeny. U vína je tato teplota 52,7 °C. Po této proceduře mají takto upravené potraviny delší trvanlivost, protože většina škodlivých mikroorganismů je zničena, ne však všechny. Přežívají některé užitečné bakterie, jejichž činnost je ovšem zpomalována uchováváním těchto potravin v chladném prostředí (Priewe, 2003).

6

1.3 Výroba červeného vína

Hlavní rozdíl mezi výrobou bílých a červených vín je v tom, že červené víno kvasí společně se slupkami, u bílého kvasí jenom šťáva. To má za následek, že se barvivo, které je obsažené pod slupkou, vyluhuje spolu s tříslovinami do vína. Hrozny pro červená vína se drtí, šťáva, dužina, slupka a pecičky tvoří drť, která se nakvašuje. Také u některých bílých vín se používá velmi krátké nakvášení. Záleží na typu a odrůdě vína (Priewe, 2003).

1.3.1 Sklizeň

Termín sklizně (vinobraní) je závislý na vyzrálosti hroznů, jejich zdravotním stavu a požadovaném typu vína.

1.3.2 Doprava a příjem hroznů

Hrozny by měly být dopraveny z vinice do místa zpracování pokud možno nepoškozené. Důvodem je možná nekontrolovatelná oxidace a vyluhování stejně jako nežádoucí mikrobiologický vývoj, jestliže se ve větším množství uvolní šťáva.

1.3.3 Zpracování hroznů

Mezi sklizní hroznů a začátkem alkoholového kvašení proběhnou v průměru dva dny. Během tohoto období se musí uskutečnit řada opatření, která ovlivní hotové víno. Způsob zpracování hroznů a získávání moštu ovlivňuje kvalitu výsledného produktu z 80 %.

1.3.3.1 Odstopkování

Odstopkováním se rozumí oddělení bobulí od třapin. Tento pracovní postup je výhodným krokem při zpracování hroznů. I když třapiny mají drenážní účinek při lisování hroznů a tím usnadňují odtok moštu, zelené stopky dodávají moštu nepříjemnou trávovitou chuť.

7

1.3.3.2 Drcení

Při tomto pracovním postupu se mezi drtícími válci naruší bobule, aby mohla šťáva lépe odtékat. Pokud proběhne drcení až po odstopkování, snižuje se podíl kalů.

1.3.3.3 Síření

Přídavek SO2 způsobí útlum oxidačních enzymů, útlum divokých kvasinek a bakterií a vyvázání vzdušného kyslíku. Čím dříve se tento přídavek uskuteční, tím lépe bude rmut chráněn před účinky vzduchu, zabrání se hnědnutí a podpoří se vývoj buketu a čistých tónů (Steidl, 2002).

1.3.4 Kvašení

Pomleté a odzrněné hrozny se docukřují a ponechají se v kádi kvasnému procesu. Při kvašení probíhá tzv. macerace, kdy se ze slupek hroznů louhují barviva a třísloviny. Tyto složky jsou v červeném víně žádané, vyšší množství je dobrým předpokladem pro jejich archivaci. Doba kvašení obvykle trvá 5-10 dní, záleží však na typu vína. Lehčí typy s menším obsahem tříslovin se oddělují od slupek dříve, naopak plnější vína s vyšším obsahem tříslovin a předpokladu delšího zrání leží na slupkách déle, 20-30 dní. Při kvašení v kádi vzniká na povrchu rmutový klobouk - slupky bobulí a zbytek třapin je nadnášen tvořícím se oxidem uhličitým. Vzniklý rmutový klobouk je potřeba ponořovat, běžně pomocí tyče, aby byly slupky neustále v kontaktu s moštem. Proces kvašení se podporuje: -

zahříváním - pro lepší vylouhování barviva se rmut zahřívá až na 50 oC - přidáním pektolytických enzymů. Enzymy snáší teplotu do 35 oC. Vyrábí se tak vína k brzké spotřebě.

-

přidáním kulturních kvasinek.

-

tlakem CO2 - prokvášením bez přístupu vzduchu se odbourávají také kyseliny a tím vzniká jemnější typ vín (Steidl, 2002). Při alkoholovém kvašení vzniká etanol za účasti kvasinek Saccharomyces

ellipsoideus, používají se také S. chevalieri, S. oviformis a Torulopsis stellata (Priewe, 2003). V čerstvém moštu se taky vyskytují v nízkých hladinách rody Rhodotorula, Pichia, Candida a Metschnikowia, ale na začátku kvašení odumírají (Fleet a kol., 1984). Teplota 8

vyšší než 35 oC činnost kvasinek zpomaluje, nebo úplně zastavuje, navíc ničí aromatické látky. Činnost kvasinek přirozeně končí metabolizací všech cukrů. Při vyšších teplotách nad 25 oC navíc unikají aromatické a buketní látky a proto je doporučováno teplotu řídit - tzv. řízené kvašení, 18-21 oC. Kvasinky také zastavují svou činnost dosažením úrovně asi 16 % obj., kdy objem alkoholu je již pro kvasinky toxický (Stevenson, 2001). Alkoholové kvašení je složitý chemický proces, který probíhá v několika krocích. Jeho sumární rovnice je: C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2. Etanol vzniká v 47-48 % a oxid uhličitý v 46-47 %. Jako vedlejší produkt vzniká glykol (2,5-3 %), kyselina jantarová (0,20,5 %), butylenglykol (0,05-0,1 %), kyselina octová (0-0,25 %), kyselina mléčná (0-0,2 %), acetaldehyd (0-0,01 %) a metanol (0,05-0,3 %). Oxid uhličitý může být přítomen i v rozpuštěné formě jako kyselina uhličitá. Vedlejší produkty představují 4-6 % vína. Z nich je nežádoucí například acetaldehyd, protože oxiduje víno a metanol, což je jedovatá látka (Priewe, 2003). Všechna červená vína po ukončení alkoholového kvašení prodělávají druhé kvašení, jablečno-mléčnou (malolaktickou) fermentaci. Při tomto typu kvašení dochází k přeměně kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou a oxid uhličitý. Kyselina jablečná způsobuje vyšší kyselost a spolu s tříslovinami dodává vínu tvrdost, jejím odbouráním je víno zjemněno. Tento proces se málo využívá u výroby bílých vín, u výroby červených vín se však stává běžným postupem (Bourdineaud a kol., 2003; Jussier a kol., 2006; Priewe, 2003; Steidl, 2002; Stevenson, 2001).

1.3.5 Zrání vína v sudech

Při zrání vína dochází k vyluhování látek obsažených ve dřevě pomocí alkoholu a k jejich oxidaci. Tak vznikají „vlastní fenolické látky“ ve víně. Další způsob vyluhování je oxidace látek již ve dřevě, „vlastní fenolické látky“ rozpouští až alkohol ve víně.

1.3.6 Ošetřování a stabilizace vína

Pod tímto názvem se skrývají všechny pracovní postupy při přípravě vína: od mladého vína až po láhvování. Cílem je dosáhnout kvalitativně vysoce hodnotného a stabilního výsledného produktu.

9

1.3.6.1 Stáčení

Stáčení je vyprázdnění původní nádoby s vínem a naplnění jiné nádoby s cílem oddělit usazené kaly od vína. Při stáčení dochází ke kontaktu vína se vzduchem, které je u červených vín žádoucí, přispívá ke zrání vína a stabilizaci barvy.

1.3.6.2 Číření vína

Číření slouží k uchovávání vína a k jeho stabilizaci při skladování v různých podmínkách při různých teplotách. Také se používá místo filtrace a odstřeďování.

1.3.6.3 Úprava obsahu oxidu uhličitého

Oxid uhličitý je významným znakem jakosti. Optimální množství pro červená vína je 0,2-0,4 g CO2/l. Přebytek oxidu uhličitého narušuje jemnost a sametovost, třísloviny mají hořčí chuť.

1.3.7 Čištění vína a filtrace

Po ukončení kvašení by mělo být víno rychle vyčištěno. Kvasinky, dužina, bílkoviny a vinný kámen mohou ještě delší dobu způsobovat zákal. Odbourávání kyselin pomocí bakterií probíhá v takovém víně lépe než v jiskrně čistém víně. I z důvodu nebezpečí vzniku sirky by měla být mladá vína co nejdříve vyčištěna. Kalné částice zastírají aroma vín (Steidl, 2002).

1.4 Vady a choroby vína

Choroba vína je stav vyvolaný mikroorganismy. Vada a nedostatek vína je nežádoucí změna způsobená technologickými, fyzikálními nebo chemickými zásahy.

10

1.4.1 Choroby vína

Octovatění způsobují bakterie octového kvašení, které přeměňují alkohol na kyselinu octovou. Vůní připomíná víno ocet nebo acetonová ředidla. Slabé octění lze odstranit filtrací a zasířením.

Křísovatění (šum, květ, rosol) bývá u vín s nízkým obsahem alkoholu, která byla málo sířená, nebo k nim měl přístup vzduch. Nemoc způsobují kvasinky, je doprovázena bílou povrchovou pokožkou. Důsledkem této choroby je rozklad alkoholu, kdy vzniká voda, oxid uhličitý a estery.

Mléčné, máselné a manitové kvašení způsobují heterofermentativní bakterie mléčného kvašení. Ty rozkládající cukry na kyselinu mléčnou s menším množstvím kyseliny máselné a octové. Vytváří chuť kvašeného zelí.

Vláčkovatění - slizovitost je způsobena napadením slizovými bakteriemi a některými slizotvornými kvasinkami. Víno má olejovitou, slizkou konzistenci.

Myšina vzniká za vyšších teplot při kvašení a delší době ležení na kvasničních kalech. Víno má velmi nepříjemnou chuť, pach po myší moči díky acetamidu.

Zvrhnutí nebo zlomení nastává, když se nechá víno dlouho na kvasnicích. Projevuje se vyšším obsahem oxidu uhličitého a štípavou chutí na patře.

Hořknutí je nemoc červených vín způsobená mléčnými bakteriemi, které produkují hořké látky a ničí tak chuť vína (Cibulka, 2003).

1.4.2 Vady vína

Černý zákal je způsoben delším stykem moštu nebo vína s železem a pozdějším ponecháním vína v neplných sudech, kde dochází ke vzniku tenátu železitého. Tato sůl se ve víně vysráží ve formě modročerných drobných vloček.

11

Šedý nebo bílý zákal se projevuje vylučováním drobných klků fosforečnanu železitého, který vzniká oxidací fosforečnanu železnatého. Po zatřepání lze vidět tzv. sněžení vína.

Sirka ve víně se vyznačuje zápachem zkažených vajíček. Sirovodík vzniká činností kvasinek.

Hnědnutí vína se projevuje zejména u mladých, málo sířených vín. Víno mění svou původní barvu, získává nahnědlý odstín. Hnědnutí je způsobeno přístupem vzduchu.

Krystalický zákal vzniká vysrážením vinného kamene, je neškodný (Cibulka, 2003).

1.5 Bakterie v procesu výroby vína

Výroby vína se účastní velké množství bakteriálních druhů. Rozsah, ve kterém tyto druhy rostou, určuje typ a koncentraci řady látek, které přispívají k tvorbě vůně a chuti vína (Fleet a kol., 1984). Růst bakteriálních rodů jako jsou Acetobacter, Gluconobacter, Lactobacillus a Pediococcus mohou způsobit kažení vína prostřednictvím produkce nechutných a zapáchajících látek. Některé bakteriální kmeny ve víně mohou také produkovat látky jako biogenní aminy a prekurzory etyl karbamátů. Na druhé straně, růst Oenococcus oeni je prospěšný, tato bakterie způsobuje jablečno-mléčné kvašení a tak přispívá k tvorbě žádoucí chuti a vůni vína. Nelze také opomenout vzájemné reakce mezi různými bakteriálními druhy a vinnými kvasinkami Saccharomyces. Tyto vzájemné reakce mohou být prospěšné nebo škodlivé pro kvalitu vína, záleží na zúčastněných druzích (Osborne a Edwards, 2005). Kvašení hroznové šťávy na víno představuje komplex biochemických reakcí zahrnující spoustu mikroorganismů. Různorodost těchto mikroorganismů a jejich složitá ekologie značně ovlivňují celkovou kvalitu vína (Fleet a kol., 1984). Mikroorganismy přítomné v hroznové šťávě před kvašením mají měnící se růstové požadavky a toleranci k potlačujícím látkám. Díky těmto vlastnostem převládají v různých časových obdobích během přirozeného

kvašení.

Rozmanité

mikroorganismy

se

také

ovlivňují

ve

vzájemných ekologických vztazích, které mohou být prospěšné i potlačující. Jako takové, vzájemné reakce mezi mikroorganismy ve víně jsou důležité, protože mohou ovlivňovat

12

úspěch nebo neúspěch alkoholového nebo jablečno-mléčného kvašení, a ty postupně ovlivňují konečnou kvalitu vína (Osborne a Edwards, 2005). Různé bakteriální druhy zvyšují nebo snižují kvalitu vína, záleží na jejich typu. Hroznová šťáva a víno představují drsné podmínky pro mikrobiální růst díky nízkému pH, minimálnímu množství kyslíku, přítomnosti etanolu a vysokému osmotickému tlaku. Díky tomu jen málo bakteriálních druhů je schopno růstu. Jako příklad slouží bakterie mléčného kvašení patřící do rodů Lactobacillus, Oenococcus a Pediococcus. Jsou běžně nalézány ve víně díky toleranci k výše uvedeným faktorům (Dicks a kol., 1995). Další bakterie jako jsou Acetobacter a Gluconobacter jsou běžně přítomny v hroznové šťávě (Du Toit a Lambrechts, 2002).

1.5.1 Bakterie mléčného kvašení (BMK) a jablečno-mléčné kvašení

Důležitý faktor, který ovlivňuje kvalitu kyselého vína a moštu je jablečno-mléčné kvašení (MLF = malolactic fermentation). Při tomto kvašení dochází k přeměně L-kyseliny jablečné na L-kyselinu mléčnou a oxid uhličitý. (Dicks a kol., 1995; Henick-Kling a kol., 1989; Osborne a Edwards, 2005; Remize a kol., 2006; Rojo-Bezares a kol., 2006; Zapparoli a kol., 1998). Tato fermentace představuje dekarboxylaci a vede ke snížení kyselosti vína a ke zlepšení růstu bakterií a chuti vína (Cavin a kol., 1989; Miranda a kol., 1997). Výroba moštu je velmi podobná výrobě vína, používají se druhy ovoce obsahující stejné látky a zahrnují spoustu stejných výrobních postupů a kroků, proto se jablečnomléčné kvašení uskutečňuje ve víně i v moštu (Zhang a Lovitt, 2006). Zastoupení kyseliny jablečné ve víně je až 50 %, zbytek představuje kyselina vinná. Množství kyseliny jablečné je závislé na zralosti hroznů. Jak hrozny zrají, dochází k odbourávání této kyseliny, může být až všechna odbourána. K tomu však nedochází v chladnějších oblastech, hrozny zde nedokáží úplně dozrát, v bobulích zůstane velké množství kyseliny jablečné a tím dojde ke zvýšení kyselosti vína (Henick-Kling a kol., 1989). Jablečno-mléčné kvašení způsobují bakterie mléčného kvašení (BMK). Název této skupiny je odvozen od jejich schopnosti zkvašovat sacharidy na kyselinu mléčnou jako hlavní výsledný produkt. Obecně neprodukují katalázu. Na rozdíl od vyšších živočichů a rostlin, které produkují výlučně L(+)-kyselinu mléčnou, BMK tvoří buď L(+) nebo D(-) izomer, případně jejich směs. Typ izomeru je rodově i druhově specifický a je využíván pro klasifikaci BMK. Taxonomie BMK je provázena velkými změnami. Jedná se o velmi 13

heterogenní skupinu, do které patří rody Bifidobacterium, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Sporolactobacillus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus a Weissella (Štegnerová a kol., 2007). Tyto bakterie se běžně nacházejí v potravě, tvoří také přirozenou mikroflóru lidí a většiny zvířat. Mezi nejznámější rody bakterií mléčného kvašení nacházející se v hroznech a ve víně patří rody Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus a Oenococcus (Rojo-Bezares a kol., 2006). Tyto bakterie jsou schopny růstu na glukose, fruktose a ostatních sacharidech, ve víně a v moštu však často rostou jako mixotrofové (Zhang a Lovitt, 2006). Jablečno-mléčné kvašení se také nazývá sekundární kvašení, protože se nejčastěji vyskytuje po alkoholovém (primárním) kvašení, ale někdy se může vyskytovat zároveň s tímto kvašením (Liu, 2002; Osborne a Edwards, 2005). Jsou tři hlavní reakce spojené s přeměnou kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou. Převládá přímá přeměna jablečnanu na mléčnan pomocí jablečno-mléčného enzymu produkovaného O. oeni. Další dvě možné reakce jsou řízeny ostatními bakteriemi mléčného kvašení, které využívají jablečný enzym. První reakce je přes pyruvát, který je pak redukován na mléčnan, druhá reakce je přes dekarboxylaci oxalacetátu na pyruvát a konečná redukce na mléčnan. Relativní zastoupení těchto reakcí závisí na celkové redoxní rovnováze. Ta je řízena uhlíkovými zdroji, které mohou působit jako donoři i akceptoři elektronů (Zhang a Lovitt, 2006). V alkoholických nápojích byly vyvinuty tři metody pro zlepšení jablečno-mléčného kvašení (obrázek č. 1- Zhang a Lovitt, 2006). Obr.1: Tři metody pro zlepšení jablečno-mléčného kvašení navozeného bakteriemi mléčného kvašení ve víně a v moštu. Upraveno dle Zhang a Lovitt, 2006.

1. spontánní jablečno-mléčné kvašení, 2. startovací kultura, 3. vysoká koncentrace buněk.

14

První metoda je spontánní jablečno-mléčné kvašení využívající původní BMK z moštu a vína. Pro uskutečnění jablečno-mléčného kvašení stačí nízká koncentrace buněk. Toto kvašení je velmi nespolehlivé a obvykle časově náročné, může trvat několik týdnů až měsíců. Vyskytuje se v pozdní fázi alkoholového kvašení (Nielsen a Richelieu, 1999). Druhá metoda zahrnuje používání startovací kultury. O. oeni, který je často používán, je přímo naočkován do vína nebo moštu. Pro uskutečnění jablečno-mléčného kvašení stačí nízká koncentrace buněk. Používání startovací kultury k navození jablečno-mléčného kvašení může v některých případech způsobit rychlejší zrání vína, snížení potenciálně škodlivých BMK, snížení útoků bakteriofágů (Zhang a Lovitt, 2006) a hlavně dovolují kontrolu a selekci kmenů zodpovědných za jablečno-mléčné kvašení a tím kontrolu chuti vína (Orduña a kol., 2001). Třetí metoda zahrnuje vysokou koncentraci buněk. Při ní dochází k oddělení produkce bakterií od jablečno-mléčného kvašení. Bakterie jsou pěstovány v příznivějších podmínkách předtím, než jsou očkovány do vína nebo do moštu. Dochází tak k vyloučení pomalého růstu a nízké koncentrace když je startovací kultura očkována. Samotné kvašení je lépe kontrolovatelné a je zajištěno, že jablečno-mléčné kvašení je dokončeno v požadovaném čase během výroby vína. Používání vysoké koncentrace buněk zajišťuje vyšší spolehlivost, lepší flexibilitu a snadnější spotřebu. Tato metoda může být rozdělena na dva systémy: dávkovací a kontinuální, které se dále dělí na 3 režimy: vysoká koncentrace volných buněk naočkovaná přímo dávkovacím systémem pro jablečno-mléčné kvašení, imobilizované buňky jako dávkovací nebo kontinuální systém, vysoká koncentrace buněk v membránovém bioreaktoru s úplnou recyklací buněk. Tyto systémy dovolují opakované používání kultur, kontrolu sekundárních produktů a navození nebo zastavení jablečno-mléčného kvašení (Zhang a Lovitt, 2006). Dřívější práce Korkese (1950) naznačují, že dekarboxylace při jablečnomléčném kvašení je katalyzovaná NAD+ specifickým jablečno-mléčnými enzymy (Osborne a Edwards, 2005). Tyto enzymy jsou homodimery nebo tetramery s velikostí podjednotek 60–70 kDa a s rozmezí Km 3–17 mM. Jejich maximální aktivita je při pH 5,5–6 a vyžadují NAD+ a Mn2+ jako kofaktory aktivity (Miranda a kol., 1997). Dlouhou dobu nebyl znám biochemický význam jablečno-mléčného kvašení. Během kvašení se netvoří pyruvát jako meziprodukt, díky tomu se vědci domnívali, že jablečno-mléčné kvašení neslouží k získávání energie (Osborne a Edwards, 2005). I přes nedostatek důkazů pro laktát/protonový symport v O. oeni (Olsen a kolektiv, 1991), Cox a Henick-Kling publikovali, že laktátový efflux neprodukuje ATP během jablečno-mléčného kvašení při nízkých hodnotách pH. Jiní autoři zase navrhovali, že ATP 15

je produkováno během katabolismu jablečnanu a je spojeno s ∆p, které se tvoří během přenosu jablečnanu a difúze kyseliny mléčné (Osborne a Edwards, 2005). Na podporu této teorie Poolman a kolektiv publikovali, že Lactococcus lactis produkuje ∆p, které je složeno z membránového potenciálu a pH gradientu přes příjem elektronů z jablečnanu společně se spotřebou protonů jako výsledek dekarboxylace L-mléčnanu (Poolman a kol., 1991). Salema a kolektiv navrhli model znázorňující přenos L-jablečnanu na monoaniontovou formu s využitím uniportu (obrázek č. 2). Tento přenos způsobí vnitřní síťový negativní náboj a tak dochází k vytvoření elektrického potenciálu. L-jablečnan je pak dekarboxylován uvnitř buňky na L-kyselinu mléčnou a oxid uhličitý v reakci, která vyžaduje jeden proton. Spotřeba tohoto protonu v cytoplasmě může vytvořit pH gradient, takže se změnou elektrického potenciálu se může vytvořit ∆p přechodem přes cytoplasmatickou membránu. Následná tvorba ATP je přes ATPasu vázanou na membráně. Salema a kolektiv navrhovali, že L-kyselina mléčná a oxid uhličitý opustí buňku jako neutrální látky, které jsou později aktivně transportovány (Salema a kol., 1994). Později tento autor navrhl model, kde ∆p je tvořeno in vitro činností elektronového uniportu v souvislosti se spotřebou protonů při dekarboxylaci L-jablečnanu (Salema a kol., 1996). Obr. 2: Navržený model pro získávání energie (ATP) u Oenococcus oeni přes přeměnu kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou a oxid uhličitý. Upraveno dle Osborne a Edwards, 2005.

Složitost a rozmanitost metabolické aktivity bakterií mléčného kvašení naznačuje, že tyto bakterie mohou ovlivňovat jablečno-mléčné kvašení pozitivně i negativně (Liu, 2002).

