Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin
Využití NIR spektroskopie při kontrole jakosti sušených mléčných výrobků Diplomová práce
Vedoucí práce: Ing. Táňa Lužová
Vypracovala: Radka Daňková
Brno 2011
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma „Využití NIR spektroskopie při kontrole jakosti sušených mléčných výrobků“ vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.
dne ………………………………. podpis diplomanta ……………….............
PODĚKOVÁNÍ Tímto bych ráda poděkovala především vedoucí mé diplomové práce Ing. Táně Lužové za odborné vedení, cenné rady a také za ochotu a čas, který během zpracování této diplomové práce věnovala konzultacím. Dále bych chtěla poděkovat Ing. Janu Ignasovi ze společnosti Eligo a. s. za poskytnutí vzorků sušené syrovátky, které byly předmětem této diplomové práce.
ABSTRAKT Diplomová práce se skládá ze dvou částí. První část informuje o výrobě sušených mléčných výrobků. Je zaměřena na mléko, jeho složení a vlastnosti, výrobu sušených mléčných výrobků, jejich vlastnosti, sortiment a současnou situaci ve výrobě sušených mléčných výrobků. Konec této části je věnován historii blízké infračervené spektroskopie a jejím charakteristikám. Cílem praktické části diplomové práce bylo vyzkoušet možnosti NIR spektroskopie při stanovení obsahu vlhkosti, měrné hmotnosti, titrační kyselosti a pH vzorků sušené syrovátky. Celkem 40 vzorků sušené syrovátky bylo analyzováno referenčními metodami a FT NIR spektroskopií. Vzorky sušené syrovátky byly měřeny v režimu reflektance v rozsahu vlnových délek 10 000 až 4 000 cm-1 se 100 scany. Kalibrační model byl vyvinut v rámci metody částečných nejmenších čtverců (PLS) a byl ověřen křížovou validací. Klíčová slova: sušené mléko, sušená syrovátka, sprejové sušení, válcové sušení, blízká infračervená spektroskopie
ABSTRACT The thesis consist of two parts. First part of this study was about production of dry milk products. It is focused on milk, its composition and characteristics, production of dry milk products, their characteristics, line and present situation in the production of dry milk products. In the end of this part is mentioned history of near-infrared spectroscopy and its characteristics. The aim of practical part of the thesis was to try possibilities of NIR spectroscopy by determine moisture content, specific weight, titrable acidity and pH of samples of dry whey. 40 samples of dry whey were analysed by reference method and by FT NIR spectroscopy. Samples of dry whey were measured in the reflectance mode at wavelenghts ranging from 10 000 to 4 000 cm-1 with 100 scan. The calibration model was developed by partial least squares (PLS) regression and was validated by cross validation. Keywords: dry milk powder, dry whey, spray drying, roller drying, near-infrared spectroscopy
OBSAH 1 ÚVOD............................................................................................................................ 8 2 CÍL PRÁCE ................................................................................................................. 10 3. LITERÁRNÍ PŘEHLED ............................................................................................ 11 3. 1 Mléko ................................................................................................................... 11 3. 1. 1 Složení mléka............................................................................................... 11 3. 1. 2 Požadavky na složení a jakost mléka........................................................... 12 3. 2 Syrovátka ............................................................................................................. 12 3. 2. 1 Složení syrovátky......................................................................................... 13 3. 3 Výroba sušených mléčných výrobků ................................................................... 13 3. 3. 1 Sušení mléka a jeho význam........................................................................ 13 3. 3. 2 Historie......................................................................................................... 14 3. 3. 2. 1 Historie sušeného mléka ...................................................................... 14 3 .3. 2. 2 Historie sušené syrovátky .................................................................... 14 3. 3. 3 Úprava mléka před sušením......................................................................... 15 3. 3. 3. 1 Výběr suroviny .................................................................................... 15 3. 3. 3. 2 Standardizace tuku............................................................................... 16 3. 3. 3. 3 Stabilizace kaseinu............................................................................... 16 3. 3. 3. 4 Zahuštění mléka (syrovátky) ............................................................... 16 3. 3. 4 Vlastní sušení............................................................................................... 16 3. 3. 4. 1 Válcové sušení ..................................................................................... 16 3. 3. 4. 2 Rozprašovací sušení............................................................................. 18 3. 3. 4. 3 Jiné typy sušení .................................................................................... 19 3. 3. 4. 4 Sušení syrovátky .................................................................................. 19 3. 3. 5 Instantizace .................................................................................................. 21 3. 3. 6 Balení a skladování...................................................................................... 21 3. 3. 7 Změny sušeného mléka................................................................................ 22 3. 4 Složky sušeného mléka ........................................................................................ 22 3. 5 Hodnocení a požadavky na sušené mléčné výrobky............................................ 22 3. 6 Mikrobiologie sušeného mléka a sušených mléčných výrobků........................... 23 3. 7 Sortiment sušených mléčných výrobků ............................................................... 24 3. 7. 1 Sušená mléka bez přísad .............................................................................. 24 3 .7. 2 Ochucené sušené výrobky pro přímý konzum............................................. 24
3. 7. 3 Přípravky pro další odvětví potravinářského průmyslu ............................... 24 3. 7. 4 Sušená smetana ............................................................................................ 24 3. 7. 5 Sušené podmáslí .......................................................................................... 24 3. 7. 6 Sušená syrovátka.......................................................................................... 24 3. 7. 7 Sušené mléčné výrobky pro kojeneckou a dětskou výživu ......................... 25 3. 7. 8 Sušené mléčné krmné směsi ........................................................................ 25 3. 7. 9 Sušené bílkovinné koncentráty a laktóza..................................................... 25 3. 8 Současná situace .................................................................................................. 25 3. 9 Infračervená spektroskopie .................................................................................. 26 3. 9. 1 NIR spektroskopie ....................................................................................... 27 3. 9. 2 Historie NIR................................................................................................. 28 3. 9. 3 Výhody a nevýhody NIR ............................................................................. 30 3. 9. 4 Přístroje měření NIR .................................................................................... 30 3. 9. 4. 1 Instrumentace On - line........................................................................ 31 3. 9. 4. 2 Instrumentace In - line ......................................................................... 32 3. 9. 5 Příprava vzorku, kalibrace ........................................................................... 32 3. 9. 6 Kvantitativní a kvalitativní analýza ............................................................. 33 3. 9. 6. 1 Kvantitativní analýza ........................................................................... 33 3. 9. 6. 2 Kvalitativní analýza ............................................................................. 33 3. 9. 7 Využití NIR.................................................................................................. 34 3. 9. 8 Využití NIR v mlékařství............................................................................. 36 3. 9. 8. 1 Využití NIR při kontrole sušeného mléka ........................................... 37 4 MATERIÁL A METODIKA....................................................................................... 38 4. 1 Použitý materiál ................................................................................................... 38 4. 2 Použité metody .................................................................................................... 38 4. 2. 1 Chemické rozbory sušeného odtučněného mléka a sušené syrovátky......... 38 4. 2. 1. 1 Stanovení obsahu vody ........................................................................ 38 4. 2. 1. 2 Stanovení titrační kyselosti .................................................................. 38 4. 2. 1. 3 Stanovení aktivní kyselosti mléka pH metrem .................................... 39 4. 2. 1. 4 Měrná hmotnost ................................................................................... 39 4. 2. 2 Infračervená spektroskopie .......................................................................... 40 5 VÝSLEDKY A DISKUZE.......................................................................................... 41 5. 1 Výsledky chemické analýzy ................................................................................ 41 5. 2 Výsledky NIR spektroskopie ............................................................................... 41
6 ZÁVĚR ........................................................................................................................ 52 7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ......................................................................... 54 SEZNAM OBRÁZKŮ.................................................................................................... 62 SEZNAM TABULEK .................................................................................................... 63 SEZNAM ZKRATEK .................................................................................................... 64
1 ÚVOD Mléko a mléčné výrobky patří už od nepaměti mezi základní potraviny, obsahují lehce stravitelné bílkoviny a tuky a celé spektrum vitaminů s výjimkou vitaminu C, minerály a stopové prvky (KŘIVÁNEK, 2009). Jsou považovány za vynikající zdroj vápníku ve výživě člověka. Vápník je nejhojnější kation v lidském těle a podporuje sílu a strukturu kostí; a také hraje důležitou roli v buněčném metabolismu, srážení krve, aktivaci enzymů a dalších procesech (VYAS et al., 2004; MILLER, 1989). Selen přítomný v mléce zpomaluje proces stárnutí a přispívá k ochraně imunitního systému. Mléko a ostatně všechny další mléčné výrobky by měly být samozřejmou součástí výživy nejenom dětí a mládeže, ale také každého dospělého člověka. Na mléko bychom neměli zapomínat ani v pokročilém věku, protože mléko působí dokonce i jako prevence proti zákeřné osteoporóze kostí (KOPÁČEK, 2007, 2008). Světová produkce mléka se dle odhadů pohybuje okolo 571 milionů tun. Kravské mléko představuje 85 % z celkového počtu, buvolí mléko 11,3 %, a kozí a ovčí mléko 3,6 % (ROBERTS et al., 2004). Češi patří se svou průměrnou spotřebou konzumního mléka něco málo přes 56 litrů mléka na hlavu a rok (2008) spíše mezi jeho průměrné konzumenty. Obyvatelé Finska ročně vypijí více než 180 litrů, ale i v dalších evropských zemích se vypije mléka podstatně více než u nás. Průměr v Evropské Unii byl v roce 2008 něco přes 89 litrů (KOPÁČEK, 2010). Živiny obsažené v mléce a pokrytí jejich denní potřeby pro člověka zobrazuje následující tabulka č. I. Tab. č. I Pokrytí denní potřeby živin 1 litrem mléka (KOPÁČEK et al., 2009) vápník fosfor vitamin B12 bílkoviny vitamin A vitamin B1 vitamin C železo
až 100 % až 67 % až 66 % až 49 % až 30 % až 27 % až 19 % až 3 %
Tekuté mléko a syrovátka jsou mlékárenské výrobky podléhající rychlé zkáze, proto vyžadují vhodné chlazení a manipulaci k udržení své čerstvosti a kvality. Mléko
-8-
i syrovátku lze uchovávat použitím různých metod, nejběžnější je zahuštění (koncentrace) odstraněním vody. Mlékárenské výrobky vyráběné tímto způsobem lze rozdělit na zahuštěné mléko, sušené mléko, zahuštěné syrovátkové výrobky a sušené syrovátkové výrobky (MARTH et al., 2001). Blízká infračervená spektrometrie (NIR) je široce používaná nedestruktivní metoda pro stanovení obsahu majoritních (ale i minoritních) složek. NIR je schopna odhalit změny v obsahu hlavních složek u naprosté většiny produktů. Slouží především k procesní analýze při monitorování složení vstupních surovin, meziproduktů a finálních produktů, jakož i při monitorování technologických procesů, a to v laboratorních podmínkách (off line) i přímo v technologickém zařízení (in-line, on-line). Je založena na měření změn intenzity absorbovaného nebo odraženého elektromagnetického záření v blízké infračervené oblasti spektra molekulami vzorku. Jednotlivé charakteristické frekvence jsou absorbovány skupinami atomů nebo vazbami mezi atomy a intenzita těchto charakteristických absorpčních pásů závisí na koncentraci látek (KUBÁŇ et al., 2007).
-9-
2 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce bylo:
Prostudovat odbornou literaturu o kontrole jakosti mléčných výrobků a sušených mléčných výrobků.
Prostudovat odbornou literaturu o využití NIR spektroskopie v mlékárenství.
Podle pokynů vedoucího provádět analýzu vybraných vzorků sušených mléčných výrobků.
Vypracování diplomové práce.
- 10 -
3. LITERÁRNÍ PŘEHLED 3. 1 Mléko Mléko je sekretem mléčné žlázy, určeného pro výživu novorozenců. Je to neprůhledná tekutina bílé až nažloutlé barvy. V prvém období po porodu je složení bližší složení krve. V dalším období pak složení přechází na zralé mléko, které je druhově odlišné. Optický vzhled mléka bývá podmíněn jemně emulgovaným tukem a koloidně rozptýlenými částicemi bílkovin. Čerstvé mléko přežvýkavců je obvykle nasládlé a příjemné chuti a má typickou vůni (SIMEONOVOVÁ et al., 2008; HROUZ et al., 2007). 3. 1. 1 Složení mléka Mléko je velmi komplikovaný disperzní systém, ve kterém kaseinové molekuly tvoří micelární disperze, globulární bílkoviny syrovátky koloidní disperze, tuk přítomný ve formě tukových kapének tvoří emulzi, částice lipoproteinů koloidní suspenzi, nízkomolekulární látky, jako je laktóza a další sacharidy, volné aminokyseliny, minerální látky, ve vodě rozpustné vitaminy, tvoří pravý roztok (VELÍŠEK, 2002). Mléčný tuk má velmi komplikované složení a strukturu. Základními složkami jsou: tri-, di- a monoacylglyceroly, volné mastné kyseliny, fosfolipidy, steroly, estery sterolů, uhlovodíky a také v tucích rozpustné vitaminy. Z celkových lipidů tvoří 98 % triacylglyceroly (GAJDŮŠEK, 2003). Obrázek č. I ukazuje jak vypadá tuková kapénka mléka.
Obr. I Nativní tuková kapénka (ZADRAŽIL, 2002) Typickým zástupcem sacharidů v mléce je laktóza. V kravském mléce její obsah kolísá od 47 do 52 g v litru. Jedná se o disacharid, který se skládá z glukózy a galaktózy (SIMEONOVOVÁ et al., 2008). - 11 -
Bílkoviny mléka jsou tvořeny kaseinovou frakcí a frakcí syrovátkových bílkovin. Základními frakcemi kaseinu jsou αS, β, κ – kasein, ostatní frakce kaseinu se považují za deriváty. Všechny frakce kaseinu mimo κ-kasein jsou vysoce citlivé na přítomnost vápníku v mléce a proti vysrážení je chrání přítomnost κ-kaseinu (GAJDŮŠEK, 2003). Jako syrovátkové nebo sérové bílkoviny se označuje ta část bílkovin, které zůstávají v roztoku (syrovátce) po vysrážení kaseinu při pH 4,6. Mají vyšší nutriční hodnotu než kasein. Ze syrovátky je lze vysrážet kupř. po záhřevu v kyselém prostředí. Z těchto frakcí tvoří největší podíl β-laktoglobulin a α-laktalbumin syntetizované mléčnou žlázou. Dvě další bílkovinné frakce jsou totožné s bílkovinami krve, je to sérum albumin a imunoglobuliny. Poslední skupinou látek jsou tzv. proteosopeptony, které tvoří jen malý podíl z bílkovinných složek mléka a v podstatě se již nejedná o bílkoviny, ale kratší peptidy (GAJDŮŠEK, 2003). V mléce jsou zastoupeny i plyny a to v množství 8 – 12 % (HROUZ et al., 2007). 3. 1. 2 Požadavky na složení a jakost mléka Základními kriterii složení mléka podle ČSN 57 0529 jsou obsah tuku (T) min. 33,0 g v litru, obsah bílkovin (B) min. 28,0 g v litru a obsah tukuprosté sušiny (TPS) nejméně 8,5 %. Z vlastností pak titrační kyselost dle Soxhlet – Henkela 6,2 až 7,8 (SIMEONOVOVÁ et al. 2008), bod mrznutí (BM) nejméně -0,520 °C dle VYHLÁŠKY 638/2004 (začleněna do legislativních předpisů EU Nařízení 852/04 a 853/04).
