Praktikum č. 12: Mikrobiologická diagnostika veterinárně významných zástupců čeledí Pasteurellaceae (r. Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Haemophilus, Taylorella), Vibrionaceae (r. Vibrio, Plesiomonas) a Aeromonadaceae (Aeromonas)
Cíle: 1. 2. 3.
Seznámit se s morfologií a kultivačními vlastnostmi veterinárně významných zástupců uvedených čeledí. Naučit se obecné postupy bakteriologické diagnosticky infekcí vyvolaných pasteurelami, aktinobacily, hemofily a aeromonádami. Naučit se postup diagnostiky infekční metritídy klisen.
Čeleď: Pasteurellaceae Rod: Pasteurella P. multocida - subsp. gallicida - subsp. multocida - subsp. septica Tento druh se vyskytuje téměř u všech teplokrevných zvířat kde vedle častých latentních infekcí sliznic dýchacích cest vyvolává různé klinické formy onemocnění. Tabulka č. 14: Nejvýznamnější onemocnění vyvolávané typy Pasteurella multocida P. multocida/typ Hostitel klinický obraz onemocnění Skot plicní pasterelóza (shipping fever), jeden z původců enzootické pneumonie telat, ojediněle mastitis Typ A Ovce Pneumonie, mastitis Prase Pneumonie Drůbež Cholera Králíci Infekční rýma Další druhy Pneumonie po stresu Typ B Skot, buvoli Hemoragická septikémie (Asie) Typ D Prase Pneumonie, atrofická rinitis Typ E Skot, buvoli Hemoragická septikémie (Afrika)
DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál - stěry sliznic, výtoky, orgány, krev. Mikroskopické vyšetření - roztěr nebo otisk barvíme metylénovou modří (pasteurely z vyšetřovaného materiálu se barví výrazněji na koncích tyčinek – jedná se o tzv. bipolární tinkci. Kultivační vyšetření: přímá kultivace na MPKA, inkubace při 37o C po dobu 24-48 h. Pasáž kontaminovaného materiálu: Suspenzi vyšetřovaného materiálu pasážujeme přes laboratorní myš (i.p. 0,5 ml) a z orgánů provedeme reizolaci pasteurel. Biochemické vyšetření: viz. tabulka č.
77
Tabulka č. 15: Přehled zástupců rodu Pasteurella s menším významem Druh Hostitel Význam P. aerogenes Prase Komenzál střeva, sporadický podíl na abortech P. anatis Kachny Komenzál střeva P. avium, Drůbež Komenzál horních dýchacích cest P. volatium, P. caballi Koně Komenzál horních dýchacích cest, příležitostně respiratorní infekce a peritonitídy P. canis Psi Komenzál dutiny ústní, příležitostně infikuje rány P. dagmatis Psi, kočky Komenzál dutiny ústní a nasofarynxu, příležitostně infikuje rány P. gallinarum Drůbež Komenzál horních dýchacích cest, příležitostně respiratorní infekce P. lymphangitidis Skot Ojediněle lymfangitídy P. mairii Prase Ojediněle aborty P. pneumotropica Hlodavci Komenzál horních dýchacích cest, ojediněle pneumonie, abscesy poranění z pokousání P. stomatis Psi, kočky Komenzál horních dýchacích cest P. testudinis Želvy Sporadicky abscesy Rod: Mannheimia Mannheimia haemolytica • pneumonie skotu a ovcí (telata, jehňata) • septikémie jehňat (i starších) • latentní infekce sliznice nasofaryngu skotu a ovcí Tabulka č. 16: Diferenciace biotypů Mannheimia haemolytica Vlastnost biotyp A biotyp T arabinóza + xylóza + trehalóza + citlivost k PNC + patogenita pneumonie skotu a ovcí, septikémie starších jehňat (více septikémie novorozených jehňat než 3 měsíce) latentní infekce + -
Tabulka 16a: Diferenciace P. multocida a M. haemolytica Znak Hemolýza na MPKA Růst na MacConkey agaru Tvorba katalázy Tvorba indolu Tvorba ureázy Ornitíndekarboxyláza Laktóza Maltóza Glukóza
M. haemolytica + + + + + +
P. multocida + + + +
