Výzkumná zpráva pro Lesy České republiky

Výzkumná zpráva pro Lesy České republiky „Hodnocení vývoje zdravotního stavu vybraných stanovišť v Krušnohoří“ Etapa II - doplněk: 1) Lokalizace stanovišť 2) Analýza mikroskopických markerů z jarního odběru 2003, srovnání

s předchozími daty z roku 2000 - Etapa III. 3) Analýza histochemických markerů z podzimu 2002 a jarního odběru 2003, srovnání s daty z roku 1998 – Etapa II a III. 4) Biochemická analýza obsahu fotosyntetických pigmentů z roku 2003 Etapa II. Kolektiv autorů: Albrechtová J., Lhotáková Z., Polák T., Stejskalová A., Bartáková D.

Hlavní řešitel: Řešitelský kolektiv:

RNDr. Albrechtová Jana, e-mail: [email protected] Mgr. Tomáš Polák (případný zástupce hlavního řešitele, e-mail: [email protected]) Zuzana Lhotáková Mgr. Alena Stejskalová Mgr. Drahomíra Bartáková

Pracoviště: Katedra fyziologie rostlin, Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy (PřF UK), Viničná 5, Praha 2, 128 44;

V Praze, dne 31.12.2003

Výzkumná zpráva pro LČR: UK, PřF – Albrechtová a kol.

2

Výzkumná zpráva pro Lesy České republiky - „Hodnocení vývoje zdravotního stavu vybraných stanovišť v Krušnohoří od roku 1998“ Etapa II - doplněk:

OBSAH: 1) LOKALIZACE STANOVIŠŤ........................................................................................................... 3 2) ANALÝZA MIKROSKOPICKÝCH MARKERŮ Z JARNÍHO ODBĚRU 2003, SROVNÁNÍ S PŘEDCHOZÍMI DATY Z ROKU 2000 - ETAPA III. .................................................................... 3 2) ANALÝZA MIKROSKOPICKÝCH MARKERŮ Z JARNÍHO ODBĚRU 2003, SROVNÁNÍ S PŘEDCHOZÍMI DATY Z ROKU 2000 - ETAPA III. .................................................................... 4 METODIKA ........................................................................................................................................... 4 Metodika odběru ............................................................................................................................. 4 Metodika přípravy preparátů.......................................................................................................... 4 Metodika semikvantitativního hodnocení mikroskopických markerů.............................................. 5 Statistické hodnocení ...................................................................................................................... 5 VÝSLEDKY ........................................................................................................................................... 6 Anatomická stavba jehlic smrku ztepilého ...................................................................................... 6 Mikroskopické markery poškození .................................................................................................. 6 ZÁVĚRY:............................................................................................................................................... 9 3) ANALÝZA HISTOCHEMICKÝCH MARKERŮ Z PODZIMU 2002 A JARNÍHO ODBĚRU 2003........................................................................................................................................................ 10 METODIKA...................................................................................................................................... 10 Systém odběru a zhotovení preparátů ........................................................................................... 10 Histochemické detekce .................................................................................................................. 10 Kondenzované taniny............................................................................................................................... 10 Lignin....................................................................................................................................................... 10 Lipidické látky ......................................................................................................................................... 10 Izoprenoidy .............................................................................................................................................. 10

Semikvantitativní hodnocení ......................................................................................................... 11 Statistické hodnocení .................................................................................................................... 11 VÝSLEDKY ......................................................................................................................................... 11 Lokalizace fenolických látek v jehlicích ........................................................................................ 11 Hodnocení v závislosti na stupni poškození, stáří jehlice a stanovišti .......................................... 13 4) BIOCHEMICKÁ ANALÝZA OBSAHU FOTOSYNTETICKÝCH PIGMENTŮ Z ROKU 2003 - ETAPA II. .................................................................................................................................. 15 METODIKA ......................................................................................................................................... 15 Metodika odběru ........................................................................................................................... 15 Metodika detekce fotosyntetických pigmentů ................................................................................ 15 Statistické zpracování dat ............................................................................................................. 15 VÝSLEDKY ......................................................................................................................................... 16 Rok 2003.................................................................................................................................................. 16 Celkový průměrný obsah fotosyntetických pigmentů na stanovištích ................................................ 16 Průměrný obsah fotosyntetických pigmentů na stanovištích v nejmladších třech ročnících jehlic ..... 18 Průměrný obsah fotosyntetických pigmentů na vybraných stanovištích v nejmladších šesti ročnících jehlic ................................................................................................................................................... 20

5) BIOCHEMICKÁ ANALÝZA OBSAHU FOTOSYNTETICKÝCH PIGMENTŮ: POROVNÁNÍ VÝSLEDKŮ Z LET 1998 - 2003 - ETAPA III. ....................................................... 22 METODIKA ......................................................................................................................................... 22 VÝSLEDKY...................................................................................................................................... 22 POUŽITÁ LITERATURA .................................................................................................................. 25


3

1) Lokalizace stanovišť Výzkum byl proveden na pěti sledovaných stanovištích Krušných hor (viz předchozí zprávy), které zejména v 80. letech vykazovaly vysokou zátěž a silný gradient atmosférického znečištění, jež se zvyšovalo ve směru od západu na východ. Stanoviště 1, 2 a 3 jsou umístěna v západním Krušnohoří nedaleko Přebuzi, a v době největších smogových epizod bylo jejich ovlivnění atmosférickým znečištěním mnohem nižší než-li u stanovišť 4 a 5 z centrálního Krušnohoří (obr. 1), zejména díky výhodnému směru převládajících větrů. Stanoviště 2 a 3 leží v oblasti postihnuté v roce 1999 masivním žloutnutím jehlic; stanoviště 1 je mimo tuto oblast. Stanoviště 4 a 5 se nacházejí v centrálním Krušnohoří (stanoviště 4 u Černého potoka Přísečnice a stanoviště 5 u Kovářské), které bylo výrazně ovlivněno atmosférickými polutanty. Všechna stanoviště (30 x 30 m) jsou umístěna v homogenním minimálně 60-letém smrkovém porostu a probíhá na nich výzkum již od roku 1998 (viz Tab. 1). Tab. 1 – Popis stanovišť v Krušných horách, blízká obec, nadmořská výška, přesná poloha zjištěná pomocí přístroje GPS.

Označení stanoviště Lokalita Nadmořská výška (m n.m.)

