Vízbiológiai Digitális Holografikus Mikroszkóp (DHM), mint korai környezeti vészjelzırendszer

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

NEMZETI TECHNOLÓGIAI PROGRAM 2008

Vízbiológiai Digitális Holografikus Mikroszkóp (DHM), mint korai környezeti vészjelzırendszer SZAKMAI BESZÁMOLÓ MELLÉKLETEK 1/4. MUNKASZAKASZ A projekt beadásának éve Az alprogram / dedikált felhívás kódja és megnevezése Projekt azonosítója Nyilvántartási száma

2008 4. alprogram: Élhetı, fenntartható környezet (A4)

1981822A TECH_08-A4/2-2008-0151 Vízbiológiai Digitális Holografikus Mikroszkóp (DHM), Projekt címe mint korai környezeti vészjelzırendszer Dr. Nagy Tamás Konzorciumvezetı MEDIRLAB Orvosbiológiai Fejlesztı Kft. Témavezetı Dr. Tıkés Szabolcs Konzorciumi tag MTA SZTAKI Témavezetı Dr. Vörös Lajos Konzorciumi tag MTA Balatoni Limnológiai Intézet Témavezetı Dr. Török Tamásné Konzorciumi tag OKI Projekt kezdete 2009. január 1. Munkaszakasz száma 1/4. Munkaszakasz idıtartama 2009. január 1. – 2009. június 30. Projekt honlapja http://www.medirlab.hu/Competitions/DHM

Budapest, 2009. augusztus 31. R-1.1 VERZIÓ

1

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK

2

MEDIRLAB MELLÉKLETEK

4

DHM rendszer mőködésének áttekintése

4

Egyszerősített DHM rendszer mőködésének áttekintése

4

A kamera egységek részletes leírása

4

A 16 elemő PC mátrix részletes leírása

5

Az I/O egység részletes leírása

5

MTA-SZTAKI MELLÉKLETEK

13

SZTAKI-3 MELLÉKLET DHM Teljes Optikai Rendszerterv

13

Bevezetés

13

A víminta sőrítése, preparálása

14

Multi-portos architektúrák elve

15

In-line DHM 4D elıdetektor, színes ROI kamerával

16

In-line DHM, színes kamerával és fluoreszcens detektorral

16

ROI kamerás szembefolyó cellával:

16

Modulok

16

Automatizált sőrítés szőrı berendezés segítségével

16

Megvilágító és gerjesztı fényforrások kiválasztása

16

Mikroszkóp architektúra változatok, konfigurációk különbözı vízbioloógiai alkalmazásokra

17

SZTAKI-3A MELLÉKLET DHM változatok részletes rendszerterve

19

DHM 3D-s rekonstrukciós és alakfelismerı rendszer elektronikai rendszerterve

19

SZTAKI-4 MELLÉKLET A DHM 3D-s rekonstrukciós szoftverének rendszerterve

24

Hullámterjesztési algoritmusok, numerikus hologram rekonstrukció

24

Síkhullám dekompozíciós (irány-spektrum) numerikus diffrakció: terjedés a szabad térben

25

Aberráció kompenzáció digitális holografikus mikroszkóp rendszerben.

33

SZTAKI-5 MELLÉKLET A hullámterjesztés néhány modellje és azok MATLAB implementációi Grafikus felhasználói interfész (GUI) fejlesztıi és hidro-biológusi változata

36

Digitális holografikus mikroszkóp - hologram rekonstrukciós szoftver 2. verziójának dokumentációja 36 SZTAKI-6 MELLÉKLET A DHM 3D-s rekonstrukciós és alakfelismerı szoftverének rendszerterve

43

Áttekintés

43

Követelmények

43

Architektúra

45

2

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Adatfolyam modell

50

Adatbázis

52

SZTAKI-7 MELLÉKLET Grafikus felhasználói felület (GUI) vízbiológusok számára, amely megkönnyíti a morfológiai adatbázis kialakítását, betanítását 55 MTA-BLKI MELLÉKLETEK

59

Szakmai beszámoló I. munkaszakasz

59

OKI MELLÉKLETEK

62

Jogi és szabályozási háttér összefoglalása

62

IVÓVÍZ

62

FELSZÍNI VÍZ

62

Kapcsolatfelvétel vízmővekkel

65

Az adatbázis létrehozásának megkezdése

65

Vízminták elemzése

67

Mintavétel

67

Minta feldolgozás

67

Vízminták értékelése

67

Adatbázis fejlesztés

71

Táblázatok OKI ELİADÁS CÍMLAPJA (2 SECOTOX)