3. 2 Syrovátka Při výrobě sladkých sýrů, tvarohů, kaseinu, kaseinátů i koprecipitátů je vedlejším produktem syrovátka (GAJDŮŠEK et al., 1993). Kyselé syrovátky jsou mléčná séra získaná během kyselého procesu srážení a obsahují laktát vápenatý. Sladká syrovátka je mléčné sérum získané během enzymatické koagulace kaseinu a je v podstatě bez vápníku. Vysoký obsah tuku v mléce na výrobu sýrů vede k vysokému obsahu tuku v syrovátce, zvláště když mléko na výrobu sýrů nebylo homogenizováno. Syrovátka obsahuje vitamíny B, C, přičemž vitamin B2 způsobuje, že syrovátka je zelenožluté barvy (SPREER, 1998). Syrovátka je vedlejším produktem mlékárenského průmyslu, který jí vyrábí velké množství, což způsobuje mnoho problémů s jejím využitím a zpracováním. Po mnoho let byla syrovátka považována za odpad a byla vypouštěna do kanalizace, což ale znečišťovalo životní prostředí. Nyní, je tendence využívat syrovátku úplně, a to jako - 12 -
cenný zdroj proteinů, laktózy, vitamínů a minerálních solí, což z ní dělá kvalitní surovinu pro výrobu potravin a krmiv. Syrovátka ve své přirozené tekuté formě podléhá rychlému kvašení, takže je třeba ji vysušit, aby si udržela své cenné vlastnosti po co nejdelší čas. Kvalita syrovátkových výrobků, závisí na metodách a podmínkách sušení (BANAVARA et al., 2003). 3. 2. 1 Složení syrovátky Chemické složení a fyzikální vlastnosti čerstvé syrovátky jsou závislé přímo na vlastnostech mléka, ze kterého je zpracovávána, způsobu koagulace bílkovin a ročním období (MITURA et al., 1996). Co se týče nežádoucích vlastností syrovátky, které znesnadňují její využití z hlediska negativních reakcí spotřebitelů, byly při analýze sladké sušené syrovátky stanoveny tyto aromatické těkavé látky: mastné kyseliny, aldehydy a ketony, laktony, sloučeniny síry, fenoly, indoly, furany a pyrroly. Některé z nich přechází z mléka nebo vznikají během výroby, zatímco jiné se tvoří během autooxidace lipidů, karamelizace cukru, a Maillardovy reakce (MAHAJAN et al., 2004). Složení tekuté syrovátky udává následující tabulka č. II Tab. č. II Složení syrovátky (FORMAN, 1996) Ukazatel
Sladká syrovátka ze sýrů
Kyselá syrovátka z tvarohu
Syrovátka z výroby kaseinu sráženého kyselinou solnou nebo fosforečnou
Sušina %
5-7
5-7
5-7
Popel %
0,6
0,7
0,7
Bílkoviny %
1,0
1,0
1,0
Laktóza %
4,9
4,5
4,5
Tuk %
0,3
0,1
0,1
pH
6,5 - 6,6
4,8 - 5,0
4,4 - 4,6
0,3 % k. mléčné
0,5 g/l HCl
3. 3 Výroba sušených mléčných výrobků 3. 3. 1 Sušení mléka a jeho význam Sušené mléčné výrobky mají široké uplatnění ve výživě lidí i hospodářských zvířat. Tyto výrobky lze snadněji dlouhodobě skladovat a přepravovat s mnohem menšími
- 13 -
náklady. Sušené výrobky jsou v důsledku odstranění vody mnohem stabilnější (SIMEONOVOVÁ et al., 2008). Dehydratace mléka je částečné nebo téměř úplné zbavení mléka vody. Jako speciální a progresivní odvětví zpracování mléka, se začalo vyvíjet až po shromáždění četných zkušeností získaných při původním zpracování mléka a po dosažení určitého stupně vývoje průmyslového zpracování mléka. Sušení mléka umožňuje mléko konzervovat, tedy zpracovávat vzniklé okamžité, zdánlivé nebo absolutní přebytky, které není možné ihned zpracovat anebo využít. Sušené mléko i jiné sušené mléčné výrobky, je však možné ve vhodný čas a na potřebném místě se snadnou manipulací a dopravou obnovit a použít s minimálními nároky na prostor a hmotnost vzhledem k původní surovině (FORMAN, 1996). Sušená syrovátka se vyrábí podobným způsobem jako sušené odstředěné mléko (TAMIME, 2007). Výroba syrovátky a syrovátkových prášků je velmi důležitá po celém světě. V roce 2002 bylo vyrobeno více než 1,6 mil. t sprejově sušené syrovátky (THOMAS et al., 2004). 3. 3. 2 Historie 3. 3. 2. 1 Historie sušeného mléka Rozvoj výroby sušeného mléka začal v době Marca Pola ve 13. století. Udává se, že Marco Polo se setkal s mlékem sušeným na slunci na svých cestách po Mongolsku a od této doby se rozšířily sušené mléčné výrobky do celého světa. Přes rané průkopnické vědce, jako Appert a Bordem byly vyvinuty základní metody pro spuštění procesů pro sušení mléčných produktů. Ekenberg a Merill jsou uznáváni jako vynálezci prvního komerčního válcového a rozprašovacího sušícího procesu ve Spojených státech. Od začátku vývoje komerčního sušícího systému byly vynalezeny významné technologické postupy důležité pro výrobu rozmanitých sušených mléčných produktů (CLARK, 2000; BEARDLEE, 1948; MARTH et al., 2001). 3 .3. 2. 2 Historie sušené syrovátky Ačkoli rozprašovací a válcové procesy jsou využívány k sušení syrovátky už mnoho let, vývoj průmyslové výroby syrovátky ve Spojených státech se ve větší míře uskutečnil až po založení organizace Whey Products Institute v roce 1971 (CLARK, 1991).
- 14 -
Technologické změny spojené se sušením syrovátky jsou dynamické. Na žádném místě v moderním mlékárenském průmyslu nejsou změny v technické podstatě tak inovativní a rychlé jako v oddělení syrovátkových výrobků. Mezi důležité aplikace sušení syrovátky se zahrnuje použití membránové techniky, která dovoluje různé syrovátkové složky oddělit na proteinovou, uhlohydrátovou nebo na minerály bohatou složku, kterou potom můžeme dále zpracovávat a vyrábět dostupnou v koncentrovaných funkčních formách (MARTH et al., 2001). 3. 3. 3 Úprava mléka před sušením Základní technologie přípravy mléka je stejná pro všechny mlékárenské výrobky. V úchovné
nádrži
je
případně
standardizován
obsah
tuku
a
mléko
bývá
homogenizováno (SIMEONOVOVÁ et al., 2008). Dále musí být mléko tepelně ošetřeno, většinou se tak děje pasterizací. Dle Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) 853/2004 se pasterizace dosahuje ošetřením: vysokou teplotou po krátkou dobu (nejméně 72 °C po dobu 15 sekund)
nízkou teplotou po dlouhou dobu (nejméně 63 °C po dobu 30 minut)
nebo jakoukoli jinou kombinací času a teploty vedoucí k rovnocennému účinku a to tak, aby výrobky bezprostředně po tomto ošetření vykazovaly negativní reakci při testu na alkalickou fosfatázu v případech, kdy je test použitelný.
3. 3. 3. 1 Výběr suroviny Základní podmínkou pro dosažení vysoké jakosti sušených výrobků je především výborná jakost syrového mléka. Zvláště jakostní mléko je požadováno u výrobků, určených pro kojeneckou a dětskou výživu (SIMEONOVOVÁ et al., 2008). Proto jsou stanoveny následující požadavky:
dobrá stabilita kaseinu k vysokým teplotám, pH 6,4 – 6,7, titrační kyselost < 7 SH, nesrážení kaseinu při smíchání se 70 % alkoholem
nízký stupeň nebo absence termorezistentních mikroorganismů
nízký stupeň nebo absence anaerobních spórových útvarů (SPREER, 1998).
- 15 -
3. 3. 3. 2 Standardizace tuku Tučnost sušeného mléka závisí na obsahu tuku a tukuprosté sušiny v surovině. Podle PROKŠE (1965) můžeme pro úpravu tučnosti zpracovávaného mléka se zřetelem na požadovanou tučnost finálního výrobku použít vzorce:
t=
f ⋅ a ⋅ t1 , 100 − t1 Kde f je hodnota 1,0 υ, v níž υ je přípustný obsah vláhy v sušeném mléce podle
normy (např. při dovoleném obsahu vláhy v sušeném mléce 2,5 % je f = 1,025, při obsahu vláhy 4 % je f = 1,04 apod.) t – tučnost, na níž je třeba původní mléko upravit, a – tukuprostá sušina původního mléka, t1 – žádaná tučnost sušeného mléka. 3. 3. 3. 3 Stabilizace kaseinu Kasein může být stabilizován přidáním roztoků vhodných solí nebo směsí solí před zahřátím nebo zahuštěním. Vhodné stabilizující soli jsou sodík a draslík, hydrogenuhličitan, kalciumchlorid, citrát sodný a draselný, orthofosfát sodný a draselný a také difosfát sodný a draselný (SPREER, 1998). 3. 3. 3. 4 Zahuštění mléka (syrovátky) K získání koncentrátu musí být vodní složka v mléce redukována k 70 %. Toto odstranění vody je nazýváno zahušťování. Zahušťování se provádí vypařováním vody ve vhodných zařízeních tzv. odparkách, kde hmota a objem se redukují a viskozita a hustota se zvyšují. Tyto parametry mohou být použity pro procesní kontrolu. Klíčové aspekty zahušťování mléka jsou:
minimální redukce nutriční hodnoty a organoleptických vlastností
minimální spotřeba páry a vody v těchto zařízeních
dobrá procesní kontrola a snadný monitoring (SPREER, 1998).
3. 3. 4 Vlastní sušení 3. 3. 4. 1 Válcové sušení Mléko je nanášeno v tenké vrstvě (0,1 až 1 mm) na povrch rotujícího válce, vyhřívaného nad 100 °C. Po určité době sušení je vzniklý suchý film oddělen
- 16 -
speciálním nožem. Hotový produkt má šupinkovou strukturu, kterou je možno dále drtit nebo mlít. Sušárny jsou obvykle konstruovány jednoválcové nebo dvouválcové se sušením za atmosférického tlaku, případně za vakua (GAJDŮŠEK, 2002). Nevýhodou vakuových sušáren je, že jsou nákladnější, kontrola práce v uzavřeném prostoru je nesnadná a také čištění je obtížné (PROKŠ, 1965). Bubnové sušení je ovlivněno následujícími faktory:
tloušťka filmu
uniformita filmu
sušící teplota a čas, kontrolovaný tlakem páry, rychlost bubnu
teplota koncentrátu a složky sušené hmoty nebo koeficient koncentrace
Sušící čas by měl být udržen mezi 1,8 – 2,5 s. Což zaručuje jemné ošetření produktu s nízkou denaturací nutrientů, především bílkovin a tak se také vyhne spálení na povrchu bubnu, které narušuje normální operaci. Specifická spotřeba páry bývá kolem 1,3 – 1,6 kg na kg vypařené vody a 4,3 – 5 kg na kg prášku. Sušící kapacita závisí na velikosti a typu bubnů bubnových sušáren a je v rozmezí 300 – 2 000 l koncentrátu za hodinu se složkou sušené hmoty 45 %. Jiné faktory, které ovlivňují kapacitu jsou:
koeficient koncentrace nebo složka sušené hmoty koncentrátu
viskozita koncentrátu
kyselost koncentrátu (se vzrůstem hodnoty titrační kyselosti ze 7,5 na 8 SH může být kapacita snížena o 10 %)
tlak páry tj. teplota povrchu bubnu (moc vysoká teplota redukuje kapacitu kvůli spalování produktu na bubnu, moc nízká teplota způsobuje pomalé odstranění vody) (SPREER, 1998).
Získaný produkt má zhoršenou rozpustnost a nutriční hodnotu. Také kapacita válcových sušáren je relativně malá. Takto vzniklé produkty jsou používány především k dalšímu průmyslovému zpracování v těch odvětvích, kde nejsou kladeny přísné požadavky na jejich rozpustnost. Sušený produkt je s výhodou používán zejména v pečivárnách, těstárnách, čokoládovnách a při výrobě krmiv. V důsledku vysokých teplot při sušení mají válcově sušená mléka dobrou mikrobiologickou kvalitu a také lépe stabilizovaný mléčný tuk, takže jsou trvanlivější než mléka sušená rozprašovacím způsobem (SIMEONOVOVÁ et al., 2008).
- 17 -
3. 3. 4. 2 Rozprašovací sušení Při rozprašování mléka musí být splněny tyto podmínky:
Částice kapaliny musí být stejně velké, aby rychlost sušení byla u všech stejná.
Směr rozprašování se musí dát řídit.
Rozprašovací zařízení (atomizér) musí být schopné pracovat delší dobu bez přerušení (PROKŠ, 1965).