1 (21)

2 (40)

3 (41)

4 (35)

5 (39)

Přebuz

Přebuz

Přebuz

Přísečnice

Kovářská

923,6

926,51

936,52

790,39

771,28

50°21´50´´S, 50°21´34´´S, 50°21´29´´S, 50°29´53´´S, 50°28´09´´S, 12°34´48´´V 12°38´16´´V 12°38´19´´V 13°07´20´´V 13°03´54´´V

Poloha

Obr. 1 - Lokalizace studovaných stanovišť na mapě Krušných hor

4

1 2, 3 5


4

2) Analýza mikroskopických markerů z jarního odběru 2003, srovnání s předchozími daty z roku 2000 - Etapa III. Vypracovali: Albrechtová, Bartáková, ve spolupráci s prof. Rockem (University of New Hampshire, USA)

METODIKA Metodika odběru Na každém z pěti stanovišť bylo v roce 1998 vybráno pět reprezentativních stromů. Z nich byla systematicky odebrána slunná větev z produkční části koruny (10-12 m nad zemí) pomocí odběrových kleští. Vzorky jehlic pro analýzy byly odebrány na počátku vegetační sezóny, a to mezi 26. květnem – 2. červnem 2003. Zpracovány byly první a třetí ročníky jehlic, které dle předchozích studií vykazují výraznější rozdíl v strukturálních parametrech. Metodika přípravy preparátů Vzorky pro anatomickou analýzu byly odebírány ihned po odběru větve a fixovány v 70% FAA (Johansen 1940, Němec a kol. 1962). Odebírány byly střední části jehlic. Schéma odběru vzorků jehlic je uvedeno v obr. 2.

Obr. 2: Schéma odběru jehlic pro anatomické řezy

Zvětšení

Strom Výhon

Jehlice

Příčný řez jehlicí 4m

25 mm

1,5 mm

0,5 mm

Po odběru byly vzorky 20 minut vystaveny podtlaku, aby bylo zajištěno prosycení pletiv fixáží. Po dvou dnech byla FAA vyměněna za 70% roztok etanolu, ve kterém vzorky zůstávaly až do zpracování. Vzorky byly postupně dehydratovány v etanolovo-butanolové řadě, s chloroformovým mezikrokem (1:1, v:v, 100% butanol:


5

chloroform) před konečným roztokem řady (100% butanolu) a převedeny do parafínu. Vzorky jehlic byly řezány na rotačním mikrotomu na příčné řezy tenké 14 µm. Řezy byly barveny safraninem a světlou zelení (nebo fast green) (Johansen 1940). Celkem bylo hodnoceno 720 řezů jehlicemi. Metodika semikvantitativního hodnocení mikroskopických markerů Bylo hodnoceno několik markerů stavu mezofylových buněk: 1) poškození chloroplastů a jejich integrita (obr. 3A) výskyt plazmolýz mezofylových buněk, 3) hromadění fenolických látek ve vakuole (obr. 3B), 4) výskyt „pruhovanosti“ protoplastu, 5) výskyt kaménkovitých látek a výskyt krystalů šťavelanu vápenatého. Těmto charakteristikám byly přiřazeny semikvantitativní hodnoty (SH) stupnice od 0 do 3. 0 = žádný výskyt, odpovídá nejlepšímu stavu, kdy sledované charakteristika nebyla vůbec přítomna. 1 = málo, 2 = středně, 3 = hodně. Řezu byla přiřazena taková SH, která odpovídala stavu nadpolovičního počtu buněk, tj. byla charakteristická pro více jak 50% mezofylových buněk. Obr. 3 - Semikvantitativní hodnoty (SH) stupnice buněčných změn mezofylu. A) Postupné poškození chloroplastů (vlevo) až jejich dezintegrace (vpravo). B) Akumulace fenolických látek v centrální vakuole. Fenolické látky tmavočerveně až fialově.

A) Poškození chloroplastů

SH=0

SH=1

SH=2

SH=3

B) Akumulace fenolických látek ve vakuole

Statistické hodnocení

SH=0

SH=1

SH=2

SH=3

Korelace mezi markery byla hodnocena s použitím Spearmanova pořadového koeficientu. Loglineární modely byly použity pro hodnocení významnosti rozdílů SH semikvantitativních parametrů, které nabývaly diskrétní hodnoty. Významnost všech testů byla ověřována na hladině α= 0.05. Statistické hodnocení bylo provedeno s pomocí programu NCSS 6.0.


6

VÝSLEDKY Anatomická stavba jehlic smrku ztepilého Smrk ztepilý je jehličnan s xeromorfními jednožilnými listy. Anatomická struktura zdravé a poškozené jehlice smrku ztepilého je uvedena v obr. 4. Povrch jehlice je tvořen pokožkou – epidermis, složenou z tlustostěnných buněk se silnou vrstvou kutikuly. Nedílnou součástí epidermis jsou zanořené průduchy. Průduchy (stomata) umožňují výměnu plynů a nacházejí se na celém povrchu listu v rovnoběžných, podélných řadách. Pod epidermis se nachází spodní pokožka - hypodermis. Hypodermis je tvořena vrstvou sklerifikovaných buněk se silnou buněčnou stěnou – je mechanickou výztuží jehlic. Tato vrstva buněk je přerušena pouze v místech, kde procházejí vertikální řady průduchů. Někdy epidermis a hypodermis bývají souhrnně označovány jako dermální pletiva. Prostor mezi krycími pletivy a středovým cévním svazkem vyplňuje fotosyntetické pletivo mezofyl, který je tvořen buňkami parenchymatické povahy s velkým množstvím chloroplastů uložených v nástěnné cytoplazmě a obvykle s jednou centrální vakuolou. Jednotlivé buňky mezofylu jsou uspořádány paprsčitě kolem cévního svazku. V listovém mezofylu lze často pozorovat 1-2 pryskyřičné kanálky. Hlavní funkce mezofylu spočívá v realizaci pochodů fotosyntézy. Strukturální stav mezofylových buněk podmiňuje funkčnost jehlic. Střed jehlice vyplňuje střední válec s jedním cévním svazkem. Cévní svazek obsahuje ve středu vodivá pletiva – dřevní (xylém) a lýkovou (floém) část. Xylém se nachází na svrchní straně listu, floém na spodní straně listu. Cévní svazek spolu s vodivými pletivy je obklopen pochvou, tzv. endodermis. V buněčné stěně endodermálních buněk jsou často popisovány Casparyho proužky a lignifikovaná buněčná stěna. Mikroskopické markery poškození Pruhovanost protoplastu se téměř nevyskytovala, proto o ní dále nebudeme hovořit ani uvažovat. Korelační analýza prokázala, že většina ze šesti sledovaných parametrů spolu koreluje a vyskytuje se tedy často společně a často se současně prohlubuje negativní změna. Konkrétně, hromadění fenolických látek statisticky průkazně koreluje s postupem plazmolýzy a výskytem kapénkových látek (subcelulárních inkluzí). Výskyt subcelulárních inkluzí koreluje s výskytem plazmolýz a výskyt krystalů šťavelanu vápenatého koreloval s výskytem subcelulárních inkluzí. S výjimkou výskytu krystalů šťavelanů vápenatého, v roce 2003 měly všechny další sledované parametry nejnižší výskyt na stanovišti 1 (21), viz graf 1. Stejný trend bylo možno pozorovat v roce 2000, avšak v roce 2003 došlo ještě ke zlepšení sledovaných parametrů oproti ostatním stanovištím. Jehlice odebrané na tomto stanovišti se jevily jednoznačně jako velmi zdravé. Ve srovnání s řezy z předchozích let (1991, 1996, 1998) to byly dosud nejzdravější námi pozorované jehlice. Poškození chloroplastů se v tomto roce na rozdíl od let předchozích vpodstatě vůbec nevyskytovalo. Taktéž došlo ke zmenšení výskytu plazmolýz protoplastu mezofylových buněk oproti jehlicím odebraných v roce 2000. Výskyt fenolických látek zůstal víceméně nezměněn. Bylo možno pozorovat mírný trend zvýšení výskytu subcelulárních inkluzí dle histochemických detekcí povahy lipidické a terpenických (pryskyřičných kyselin), viz obr. 5. Hromadění látek lipidické povahy je známo v důsledku poškození stresovými faktory a bylo pozorováno mnoha autory. Hromadění látek terpenických může přispívat ke zvýšení odolnosti stromů vůči napadení parazity.