16

1.5.2 Vzájemné vztahy mezi bakteriemi a dalšími mikroorganismy ve víně

1.5.2.1 Výskyt mikroorganismů během výroby vína

Některé rody kvasinek a bakterií se přirozeně vyskytují na bobulích hroznů v době sklizně nebo se nacházejí na vinařském zařízení. Díky odlišným tolerancím k inhibičním látkám a různým růstovým požadavkům mohou tyto mikroorganismy úspěšně růst během alkoholového a jablečno-mléčného kvašení (obrázek č. 3 - Fleet a kolektiv, 1984). Během počátečních fází alkoholového kvašení převládají ve víně rody kvasinek, které nepatří do rodu Saccharomyces. Jejich životaschopnost ovšem rapidně klesá díky nedostatku kyslíku a zvýšené koncentraci etanolu kvůli růstu Saccharomyces cerevisiae, které provádí alkoholového kvašení (Heard a Fleet, 1985). Při dokončení tohoto kvašení vstupuje Saccharomyces do stacionární fáze a fáze odumírání, dochází ke zvýšení počtu Oenococcus oeni a začíná jablečno-mléčné kvašení. Další bakterie jako jsou Acetobacter, Lactobacillus a Pediococcus mohou růst po jablečno-mléčném kvašení během uchovávání nebo stárnutí vína (Osborne a Edwards, 2005). Obr. 3: Hlavní výskyt vybraných mikroorganismů během výroby vína. Upraveno dle Osborne a Edwards, 2005.

1.5.2.2 Vzájemné reakce mezi bakteriemi mléčného kvašení

Během výroby vína se vyskytují antagonistické vztahy mezi bakteriemi mléčného kvašení. Například rod Pediococcus, konkrétně P. pentosaceus působí jako antagonista O. oeni, protože dokáže akumulovat malé proteolyticky senzitivní a termostabilní složky. Na základě těchto informací se usuzuje, že růst některých druhů rodu Pediococcus ve víně 17

ještě před jablečno-mléčným kvašením může způsobit značné problémy při začátcích tohoto sekundárního kvašení (Osborne a Edwards, 2005). Některé bakterie mléčného kvašení produkují antibakteriální látky proteinové povahy nazývané bakteriociny. Bakteriociny mají úzké spektrum účinku proti blízce příbuzným druhům (Jack a kolektiv, 1995). Například kmeny P. pentosaceus produkují inhibiční látky proti některým kmenům rodu Lactobacillus, Oenococcus a Pediococcus. Bakteriociny by mohly v budoucnu sloužit jako kontrolní agens bakterií způsobujících kažení vína (Osborne a Edwards, 2005).

1.5.2.3 Vzájemné vztahy mezi bakteriemi mléčného kvašení a Saccharomyces

Nekontrolovatelný růst neznámých laktobacilů může ovlivnit alkoholové kvašení. Často tyto bakterie způsobují zpomalení alkoholového kvašení, tzv. „loudavé“ kvašení. Boulton publikoval, že zrychlený růst „divokých“ laktobacilů způsobuje nadměrnou produkci kyseliny octové během 2-3 dnů a tím inhibuje metabolismus kvasinek. Kyselina octová však nemusí být jediná příčina inhibice kvasinek, působí zde řada dalších neznámých inhibičních faktorů. Vztahy mezi Saccharomyces a O. oeni během výroby vína mohou být jak pozitivní, tak i negativní (Osborne a Edwards, 2005). Příjem a uvolňování živin kvasinkami může značně ovlivnit další vývoj bakterií mléčného kvašení. Během alkoholového kvašení kvasinky vyčerpávají z média snadno asimilovatelné živiny, jako jsou amoniak, hexosy, aminokyseliny a vitamíny (Remize a kol., 2006). Negativní vztahy se vyskytují po naočkování O. oeni do vína a před dosažením koncentrace životaschopných buněk 105-107 na ml. Je to vysvětlováno tím, že Sacchromyces rychleji roste a tak vyčerpá živiny z moštu. Dalším vysvětlením je produkce toxických metabolitů a inhibičních látek jako jsou etanol, SO2, středně větvené mastné kyseliny a antibakteriální proteiny nebo peptidy (Osborne a Edwards, 2005).

18

1.6 Jednotlivé rody bakterií mléčného kvašení

1.6.1 Rod Lactobacillus

Zástupci tohoto rodu jsou grampozitivní, nesporulující bakterie, které mohou být dlouhé a štíhlé tyčinky, někdy mohou být zahnuté, krátké nebo koryneformní kokobacily. Buňky se vyskytují v řetízcích, jsou mikroaerofilní. Tvoří malé kolonie (2-5 mm), které mají celistvé okraje, jsou vypouklé, hladké, lesklé a bez pigmentu. Teplotní optimum je 30-40 °C, ale mohou růst v teplotním rozmezí 2-53 °C. K růstu vyžadují aminokyseliny, peptidy, deriváty nukleových kyselin, vitamíny, soli mastných kyselin nebo estery mastných kyselin a cukry ke kvašení. Tyto nutriční požadavky jsou charakteristické pro každý druh, často pro každý kmen. Jsou striktně sacharolytické, často je konečným produktem mléčnan (Kandler a Weiss, 1986; Osborne a Edwards, 2005). Laktobacily jsou kataláza a cytochrom negativní, jen některé kmeny mohou rozkládat peroxid vodíku na pseudokatalázu (Johnston a Delwiche, 1962). Obsah G + C v DNA je 32-53 molárních %. Hlavní dráhy při fermentaci hexóz jsou Embden-Meyerhofova, která přeměňuje 1 mol hexózy na dva moly kyseliny mléčné (homofermentativní kvašení) a 6-fosfoglukonátová, při které se tvoří 1 mol CO2 a jeden mol etanolu (nebo kyseliny octové) a jeden mol kyseliny mléčné (heterofermentativní kvašení) (Hammes a kol., 1992; Kandler a Weiss, 1986). Laktobacily jsou acidofilní, jsou důležité pro tvorbu i kažení kvašených rostlinných krmiv, potravin a nápojů. Nacházejí se v mléčných a kvašených mléčných produktech, v mase a mastných výrobcích, v rybách a marinovaných výrobcích, v lidském i zvířecím těle, v odpadních vodách a hnojivech (Kandler a Weiss, 1986). Další místo výskytu laktobacilů je rostlinný materiál. Bakterie mléčného kvašení se nacházejí na listnatých površích v počtu 10-1000 na gram, což je 0,01 % celkové mikroflory. Některé druhy rodu Lactobacillus mohou tvořit antagonistické látky, které inhibují Xanthomonas campestris, Erwina carotovora a Pseudomonas syringe (Hammes a kol., 1992).

1.6.1.1 Víno a rod Lactobacillus

Mezi celosvětově rozšířené druhy rodu Lactobacillus izolované z hroznů a vína patří L. brevis, L. buchneri, L. casei, L. cellobisus, L. curvatus, L. fermentum, L. fructivorans, L. hilgardii, L. homohiochii, L. jensenii, L. leichmanii, L. plantarum, 19

L. sake a L. trichodes (Davis a kol., 1986). L. cellobiosus je považován za biotyp L. fermentum, zatímco L. leichmanii je teď uváděn jako L. delbrueckii subspecies lactis (Kandler a Weiss, 1986). L. trichodes je považován za synonymum L. fructivorans (Osborne a Edwards, 2005). Edwards a kolektiv izolovali dva nové druhy Lactobacillus z hroznů v obchodních řetězcích, které způsobují „loudavé“ kvašení - L. kunkeei a L. nagelii (Edwards a kol., 1998). Výskyt a přežívání druhů Lactobacillus ve víně je vysoce závislé na pH a obsahu etanolu (Davis a kol., 1986), na přítomnosti SO2, teplotě a dostupnosti živin (Du Plessis a kol., 2004). Při vysokém pH (>3,5) druhy rodu Lactobacillus často převládají, zatímco při nižších hodnotách pH převládají jiné bakterie mléčného kvašení jako je Oenococcus oeni. Tolerance k etanolu závisí na druhu Lactobacillus (Osborne a Edwards, 2005). Rod Lactobacillus se vyskytuje v alkoholických nápojích po alkoholovém kvašení a může přispívat ke zlepšení kvality těchto nápojů, ale také může způsobovat kažení (Hammes a kol., 1992), záleží na druhu a kmeni laktobacilů a také na tom, v které fázi výroby vína se nachází (Du Plessis a kol., 2004). Jeho nekontrolovatelný růst může vést ke zvýšení kyselosti vína nebo k tvorbě dalších nežádoucích pachů a chutí. Některé druhy produkují velké množství kyseliny octové. Další nežádoucí účinek laktobacillů je pomalé nebo váznoucí kvašení (Osborne a Edwards, 2005). Některé kmeny L.hilgardii byly zapojeny do tohoto kvašení (Edwards a kol., 1998). V mnoha případech, ve kterých „divoké“ laktobacilly způsobují kažení vína, nepoužívají vinaři přidávání oxidu siřičitého a počáteční pH vín bylo kolem 3,5, což jsou podmínky podporující růst rodu Lactobacillus (Osborne a Edwards, 2005). Heterofermentativní laktobacily jsou spojeny s „myšinovým“ defektem vína. Tento typ kažení vína je charakterizován jako rozvoj zapáchajících látek, které způsobují nechutnost vína. Laktobacily spojené s tímto defektem jsou L. brevis, L. higardii a L. celobiosus, mohou tvořit N-heterocyklické báze, jako jsou 2-etyltetrahydropyridin, 2-acetyltetrahydropyridin a 2-acetyl-1-pyrolin. Tvora těchto látek vyžaduje přítomnost etanolu, proto je tento defekt častější ve vínech než v moštech. Některé laktobacily také způsobují alkoholizování vína. Je známé jako „Fresno forma“. Tento typ kažení je charakterizován myceliálním/vláknitým růstem ve víně a je způsobeno L. trichodes (L. fructivorans). Tyto druhy jsou relativně citlivé k oxidu siřičitému, proto užívání antiseptických látek může předejít růstu těchto mikroorganismů (Osborne a Edwards, 2005).

20

Další nežádoucí účinek heterofermentativních laktobacilů ve víně je jejich schopnost degradovat arginin. Dochází k tvorbě amoniaku, citrulinu, ornitinu, ATP a CO2. Tvorba amoniaku způsobí zvýšení pH vína a tím dojde ke zvýšenému růstu nežádoucích bakterií, které mohou využívat tvořící se ATP. Citrulin je toxický, je totiž prekurzorem tvorby karcinogenního uretanu (Orduña a kol., 2001). Některé rody Lactobacillus se také účastní jablečno-mléčného kvašení (Orduña a kol., 2001; Ansanay a kol., 1993), patří mezi ně L. plantarum, L. casei (Ansanay a kol., 1993), L. brevis, L. buchneri, L. hilgardii, L. trichodes, L. fructivorans, L.desidiosus a L. mali (Hammes a kol., 1992).

1.6.1.2 Izolace z vína a uchovávání

Při izolaci laktobacilů se bere ohled na jejich acidofilní povahu a na komplex jejich růstových požadavků. Všechna média musí obsahovat požadované růstové faktory, obvykle s kvasničným extraktem jako zdrojem vitamínů, také pepton, manganázu, acetát a Tween 80. Někdy se také přidává rajčatový džus a etanol (Hammes a kol., 1992). Pro krátkodobé uchovávání (měsíc) se mohou tyto rody uchovávat v chladničce při 4-7 °C na MRS agaru. Někdy se také mohou uchovávat kultury narostlé do stacionární fáze hluboce zamražené v růstovém médiu a uchovávané při – 20 °C. Pro dlouhodobější uchovávání se používá lyofilizace buněk narostlých do logaritmické fáze (Kandler a Weiss, 1986).

1.6.1.3 Odlišení rodu Lactobacillus od ostatních bakterií mléčného kvašení

Laktobacily jsou metabolicky velmi podobné dalším rodům bakterií mléčného kvašení. Jen jejich tvar je dokáže rychle odlišit od kulovitých tvarů rodů Streptococcus, Leuconostoc a Pediococcus, ačkoliv některé striktně heterofermentativní laktobacily tvoří kokotyčinky a tak mohou být zaměněny s rodem Leuconostoc. Tyto druhy jsou odlišeny od leukonostoků produkcí D, L-kyseliny mléčné a tvorbou amoniaku z argininu (Kandler a Weiss, 1986; Hammes a kol., 1992). Heterofermentativní laktobacily tvořící plyn mohou být odlišeny na základě jejich schopnosti hydrolyzovat arginin a tvořit D, L-mléčnan (Holzapfel a Schillinger, 1992).

21

1.6.1.4 Druhová diferenciace

Rod Lactobacillus je tradičně dělen do tří skupin podle schopnosti zkvašování cukrů: Skupina I:

obligátně homofermentativní laktobacily: dokáží zkvašovat hexosy na kyselinu mléčnou pomocí Embden-Meyerhofovy dráhy, pentosy a glukonát nejsou zkvašovány (Kandler a Weiss, 1986). Kyselina mléčná se tvoří ve více než 85 % (Hammes a kol., 1992).

Skupina II: fakultativně heterofermentativní laktobacily: dokáží zkvašovat hexosy na kyselinu mléčnou pomocí Embden-Meyerhofovy dráhy, kromě této kyseliny se ještě tvoří kyselinu octovou, etanol a kyselinu mravenčí při limitaci glukosou. Pentosy zkvašují na kyselinu mléčnou a octovou skrz fosfoketolázovou dráhu. Skupina III: obligátně heterofermentativní laktobacily: dokáží zkvašovat hexosy na kyselinu mléčnou, kyselinu octovou (etanol) a CO2. Pentosy zkvašují na kyselinu mléčnou a octovou. Oba tyto typy kvašení zahrnují fosfoketolázovu dráhu (Kandler a Weiss, 1986).

Druhová identifikace rodu Lactobacillus je poměrně složitá. Komerčně dostupné testy na zkvašování cukrů nemusí být 100 % spolehlivé. Častěji se používá SDS-PAGE, což je identifikace buněčných proteinů na polyakrylamidovém gelu pomocí dodecylsulfátu sodného (Felten a kol., 1999). Může se také používat sekvencování 16S rRNA a PCR reakce s druhově specifickými primery (Du Plessis a kol., 2004).

1.6.2 Rod Leuconostoc

Zástupci tohoto rodu jsou grampozitivní, nepohyblivé, nesporulující bakterie, které mají kulatý až čočkovitý tvar, zvláště rostou-li na agaru. Buňky se vyskytují v párech nebo v řetízcích, jsou fakultativně anaerobní (Garvie, 1986; Thunell, 1995). Jsou relativně necitlivé ke kyslíku, avšak lepší růst je pozorován v redukované atmosféře (Holzapfel a Schillinger, 1992). Tvoří malé kolonie, obvykle menší než 1 mm, které jsou hladké, kulaté, bílošedé. Teplotní optimum je 20-30 °C, ale mohou růst v teplotním rozmezí 5-30 °C po dobu 2 až 10 dnů. Jsou chemoorganotrofní, k růstu vyžadují bohaté médium s komplexem růstových faktorů a požadavků na aminokyseliny. Všechny druhy vyžadují kyselinu nikotinovou, thiamin, biotin a kyselinu pantotenovou nebo její deriváty. Růst je závislý na 22

přítomnosti fermentovaných cukrů a glukosy v kombinaci hexosa-monofosfátové a fosfoketolázové cesty. Leukonostoky jsou kataláza negativní, neobsahují cytochromy a nehydrolyzují arginin. Obsah G + C v DNA je 38-44 molárních % (Garvie, 1986). Rod Leuconostoc má podobnou fyziologii s rodem Lactobacillus, Pediococcus i s ostatními bakteriemi mléčného kvašení. Fyziologicky jsou tyto rody považovány za smíšené. Samotný rod Leuconostoc netvoří jednotnou skupinu. Studie 23S rRNA prokázaly, že Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides a Lc. paramesenteroides patří do dvou značně odlišných skupin (Holzapfel a Schillinger, 1992). V roce 1993 byl Lc. paramesenteroides reklasifikován do rodu Weissella (Thunell, 1995). Leukonostoky

sdílejí

spoustu přirozených

i

umělých

míst

s laktobacily,

upřednostňují neutrální nebo lekce kyselá média. Nacházejí se v nejrůznějších nápojích, v moštu, v mase a v mastných výrobcích, v mléce a v mléčných nápojích, v rostlinných materiálech a fermentovaných výrobcích rostlinného původu (Thunell, 1995).

1.6.2.1 Víno a rod Leuconostoc

Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides a další bakterie mléčného kvašení se nacházejí na povrchu bobulí i listů révy vinné a jsou přítomny i v moštu, avšak nedokáží přežít alkoholové kvašení, nejsou uzpůsobeny růstu při vysoké koncentraci etanolu (Holzapfel a Schillinger, 1992).


Leukonostoky nacházející se ve víně se od ostatních leukonostoků liší fyziologickými vlastnostmi. Média pro jejich selekci jsou založena na jejich acidofilní povaze, toleranci k alkoholu a k adaptaci na prostředí vína. Pro krátkodobé uchovávání (1-2 týdny) se mohou tyto rody uchovávat v chladničce při

4

°C

vpichem

na

šikmém

MRS

agaru.

Pro

dlouhodobější

uchovávání

Lc. mesenteroides subsp. mesenteroieds se používá lyofilizace v roztoku přírodního dextranu, ve kterém dochází k potlačení schopnosti tohoto druhu tvořit tento polysacharid (Holzapfel a Schillinger, 1992).

23

1.6.2.3 Odlišení rodu Leuconostoc od ostatních bakterií mléčného kvašení

Odlišení rodu Leuconostoc od ostatních bakterií mléčného kvašení se provádí na základě fenotypických odlišností jako jsou kulovitý tvar, tvorba plynu, neschopnost hydrolyzovat arginin a produkce D(-)-mléčnanu z glukosy. Často se využívá i tvorba dextranu ze sacharosy a složení buněčné stěny (tabulka č. 1). Morfologické odlišení je často obtížné, leukonostoky, laktokoky a streptokoky mohou totiž tvořit jak koky, tak i tyčinky, laktobacily mohou zase tvořit krátké tyčinky až elipsoidní buňky. Tvorba plynu je základní rozlišující znak, který umožňuje odlišení homofermentativních laktobacilů, pediokoků, laktokoků, enterokoků a streptokoků od leukonostoků (Holzapfel a Schillinger, 1992). Tab. 1: Odlišení rodu Leuconostoc od ostatních bakterií mléčného kvašení. Upraveno dle Holzapfel a Schillinger, 1992. Leukonostoky

morfologie

Heterofermentativní

Homofermentativní

laktobacily

laktobacily

Koky nebo

Kokobacily nebo

Tyčinky

kokobacily

tyčinky

Streptokoky Pediokoky

Carnobakterie

Tyčinky

Koky

Koky v

(kokobacily)

tetrádách

Plyn z glukosy +

+

-

-

-

(+)

-

±

-/+

- nebo +

- nebo +

+

- nebo +

-/+

-/+

-/+

-

-

D (-)

DL

D(-), DL nebo L(+)

L(+)

DL nebo

L(+)

Hydrolýza argininu Dextran ze sacharosy Kyselina

L(+)

mléčná

+

pozitivní reakce,

-/+ většinou negativní reakce,

(+)

slabá pozitivní reakce,

-

negativní reakce

±

většinou pozitivní reakce


Odlišení jednotlivých druhů rodu Leuconostoc se provádí na základě růstu při různých teplotách, při pH 4,8, v 10 % etanolu, na základě hydrolýzy eskulinu, tvorby dextranu ze sacharosy, pigmentu a tvorby kyselin z cukrů (tabulka č. 2 - Holzapfel a Schillinger, 1992).

24

Tab. 2: Odlišení jednotlivých druhů rodu Leuconostoc. Upraveno dle Holzapfel a Schillinger, 1992.

+

pozitivní reakce,

-

negativní reakce,

d

variabilní reakce,

ND žádná data,

±

většinou pozitivní reakce

-/+ většinou negativní reakce

1.6.3 Rod Oenococcus

Kmeny nacházející se ve víně patřící do rodu Leuconostoc byly původně klasifikovány jako Leuconostoc oenos Garviesem v roce 1967. Později fylogenetické studie odhalily, že L. oenos tvoří odlišný dílčí článek mezi dalšími druhy Leuconostoc, proto v roce 1995 byl zpětně reklasifikován Dicksem a kolektivem na nový rod Oenococcus (Dicks a kol., 1995). Zástupci tohoto rodu jsou grampozitivní, nepohyblivé, nesporulující bakterie, které mají elipsoidní nebo kulovitý tvar a vyskytují se obvykle v párech nebo v řetězcích. Tvoří kolonie menší než 1 mm, které jsou hladké, kulaté, šedobílé (Garvie, 1986). Jsou acidofilní, preferují pH 4,8, dokáží však růst i při pH 3,5, a na médiích obsahující 10 % etanolu. Mají stejné požadavky na komplex růstových faktorů a aminokyselin jako leukonostoky, navíc vyžadují glukoso-deriváty kyseliny pantotenové, které jsou známé jako tomato juice faktor. Jsou fakultativně anaerobní až mikroaerofilní, ale mohou růst i v anaerobním prostředí. Optimální teplota růstu je 20-25 ºC, preferují spíše 20 °C (Holzapfel a Schillinger, 1992), ale dokáží růst v teplotním rozmezí 5-30 °C. Jsou kataláza i cytochrom negativní, obsah G + C je 37-39 molárních % (Garvie, 1986).

1.6.3.1 Víno a rod Oenococcus

O. oeni se spolu s dalšími bakteriemi mléčného kvašení vyskytuje na površích listů, bobulí révy vinné a také v nízkých hladinách v moštu, ale pouze jako jediný dokáže přežít 25

během alkoholového kvašení. Je nejvíce zapojen v jablečno-mléčném kvašení ve víně. To je v závislosti na typu vína, regionu a výrobních technikách považováno za prospěšné nebo škodlivé (Holzapfel a Schillinger, 1992). Přeměna kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou vede k přirozenému snížení kyselosti vína, zajišťuje i biologickou stabilitu vína před napouštěním do lahví a ovlivňuje chuť a vůni vína (Cavin a kol., 1989; Miranda a kol., 1997). Jablečno-mléčné kvašení je škodlivé u australských vín, která mají vysoké pH. Dochází u nich ke snížení kvality a růstu bakterií, které způsobují kažení vína. Růst O. oeni a poměr jablečno-mléčného kvašení je ovlivňován pH vína, koncentrací etanolu, SO2, kmenem kvasinek používaných při alkoholovém kvašení (Holzapfel a Schillinger, 1992), teplotou, a inhibičními složkami jako jsou mastné kyseliny, fenolové kyseliny a taniny (Bourdineaud a kol., 2003). Pro jablečno-mléčné kvašení je optimální pH 3,5 a 45 mM saturační koncentrace substrátu (Miranda a kol., 1997). K opoždění nebo k úplnému vymizení tohoto kvašení dochází, když koncentrace O. oeni nedosáhne 106 cfu na ml (Remize a kol., 2006). Glukosa a fruktosa, dva hlavní sacharidy zastoupené ve víně, mohou sloužit jako zdroj energie pro růst O. oeni (Miranda a kol., 1997). Také dusíkaté požadavky na výživu hrají roli při optimalizaci jablečno-mléčného kvašení (Remize a kol., 2006) a je nutné vzít v úvahu interakce jablečnanového metabolismu a metabolismu dalších uhlíkových zdrojů, které jsou přítomny ve víně po alkoholovém kvašení. Kofermentace sacharidů a jablečnanu je závislá na kmeni O. oeni a na kultivačních podmínkách, jako jsou pH a koncentrace biomasy. V přítomnosti 5 mM glukosy dochází k potlačení jablečno-mléčného kvašení v 65–70 %. Také galaktosa, manosa, maltosa a trehalosa dokáží potlačovat tento typ kvašení v 60 % (Miranda a kol., 1997). Během jablečno-mléčného kvašení O. oeni dochází k degradaci kyseliny citrónové (obrázek č. 4). Při této degradaci vzniká jako meziprodukt diacetyl, který je považován za důležitou látku, která ovlivňuje vůni vína. Ve vysokých koncentracích způsobuje „máslové“ nebo „oříškové“ aroma. Zdroj diacetylu je α-acetomléčná kyselina (ALA), což je nestabilní složka, která podléhá spontánní nebo bakteriální dekarboxylaci na acetoin, který je oxidován na diacetyl. Diacetyl je redukován O. oeni na acetoin a 2,3-butandiol, které v normálních koncentracích neovlivňují vůni vína (Nielsen a Richelieu, 1999).