Rod: Actinobacillus A.equuli, A.capsulatus, A.hominis, A.lignieresii, A.pleuropneumonie, A.muris, A.rossii, A.seminis, A.suis, A.ureae A. lignieresii Je to komenzál dutiny ústní a původce aktinomykózy měkkých tkání (jazyk, mízní uzliny) skotu a ovcí, jen zřídka u koní, psů a koček, ojediněle onemocní i člověk. A. equuli • komenzál střeva zdravých koní • izolován při ochromě hříbat (early paresis) • aborty klisen • enteritídy prasat, telat • artritídy prasat • septikémie selat A. suis • septikémie a pneumonie (sající selata) • subakutní infekce starších selat - odstávčat (arthritis, periarthritis, endocarditis, abscesy) • u ostatních druhů dom. zvířat se zřídka zjišťují infekce koní (pneumonie) A.pleuropneumoniae • původce infekční pleuropneumónie prasat A. capsulatus • vyvolává arthritídy králíků A. seminis • vyvolává v Austrálii, na Novém Zélandě a Jižní Africe infekční epididimitídy beranů DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál - punktáty, tkáně uhynulých zvířat, bioptáty a pod. Mikroskopické vyšetření - průkaz drůz (granul) při podezření na aktinomykózu. Kultivační průkaz - přímá izolace na MPKA, u A. pleuropneumoniae se půdy obohacují o růstové látky a antibiotický suplement. U některých druhů je vhodné v atmosféře zvýšit obsah oxidu uhličitého Tabulka č. 17: Diferenciace významných zástupců rodu Actinobacillus hemolýza CAMP růst na oxidáza ureáza laktóza manit trehalóza Druh test
MCA
A.lignieresii + + + + A.equuli v + v + + A.suis + + v + + A.pleuropneumoniae + + v + A.capsulatus + + + + Vysvětlivky: v - variabilní znak, MCA - Mc Conkeyův agar (upraveno pro výuku)
+ + +
+ + +
79
Rod: Haemophilus Tabulka č. 18: Význam jednotlivých druhů hemofilů Haemophilus parasuis
Onemocnění Glässerova choroba, polyserositídy a artritídy, sekundární pneumonie součást mikroflóry nosní dutiny
(+bažanti, krůty)
paragallinarum
Infekční rýma drůbeže, sinusitída, konjuktivitída
Pes
haemoglobinophilus aphrophilus felis somnus
Součást mikroflóry prepucia, vaginitídy a respiratorní infekce Komenzál farynxu Komenzál nazofarynxu, příležitostně respirační infekce 1. ISTME – infekční septikemická trombotizující meningoencefalitída (syndróm ospalosti) 2. respiratorní infekce - pneumónie, laryngitídy a tracheitídy (smíšené infekce s jinými bakteriémi) 3. arthritis, tendovaginitis 4. infekce reprodukčních orgánů, endometritídy, aborty, výskyt v semeni býků a na sliznicích reprodukčních orgánů Bronchopneumónie Septikémie, pneumónie, artritídy jehňat Obdobné infekce jako u skotu Vředovitá choroba pstruhů (vředovitý zánět tlamy a ploutví)
Hostitel Prase Drůbež
Kočka Skot
Ovce
Ryby
ovis agni somnus piscium
DIAGNOSTIKA HEMOFILŮ (obecně) Vyšetřovaný materiál. K vyšetření odebíráme stěry sliznic, změněné tkáně. Odebraný materiál chráníme zejména před vysýcháním v transportním médiu (Amiesova půda) a dopravíme ho co nejdříve k vyšetření (do 24 hodin). Přímé mikroskopické vyšetření. V obarvených otiskových preparátech a roztěrech hledáme drobné gramnegativní kokobacily, někdy i vlákna. Kultivační vyšetření. Hemofily s vyjímkou druhu H.somnus vyžadují v kultivačních médiích přítomnost růstových faktorů X (hemin) a V (NAD). Faktor X je termostabilní a je přítomný v dostatečném množství v 5% MPKA. Faktor V je koncentrován uvnitř červených krvinek a je citlivý NADázám, které se v krvi běžně vyskytují. Při přípravě čokoládového krevního agaru se V faktor uvolní z krvinek do média , NADázy se zahřátím média inaktivují a termostabilní X faktor zůstává zachován. Vedle čokoládového krevního agaru lze ke kultivaci využít satelitního typu růstu hemofilů na MPKA v blízkosti stafylokokové kultury (Staphylococcus epidermidis). Naočkovaná média inkubujeme při 37o C za aerobních nebo mikroaerofilních podmínek ( v 10% CO2) po dobu 2-4 dnů. U některých druhů může být růst patrný již po 24 hodinové inkubaci. Rod: Taylorella Taylorella equigenitalis Je původcem infekční metritídy klisen (CEM- contagius equine metritis). Průvodními příznaky infekce jsou endometritídy, vaginitídy, cervicitídy. U klisen a zejména hřebců jsou zjišťovány časté latentní infekce.