ZDRAVÁ JEHLICE

7

POŠKOZENÁ JEHLICE

průduch

epidermis hypodermis střední válec s vodivými pletivy mezofylové buňky mezibuněčné prostory

Obr. 4 - Příčný řez středovou částí zdravé a poškozené jehlice smrku ztepilého. (nahoře). Jednotlivá pletiva tvořící jehlici jsou popsána v obrázku. Některé negativní změny mezofylových buněk (dole): poškození chloroplastů, výskyt plazmolýz buněk, hromadění fenolických látek. Ve více detailu viz obr. 4. Úsečka odpovídá 300 um.

POŠKOZENÁ

ZDRAVÁ

A

chloroplasty

B

C

jádro

D

Plazmolýza akumulace (odtržení fenolických protoplastu od látek ve vakuole buněčné stěny) (tmavě fialové zbarvení)


8

Graf 1 - Průměrné hodnoty semikvantitativních hodnot (0-3) sledovaných parametrů poškození mezofylových buněk na řezech jehlicemi smrku ztepilého. Porovnání roku 2000 a 2003. NAC – ročník jehlic. Vertikální úsečky označují směrodatné odchylky,v roce 2000 n=180, v roce 2003 n=720. semikvantitativní hodnocení

hromadění fenolických látek

3

NAC 1

2

3

1 0 21

40

41

35

39

21

40

2000

41

35

39

2003

semikvantitativní hodnocení

poškození chloroplastů

3 1

2

3

1 0 21

40

41

35

39

21

40

2000

41

35

39

2003


postup plazmolýz mezofylových buněk

3

NAC

2

1 3

1 0 21

40

41

35

39

21

40

2000

41

35

39

2003


výskyt subcelulárních inkluzí

3

NAC 1

2

3

1 0 21

40

41 2000

35

39

21

40

41 2003

35

39


9

Obr. 5 - Výskyt kapénkovitých látek (subcelulárních inkluzí) v mezofylových buňkách. A) často se vyskytuje jedna kapénka v blízkosti jádra. B) hodně kapének C) histochemická detekce lipidických látek – červené kapénky, viz kap. 3. D) histochemická detekce terpenů – modře monoterpeny, fialově pryskyřičné kyseliny, viz kap.3.

A

C

D

B

Množství krystalů šťavelanu vápenatého bylo statisticky odlišné na jednotlivých stanovištích v Krušných horách a nejevilo souvislost s poškozením. Zdá se, že souvislost je třeba hledat v průběhu vápnění jednotlivých studijních ploch. Například stanoviště 1 (21) bylo vápněno v roce 2000 a v jehlicích bylo zjištěno velké množství krystalů nezávisle na ročníku jehlic či poškození. Jehlice ze stanoviště 5 (39) téměř neobsahovaly krystaly šťavelanu vápenatého v roce 2000, zatímco v roce 2003 ano poté, co plocha byla vápněna v mezidobí (Tab. 2). Tab. 2 - Přehled vápnění sledovaných ploch (data dodána LČR). Minimální hmotnost v suchém materiálu: MgCO3: 36.5%; MgO: 17.4%; Mg: 10%; CaCO3 + MgCO3: 80%. 21

35

1985 (3t/ha)

1990 (2,2t/ha)

2000 (2,5t/ha)

2002 (3t/ha)

39 2001 (3t/ha)

40

41

?

?

2000 (3t/ha)

2000 (3t/ha)

ZÁVĚRY: Na základě detailního hodnocení anatomických řezů jehlicemi smrku ztepilého je možno uzavřít, že: • Jehlice ze stanoviště 1 (21) jsou ve výborném fyziologickém a strukturálním stavu a došlo zde ke zlepšení jejich stavu oproti roku 2000. • Dochází k postupnému zlepšování strukturálního a fyziologického stavu jehlic na jednotlivých stanovištích. • Výskyt krystalů šťavelanu vápenatého se jeví závislý na stanovišti a předchozím vápnění.


10

3) Analýza histochemických markerů z podzimu 2002 a jarního odběru 2003 Vypracovaly: Stejskalová, Polák, Albrechtová