26

Obr. 4: Odbourávání kyseliny citrónové u O. oeni. Upraveno dle Nielsen Richelieu, 1999.


Izolace se provádí na stejných médiích jako pro leukonostoky, někdy se může do média přidat 40–80 % vína ke zlepšení růstu O. oeni. Pro krátkodobé uchovávání se může tento rod uchovávat v chladničce při 4 °C vpichem na šikmém Acidic Tomato agaru (Holzapfel a Schillinger, 1992). Pro dlouhodobé uchovávání se používá lyofilizace v koňském séru se 7,5 % glukosy, buňky musí být narostlé do pozdní logaritmické nebo rané stacionární fáze (Garvie, 1986).

1.6.3.3 Odlišení rodu Oenococcus od ostatních bakterií mléčného kvašení

O. oeni a Lc. mesenteroides jsou si hodně podobné, obě jsou to heterofermentativní bakterie mléčného kvašení (Dicks a kol., 1995). Jsou schopny kvasit pyruvát jako zdroj uhlíku (2 pyruvát → 1 mléčnan + 1 octan + 1 CO2) (Wagner a kol., 2005). Byly řazeny do stejné skupiny na základě fyziologických a genetických podobností (Dicks a kol., 1995; Wagner a kol. 2005). Odlišení rodu Oenococcus od ostatních bakterií mléčného kvašení je poměrně snadné díky jeho růstu při nízkém pH (4,2-4,8) a růstu v 10 % etanolu v médiu s rajčatovým džusem (Holzapfel a Schillinger, 1992). Růst je velmi pomalý, při 22 °C rostou zástupci tohoto rodu 5-7 dnů. Odlišení O. oeni od ostatních leukonostoků je možné na základě RNA/DNA hybridizace, protože leukonostoky patří do jednotné RNA skupiny

27

(Garvie, 1986), nebo pomocí druhově specifické PCR s primery o velikosti 1025 bp (Zapparoli a kol., 1998).


Do rodu Oenococcus patří zatím dva druhy: O. oeni od roku 1995 a O. kitahariae od roku 2006. O. oeni se nachází ve víně, je acidofilní, alkoholtolerantní a je zodpovědný za jablečno-mléčné kvašení, zatímco O. kitahariae není acidofilní, ani nezpůsobuje jeblečno-mléčné kvašení a nachází se v kompostovaných zbytcích, proto odlišení těchto druhů není problém (Endo a Okada, 2006).

1.6.4 Rod Pediococcus

Zástupci tohoto rodu jsou grampozitivní, nepohyblivé, nesporulující bakterie, které mají kulovitý tvar. Jsou to jediní zástupci bakterií mléčného kvašení, kteří se dělí ve dvou rovinách a tak tvoří tetrády nebo shluky buněk. Jsou aerobní až mikroaerofilní, chemoorganotrofní a vyžadují komplex růstových faktorů a aminokyselin. Všechny druhy vyžadují kyselinu nikotinovou, pantotenovou a biotin. Jsou kataláza i cytochrom negativní, avšak některé kmeny mohou tvořit pseudokatalázu, zvláště když rostou na médiích s nízkým obsahem sacharidů (Weiss, 1992; Osborne a Edwards, 2005). Pediokoky jsou homofermentativní, zkvašují glukosu na D, L- a v případě P. dextranicus a P. halophilus na L(+)-mléčnan přes Embden-Meyerhofovu dráhu bez tvorby CO2. Rostoucí kultury jsou také schopny tvořit L(+)-mléčnan z kyseliny jablečné. Netvoří plyn z glukosy. Nacházejí se na rostlinách a ovoci, ale jen v malém počtu. Můžeme je také najít ve kvašeném rostlinném materiálu, jako jsou siláže, okurky nebo olivy, zde se rychle pomnožují a převládnou nad ostatními bakteriemi mléčného kvašení v počátečních fázích alkoholového kvašení. Dalším přirozeným místem výskytu pediokoků jsou sýry, sojová omáčka, pivo, čerstvé i konzervované maso, syrové klobásy, čerstvé a marinované ryby (Weiss, 1992).

28

1.6.4.1 Víno a rod Pediococcus

Pediococcus se může dostávat do vína z půdy, z bobulí révy vinné, z vinařského vybavení. Jejich přežívání ve víně je zvýhodněno při pH vyšším než 3,5 (Davis a kol., 1986). Druhy, které se nacházejí ve víně, jsou P. damnosus, P. inopinatus, P. pentosaceus a P. parvulus (Lafon-Lafourcade a kol., 1983). Růst pediokoků ve víně je považován za nežádoucí, produkují totiž zapáchající a nechutné látky, mezi které patří acetoin a diacetyl. Ty vznikají ve vysoké koncentraci. Některé druhy rodu Pediococcus jsou schopny degradovat glycerol na akroletin, látku, která reaguje s fenolovou složkou antokyanů. Tak vzniká hořká chuť vína (Osborne a Edwards, 2005). Za určitých podmínek však může být růst pediokoků ve víně prospěšný, někdy totiž mohou tvořit vůně a příchutě pro víno žádoucí (Fleet a kol., 1984). Kromě produkce nežádoucích látek ve víně může tento rod tvořit β-D-glukany, což jsou extracelulární polysacharidy. Tyto glukany jsou tvořeny z glukosy a obsahují trisacharidovou opakující se jednotku spojenou 1→3 vazbou v hlavním řetězci a 1→2 vazbu, která připojuje vedlejší řetězce jedné D-glukopyranosyl skupiny. Způsobují zvýšení viskozity vína a mají zvýšenou odolnost k etanolu (Osborne a Edwards, 2005).


Pro izolaci pediokoků z rostlin a kvašených rostlinných materiálů se používá MRS agar. Ke krátkodobému uchovávání těchto rodů (měsíc) se používají příslušná média naočkovaná vpichem a uchovávaná v chladničce při 4 °C. K dlouhodobějšímu uchovávání se používají konzervační média s glycerolem uchovávaná při – 20 °C. Pro dlouhodobé uchovávání slouží lyofilizace (Weiss, 1992).

1.6.4.3 Odlišení rodu Pediococcuss od ostatních bakterií mléčného kvašení

K odlišení pediokoků od ostatních bakterií mléčného kvašení se využívá jejich charakteristických vlastností. Tyto vlastnosti umožňují jejich odlišení od ostatních grampozitivních koků s vysokou spolehlivostí (Weiss, 1992).

29


Druhová diferenciace je založena na schopnosti růstu v teplotním rozmezí, při různém pH, při koncentraci solí, na schopnosti kvasit cukry, hydrolyzovat arginin a tvořit isomery kyseliny mléčné (tabulka č. 3 - Weiss, 1992). Tab. 3: Vlastnosti k odlišení druhů rodu Pediococcus. Upraveno dle Weiss, 1992. P.

P.

P.

P.

P.

P.

P.

damnosus

parvulus inopinatus

dextrinicus

pentoseceus

acidilactici

halophilus

urinaeequi

P.

Růst při pH 4,5

+

+

ND

-

+

+

-

-

Růst při pH 7

-

+

+

+

+

+

+

+

Růst při 45 °C

-

-

-

-

d

+

-

-

Růst při 10% NaCl

-

-

-

-

d

-

+

-

Pseudokataláza

-

-

ND

-

+

+

-

-

NH3 z argininu

-

-

-

-

+

+

-

-

Kyselina z ribosy

-

-

-

-

+

+

+

ND

Kyselina z arabinosy

-

-

-

-

+

d

+

d

Kyselina z xylosy

-

-

-

-

d

+

-

d

Kyselina z manitolu

-

-

-

-

-

-

-

d

Kyselina z laktosy

-

-

+

d

d

d

-

d

Kyselina z maltosy

d

+

+

+

+

-

+

+

Kyselina ze sacharosy

d

-

d

d

-

-

+

+

Kyselina z trehalosy

+

d

+

-

+

d

-

-

Kyselina z melesitosy

d

-

-

-

-

-

-

+

Kyselina z dextrinu

-

-

d

+

-

-

-

+

Kyselina ze škrobu

-

-

-

+

-

-

-

-

Isomer mléčnanu

DL

DL

DL

L(+)

DL

DL

L(-)

L(+)

+

90% a více kmenů pozitivní

-

90% a více kmenů negativních

d

11-89% kmenů pozitivních

ND

žádná data

1.7 Identifikace bakterií mléčného kvašení

Rodová diferenciace: morfologická charakteristika na základě makroskopického vzhledu a mikroskopie za pomocí Gramova barvení. V návaznosti jsou používány biochemické testy: katalázová reakce, růst při odlišných koncentracích, tvorba CO2 z glukosy, tvorba NH3 z argininu, růst při teplotách 45 °C a 15 °C aerobně, růst na masopeptonovém agaru při 30 °C.

30

Druhová identifikace: komerční souprava API 50CH (bioMérieux), zejména pro druhy rodů Lactobacillus, Lactococcus a Leuconostoc. Principem testu je fermentace 49 odlišných substrátů, která se projevuje různě intenzivní změnou barvy indikátoru. Konečné vyhodnocení se provádí pomocí identifikačního programu BACTSELEKT pro numerickou identifikaci bakterií mléčného kvašení s použitím matrice LAB API 50 CHL V8.0. (Štegnerová a kol., 2007).

1.8 Schisosacchcaromyces pombe a Saccharomyces cerevisiae

Některé kmeny kvasinek, konkrétně Sch. pombe mohou účinně odbourávat vysoké koncentrace kyseliny jablečné. Schopnost této kvasinky odbourávat extracelulární kyselinu jablečnou je závislá na transportu dikarboxylových kyselin a na účinnosti intracelulárních jablečných enzymů. Tyto jablečné enzymy přeměňují kyselinu jablečnou na kyselinu pyrohroznovou, která je později metabolizována na etanol a CO2 při kvašení skrz jablečnoetanolovou dráhu. Mezi jablečné enzymy patří malátpermeasa, cytoplasmatický jablečný enzym a mitochondriální malátdehydrogenasa. Transport L-kyseliny jablečné u některých kmenů Sch. pombe je aktivní pouze v přítomnosti glukosy a dalších využitelných zdrojů uhlíku a není závislý na substrátu. Tento druh je vysoce tolerantní k vysoké koncentraci L-kyseliny jablečné, až 29 g na litr může být odbouráno bez jakéhokoliv účinku na buněčný růst. Tento vysoce aktivní metabolismus odbourávání nijak neovlivňuje metabolismus cukrů nebo schopnosti produkovat etanol (Volschenk a kol., 2003). K úplnému jablečno-mléčnému kvašení se také používá geneticky modifikovaná S. cerevisiae (Camarasa a kol., 2001; Husnik a kol., 2006), která obsahuje gen mleS z Lactococcus lactis kódující jablečnomléčný enzym a gen mae1 pro malátpermeasu ze Sch. pombe. Všechny tyto geny jsou pod kontrolou kvasinkového promotru. Pak dochází k souběžnému alkoholovému a jablečno-mléčnému kvašení (Bony a kol., 1997), přičemž nedochází ke snížení účinnosti jablečného kvašení. Rekombinantní kmeny S. cerevisiae jsou pak schopny dekarboxylovat až 4,5 g na litr jablečnanu na mléčnan a CO2 během 4 dnů (Husnik a kol., 2006).

31

1.9 Bakterie octového kvašení

Bakterie octového kvašení (AAB = acetic acid bacteria) jsou gramnegativní nebo gramvariabilní, aerobní, chemoorganotrofní, kataláza pozitivní, tyčinky nebo elipsoidní bakterie, které se vyskytují v párech nebo v řetízcích. Mohou být pohyblivé pomocí peritrichálních bičíků nebo pomocí 1-8 polárních bičíků nebo nepohyblivé. Jejich teplotní optimum je 25-30 °C, optimální pH je 5-6, obsah G + C v DNA je 51-65 molárních % (De Ley a kol., 2005). Patří do čeledi Acetobacteraceae, její nejvýznamnější rody jsou Acetobacter, Acidomonas, Gluconobacter a Gluconacetobacter (Ruiz a kol., 2000). Acetobacter a Gluconobacter byly izolovány z květin, ovoce, vína, moštu, piva, včel a medu. Jsou to primární mikroorganismy zahrnuty v produkci octa. Acetobacter může být také nalezen v zahradní půdě a odpadní vodě (De Ley a kol., 2005).

1.9.1 Bakterie octového kvašení a víno

Gluconobacter

oxydans,

Acetobacter

aceti,

Acetobacter

pasteurianus,

Gluconacetobacter liquefaciens a Gluconacetobacter hansenii jsou přidruženy s hrozny a vínem (Du Toit a Lambrechts, 2002; Joyeux a kol., 1984). Během kvašení a skladování převládají rody G. oxydans, A. pesteurianus a A. aceti. Druhy rodu Gluconobacter jsou běžně izolovány z hroznů a šťávy, ale vymizí na počátku alkoholového kvašení díky jejich nízké toleranci k etanolu nebo díky ztrátě kyslíku. Gluconobacter oxydans je nejvýznamnější druh, který se nachází na zdravých, nehnilých hroznech. Acetobacter je více tolerantní k etanolu než Gluconobacter a může přežívat i během alkoholového kvašení. A. aceti a A. pasteurianus izolovány z hroznů a šťávy běžně dosahují populace 106 buněk na gram poškozených hroznů. Tyto druhy jsou časté na kazících se hroznech. (Joyeux a kol., 1984). Kvasinky přítomné na poškozených hroznech mohou metabolizovat hroznové cukry a tak produkovat etanol, který je těmito bakteriemi oxidován na kyselinu octovou. Vysoká koncentrace bakterií octového kvašení jako 3,9 g na litr může být nalezena ve šťávě z poškozených hroznů (Osborne a Edwards, 2005). Hustota bakterií octového kvašení je spojena se stupněm napadení révy vinné. Čím více jsou hrozny napadeny a poškozeny, tím více se na nich nachází bakterií octového kvašení. Čerstvá hroznová šťáva na počátku sklizně obsahuje průměrně 102 buněk na 1 ml bakterií octového kvašení (Joyeux a kol., 1984).

32

Protože jsou bakterie octového kvašení aerobní povahy, jsou přirozeně potlačovány v anaerobním prostředí, které je spojeno s alkoholovým kvašením (Osborne a Edwards, 2005). Ačkoliv A. pasteurianus a A. aceti jsou častěji izolovány z vín uskladňovaných v sudech nebo dalších nádržích ve vinařských závodech v semiaerobních podmínkách (Joyeux a kol., 1984). Přežívání bakterií octového kvašení v těchto vínech může být způsobeno vystavením vína na vzduch během čerpání a přenosu. Například Drysdale a Fleet uvedli, že bakterie octového kvašení mohou dosáhnout ve víně počtu 108 cfu na ml po vystavení kyslíku během přečerpávání. Kromě přítomnosti kyslíku je růst bakterií octového kvašení značně ovlivňován pH moštu (Osborne a Edwards, 2005). Ve studii Du Toita a Lambrechta je uvedeno, že počet bakterií octového kvašení se snížil z 105 cfu na ml na 102 cfu na ml v moštu s pH menším než 3,5, zatímco v moštu s pH 3,7 byla zjištěna vyšší buněčná životaschopnost (Du Toit a Lambrechts, 2002). Bakterie octového kvašení tvoří kyselinu octovou skrz oxidaci etanolu pomocí dvou enzymů vázaných na membránu, alkoholdehydrogenasy a aldehyddehydrogenasy. Alkoholdehydrogenasa oxiduje etanol na acetaldehyd, který je dále oxidován na kyselinu octovou pomocí aldehyddehydrogenasy (Saeki a kol., 1997). Některé kmeny bakterií octového kvašení mohou produkovat více než 50 g na litr z etanolu, což je dělá důležitými v produkci vinného octa (Lu a kol., 1999). Během růstu ve víně využívají bakterie octového kvašení glukosu jako zdroj uhlíku, ačkoliv glukosa je lepší zdroj uhlíku pro Gluconobacter než pro Acetobacter, protože ne všechny kmeny Acetobacter mohou účinně využívat tento cukr. Druhy Acetobacter metabolizují cukry skrz hexosa-monofosfátovou cestu, také přes Embden-MeyerhofParnasovu cestu a Entner-Doudoroffovu cestu a produkují octan a mléčnan. Tyto látky mohou být později oxidovány některými kmeny na oxid uhličitý a vodu skrz cestu trikarbonových kyselin. Na rozdíl od rodu Acetobacter, druhy rodu Gluconobacter využívají jen pentosa-fosfátovou cestu k tvorbě energie. Tyto organismy neobsahují funkční cyklus trikarbonových kyselin, proto nemohou oxidovat octan a mléčnan až na oxid uhličitý a vodu. Kromě glukosy mohou bakterie octového kvašení využívat i další cukry, které se mohou nacházet ve víně, jako jsou arabinosa, fruktosa, galaktosa, manitol, manosa, ribosa, sorbitol a xylosa (De Ley a kol., 2005).

33

1.9.1.1 Bakterie octového kvašení a červené víno Čerstvě vylisovaný mošt obsahuje zhruba 104 buněk na ml G. oxydans. Populace se značně sníží během alkoholového kvašení a na konci tohoto kvašení (10 dnů) víno obsahuje jen asi 20 buněk na ml (tabulka č. 4). Poměr G. oxydans v populaci se snižuje a naopak poměr A. pasteurianus v populaci se zvyšuje. Při odtoku vína z kvasných tanků dojde ke zvýšení populace na 3 x 104 buněk na ml. Na počátku jablečno-mléčného kvašení je ve víně počet bakterií octového kvašení 102-103 na ml, převažuje hlavně A. pasteurianus a v menším množství G. oxydans a A. aceti (tabulka č. 5). Po dokončení jablečno-mléčného kvašení (3 měsíce) počet buněk zůstává na 102 na ml v zastoupení hlavně A. aceti a v menším procentu A. pasteurianus. Pak dochází k přidávání SO2 do vína, k filtraci a skladování vína. Po 11 měsících skladování je počet buněk 102-103 na ml a skládá se hlavně z A. aceti a z menšího množství A. pasteurianus. Množství těchto mikroorganismů je skoro stejné na povrchu i ve spodu barelů. Na konci této fáze převládá A. aceti subsp. aceti (Joyeux a kol., 1984). Tab. 4: Vývoj bakterií octového kvašení během výroby červeného vína. Upraveno dle Joyeux a kol., 1984.

Tab. 5: Vývoj bakterií octového kvašení během jablečno-mléčného kvašení a skladování červeného vína v barelech. Upraveno dle Joyeux a kol., 1984.

34

1.9.1.2 Bakterie octového kvašení a kažení vína

A. aceti a A. pasteurianus jsou často spojeny s kažením vína pomocí produkce vysoce těkavých kyselin. Tyto bakterie jsou aerobní, ale jsou běžně izolovány z vína ze dna tanků a barelů, proto jsou schopny přežívat a možná i růst v anaerobních a semi-anaerobních podmínkách (Bartowsky a kol., 2003). Hlavní význam bakterií octového kvašení při kažení vína je v produkci nadměrného množství kyseliny octové v přítomnosti nízké koncentrace kyslíku (Bartowsky a kol., 2003). Zákonem udávaný limit pro kyselinu octovou je 1,2 –1,4 g na litr, je to koncentrace, která také značně snižuje kvalitu vína. Drysdale a Fleet uvedli, že až 50–60 % obsahu etanolu ve víně může být oxidováno těmito bakteriemi s produkcí kyseliny octové 1,5 – 3,75 g na litr (Osborne a Edwards, 2005). Další hlavní produkt, který ovlivňuje kvalitu vína je etylacetát. Tato látka je vysoce nežádoucí již při obsahu 10 mg na litr. Bylo prokázáno, že bakterie octového kvašení produkují etylacetát až do koncentrace 140 mg na litr ve víně a 30 mg na litr v moštu. Další nežádoucí látky pro kvalitu vína kromě kyseliny octové a etylacetátu, které produkují bakterie octového kvašení, jsou acetaldehyd (Osborne a Edwards, 2005), acetoin a dihydroxyaceton (Wixom, 1965). Drysdale a Fleet uvedli, že byla zjištěna zvýšená koncentrace acetaldehydu ve víně, kde rostly bakterie octového kvašení. Koncentrace acetaldehydu nad smyslový práh ve víně (což je 100–125 mg na litr) je nepříjemná kvůli „zelené“, „travnaté“ a „rostlinné“ vůni. Dihydroxyaceton může být produkován A. aceti a G. oxydans přes metabolismus glycerolu v aerobních podmínkách. Tato látka může ovlivňovat smyslovou kvalitu vína sladkou/esterickou chutí a může také reagovat s prolinem za tvorby „kůrové“ vůně. Kromě toho acetaldehyd a dihydroxyaceton mohou vázat oxid siřičitý ve víně za tvorby látek, které jsou neúčinné jako antimikrobiální agens. Na závěr, některé druhy Acetobacter mohou využívat laktát za produkce acetoinu, prekurzoru diacetylu (Osborne a Edwards, 2005). Nejvyšší riziko kažení vína bakteriemi octového kvašení je během rozsáhlého skladování ve sklepě před stáčením do lahví. Toto riziko může být sníženo zabráněním vystavení vína kyslíku, nebo přidáváním SO2 (Bartowsky a kol., 2003).

35

1.10 Metoda MALDI -TOF MS

Metoda MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry) hmotnostní spektrometrie je vysoce výkonná a spolehlivá metoda pro klasifikaci a identifikaci mikroorganismů (Fenselau a Demlrev, 2001; Krishnamurthy a Ross, 1996; Lay, 2001), která využívá přímý přístup (obrázek č. 5 - Lay, 2001). Jako první použila hmotnostní spektrometrii k charakterizaci bakterií Fenselau v roce 1975. V roce 1994 Cain uvedl, že používání off-line chromatografie v kombinaci s metodou MALDITOF MS rozlišuje bakterie v závislosti na analýze proteinů (Liu a kol., 2007). Obr. 5: Hlavní zpracování mikroorganismů k identifikaci a ke klasifikaci. Upraveno dle Maier a kol., 2006b.

Tato metoda se využívá k fylogenetické klasifikaci a identifikaci bakterií, kvasinek i hub, dokonce i k identifikaci a klasifikaci problémových mikroorganismů (Bacillus cereus) (Maier a kol., 2006a) ze vzorků životního prostředí. Je schopna rozlišit mikroorganismy až na úroveň kmenů (Jones a kol., 2003). Na rozdíl od PCR nebo analýzy metabolitů nepotřebuje MALDI žádné počáteční určování jako je výběr primerů, oxidázový test nebo barvení dle Grama. Tato metoda je jednoduchá, rychlá, vyžaduje jen malé množství biologického materiálu a je vysoce reprodukovatelná. Díky těmto vlastnostem, nízkým nákladům a vysoké rozlišovací schopnosti je tato metoda skvělou alternativou ke klasickým mikrobiologickým technikám (Krishnamurthy a Ross, 1996; Liu a kol., 2007; Maier a kol., 2006a).