Sušení rozprašováním využívá styku horkého vzduchu s mlékem rozptýleným v jemné kapénky. Voda se z mléka odpaří ve zlomku vteřiny a mléko se vysuší na jemný prášek. Prášek je mnohem jemnější než u mléka sušeného na válcích (DUŠEK et al., 1964). Při sušení dochází nejprve k prudkému odpaření vody z povrchu kapky až dojde k vytvoření pevné částice. Při dalším sušení již vlhkost proniká k povrchu pevné částice mnohem pomaleji a ani zvýšení teploty vzduchu tento proces neurychlí. Proto se u řady sušáren provádí sušení dvoustupňové. Usušený prášek, po oddělení od vzduchu v odlučovačích (nejrozšířenější jsou cyklony), se dopravuje do vibračního fluidního žlabu, kde se provádí případné dosoušení proudem horkého vzduchu, v každém případě však vychlazování na teploty nižší než 30 °C (SIMEONOVOVÁ et al., 2008). Moderní
sušící
zařízení
jsou
kontrolovány
a
řízeny
v automatických
a poloautomatických modelech použitím procesního ovládání. To dovoluje vysokou operační bezpečnost, ekonomii a stabilní kvalitu produktu. Klíčové parametry zahrnují teplotu, tlak, proudící rychlost, hodnotu pH, elektrickou konduktivitu a vlhkost výrobku. Během operací rozprašovací sušárny mají hlavní význam následující faktory:
množství horkého vzduchu na sušení
teplota koncentrátu
množství koncentrátu k sušení
Látková vyrovnanost na konci sušení je dána rovnicí: m p = mm ⋅
DM m DM p
mp množství prášku v kg mm množství mléka nebo koncentrátu v kg DMm sušená hmota mléka nebo koncentrátu v % DMp sušená hmota prášku v % Vypočítaná data musí být srovnávána s aktuálními výsledky. - 18 -
Rozdíl mezi teoretickými a aktuálními daty v % je technologická ztráta, výkonnost η je rozdíl od 100 %. V produkci mléčného prášku je výkonnost 94 – 96 % (SPREER,1998). 3. 3. 4. 3 Jiné typy sušení Při zpěňovacím způsobu se mléko nejprve homogenizuje při 63 °C a pasteruje 16 sekund při 77,6 °C. V trubkové odparce se zahustí na obsah sušiny 47 až 50 % při teplotě 30 až 38 °C. Po novém záhřevu na 59 °C se mléko podruhé homogenizuje. Získá se hustá a viskózní kapalina, do níž je pak foukán plynný dusík. Vzniklá hmota se suší ve vakuových skříňových sušárnách při 13 °C. Suchý produkt se poté mele na prášek (PROKŠ, 1965). Sušení sublimací ze zmrazeného stavu tzv. lyofilizace je nejšetrnějším způsobem odnímání vody potravinám. Voda je odnímána nikoli z kapalné fáze, nýbrž z tuhé, tj. z ledu. Předností tohoto způsobu je, že se při něm nemění molekulární struktura sušené látky ani nevznikají bakteriální nebo enzymatické procesy (PROKŠ, 1965). 3. 3. 4. 4 Sušení syrovátky Ve výrobě sušené syrovátky v průmyslovém měřítku jsou používány dva způsoby sušení: bubnové sušení a sprejové sušení. Některé systémy sušící syrovátku přijímají pro zpracování jen zahuštěnou syrovátku, jiné přijímají zahuštěnou i čerstvou tekutou syrovátku. Proces sušení je stejný jako ten používaný k výrobě sušeného mléka, a některé výrobní podniky, mohou sušit oba výrobky zaměnitelně. Rozdíl je pouze v teplotě pasterace, kdy pro syrovátku se doporučuje teplota max. 85 °C, vyšší teploty způsobují napalování syrovátkových bílkovin na teplosměnné plochy trubek odparky, protože tyto bílkoviny nejsou chráněny kaseinovým komplexem (MITURA et al., 1996; MARTH et al., 2001; FORMAN, 1996). Procesní operace k výrobě změněných syrovátkových výrobků zahrnují reverzní osmózu, ultrafiltraci a elektrodialýzové postupy (MARTH et al., 2001). Syrovátku lze sušit přímo nebo po úpravě. Jedním ze způsobů úpravy je demineralizace, kterou se ze syrovátky odstraní minerální látky, čímž se syrovátka stane technologicky lépe zpracovatelnou (LUKÁŠOVÁ, 2001). Při demineralizaci jsou ze syrovátky odstraňovány kationy a aniony anorganických i organických sloučenin. K demineralizaci se používá elektrodialýzy,
což je
membránový proces umožňující separaci látek z roztoků na jednotlivé komponenty.
- 19 -
Při elektrodialýze se vstupující syrovátka rozdělí na dva proudy: diluát (odsolená syrovátka představující cca 90 % – 95 % původního objemu syrovátky) a koncentrát (roztok o vysoké koncentraci solí a ostatních látek, cca 5 – 10 % původního objemu). Diluát je produkt, který se používá k dalšímu zpracování (např. do krmných směsí) a zůstává koncentrát, jehož využití je více problematické, vzhledem ke značnému objemu solí anorganického i organického původu. Průměrné procento odsolení je 60 %, což znamená, že v diluátu zbude 40 % původního obsahu minerálních solí. Uvedené hodnoty dokumentují, že pomocí elektrodialýzy lze upravit syrovátku tak, aby se dal lépe využít cenný obsah složek její sušiny (bílkoviny, laktóza) (FORMAN, 1996). Struktura sušené syrovátky je zcela odlišná od odstředěného sušeného mléka, což by mohlo být přičítáno jejímu chemickému složení, tj. hlavně obsahu laktózy, syrovátkových bílkovin a minerálů. Povrchy částic nejsou hladké, a každá z částic je plná děr (TAMIME, 2007). Struktura sušené syrovátky a sušeného odtučněného mléka je znázorněna na obrázku č. II a III.
Obr. II Struktura sušeného odtučněného mléka (TAMIME, 2007)
Obr. III Struktura sušené syrovátky (TAMIME, 2007)
- 20 -
Sušená syrovátka vyrobená bubnovým sušením je těžko rozpustná, protože v důsledku dlouhodobého působení vysoké teploty jsou syrovátkové bílkoviny denaturovány a část laktózy je karamelizována. Nevratné změny těchto komponent činí výrobek neužitečný pro potravinářský průmysl Na druhou stranu, prášek, který je produkován sprejovým sušením je snadno rozpustný a jednotlivé komponenty zůstávají v původní formě (MITURA et al., 1996). 3. 3. 5 Instantizace Pro
získání
rychle rozpustného
mléčného
prášku
bývají
sušárny doplněny
instantizačním zařízením. Sušené mléko, získané rozprašovacím sušením, je v instantizační komoře zvlhčováno parou, atomizovanou vodou, proudem vlhkého vzduchu, odstředěným nebo zahuštěným mlékem, a dochází k aglomeraci zvlhčeného prášku. Vytvořené granule se poté dosoušejí proudem horkého vzduchu ve vibračním fluidním žlabu na požadovanou vlhkost a ochlazují se (SIMEONOVOVÁ et al., 2008). Při instantizační aglomeraci částic vznikají pórovité shluky s četnými kanálky a dutinkami, které umožňují přístup vody k jednotlivým částicím sušeného mléka. Tyto částice obsahují krystalky laktózy, které rovněž svým vznikem vytvoří systém dutinek a kanálků. Tak je dosaženo rychlé snášivosti a disperzibility a tím tedy i snadné a rychlé rozpustnosti takto upravených sušených mlék (PROKŠ, 1965). 3. 3. 6 Balení a skladování Vyrobený prášek bývá buď ihned balen do spotřebitelských obalů nebo je skladován v pojízdných silech (LUKÁŠOVÁ, 2001). Pro velkoobchodní cíle je mléčný prášek balen do papírových pytlů, které jsou obaleny na vnitřní straně voskem nebo do vnitřního pytle vyráběného z plastu nebo obaleného plastem. Maloobchodní balíky jsou krabice nebo nádoby s plastovým vložením. Čistá váha bývá 250 a 500 g. Hlavní prostor obsahuje jak ve velkoobchodním tak i maloobchodním balení vnitřní plyny (N2, CO2) kvůli vytlačení kyslíku. Při teplotě 15 °C a relativní hustotě 75 % má odstředěný mléčný prášek minimální skladovací život dva roky, průměrný skladovací život tři roky a maximální skladovací život čtyři roky. Pro plnotučný mléčný prášek (balený v inertním plynu) jsou hodnoty skladovacího života jeden rok, jeden a půl roku a tři roky (SPREER, 1998).
- 21 -
3. 3. 7 Změny sušeného mléka Jestliže nemohou být udrženy skladovací podmínky pro mléčný prášek (především teplota) a bývá překročen čas, pak jsou zaregistrovány následující změny produktu:
vzrůst složky vlhkosti a nepatrné snížení hodnoty pH
vzrůst složky neproteinového dusíku (za jeden rok skladování až na 60 %) a redukce tepelné stability proteinů
ztráty vitaminů: vitamin A na 30 %, vitamin C na 70 % (čtyři týdny skladování při 45 °C) (SPREER, 1998).
Syrovátkové prášky obsahují relativně vysoké koncentrace laktózy (cca 73%) a bílkovin (cca 12%) s vysokým obsahem lyzinu. V přítomnosti vlhkosti, se tyto komponenty ochotně
účastní
Maillardovy reakce.
Některé
fyzikální
faktory
při zpracování a skladování jako jsou: skladovací teplota, atmosférický kyslík a obaly mohou její průběh také ovlivnit. Ke škodlivým účinkům patří: snížení nutričních hodnot, ztráta bílkovin, vznik příchutí, vývoj nežádoucí barvy, snížená rozpustnost, texturní změny, ztráta vitaminů a zvýšená kyselost (SITHOLE et al., 2005). Ztráty jsou zaznamenány u vitaminu C (20 %), B12 (20 – 30 %) a B1 (10 %) (LUKÁŠOVÁ, 2001).
3. 4 Složky sušeného mléka Laktóza je v dobře uskladněném sušeném mléce s nízkým obsahem vody v amorfním stavu. Za normálních teplot nastává rychlá a značná krystalizace laktózy při obsahu vody 6,5 až 7 % u plnotučného mléka, u odstředěného při 7,5 až 8 %. Krystalizaci laktózy provází obvykle spékání prášku na pevnou hmotu, destabilizace bílkovin, mechanické poškození obalu tukových kapiček a do částic snadněji pronikají kapaliny a plyny. Bílkoviny mléka podléhají největším změnám v disperzním stavu u sušení na válcích. Také rozsah denaturace je podstatně vyšší než u mléka sprejového. Tuk je v částicích sušeného mléka buď ve formě jemně rozptýlených kapiček v kontinuální fázi amorfní laktózy, nebo ve větších shlucích. Amorfní laktóza je těžko prostupná pro plyny, proto představuje dobrou ochranu mléčného tuku před oxidací. Obsah vody v sušeném mléce nemá přestoupit 4 až 5 % (LUKÁŠOVÁ, 2001).
3. 5 Hodnocení a požadavky na sušené mléčné výrobky Sušené
výrobky
jsou
hodnoceny
organolepticky,
chemicko-fyzikálně
a mikrobiologicky. V organoleptickém hodnocení by měly mít dlouhotrvanlivé výrobky - 22 -
kvalitu (chuť a vůni) blízkou originálnímu produktu. U rozpustných mléčných prášků by měla být jemná vyvážená chuť a aroma (SPREER, 1998). Před hodnocením sušeného mléka a sušených mléčných výrobků se vzorky smísí s vodou a vytvoří se tak suspenze. Hodnotí se vzhled, aroma, chuť, čistota, obsah tuku, pH, sediment, obsah vlhkosti, rozpustnost a mísitelnost (jen pro instantní prášky), obsah fosfátů (jen pro podmáslový prášek), mléčné kyseliny (jen pro sušené acidofilní mléko), mikrobiologická kritéria (SPREER, 1998). Měrná hmotnost sušených výrobků by měla být: sušené plnotučné mléko ρt = 1 300 kg·m -3
sušené odstředěné mléko ρt = 1 480 kg·m -3
sušená syrovátka ρt = 1 560 kg·m -3 (WALSTRA et al., 2006).
Pro průmyslové využití, by měl být prášek sypký a snadno rehydratovatelný (GAIANI et al., 2007).
3. 6 Mikrobiologie sušeného mléka a sušených mléčných výrobků Mléko jako přirozeně se vyskytující potrava, a proto je ideálním médiem pro růst mikroorganismů (ROBINSON, 2002). Mikroorganismy v sušeném mléce nerostou, mohou však přežívat dlouhou dobu. Mikroflóra sušeného mléka závisí na mnoha faktorech, které zahrnují počty a druhy mikroorganismů v syrovém mléce, teplotu předehřátí, hygienu závodu a sušících zařízení. V sušeném mléce se vyskytuje jen málo bakteriálních druhů. Zastoupeny jsou především
rody
Streptococcus,
Micrococcus,
Bacillus,
Clostridium,
Sarcina,
a Enterococcus. Koliformní bakterie se nevyskytují. Pokud jsou zjištěny, jedná se o sekundární kontaminaci (LUKÁŠOVÁ, 2001). Z patogenních mikroorganismů může být přítomen Staphylococcus aureus, který je schopen dlouhou dobu přežívat v prášku. Po obnovení mléka se stává plně virulentní. V sušeném mléce se mohou vyskytovat i salmonely, jde však většinou o sekundární kontaminaci, nejčastěji chladícím vzduchem. Z dalších mikroorganismů to může být Clostridium perfringens. Toxinogenní plísně se dostávají do prášku ze zevního prostředí při manipulaci s práškem. Zvýší-li se vlhkost prášku rozmnožují se a mohou produkovat toxin (LUKÁŠOVÁ, 2001).
- 23 -
3. 7 Sortiment sušených mléčných výrobků 3. 7. 1 Sušená mléka bez přísad Sušené odtučněné mléko se vyrábí celosvětově, zaujímá největší objem výroby sušených výrobků. Vyrábí se ve formě neinstantního produktu (průmyslové zpracování) i ve formě instantního produktu zejména pro přímý konzum (FORMAN, 1996). Sušená mléka se vyrábí celosvětově s různými obsahy tuku podle požadavků zákazníka (běžně 12 %, 26 %, 28 % příp. sušená smetana 60 % až 72 % tuku (FORMAN, 1996). 3 .7. 2 Ochucené sušené výrobky pro přímý konzum V ČR se vyrábí několik typů sušených ochucených mléčných výrobků včetně sušených mléčných pudinků. Technicky je v současné době možné vyrábět širokou škálu ochucených výrobků podle chuťových zvyklostí a přání konzumentů (FORMAN, 1996). 3. 7. 3 Přípravky pro další odvětví potravinářského průmyslu Kromě sušeného odtučněného a plnotučného mléka se pro potřeby dalších odvětví potravinářského průmyslu vyrábí sušené směsi odtučněného mléka s monoglyceridy (pekárenský průmysl), polotovary na bázi sušeného mléka pro přípravu zmrzlinových směsí a další (FORMAN, 1996). 3. 7. 4 Sušená smetana Jedná se o výrobek s vysokým obsahem tuku (nejméně 50 %). Základní surovinou je smetana o vhodné tučnosti (LUKÁŠOVÁ, 2001). 3. 7. 5 Sušené podmáslí Používá se podmáslí, jehož kyselost je mezi 22 a 26 SH. Zahustí se, homogenizuje a při nízkých teplotách se suší (PROKŠ, 1965). 3. 7. 6 Sušená syrovátka Primární syrovátkové produkty zahrnují syrovátku s redukovanou laktózou, syrovátku s redukovanými minerály a bílkovinný koncentrát. Jiné upravené syrovátkové výrobky jsou vyráběny v malých množstvích a zahrnují laktalbumin (minimum bílkovinné
- 24 -
složky 80 %) a izolovaný syrovátkový protein (minimum bílkovinné složky 90 %). Laktóza je vyráběna ve velkém množství jako spoluvýrobek ve výrobě upravených syrovátek (MARTH et al., 2001). 3. 7. 7 Sušené mléčné výrobky pro kojeneckou a dětskou výživu Sortiment kojenecké a dětské výživy má velmi široké spektrum výrobků od běžného sušeného plnotučného mléka vysoké kvality přes několik druhů mléka s obdobným složením jako mateřské mléko pro kategorie nejmenších dětí (adaptovaná mléka) až po speciální výrobky určené malým skupinám dětí s intolerancí konzumu neupraveného kravského mléka. Vhodným doplňkem jsou mléčné kaše vyráběné v několika chuťových variantách. U všech výrobků je kladen velký důraz na vysokou kvalitu vstupních surovin, technologii výroby i technickou úroveň výrobních zařízení (FORMAN, 1996). 3. 7. 8 Sušené mléčné krmné směsi Mléčné krmné směsi mají různé složení dané druhem a stářím krmených zvířat, případně způsobem použití. Základem je obvykle sušené mléko, netučněné nemléčným tukem (sádlo, lůj apod.), syrovátka, podmáslí, mouka, minerální, vitaminové a ochucující doplňky. Sortiment vyráběných krmných směsí je velmi široký a zahrnuje mléčné krmné směsi pro odchov mláďat všech hospodářských zvířat a dále medikované mléčné krmné směsi (SIMEONOVOVÁ et al., 2008). 3. 7. 9 Sušené bílkovinné koncentráty a laktóza V ČR se vyrábí kyselý technický kasein, kaseinát sodný, sérové bílkoviny a z dalších speciálních produktů, laktóza (FORMAN, 1996).