METODIKA Systém odběru a zhotovení preparátů Jehlice prvního a třetího ročníku smrku ztepilého byly řezány na ručním mikrotomu. Z každého stanoviště byly vybrány vždy dva stromy patřící do odlišné kategorie poškození stromů založené na různé defoliaci koruny těchto stromů (stupeň poškození (SP; určován podle Muller et al. 1990) roven jedné pro defoliaci koruny 20 – 25% a stupeň poškození roven dvěma pro defoliaci koruny 30 – 35%.). Tloušťka řezů byla přibližně 50 µm. Na pěti ručních příčných řezech ze tří jehlic jednoho vzorku vždy pro každou detekci byl prováděn obecný důkaz fenolických látek, rozpustných taninů, ligninu, lipidů. Histochemické detekce Fenolické látky Histochemický průkaz fenolických látek byl prováděn pomocí nasyceného roztoku Fast Blue BB (Salt) v destilované vodě (O´Brien a McCully 1981). Pletiva obsahující fenolické látky se barvila hnědočerveně. Kondenzované taniny Pro zjišťování lokalizace kondenzovaných taninů byl použit vanilinový test (Gardner 1975). Jednalo se o nasycený roztok vanilinu v 96% etanolu, který se smíchal se stejným objemem 50% H2SO4. Po 5 minutách barvení byly řezy montovány do okyseleného glycerolu. Výsledkem reakce bylo červené zbarvení kondenzovaných taninů. Z důvodu zjištěné nestálosti barevné reakce byly tyto řezy hodnoceny ihned po provedení barevné detekce. Lignin Přítomnost ligninu v pletivech jehlic byla zjišťována floroglucinol-HCl testem (Němec 1962). Detekčním činidlem byl roztok 12% HCl, kde floroglucinol tvořil jedno hmotnostní procento. Aby se předešlo ztrátě zabarvení, řezy byly po 5 minutách barvení montovány do okyseleného glycerolu. Pletiva obsahující lignin byla zbarvena purpurově až fialově. Lipidické látky K detekci lipidických látek byla použita sudanová červeň (Brundrett et al. 1991), rozpuštěná při 90°C v PEG 400 na konečný jednoprocentní hmotnostní obsah. Lipofilní částice byly v řezech zbarveny červeně. Izoprenoidy Barvení NADI (David et al. 1964) slouží k lokalizaci jednotlivých skupin izoprenoidů. Tato detekce byla pouze testována (viz obr. 5 v kap. 2). Těsně před barvením se smíchá 0,5 ml jednoprocentního roztoku α-naftolu ve 40 % etanolu s 0,5 ml jednoprocentního roztoku chlorhydrátu dimetyl-parafenylen-diaminu a 49 ml 0,05 M fosfátového pufru o pH 7,2. Zmražené řezy se umisťují na 1 – 1,5 h do této směsi a poté jsou montovány do čistého 75 % glycerolu.


11

Semikvantitativní hodnocení Výsledky histochemických reakcí byly hodnoceny na základě semikvantitativní stupnice (Tab. 3) v krycích pletivech, v buněčných stěnách mezofylových buněk a endodermis, dále v cytoplazmě mezofylových buněk a endodermis a ve středním válci. Intenzita barevné reakce nebyla hodnocena, odhadem se hodnotila plocha s pozitivní reakcí. Stupeň barevné Detekce 0 1 2 3

Odhad plochy s pozitivní reakcí žádná (0 %) malá (1 – 25%) střední (26 – 50%) velká (51 – 100%)

Tab. 3 – Semikvantitativní stupnice hodnocení výsledků histochemických detekcí v jehlicích odebraných v Krušných horách

Statistické hodnocení Data byla vyhodnocena pomocí statistického programu NCSS 6.0., hladina významnosti všech testů byla α = 0,05. výsledky získané semikvantitativním hodnocením byly hodnoceny loglineárními modely, viz kap. 2.

VÝSLEDKY Lokalizace fenolických látek v jehlicích

Lokalizace studovaných látek bez ohledu na intenzitu zbarvené reakce v jednotlivých částech jehlice smrku ztepilého zjištěná pomocí histochemických detekcí je uvedena v Tab. 4. Fenolické látky a kondenzované taniny byly pozorovány v cytoplazmě krycích pletiv (epidermis a hypodermis) a dále v buněčných stěnách a cytoplazmě mezofylových buněk, endodermis a středního válce jehlice smrku ztepilého. Hlavní složku fenolických látek v jehlicích tvořily kondenzované taniny, jak je patrné při porovnání detekce fenolických látek a kondenzovaných taninů (obr. 6). Lignin byl pozorován v buněčných stěnách téměř všech buněk jednotlivých pletiv jehlice (epidermis a hypodermis, mezofylové buňky, endodermis, xylém, sklereidy). Ve středním válci jehlice nebyly lignifikované buněčné stěny proteinových a sítkových buněk (obr. 6). Lipidické látky byly v jehlicích pozorovány ve vrstvě epikutikulárního vosku. Ve formě lipidických kapének se vyskytovaly v cytoplazmě epidermis, hypodermis, mezofylových buněk a endodermis. Ve středním válci byly lipidické látky lokalizovány hlavně v cytoplazmě parenchymatických buněk (obr. 6).


12

Tab. 4 – Lokalizace jednotlivých studovaných látek ve studovaných částech jehlice smrku zjištěná pomocí konkrétní histochemické detekce. Pletiva / studované látky Detekce Kutikula Buněčné stěny krycích pletiv Cytoplazma krycích pletiv

kondenzované fenolické látky taniny Floroglucinol Vanilin Fast Blue BB Salt ano ne ne ano ne ne ano ano ano lignin

lipidické látky Sudan 7B Ano Ne Ano

Buněčné stěny mezofylových buněk

ano

ano

ano

Ne

Cytoplazma mezofylových buněk

ne

ano

ano

ano

Buněčné stěny endodermis Cytoplazma endodermis Buněčné stěny středního válce Cytoplazma středního válce

Ano Ne ano ne

ano ano ano ano

ano ano ano ano

ne ano ne ano

Obr. 6 - Lokalizace sledovaných látek v jednotlivých částech jehlic smrku ztepilého. Dermální pletiva Mezofylové buňky Endodermis Kondenzované taniny

Vanilin M=40x

Lignin Floroglucin ol M=40x

Fenolické látky

Fast Blue BB Salt

M=40x

Lipidické látky Sudan 7B M=40x

Střední válec


13

Hodnocení v závislosti na stupni poškození, stáří jehlice a stanovišti Zhodnocení histochemických reakcí pro detekci fenolických látek, kondenzovaných taninů a ligninu neprokázalo žádné rozdíly v lokalizaci těchto látek v žádném z hodnocených pletiv. Rozdíl v lokalizaci ligninu v buněčných stěnách mezofylových buněk byl pozorován pouze při hodnocení v roce 1998 (Soukupová et al. 2000), ale již ne v roce 2000 (Stejskalová 2003). Lokalizace těchto látek nebyla ovlivněna stářím jehlice, stupněm poškození stromu ani rozdílnou lokalitou. Rozdíl byl nalezen pouze v akumulaci lipidických látek v mezofylových buňkách jehlic v roce 2003, kdy se množství lipidických látek lišilo na jednotlivých stanovištích, přičemž úplně nejméně lipidických látek obsahovaly jehlice ze stanoviště 1 (21) , viz graf 2, tab. 5. V roce 2002 nebyl zjištěn žádný statistický rozdíl ve výskytu lipidických látek v jehlicích v žádném ze sledovaných pletiv, tedy množství lipidických látek nebylo ovlivněno stupněm poškození stromu ani stanovištěm (tab. 5).