36

Při této technice jsou rostoucí bakteriální kolonie přímo přemístěny z povrchu agaru na MALDI destičku, na které jsou překryty mikroobjemem matrixového roztoku a pak jsou ozářeny N2 laezrem (Ishida a kol., 2005). Počáteční materiál pro přípravu vzorků může být jedna kolonie (Fenselau a Demlrev, 2001) nebo pelet zcentrifugované tekuté kultury. Optimální koncentrace buněk pro přesné měření je 105 na ml, detekční limit spor je uváděn 103 na ml (Maier a kol., 2006b). Vzorek se nanáší jako tenký film přímo na MALDI destičku, kde se překryje 2 µl matrixového roztoku a vysuší se (Fenselau a Demlrev, 2001). Jako MALDI matrixový roztok je doporučován nasycený roztok HCCA (alfa-kyano-4hydroxy kyselina skořicová) v organickém rozpouštědle (OS), které je složeno z 50% acetonitrilu (ACN), 2,5% trifluorooctové kyseliny (TFA) a destilované vody (Maier a kol., 2006b). Hmotnostní

spektra

jsou

získána

s využitím

FLEX

řady

MALDI-TOF

hmotnostního spektrometru v lineárním positivním režimu při maximální frekvenci (20 až 200 Hz). Hmotnostní rozmezí spektra je 2000 až 20 000 Da. Automatizovaná spektra jsou získaná pomocí automatizovaného Bruker softwaru s kontrolou intenzity laezru. Většinou se vystřeluje 500 x laezrem v 50-ti různých pozicích nanesené kapky. Energie laezru je nastavena mírně pod práh ionizace k získání spektra o maximálním rozlišení a širokém hmotnostním rozmezí (Maier a kol., 2006b). Výhodou metody MALDI-TOF je její vysoká opakovatelnost (Fenselau a Demlrev, 2001). Různé složení růstového média jen málo ovlivňuje rozložení píků, zvláště v rozmezí 4000 až 12 000 Da, nedochází k žádnému ovlivňování. Ani přítomnost média, které adheruje na bakteriální kolonie nemá vliv na vzniklé signály. Růstová fáze buněk má malý vliv na píky, buňky v lag fázi vykazují velmi podobné vlastnosti jako buňky ve stacionární fázi nebo ve fázi odumírání. Navíc příprava vzorků a jejich měření jsou prováděny za standardizovaných podmínek, proto získaná spektra jsou vysoce srovnatelná při různých měřeních metodou MALDI-TOF (Maier a kol., 2006b). Pro přípravu vzorků k charakterizaci grampozitivních i gramnegativních bakterií byly vyvinuty univerzální postupy (Krishnamurthy a Ross, 1996; Liu a kol., 2007). Získaná spektra mohou být použita k vytvoření velké a spolehlivé databáze. Významná opakovatelnost této metody je založena na měření konstantně tvořených vysokomolekulárních proteinů, například ribosomálních proteinů. Hmotnostní rozmezí spektra je 2000 až 20 000 Da, analýzy při tomto rozmezí obsahují málo měřitelných metabolitů (Maier a kol., 2006b). Analyzační BioTyper software obsahuje zařízení pro získávání hmotnostních spekter a zařízení pro identifikaci a klasifikaci mikroorganismů. Identifikace neznámých 37

mikroorganismů se provádí porovnáváním vytvořených píků s knihovnou uložených spekter, které obsahují charakteristické spektra druhů a poddruhů. Tyto knihovny jsou získány měřením známých bakteriálních druhů a kmenů v různých dnech v úzce definovaných podmínkách. Software automaticky vybírá píky z celé řady spekter a vygeneruje typické píky, které jsou zastoupeny v určitém počtu spekter jednoho druhu (Maier a kol., 2006b).

38

2. CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE Cílem této diplomové práce jsou mikroorganismy v procesu výroby červeného vína, práce je zaměřena na bakterie podílející se na vzniku charakteristických senzorických vlastností, tak na bakterie nežádoucí.

Vlastní provedení zahrnuje:

-

izolaci bakterií v různých fázích výroby červeného vína

-

přečištění vyizolovaných kmenů a jejich uchování tak, aby byly nezměněny pro další použití a studium

-

taxonomickou charakterizaci izolovaných kmenů (např. na základě MALDI-MS profilu)

-

ověření vhodnosti vyžití MALDI-MS metody pro charakterizaci a identifikaci izolátů z vína

-

získání přehledu o tom, které rody bakterií mléčného kvašení se nacházejí v jednotlivých fázích výroby vína, zda se tyto rody opakují a zda jsou rozdíly v počtu a zastoupení jednotlivých rodů ve vzorcích vína

39

3. MATERIÁL A METODY 3.1 Použité vzorky vína

V diplomové práci byly použity vzorky moštu a červeného vína ze zahradnické fakulty v Lednici, která je součástí Mendlovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně. Vzorky byly odebírány do plastových zkumavek s víčkem o objemu 50 ml. Doby odběrů vzorků byly přizpůsobeny jednotlivým fázím výroby vína. Tab. 6: Vzorky vína, obsah cukru, a datum sběru jednotlivých odrůd.

Vzorek

Obsah cukru

Datum sběru

Frankovka

19 º NM

11. 10. 2006

Ariana

19,5 º NM

13. 10. 2006

Cerason

22 º NM

26. 10. 2006

Mi-5-70

21 º NM

26. 10. 2006

Cabernet Sauvignon

21,5 º NM

2005

Tab. 7: Fáze výroby vína, při kterých byly odebírány vzorky, datumy jednotlivých odběrů.

Odběr číslo

Fáze výroby

Datum odběru

1

Fáze macerace, alkoholové kvašení

6. 11. 2006

2

Po vylisování hroznů

13. 11. 2006

3

Začátek jablečno-mléčného kvašení

20. 11. 2006

4

Probíhá jablečno-mléčné kvašení

4. 12. 2006

5

Ukončení jablečno-mléčného kvašení, stočení vína

24. 1. 2007

Vzorek Ariana byl uchováván v KEG sudu, vzorky Frankovka, Cerason a Mi-5-70 byly uchovávány v kovových kádích a vzorek Cabernet Sauvignon byl uchováván ve skleněném demižonu. Cabernet Sauvignon sloužil jako srovnávací vzorek, jedná se o hotové víno po hrubé filtraci z roku 2005. Do všech vzorků kromě vzorku Ariana byly přidávány bakterie mléčného kvašení O. oeni BioStar Oenos sk1, které distribuje německá firma Erbslöich Gaisen.

40

3.2 Kultivační média

ACETOBACTER-GLUCONOBACTER AGAR Kvasničný extrakt………………….……………………………10 g Glukosa………………………………………………………...100 g CaCO3………………………………………………..……….…20 g Agar……………………………………………………………..25 g Destilovaná voda……………………………………………1000 ml pH = 7,4 ± 0,2

ACETOBACTER AGAR (GLUCOSE) Kvasničný extrakt..………………………………...…….,….…..10 g CaCO3………………………………………………..…….…….10 g Glukosa………………………………………………………..…..3 g Agar…………………………………………………….…….…..15 g Destilovaná voda…………………………………………….1000 ml pH = 7,4 ± 0,2 K izolaci bakterií octového kvašení (Yamada a kol., 1999).

LACTOBACILLUS AGAR (M.R.S. = de Man, Rogosa, Sharpe) Pepton………………………………………………………..….10 g Lab-Lemco prášek………………………………………..………8 g Kvasničný extrakt……………………………………...……....…4 g Glukosa……………………………………………...……...…...20 g Tween 80………………………………………………………..1 ml Hydrogenfosfát draselný……………………………………...….2 g Acetát sodný x 3H2O…………………………………...………..5 g Citrát amonný……………………………………....…………….2 g Sulfát hořečnatý x 7H2O ……………………...….…………....0,2 g Sulfát manganatý x 4H2O……….….………...……………....0,05 g Agar……………………..…………..……...…………………...15 g Destilovaná voda…………………..………………………..1000 ml pH = 6,2 ± 0,2 K izolaci bakterií mléčného kvašení (Hammes a kol., 1992). 41

TOMATO JUICE AGAR Pepton…………………………………………………………...…10 g Peptonové mléko…………………………………………………..10 g Rajčatový džus……………………………………………….…400 ml Agar………………………………………………………………..20 g Destilovaná voda………………………………………………..600 ml pH = 6,1 ± 0,2

TOMATO JUICE AGAR Rajčatový džus…………………………………………….……….20 g Pepton…………………………………………………………...…10 g Peptonové mléko…………………………………………………..10 g Agar………………………………………………………………..12 g Destilovaná voda……………………………………… …….1000 ml pH = 6,1 ± 0,2 K izolaci bakterií rodu Oenococcus, Leuconostoc a Pediococcus (Holzapfel a Schillinger, 1992).

NUTRIENT AGAR (MPA 1) Pepton……………………………………………………………....5 g NaCl………………………………………………………………...5 g Hovězí extrakt…………………………………………………….1,5 g Kvasničný extrakt…………………………………………………1,5 g Agar………………………………………………………………..15 g Destilovaná voda………………………………………………1000 ml pH = 7,4 ± 0,2

Sterilizace kultivačních médií byla prováděna autoklávováním po dobu 15-20 minut při teplotě 121 °C. Na vysterilizovaná média se pipetovalo 0,1 ml vína sterilními špičkami, následovalo rovnoměrné rozetření pomocí sterilních skleněných hokejek. Pro ukládání mikroorganismů do glycerolových konzerv byly použity roztoky sterilního Acetobacter média, MPB, MRS média, Tomato juice broth a sterilního 15 % glycerolu ve výsledném objemu 1ml.

42

Pro ukládání mikroorganismů na korálcích byly použity ochranná sterilní Acetobacter média, MPB, MRS média a Tomato juice broth s 15% glycerolem.

3.3 Antimykotika

K potlačení růstu kvasinek byl použit nystatin, což je polyenové antimykotikum s velmi dobrou účinností. Je poměrně toxický, váže se na ergosterol a tak ovlivňuje permeabilitu buněčné stěny a cytoplasmatické membrány (Votava, 2001). 30 mg práškového nystatinu bylo naředěno 6ti ml dimetylsulfoxidu. Po rozpuštění se pipetovalo 0,1 ml sterilními špičkami na misky, následovalo rovnoměrné rozetření pomocí sterilních skleněných hokejek. Nystatin se používal od druhého odběru v Lednici (13. 11. 2006).

3.3.1 Testování citlivosti na antimykotikum nystatin

Zkoušely se tři typy ředění nystatinu dimetylsulfoxidem u vzorku Ariana, odběr 2: Zkumavka č.1: 15 mg nystatinu + 3 ml dimetylsulfoxidu, pipetovat 0,1 ml sterilními špičkami na misku. Zkumavka č.2: 100 µl směsi ze zkumavky č.1 + 100 µl dimetylsulfoxidu, pipetovat 0,1 ml sterilními špičkami na misku. Zkumavka č.3: 100 µl směsi ze zkumavky č.2 + 100 µl dimetylsulfoxidu, pipetovat 0,1 ml sterilními špičkami na misku. Napipetované antimykotikum se rovnoměrně rozetřelo po miskách pomocí sterilních skleněných hokejek.

43

3.4 Kultivace mikroorganismů

Kultivace mikroorganismů z moštu a červeného vína probíhala na miskách s uvedenými médii s nystatinem. Tomato agar se používal od druhého odběru (13. 11. 2006), MRS agar se nepoužíval v posledním odběru (24. 1. 2007), antimykotikum nystatin se používalo od druhého odběru (13. 11. 2006). Pro přehlednost jsou použitá média v jednotlivých odběrech shrnuty v tabulce č. 8. Tab. 8: Použitá média při izolaci mikroorganismů z moštu a červeného vína.

Odběr Datum

Použitá média / počet jednotlivých izolátů

nystatin

číslo

odběru

Acetobacter agar MPA

MRS agar

Tomato agar

1

6. 11. 2006

+

+

+

-

-

2

13. 11. 2006

+

+

+

+

±

3

20. 11. 2006

+

+

+

+

+

4

4. 12. 2006

+

+

+

+

+

5

24. 1. 2007

+

+

-

+

±

Obr. 6: Izolace z Mi-5-70

Obr.7: Izolace z Frankovky

horní řada – Tomato, Aceto, MPA a MRS agar,

horní řada – Tomato, Aceto, MPA a MRS agar,

dolní řada - Tomato, Aceto, MPA a MRS agar

dolní řada - Tomato, Aceto, MPA a MRS agar

s přídavkem nystatinu

s přídavkem nystatinu

Kultivace probíhala při 30 ºC po dobu 7 dnů, nárůst byl hodnocen po 24. hod, 48. hod, 72. hod, 96. hod, 120. hod, 144. hod a 168. hod.

44

3.5 Uchovávání mikroorganismů

Vyizolované a přečištěné kultury byly uchovávány na šikmých agarech při 4 ˚C po dobu 1–2 týdnů v chladničce a následně uchovávány jako tzv. glycerolové konzervy a na korálcích. Glycerolové konzervy byly připraveny resuspendováním 2-3 kliček 48. hodinové nebo 72. hodinové kultury v 850 µl Acetobacter média, MPB, MRS média, Tomato broth a 150 µl sterilního glycerolu. Zamražení bylo provedeno při teplotě – 70 °C, uchovávání při – 25 °C. Při uchovávání na korálcích se do sterilních kryozkumavek se saponátem omytými 22. korálky pipetovalo cca 2 ml ochranného Acetobacter média, MPB, MRS média a Tomato juice broth s glycerolem. Na 100 ml média se přidávalo 15 g glycerolu. Do ochranného média se přidaly 2-3 kličky 48. hodinové nebo 72. hodinové kultury, poté se médium odsálo pomocí pipety a kultury se zamrazily při teplotě – 70 °C, poté byly uchovávány při –25 °C.

3.6 Použité přístroje

Autokláv PS 20 A (Chirana, ČR) Autokláv Sanyo (Japonsko) Centrifuga T24 (Janetzki) Flow box Schoeller instruments clean air EH 12469 (Nizozemí) Fotoaparát Nikon (Japonsko) Chladničky (Gorenje, Calex, Liebherr) Laboratorní váhy Sartorius Excellence, E 2000 D (Gottlingen AG, Německo) Mikroskop OLYMPUS (Japonsko) Termostat BT 120 (Liebher, Švýcarsko) Vortex (Heidolph) Zařízení Reflex IV (Bruker, Brémy, Německo)

45

3.7 Základní diagnostické testy

Vyizolované a přečištěné kultury byly zamraženy a připraveny pro identifikaci pomocí základních diagnostických testů a metody MALDI-TOF.

3.7.1 Makroskopie kolonií

Byl hodnocen vzhled kolonií, tvar, velikost, barva a přibližný počet. Makroskopie se prováděla u kultur narostlých na Acetobacter agaru, MRS agaru, Tomato juice agaru a MPA.

Příklady dokumentace nárůstu izolátů na agarových médiích: Obr.8: Frankovka + nystatin, odběr 5,

Obr.9: Mi-5-70 + nystatin, odběr 4,

kolonie č. 2, Tomato agar


3.7.2 Barvení dle Grama

Barvení dle Grama se provádělo u kultur narostlých na Acetobacter agaru, MRS agaru a Tomato juice agaru. Na podložní sklíčko se nanesla kapka vody, přidala se klička kultury, sklíčko se nechalo usušit. Fixace v plameni. Fixovaný preparát se barvil krystalovou violetí, která obarvila buňky tmavěmodře až fialově. Následovalo barvení Lugolovým roztokem, což v buňkách vedlo ke vzniku komplexu barviva s jodem. Dalším krokem bylo působení 96% etanolu, grampozitivní bakterie si podržely komplex krystalové violeti s jodem, gramnegativní bakterie se odbarvily. Poslední barvení bylo safraninem (Votava, 2001).

46

3.7.3 Mikroskopie kolonií

Usušená a nabarvená sklíčka se pozorovala pod světelným mikroskopem při zvětšení 10 x 100 pomocí imerzního oleje.

Příklady kultur po barvení dle Grama: Obr.10: Ariana + nystatin, odběr 5,

Obr.11: Cerason + nystatin, odběr 5,

kolonie č.1, Tomato agar


Obr.12: Mi-5-70 + nystatin, odběr 4,

Obr.13: Frankovka + nystatin, odběr 5,



47

3.7.4 Identifikace bakterií mléčného kvašení

Tyto testy se prováděly u kultur narostlých na MRS agaru a Tomato juice agaru.

3.7.4.1 KOH test

KOH test se prováděl k potvrzení, zda jsou kultury grampozitivní či gramnegativní. Na podložní sklíčko se nanesla kapka 3% KOH, do které se přidala klička 48. hodinové nebo 72. hodinové kultury. U gramnegativních bakterií došlo k porušení buněčné stěny a cytoplasmatické membrány a k lyzy buňky, tím došlo ke změně viskozity během 5-60 s. Kultura se táhla za kličkou. U grampozitivních bakterií k porušení buněčné stěny nedošlo (Carlone a kol., 1983). 3.7.4.2 Růst v MPB

Připravily se zkumavky s MPB, které se naočkovaly kličkou 48. hodinové nebo 72. hodinové kultury. Jako kontrola růstu kultur sloužily zkumavky s Tomato juice broth a MRS médiem. Kultivace probíhala při 30 °C po dobu 48 hod až 72 hod.

3.7.4.3 Katalázový test

Katalázový test je založen na katalytické přeměně katalázy H2O2 na H2O + O2. Unikání kyslíku je pozorovatelné okem, vznikají bublinky. Na podložní sklíčko se nanese kapka 3% H2O2, vedle této kapky se nanese klička 48. hodinové nebo 72. hodinové kultury, následuje rozetření kultury v H2O2. K uvolňování kyslíku dochází ihned po reakci kultury s H2O2 (MacFaddin, 2000).

48

3.7.4.4 Růst při 15 °C a při 45 °C

Růst při při 15 °C a při 45 °C se prováděl v Tomato juice broth a MRS médiu. Tato média se naočkovala kličkou 48. hodinové nebo 72. hodinové kultury a nechala se kultivovat při daných teplotách 48 hod až 72 hod. Jako kontrola růstu kultur sloužily zkumavky s Tomato juice broth a MRS médiem kultivované při teplotě 30 °C po dobu 48 hod až 72 hod.

3.7.4.5 Tvorba NH3 z argininu Princip tohoto testu je rozklad argininu na ornitin + NH3 + CO2. Detekce NH3 se provádí Nesslerovým činidlem. Médium:

Trypton…………………………………………0,5 g Kvasničný extrakt………………………....……0,5 g Glukosa…………………………………….….0,05 g KH2PO4………………………..………………0,2 g L-arginin……………………………………….0,3 g Destilovaná voda…………………………….100 ml pH = 7

Zkumavky se očkovaly 48. hodinovou nebo 72. hodinovou kulturou, kultivace probíhala 72 hod při 30 °C. Nesslerovo činidlo:

KI……………………………………………..…..7 g I2Hg……………………………………………...10 g KOH……………………………………………..10 g Destilovaná voda……….……………………..100 ml

Na podložní sklíčko se nanesly 3-4 kapky kultury narostlé v médiu a přidala se kapka Nesslerova činidla (Niven a kol, 1944; Langston a Bouma, 1960). Tab. 9: Zbarvení při pozitivní a negativní reakci, použité kontrolní kmeny.

Reakce

Zbarvení

Kontrolní kmeny

Pozitivní

Oranžová - hnědá

L. brevis CCM 1815

Negativní

Beze změny

L. rhamnosus CCM 1828 49

3.7.4.6 Hydrolýza eskulinu

Principem tohoto testu je schopnost hydrolyzovat glykosid eskulin na eskuletin a glukosu. Eskulin je hydrolyzován v místě glykosidické vazby. Vzniklý eskuletin je detekován pomocí železitých iontů, se kterými tvoří tmavě hnědý až černý fenolický komplex.

Médium: Pepton……………………………………….1 g Eskulin…………………………………….0,1 g Citronan železitý…………………………0,05 g Destilovaná voda………………………...100 ml pH = 7

Zkumavky s médiem byly naočkovány 48. hodinovou nebo 72. hodinovou kulturou, inkubace probíhala 48 hod až 72 hod při teplotě 30 °C. Pozitivní reakce bylo tmavě hnědé až černé zbarvení, negativní reakce byla barva média beze změny (Cowan, 1974).

50

3.7.4.7 Tvorba plynu z glukosy

Princip tohoto testu je tvorba bublinek CO2 při kontaktu inokula s rozžhavenou kličkou. Médium: Pepton………………………………...…..1,25 g Kvasničný extrakt…………...………...…..0,75 g Tween 80………………………………….0,2 ml Octan sodný…………………………….…..0,5 g NaCl………………………….…………..…0,5 g Glukosa…………………….………...……….2 g Roztok solí A……………………………...0,5 ml Roztok solí B……………………………...0,5 ml Destilovaná voda…………...…………….100 ml pH = 6,2 – 6,6 (Sperber a Swan, 1976)

Roztok solí A: K2HPO4……………………..10 g KH2PO4…………………..…10 g Destilovaná voda….………100 ml

Roztok solí B: MgSO4 x 7 H2O…….….....11,5 g MnSO4 x 4 H2O………...…..2,4 g FeSO4 x 7 H2O………....…0,68 g Destilovaná voda…….…...100 ml (Hayward, 1957)

Do 24. hodinového inokula se ponoří rozžhavená klička (červený žár). Při pozitivní reakci se produkce plynu projeví buď bohatou tvorbou bublinek, nebo malým proužkem bublinek. Při negativní reakci bublinky nevznikají, je nutné prodloužení doby kultivace o dalších 24 hod a poté zopakovat ponoření s rozžhavenou kličkou (Sperber a Swan, 1976).

51

3.7.4.8 Tvorba plynu z glukonátu

Princip tohoto testu je tvorba CO2 a kyseliny při fermentaci cukrů. Vznikající CO2 je jímán do plynovky. Médium: Pepton………………………………...……...1 g Kvasničný extrakt…………………….….....0,5 g Tween 80………………………………….0,1 ml Glukonát draselný……………………………3% Roztok solí A……………………………...0,5 ml Roztok solí B……………………………...0,5 ml Destilovaná voda……………………...….100 ml pH = 7,2

Roztok solí A: K2HPO4……………………..10 g KH2PO4…………………..…10 g Destilovaná voda…………100 ml

Roztok solí B: MgSO4 x 7 H2O……..….....11,5 g MnSO4 x 4 H2O…..…….…..2,4 g FeSO4 x 7 H2O……..…..…0,68 g Destilovaná voda………….100 ml

Vysterilizovaná média se dala na 24 hod do termostatu při 37 °C na zkoušku sterility. Koncentrace glukonátu draselného se stanovovala na 3 %. Médium s plynovkou se převrstvilo parafinovým olejem, které se očkovalo 48. hodinovou nebo 72. hodinovou kulturou. Kultivace probíhala 1–10 dnů při 30 °C. Pozitivní reakcí byl vznik plynu, který byl zachycen v plynovce, při negativní reakci plyn nevznikl (Davis 1955; Hayward 1957).

52

3.8 Metoda MALDI-MS

Tato metoda je univerzální na grampozitivní i gramnegativní bakterie, jen se liší v přípravě vzorku pro analýzu. U grampozitivních buněk je jejich buněčná stěna rozrušena lysozymem v místě β-1,4-glykosidických vazeb mezi N-acetylglukosaminem a kyselinou N-acetylmuramovou v peptidoglykanu (Smole a kol., 2002).