3. 8 Současná situace Celková výroba sušených mlék se v 1. pololetí roku 2010 nadále snižovala, když oproti roku 2009 propadla o 3 381 tun, což představuje -19,6 %. Na tomto snížení se podílí především produkce SOM, zatímco výroba sušeného plnotučného mléka zůstává stabilní. Nižší výroba sušených komodit vyplývá z nižší bilance mléka k užití. Výrazně se snížily i celkové konečné zásoby sušených mlék o 1 508 tun (-43,6 %) na celkových 1 947 tun. Významné snížení zásob sušených mlék, zejména SOM, je
- 25 -
důsledkem celkové zlepšené situace na světovém trhu s mlékem (KOPÁČEK, 2010). Současný stav produkce sušených mléčných výrobků udává tabulka č. III. Tab. č. III Současná produkce sušených mléčných výrobků (KOPÁČEK, 2010) Výrobek Poč. zásoba k 1. 1. Z toho - SOM - SMT Výroba celkem Z toho - SOM - SMT Vývoz celkem Z toho - SOM - SMT Konečná zásoba k 31. 3. Z toho - SOM - SMT
Výroba v tunách 2010 2009 2 266 5 487 1 331 3 377 935 2 110 13 860 17 241 7 603 11 233 6 257 6 008 7 467 9 698 3 520 4 947 3 947 2 282 1 947 3 455 1 299 2 231 648 1 224
Rozdíl tuny - 3 221 - 2 046 - 1 175 - 3 381 - 3 630 249 - 2 231 - 1 427 1 665 - 1 508 - 932 - 576
Rozdíl v % 2010/2009 - 58,7 - 60,6 - 55,7 - 19,6 - 32,3 + 0,4 - 23,0 - 28,8 + 72,9 - 43,6 - 41,8 - 47,0
3. 9 Infračervená spektroskopie Lidé stále více myslí na své zdraví, a proto je nutná produkce vysoce kvalitních surovin a zpracovaných potravin. Management řízení kvality (např. v návaznosti na ISO 9 000), bezpečnosti potravin, (např. ISO 22 000), a environmentální management (např. ISO 14 000) při produkci a zpracování potravin, jsou důležité z hlediska výroby vysoce kvalitních výrobků uváděných na trh. Zásady správné zemědělské praxe a správné výrobní praxe jsou podstatné ve všech komplexních plánech řízení v oblasti zemědělství a potravinářského průmyslu. Pro tento účel jsou aktivně vyvíjeny systémy sledovatelnosti potravin pomocí moderních informačních a komunikačních technologií. Pro bezpečnost potravin, kvalitu snímání potravin ve výrobě je nutná technologie, která by měla být jednoduchá, nedestruktivní, simultánní, rychlá, kvalitativní i kvantitativní. Kromě toho je také zapotřebí software pro hodnocení naměřených dat. Optické a spektroskopické metody by mohly teoreticky uspokojit tyto požadavky. Zejména využití viditelného záření a infračerveného záření pomocí spektroskopie jsou velmi populární a hojně využívané. Aplikace blízké infračervené spektroskopie (NIR) jsou velmi rozšířené v zemědělství a potravinářství spolu s chemometrickými technikami. Kvalita potravin a zemědělských produktů je ovlivňována nejen molekulární strukturou jednotlivých složek, ale také interakcemi mezi molekulami a okolním prostředím (BENITO et al., 2008).
- 26 -
3. 9. 1 NIR spektroskopie Základem infračervené spektrometrie je interakce infračerveného záření (IČ) s molekulami analyzované látky. Infračervené záření zaujímá široký úsek spektra vlnočtů 13 000 – 10 cm-1 či vlnových délek 0,77 – 1 000 µm. V IČ spektrometrii se užívá vyjádření vlnových délek většinou ve vlnočtech. Infračervená oblast se rozděluje na:
blízkou 13 000 – 4 000 cm-1 (0,77 – 2,5 µm)
střední 4 000 – 200 cm-1 (2,5 – 50 µm)
dalekou 200 – 10 cm-1 (50 – 1 000 µm) (JANČÁŘOVÁ et al., 2003).
Blízká-infračervená (NIR) spektra jsou mezi viditelnou oblastí elektromagnetického spektra (EMS) a střední infračervenou oblastí. Podle konvence je charakterizováno jako region 780 do 2 500 nm, což odpovídá 12 820,5 do 4 000 cm
-1
, což představuje
frekvenci přibližně 10 5 GHz. Hlavním cílem této analytické metody je měření hlavních složek biologických materiálů a souvisejících organických a anorganických složek (ROBERTS et al., 2004). Molekulární spektra vyplývají z pravidelných pohybů atomových jader v rámci svých příslušných molekul. Tato jádra se pohybují společně, nebo odděleně po přímé linii vektoru, točí se, vibrují, a ohýbají ve vztahu ke svému těžišti. Vibrace a ohýbání molekul vykazuje vibrační spektroskopickou aktivitu, která může být měřena pomocí libovolného počtu spektroskopických technik, včetně blízké infračervené, střední infračervené, daleké infračervené a Ramanovy spektroskopie (WORKMAN et al., 2008). Mezi hlavní funkční skupiny absorbance v NIR regionu v důsledku základních vibrací, patří ty které jsou vidět v střední-infračervené oblasti spektra. Mezi tyto funkční skupiny patří CH, OH, NH, C = O, = CH, COOH (ASIMOPOYLOS et al., 2004). Tři nejvýznamnější vlastnosti v analýze NIR jsou přesnost, opakovatelnost a reprodukovatelnost (ROBERTS et al., 2004). Blízká-infračervená spektroskopie je široce aplikována jako rychlá, nedestruktivní analytická metoda, která nevyžaduje přípravu vzorku (WU et al., 2008). Ve většině případů NIR spektroskopie vyžaduje referenční techniky ke kalibraci. Není jen rutinním nástrojem, ale má také obrovský výzkumný potenciál, který může poskytnout jedinečné informace, které nejsou přístupné jinou technikou (SIESLER et al., 2002). Typy měření v NIR regionu zobrazuje obrázek č. IV.
- 27 -
a)
transmitance,
b)
difúzní
reflektance,
c)
vnitřní
celková
reflektance,
d) transreflektance Obr. IV Typy měření NIR (BENITO et al., 2008) 3. 9. 2 Historie NIR Spektrometrie v blízké infračervené oblasti, prakticky využívaná v rozsahu vlnočtů 4 000 – 12 500 cm-1, vychází z významného objevu, který učinil geniální matematik, astronom a hudební skladatel sir William Herschel. Již v roce 1800 dokončil práci, která prokázala existenci energie v prostoru mimo spektrum viditelného záření, a tedy mimo možnost detekce lidským okem, kterému dnes říkáme blízká infračervená oblast (NIR) (ŠIKOLA, 2002). Herschelův experiment ukazuje obrázek č. V.
Obr. V Herschelův experiment (DAVIES, 1998) Herschel označil tento nově objevený jev jako "sálavé teplo" a "termometrikální spektra". Chybně, považoval tuto formu energie jako odlišnou od světla. Což bylo ponecháno na Ampera, který v roce 1835 vynalezl nový termočlánek, který prokazuje, že NIR má stejné optické vlastnosti jako viditelné světlo, a že se jedná o stejný jev.
- 28 -
Na
počátku
dvacátého
století,
byla
mnohem
lépe
chápána
povaha
elektromagnetického spektra, k čemuž výrazně přispěli James Clerk Maxwell, Kirchoff, Stefan, Wien, Max Planck. První měření v NIR regionu provedli Abney a Festing v roce 1881. Další měření pomocí spektrometru ze solného hranolu provedl Coblentz kolem roku 1905. Coblentz zjistil, že neexisují žádné dvě látky se stejným spektrem, i kdyby měli stejné složení prvků (např. izomery propan-1-ol a propan-2-ol). Každá sloučenina měla jedinečný "otisk prstu". Coblentzovi současníci pracovali na nových, instrumentálních vzorech, které se o několik let později, měly stát základem pro současnou spektrometrii. Rowland vyvinul difrakční mřížky a konkávní rošty, Michelson publikoval dokument popisující dvoupaprskový interferometr. Možná, první kvantitativní měření NIR bylo stanovení vlhkosti ovzduší na observatoři Mount Wilson v roce 1912, v roce 1938 Ellis a Bath určili množství vody v želatině. Ve 40. letech dvacátého století Barchewitz analyzoval palivo a Barr zveřejnil spektra některých rostlinných olejů. Moderní technologie NIR spoléhá na počítač (a zvláště mikroprocesor), a to nejen pro jeho schopnost řídit a získávat data z přístroje, ale pro usnadnění kalibrace a analýzy dat. Základy analýzy dat byly stanoveny v roce 1930. Prací na difúzním rozptylu světla Kubelka a Munk v roce 1931 otevřeli dveře k NIR měření pevných látek (BURNS et al., 2007). První komerční přístroje se objevily v 70. letech poté, co v USA profesor Norris úspěšně vyřešil analýzu vlhkosti a N-látek v pšenici pomocí odraženého záření v NIR oblasti. Dal tak vznik prvním spektrofotometrům firem NEOTEC, TECHNICON apod. Dnes jsou na světě desítky výrobců různých typů NIR spektrofotometrů pro nejrůznější oblasti použití (BIEN, 2006). Dalším
zlomem
bylo
zavedení
infračervené
spektroskopie
s Fourierovou
transformací, jejíž výhody se uplatňují tam, kde končí možnosti spektroskopie disperzní. Ve spojení se vzorkovacími technikami využívajícími optická vlákna je NIR spektroskopie ideální metodou pro on-line analýzu v průběhu technologických procesů. Rozšíření NIR spektroskopie by však nebylo možné bez současného rozvoje chemometrických metod a také výkonné výpočetní techniky, která umožňuje statisticky vyhodnotit snímaná spektra v korelaci s analyticko-chemickými a fyzikálními vlastnostmi měřených vzorků (ČOPÍKOVÁ et al., 2003). - 29 -
NIR technologie se rychle vyvíjela od roku 1970 a nyní získala široké uplatnění v mnoha odvětvích (BURNS et al., 2007). 3. 9. 3 Výhody a nevýhody NIR NIR spektrometrie je populární svými čtyřmi hlavními výhodami: rychlost (spektrum je možné získat za pouhé desetiny sekund), malá nebo žádná příprava vzorku (je-li nutná jakákoli příprava, pak je obvykle docela jednoduchá), vícenásobná analýza z jednoho scanu (není nutné skenování vzorků pro každou složku), a nedestruktivní proces měření (umožňující návrat analyzovaného dílčího výběru na původní šarži) (OZAKI et al., 2006). Dle ŠIKOLY (2002) jsou výhody, které poskytuje analýza NIR spektrometrií ve srovnání s klasickou spektrometrií a chromatografickými metodami také vysoká spolehlivost,
není
potřeba
použití
organických
rozpouštědel,
takže
kromě
ekonomických předností, klesá zároveň zatížení životního prostředí toxickým odpadem. Dle MLČKA et al. (2010) je to dále velký potenciál pro on-line analýzu, snadnost obsluhy, možnost měřit přes transparentní obaly. V současné době, NIR spektrometrie má tři nedostatky. Za prvé, je to technologie, která musí být kalibrována. To znamená, že přístroje musí být kalibrovány pomocí skenování souboru vzorků se známými kvalitativními/kvantitativními parametry. Za druhé, známé úrovně často zahrnují nákladné a složité referenční metody úzce spjaté s mokrou cestou, nutnost vstupu kvalifikovaných pracovníků. Za třetí, moderní kalibrační metody se spoléhají na poněkud sofistikované chemometrické techniky, potřeba personálu, který je kvalifikovaný v chemometrii (nebo statistické chemii) (OZAKI et al., 2006). Další nevýhodou je vyšší pořizovací cena přístrojů, slabá citlivost k minoritním složkám a u některých typů spektrometrů omezený převod kalibrací mezi různými přístroji (MLČEK et al., 2010). 3. 9. 4 Přístroje měření NIR Základními prvky každého IČ spektrometru bývají:
zdroj IČ záření
kyveta
monochromátor
detektor IČ záření
- 30 -
registrační zařízení (JANČÁŘOVÁ et al., 2003).