ZÁVĚRY Na základě detailního hodnocení histochemických detekcí na řezech jehlicemi smrku ztepilého je možno uzavřít, že: •

Nebyl nalezen rozdíl v lokalizaci sledovaných látek (fenolických látek, ligninu, kondenzovaných taninů) zjištěné pomocí histochemické detekce mezi rokem 2002 a 2003. Intenzita reakcí nebyla studována. Jediný rozdíl byl nalezen v lokalizaci lipidických látek, kdy mezofylové buňky jehlic ze stanoviště 1 (21) obsahovaly méně lipidických kapének než jehlice z ostatních stanovišť. To opět ukazuje na nejlepší fyziologický stav jehlic na tomto stanovišti.

•

Graf 2 - Průměrné zastoupení lipidických látek v jednotlivých pletivech jehlice smrku ztepilého. SP – stupeň poškození. Použito semikvantitativní hodnocení (viz tab. 2); vertikální úsečky odpovídají směrodatné odchylce. Lipidické látky (mezofyl)

4

2002 SP 1

3

2002 SP 2

2

2003 SP 1

1

2003 SP 2

0 21

35

39

40

Semikvantitativní hodnocení


Lipidické látky (krycí pletiva) 4

2002 SP 1

3

2002 SP 2

2

2003 SP 1

1

2003 SP 2

0

41

21

2002 SP 1 2002 SP 2

2

2003 SP 1

1

2003 SP 2

0 40

Stanoviště

41



3

39

40

41

Lipidické látky (střední válec)

Lipidické látky (endodermis)

35

39

Stanoviště

Stanoviště

21

35

3

2002 SP 1

2

2002 SP 2 2003 SP 1

1

2003 SP 2

0 21

35

39

40

Stanoviště

41


14

Tab.5 - Dosažené hladiny testu vlivu stupně poškození a stanoviště na obsah lipidických látek a zastoupení šťavelanu vápenatého v jednotlivých pletivech jehlic na podzim 2002 a na jaře 2003. Vliv faktoru je statisticky průkazný pro dosaženou hladinu testu nižší než 0,05. hodnoceno loglineárními modely. Vliv faktoru

Krycí pletiva Mezofyl Endodermis Střední válec

Stupeň poškození Stanoviště Stupeň poškození Stanoviště Stupeň poškození Stanoviště Stupeň poškození Stanoviště

Dosažená hladina testu Podzim 2002

Jaro 2003

1,0000 1,0000 0,8859 0,9894 0,9360 1,0000 0,8629 0,9890

1,0000 1,0000 0,4536 0,0001 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000


15

4) Biochemická analýza obsahu fotosyntetických pigmentů z roku 2003 - Etapa II. Vypracovali: Lhotáková, Polák, Stejskalová, Albrechtová

METODIKA Metodika odběru Vzorky jehlic pro biochemické analýzy obsahu fotosyntetických pigmentů byly odebrány na počátku vegetační sezóny, a to mezi 26. květnem – 2. červnem 2003 na pěti dlouhodobě sledovaných stanovištích v západních a středních Krušných horách (viz Tab. 1). Byl stanoven obsah fotosyntetických pigmentů (chlorofylu a, chlorofylu b a celkových karotenoidů) vždy pro 3 nejmladší ročníky jehlic z pěti reprezentativních stromů na každém stanovišti. Vzhledem k tomu, že se jednalo o počátek vegetační sezóny, kdy ještě nebyl ukončen vývoj jehlic ročníku, který byl formován v tomto roce, jako ročník 1 byly odebrány nejmladší, plně vyvinuté jehlice, tj. jehlice formované v roce 2002. To znamená, že 1. ročník jehlic v roce 2003 odpovídá 1. ročníku jehlic v roce 2002. U stanovišť 1, 2, 3 a 4 byl obsah fotosyntetických pigmentů zjišťován až u 6 nejmladších ročníků jehlic. Opět 1. ročník jehlic v případě jehlic odebraných v roce 2003 se vztahuje k nejmladšímu ročníku plně vyvinutých jehlic, tj. jehlic formovaných na jaře roku 2002. Metodika detekce fotosyntetických pigmentů Koncentrace chlorofylu a a b a celkového množství karotenoidů byly zjišťovány spektrofotometricky extrakcí v dimethylamidu kyseliny mravenčí (DMF; Porra et al. 1989, Wellburn 1994). Hodnoty absorbance byly změnřeny spektrofotometrem Unicam Helios α. při vlnových délkách 480, 647, 664 a 750 nm. Výpočet koncentrace fotosyntetických pigmentů byl prováděn podle rovnic Lichtenthalera (Box 1; 1987) a odebrané paralelní vzorky sloužily ke stanovení suché hmotnosti, podíl suché a čerstvé hmotnosti byl součástí výpočtů koncentrace fotosyntetických pigmentů. Box 1 - Rovnice výpočtu koncentrace chlorofylů dle Lichtenthalera (1987). Cha = chlorofyl a; Chb = chlorofyl b; c(x + c) = celková koncentrace karotenoidů a xantofylů. Cha = 11,65 * A664 – 2,69 * A647 (µg/ml) Chb = 20,81 * A647 – 4,53 * A664 (µg/ml) c(x + c) = (1000 * A480 – 0,89 Ca – 52,02 * Cb) / 245 (µg/ml)

Statistické zpracování dat Data byla vyhodnocena pomocí statistického programu NCSS 6.0., hladina významnosti všech testů byla α = 0,05. Hodnoty získané z biochemických analýz byly hodnoceny pomocí jednorozměrné analýzy rozptylu. V případě normálního rozdělení dat a shody rozptylů byl použit regulérní test analýzy rozptylu a jako mnohonásobný srovnávací test Tukey-Kramer test. V opačném případě byl použit Kruskal-Wallis Z test. Pro zjištění vlivu více faktorů byla použita analýza variance.