3.8.1 Metoda etanolové extrakce

Protože jsme tuto metodu použily pro bližší identifikaci bakterií mléčného kvašení, ke kultivaci našich kultur jsme použily MRS agar a Tomato juice agar. Doba kultivace kultur byla 72 hod při 30 °C, pro MALDI-MS se použila druhá pasáž. První pasáž byla použita ze šikmého agaru nebo z glycerolové konzervy. Po 72. hodinách se přeočkovávala druhá pasáž, z té se odebíral nárůst sterilní umělohmotnou kličkou. Pro přípravu vzorku se odebíraly dvě plné kličky z 2. a 3. kvadrantu. Příprava vzorků: do vysterilizovaných a vysušených zkumavek Eppendorf jsme napipetovali 300 µl sterilní demi Q-vody, přidali jsme dvě plné kličky narostlé bakteriální kultury (5-10 mg) a vortexovali při 1500–2000 otáčkách. K suspenzi jsme přidali 900 µl 96% absolutního etanolu a znova vortexovali při 1500–2000 otáčkách. Následovala centrifugace při 14 000 otáčkách po dobu 2. minut a slití supernatantu do sklenice s dezinfekcí. Zbylý etanol se odstranil nesterilně pomocí pipety. Získaný pelet se umístil na led a převezl do Bohunic, kde byl dále zpracováván. Pelet je možno uchovávat v chladničce týden. Metodou MALDI-MS jsme se pokoušeli identifikovat 31 našich kultur, které byly potenciální bakterie mléčného kvašení, 6 typových kultur z České sbírky mikroorganismů a 1 vzorek O. oeni BioStar Oenos sk1, který jsme oživili ve 20 °C teplé vodě a poté kultivovali na Tomato agaru při 30 °C po dobu 7 dnů. Pelet byl resuspendován v 50% acetonitrilu a 0,1% trifluoroctové kyselině (TFA). Následovalo rozrušení buněčné stěny lysozymem, pak byl vzorek smíchán s matricí, která je v nadbytku k analyzovanému roztoku. Po usušení následovala MALDI-TOF MS analýza (Smole a kol. 2002).

53

3.9 Typové kultury

Ke srovnání spekter, které jsme získali z našich kultur, jsme použili typové kultury z České sbírky mikroorganismů (CCM). Tyto typové kultury jsme vybírali tak, abychom zahrnuli široké spektrum bakterií mléčného kvašení, které se nacházejí ve víně a podporují jablečno-mléčné kvašení. Tab. 10: Použité typové kultury z CCM.

Název typové kultury

Doba kultivace

Teplota

(hod)

kultivace (°C)

Lactobacillus sakei subsp. sakei CCM 7203T

48

30

CCM 7039T

48

30

24-48

37

CCM 1803T

72

25

Pediococcus dextrinicus

CCM 3457T

72

25

Pediococcus inopinatus

CCM 3451T

72

30

Lactobacillus plantarum

Označení CCM

Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 1877T Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides

3.10 Doplňující diagnostické testy

Jako doplňující testy jsme použili růst při pH 4,8, růst v 10 % etanolu a fermentaci sacharosy a maltosy. Tyto testy slouží k odlišení rodu Oenococcus od ostatních leukonostoků.

3.10.1 Růst při pH 4,8

Ke zkumavkám s Tomato juice broth se pipetou přes filtrační papír přidávala 1M HCl. HCl se přidávala tak dlouho, dokud nám pH nekleslo na 4,8. Hodnotu pH jsme kontrolovali pH papírky. Média se očkovala 48. hodinovou nebo 72. hodinovou kulturou a nechala se kultivovat po dobu 48–72 hod. Pozitivní reakcí byl zákal, který vytvořila rostoucí kultura, negativní reakcí bylo čiré médium.

54

3.10.2 Růst v 10 % etanolu

Ke sterilnímu základu z Tomato juice broth se přidával přes filtrační papír 96% etanol. Etanol se přidával tak dlouho, dokud jeho koncentrace nebyla 10 g na 100 ml média. Na 5 ml média jsme přidávali 0,6337 ml etanolu. Média se očkovala 48. hodinovou nebo 72. hodinovou kulturou a nechala se kultivovat po dobu 48–72 hod. Pozitivní reakcí byl zákal, který vytvořila rostoucí kultura, negativní reakcí bylo čiré médium.

3.10.3 Fermentace cukrů

Princip tohoto testu je tvorba CO2 a kyseliny při fermentaci cukrů. Pozitivní reakcí je změna barvy média, ke které dochází vlivem okyselení média. Médium: Pepton………………………….……...……...1 g Kvasničný extrakt……………………..…....0,5 g Tween 80………………………………….0,1 ml Maltosa / sacharosa…….…………………..…1 g BKP 0,2% roztok v 50% etanolu……………2 ml Roztok solí A……………………………...0,5 ml Roztok solí B……………………………...0,5 ml Destilovaná voda………………………....100 ml pH = 7,2

Roztok solí A: K2HPO4……………………..10 g KH2PO4…………………...…10 g Destilovaná voda…………100 ml

Roztok solí B: MgSO4 x 7 H2O…...…….....11,5 g MnSO4 x 4 H2O……….….....2,4 g FeSO4 x 7 H2O…………..…0,68 g Destilovaná voda……….….100 ml

Vysterilizovaná média se dala na 24 hod do termostatu při 37 °C na zkoušku sterility. Médium se očkovalo 48. hodinovou nebo 72. hodinovou kulturou. Kultivace

55

probíhala 1–10 dnů při 30 °C. Pozitivní reakcí bylo žluté zbarvení, negativní reakcí byla barva média beze změny (Davis 1955; Hayward 1957). 3.10.4 API 50 CH Tento typ testu se používá k identifikaci rodu Lactobacillus a příbuzných rodů. Obsahuje médium API 50 CHL, které umožňuje fermentaci 49 sacharidů. Během inkubace jsou sacharidy fermentovány na kyseliny, což navodí pokles pH, který se detekuje změnou barvy indikátoru. Výsledky tvoří biochemický profil, který je využit identifikačním softwarem k identifikaci kmene.

Tímto testem jsme identifikovali kultury : Ariana + nystatin, odběr 5, kolonie č.1 Cerason + nystatin, odběr 5, kolonie č.3

Médium:

Polypepton (hovězího/vepřového původu)…..……..10 g Kvasničný extrakt…………………………..………..5 g Tween 80……………………………………………1 ml Hydrogenfosforečnan draselný……………...……….2 g Octan sodný………………………………...……..…5 g Diamonium-citrát…………………….……...…….....2 g Síran hořečnatý……………………….……...……0,20 g Síran manganatý……………………………...…...0,05 g Bromkresolová červeň……………………...……..0,17 g Demineralizovaná voda…………………...…….1000 ml pH = 6,7 – 7,1

Fyziologický roztok o objemu 2 ml jsme naočkovali kličkou kultury, která se kultivovala 72 hod při 30 °C. Vytvořili jsme suspenzi se zákalem rovným 2 McFarlandovy zákalové stupnice. Tuto suspenzi jsme nasáli do Pasteurovy pipety a kapali do dalšího fyziologického roztoku na zákal rovný 2 McFarlandovy zákalové stupnice. Nakapali jsme 15 kapek k vytvoření daného zákalu. Promíchali jsme vzniklou suspenzi. Do nové Pasteurovy pipety jsme nasáli suspenzi a inokulovali jsme 2 x 15 kapek do API 50 CHL média. Opět jsme promíchali suspenzi. Zkumavky s jednotlivými cukry jsme plnili inokulovaným API 50 CHL médiem a všechny testy jsme převrstvili minerálním olejem. 56

Inkubovali jsme při 30 °C po dobu dnů. Testy jsme odečítaly po 24. hod, 48. hod, 96. hod a 168. hod. Pozitivní reakcí byla změna barvy média z fialové na žlutou, negativní reakcí bylo původní zbarvení média. Tab. 11: Použité cukry a jejich zkratky při API 50 CH.

Zkumavka Test

Aktivní složky

Množství (mg/jam.)

0

KONTROLA

-

1

GLY

GLYcerol

1,64

2

ERY

ERYthritol

1,44

3

DARA

D-ARAbinosa

1,4

4

LARA

L-ARAbinosa

1,4

5

RIB

D-RIBosa

1,4

6

DXYL

D-XYLosa

1,4

7

LXYL

L-XYLosa

1,4

8

ADO

D-ADOnitol

1,36

9

MDX

Methyl-βD-Xylopyranosid

1,28

10

GAL

D-GALaktosa

1,4

11

GLU

D-GLUkosa

1,56

12

FRU

D-FRUktosa

1,4

13

MNE

D-MaNosa

1,4

14

SBE

L-SorBosa

1,4

15

RHA

L-RHAmnosa

1,36

16

DUL

DULcitol

1,36

17

INO

INOsitol

1,4

18

MAN

D-MANitol

1,36

19

SOR

D-SORbitol

1,36

20

MDM

Metyl-αD-Manopyranosid

1,28

21

MDG

Metyl- αD-Glukopyranosid

1,28

22

NAG

N-AcetylGlukosamin

1,28

23

AMY

AMYgdalin

1,08

24

ARB

ARButin

1,08

25

ESC

Eskulin

1,16

Citrát železa

0,152 57

26

SAL

SALicin

1,04

27

CEL

D-CELobiosa

1,32

28

MAL

D.MALtosa

1,4

29

LAC

D-Laktosa (hovězího původu)

1,4

30

MEL

D-MELibiosa

1,32

31

SAC

D-SACharosa

1,32

32

TRE

D-TREhalosa

1,32

33

INU

INUlin

1,28

34

MLZ

D-MeLesitosa

1,32

35

RAF

D-rafinosa

1,56

36

AMD

škrob

1,28

37

GLYG

GLYkoGen

1,28

38

XLT

XyLitol

1,4

39

GEN

GENtibiosa

0,5

40

TUR

D-TURanosa

1,32

41

LYX

D-LYXosa

1,4

42

TAG

D-TAGatosa

1,4

43

DFUC

D-FUCosa

1,28

44

LFUC

L-FUCosa

1,28

45

DARL

D-ARabitoL

1,4

46

LARL

L-ARabitoL

1,4

47

GNT

GlukoNáT draselný

1,84

48

2KG

2-KetoGlukanát draselný

2,12

49

5KG

5-KetoGlukonát draselný

1,8

3.11 Identifikace bakterií octového kvašení

U izolátů vyrostlých na Acetobacter agaru jsme provedli makroskopii, pozorovali jsme také hydrolýzu uhličitanu vápenatého a vznik projasněných míst pod koloniemi a mikroskopii po barvení dle Grama.

58

4. VÝSLEDKY

4.1 Izolace bakterií z vína

Označení izolátů vyplývá z doby jednotlivých odběrů a počtu typů jednotlivých kolonií. Jako první je uveden název vína, pak číslo odběru a číslo kolonie. Z 5ti odběrů uskutečněných v listopadu, v prosinci 2006 a v lednu 2007 bylo získáno a uchováno 334 izolátů. Při odběru č. 1 bylo získáno 28 izolátů, při odběru č. 2 bylo získáno 56 izolátů, při odběru č. 3 bylo získáno 74 izolátů, při odběru č. 4 bylo získáno 100 izolátů a při odběru č. 5 bylo získáno 76 izolátů. Pro lepší orientaci je v tabulce č. 12 uveden přehled odběrů, počet jednotlivých izolátů z jednotlivých médií, a zda se používalo antimykotikum nystatin. Tab. 12: Datum odběrů a počet jednotlivých izolátů na jednotlivých médiích.

Odběr Datum

Použitá média / počet jednotlivých izolátů

nystatin

číslo

odběru

Acetobacter agar MPA

MRS agar Tomato agar

1

6. 11. 2006

11

9

8

-

-

2

13. 11. 2006

15

20

10

11

±

3

20. 11. 2006

27

27

12

8

+

4

4. 12. 2006

42

35

10

13

+

5

24. 1. 2007

28

34

-

14

±

4.2 Testování citlivosti na antimykotikum nystatin

Zkoušely se tři typy ředění nystatinu dimetylsulfoxidem u vzorku Ariana, odběr 2. Na misku č. 1 se pipetovala koncentrace 5 mg/1 ml (15 mg nystatinu + 3 ml dimetylsulfoxidu ze zkumavky č. 1). Na misku č. 2 se pipetovala koncentrace 2,5 mg/1 ml (100 µl směsi ze zkumavky č. 2, která obsahovala 100 µl směsi ze zkumavky č.1 + 100 µl dimetylsulfoxidu). Na misku č. 3 se pipetovala koncentrace 1,25 mg/1 ml (100 µl směsi ze zkumavky č.2 + 100 µl dimetylsulfoxidu). Docházelo tak k postupnému ředění nystatinu. Na misce č. 1 vyrostlo několik desítek smetanových kolonií, stejně jako na misce č. 2. Na misce č. 3 vyrostlo 13 smetanových kolonií a asi na jedné třetině misky se vytvořil souvislý bílý nárůst buněk kvasinkového typu. 59

Obr. 14: Misky s jednotlivým ředěním nystatinu pomocí dimetylsulfoxidu.

4.3 Základní diagnostické testy

Tyto testy se prováděly u izolátů narostlých na Tomato agaru a MRS agaru. Sloužily k identifikaci bakterií mléčného kvašení, popřípadě k jejich rodové a druhové identifikaci.

4.3.1 Makroskopie a mikroskopie kolonií

U všech 334 izolátů, které byly získány z jednotlivých odběrů vína, byla provedena makroskopie kolonií, u izolátů vyrostlých na Tomato agaru, MRS agaru a Acetobacter agaru byla provedena i mikroskopie. Přehled makroskopie a mikroskopie jednotlivých kolonií vyrostlých na Tomato agaru a MRS agaru při 30 °C za 1 až 7 dnů, které nás nejvíce zajímají, protože by to mohly být bakterie mléčného kvašení, jsou uvedeny v tabulkách č. 13 a 14. Tab. 13: Makroskopie a mikroskopie jednotlivých kolonií vyrostlých na Tomato agaru. Víno, odběr, číslo kolonie Makroskopie Mikroskopie smetanové, lesklé, větší, rozlité kolonie Frankovka, odběr 2, kolonie č. 1 s vypouklým středem G + buňky kvasinkového typu Frankovka + nystatin, odběr 2, bílé, lesklé, malé kolonie s vypouklým G+ krátké tyčinky se zaoblenými kolonie č. 1 středem konci, ve dvojcích nebo ve shlucích Frankovka + nystatin, odběr 2, bílé, matné, velké, vrásčité kolonie, G + dlouhé, štíhlé tyčinky, netvoří kolonie č. 2 uvnitř médium vlákna Frankovka + nystatin, odběr 3, G + malé, nepravidelné koky, ve kolonie č. 1 bezbarvé, lesklé, malé kolonie dvojcích Frankovka + nystatin, odběr 3, smetanové, lesklé, větší, rozlité kolonie kolonie č. 2 s vypouklým středem G+ buňky kvasinkového typu Frankovka + nystatin, odběr 4, smetanové, lesklé, větší, rozlité kolonie kolonie č. 1 s vypouklým středem G+ buňky kvasinkového typu Frankovka + nystatin, odběr 4, nahnědlé, lesklé, malé kolonie G+ krátké, štíhlé tyčinky, ve

60

kolonie č. 2 Frankovka + nystatin, odběr 4, kolonie č. 3 Frankovka + nystatin, odběr 5, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 5, kolonie č. 2

shlucích smetanové, lesklé, větší, rozlité kolonie s vypouklým středem bezbarvé, lesklé, malé kolonie s vypouklým středem bezbarvé, lesklé, malé kolonie s vypouklým středem

Ariana + nystatin, odběr 2, kolonie bílé, lesklé, malé kolonie s vypouklým č. 1 středem Ariana + nystatin, odběr 2, kolonie č. 2 bezbarvé, lesklé, malé kolonie Ariana + nystatin, odběr 3, kolonie nahnědlé, lesklé, malé kolonie s č. 1 vypouklým středem Ariana + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 bílé, lesklé, velké, kulaté kolonie Ariana + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 bebarvé, lesklé, velké kolonie Ariana + nystatin, odběr 4, kolonie nahnědlé, lesklé, malé kolonie s č. 2 vypouklým středem smetanové, lesklé, větší, rozlité kolonie Ariana, odběr 5, kolonie č. 1 s vypouklým středem smetanové, lesklé, větší, rozlité kolonie Ariana, odběr 5, kolonie č. 2 s vypouklým středem bezbarvé, lesklé, malé kolonie s Ariana, odběr 5, kolonie č. 3 vypouklým středem bezbarvé, lesklé, malé kolonie s Ariana, odběr 5, kolonie č. 4 vypouklým středem Ariana + nystatin, odběr 5, kolonie č. 1 bezbarvé, lesklé, malé kolonie Ariana + nystatin, odběr 5, kolonie č. 2 bezbarvé, malé lesklé kolonie

G+ buňky kvasinkového typu G+ štíhlé tyčinky variabilní délky, jednotlivě nebo ve dvojcích G+ štíhlé tyčinky variabilní délky, jednotlivě nebo ve dvojcích G+ štíhlé, dlouhé tyčinky, ve shlucích, netvoří řetízky G+ malé koky, jednotlivě G- krátké, štíhlé tyčinky, ve shlucích G+ dlouhé tyčinky se zaoblenými konci, ve shlucích G+ štíhlé tyčinky různé délky, jednotlivě nebo ve shlucích G+ štíhlé tyčinky, jednotlivě nebo ve shlucích G+ buňky kvasinkového typu G+ buňky kvasinkového typu G+ dlouhé tyčinky, ve dvojcích G+ štíhlé, dlouhé tyčinky, netvoří řetízky G+ malé koky, v řetízcích G+ krátké tyčinky, ve shlucích

Cerason + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 2, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 5, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 5, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 5, kolonie č. 3

G+ koky, jednotlivě nebo ve bílé, lesklé, malé kolonie shlucích žluté, lesklé, velké kolonie s vypouklým G+ zavalité tyčinky se zaoblenými středem konci, v řetízcích nebo ve shlucích G- koky - kokotyčky, ve dvojcích bezbarvé, lesklé, malé kolonie nebo ve shlucích smetanové, lesklé, větší, rozlité kolonie s vypouklým středem G+ buňky kvasinkového typu G+ štíhlé, krátké tyčinky, ve bezbarvé, lesklé, malé kolonie dvojcích G+ krátké tyčinky, jednotlivě nebo bezbarvé, lesklé, malé kolonie ve dvojcích G+ kokotyčky, ve dvojcích nebo ve nahnědlé, lesklé, malé kolonie shlucích

Cabernet Sauvignon, odběr 2, kolonie č. 1 Cabernet Sauvignon, odběr 2, kolonie č. 2 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1

smetanové, lesklé, větší, rozlité kolonie s vypouklým středem G+ buňky kvasinkového typu

nahnědlé,malé kolonie, kožovitý vzhled G+ kokotyčky, ve shlucích bezbarvé, lesklé, malé kolonie

G+ malé koky, v řetízcích

bezbarvé, lesklé, malé kolonie

G+ drobné koky, ve shlucích

bezbarvé, lesklé, malé kolonie

G+ drobné tyčinky, ve shlucích

61

Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 4, kolonie č. 3 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 5, kolonie č. 1 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 5, kolonie č. 2 Mi-5-70 + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Mi-5-70 + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Mi-5-70 + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Mi-5-70 + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Mi-5-70 + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2 Mi-5-70 + nystatin, odběr 4, kolonie č. 3 Mi-5-70 + nystatin, odběr 5, kolonie č. 1

nahnědlé, hrubé, vrásčité kolonie bezbarvé, lesklé, malé kolonie smetanové, lesklé, větší, rozlité kolonie s vypouklým středem hnědé, rozlité, vrásčité kolonie s nepravidelnými okraji hnědé, rozlité, vrásčité kolonie s nepravidelnými okraji

G+ dlouhé, masivní tyčinky, ve shlucích G+ štíhlé tyčinky, ve shlucích G+ buňky kvasinkového typu G+ zavalité tyčinky se zaoblenými konci, netvoří řetízky G+ zavalité tyčinky se zaoblenými konci, netvoří řetízky

nahnědlé, lesklé, velké, rozlité kolonie s G+ zavalité tyčinky se zaoblenými nepravidelnými okraji konci, ve shlucích bezbarvé, lesklé, malé kolonie bílé, lesklé, malé kolonie s vypouklým středem bezbarvé, lesklé, malé kolonie s vypouklým středem nahnědlé, lesklé, malé kolonie s vypouklým středem smetanové, lesklé, větší, rozlité kolonie s vypouklým středem bezbarvé, lesklé, malé kolonie

G+ dlouhé tyčinky, netvoří řetízky G+ malé tyčinky, ve shlucích G+ tyčinky, některé zkrácené, jednotlivě G+ kokotyčky až zkrácené tyčinky, jednotlivě nebo ve shlucích G+ buňky kvasinkového typu G+ štíhlé tyčinky, jednotlivě, v řetízcích nebo ve shlucích

Tab. 14: Makroskopie a mikroskopie jednotlivých kolonií vyrostlých na MRS agaru. Víno, odběr, číslo kolonie Makroskopie Mikroskopie smetanové, lesklé, větší, rozlité kolonie Frankovka, odběr 1, kolonie č. 1 s vypouklým středem G+ buňky kvasinkového typu smetanové, lesklé, větší, rozlité kolonie Frankovka, odběr 2, kolonie č. 1 s vypouklým středem G+ buňky kvasinkového typu Frankovka + nystatin, odběr 2, smetanové, matné, vrásčité kolonie, G- dlouhé, štíhlé tyčinky se kolonie č. 1 uvnitř médium zaoblenými konci, netvoří řetízky Frankovka + nystatin, odběr 2, bílé, lesklé, malé kolonie s vypouklým G+ koky, jednotlivě nebo ve kolonie č. 2 středem shlucích Frankovka + nystatin, odběr 3, G+ tyčinky se zašpičatělými konci, kolonie č. 1 bezbarvé, lesklé, malé kolonie jednotlivě nebo ve dvojcích Frankovka + nystatin, odběr 3, bílé, lesklé kolonie s vypouklým G+ koky, ve dvojcích nebo ve kolonie č. 2 středem shlucích Frankovka + nystatin, odběr 4, smetanové, lesklé, malé kolonie s G+ štíhlé tyčinky různé délky, kolonie č. 1 vypouklým středem jednotlivě nebo ve dvojcích Frankovka + nystatin, odběr 4, bílé, lesklé, malé kolonie s vypouklým G+ dlouhé, štíhlé tyčinky se kolonie č. 2 středem zaoblenými konci, jednotlivě smetanové, lesklé, větší, rozlité kolonie s vypouklým středem G+ buňky kvasinkového typu smetanové, lesklé, větší, rozlité kolonie Ariana, odběr 1, kolonie č. 2 s vypouklým středem G+ buňky kvasinkového typu G+ krátké, zavalité tyčinky se Ariana + nystatin, odběr 2, kolonie bílé, lesklé, malé kolonie s vypouklým zaoblenými konci, jednotlivě nebo č. 1 středem ve shlucích Ariana + nystatin, odběr 2, kolonie bílé, lesklé, malé kolonie s vypouklým G+ dlouhé, štíhlé tyčinky se č. 2 středem zaoblenými konci, v řetízcích Ariana + nystatin, odběr 3, kolonie bezbarvé, lesklé, malé kolonie s G+ malé koky, ve shlucích Ariana, odběr 1, kolonie č. 1

62

č. 1 vypouklým středem Ariana + nystatin, odběr 3, kolonie bílé, lesklé, velké kolonie s vypouklým č. 2 středem Ariana + nystatin, odběr 4, kolonie bezbarvé, lesklé, malé kolonie s č. 1 vypouklým středem Ariana + nystatin, odběr 4, kolonie bezbarvé, lesklé, velké kolonie s č. 2 vypouklým středem