Měření spektra pro všechny NIR spektrofotometry je dáno poměrem fotometrického (tj. propustnosti a odrazivosti) měření vzorku při vlnové délce nebo souboru vlnových délek s měřením referenčního materiálu ve stejné vlnové délce (ROBERTS et al., 2004). Křemen-halogenová žárovka je zdaleka nejpopulárnější zdroj energie NIR. Světloemitující diody jsou druhým nejoblíbenějším zdrojem energie NIR. Vlnové izolátory v technologii: fotodioda (PDA), detektory diodového pole (DAD), laserové diody (LD), pevné filtry (FF), klínové interferenční filtry (WIF), naklápěcí filtry (TF), akustooptické filtry (AOTF), filtry tekutých krystalů (LCTF), hranoly, mřížky. Spektrometry mají řadu detektorů, z nichž nejpopulárnější jsou galenit (PbS), indium, gallium arsenid (InGAS), a křemík. Křemíkové detektory jsou omezeny jejich spektrální odezvou na ultrafialové, viditelné a krátké vlnové délky (200 – 1 000 nm) (OZAKI et al., 2006). NIR spektra lze měřit jako zeslabení zářivého toku po průchodu záření vzorkem (transmisní měření) nebo po odrazu záření (reflexní techniky). V rámci reflexních technik se nejčastěji uplatňuje princip difúzní reflexe, kdy se dopadající záření odráží od povrchu jednotlivých malých částic práškového vzorku. Transmisní měření se využívá především v případě kapalin, kašovitých vzorků a polymerních folií. Kapalné vzorky je možné měřit v kyvetách ze speciálního skla (INFRASIL, SUPRASIL), které vykazuje vysokou propustnost v celé NIR oblasti. Přístrojová technika pro NIR spektroskopii se vyvíjela od filtrových přístrojů přes stále poměrně rozšířené disperzní spektrometry, které jsou však postupně nahrazovány přístroji s Fourieovou transformací (FT). FT NIR spektrometr má ve srovnání s disperzním spektrometrem řadu výhod, je to především vyšší rychlost snímání spekter, lepší poměr signálu k šumu, vysokou vlnočtovou přesnost, velkou rozlišovací schopnost a konstantní rozlišení v celém rozsahu spektra (ČURDA et al., 2002). 3. 9. 4. 1 Instrumentace On - line On-line instrumentace je obvykle nejnáročnější. Přístroj je umístěn v blízkosti monitorovaného procesu, který vyžaduje, aby přístroj vydržel drsné podmínky prostředí procesu. Často, tyto podmínky zahrnují extrémní teplotní podmínky, vysokou vlhkost vzduchu, vysokou prašnost, atd. Snímání spekter vzorků se provádí sondou, která je přímo vložena do technologické linky a konstrukce sondy by měla být taková, aby sonda odolávala podmínkám procesu. Sonda musí mít také schopnost vydržet podmínky čisticích cyklů používaných pro čištění a dezinfekci výrobních linek, musí být snadno
- 31 -
vyjmutelná z technologické linky pro její kontrolu a čištění. Vyjmutí sondy by mělo být provedeno, aniž by muselo dojít k zastavení procesu, zejména v kontinuálních procesech. On-line monitorování nabízí velké množství výhod. Vzhledem k tomu, že produkt je neustále monitorován, proces může být trvale upraven k vyloučení výroby zmetkových produktů, čímž se zvyšuje výnos a eliminují náklady na odstraňování nebo přepracování výrobků. Výnos je také zvýšen tím, že není nutné produkt ukládat při čekání na výsledky analýz z laboratoře, které často mohou trvat i hodiny (ASIMOPOYLOS et al., 2004). 3. 9. 4. 2 Instrumentace In - line Požadavky na instalaci in-line analyzátoru NIR jsou většinou poměrně jednoduché. Přístroj je fyzicky blízko monitorovaného procesu, ale v místě, které je snadno přístupné a je často teplotně stabilizováno. Pro in-line sledování, se musí vzorek z technologické linky vzít a předat do analyzátoru. Hlavní výhodou in-line sledování je velká rychlost, kterou NIR analýza nabízí. Hlavní nevýhodou in-line sledování versus on-line sledování je, že sledování není souvislé, a vzorek musí být před analýzou vyjmut z linky. Další nevýhodou je nutné zaškolení obsluhy (ASIMOPOYLOS et al., 2004). 3. 9. 5 Příprava vzorku, kalibrace Ve většině případů není nutná žádná příprava vzorku. Pokud je nutná, pak se většinou jedná o zmenšení velikosti částic mletím, a mícháním, někdy i odstraněním vlhkosti. Vzorky mohou být pevné látky, kapaliny, plyny, nebo jejich kombinace, jako jsou kaly, pasty, suspenze, pěny nebo filmy. Nejoblíbenější způsob, jak využít tuto analytickou technologii, je po kalibraci s referenčními laboratorními hodnotami získanými pomocí standardní laboratorní metody (ROBERTS et al., 2004). Pro stanovovanou složku musí být provedena kalibrace příslušného NIR spektrometru pomocí vhodného souboru kalibračních standardů (nejméně 30 vzorků) o známém složení, které je určeno nezávislou analytickou metodou. Kalibrační vzorky by měly charakterizovat v maximální míře vlastnosti analyzovaných vzorků a měly by pokrývat celý koncentrační rozsah. Úzké koncentrační rozpětí kalibračních vzorků lze řešit přípravou modelových vzorků (ČURDA et al., 2002).
- 32 -
Informace obsažená v NIR spektrech však může být v současné době získána s pomocí chemometrických metod, které s postupným rozvojem výpočetní techniky přešly z lokální podoby zpracovávání vybraných frekvencí (multiple regression) na globální metody v případě regrese hlavních komponent (Principal Component Regression, PCR), postupné vícenásobné regrese(Stepwise Multiple Linear Regression, SMLR), Fourierovy regrese (Fourier Regression, FR), metody částečných nejmenších čtverců (Partial Least Squares, PLS) a nejnověji neuronových sítí (Neural Network, NN), které pracují s celospektrální informací. Matematická předúprava zahrnuje nejčastěji použití 1. či 2. derivace spektra a vícenásobnou korekci rozptylu (multiplicative scattering correction, MSC) pro eliminaci různé velikosti částic, vektorové normalizace a jiných matematických metod bez jejichž použití by si NIR spektroskopie nevybudovala současnou pozici v chemické analýze (ŠIKOLA, 2002). 3. 9. 6 Kvantitativní a kvalitativní analýza 3. 9. 6. 1 Kvantitativní analýza Praktický postup při kvantitativní analýze vychází z měření kalibračních nebo referenčních vzorků NIR spektrometrem, jejich matematického předzpracování a tvorby kalibračního modelu, přičemž je hledána matematická závislost mezi spektrem a hledanými fyzikálními parametry (nejčastěji koncentrací), které byly stanoveny dříve nezávislou, referenční technikou. Jestliže takovou závislost získáme s dostatečně spolehlivými statistickými parametry, můžeme takový model použít ke spolehlivé analýze neznámých vzorků prostřednictvím změřených NIR spekter (ŠIKOLA, 2002). Pokud není přesnost dostatečná, je proces opakován včetně širší variace typů vzorků v kalibraci, a kontrola správnosti laboratorních výsledků získaných mokrou cestou. Tento proces se opakuje až do potvrzení nebo až do té doby než testovací sada dává přesné výsledky (ROBERTS et al., 2004). 3. 9. 6. 2 Kvalitativní analýza První z nich je diskriminační analýza, v níž jsou použity různé algoritmy k určení, zda vzorek patří do skupiny známých vzorků na základě spektrálního porovnání. Druhá je spektrální vyhledávání, ve kterém vzorové algoritmy jsou různě používány k určení míry podobnosti mezi spektrem vzorku a známým spektrem (ROBERTS et al., 2004).
- 33 -
3. 9. 7 Využití NIR Aplikační rozsah NIR spektroskopie: Vlhkost: stanovení vody bylo jednou z prvních aplikací. Využívá se intenzivní absorpce vazby OH v molekule vody. Stanovení se provádí běžně jak u sypkých tak u pastovitých a kapalných vzorků.
Bílkoviny: stanovení obsahu bílkovin je umožňováno absorpcí vazby NH přítomné v peptidické vazbě a dovoluje stanovení nejen celkového obsahu bílkovin, ale např. i jednotlivých aminokyselin v určitých matricích nebo jejich vlastností, jako je teplem poškozený protein, lepek nebo frakce bílkovin.
Tuky, oleje: u stanovení tuků je využíváno charakteristických absorpčních pásů způsobovaných vazbou CH přítomnou v jejich molekulách. Mimo celkového obsahu tuků je možné sledovat také jejich kvalitu (jodové číslo apod.).
Polysacharidy: charakteristické skupiny a jejich vazby (C-H, O-H) umožňují stanovení vlákniny v různých modifikacích, škrobu a jednoduchých cukrů (sacharóza, glukóza, laktóza).
Popel: obsah popele se metodou NIR určuje nepřímo, neboť je v řadě matric v korelaci k celkové organické hmotě (BIEN, 2006).
Tato technika je široce používána v různých oblastech: zemědělství, zoologických vědách, biotechnologii, v průmyslové chemii, kosmetice, chemii potravin a nápojů, kriminalistických analýzách, lékařství a klinické chemii, vojenském výzkumu, farmaceutické produkci, botanice a dalších (BENITO et al., 2008). Infračervená spektroskopie bývá také použita pro rychlé, nedestruktivní, a snadné měření reziduí pesticidů v zemědělských produktech a potravinách (HASHIMOTO et al., 2008). NIR může být uplatňována při detekci a kvantifikaci masokostní moučky přidávané do krmných směsí (GARRIDO-VARO et al., 2005). V potravinářství
má
NIR
spektrometrie
velkou
perspektivu
především
v kvantitativní analýze při stanovení obsahu tuku, vody, bílkovin, cukrů, mastných kyselin a jiných složek (ŠIKOLA, 2002). Spektroskopické techniky ve spojení s multivariační analýzou se jeví jako velice užitečné při analýze kakaového prášku (TRILČOVÁ et al., 2005).
- 34 -
Blízká infračervená spektroskopie je velmi využívána v oblasti masného průmyslu, kde se aplikuje ke zjišťování kvantitativních znaků, ale také se spektroskopie NIR uplatňuje při posuzování kvality masa z hlediska technologických a senzorických znaků (MLČEK et al., 2010). WOLD et al. (1996) použili NIR spektroskopii k určení průměrného obsahu tuku v lososech. DOWNEY (1996) měřil NIRS přes kůži čerstvého lososa při stanovení vlhkosti a obsahu mastných kyselin. Tato metoda byla užitečná k optimalizaci obsahu tuku a vlhkosti u lososů z chovu. NIR spektroskopie použil LOVASZ et al. (1994) pro zkoumání několika parametrů kvality jablek. Parametry byly pevnost, pH, celková kyselost, sušina, nerozpustné pevné látky a obsah alkoholu. VENTURA et al. (1998), ZUDE et al. (2006), a XIAOBO et al.(2007) zkoumali rozpustnou sušinu jako parametr kvality jablek a TEMMA et al. (2002) měřil obsah cukru. HERNÁNDEZ et al. (2006) použil podobné studie ale ke zjištění kvality mandarinek. ZAHN (1993) popisuje spektroskopii NIR jako "Výkonný nástroj pro rychlé řízení procesů a produktů v pivovarech a sladovnách". COZZOLINO et al. (2006) připravili bibliografické studie využití technologie NIR ve vinařství. NAZAROV et al. (2005) chtěli zjistit, zda NIR by mohla být začleněna do vinic a skladů. Výsledky ukazují, NIR jakožto nástroj vhodný pro analýzu hroznů a vína cit. dle BENITO et al. (2008). Ovocná šťáva je důležitá v nápojovém průmyslu a její důležitost roste s rychlým rozvojem techniky zpracování potravin. Z mnoha různých druhů ovoce jsou připravovány šťávy, nejdůležitější je pomerančový džus. Vzhledem ke ztrátě některých živin v procesu přípravy přírodní pomerančové šťávy a jiných, jsou do levnějších džusů často přidávány cukry, kyseliny, barviva, voda a jiné přísady, pro získání chuti a barvy. Organické kyseliny, včetně kyseliny vinné a citronové, je možné použít jako "otisk prstu", protože reprezentují vlastnosti každé ovocné šťávy. V této souvislosti mohou být použity VIS a NIR spektroskopie pro rychlou detekci obou kyselin v pomerančové šťávě (BENITO et al., 2008).
- 35 -
Využití NIRS v potravinářství je znázorněno v tabulce č. IV. Tab. IV NIR analýza potravin (BENITO et al., 2008) Výrobek Transmitance Pivo Víno Extrakt kukuřice Reflektance Sušené mléko Mouka (koneč. mletí) Mouka Drcená slunečnicová semínka Produkty z ryb Máslo
Komponenty Různé komponenty Obsah alkoholu Bílkoviny Tuk, vlhkost Bílkoviny, vlhkost a čistota Lepek Bílkoviny Sacharidy a vlhkost Vlhkost
3. 9. 8 Využití NIR v mlékařství Tradiční metody hodnocení kvality mléka a jeho hlavních součástí jsou relativně pomalé a poměrně drahé (JANKOVSKÁ et al., 2003). Nejdůležitější spektroskopické metody používané v mlékárenském průmyslu je střední infračervená spektroskopie (MIR) a blízká infračervená spektroskopie (NIR) (BENITO et al., 2008). Tato technika umožňuje souběžné měření několika složek, jako je tuk, sušina, bílkoviny, voda, atd., a nabízí mnoho výhod (ASIMOPOYLOS et al., 2004). Aplikace NIR spektroskopie v mlékárenském průmyslu sahá až do druhé poloviny 70. let (OZAKI et al., 2006). POLESELLO a GIANGIACOMO v roce 1983 shrnuli první zkušenosti s uplatňováním NIR ke studiu optických vlastností mléčných výrobků a využití vláknové optiky pro určení chemického složení plnotučného modrého sýra. V roce 1994, GIANGIACOMO a NZABONIMPA podali zprávu o vývoji a uplatnění NIR technologie mléčných výrobků. Jejich přehled také citoval průmyslové aplikace a hlavní faktory ovlivňující měření. RODRIGUEZ-OTERO et al. v roce 1997 aktualizovali výzkum z roku 1994 analýzou NIR mléčných výrobků, s důrazem na posledních zpracování dat umožňující analýzu hlavních komponent. Došli k závěru, že NIR spektroskopie je také užitečná jako nástroj pro klasifikaci sušeného mléka a jako screeningová metoda pro detekci falšování. Blízká-infračervené spektroskopie byla aplikována na určování tuku, bílkovin, dusíku, močoviny v mléce a laktózy měřené v homogenizovaném mléce a nehomogenizovaném mléce jako indikátory kvality mléka a krmiv. NIR spektroskopie - 36 -
byla úspěšně využita pro měření složení mléka a somatických buněk pomocí stanovení spektra nehomogenizovaných vzorků od jednotlivých krav. NIR spektroskopie se ukázala jako cenný nástroj pro diagnostiku mastitidy a pro hodnocení kvality mléka (OZAKI et al., 2006). 3. 9. 8. 1 Využití NIR při kontrole sušeného mléka Mezi další aplikace NIR v mlékárenském průmyslu je oblast výroby sušeného mléka, syrovátky a různých mléčných směsí ke stanovení základních jakostních ukazatelů pomocí filtrových přístrojů či jiných typů spektrometrů. NIR spektrometrie je vhodná ke zjištění složení originálního a lyofilizovaného sušeného mléka, případně při kontrole jakosti z hlediska možných příměsí a nečistot v sušeném mléce (RŮŽIČKOVÁ et al., 2007). Procesní kontroly kvality pevných látek obecně a především mléka jsou obtížné. Ve srovnání s kapalinami je měření pevných látek v procesu on-line velmi náročné, což také komplikuje použití spektroskopických metod (IRUDAYARAJ et al., 2008). DOWNEY et al. (1996) použili NIR ke klasifikaci obchodního odtučněného sušeného mléka podle tepelného zpracování. Použili 66 vzorků z komerčně vyráběného sušeného odstředěného mléka, včetně vysoce-tepelně, středně-tepelně, a nízko-tepelně ošetřených prášků. NIR predikce falšování sušeného mléka izoláty zeleniny poskytovala lepší výsledky než ostatní analytické metody a NIR by mohla být vhodná metoda pro účely screeningu (OZAKI et al., 2006).
- 37 -
4 MATERIÁL A METODIKA 4. 1 Použitý materiál Pro analytické stanovení obsahu vlhkosti, titrační kyselosti, měrné hmotnosti a pH byly použity vzorky sušené syrovátky. Vzorky k analýze poskytla firma Eligo, a. s. Vzorky byly analyzovány na Ústavu technologie potravin Mendelovy univerzity v Brně. Ke všem analýzám bylo použito 40 vzorků sušené syrovátky.