16

VÝSLEDKY Rok 2003 Celkový průměrný obsah fotosyntetických pigmentů na stanovištích Průměrný obsah fotosyntetických pigmentů je uveden v grafu 3a,b. Průměrný obsah chlorofylu a+b, chlorofylu a a chlorofylu b (graf 3a) byl sice nejnižší u stanoviště 21 ze západního Krušnohoří, avšak nebyly nalezeny žádné statisticky významné rozdíly v obsahu fotosyntetických pigmentů v jehlicích studovaných stromů. To znamená, že můžeme uzavřít, že obsah fotosyntetických pigmentů v jehlicích je víceméně stejný na všech stanovištích a pohybuje se ve fyziologickém rozmezí indikujícím dobrý fyziologický stav stromů. Vzhledem k hodnotám obsahu fotosyntetických pigmentů zjištěných pomocí spektrálních analýz v jehlicích odebraných v letech 1991 a 1995 (obr. 2 v Rock, 2003 – Zpráva pro Lesy České republiky) je možno uzavřít, že od počátku 90. let minulého století došlo k průběžnému zlepšování zdravotního stavu stromů. Je známo, že obsahy chlorofylů i karotenoidů v jehlicích jehličnatých stromů (a rostlin obecně) vykazují zřetelnou roční dynamiku s maximem v létě, což odpovídá vegetační sezóně, kdy fyziologické a metabolické procesy jsou velmi intenzivní, dochází k budování biomasy, vázání vzdušného CO2 do organických sloučenin, v případě stromů převážně do dřeva - do celulózy, ligninu. Minimální obsah chlorofylů i karotenoidů v jehlicích jehličnatých stromů v průběhu roční dynamiky je v zimních měsících, kdy vegetační sezóna je ukončena a stromy se nacházejí v klidovém období – tzv. období dormance. V literatuře se uvádí, že obsah chlorofylu a v jehlicích nepoškozených smrků se pohybuje v rozmezí 1,4-1,6 mg/g sušiny v zimě a 2,2-2,7 mg/g sušiny v létě (Siefermann-Harms 1994). Jelikož byly odběry v roce 2003 provedeny na přelomu května a června, kdy došlo k nástupu vegetační sezóny, která však ještě nebyla v plném proudu, je zřejmé, že všechna stanoviště mají dostatečně vysoké hodnoty odpovídající dobrému fyziologickému stavu stromů (obr. 3a). Mírně nižší průměrná hodnota chlorofylu a, avšak ne statisticky významně, byla nalezena pouze na stanovišti 21, a to 2,1 mg/g sušiny. Avšak vzhledem k tomu, že se statisticky neliší od ostatních stanovišť, jejichž průměr přesahuje hodnoty uváděné pro zdravé stromy v létě, je možné uzavřít, že obsah fotosyntetických pigmentů ukazuje na dobrý fyziologický stav stromů. Chlorofyly a a b, které tvoří obvykle 0,5-2% sušiny rostlin (Šesták a Čadský 1966), se ve vyšších rostlinách vyskytují v určitém poměru (chlorofyl a/b), který bývá v rozmezí 1,5:1 až 3,5:1 (nejčastěji 2:1 až 3:1) (Šesták a Čadský 1966). Tento poměr může být ovlivněn podmínkami růstu a faktory prostředí (Lichtenthaler 1987) jako je např. dostupnost slunečního záření, živin a působení atmosférických polutantů. Poměr chlorofylu a / chlorofylu b byl průkazně nejvyšší u stanoviště 35 a nejnižší u stanoviště 21 (graf 3b), avšak na všech stanovištích se tento poměr vyskytuje v uvedeném fyziologickém rozmezí odpovídajícím dobrému fyziologickému stavu stromů. Zvýšený poměr chlorofylů a/b zaznamenali např. Igawa a kol. (1997) ve stromech jedle ošetřených kyselým spadem, kdy příčinou tohoto nárůstu bylo zvýšení obsahu chlorofylu a. Pozorovaný jev autoři vysvětlují jako možnou cestu vyrovnání ztrát pigmentů způsobených opadem jehlic. A právě stanoviště 35 v Krušných horách bylo v minulosti silně ovlivňováno vysokým kyselým spadem a dochází zde


17

k regeneračním procesům postupné náhrady opadaného jehličí (viz naše zpráva pro LČR - Etapa I a Etapa II). Dalším fotosyntetickými pigmenty jsou karotenoidy, které vykonávají dvě podstatné úlohy v procesu fotosyntézy. Buď se podílejí na příjmu světla, nebo je jejich funkcí fotoprotekce fotosyntetického aparátu. Obě tyto funkce v sobě zahrnují interakci mezi karotenoidy a chlorofyly, ale pokaždé v jiném směru. Fotoprotekce zajišťuje, při nadměrné ozářenosti, tok energie směrem od chlorofylů. Při sběru světla je naopak energie předávána na chlorofyly (Demmig-Adams a kol. 1996). Obsah celkových karotenoidů byl statisticky průkazně nejnižší u stanoviště č.21 (graf 3a), avšak stále hodnoty odpovídají fyziologickým hodnotám. Poměr chlorofylu a+b a celkových karotenoidů byl u všech stanovišť shodný a hodnoty odpovídají fyziologickým hodnotám (graf 3b). Graf 3a,b - Průměrné obsahy fotosyntetických pigmentů (a) (udávané v mg na g suché hmotnosti jehlic) a jejich poměrů (b; bezrozměrná veličina) pro jednotlivá stanoviště. Vertikální úsečky označují směrodatné odchylky. Písmena nad sloupci u dané proměnné jsou uvedena pouze v případě, když mezi jednotlivými sloupci byl zjištěn průkazný rozdíl. Sloupce se shodnými písmeny nejsou statisticky průkazně odlišné; analýza rozptylu jednoduchého třídění, α = 0,05.

(mg/g SH)

a

Průměrný obsah fotosyntetických pigmentů (2003)

4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

21 40 41 35 39

b a a a a Chlorofyl a+b

b

Chlorofyl a

Chlorofyl b

Celkové karotenoidy

Průměrný obsah fotosyntetických pigmentů (2003)

18 16 14

21 40 41 35 39

12 10 8 6 4

c

bc

bc

a

ab

2 0 Chlorofyl a / Chlorofyl b

Chlorofyl a+b / celkové karotenoidy


Průměrný obsah fotosyntetických v nejmladších třech ročnících jehlic

18

pigmentů

na

stanovištích

Průměrný obsah fotosyntetických pigmentů (chlorofyl a, b, a+b, celkové karotenoidy) a jejich poměrů (chlorofyl a/b, chlorofyl a+b / celkové karotenoidy) na stanovištích pro první tři ročníky jehlic je uveden v grafu 4a-f. Celkový obsah chlorofylů se průkazně zvyšuje s rostoucím stářím jehlic na všech stanovištích (graf 1c), což je obvyklý trend zaznamenaný ve většině prací. Vzhledem k tomu, že statistická analýza neprokázala statisticky významnou interakci vlivu stanoviště a stáří jehlic na celkový obsah chlorofylů, můžeme říci že trend zvýšení obsahu chlorofylů je shodný na všech stanovištích a je tudíž obecnějšího charakteru. Opět tedy svědčí závětu o zlepšování zdravotního stavu stromů v posledních letech. Graf 4 a-f - Průměrné obsahy fotosyntetických pigmentů (udávané v mg na g suché hmotnosti jehlic) pro nejmladší tři ročníky jehlic na sledovaných stanovištích. Vertikální úsečky označují směrodatné odchylky. Písmena nad sloupci u dané proměnné jsou uvedena pouze v případě, když mezi jednotlivými sloupci byl zjištěn statisticky průkazný rozdíl. Sloupce se shodnými písmeny nejsou statisticky průkazně odlišné; analýza rozptylu jednoduchého třídění, α = 0,05.