Cerason, odběr 1, kolonie č. 1 Cerason, odběr 1, kolonie č. 2 Cerason, odběr 1, kolonie č. 3 Cerason + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 3 Cabernet Sauvignon, odběr 1, kolonie č. 1 Cabernet Sauvignon, odběr 2, kolonie č. 1 Cabernet Sauvignon, odběr 2, kolonie č. 2

smetanové, lesklé, větší, rozlité kolonie s vypouklým středem smetanové, lesklé, větší, rozlité kolonie s vypouklým středem smetanové, lesklé, větší, rozlité kolonie s vypouklým středem bílé, lesklé, malé kolonie s vypouklým středem bezbarvé, lesklé, malé kolonie s vypouklým středem bílé, lesklé, malé kolonie s vypouklým středem

G+ tyčinky se zaoblenými konci, ve shlucích G+ tyčinky variabilní délky se zaoblenými konci, ve shlucích G+ tyčinky se zaoblenými konci, jednotlivě nebo ve shlucích

G+ buňky kvasinkového typu G+ buňky kvasinkového typu G+ buňky kvasinkového typu G+ koky, netvoří řetízky G+ dlouhé, štíhlé tyčinky se zaoblenými konci, v řetízcích G+ koky, jednotlivě nebo ve shlucích G+ malé koky ve dvojcích nebo ve shlucích

bezbarvé, lesklé, malé kolonie smetanové, lesklé, větší, rozlité kolonie s vypouklým středem G+ buňky kvasinkového typu G+ krátké, zavalité tyčinky se nahnědlé, lesklé, malé kolonie s zaoblenými konci, jednotlivě nebo vypouklým středem ve shlucích

Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2

smetanové, lesklé, větší, rozlité kolonie s vypouklým středem G+ buňky kvasinkového typu smetanové, lesklé, větší, rozlité kolonie s vypouklým středem G+ buňky kvasinkového typu G+ tyčinky se zaoblenými konci, ve bezbarvé, malé lesklé kolonie shlucích G+ malé, krátké tyčinky se zaoblenými konci, jednotlivě nebo nažloutlé, lesklé, malé kolonie shlucích růžové, lesklé, velké, rozlité kolonie s vypouklým středem G+ buňky kvasinkového typu bezbarvé, lesklé, větší kolonie s G+ krátké tyčinky se zaoblenými vypouklým středem konci, jednotlivě nebo ve shlucích bezbarvé, lesklé, malé kolonie s G+ štíhlé tyčinky různé délky se vypouklým středem zaoblenými konci, ve shlucích G+ štíhlé, dlouhé tyčinky se nahnědlé, lesklé, malé kolonie zaoblenými konci, ve shlucích G+ krátké, zavalité tyčinky se bílé, lesklé, malé kolonie s vypouklým zaoblenými konci, jednotlivě nebo středem ve dvojcích G+ tyčinky se zaoblenými konci, bílé, lesklé, malé kolonie s vypouklým jednotlivě, ve shlucích nebo středem v řetízcích

Mi-5-70, odběr 1, kolonie č. 1 Mi-5-70 + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Mi-5-70 + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1

smetanové, lesklé, malé kolonie s vypouklým středem nahnědlé, lesklé, malé kolonie s vypouklým středem bezbarvé, lesklé, malé kolonie s vypouklým středem

Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 3, kolonie č. 3 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 3, kolonie č. 4 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1

63

G+ tyčinky se zaoblenými konci, jednotlivě nebo ve shlucích G+ štíhlé, krátké tyčinky se zaoblenými konci, v řetízcích G+ tyčinky různé délky se zašpičatělými konci, ve shlucích

Mi-5-70 + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Mi-5-70 + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1

bílé, lesklé, větší kolonie s vypouklým G+ krátké tyčinky se zaoblenými středem konci, v řetízcích G+ malé, krátké, zavalité tyčinky se bezbarvé, lesklé, malé kolonie s zaoblenými konci, jednotlivě nebo vypouklým středem ve dvojcích

4.3.2 KOH test, růst v MPB, katalázový test, růst při 15 °C a při 45 °C

Tyto testy slouží k identifikaci bakterií mléčného kvašení. Ty jsou KOH pozitivní, kataláza negativní, nerostou v MPB, rostou při 15 °C a nerostou při 45 °C. Základní kultivační teplota všech izolátů byla 30 °C. Výsledky růstu jsou zobrazeny v tabulkách č. 15 a 16. Tab. 15: Výsledky KOH testů, růstu v MPB, tvorby katalázy, růstu při 15 °C a při 45 °C u izolátů vyrostlých na Tomato agaru.

Víno, odběr, číslo kolonie Frankovka, odběr 2, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 2, kolonie č. 2 Frankovka + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Frankovka + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2 Frankovka + nystatin, odběr 4, kolonie č. 3 Frankovka + nystatin, odběr 5, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 5, kolonie č. 2

KOH + + + + + + + + + +

MPB + + + -

kataláza + + + + + + + -

15 °C + + + + + + + w +

45 °C + + -

Ariana + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Ariana + nystatin, odběr 2, kolonie č. 2 Ariana + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Ariana + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Ariana + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Ariana + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2 Ariana, odběr 5, kolonie č. 1 Ariana, odběr 5, kolonie č. 2 Ariana, odběr 5, kolonie č. 3 Ariana, odběr 5, kolonie č. 4 Ariana + nystatin, odběr 5, kolonie č. 1 Ariana + nystatin, odběr 5, kolonie č. 2

+ + + + + + + + + + +

+ -

+ + + -

+ + + + + + + + +

+ -

Cerason + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 2, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2

+ + +

-

+ + +

+ + + +

-

64

Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 5, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 5, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 5, kolonie č. 3

+ + + + +

-

+ + + -

+ + + + +

-

Cabernet Sauvignon, odběr 2, kolonie č. 1 Cabernet Sauvignon, odběr 2, kolonie č. 2 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 4, kolonie č. 3 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 5, kolonie č. 1 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 5, kolonie č. 2

+ +

-

+ +

+ +

-

+

-

-

w

-

+

+

+

+

+

+

+

-

+

-

+

-

+

+

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+ + + + + + +

+ -

+ + + + -

+ + + w + + +

w + -

Mi-5-70 + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Mi-5-70 + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Mi-5-70 + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Mi-5-70 + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Mi-5-70 + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2 Mi-5-70 + nystatin, odběr 4, kolonie č. 3 Mi-5-70 + nystatin, odběr 5, kolonie č. 1 +

pozitivní reakce,

-

negativní reakce,

w

slabá pozitivní reak

Tab. 16: Výsledky KOH testů, růstu v MPB, tvorby katalázy, růstu při 15 °C a při 45 °C u izolátů vyrostlých na MRS agaru.

Víno, odběr, číslo kolonie Frankovka, odběr 1, kolonie č. 1 Frankovka, odběr 2, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 2, kolonie č. 2 Frankovka + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Frankovka + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2

KOH + + + + + + +

MPB + -

kataláza + + + w -

15 °C + + + + + + +

45 °C + + + -

Ariana, odběr 1, kolonie č. 1 Ariana, odběr 1, kolonie č. 2 Ariana + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Ariana + nystatin, odběr 2, kolonie č. 2 Ariana + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1

+ + + + +

+ -

+ + + -

+ + + w w

+ + -

65

Ariana + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Ariana + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Ariana + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2

+ + +

-

+

+ + +

-

Cerason, odběr 1, kolonie č. 1 Cerason, odběr 1, kolonie č. 2 Cerason, odběr 1, kolonie č. 3 Cerason + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 3

+ + + + + + + + +

+ -

+ + + +

+ + + + + + +

+

Cabernet Sauvignon, odběr 1, kolonie č. 1 Cabernet Sauvignon, odběr 2, kolonie č. 1 Cabernet Sauvignon, odběr 2, kolonie č. 2 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 3, kolonie č. 3 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 3, kolonie č. 4 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2

+ + +

-

+ -

+ + +

+ + -

+

-

-

+

-

+

-

-

+

+

+

-

-

-

-

+

-

+

-

-

+

+

+

-

-

+

-

-

+

-

+

-

-

+

-

Mi-5-70, odběr 1, kolonie č. 1 Mi-5-70 + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Mi-5-70 + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Mi-5-70 + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Mi-5-70 + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1

+ + + + +

-

-

+ + + + +

w

+

pozitivní reakce,

-

negativní reakce,

w

slabá pozitivní reakce

Získali jsme 14 izolátů z Tomato agaru a 19 izolátů z MRS agaru, které jsou KOH pozitivní, nerostou v MPB, jsou kataláza negativní, rostou při 15 °C a nerostou při 45 °C. Tyto izoláty, v tabulkách zvýrazněné tučně, byly podrobeny detailnější charakterizaci.

66

4.3.3 Tvorba plynu z glukosy a glukonátu

Tyto testy slouží k rodové identifikaci bakterií mléčného kvašení. Leukonostoky, heterofermentativní laktobacily a oenokoky tvoří plyn z glukosy, zatímco pediokoky a homofermentativní laktobacily jej netvoří. Tvorba plynu z glukonátu je důležitá k odlišení obligátních homofermentativních laktobacilů od ostatních bakterií mléčného kvašení, tato skupina laktobacilů plyn z glukonátu netvoří. Výsledky testů jsou shrnuty v tabulkách č. 17 a 18. Tab. 17: Tvorba plynu z glukosy a glukonátu u izoátů z Tomato agaru.

Víno, odběr, číslo kolonie Frankovka, odběr 2, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 2, kolonie č. 2 Frankovka + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Frankovka + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2 Frankovka + nystatin, odběr 4, kolonie č. 3 Frankovka + nystatin, odběr 5, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 5, kolonie č. 2

plyn z glukosy x x x x x -

plyn z glukonátu x x x x x -


+ + + + x x + +

+ + x x +

Cerason + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 2, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 5, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 5, kolonie č. 2

x + -

x + -

67

Cerason + nystatin, odběr 5, kolonie č. 3

+

-


x + x + w

x + w x w -

Mi-5-70 + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Mi-5-70 + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Mi-5-70 + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Mi-5-70 + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Mi-5-70 + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2 Mi-5-70 + nystatin, odběr 4, kolonie č. 3 Mi-5-70 + nystatin, odběr 5, kolonie č. 1

+ x +

+ w x w

+

pozitivní reakce,

-

negativní reakce,

w


x

žádná data

Tab. 18: Tvorba plynu z glukosy a glukonátu u izoátů z MRS agaru.


plyn z glukosy x x +

plyn z glukonátu x x -

Ariana, odběr 1, kolonie č. 1 Ariana, odběr 1, kolonie č. 2 Ariana + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Ariana + nystatin, odběr 2, kolonie č. 2 Ariana + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Ariana + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Ariana + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Ariana + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2

x x + + + -

x x + + + -

Cerason, odběr 1, kolonie č. 1 Cerason, odběr 1, kolonie č. 2 Cerason, odběr 1, kolonie č. 3 Cerason + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1

x x x w

x x x -

68

Cerason + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 3

x +

x -


x x + x + -

x x + x w w -


+ w w -

w -

+

pozitivní reakce,

-

negativní reakce,

w


x

žádná data

U kolonií narostlých na Tomato agaru tvoří plyn z glukosy 13 izolátů a plyn z glukonátu 10 izolátů. U kolonií narostlých na MRS agaru tvoří plyn z glukosy 11 izolátů a plyn z glukonátu 7 izolátů.

4.3.4 Tvorba NH3 z argininu a hydrolýza eskulinu Tyto testy slouží k rodové i druhové identifikaci bakterií mléčného kvašení. Některé druhy rodů Lactobacillus a Pediococcus tvoří NH3 z argininu, jiné jej netvoří. Rody Leuconostoc a Oenococcus NH3 z argininu netvoří. Druhy rodů Leuconostoc, Lactobacillus a Pediococcus hydrolyzují eskulin, jiné jej nehydrolyzují, rod Oenococcus eskulin nehydrolyzuje. Souhrn výsledků je uveden v tabulkách č. 19 a 20. Tab. 19: Tvorba NH3 z argininu a hydrolýza eskulinu u izolátů z Tomato agaru.

tvorba NH3 z argininu x +

Víno, odběr, číslo kolonie Frankovka, odběr 2, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 2, kolonie č. 2 69

hydrolýza eskulinu x + +

Frankovka + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Frankovka + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2 Frankovka + nystatin, odběr 4, kolonie č. 3 Frankovka + nystatin, odběr 5, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 5, kolonie č. 2

x x x x -

x x x x +


+ x x +

+ + + + x x + -

Cerason + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 2, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 5, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 5, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 5, kolonie č. 3

+ + x + -

+ x + -


x + w x + +

x x + +

Mi-5-70 + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Mi-5-70 + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Mi-5-70 + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Mi-5-70 + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Mi-5-70 + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2 Mi-5-70 + nystatin, odběr 4, kolonie č. 3

+ x

+ + x

70

Mi-5-70 + nystatin, odběr 5, kolonie č. 1

-

+

pozitivní reakce,

-

negativní reakce,

w


x

žádná data

-

Tab. 20: Tvorba NH3 z argininu a hydrolýza eskulinu u izolátů z MRS agaru.


tvorba NH3 z argininu x x + + +

hydrolýza eskulinu x x + w +

Ariana, odběr 1, kolonie č. 1 Ariana, odběr 1, kolonie č. 2 Ariana + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Ariana + nystatin, odběr 2, kolonie č. 2 Ariana + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Ariana + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Ariana + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Ariana + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2

x x + +

x x + + + + +

Cerason, odběr 1, kolonie č. 1 Cerason, odběr 1, kolonie č. 2 Cerason, odběr 1, kolonie č. 3 Cerason + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1 Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 3

x x x x -

x x x + x -


x x + x + -

x x + + -

71


+ x

+

pozitivní reakce,

-

negativní reakce,

w


x

žádná data

+ -

U kolonií narostlých na Tomato garu tvoří NH3 z argininu 11 izolátů a eskulin hydrolyzuje 14 izolátů. U kolonií narostlých na MRS agaru tvoří NH3 z argininu 8 izolátů a eskulin hydrolyzuje 12 izolátů.

4.4 MALDI MS

U izolátů vyrostlých na Tomato agaru a MRS agaru jsme provedli základní biochemické testy, které nám pomohly vybrat potencionální zástupce skupiny bakterií mléčného kvašení a provést rodovou, popřípadě orientační druhovou identifikaci. Ze 46.ti izolátů z Tomato agaru a ze 40.ti izolátů z MRS agaru jsme vybrali 13 izolátů z Tomato agaru a 18 izolátů z MRS agaru, u kterých jsme provedli charakterizaci pomocí metody etanolové extrakce na MALDI MS. Při této metodě jsme získali spektra, která jsme porovnávali se spektry námi vybraných typových kultur z CCM a spektrem O. oeni z O. oeni BioStar Oenos sk1. Spektra vybraných typových kultur jsou znázorněny na obrázcích č. 15 až 21. Získané hmotnostní spektrum je zobrazením četnosti ionizovatelných částic bakteriálního proteomu. MALDI-MS profil proteinů celých buněk i izolovaných proteinů je vysoce charakteristický. Charakter spektra závisí na krystalizaci a ionizačních vlastnostech vzorku, proto je výška píku rovna relativní koncentraci proteinu v místě ionizace na destičce (Lay, 2001).

72

Obr. 15: Lactobacillus plantarum CCM 7039T

Osa x: poměr m/z (hmotnost); osa y: intenzita signálu a.i. (arbitrary units) Obr. 16: L. sakei subsp. sakei CCM 7203T

Osa x: poměr m/z (hmotnost); osa y: intenzita signálu a.i. (arbitrary units) Obr. 17: Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides CCM 1803T

Osa x: poměr m/z (hmotnost); osa y: intenzita signálu a.i. (arbitrary units)

73

Obr. 18: Pediococcus dextrinicus CCM 3457T

Osa x: poměr m/z (hmotnost); osa y: intenzita signálu a.i. (arbitrary units) Obr. 19: Pediococcus inopinatus CCM 3451T

Osa x: poměr m/z (hmotnost); osa y: intenzita signálu a.i. (arbitrary units) Obr. 20: L .lactis subsp. lactis CCM 1877T


74

Obr. 21: O. oeni z O. oeni BioStar Oenos sk1


Některá spektra našich izolátů se velmi podobala spektrům typových kultur. Při srovnávání spekter jednotlivých druhů uvnitř rodu se hledají rodově charakteristické píky. Tyto píky se opakují u všech druhů. Na spektrech se porovnává rozmístění jednotlivých píků, ne jejich výška. Některá zajímavá spektra jsou znázorněny na obrázcích č. 22 až 32. Obr. 22: Cerason + nystatin, odběr 5, kolonie č. 3, Tomato agar


75

Obr. 23: Ariana + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1, Tomato agar


Obr. 24: Ariana + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2, Tomato agar


Obr. 25: Ariana + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1, MRS agar


76

Obr. 26: Frankovka + nystatin, odběr 2, kolonie č. 2, MRS agar


Obr. 27: Frankovka + nystatin, odběr 3 kolonie č. 2, MRS agar


Obr. 28: Ariana + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1, MRS agar


77

Obr. 29: Cerason + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1, Tomato agar


Obr. 30: Cerason + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1, MRS agar




78



Do zpracování dat patří identifikace a kvantifikace píků a výpočet podobnosti mezi hmotnostními spektry. Z matice podobnosti spekter se provádí klastrová analýza. Shluky podobnosti se zobrazují jako dendrogram a jsou vypočítávány vzdálenosti mezi větvemi. Jednotlivé dendrogramy jsou znázorněny na obrazcích č. 33 až 35.

Obr. 33: Dendrogram presumptivních bakterií mléčného kvašení.

79


80


Spektra se nepodařilo získat u vzorků Ariana + nystatin, odběr 5, kolonie č.1, Tomato agar a Mi-5-70 + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1, MRS agar.

81

4.5 Doplňující diagnostické testy

Po základních diagnostických testech a po MALDI-MS analýze u kultur, které byly presumptivní bakterie mléčného kvašení, jsme dále charakterizovali 4 kultury narostlé na Tomato juice agaru:

Mi-5-70 + nystatin, odběr 4, kolonie č.2 Frankovka + nystatin, odběr 5, kolonie č.2 Ariana + nystatin, odběr 5, kolonie č.1 Cerason + nystatin, odběr 5, kolonie č.3

Tyto kultury jsou potencionálně významné pro jablečno-mléčné kvašení, mohly by totiž patřit do rodu Oenococcus, proto jsme u nich provedli další diagnostické testy, které slouží k odlišení rodu Oenococcus a Leuconostoc. Oba tyto rody jsou koky, ale liší se ve schopnosti růstu při pH 4,8, růstu v 10 % etanolu a ve fermentaci cukrů.

4.5.1 Růst při pH 4,8 a růst v 10 % etanolu

Testování bylo provedeno ve dvou opakováních. O. oeni roste při pH 4,8 a v 10 % etanolu. Výsledky testů jsou znázorněny v tabulce č. 21. Tab. 21: Růst při pH 4,8 a růst v 10 % etanolu u izolátů vyrostlých na Tomato agaru.

Víno, odběr, číslo kolonie Ariana + nystatin, odběr 5, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 5, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 5, kolonie č. 3 Mi-5-70 + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2 O.oeni z O. oeni BioStar Oenos sk1 +

pozitivní reakce,

-

Růst při pH 4,8 +;+ +;+ -;+;+ +

negativní reakce,

w

Růst při 10% etanolu w;w -;w -;w -;w w

slabá pozitivní reakce

Ze čtyř testovaných izolátů tři dokázaly růst při pH 4,8 a v 10 % etanolu, v tabulce jsou zvýrazněny tučně.

82

4.5.2 Tvorba kyselin z maltosy a ze sacharosy

Testování bylo provedeno ve dvou opakováních. O. oeni netvoří kyseliny z maltosy a sacharosy. Výsledky testů jsou znázorněny v tabulce č. 22. Tab. 22: Tvorba kyselin z maltosy a ze sacharosy u izolátů vyrostlých na Tomato agaru.

Víno, odběr, číslo kolonie

Kyselina z maltosy -;+;+ -;+;+ +

Ariana + nystatin, odběr 5, kolonie č. 1 Frankovka + nystatin, odběr 5, kolonie č. 2 Cerason + nystatin, odběr 5, kolonie č. 3 Mi-5-70 + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2 O.oeni z O. oeni BioStar Oenos sk1 +

pozitivní reakce,

-

Kyselina ze sacharosy -;+;+ -;+;+ ±

negativní reakce,

Ze čtyř testovaných izolátů dva netvořily kyselinu z maltosy a sacharosy, v tabulce jsou zvýrazněny tučně.

4.6 API 50CH

API 50CH se používá k identifikaci rodu Lactobacillus a příbuzných rodů. Tímto testem jsme identifikovaly kultury: Ariana + nystatin, odběr 5, kolonie č.1 Cerason + nystatin, odběr 5, kolonie č.3.

Ani u jedné kultury žádný test nebyl pozitivní na fermentaci cukrů.

83

4.7 Bakterie octového kvašení Bakterie octového kvašení patří mezi nejdůležitější kontaminaci vína. Dokáží přeměnit etanol na kyselinu octovou, což ovlivňuje chuť i vůni vína a tak jej znehodnocují (Osborne a Edwards, 2005). Z Acetobacter média při jednotlivých odběrech z vína jsme vyizolovali 123 kultur. Acetobacter médium obsahuje uhličitan vápenatý, který bakterie octového kvašení dokáží rozkládat, takže na médiu pod koloniemi vznikají projasněná místa (Yamada a kol., 1999). Z našich kultur dokázaly využívat uhličitan vápenatý:

Mi-5-70 + nystatin, odběr 3, kolonie č.5 Frankovka + nystatin, odběr 4, kolonie č.1 Frankovka + nystatin, odběr 4, kolonie č.3 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 4, kolonie č.1 Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 4, kolonie č.3

Tyto kultury jsme pozorovali makroskopicky i mikroskopicky po obarvení dle Grama a zamrazili je jako glycerolové konzervy a na korálcích. Takto uchované kultury bychom chtěli v budoucnu ještě dále zpracovávat.

84

5. DISKUSE

5.1 Izolace kmenů

Studovali jsme bakterie v procesu výroby vína u pěti odrůd z Mendlovy zemědělské a lesnické fakulty v Brně. Odběry těchto vzorků jsme přizpůsobili jednotlivým fázím výroby vína, od macerace a alkoholového kvašení, až po ukončení jablečno-mléčného kvašení a stáčení vína. K izolaci bakterií jsme použili plotnovou metodu s Acetobacter agarem, s MPA, s MRS agarem a Tomato agarem. Tuto metodu jsme použili proto, abychom získali jednotlivé kmeny, které by jsme mohli uchovávat pro další práci a studium. Získali jsme celkem 334 izolátů, 123 izolátů z Acetobacter agaru, 125 izolátů z MPA, 40 izolátů z MRS agaru a 46 izolátů z Tomato agaru. Cílem našeho zájmu byly bakterie mléčného kvašení, které jsou pro víno prospěšné i škodlivé (Neeley a kol., 2005). Pro izolaci těchto bakterií jsme použili MRS agar a Tomato agar (Kawarai a kol., 2007; Stamer a kol., 1964). Vzorek Ariana byl uchováván v KEG sudu, což je cylindrický kontejner, obvykle z hliníku, oceli nebo dřeva a slouží k uchovávání a transportu alkoholických i nealkoholických nápojů (http://en.wikipedia.org/wiki/Keg). Mikroorganismy vyizolované z tohoto vína by měly být odlišné od ostatních vzorků vín, které byly uchovávány v kovových kádích. KEG sud chrání nápoje před mikroorganismy z vnějšího prostředí a také způsobuje jiné prostředí, ve kterém je mošt a víno uchováváno, hlavně, co se týká přístupu kyslíku. Do tohoto vzorku se také nepřidávaly bakterie mléčného kvašení O. oeni BioStar Oenos sk1. Proto se lze domnívat, že všechny vyizolované mikroorganismy z tohoto vína jsou přirozené mikroorganismy, které se dostaly do vína přirozenou cestou při jeho výrobě. Jiné mikroorganismy by se měly nacházet ve vzorku Cabernet Sauvignon, tento vzorek je z roku 2005, jedná se již o hotové víno, proto počet a zastoupení mikroorganismů nacházejících se v tomto víně by měl být poměrně stabilní a neměnný. Vzorky Frankovka, Cerason a Mi-5-70 by měly obsahovat podobné počty i druhy mikroorganismů, tyto odrůdy byly zpracovávány a uskladňovány za stejných podmínek a byly do nich přidávány i stejné bakterie mléčného kvašení O. oeni BioStar Oenos sk1.