4. 2 Použité metody 4. 2. 1 Chemické rozbory sušeného odtučněného mléka a sušené syrovátky V rámci chemické analýzy vzorků byl stanoven obsah vlhkosti, titrační kyselost, pH a měrná hmotnost dle ČSN 57 0105 a ŠUSTOVÉ (2005a,b). 4. 2. 1. 1 Stanovení obsahu vody Podle ČSN 57 0105 se obsah vody stanoví sušením při teplotě 87 ± 2 ºC, při níž nedochází k porušení organických látek. Metody se používá pro všechny sušené mléčné výrobky. Prázdná váženka se asi hodinu předsouší v sušárně při 87 ± 2 ºC a po ochlazení se naváží s přesností 0,0001 g asi 3 g vzorku, stejnoměrně rozprostřeného na dně váženky. Vzorek se suší 6 hodin a po půlhodinovém ochlazení v exikátoru zváží. Sušení se ještě opakuje vždy hodinu při 87 ± 2 ºC až do nejnižší váhy. V sušárně se smí současně sušit jen sušená mléka, nikoliv výrobky s vyšším obsahem vody. Obsah vody v % (x) se vypočte podle vzorce: x=
a ⋅ 100 n
a - úbytek na váze sušením v g n - navážka vzorku v g
4. 2. 1. 2 Stanovení titrační kyselosti Podle ČSN 57 0105 se sušené mléko obnovuje rozpuštěním 13,50 g plnotučného, 12 g polotučného nebo 10 g odtučněného sušeného mléka rozmixováním (90 s ) s přídavkem 100 ml 24oC teplé vody.
- 38 -
Kyselost mléka se vyjadřuje počtem mililitrů roztoku NaOH (0,25 mol/l), spotřebovaných při titraci 100 ml mléka za přídavku fenolftaleinu jako indikátoru. Toto titrační vyjádření bylo dříve označováno ve stupních Soxhlet – Henkelových (ºSH), což je při číselném vyjádření stejná hodnota. Do titrační baňky se odpipetuje 50 ml mléka, přidají se 2 ml fenolftaleinu a za stálého míchání se titruje roztokem NaOH (0,25 mol/l) do trvalého, slabě růžového zabarvení. Titrační kyselost (x) (0,25 mol/l) (dříve ve ºSH) se vypočte podle vzorce: x = 2⋅a⋅ f a - spotřeba roztoku NaOH (0,25 mol/l). f - faktor NaOH
4. 2. 1. 3 Stanovení aktivní kyselosti mléka pH metrem Dle ŠUSTOVÉ (2005a) je aktivní kyselost mléka dána koncentrací vodíkových iontů v mléce a měří se na přístroji WTW pH Meter pH 95. Vyjadřuje se v hodnotách pH. pH metr se kalibruje v rozsahu 4 až 7 pH podle ústojných roztoků o známé hodnotě pH. Při vlastním měření je nutné postupovat podle návodu použitého pH metru. Elektroda se ponoří do mléka o teplotě kolem 20ºC a změří se odpovídající hodnota pH. Aktivní kyselost se vyjádří v hodnotách pH v zaokrouhlení na 0,05 pH.
4. 2. 1. 4 Měrná hmotnost Podle ŠUSTOVÉ (2005b) se do odměrného válce volně nasype sušený výrobek a povrch prášku se zarovná hladce s okrajem válce. Potom se válec se vzorkem zváží (b). Hmotnost válce bez vzorku je (a). Je možno pracovat i s jiným objemem než 100, musí však být proměřen až po rovný okraj (objem V). Hmotnost se vyjádří v g, objem v cm3. Hmotnost volně nasypaného prášku =
b−a , v g.cm-3 (či násobením 1 000 v kg.m-3). V
- 39 -
4. 2. 2 Infračervená spektroskopie Hodnoty získané chemickými rozbory sušené syrovátky byly použity ke kalibraci v rámci NIR spektroskopie. Vzorky sušené syrovátky byly proměřeny na spektrometru NIR Nicolet Antaris ve spektrálním rozsahu 10 000 – 4 000 cm-1 se 100 scany s rozlišením 8. Vzorek byl snímán dvakrát a čas snímání jednoho spektra se pohyboval okolo 1,5 min. Spektra byla měřena pomocí optické sondy v režimu reflektance. Naměřená data byla zpracována pomocí programu TQ Analyst metodou PLS (částečných nejmenších čtverců). Dále byl využit diagnostický nástroj PRESS (predicted residual error sum of squares). Stejné vzorky byly použity pro křížovou validaci. Výsledky byly vyhodnoceny pomocí statistického a grafického programu Microsoft Office Excel. Statistickými metodami byly zjišťovány směrodatná odchylka kalibrace (SEC), směrodatná odchylka validace (SEP), kalibrační variační koeficient (CCV) a predikční variační koeficient (PCV). Dalším ukazatelem spolehlivosti kalibračního modelu je hodnota korelačního koeficientu R. Pro srovnání hodnot naměřených pomocí FT-NIR s hodnotami zjištěnými v laboratoři byl použit párový T-test na střední hodnotu.
- 40 -
5 VÝSLEDKY A DISKUZE 5. 1 Výsledky chemické analýzy U všech vzorků sušené syrovátky byla stanovována měrná hmotnost, titrační kyselost, vlhkost a pH. Výsledné naměřené hodnoty stanovené při chemické analýze jsou uvedeny v tabulce č. V. Tab. V Výsledky chemické analýzy Kalibrační složky měrná hmotnost (g/cm3) titrační kyselost vlhkost (%) pH
N 40 40 40 40
xp 0,426 5,749 5,016 6,493
MIN 0,40 5,06 3,68 6,27
MAX 0,45 6,26 6,47 6,68
sx 0,0171 0,3806 0,7836 0,1239
N – počet vzorků, xp – průměrná hodnota, MIN – minimální hodnota, MAX – maximální hodnota, sx – směrodatná odchylka
Průměrná hodnota měrné hmotnosti byla stanovena 0,426 g/cm3. Dle WALSTRY et al. (2006) by se měla měrná hmotnost sušené syrovátky rovnat hodnotě 1,560 g/cm3. Průměrná hodnota titrační kyselosti byla 5,749 SH, průměrný obsah vlhkosti 5,016 % a průměrná hodnota pH 6,493. Hodnota SH by se měla u produktů určených k sušení pohybovat pod 7 SH. Obsah vlhkosti v sušené syrovátce by měl být do 4 %, ale během skladování obvykle mírně vzroste. Hodnota pH tekuté syrovátky se obvykle pohybuje mezi 6,5 – 6,6 (FORMAN, 1996), během skladování sušené syrovátky se může hodnota pH mírně snížit. Velký rozdíl mezi minimální a maximální hodnotou obsahu vlhkosti byl dán dlouhou dobou skladování při nedokonale uzavřených obalech.
5. 2 Výsledky NIR spektroskopie Tvorba kalibračního modelu vyžaduje použití počítače vybaveného chemometrickým softwarem. Principem kalibrace je získání závislosti mezi spektrální informací a složením vzorku (ČURDA et al., 2002). Obrázek č. VI ukazuje různost spekter sušené syrovátky, konzumního mléka a eidamského sýru. Odlišnost spekter je způsobena rozdílnou chemickou strukturou vzorků.
- 41 -
Obr. VI Ukázka spekter sušené syrovátky, konzumního mléka a eidamského sýru V případě kalibrace vlhkosti a hodnoty pH bylo spektrum upraveno pomocí 1. derivace. Pomocí metody PLS (Partial least squares) byly vytvořeny kalibrační modely. K vývoji kalibračního modelu byl použit diagnostický nástroj PRESS, který udává optimální počet použitých PLS faktorů. Optimální počet PLS faktorů se volí v minimu funkce PRESS. Pokud je počet PLS faktorů příliš vysoký lze usuzovat, že model má v sobě zahrnuto příliš mnoho spektrálního šumu, který může zkreslovat konečné výsledky kalibrace (RŮŽIČKOVÁ et al., 2007). Ovšem stejně tak je nevhodný i nízký
- 42 -
počet faktorů, kdy dostatečně nevyužíváme veškeré relevantní informace (MATĚJKA, 2008). V našem případě byl stanoven počet PLS faktorů u měrné hmotnosti na 3, u titrační kyselosti na 2, u vlhkosti na 10 a u pH na 1. Optimální průběh funkce PRESS by měl ukazovat výrazný pokles, poté by měl pozvolna stoupat, jak je patrné z obrázku č. VII a VIII, kde je znázorněn průběh funkce u stanovení titrační kyselosti a pH.
Obr. VII Funkce PRESS stanovená u titrační kyselosti sušené syrovátky
- 43 -
Obr. VIII Funkce PRESS stanovená u pH sušené syrovátky Správnost kalibračního modelu byla ověřena křížovou validací. Pro niž byly použity stejné vzorky sušené syrovátky jako pro tvorbu kalibračních modelů. Dále byla kvalita modelu ověřena pomocí směrodatné odchylky kalibrace (SEC), směrodatné odchylky validace (SEP) a korelačních koeficientů R. Hodnota SEP by měla být minimální a u spolehlivé kalibraci by neměla být o mnoho vyšší než SEC (ČURDA et al., 2002). Referenční a predikované hodnoty by v ideálním případě měly vykazovat lineární závislost jdoucí počátkem a se směrnicí rovnou 1. Proto lze posoudit kvalitu kalibračního modelu na základě korelačních koeficientů (ČURDA et al., 2002). Tudíž
čím víc se hodnota korelačního koeficientu R blíží 1, tím lze považovat kalibraci za věrohodnější. Korelační koeficient vypovídá o kvalitě regresní závislosti mezi laboratorními hodnotami a hodnotami předpověděnými pomocí NIR spektroskopie. Závislost s korelačním koeficientem 0,95 – 0,99 se považuje za velmi silnou,
- 44 -
s korelačním koeficientem 0,80 – 0,94 za dosti silnou, s 0,50 – 0,79 za středně silnou a je-li hodnota nižší než 0,50 za závislost bezvýznamnou (TRILČOVÁ et al., 2005). Tabulka č. VI uvádí korelační koeficient, směrodatnou odchylku kalibrace, počet PLS faktorů, kalibrační variační koeficient, lineárně regresní závislost výsledků NIR metody na výsledcích referenční metody, derivaci. Tab. VI Kalibrační výsledky Kalibrační složky měrná hmotnost (g/cm3) titrační kyselost vlhkost (%) pH
R
SEC
0,814 0,876 0,995 0,878
0,001 0,189 0,075 0,059
PLS faktory 3 2 10 1
CCV (%)
LR
derivace
2,33 3,29 1,50 0,91
y = 0,6436x + 0,1524 y = 0,764x + 1,357 y = 0,9905x + 0,0478 y = 0,7751x + 1,4604
0 0 1 1
R - korelační koeficient, SEC - směrodatná odchylka kalibrace, CCV - kalibrační variační koeficient, LR - lineárně regresní závislost výsledků NIR metody na výsledcích referenční metody
Korelační koeficienty se pohybovaly v rozmezí od 0,814 do 0,995. Nejlepší hodnoty dosáhl korelační koeficient v případě stanovení vlhkosti, a to hodnoty 0,995, což je považováno za závislost velmi silnou. Naopak nejnižší hodnota byla dosažena v případě stanovení měrné hmotnost při hodnotě 0,814, ale i přesto můžeme hovořit o dosti silné závislosti hodnot referenčních a hodnot předpověděných NIR spektroskopií. Směrodatné odchylky kalibrace se pohybovaly mezi hodnotami 0,001 až 0,189. Nejvyšší hodnota směrodatné odchylky kalibrace byla stanovena při měření titrační kyselosti a to hodnoty 0,189. Naproti tomu nejnižší hodnota směrodatné odchylky kalibrace byla dosažena u stanovení měrné hmotnosti při hodnotě 0,001. Tabulka č. VII udává korelační koeficient, směrodatnou odchylku validace, počet PLS faktorů, predikční variační koeficient, lineárně regresní závislost výsledků NIR metody na výsledcích referenční metody, derivaci u všech zvolených kalibračních složek a to: měrné hmotnosti, titrační kyselosti, vlhkosti a pH. Tab. VII Validační výsledky Kalibrační složky měrná hmotnost (g/cm3) titrační kyselost vlhkost (%) pH
R
SEP
0,749 0,819 0,764 0,854
0,011 0,219 0,518 0,064
PLS faktory 3 2 10 1
PCV (%) 2,58 3,81 10,33 0,99
LR
derivace
y = 0,6192x + 0,1634 y = 0,7075x + 1,6786 y = 0,6944x + 1,5132 y = 0,7369x + 1,7091
0 0 1 1
R - korelační koeficient, SEP - směrodatná odchylka validace, PCV - predikční variační koeficient, LR - lineárně regresní závislost výsledků NIR metody na výsledcích referenční metody
- 45 -
Korelační koeficienty se pohybovaly v rozmezí od nejhorší hodnoty v případě stanovení měrné hmotnosti (stejně jako v případě předchozí kalibrace), kdy bylo dosaženo hodnoty 0,749, přičemž se jedná o středně silnou závislost, až po nejlepší hodnotu v případě stanovení hodnoty pH,a to 0,854, v tomto případě se jedná o velmi silnou závislost. Hodnota směrodatné odchylky validace se pohybovala v rozmezí od 0,011 pro měrnou hmotnost až po hodnotu 0,518 pro stanovení vlhkosti. Hodnota validační odchylky SEP by se neměla příliš odlišovat od hodnoty směrodatné odchylky kalibrace. Nejméně se hodnoty SEP a SEC liší v případě stanovení hodnoty pH a nejvíce při měření vlhkosti. Grafické vyjádření výsledků závislosti hodnot zjištěných při NIR spektroskopii na výsledcích chemické analýzy jednotlivých složek je znázorněno na obrázcích č. IX až XII. Přímky kalibrace a validace by měly být v co nejtěsnější závislosti. Nejtěsněji k sobě přímky kalibrace a validace přiléhají v případě měření hodnoty pH, nejméně potom u stanovení vlhkosti. Čemuž také odpovídá předchozí stanovení hodnoty směrodatných odchylek SEP a SEC. Měrná hmotnost 0,46
měrná hmotnost/NIR
0,45
y = 0,6436x + 0,1524 R = 0,814
0,44 0,43 0,42 y = 0,6192x + 0,1634 R = 0,749
0,41 0,4 0,39 0,39
0,4
0,41
0,42
0,43
0,44
0,45
0,46
měrná hmotnost/stanoveno chemicky kalibrace
validace
Lineární (kalibrace)
Lineární (validace)
Obr. IX Grafické vyjádření kalibračních a validačních výsledků stanovení měrné hmotnosti sušené syrovátky
- 46 -
Titrační kyselost 6,4 6,2 y = 0.764x + 1.357 R = 0.876
TK/NIR
6 5,8 5,6 5,4
y = 0.7075x + 1.6786 R = 0.819
5,2 5 5
5,2
5,4
5,6
5,8
6
6,2
6,4
TK/stanoveno chemicky kalibrace
validace
Lineární (kalibrace)
Lineární (validace)
Obr. X Grafické vyjádření kalibračních a validačních výsledků stanovení titrační kyselosti sušené syrovátky Vlhkost 7 6,5 y = 0,9905x + 0,0478 R = 0,9954
vlhkost/NIR
6 5,5 5 4,5
y = 0,6944x + 1,5132 R = 0,764
4 3,5 3 3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
vlhkost/stanoveno chemicky kalibrace
validace
Lineární (kalibrace)
Lineární (validace)
Obr. XI Grafické vyjádření kalibračních a validačních výsledků stanovení vlhkosti sušené syrovátky
- 47 -
pH 6,7 6,65
y = 0,7751x + 1,4604 R = 0,878
6,6
pH/NIR
6,55 6,5 6,45 6,4
y = 0,7369x + 1,7091 R = 0,854
6,35 6,3 6,25 6,2
6,25
6,3
6,35
6,4
6,45
6,5
6,55
6,6
6,65
6,7
6,75
pH/stanoveno chemicky kalibrace
validace
Lineární (kalibrace)
Lineární (validace)
Obr. XII Grafické vyjádření kalibračních a validačních výsledků stanovení pH sušené syrovátky Pro porovnání spolehlivosti kalibrace byl vypočten kalibrační variační koeficient CCV, který udává SEC v procentech průměrné laboratorní hodnoty. Analogicky byl vypočten i predikční variační koeficient PCV z hodnoty SEP. Hodnota CCV by se měla pohybovat do 5 %, hodnota PCV do 10 %. U CCV bylo v případě měrné hmotnosti vypočteno 2,33 %, titrační kyselosti 3,29 %, vlhkosti 1,50%, a pH 0,91 %. Což znamená, že ani jedna z kalibračních složek nepřekračuje hranici 5 %. U PCV bylo v případě měrné hmotnosti vypočteno 2,58 %, titrační kyselosti 3,81 %, vlhkosti 10,33 %, a pH 0,99 %. Při dosažení hodnoty PCV pod 10 % a současně hodnoty CCV pod 5 % lze kalibrační model považovat za spolehlivý. Čehož bylo dosaženo v případě stanovení měrné hmotnosti, titrační kyselosti i pH. Pokud jedna z hodnot přesahuje stanovenou hranici lze pak tento model považovat za ještě spolehlivý a je možné jej optimalizovat, hodnota 10 % byla překročena u PCV při měření vlhkosti. Pokud by obě hodnoty CCV i PCV překročily hranici pak je možné tento model označit jako nespolehlivý. Ke zhodnocení kvality modelu kalibrace lze využít t-test, který shrnuje tabulka
č. VIII.