80
DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál. Od klisen pro vyšetření získáváme tamponové stěry z fossa glandis a krčku děložního. Od hřebců získáváme výtěry uretry, fossa glandis penis, prepucia a vzorek preejakulační tekutiny. Po odběru se provádí okamžitá kultivace médií nebo se vzorek vkládá do transportního média (Amiesova půda). Vzorky kultivujeme na čokoládový agar s antibiotickým suplementem (streptomycin nebo amphotericin B). Půdy inkubujeme za mikroaerofilních podmínek (95% N2, 5% CO2) při 37o C, po dobu 4 dnů. Identifikace. Šedobílé drobné kolonie mají průměr 1 - 1,5 mm, po obarvení podle Grama zjišťujeme přítomnost gramnegativních pleomorfních kokobacilů. Biochemické vlastnosti: oxidáza +, kataláza +, fosfatáza +
Tabulka č. 19: Diferenciace vybraných druhů hemofilů a T.equigenitali Vlastnost H.somnus H.parasuis H.paragallinarum H.hemoglobino- Taylorella equigenitalis philus závislost na X + faktoru závislost na + + V faktoru kataláza + + + oxidáza + + + růst při CO2 + V + + hemolýza V indol V + ureáza glukóza + + + + redukce NO3 + + + + sacharóza + + + Poznámky:
81
Čeleď: VIBRIONACEAE Rod: Vibrio V. cholerae • původce cholery člověka V. metschnikovi • vyvolává akutní gastroenteritídy kura domácího DIAGNOSTIKA • roste aerobně na základních médiích (MPA) v průhledných koloniích, 2-4 mm v průměru, v S a R fázi • biochemické vlastnosti: růst v bujónu s 3,5 % Na Cl + manit + arabinóza - sorbitol -
indol + glukóza +
sacharóza + xylóza -
V. parahaemolyticus • vyskytuje se v mořské vodě u pobřeží jihovýchodní Asie (brakické vody) • je původcem alimentárních toxikoinfekcí lidí (po požití kontaminovaných syrových a polosyrových ryb), dovozem potravin se může dostávat toto onemocnění i do jiných oblastí DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál - střevní obsah ryb, orgány, vzorky rybích výrobků Izolační postup : 4selektivní pomnožení ve slaném vizmut-sulfitovém bujonu (pH 9) při 42o C po dobu 24h
4
selektivní izolace na thiosulfát - citrátovém agaru se žlučovými solemi (pH 8,4) nebo na vizmut-sulfitovém agaru s fenolovou červení
Rod : Plesiomonas Plesiomonas shigeloides
4 4 4
je izolován z povrchových vod, střeva ryb a jiných vodních živočichů je prokazován i ve výkalech různých druhů savců např. koček, psů a opic (patogenita není zcela jasná) u člověka byl zaznamenán jako příčina průjmů
Čeleď: Aeromonadaceae Rod: Aeromonas POHYBLIVÉ AEROMONÁDY: A. hydrophila, A. caviae, A. sobria, A. media, A. allosacharophila, A. encheleia, A. trota, A. jandaei, A. veronii, A. schubertii Pohyblivé aeromonády jsou ubikvitární mikroflórou vody a ryb, patogenní kmeny druhu např. A.hydrophila vyvolávají choroby především u chladnokrevných zvířat:
4 4 4 4 4 4
infekční vodnatelnost kaprovitých po primární virové infekci erytrodermatóza kaprů včetně okrasných koi kaprů hemoragická septikémie ryb, žab („red leg disease“) ulcerativní stomatitídy hadů ojedinělé celkové infekce teplokrevných zvířat (štěňata), aborty skotu alimentární toxikoinfekce člověka
NEPOHYBLIVÉ AEROMONÁDY: A. salmonicida A. salmonicida subsp. achromogenes, subsp. masoucida a subsp. smithia jsou atypické kmeny izolované z lososovitých ryb. A. salmonicida subsp. salmonicida Vyvolává furunkulózu lososovitých. Onemocnění se projevuje kožní ulcerací, katarální až hemoragickou enteritídou. DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál - změněné tkáně, orgány, obsah střeva. Mikroskopické vyšetření – imunofluorescence. Kultivační průkaz - MPKA (7% ovčí krve), Columbia agar, Furunculosis agar (Difco). Biochemické vlastnosti: optimální teplota růstu 22 - 28o C, oxidáza + , OF test +/+ , rezistence k vibriostatikům, kataláza +, nitráty + Tabulka č. 20: Rozlišení A.hydrophila a A.salmonicida subsp. salmonicida Vlastnost A. hydrophila A. salmonicida subsp. salmonicida pohyb + o + růst při 37 C hydrolýza eskulinu + -
83