85

5.2 Optimalizace procesu izolace

Prováděli jsme tři typy ředění nystatinu dimetylsulfoxidem u vzorku Ariana, odběr 2. Na misku č. 1 se pipetovala koncentrace nystatinu 5 mg/1 ml, na misku č. 2 se pipetovala koncentrace nystatinu 2,5 mg/1 ml a na misku č. 3 se pipetovala koncentrace nystatinu 1,25 mg/1 ml. Docházelo tak k postupnému ředění nystatinu vždy o 50 %. Na misce č. 1 vyrostlo několik desítek smetanových kolonií, stejně jako na misce č. 2. Na misce č. 3 vyrostlo 13 smetanových kolonií a asi na jedné třetině misky se vytvořil souvislý bílý nárůst buněk kvasinkového typu (obrázek č. 14). Podle srovnání počtu kolonií na jednotlivých miskách jsme usoudili, že koncentrace na misce č. 2, což je 2,5 mg/1 ml, je dostačující k inhibici kvasinek. Nystatin je polyenové antimykotikum, které je poměrně toxické a slouží k potlačení kvasinek (Votava, 2001). My jsme používali nejvyšší koncentraci (5 mg/1 ml), která by neměla být toxická pro bakterie, ale měla by maximálně inhibovat růst kvasinkových mikroorganismů.

5.3 Testy k identifikaci izolovaných kmenů

Z celkového počtu izolovaných kmenů (334) byla provedena identifikace dle základních diagnostických testů u 84 izolátů vyrostlých na MRS agaru a Tomato agaru. Makroskopie a mikroskopie byly provedeny u pěti izolátů z Acetobacter agaru, které byly schopny rozkládat uhličitan vápenatý a díky tomu by mohly patřit mezi bakterie octového kvašení. Při testování pomocí biochemických testů bylo u některých kultur často nutné prodloužit dobu kultivace až na 7 dnů. Testy k identifikaci bakterií mléčného kvašení byly zvoleny po konzultaci s RNDr. Ivo Sedláčkem, CSc. z České sbírky mikroorganismů a podle článku Štegnerová a kol., 2007. Prováděli jsme makroskopii a mikroskopii po barvení dle Grama, KOH test, růst v MPB, katalázový test, a růst při 15 °C a při 45 °C. Tyto testy nám pomohly určit, zda dané izoláty patří mezi bakterie mléčného kvašení. Jako další testy jsme prováděli tvorbu plynu z glukosy a glukonátu, tvorbu NH3 z argininu a hydrolýzu eskulinu. Tyto testy sloužily k rodové a někdy i k druhové identifikaci bakterií mléčného kvašení. Po těchto základních diagnostických testech následovala metoda MALDI MS a srovnávání získaných spekter se spektry námi vybraných typových kultur z CCM a jedné kultury O. oeni BioStar Oenos sk1. Jako doplňující diagnostické testy jsme použili růst při pH 4,8 a v 10 % etanolu, tvorbu kyselin z maltosy a sacharosy. Tyto testy slouží k odlišení druhu Oenococcus oeni 86

od ostatních druhů leukonostoků. K potvrzení fermentace cukrů jsme použili test API 50 CH s kultivačním médiem API 50 CHL. Všechny základní biochemické testy byly provedeny bez problémů, jen u metod MALDI MS a u API 50 CH se vyskytly komplikace. Metodou MALDI MS jsme se pokoušeli identifikovat 31 našich kultur z MRS agaru a Tomato agaru, které by mohly být bakterie mléčného kvašení. Tato metoda selhala při charakterizaci některých vzorků, spektra se nepodařilo získat u vzorků Ariana + nystatin, odběr 5, kolonie č.1, Tomato agar a Mi-5-70 + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1, MRS agar. Metoda MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie je vysoce výkonná a spolehlivá metoda pro klasifikaci a identifikaci mikroorganismů (Fenselau a Demlrev, 2001; Krishnamurthy a Ross, 1996; Lay, 2001). Využívá přímý přístup, významná opakovatelnost

této

metody

je

založena

na

měření

konstantně

tvořených

vysokomolekulárních proteinů, například ribosomálních proteinů (Maier a kol., 2006b). Je schopna rozlišit mikroorganismy až na úroveň kmenů (Jones a kol., 2003). Tato metoda je jednoduchá, rychlá, vyžaduje jen malé množství biologického materiálu a je vysoce reprodukovatelná (Krishnamurthy a Ross, 1996). Výhodou této metody, jak uvádí Smole a kolektiv, je její univerzálnost, je účinná na grampozitivní i gramnegativní bakterie, liší se jen v přípravě vzorků.U grampozitivních bakterií se přidává lysozym, který slouží k porušení jejich tlusté buněčné stěny. I tak se někdy stává, že dochází k uvolnění proteinů pouze z cytoplasmatické membrány. To by mohlo být vysvětlení, proč jsme nedokázali získat spektra u našich dvou izolátů. Mohli jsme špatně nebo málo narušit buněčnou stěnu a tak by se nemohla vytvořit odpovídající spektra. Dalším vysvětlením je to, že bakterie mléčného kvašení rostou velmi špatně a někdy také vrůstají do média. Optimální koncentrace buněk pro přesné měření je 105 na ml, nám se mohlo stát, že jsme přidali nižší koncentraci buněk a tak se nemohla vytvořit odpovídající spektra. Účinnost získání spekter z MALDI MS u našich izolátů byla 91,01 %. Chyba se pravděpodobně stala při přípravě vzorků a etanolové extrakci, to však neovlivňuje tvrzení, že je tato metoda univerzální na grampozitivní i gramnegativní bakterie a dají se jí proto identifikovat i bakterie z vína. API 50 CH se používá k identifikaci rodu Lactobacillus a příbuzných rodů bakterií mléčného kvašení. Obsahuje médium API 50 CHL, které umožňuje fermentaci 49 sacharidů. Během inkubace jsou sacharidy fermentovány na kyseliny, což navodí pokles 87

pH, který se detekuje změnou barvy indikátoru. Médium obsahuje polypepton, kvasničný extrakt, Tween 80, hydrogenfosforečnan draselný, octan sodný, diamonium-citrát, síran hořečnatý, síran manganatý, bromkresolovou červeň a demineralizovanou vodu. API 50 CH jsme použili u dvou našich izolátů, u kterých jsme provedli doplňující diagnostické testy. API 50 CH sloužil k potvrzení těchto doplňujících testů, ale nezaznamenali jsme ani jednu pozitivní reakci u našich izolátů. Jedním z možných vysvětlení je to, že API 50 CH jsou hlavně k identifikaci laktobacilů a příbuzných rodů z klinického prostředí, ale my jsme testovali izoláty z vína, proto by mohly být naše izoláty náročnější na kultivaci i na složky média API 50 CHL. Toto médium obsahuje spoustu látek ve vysokých koncentracích, na které by mohly být naše izoláty citlivé. Dobu kultivace našich izolátů jsme prodloužili až na 7 dnů, teplotu kultivace jsme ponechali 30 °C, avšak ani jedna reakce, včetně kontroly, nevyšla pozitivně. To potvrzuje, že naše izoláty jsou pravděpodobně citlivé na některou složku nebo složky z média API 50 CHL.

5.4 Identifikace izolovaných kmenů

Bakterie mléčného kvašení jsou grampozitivní, různého tvaru, od koků, až po tyčinky. Nerostou v MPB a jsou kataláza negativní. Dokáží růst při 15 °C, ale nerostou při 45 °C. Tvorba plynu z glukosy a glukonátu, tvorba NH3 z amoniaku a hydrolýza eskulinu jsou rodovou i druhovou záležitostí (Štegnerová a kol., 2007). Po základních diagnostických testech jsme provedli metodu MALDI MS, ze které jsme získali spektra, která jsme porovnávali se spektry námi vybraných typových kultur z CCM a spektrem O. oeni z O. oeni BioStar Oenos sk1. Z matice podobnosti spekter se provedla klastrová analýza. Shluky podobnosti se zobrazily jako dendrogramy, které znázorňují příbuznost jednotlivých izolátů a příbuznost s námi vybranými typovými kulturami a O. oeni BioStar Oenos sk1. Jednotlivé dendrogramy jsou znázorněny na obrázcích č. 33 až 35, zajímavá spektra jsou znázorněny na obrázcích č. 15 až 32, ostatní spektra jsou uvedena v příloze. K potvrzení, že jsme vyizolovali O. oeni jsme provedli doplňující testy. O. oeni dokáže růst při pH 4,8 a v 10 % etanolu a netvoří kyseliny ze sacharosy a maltosy. U kmene Ariana + nystatin, odběr 5, kolonie č. 1, Tomato agar jsme nezískali MALDI MS spektrum. Podle biochemických testů jsou to grampozitivní malé koky, často v řetízcích a tvoří bezbarvé, malé, lesklé kolonie. Neroste v MPB, je kataláza negativní, roste při 15 °C a neroste při 45 °C. Tvoří plyn z glukosy, ale netvoří plyn z glukonátu, 88

netvoří NH3 z amoniaku a hydrolyzuje eskulin. Dokáže růst při pH 4,8 a v 10 % etanolu, ale netvoří kyseliny ze sacharosy a maltosy. Všechny testy naznačují, že jsme vyizolovali presumptivního O. oeni. Vzhledem k tomu, že do vzorku Ariana se nepřidávaly bakterie mléčného kvašení, jedná se o presumptivního oenokoka z přirozeného prostředí, který se může dostávat do vína například z povrchů révy vinné. Kmeny Ariana + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1, Tomato agar, Ariana + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2, Tomato agar a kmen Ariana + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1, MRS agar mají velmi podobná spektra z MALDI MS a vykazují také velkou podobnost se spektrem typové kultury Lactobacillus plantarum CCM 7039T, viz obrázky dendrogramů č. 33 a 34. Kmen Ariana + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1, Tomato agar jsou grampozitivní štíhlé, dlouhé tyčinky, ve shlucích, které netvoří řetízky a rostou jako bílé, lesklé, malé kolonie s vypouklým středem. Kmen Ariana + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2, Tomato agar jsou grampozitivní dlouhé tyčinky se zaoblenými konci, ve shlucích a tvoří bílé, lesklé, velké, kulaté kolonie. Kmen Ariana + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1, MRS agar jsou grampozitivní krátké, zavalité tyčinky se zaoblenými konci, jednotlivě nebo ve shlucích a tvoří bílé, lesklé, malé kolonie s vypouklým středem. Všechny kmeny nerostou v MPB, jsou kataláza negativní, rostou při 15 °C a nerostou při 45 °C. Tvoří plyn z glukosy i glukonátu, netvoří NH3 z amoniaku a hydrolyzují eskulin. Všechny testy naznačují, že tyto tři kmeny patří do rodu Lactobacillus, do II nebo III skupiny, což jsou fakultativně heterofermentativní a obligátně heterofermentativní laktobacily. Obligátně homofermentativní laktobacily totiž netvoří plyn z glukonátu. Ve víně se nejčastěji vyskytují druhy L. brevis, L. buchneri, L. casei, L. curvatus, L. fermentum, L. fructivorans, L. hilgardii, L. jensenii, L. delbruckii subspecies lactis, L. plantarum, a L. sake (Davis a kol., 1986). Do skupiny obligátních homofermentativních laktobacilů patří L. delbruckii subspecies lactis a L. jensenii. L. jensenii také roste i při 45 °C. L. sake tvoří jiné spektrum na MALDI MS. L. brevis tvoří NH3 z argininu, stejně jako L. buchneri. L. fermentum nehydrolyzuje eskulin, stejně jako L. fructivorans a L. hilgardii (Kandler a Weiss, 1986). Srovnáním biochemických vlastností jsme usoudili, že naše kmeny by mohly být L. casei, L. curvatus nebo L. plantarum. Vzhledem k velké podobnosti spekter těchto tří izolátů s typovou kulturou Lactobacillus plantarum CCM 7039T je pravděpodobné, že jsme vyizolovali 3 kmeny L. plantarum. Kmen Cerason + nystatin, odběr 5, kolonie č. 3, Tomato agar měl podobné spektrum z MALDI MS se spektrem Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides CCM 1803T, viz obrázky č. 17 a 22. Podle biochemických testů to jsou grampozitivní malé koky, 89

v řetízcích a tvoří bezbarvé, lesklé, malé kolonie. Neroste v MPB, je kataláza negativní, roste při 15 °C a neroste při 45 °C. Tvoří plyn z glukosy, ale netvoří plyn z glukonátu, netvoří NH3 z amoniaku a nehydrolyzuje eskulin. Nedokáže růst při pH 4,8 a v10 % etanolu roste velmi slabě nebo vůbec, netvoří ani kyseliny ze sacharosy a maltosy. Testy naznačují, hlavně morfologie a tvorba plynu z glukosy, že tento kmen patří do rodu Leuconostoc. Ve víně se nejčastěji nacházejí Leuconostoc mesenteroides, nejvíce Leuconostoc mesenteriodes subsp. mesenteroides (Fornachton a Lloyd, 2006) a Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris (Yurdugül a kol., 2008). Lc. mesenteriodes subsp. mesenteroides ve většině případů hydrolyzuje eskulin, ve většině případů také tvoří kyselinu z maltosy, vždy tvoří kyselinu ze sacharosy a nedokáže růst při pH 4,8 a v 10 % etanolu. Lc. mesenteroides subsp. dextranicum dává variabilní výsledky při hydrolýze eskulinu a ve většině případů je pozitivní při tvorbě kyselin z maltosy i sacharosy, nedokáže růst při pH 4,8 a v 10 % etanolu. Lc. mesenteroides subsp. cremoris nehydrolyzuje eskulin, ani netvoří kyseliny z maltosy a sacharosy a nedokáže růst při pH 4,8 a v 10 % etanolu. Srovnáním biochemických vlastností jsme usoudili, že jsme vyizolovali presumptivní Lc. mesenteroides subsp. cremoris. Kmeny Cerason + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1, Tomato agar, Frankovka + nystatin, odběr 2, kolonie č. 2, MRS agar, Frankovka + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2, MRS agar, Ariana + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1, MRS agar, Cerason + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1, MRS agar, Cerason + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2, MRS agar a kmen Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1, MRS agar mají velmi podobná spektra z MALDI MS a vykazují také velkou podobnost se spektry typových kultur Pediococcus dextrinicus CCM 3457T a Pediococcus inopinatus CCM 3451T , viz obrázky dendrogramů č. 33 až 35. Kmen Cerason + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1, Tomato agar jsou grampozitivní koky, jednotlivě nebo ve shlucích a tvoří bílé, lesklé, malé kolonie. Kmen Frankovka + nystatin, odběr 2, kolonie č. 2, MRS agar jsou grampozitivní koky, jednotlivě nebo ve shlucích a tvoří bílé, lesklé, malé kolonie s vypouklým středem. Kmen Frankovka + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2, MRS agar jsou grampozitivní koky, ve dvojcích nebo ve shlucích a tvoří bílé, lesklé kolonie s vypouklým středem. Kmen Ariana + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1, MRS agar jsou grampozitivní malé koky, ve shlucích a tvoří bezbarvé, lesklé, malé kolonie s vypouklým středem. Kmen Cerason + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1, MRS agar jsou grampozitivní koky, které netvoří řetízky a rostou jako bílé, lesklé, malé kolonie s vypouklým středem. Kmen Cerason + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2, MRS agar jsou grampozitivní koky, jednotlivě nebo ve shlucích a tvoří bílé, lesklé, malé kolonie s 90

vypouklým středem. A kmen Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1, MRS agar jsou grampozitivní malé koky ve dvojcích nebo ve shlucích a tvoří bezbarvé, lesklé, malé kolonie. Všechny kmeny nerostou v MPB, jsou kataláza negativní, rostou při 15 °C a nerostou při 45 °C. Netvoří plyn z glukosy ani z glukonátu, netvoří NH3 z amoniaku a některé hydrolyzují eskulin. Všechny testy naznačují, že tyto kmeny patří do rodu Pediococcus. Pediokoky jsou sférické, nikdy nejsou prodloužené a nikdy netvoří řetízky (Sedláček, 2007). Ve víně se nejčastěji vyskytují druhy P. damnosus (Beneduce a kol., 2004; Gindreau a kol., 2001), P. inopinatus (Lafon-Lafourcade a kol., 1983), P. pentosaceus (Fernández a kol., 2003) a P. parvulus (Liu a kol., 1995). P. pentosaceus tvoří NH3 z argininu, někdy je slabě kataláza pozitivní a také 11-89 % kmenů roste při 45 °C. P. inopinatus je geneticky blízce příbuzný s P. parvulus a P. damnosus. Některé naše izoláty hydrolyzují eskulin a některé ne, avšak hydrolýza eskulinu není uvedena v odborné literatuře jako jeden z identifikačních testů. Kmen

Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1, MRS agar má téměř shodné

spektrum s typovým kmenem Pediococcus inopinatus CCM 3451T, z toho jsme usoudili, že tento kmen je presumptivní P. inopinatus. Ostatních 6 kmenů by mohlo patřit do druhů P. damnosus, P. inopinatus nebo P. parvulus, k bližší identifikaci by se musely provést další testy, jako je růst při pH 4,5 a pH 7, v10 % NaCl a tvorba kyselin z cukrů (Weiss, 1992).

5.5 Počet a zastoupení jednotlivých kmenů

Srovnáním dendrogramů a jednotlivých spekter jsme se snažili získat přehled o tom, které rody bakterií mléčného kvašení se nacházejí v jednotlivých fázích výroby vína, zda se tyto rody opakují, zda rostou na Tomato agaru i MRS agaru a zda jsou rozdíly v počtu a zastoupení jednotlivých rodů ve vzorcích vína. Presumptivní O. oeni byl izolován z našich vzorků jen jednou, ve vzorku Ariana při odběru č. 5, což bylo při ukončení jablečno-mléčného kvašení a stáčení vína. O. oeni je právě nejvíce zodpovědný za tento typ kvašení a jako jeden z mála rodů dokáže přežívat při nízkém pH a při vysokém obsahu etanolu. Do vzorku Ariana se nepřidávaly bakterie mléčného kvašení, proto lze usuzovat, že tento oenokok je z přirozeného prostředí. Presumptivní Lactobacillus byl izolován z našich vzorků třikrát a to ve vzorku Ariana, při odběru č. 2 a 3, což bylo při vylisování hroznů a na začátku jablečno-mléčného 91

kvašení. Přežívání tohoto rodu ve víně je závislé na pH a obsahu etanolu. Při vysokém pH rod Lactobacillus často převládá, zatímco při nižších hodnotách pH převládají jiné bakterie mléčného kvašení. Lactobacillus se vyskytuje v alkoholických nápojích po alkoholovém kvašení a může přispívat ke zlepšení i zhoršení kvality těchto nápojů. Při odběru č. 2 byl izolován presumptivní Lactobacillus z Tomato agaru i MRS agaru, na každé plotně byla vykultivována jedna kolonie, při odběru č. 3 byl izolován tento rod na Tomato agaru a byly vykultivovány 3 kolonie. Presumptivní Leuconostoc byl izolován v našich vzorcích jen jednou a to ve vzorku Cerason při odběru č. 5, což bylo při ukončení jablečno-mléčného kvašení a stáčení vína. Výskyt tohoto rodu v této fázi výroby vína je docela pozoruhodný, většina druhů tohoto rodu nedokáže přežít alkoholové kvašení, nejsou totiž uzpůsobeny růstu při vysoké koncentraci etanolu. Presumptivní Pediococcus byl izolován z našich vzorků sedmkrát a to ve vzorcích Frankovka, Ariana a Cerason při odběrech č. 2, 3 a 4, což bylo při vylisování hroznů, na začátku jablečno-mléčného kvašení a v průběhu tohoto kvašení. Přežívání tohoto rodu ve víně je zvýhodněno při pH vyšším než 3,5, ke zvyšování pH dochází během jablečnomléčného kvašení. Růst pediokoků ve víně je považován za žádoucí i nežádoucí, produkují totiž zapáchající a nechutné látky, ale někdy také vůně a příchutě pro víno prospěšné. Ve vzorku Frankovka při odběru č. 2 byl izolován presumptivní Pediococcus z MRS agaru a byla vykultivována jedna kolonie, při odběru č. 3 byl izolován tento rod z MRS agaru a byla vykultivována také jedna kolonie. Ve vzorku Cerason při odběru č. 2 byl izolován presumptivní Pediococcus z Tomato i MRS agaru, na každé plotně byla vykultivována pouze jedna kolonie, při odběru č. 3 byl izolován tento rod z MRS agaru a byla vykultivována také pouze jedna kolonie, ale při odběru č. 4 byl izolován tento rod z MRS agaru a bylo vykultivováno několik desítek kolonií. Při odběru č. 1 jsme vyizolovali 1 kmen z MRS agaru, při odběru č. 2 jsme vyizolovali 3 kmeny z Tomato a 6 kmenů z MRS agaru, při odběru č. 3 jsme vyizolovali 2 kmeny z Tomato a 6 kmenů z MRS agaru, při odběru č. 4 jsme vyizolovali 3 kmeny z Tomato a 6 kmenů z MRS agaru a při odběru č. 5 jsme vyizolovali 6 kmenů z Tomato agaru, které jsou grampozitivní bakterie, nerostou v MPB, jsou kataláza negativní a dokáží růst při 15 °C, ale nerostou při 45 °C a tudíž by to mohly být bakterie mléčného kvašení. Tento nárůst počtu kmenů se shoduje s obrázkem č. 3, který navrhli Osborne a Edwards, je na něm znázorněno zvýšení počtu bakterií mléčného kvašení na začátku jablečno-mléčného

92

kvašení, některé rody těchto bakterií pak mohou růst po jablečno-mléčném kvašení během uchovávání nebo stárnutí vína. Nejvíce presumptivních bakterií mléčného kvašení jsme vyizolovali ze vzorku Ariana (10), pak ze vzorku Frankovka (6), Cerason (6) Mi-5-70 (6) a nejméně ze vzorku Cabernet Sauvignon (5). Je zvláštní, že vzorek Ariana měl největší počet presumptivních bakterií mléčného kvašení, tento vzorek byl uchováván v KEG sudu, který slouží k ochraně vína před bakteriemi z prostředí. Na druhou stranu se do něj nepřidával O. oeni BioStar Oenos sk1. Zhang a Lovitt uvedli, že používání startovací kultury k navození jablečnomléčného kvašení může v některých případech způsobit rychlejší zrání vína a také snížení potenciálně škodlivých bakterií mléčného kvašení. To mohlo způsobit, že u vzorků, do kterých se přidával O. oeni BioStar Oenos sk1 došlo k potlačení některých bakterií mléčného kvašení, které jsou pro víno nežádoucí. Vzorek Cabernet Sauvignon měl nejnižší počet presumptivních bakterií mléčného kvašení. Dalo se to očekávat, tento vzorek je z roku 2005 a měl by mít nejnižší počet těchto bakterií.

93

6. ZÁVĚR

1.