Chlorofyl a+b (mg / g SH)

a 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

a

Chlorofyl a (mg / g SH)

a

a

a

b

ab

b

b

c

21

b

b

40

c

41 Stanoviště

2,5 2

35

b c

b

b

39

a a ab c

1 0,5 0 40

41 Stanoviště

35

Ročník jehlic

1 2 3

c

1,5

21

Ročník jehlic

1 2 3

b

ab b

b

a

a

a

ab

b

3,5 3

a

39


Chlorofyl b (mg / g SH)

c

1,2

a

1 0,8

19

a

a

a b

a

ab

b

b b b

b

0,6

ab b

c

Ročník jehlic

1 2 3

0,4 0,2 0 21

Chlorofyl a / chlorofyl b

d

40

41 Stanoviště

35

39

4 a

3,5

b b

3

Ročník jehlic

2,5

1 2 3

2 1,5 1 0,5 0

e

0,235

Karotenoidy (mg / g SH)

21

0,23

40

41 Stanoviště

35

39

0,225

Ročník jehlic

0,22 0,215

1 2 3

0,21 0,205 0,2 0,195 0,19 21

40

41 Stanoviště

35

39


(Chlorofyl a + chlorofyl b) / celkové karotenoidy

f

20

30 25 20

a a

Ročník jehlic

a b

15

a

1 2 3

b

10 5 0 21

40

41 Stanoviště

35

39

Průměrný obsah fotosyntetických pigmentů na vybraných stanovištích v nejmladších šesti ročnících jehlic Pro detailnější porovnání obsahu fotosyntetických pigmentů byla vybrána dvě stanoviště ze západního Krušnohoří (40, 41) a stanoviště 39 ze středního Krušnohoří (graf 5). U obou stanovišť byl obsah fotosyntetických pigmentů stanoven pro 6 ročníků jehlic. Průměrné obsahy chlorofylů byly vyšší u stanoviště 40 a 41 u Přebuzi. Ačkoliv pro stanoviště 39 byly naměřeny nižší průměrné obsahu pigmentů, stále dosahují uspokojivých fyziologických hodnot. I přes dřívější závažnou imisní zátěž centrálního Krušnohoří lze podle absence výkyvů v obsahu pigmentů starších ročníků jehlic usuzovat na regeneraci stromů v této oblasti.


21

b

6 5 4 3

40

2

41

1

39

0 1

2

3

4

5

4 Chlorofyl a (mg / g SH)

a

Chlorofyl a+b (mg / g SH)

Graf 5 a-f - fotosyntetických pigmentů (udávané v mg na g suché hmotnosti jehlic) a jejich poměru u 6 ročníků jehlic na třech vybraných stanovištích. Vertikální úsečky označují směrodatné odchylky. Písmena nad sloupci u dané proměnné jsou uvedena pouze v případě, když mezi jednotlivými sloupci byl zjištěn průkazný rozdíl. Sloupce se shodnými písmeny nejsou statisticky průkazně odlišné; analýza rozptylu jednoduchého třídění, α = 0,05.

3,5 3 2,5

abb 40

2 1,5

41

1 0,5

39

0

6

1

2

3

1

40 41

0,5

39

0 2

3

4

5

6

Chlorofyl a/ chlorofyl b

d

1,5

1

Celkové karotenoidy (mg / g SH)

Ročník jehlic

a b a

0,2

e

f

0,15

40

0,1

41

0,05

39

0 2

3

4

Ročník jehlic

6

4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

40 41 39

1

0,25

1

5

Ročník jehlic

5

6


c

Chlorofyl b (mg / g SH)

Ročník jehlic

4

2

3 4 Ročník jehlic

5

6

30 25

a b ab

20

40

15

41

10

39

5 0 1

2

3 4 Ročník jehlic

5

6


22

5) Biochemická analýza obsahu fotosyntetických pigmentů: porovnání výsledků z let 1998 - 2003 - Etapa III. Vypracovali: Stejskalová, Lhotáková, Polák, Soukupová, Šolcová, Albrechtová

METODIKA Je stejná jako metodika popsaná v kapitole 4 této zprávy.

VÝSLEDKY V grafu 6a-f jsou vyneseny průměrné hodnoty fotosyntetických pigmentů a jejich poměrů pro první tři ročníky jehlic na sledovaných stanovištích v letech 1998-2003. Pro stanoviště č. 41, které těsně sousedí se stanovištěm č. 40 chybí hodnoty z let 1998 a 1999. Od roku 2000 jsou data kompletní pro všech 5 sledovaných stanovišť. Průměrný obsah chlorofylu a+b byl v roce 1998 a 1999 nejvyšší na stanovištích 21 a 40 ze západního Krušnohoří (ze stanoviště 41 nejsou pro tyto dva roky data) (graf 6a), která byla imisními poměry v minulém století méně zasažena než-li oblast centrálního Krušnohoří. V roce 1999 došlo v západním Krušnohoří v oblasti stanovišť 40 a 41 k masivnímu žloutnutí jehlic. Toto masivní žloutnutí v oblasti Přebuzi je patrné z průkazně nižšího obsahu chlorofylů na stanovišti 41 v letech 2000 a 2001 (data pro rok 1999 pro toto stanoviště chybí). Přesto však hodnoty obsahu chlorofylů zůstaly na všech stanovištích v rozmezí uspokojivých fyziologických hodnot. Průkazně nízký obsah chlorofylu a a b byl v letech 1998 až 2001 zaznamenán na stanovišti 35 v centrálním Krušnohoří, ale stále se pohyboval na fyziologické hranici nepoškozených smrků. Od roku 2002 nejsou průkazné rozdíly mezi jednotlivými stanovišti. Což svědčí o postupném zvyšování obsahu chlorofylů na dříve více poškozených stanovištích a postupném vyrovnání obsahu na všech stanovištích. To svědčí o zlepšování zdravotního stavu stromů ve sledované oblasti Krušnohoří. Obsah chlorofylu a (graf 6b) byl v letech 1998 a 1999 průkazně nejnižší na stanovišti 35 v centrálním Krušnohoří, ale stále se pohyboval na fyziologické hranici nepoškozených smrků, která je uváděna 2,2-2,7 mg/g sušiny ve vegetačním období (Siefermann-Harms 1994). Podobná situace byla zaznamenána i pro obsah chlorofylu b na tomtéž stanovišti (graf 6c). Posléze se obsah chlorofylu a vyrovnal na všech stanovištích, což svědčí o zlepšování zdravotního stavu stromů v centrálním Krušnohoří. Poměr chlorofyl a / chlorofyl b byl ve fyziologických mezích na všech stanovištích od počátku sledování tohoto parametru v roce 1998 a přestože byly nalezeny statisticky průkazné rozdíly (graf 6d), není třeba se tímto parametrem znepokojovat. Údaje v literatuře ohledně chování tohoto parametru v důsledku působení stresových faktorů jsou doposud kontroverzní. Celkový obsah karotenoidů (graf 6e) byl v roce 2003 přibližně dvakrát nižší než-li v předcházejících letech. Vyplývá z jiného časování odběru v roce 2003, kdy odběry byly provedeny na jaře na počátku vegetační sezóny, kdežto v předchozích letech to bylo vždy na podzim, již po nástupu dormance. Totéž platí pro výsledky z roku 2003 ohledně poměru chlorofylu a+b / celkovým karotenoidům, kdy tento poměr byl téměr dvojnásobný v důsledku dynamické změny obsahu celkových karotenoidů (graf 6f).