- 48 -
Tab. VIII Statistické vyhodnocení jednotlivých kalibrovaných složek sušené syrovátky t-testem Kalibrační složky měrná hmotnost (g/cm3) titrační kyselost vlhkost (%) pH
xREF 0,4257 5,7492 5,0161 6,4934
xNIR 0,4263 5,7496 5,0161 6,4931
SD 0,0027 0,0602 0,1239 0,0196
tstat -0,348 -0,011 0,000 0,030
t1 (krit) 1,699 1,711 1,694 1,696
t2 (krit) 2,045 2,064 2,037 2,040
xREF - hodnoty referenční, xNIR - hodnoty predikované, SD - směrodatná odchylka diference, tstat – T-test, t1(krit) tabulková hodnota při = 0,05, t2(krit) - tabulková hodnota při = 0,01
Při srovnání referenčních hodnot a hodnot získaných spektrometrem T-testem nebyl mezi nimi zaznamenán statisticky průkazný rozdíl (tstat < ttab) ani na hladině významnosti α = 0,05 ani na α = 0,01. Což platí pro všechny kalibrované složky tj. měrnou hmotnost, titrační kyselost, vlhkost i pH. Ke stejnému závěru dospěla i RŮŽIČKOVÁ et al. (2007) při kalibraci titrační kyselosti a vlhkosti u směsí sušeného odstředěného mléka a sušené syrovátky. Literární zdroje uvádí, že DE VILDER a BOSSUYT (1983) určovali obsah vody v odtučněném mléce a plnotučném sušeném mléce získaných nízkým, středním a vysokým tepelným ošetřením mléka na přístroji InfraAlyzer 400. Kalibrace byla aplikována na 54 neznámých vzorků plnotučného sušeného mléka a ukázala směrodatnou odchylku 0,12 u vlhkosti, v 74 vzorcích odtučněného sušeného mléka ukázala směrodatnou odchylku 0,09. Což je v porovnání se směrodatnou odchylkou kalibrace v našem stanovení horší výsledek, protože naše hodnota byla 0,075. Současně BAER et al. (1983) určovali obsah vody v odtučněném sušeném mléce. Směrodatná odchylka kalibrace byla 0,217 a SEP 0,274. Ovšem jako referenční metodu použili destilaci toluenem narozdíl od předchozích autorů, kteří použili jako referenční metodu sušení při 102 °C, což vedlo k vyšším odchylkám. FRANKHUIZEN a VAN DER VEEN (1985) za použití filtrového přístroje, určovali vlhkost asi 300 vzorků odstředěného sušeného mléka. Referenční metoda byla vysoušení. Získali SEC o 0,12 a SEP 0,08. Tyto výsledky jsou srovnatelné s DE VILDER a BOSSUYT (1983), což naznačuje vliv referenční metody pro kalibraci NIR. Také v porovnání našich výsledků s výsledky autorů FRANKHUIZEN a VAN DER VEEN (1985) jsme dosáhli při kalibraci lepších výsledků, naše hodnota SEC byla 0,075, ovšem při validaci se hodnota směrodatné odchylky zvýšila na 0,518. K dosažení lepších výsledků při validaci by bylo nejspíše zapotřebí rozšířit množství kalibrovaných vzorků.
- 49 -
VUATAZ (1990) studoval možnost měření obsahu vlhkosti v dietním sušeném mléce během skladování. Celkem 146 vzorků bylo analyzováno přístrojem InfraAlyzer 500 v rozmezí 1 400 – 2 400 nm. SEC byla 0,03 a SEP 0,05. Hodnoty SEC i SEP jsou v tomto případě lepší než naše získané hodnoty SEC a SEP. Řešením by bylo, jak už bylo
zmíněno
dříve,
optimalizovat
kalibrační
modely
zvýšením
množství
analyzovaných vzorků. BARABASSY a KAFFKA (1993) stanovovali kvantitativní vztah mezi obsahem vody a NIR spektry pro sušené mléko ve vícesložkové směsi. Autoři připravili 152 vzorků, smícháním odstředěného mléka, proteinového koncentrátu, laktózy, a sušené syrovátky v různých poměrech. Spektra byla snímána přístrojem PMC Spectralyzer 1025 v rozmezí 1 000 – 2 500 nm. SEC byla určena 0,098. V tomto případě je naše hodnota směrodatné odchylky kalibrace u kalibračního modelu vlhkosti lepší, a to 0,075. TAKAMURA et al. (1998) se pokusil překonat dlouhou dobu potřebnou pro stanovení vlhkosti sušením při testování různých organických rozpouštědel k extrakci zbytkové vody z mléčných prášků. Jako nejlepší výsledek pro sušené odstředěné mléko byla hodnota SEP 0,398 pro stanovení sušiny sušením. Což dokázalo, že stanovení vlhkosti sušením je stále nejvhodnější referenční metoda pro měření jejího obsahu. Hodnota SEP byla v této analýze opět o něco nižší než hodnota SEP při stanovení vlhkosti v našem případě. RŮŽIČKOVÁ et al. (2007), dosáhla při stanovení vlhkosti SEC 0,204 a SEP 0,237 u směsi sušeného odstředěného mléka a sušené syrovátky (70 vzorků). Což ve srovnání s naší analýzou znamená horší hodnotu SEC (0,075), ovšem opět lepší hodnotu SEP (0,518). Hodnota CCV byla u RŮŽIČKOVÉ et al. (2007) 6,24 %, což přesahuje hranici 5 %. Hodnota PCV hranici 10 % nepřekročila, byla 7,24 %. V případě kalibrace sušené syrovátky v této diplomové práci byla překročena hodnota 10 % u PCV, ale hranice 5 % u CCV překročena nebyla. K vytvoření spolehlivějšího kalibračního modelu by bylo zapotřebí větší množství kalibračních vzorků, jak bylo uvedeno u předchozích autorů. Co se týče stanovení titrační kyselosti RŮŽIČKOVÁ et al. (2007) stanovovala titrační kyselost u směsi sušeného odstředěného mléka a sušené syrovátky (40 vzorků). Kalibrační hodnota korelačního koeficientu byla 0,993, validačního potom o něco málo nižší a to 0,990. SEC byla stanovena 2,84·10-2. Hodnota CCV dosáhla hodnoty 0,46 a 0,90 % a PCV 0,57 a 1,32 %. V porovnání se stanovením titrační kyselosti u sušené syrovátky v naší práci byly hodnoty korelačních koeficientů vyšší (0,876, 0,819) - 50 -
a současně hodnota SEC (0,189), CCV (3,29 %) i PCV (3,81 %) byla nižší. Tudíž kalibrační model v případě stanovení RŮŽIČKOVÉ et al. (2007) byl spolehlivější než kalibrační model uvedený v této diplomové práci.
- 51 -
6 ZÁVĚR Sušené mléčné výrobky hrají důležitou roli ve výživě lidí i zvířat. Jejich výhoda spočívá především v delší době skladovatelnosti. Jsou vyráběny za přísných hygienických podmínek. Jejich využití v potravinářském průmyslu není zanedbatelné. Především stoupá potravinářské a krmivářské využití sušené syrovátky, jako zdroj cenných bílkovin, vitaminů a minerálů. Už není možné tento vedlejší produkt mlékárenského průmyslu vypouštět do kanalizací, jak tomu bylo dříve. A proto je nutné hledat pro syrovátku vhodné využití. Cílem diplomové práce bylo zjistit možnost využití NIR spektroskopie při kontrole jakosti sušené syrovátky NIR spektroskopií. Jedná se o rychlou nedestruktivní metodu, která vzhledem k tomu, že není zapotřebí využití žádných chemikálií, nezatěžuje životní prostředí. Lze ji využít především v analýze majoritních složek, a to nejen mléka a potravin. Její nevýhoda spočívá především v nutnosti kalibrace pomocí referenčních metod. 40 vzorků sušené syrovátky bylo analyzováno chemickými metodami, přičemž byl zjišťován obsah vlhkosti, titrační kyselost, měrná hmotnost a pH. Poté byly proměřeny na spektrometru NIR Nicolet Antaris ve spektrálním rozsahu 10 000 – 4 000 cm-1 se 100 scany s rozlišením 8. Spektra byla měřena pomocí optické sondy v režimu reflektance, každý vzorek byl proměřen dvakrát. Naměřená data byla zkalibrována pomocí algoritmu PLS. Dále bylo využito diagnostického nástroje PRESS. Všechny vzorky byly ověřeny křížovou validací. Statistickými metodami byla zjištěna směrodatná odchylka kalibrace (SEC), směrodatná odchylka validace (SEP), kalibrační variační koeficient (CCV), predikční variační koeficient (PCV) a hodnota korelačního koeficientu R, který v případě kalibrace nabyl hodnot u měrné hmotnosti 0,814, titrační kyselosti 0,876, vlhkosti 0,995 a pH 0,878. V případě validace to bylo u měrné hmotnosti 0,749, titrační kyselosti 0,819, vlhkosti 0,764, a pH 0,864. Překročena byla pouze hodnota PCV u stanovení vlhkosti, a to pouze o 0,33 %, a proto lze všechny kalibrační modely považovat za spolehlivé. Pro srovnání hodnot naměřených pomocí FT-NIR s hodnotami zjištěnými v laboratoři byl použit párový T-test na střední hodnotu, přičemž nebyly prokázány statisticky průkazné rozdíly mezi referenčními metodami a hodnotami zjištěnými NIR
- 52 -
spektroskopií. Na základě zjištěných výsledků je možné považovat NIR spektroskopii za vhodnou metodu pro analýzu sledovaných složek u sušené syrovátky.
- 53 -
7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ASIMOPOYLOS G., SAVVIDIS S., ASIMOPOYLOS N., 2004: On-line monitoring of dairy products with the use of NIR technology. Acta Montanistica Slovaca, 9 (1): 36 – 40. BAER R. J., FRANK J. F., LOEWENSTEIN M., 1983: Compositional analysis of nonfat dry milk by using near infrared diffuse reflectance spectroscopy. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 66: 858 – 863. BANAVARA D. S., ANUPAMA D., RANKIN S. A., 2003: Studies on Physicochemical and Functional Properties of Commercial Sweet Whey Powder. Journal of Dairy Science, 86 (12): 3866 – 3875. BARABASSY S., KAFFKA K., 1993: The application possibilities of the near infrared technique in the non destructive investigation of mixed milk powder products. J. Food Phys., 57: 39 – 48. BEARDSLEE CE., 1948: Dry milks, The Story of an Industry. American Dry Milk Institute, Chicago. BIEN R., 2006: NIR spektroskopie v systému hodnocení jakosti potravin a krmiv NIR instrumentace Perten Instruments. O. K. SERVIS BioPro, s. r. o., Praha. BENITO M. T. J., OJEDA C. B., ROJAS F. S., 2008: Process Analytical Chemistry: Applications of Near Infrared Spectrometry in Environmental and Food Analysis: An Overview. Applied Spectroscopy Reviews, 43 (5): 452 – 484. BURNS D. A., CIURCZAK E. W. (ed.), 2007: Handbook of Near-Infrared Analysis. CRC Press, New York, 876 s. CLARK WS Jr., 1991: Whey processing: history and development, s. 2845 – 2847. In: Hui YH, (ed.) Encyklopedia of Food Science and Technology. Wiley, New York. CLARK WS Jr., 2000: Dry milk, s. 540 – 542. In: Francis FJ, (ed.) Wiley Encyklopedia of Food Science and Technology. Wiley, New York.
- 54 -
COZZOLINO D., DAMBERGS R. G., JANIK L., CYNKAR W. U., GISHEN M., 2006: Analysis of grapes and wine by near infrared spectroscopy. J. Near Infrared Spectrosc., 14: 279 – 289.
ČOPÍKOVÁ J., NOVOTNÁ M., ŠMÍDOVÁ I., SINYTSYA A., ČERNÁ M., 2003: Uplatnění NIR spektroskopie v analýze čokolády. Chemické listy, 97 (7): 571 – 575.