Z pěti odběrů vín u pěti odrůd (Frankovka, Ariana, Cerason, Mi-5-70 a Cabernet Sauvignon) ze zahradnické fakulty v Lednici, která je součástí Mendlovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně, bylo získáno 334 izolátů, 123 izolátů z Acetobacter agaru, 125 izolátů z MPA, 40 izolátů z MRS agaru a 46 izolátů z Tomato agaru plotnovou metodou. Cílem našeho zájmu byly bakterie mléčného kvašení, které způsobují ve víně jablečno-mléčné kvašení, ale také mohou být pro víno škodlivé, jak po chuťové, tak i čichové stránce. Pro izolaci těchto bakterií jsme použili MRS agar a Tomato agar.

2.

Vyizolované a přečištěné kmeny byly uchovávány na šikmých agarech při 4 ˚C po dobu 1–2 týdnů v chladničce a následně uchovávány jako tzv. glycerolové konzervy a na korálcích. Zamražení bylo provedeno při teplotě – 70 °C, uchovávání při – 25 °C. Takto uchovávané izoláty jsou nezměněny a mohou proto sloužit pro další použití a studium.

3.

U izolátů narostlých na Tomato agaru a MRS agaru jsme provedli základní diagnostické testy (makroskopii a mikroskopii po barvení dle Grama, KOH test, růst v MPB, katalázový test, a růst při 15 °C a při 45 °C, tvorbu plynu z glukosy a glukonátu, tvorbu NH3 z argininu a hydrolýzu eskulinu), následovala metoda MALDI MS a srovnávání získaných spekter se spektry námi vybraných typových kultur z CCM a jedné kultury O. oeni BioStar Oenos sk1, u vybraných izolátů jsme ještě provedli doplňující diagnostické testy (růst při pH 4,8 a v 10 % etanolu, tvorbu kyselin z maltosy a sacharosy). Získali jsme 14 kmenů z Tomato agaru a 19 kmenů z MRS agaru presumptivních bakterií mléčného kvašení.

4.

Účinnost získání spekter z MALDI MS u našich izolátů byla 91,01 % (spektra se nepodařilo získat u 2 izolátů z 31). Chyba se pravděpodobně stala při přípravě vzorků a etanolové extrakci, to však neovlivňuje tvrzení, že je tato metoda univerzální na grampozitivní i gramnegativní bakterie a proto je vhodná i pro identifikaci bakterií z vína.

94

5.

Z těchto 33 kmenů jsme identifikovali jednoho presumptivního oenokoka, 3 presumptivní laktobacily, jednoho presumptivního leukonostoka a 7 presumptivních pediokoků. Presumptivní O. oeni byl izolován ze vzorku Ariana při odběru č. 5, což bylo při ukončení jablečno-mléčného kvašení a stáčení vína. Presumptivní Lactobacillus byl izolován ze vzorku Ariana, při odběru č. 2 a 3, což bylo při vylisování hroznů a na začátku jablečno-mléčného kvašení. Presumptivní Leuconostoc byl izolován ze vzorku Cerason při odběru č. 5, což bylo při ukončení jablečno-mléčného kvašení a stáčení vína. Presumptivní Pediococcus byl izolován ze vzorků Frankovka, Ariana a Cerason při odběrech č. 2, 3 a 4, což bylo při vylisování hroznů, na začátku jablečno-mléčného kvašení a v průběhu tohoto kvašení.

6.

Srovnáváním počtu jednotlivých kmenů při jednotlivých fázích výroby vína jsme zjistili, že po alkoholovém kvašení dochází ke zvyšování počtu bakterií mléčného kvašení. Tento nárůst počtu kmenů se shoduje s literaturou, která uvádí, že ke zvýšení počtu bakterií mléčného kvašení dochází po alkoholovém kvašení a to až na začátku jablečno-mléčné kvašení, některé rody těchto bakterií pak mohou růst po jablečnomléčném kvašení během uchovávání nebo stárnutí vína.

7.

Nejvíce presumptivních bakterií mléčného kvašení jsme vyizolovali ze vzorku Ariana, stejné množství ze vzorku Frankovka, Cerason, Mi-5-70 a nejméně ze vzorku Cabernet Sauvignon. Do vzorku Ariana se nepřidával O. oeni BioStar Oenos sk1. Tato startovací kultura pravděpodobně způsobila snížení potenciálně škodlivých bakterií mléčného kvašení. Vzorek Cabernet Sauvignon měl nejnižší počet presumptivních bakterií mléčného kvašení. Dalo se to očekávat, tento vzorek je z roku 2005 a sloužil pro kontrolu. Byl už jako hotové víno po hrubé filtraci a proto by měl mít nejnižší a stabilní počet těchto bakterií.

95

7. SEZNAM LITERATURY Ansanay V., Dequin S., Blondin B. and Barre P.(1993): Cloning, sequence and expression of the gene encoding the malolactic enzyme from Lactococcus lactis. FEBS Lett. 332: 74-80. Araim O. M. D., Ballantyne J., Waterhouse A. L. and Sumpio B. E. (2002): Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation with red wine and red wine polyphenols. J. Vasc. Surg. 35: 1226-1232. Bartowsky E. J., Xia D., Gibson R. L., Fleet G. H. and Henschke P. A. (2003): Spoilage of bottled red wine by acetic acid bacteria. Lett. Appl. Microbiol. 36: 307-314. Beneduce L., Spano G., Vernile A., Tarantino D. and Massa S. (2004): Molecular characterization of lactic acid populations associated with wine spoilage. J. Basic. Microbiol. 44: 6-10. Bony M., Bidart F., Camarasa C., Ansanay V., Dulau L., Barre P. and Dequin S. (1997): Metabolic analysis of S. cerevisiae strains engineered for malolactic fermentation. FEBS Lett. 410: 452-456. Bourdineaud J. P., Nehmé B., Tesse S. and Lonvaud-Fnel A. (2003): The ftsH Gene of the Wine Bacterium Oenococcus oeni Is Involved in Protection against Environmental Stress. Appl. Environ. Microbiol. 69: 2512-2520. Camarasa C., Bidard F., Bony M., Barre P. and Dequin S. (2001): Characterization of Schisosaccharomyces pombe Malate Permease by Expression in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol.67: 4144-4151. Carlone G. M., Valadez M. J., Pickett M. J. (1983): Methods for distinguishing Grampositive from Gram-negative bacteria. J. Clin. Microbiol. 16: 1157 – 1159. Cavin J. F., Prevost H., Lin J., Schmitt P. and Divies C. (1989): Medium for Screening Leuconostoc oenos Strains Defective in Malolactic Fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 55: 751-753. Cibulka J. (2003): Rozdělení vín a výběr surovin, nemoci a vady vín. In: Domácí vína, piva, likéry a medoviny, nakladatelství Gen, spol. s r. o., Liberec, p. 60-88. Cowan S. T. (1974): Cowan and Steel´s manual for the identification of medical bacteria. Cambridge University Press, p. 17-179. Davis G. H. G. (1955): The classification of lactobacilli from the human mouth. J. Gen. Microbiol. 13: 481-484. Davis C. R., Wibowo D. J., Lee T. H. and Fleet G. H. (1986): Growth and metabolism of lactic acid bacteria during and after malolactic fermentation of wines at different pH. Appl. Environ. Microbiol. 51: 539-545.

96

De Ley J., Gillis M. and Swings J. (2005): Family VI. Acetobacteraceae. In: Brenner, Krieg and Staley (Editors), The Bergey's manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed., Vol II, Springer, New York, p. 267-278. Dicks L. M. T., Dellaglio F. and Collins M. D. (1995): Proposal to reclassify Leuconostoc oenos as Oenococcus oeni [corrig.] gen. nov., comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 45: 395397. Du Plessis H. W., Dicks L. M. T., Pretorius I. S., Lambrechts M. G. and du Toit M. (2004): Identification of lactic acid bacteria isolated from South African base wines. Int. J. Food Microbiol. 91: 19-29. Du Toit W. J. and Lambrechts M. G. (2002): The enumeration and identification of acetic acid bacteria from South African red wine fermentations. Int. J. Food Microbiol. 74: 57-64. Edwards C. G., Haag K. M., Collins M. D., Hutson R. A. and Huang Y. C. (1998): Lactobacillus kunkeei sp. nov.: A spoilage organism associated with grape juice fermentation. J. Appl. Microbiol. 84: 698-702. Endo A. and Okada S. (2006): Oenococcus kitaharae sp. nov., a non-acidophilic and nonmalolactic-fermenting oenococcus isolated from a composting distilled shochu residue. Int. J. Syst .Evol. Microbiol. 56: 2345-2348. Felten A., Barreau C., Bizet C., Lagrange P. H. and Philippon A. (1999): Lactobacillus Species Identification, H2O2 Production, and Antibiotic Resistance and Correlation with Human Clinical Status. J. Clin. Microbiol. 37: 729-733. Fenselau C., Demlrev P. A. (2001): Characterization of intact microorganisms by MALDI-MS spectrometry. Mass. Spectrom. Rev. 20: 157-171. Fernández A. P. A., Saguir F. M. and De Nadra M. M. C. (2003): Effect of amino acids peptides on growth of Pediococcus pentosaceus from wine. Lat. Am. Appl. Res. 33:225-229. Fleet G. H., Lafon-Lafourcade S. and Ribéreau-Gayon P. (1984): Evolution of yeasts and lactic acid bacteria during fermentation and storage of Bordeaux wines. Appl. Environ. Microbiol. 48: 1034-1038. Fornachton J. C. M. and Lloyd B. (2006): Bacterial production of diacetyl and acetoin in wine. J. Sc.i Food Agr. 16: 710-716. Garvie E. I. (1986): Genus Leuconostoc, genus Pediococcus. In: Brenner, Krieg and Staley (Editors), The Bergey's manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed., Vol II, Springer, New York, p. 1071-1079. Gindreau E., Walling E. and Lonvaud-Funel A. (2001): Direct polymerase chain reaction detection of ropy Pediococcus damnosus strains in wine. J. Appl. Microbiol. 90: 535-542.

97

Hammes W. P., Weiss N. and Holzapfel W. (1992): The Genera Lactobacillus and Carnobacterium. In: Balows, Trüper, Dworkin, Harder and Schleifer (Editors), The Prokaryotes, 2nd ed., Vol. II, Springer-Verlag, New York, p. 1535-1595. Hayward A. C. (1957): Detection of gas production from glucose by heterofermentative lactic acid bacteria. J. Gen. Microbiol. 16: 9-15. Heard G. M. and Fleet G. H. (1985): Growth of natural yeast flora during the fermentation of inoculated wines. Appl. Environ. Microbiol. 50: 727-728. Henick-Kling T., Sandine W. E. and Heatherbell D. A. (1989): Evaluation of Malolactic Bacteria Isolated frm Oregon Wines. Appl.Environ.Microbiol. 55: 2010-2016. Holzapfel W. H. and Schillinger U. (1992): The Genus Leuconostoc. In: Balows, Trüper, Dworkin, Harder and Schleifer (Editors), The Prokaryotes, 2nd ed., Vol. II, SpringerVerlag, New York, p. 1508-1534. Husnik J. I., Volschenk H., Bauer J., Colavizza D., Luo Z, Vuuren H. J. J. (2006): Metabolic engineering of malolactic wine yeast. Metabolic. Eng. 8:315-323. Ishida Y., Kitagawa K., Nakayama A. and Ohtani H. (2005): On-Probe Sample Pretreatment for Direct Analysis of Lipids in Gram-Positive Bacterial Cells by MatrixAssisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Appl.Environ.Microbiol. 71: 7539-7541. Jack R. W., Tagg J. R. and Ray B. (1995): Bacteriocins of gram-positive bacteria. Microbiol. Rev. 59: 171-200. Johnston M. A. and Delwiche E. A. (1962): Catalase of the Lactobacillaceae. J. Bacteriol. 83: 936-938. Jones J. J., Stump M. J., Fleming R. C., Lay J. O. and Wilkins C. L. (2003): Investigation of MALDI-TOF and FT-MS Techniques for Analysis of Escherichia coli Whole Cells. Anal. Chem. 75: 1340–1347. Joyeux A., Lafon-Lafourcade S. and Ribéreau-Gayon P. (1984): Evolution of Acetic Acid Bacteria During Fermentation and Storage of Wine. Appl.Environ.Microbiol. 48: 153-156. Jussier D., Morneau A. D. and de Orduña R. M. (2006): Effect of Simultaneous Inoculation with Yeast and Bacteria of Fermentation Kinetics and Key Wine Parameters of Cool-Climate Chardonnay. Appl. Environ. Microbiol. 72: 221-227. Kandler O. and Weiss N. (1986): Genus Lactobacillus. In: Brenner, Krieg and Staley (Editors), The Bergey's manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed., Vol II, Springer, New York, p. 1209-1234. Kawarai T., Furukawa S., Ogihara H. and Yamasaki M. (2007): Mixed-Species Biofilm Formation by Lactic Acid Bacteria and Rice Wine Yeasts. Appl. Environ. Microbiol. 73: 4673–4676. 98

Krishnamurthy T. and Ross P. L. (1996): Rapid identification of bacteria by direct matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of whole cells. Rapid Commun. Mass Spectrom. 10: 1992-1996. Lafon-Lafourcade S., Carre E. and Ribéreau-Gayon P. (1983): Occurrence of lactic acid bacteria during the different stages of vinification and conservation of wines. Appl. Environ. Microbiol. 46: 874-880. Langston C. W. and Bouma C. (1960): A Study of the Microorganisms from Grass Silage. I. The Cocci. Appl. Microbiol. 8: 212-222. Lay J. O. Jr. (2001): MALDI-TOF mass spectrometry of bacteria. Mass Spectrom. Rev. 20: 172– 194. Lilly M., Lambrechts M. G. and Pretorius I. S. (2000): Effect of Increased Yeast Alcohol Acetyltransferase Activity on Flavor Profiles of Wine and Distillates. Appl. Environ. Microbiol. 66: 744-753. Liu S. Q., Pritchard G. G., Hardman M. J. and Pilone G. J. (1995): Occurrence of Arginine Deiminase Pathway Enzymes in Arginine Catabolism by Wine Lactic Acid Bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 61: 310-316. Liu S. Q. (2002): A Review Malolactic fermentation in wine – beyond deacidification. J. Appl. Microbiol. 92: 589-601. Liu H., Du Z., Wang J. and Yang R. (2007): Universal Sample Preparation Method for Characterization of Bacteria by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry. Appl. Environ. Microbiol. 73: 1899-1907. Lu S. F., Lee F. L. and Chen H. K. (1999): A thermotolerant and high acetic acid producing bacterium Acetobacter sp. J. Appl. Microbiol. 86: 55-62. MacFaddin J. F. (2000): Biochemical tests for identification of medical bacteria. Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia. 78-96. Maier T., Klepel S., Renner U., Fahr K., Pusch W. and Kostrzewa M. (2006a): The MALDI BioTyper: Identification and Classification of microorganisms by MALDI-TOF MS fingerprints. 9 th International Conference in Genomics and Proteomics of human pathogens, London 2006. Maier T., Klepel S., Renner U. and Kostrzewa M. (2006b): Fast and reliable MALDITOF MS–based microorganism identification. Nature Methods 3. Miranda M., Ramos A.,Veiga-Da-Cunha M., Loureiro-Dias M. C. and Santos H. (1997): Biochemical Basis for Glucose-Induced Inhibition of Malolactic Fermenatation in Leuconostoc oenos. J. Bacteriol. 179: 5347-5354. Neeley E. T., Phister T. G. and Mills D. A. (2005): Differential Real-Time PCR Assay for Enumeration of Lactic Acid Bacteria in Wine. Appl. Environ. Microbiol. 71: 89548957. 99

Nielsen J. C. and Richelieu H. (1999): Control of flavour development in wine during and after malolactic fermentation by Oenococcus oeni. Appl. Environ. Microbiol. 65: 740-745. Niven C. F. Jr., Smiley K. L. and Sherman J. M. (1944): The hydrolysis of arginine by streptococci. J. Bacteriol. 43: 651-660. Olsen E. B., Russel J. B. and Henick-Kling T. (1991): Electrogenic L-malate transport by Lactobacillus plantarum: A basis of energy derivation from malolactic fermentation. J. Bacteriol. 173: 6199-6206. Orduña M. de R., Patchett M. L., Liu S. Q. and Pilone G. J. (2001): Growth and arginine metabolism of the wine lactic acid bacteria Lactobacillus buchneri and Oenococcus oeni at different pH values and arginine concentrations. Appl. Environ. Microbiol. 67: 1657-1662. Osborne J. P. and Edwards CH. G. (2005): Bacteria importatnt during winemaking. Adv. Food Nutr. Res. 50: 139-177. Poolman B., Molenaar D., Smid E. J., Ubbink T., Abee T., Renault P. P. and Konings W. N. (1991): Malolactic fermentation: Electrogenic malate uptake and malate/lactate uniport generate metabolic energy. J. Bacteriol. 173: 6030-6037. Priewe J. (2003): Vinohradnictví, odrůdy révy vinné, výroba vína. In: Nová škola vína, knižní klub, Praha, p. 14-77. Remize F., Gaudin A., Kong Y., Guzzo J., Alexandre H., Krieger S. and GuillouxBenatier M. (2006): Oenococcus oeni preference for peptides: qualitative and quantitative analysis of nitrogen assimilation. Arch. Microbiol. 185: 459-469. Rojo-Bezares B., Sáenz Y.,Poeta P., Zarazaga M., Ruiz-Larrera F. a Torres C. (2006): Assessment of antibiotic susceptibility within lactic acid bacteria strains isolated from wine. Int. J. Food Microbiol. 111: 234-240. Ruiz A., Poblet M., Mas A. and Guillamo J. M. (2000): Identification of acetic acid bacteria by RFLP of PCR-amplified 16S rDNA and 16S–23S rDNA intergenic spacer. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50: 1981–1987. Saeki A., Taniguchi M., Matsushita K., Toyama H., Theeragool G., Lotong N. and Adachi O. (1997): Microbiological aspects of acetate oxidation by acetic acid bacteria, unfavorable phenomena in vinegar fermentation. Biosci. Biotechnol. Biochem. 61: 317323. Salema M., Poolman B., Lolkema J. S., Dias M. C. and Konings W. N. (1994): Uniport of monoanionic L-malate in membrane vesicles from Leuconostoc oenos. Eur. J. Biochem. 225: 289-295. Salema M., Lolkema J. S., San Ramao M. V. and Loureiro-Dias M. C. (1996): The proton motive force generated in Leuconostoc oenos by L-malate fermentation. J. Bacteriol. 178: 3127-3132. 100

Sedláček I. (2007): Bakterie s buněčnou stěnou grampozitivního typu. In: Taxonomie prokaryot, Masarykova univerzita, p. 187-256. Smole S. C., King L. A., Leopold P. E., Arbeit R.D. (2002): Sample preparation of Gram-positive bacteria for identification by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight. J. Microbiol. Methods 48: 107-115. Sperber W. H. and Swan J. (1976): Hot-loop test for the determination of carbon dioxide production from glucose by Lactic acid bacteria. Appl.Environ.Microbiol. 31: 990-991. Stamer J. R., Albury M. N. and Pederson C. S. (1964): Substitution of Manganase for Tomato Juice in the Cultivation of Lactic Acid Bacteria. Appl. Microbiol. 12: 165-168. Steidl R. (2002): Sklepní hospodářství, Národní salon vín, Valtice, p. 12-198. Stevenson T. (2001): Jak se dělá víno. In: Světová encyklopedie vín, unikátní průvodce víny celého světa, Knižní klub v edici Balios, Praha, p. 18-23. Štegnerová E., Nápravníková I., Steinhauserová P. a Švec P. (2007): Identifikace bakterií mléčného kvašení v mase baleném v podmínkách ochranné atmosféry. Veterinářství. 57: 39-42. Thunell R. K. (1995): Symposium: The dairy Leuconostoc. J. Dairy Sci. 78: 2514-2522. Vogel R. A. (2003): Are French Red Wines More Cardioprotective? J. Am. Coll. Cardiol. 41: 479-481. Volschenk H.,Vuuren H. J. J. and Vilijoen-Bloom M. (2003): Malo-ethanolic fermentation in Saccharomyces and Schisosaccharomyces. Curr.Gent. 43: 379-391. Votava M. (2001): Základní vlastnosti bakterií, Antimikrobiální látky In: Lékařská mikrobiologie obecná, Neptun, p.19-53, 161-191. Wagner N., Tran Q. H., Richter H., Selzer P. M. and Unden G. (2005): Pyruvate Fermentation by Oenococcus oeni and Leuconostoc mesenteroides and Role of Pyruvate Dehydrogenase in Anaerobic Fermentation. Appl.Environ.Microbiol. 71: 4966-4971. Weiss N. (1992): The Genera Pediococcus and Aerococcus. In: Balows, Trüper, Dworkin, Harder and Schleifer (Editors), The Prokaryotes, 2nd ed., Vol. II, Springer-Verlag, New York, p. 1502-1507. Wixom R. L. (1965): Acetolactate Metabolism and the Presence of a Dihydroxy Acid Dehydratase in Micro-organisms. Biochem. J. 94: 427-435. Yamada Y., Hosono R., Lisdiyanti P., Widyastuti Y., Susono S., Yamada Y., Uchimura T. and Komagata K. (1999): Identification of acetic acid bacteria isolated from Indonesian sources, especially of isolates classified in the genus Gluconobacter. J. Gen. Appl. Microbiol. 45: 23-28.

101

Yurdugül, Seyhun, Bozoglu and Faruk (2008): Effects of a bacteriocin-like substance produced by Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris on spoilage strain Lactobacillus fructivorans and various pathogens. IJFST. 43: 76-81. Zapparoli G., Torriani S., Pesente P. and Dellaglio F. (1998): Design and evaluation of malolactic enzyme gene targeted primers for rapid identification and detection of Oenococcus oeni in wine. Lett. Appl. Microbiol. 27: 243-246. Zhang D. and Lovitt R. W. (2006): Review Strategies for enhanced malolactic fermentation in wine and cider maturation. J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1130-1140.

Internetové zdroje: http://en.wikipedia.org/wiki/Keg

102

PŘÍLOHY

103

Obr. A: Frankovka + nystatin, odběr 3, kolonie č. 1, Tomato agar


ObrB: Frankovka + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1, MRS agar


Obr. C: Frankovka + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2, MRS agar


104

Obr.D: Frankovka + nystatin, odběr 5, kolonie č. 2, Tomato agar


Obr.E: Ariana + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2, MRS agar


Obr. F: Ariana + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1, MRS agar


105

Obr. G: Ariana + nystatin, odběr 4, kolonie č . 2, Tomato agar


Obr. H: Ariana + nystatin, odběr 5, kolonie č. 2, Tomato agar


Obr. I: Ariana , odběr 5, kolonie č. 4, Tomato agar


106

Obr. J: Cerason + nystatin, odběr 4, kolonie č. 1, Tomato agar


Obr. K: Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1, Tomato agar


Obr. L: Cabernet Sauvignon + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1, MRS agar


107

Obr. M: Cabernet Sauvignon , odběr 2, kolonie č. 2, MRS agar


Obr. N: Mi-5-70, odběr 1, kolonie č. 1, MRS agar


Obr. O: Mi-5-70 + nystatin, odběr 2, kolonie č. 1, MRS agar


108

Obr. P: Mi-5-70 + nystatin, odběr 3, kolonie č. 2, MRS agar


Obr. Q: Mi-5-70 + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2, Tomato agar


Obr. R: Mi-5-70 + nystatin, odběr 5, kolonie č. 1, Tomato agar


109

Druhová diferenciace Rod Leuconostoc Víno a rod Leuconostoc Izolace z vína a uchovávání

Recommend Documents