23

Graf 6 a-f - Obsah fotosyntetických pigmentů (udávaný v mg na g suché hmotnosti jehlic) a jejich poměrů pro první tři ročníky jehlic na sledovaných stanovištích v letech 1998-2003. Hodnoty chybí v letech 1998 a 1999 pro stanoviště č. 41. Vertikální úsečky označují směrodatné odchylky. Písmena nad sloupci u dané proměnné jsou uvedena pouze v případě, když mezi jednotlivými sloupci byl zjištěn průkazný rozdíl. Sloupce se shodnými písmeny nejsou statisticky průkazně odlišné; analýza rozptylu jednoduchého třídění, α = 0,05.

a

5

Chlorofyl a+b (mg/g SH)

4,5

a

4

a

a ab

3,5

a

a

a

a ab ab

a

ab

bc

b

40

b

b

3

21

c

b

41

2,5

35

2

39

1,5 1 0,5 0 1998

b

2000

2001

2002

2003

4 3,5

Chlorofyl a (mg/g SH)

1999

3

a

a

a ab

a a

ab

b

2,5

a a ab bc

b

ab a bc

21

c

40

c

41

2

35

1,5

39

1 0,5 0 1998

1999

2000

2001

2002

2003


c

24

1,4

Chlorofyl b (mg/g SH)

1,2

a

a

1

a

ab

ab b

0,8

a

a ab a

aa

a

ab bc

c

bc ab

ab abb

21 40 41 35 39

c

b

0,6 0,4 0,2 0 1998

d

1999

2000

3,4

a ab ab b

Chlorofyl a / chlorofyl b

3,3 a

3,2 3,1

b ab

ab

a b

3

b

b

2001

2002

aa

a ab bb b

a

a

a

ab bc bc c

b

2003

21 40 b

41 35

2,9

39

2,8 2,7 2,6 2,5

e

0,7

Celkové karotenoidy (mg/g SH)

1998

0,6

1999

ab a

0,5

2000

aa

2001

2002

2003

ab

a b b

0,4

21 40

b

41 35

0,3

b aa aa

0,2 0,1 0 1998

1999

2000

2001

2002

2003

39



f

25

20 18 16

21

14

40

12 10 8

a ab

bb

a ab

b

ab

a

b b ab b

41

a ab ab ab aab ab b bab

35 39

6 4 2 0 1998

1999

2000

2001

2002

2003

Použitá Literatura Brundett M.C., Endstone D.E., Peterson K.E. 1988. A berberine-aniline blue fluorescent staining procedure for suberin, lignin, and callose in plant tissue. Protoplasma 66: 133 – 142 David M.M.R., Carde J.-P., Dangeard M.P. 1964. Coloration différentielle des inclusion lipidiques et terpénques des pseudophylles du Pin maritime au moyen du réactof nadi. C.R.Acad.Sc.Paris, t. 258 (27 janvier 1964), Groupe 13, p. 1338 – 1340. Demmig-Adams B., Gilmore A. M., Adams W. W. 1996. In vivo functions of carotenoids in higher plants. The FASEB Journal 10, Carotenoid functions in plants - serial review. Gardner R.O. 1975.Vanillin-hydrochloric acid as a histochemical test for tannin. Stain Technology 50, 315-317. Igawa M., kameda H., Maruyama F., Okochi H., Otsuka I. 1997. Effect of simulated acid fog on needles of fir seedlings. Environmental and Experimental Botany 38, 155-163 Johansen D. A. 1940. Plant microtechnique. McGraw-Hill Book Co. Inc.: New York Lichtenthaler H.K. 1987. Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes. Methods in Enzymology, vol. 148, p. 350 – 382. Müller E., Stierlin H.R. 1990. Sanasilva Kronenbilder mit Nadel- und Blattverlustprozenten. 2nd ed., Swiss Federal Institute for Forest, Snow and Landscape Research, CH-8903 Birmensdorf. Němec B. (1962). Botanická mikrotechnika. Nakladatelství Československé akademie věd, Praha O´Brian T.P., McCully M.E. 1981. The study of plant structure: principles and selected methods. Melbourne: Termacarthi Pty. Ltd. Porra R.J., Thompson W.A., Kriedemann P.E. 1989. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standarts by atomic absorption spectroscopy. Biochemica et Biophysica Acta, vol. 975, p. 384 – 394.


26

Rock B.N. 2003. Lesy České Republiky Study: Final Report. Complex Systems Research Center University of New Hampshire. Singleton V.L., Rossi J.A. 1965. Colorimetry of total phenolics and phosphomolybdicphosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture, vol. 16, p.144 – 158. Siefermann-Harms D. 1994. Light and temperature control of Season-dependent changes in the α− and β−carotene content of Spruce needles. J. Plant. Physiol. 143, 488-494 Soukupová J., Cvikrová M., Albrechtová J., Rock B.N., Eder J. 2000. Histochemical and biochemical approaches to the study of phenolic compounds and peroxidases in needled of Norway spruce (Picea abies (L.) Karst). New Phytologist 146: 403 – 414 Stejskalová A. 2003. Využití biochemických a histochemických metod ke studiu zdravotního stavu smrkových porostů v Krušných horách. Diplomová práce, Katedra fyziologie rostlin, Přírodovědecká fakulta UK, květen. Šesták Z., Čadský J. 1966. Základní metody studia a stanovení chlorofylů. In: Metody studia fotosyntetické produkce rostlin; metodické příručky experimentální botaniky. Sv. 2, Academia, Praha 1966, 335-366 Wellburn A.R. 1994. The spectral determination of chlorophylls a and b, as well as total carotenoids, using various solvents with spectrophotometers of different resolution. Journal of Plant Physiology, vol. 44, p. 307 – 313.

Výzkumná zpráva pro Lesy České republiky

Recommend Documents