ČSN 57 0529 Syrové kravské mléko pro mlékárenské ošetření a zpracování ČSN 57 0105 Metody zkoušení mléčných výrobků sušených a zahuštěných ČURDA L., KUKAČKOVÁ O., NOVOTNÁ M., 2002: NIR spektroskopie a její využití při analýze mléka a mléčných výrobků. Chemické listy, 96 (5): 305 – 310. DAVIES T., 1998: The history of near infrared spectroscopic analysis: Past, present and future – “From sleeping technique to the morning star of spectroscopy”. Analusis Magazine, 26 (4): 17 – 19. DE VILDER J., BOSSUYT R., 1983: Practical experiences with an InfraAlyzer 400 in determining the water, protein and fat content of milk powder. Milchwissenschaft, 38: 65 – 69. DOWNEY G., ROBERT P., BERTRAND D., KELLY P. M., 1990: Classification of commercial skim milk powders according to heat treatment using factorial discriminant analysis of near-infrared reflectance spectra. Appl. Spectrosc., 44: 150 – 155. DOWNEY G., 1996: Non-invasive and non-destructive percutaneous analysis of farmed salmon flesh by near-infrared spectroscopy. Food Chem., 55: 305 – 311. DUŠEK B., ŠEBELA F., PAVEL J., 1964: Mlékařství. Státní zemědělské nakladatelství v Praze, , 328 s. FORMAN L., 1996: Mlékárenské technologie II. VŠCHT, Praha, 228 s.
- 55 -
FRANKHUIZEN R., VAN DER VEEN N. G., 1985: Determination of major and minor constituents in milk powders and cheese by near infrared reflectance spectroscopy. Milk Dairy J., 39: 191 – 207. GAIANI C., SCHUCK P., SCHER J., DESOBRY S., BANON S., 2007: Dairy Powder Rehydration:
Influence of
Protein State,
Incorporation
Mode, and
Agglomeration. Journal of Dairy Science, 90 (2): 570 – 581. GAJDŮŠEK S., KLÍČNÍK V., 1993: Mlékařství. Vysoká škola zemědělská v Brně, 129 s. GAJDŮŠEK S., 2002: Mlékařství II. MZLU, Brno, 142 s. GAJDŮŠEK S., 2003: Laktologie. MZLU, Brno, 84 s. GARRIDO-VARO A., PÉREZ-MARÍN M. D., GUERRERO J. E., GÓMEZCABRERA A., de la HABA M., J., BAUTISTA J., SOLDADO A., VICENTE F., MARTÍNEZ A., de la ROZA-DELGADO B., TERMES S., 2005: Near infrared spectroscopy for enforcement of European legislation concerning the use of animal byproducts in animal feeds. Biotechnol. Agron. Soc. Environ., 9 (1): 3 – 9. GIANGIACOMO R., NZABONIMPA R., 1994: Approach to near infrared spectroscopy. Bull. Int. Dairy Fed., 298: 37 – 42. HASHIMOTO A., KAMEOKA T., 2008: Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical, Food, and Agricultural Processes. Applied Spectroscopy Reviews, 43 (5): 416 – 451. HERNÁNDEZ G. A., HE Y., PEREIRA G. A., 2006: Non-destructive measurement of acidity, soluble solids and firmness of Satsuma mandarin using Vis/NIR-spectroscopy techniques. J. Food Eng., 77: 313 – 319. HROUZ J., ŠUBRT J., 2007: Obecná zootechnika. MZLU, Brno, 207s. IRUDAYARAJ J., REH CH. (ed.), 2008: Nondestructive Testing of Food Quality. Wiley-Blackwell, Ames, Iowa, 384s.
- 56 -
JANČÁŘOVÁ I., JANČÁŘ L., 2003: Analytická chemie. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 195 s. JANKOVSKÁ R., ŠUSTOVÁ K., 2003: Analysis of cow milk by near-infrared spectroscopy. Czech Journal of Food Science, 21 (4): 123 – 128. KOPÁČEK J., 2007: Oslava mléka. Potravinářský zpravodaj, list potravinářské komory ČR, 5 (8): 1, 3. KOPÁČEK J., 2008: Trh s mlékem a mléčnými výrobky má „zelenou“. Potravinářský zpravodaj, list potravinářské komory ČR, 5 (9): 1, 3. KOPÁČEK J., OBERMAIER O., 2009: Vápník – důvod proč pít mléko – I. část. Svět potravin, (11): 20 – 21. KOPÁČEK J., 2010: Výroba mlékárenských výrobků v 1. pololetí 2010. Potravinářský zpravodaj, list potravinářské komory ČR, 11 (6): 18 – 19. KŘIVÁNEK M., 2009: Nutriční význam mléčných výrobků. Svět potravin, (5): 20 – 21. KUBÁŇ V., KUBÁŇ P., 2007: Analýza potravin. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 203 s. LOVASZ T., MERESZ P., SALGO A., 1994: Application of near-infrared transmission spectroscopy for the determination of some quality parameters of apples. J. Near-infrared Spectrosc., 2: 213 – 221. LUKÁŠOVÁ J., 2001: Hygiena a technologie mléčných výrobků. Veterinární a farmaceutická univerzita, Brno, 180 s. MAHAJAN S. S., GODDIK L., QIAN M. C., 2004: Aroma Compounds in Sweet Whey Powder. Journal of Dairy Science, 87 (12): 4057 – 4063. MARTH E. H., STEELE J. L., 2001: Applied Dairy Microbiology. Marcel Dekker, New York, 744 s. MATĚJKA P., 2008: Spektrometrie v blízké infračervené oblasti. Online [cit. 2010-10-30]. Dostupné na: http://www.vscht.cz/anl/lach2/NIR.pdf - 57 -
MILLER D. D., 1989: Calcium in the diet: food sources, recommended intakes and nutritional bioavailability. Adv. Food Nutr. Res., 33: 103 – 156. MITURA E., KAMINSKI W., 1996: Whey Drying on Porous Carriers. Drying Technology, 14 (2): 381 – 390. MLČEK J., ROP O., ŠUSTOVÁ K., SIMEONOVOVÁ J., GÁL R., 2010: Možnosti využití spektroskopie NIR v masném průmyslu. Chemické listy, 104 (9): 855 – 860. Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 852/2004 ze dne 29. dubna 2004, o hygieně potravin. Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004 ze dne 29. dubna 2004, kterým se stanoví specifické hygienické předpisy pro potraviny živočišného původu. NAZAROV I., WAMPLE R. L., KAYE O., SANTOS A. O., GOULART K., 2005: Near infrared laboratory on shoulder. Information and Technology for Sustainable Fruit and Vegetable Production FRUTIC, 05, 355 – 362. OZAKI Y., MCCLURE W. F., 2006: Near infrared spectroscopy in food science and technology. Wiley-Inetrscience, Hoboken, New Jersey, 424 s. POLESELLO A., GIANGIACOMO R., 1983: Application of near infrared spectrophotometry to the nondestructive analysis of foods: A review of experimental results. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 18: 203 – 237. PROKŠ J., 1965: Mlékařství díl II. Státní nakladatelství technické literatury Praha, 368 s. ROBERTS C. A., WORKMAN J., 2004: Near-infrared spectroscopy in agriculture. American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin, 822 s. ROBINSON R., K. (ed.), 2002: Dairy Microbiology Handbook. WileyInterscience, Inc., New York, 784 s.
- 58 -
RODRIGUEZ-OTERO J. L., HERMIDA M., CENTENO J., 1997: Analysis of dairy products by near-infrared spectroscopy: A review. J. Agric. Food Chem., 45: 2815 – 2819. RŮŽIČKOVÁ J., ŠUSTOVÁ K., 2007: Využití NIR spektroskopie při analýze sušeného mléka. Celostátní přehlídky sýrů 2007, Výsledky přehlídek a sborník přednášek semináře Mléko a sýry, Praha – leden 2007, 190 – 194. SIESLER H. W., OZAKI Y., KAWATA S., HEISE H. M. (ed.), 2002: NearInfrared Spectroscopy: Principles, Instruments, Applications. Wiley – VCH, Weinheim, 361s. SIMEONOVOVÁ J., INGR I., GAJDŮŠEK S., 2008: Zpracování a zbožíznalství živočišných produktů, MZLU, Brno, 124 s. SITHOLE R., McDANIEL R., MEUNIER GODDIK L., 2005: Rate of Maillard Browning in Sweet Whey Powder. Journal of Dairy Science, 88 (5): 1636 – 1645. SPREER E., 1998: Milk and Dairy Product Technology. Marcel Dekker, New York, 483 s. ŠIKOLA J., 2002: NIR SPEKTROSKOPIE – Perspektivní metoda pro kvalitativní a kvantitativní analýzu v potravinách. Kvalita potravin, 2 (4): 18 – 19. ŠUSTOVÁ K., 2005a: Laktologie (návody do cvičení). Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně. ŠUSTOVÁ K., 2005b: Mlékárenské technologie (návody do cvičení). Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně. TAMIME A. (ed.), 2007: Structure of dairy products. Blackwell Publishing Ltd, 304 s. TAKAMURA H., ENDO N., MATOBA T., 1998: Near infrared spectroscopic determination of moisture content in foods: Extraction method by organic solvents. J. Near Infrared Spectrosc., 6: 235 – 240.
- 59 -
TEMMA T., HANAMATSU K., SHINOKI F., 2002: Development of a portable near infrared sugar-measuring instrument. J. Near Infrared Spectrosc., 10: 77 – 83. THOMAS M. E. C., SCHER J., DESOBRY S., 2004: Lactose β-Lactoglobulin Interaction During Storage of Model Whey Powders. Journal of Dairy Science, 87 (5): 1158 – 1166. TRILČOVÁ A., ČOPÍKOVÁ J., COIMBRA M. A., BARROS A. S., KŘÍSTKOVÁ H., EGERT L., SYNYTSYA A., 2005: Využití infračervené spektroskopie při sledování kvality kakaového prášku. Chemické listy, 99 (11): 821 – 824. VELÍŠEK J., 2002: Chemie potravin 1. OSSIS – Ing. Václav Šedivý, Tábor, 344 s. VENTURA M., de JAGER A., de PUTTER H., ROELOFS F. P. M. M., 1998: Non-destructive determination of soluble solids in apple fruit by near infrared spectroscopy (NIRS). Postharvest Biol. Technol., 14: 21 – 27. VUATAZ G., 1990: Some NIR observations of lactose crystallization in milk powders during storage. s. 218 – 234. In R. Biston and N. Bartiaux-Thill (ed.) Proceedings 3rd Int. Conf. on Near-Infrared Spectroscopy, Agricultural Research Centre Publishing, Gembloux, Belgium. VYAS H. K., TONG P. S., 2004: Impact of Source and Level of Calcium Fortification on the Heat Stability of Reconstituted Skim Milk Powder. Journal of Dairy Science, 87 (5): 1177 – 1180. VYHLÁŠKA 638/2004 Sb., kterou se mění vyhláška č. 200/2003 Sb., o veterinárních požadavcích na vaječné výrobky, a vyhláška č. 203/2003 Sb., o veterinárních požadavcích na mléko a mléčné výrobky. WALSTRA P., WOUTERS J. T. M., GEURTS T. J., 2006: Dairy science and technology. CRC/Taylor & Francis, Boca Raton, 782 s. WOLD J. P., JAKOBSEN T., KRANE L., 1996: Atlantic salmon average fat content estimated by near infrared transmittance spectroscopy. J. Food Sci., 61: 74 – 77.
- 60 -
WORKMAN J., WEYER L., 2008: Practical Guide to Interpretive Near-Infrared Spectroscopy. CRC/Taylor & Francis, Boca Raton, 344 s. WU D., FENG S., HE Y., 2008: Short-Wave Near-Infrared Spectroscopy of Milk Powder for Brand Identification and Component Analysis. Journal of Dairy Science, 91 (3): 939 – 949. XIAOBO Z., YANXIAO L., JIEWEN Z. 2007: Using genetic algorithm interval partial least squares selection of the optimal near infrared wavelength regions for determination of the soluble solids content of ‘Fuji’ apple. J. Near Infrared Spectrosc., 15: 153 – 159. ZADRAŽIL K., 2002: Mlékařství : (přednášky). ČZU, Praha, 127 s. ZAHN T., 1993: Near-infrared-transmittance-spectroscopy. A powerful tool for fast process and product control in breweries and malthouses. Monogr. Eur. Brew. Conv., 20: 23 – 31. ZUDE M., HEROLD B., ROGER J., BELLON-MAUREL V., LANDAHL S., 2006: Non-destructive tests on the prediction of apple fruit flesh firmness and soluble solids content on tree and in shelf life. J. Food Eng., 77: 254 – 260.
- 61 -
SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. I Nativní tuková kapénka Obr. II Struktura sušeného odtučněného mléka Obr. III Struktura sušené syrovátky Obr. IV Typy měření NIR Obr. V Herschelův experiment Obr. VI Ukázka spekter sušené syrovátky, konzumního mléka a eidamského sýru Obr. VII Funkce PRESS stanovená u titrační kyselosti sušené syrovátky Obr. VIII Funkce PRESS stanovená u pH sušené syrovátky Obr. IX Grafické vyjádření kalibračních a validačních výsledků stanovení měrné hmotnosti sušené syrovátky Obr. X Grafické vyjádření kalibračních a validačních výsledků stanovení titrační kyselosti sušené syrovátky Obr. XI Grafické vyjádření kalibračních a validačních výsledků stanovení vlhkosti sušené syrovátky Obr. XII Grafické vyjádření kalibračních a validačních výsledků stanovení pH sušené syrovátky
- 62 -
SEZNAM TABULEK Tab. I Pokrytí denní potřeby živin 1 litrem mléka Tab. II Složení syrovátky Tab. III Současná produkce sušených mléčných výrobků Tab. IV NIR analýza potravin Tab. V Výsledky chemické analýzy Tab. VI Kalibrační výsledky Tab. VII Validační výsledky Tab. VIII Statistické vyhodnocení jednotlivých kalibrovaných složek sušené syrovátky t-testem
- 63 -
SEZNAM ZKRATEK AOTF – akusto-optický filtr B – bílkoviny BM – bod mrznutí CCV – kalibrační variační koeficient
ČSN – Česká technická norma ČR – Česká republika DAD – detektor diodového pole EMS – elektromagnetické spektrum EU – Evropská unie FF – pevný filtr FR – Fourierova regrese FT-NIR – Fourierova transformace NIR IČ – infračervený ISO – International Organization for Standardization LCTF – filtr tekutých krystalů LD – laserová dioda MIR – střední infračervená oblast MSC – vícenásobná korekce rozptylu NIR – blízká infračervená oblast NIRS – blízká infračervená spektroskopie NN – neuronová síť PCR – regrese hlavních komponent PCV – predikční variační koeficient PDA – fotodioda PLS – metoda částečných nejmenších čtverců PRESS – predicted residual error sum of squares R – korelační koeficient SEC – směrodatná odchylka kalibrace SEP – směrodatná odchylka validace SH – Soxhlet Henkel SMLR – postupná vícenásobná regrese SMT – sušené mléko plnotučné
- 64 -
SOM – sušené mléko odtučněné T – tuk TF – naklápěcí filtr TPS- tukuprostá sušina UHT – vysokotepelné ošetření VIS – viditelné infračervené spektrum WIF – klínový interferenční filtr
- 65 -