72 ND

INTERNATIONAL CONFERENCE ON CEMEPE AND 75

3

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

MEDIRLAB MELLÉKLETEK DHM rendszer mőködésének áttekintése A digitális holografikus mikroszkópia nagyfelbontású, háromdimenziós képalkotást tesz lehetıvé, hagyományos módszerekkel nem vizsgálható (például folyamatosan áramló, átlátszó) minták esetén is. Az ismert elven elıállított hologramokat egy nagyfelbontású (4 Megapixel), nagy sebességő (200 frame/s) monokromatikus érzékelıvel ellátott kamera egység (1. kamera egység) fogadja. A holografikus jel dekódolása nagy bonyolultságú matematikai mővelet, melynek valós idejő végrehajtása az említett felbontás és képfrissítési ráta mellett különösen nagy számítási teljesítményt igényel. Ezt a 16 egységbıl álló PC mátrix biztosítja. A DHM technológiával együtt, pl. fluoreszcens mikroszkópia elvén alkotott képet a 2. kamera egység érzékeli. A vizsgált minta által emittált fény hullámhosszának (színének) is lehet jelentısége, ezért ebben a kamera egységben a képérzékelı szenzor színes verzióját alkalmazzuk. A kamera által biztosított jel közvetlen információtartalommal bír, ezért egy analóg kimenet is biztosított, amit valós idejő megfigyelésre használhatunk. A digitális kimenet az 1. kamera egységgel megegyezı módon csatlakozik egy PC mátrixhoz. A PC mátrixok kimenetei Gigabit Ethernet kapcsolaton keresztül csatlakoznak egy Switch-hez, ami kapcsolatban áll az irányító-kiértékelı számítógéppel. Ez a PC a megkapott, feldolgozott képtartalmat Ethernet kapcsolaton keresztül, vagy egy rádiófrekvenciás kommunikációs egység segítségével, ANT hálózaton képes továbbítani. Az irányító-kiértékelı PC a szenzoroktól kapott jeleket felhasználva vezérli az I/O egységen keresztül a felvételkészítéshez szükséges fényforrásokat, szelepeket, illetve motorokat. A kamera egységek konfigurálhatók a PC segítségével. A rendszer zavartalan mőködéséhez szünetmentes tápfeszültség-ellátás biztosított. A teljes megvalósítandó 19”-os Elektronikai Rack szekrény és a 16 elemő PC mátrix hardver rendszereket a következı oldalakon mutatjuk be.

Egyszerősített DHM rendszer mőködésének áttekintése Az DHM rendszer egyszerősített verziója egy kisebb mérető, kompakt eszköz. A méretcsökkentés ára a kisebb számítási kapacitás, ami korlátozza a térbeli és idıbeli felbontást. Az eszköz ANT hálózaton keresztül távolról vezérelhetı, a mérési eredmények is ilyen módon érhetık el.

A kamera egységek részletes leírása A kamera egységekben az érzékelni kívánt fényjel, a megfelelı optikai illesztésen keresztül egy 4 megapixel (2352x1728) felbontású 200 FPS sebességő mőködésre alkalmas CMOS képérzékelı szenzorba érkezik. A szenzor beépített ADC-kkel (analóg-digiális átalakító) rendelkezik, így az érzékelt jel digitalizált formában, közvetlenül juthat a FIFO (First In – First Out) szervezéső memória modulba. A szenzor kiolvasása külsı vezérlést igényel. Ezt a feladatot az I. számú CPLD (Complex Programmable Logic Device) látja el, elıállítva az órajelet, az aktuálisan kiolvasandó sor

4

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

címzését, valamint a további szükséges vezérlıjeleket. Ugyanez az IC vezérli a FIFO memória írását, amelybe a szenzor 16 darab kimeneti portjáról érkezı digitális jel íródik. A FIFO memória lecsökkenti az adatbusz szélességét a könnyebb adattovábbítás érdekében, így kimenete egy 8 bit széles buszon keresztül áll kapcsolatban a II. számú CPLD-vel. A CPLD II. felelıs a szenzor beállításáért, kalibrálásáért is. Egy többcsatornás DAC-t (digitális-analóg átalakító) vezérelve állítja elı a szenzor AD átalakítóinak mőködéséhez és kalibrációjához, valamint a sötétáram kivonásához szükséges referencia feszültségeket. A kameraegység digitális jelkimenetét a CPLD II. állítja elı, amely a 16 elemő PC mátrixban kerül további feldolgozásra. Az analóg kimenettel is rendelkezı kameramodulban a szenzor kimenete csökkentett felbontással (csak minden második sor minden második pixele kerül felhasználásra) két DPRAM (DualPorted RAM) modulba is beíródik (a CPLD I. vezérlésével). A két DPRAM modul tartalmát felváltva olvassa ki a CPLD III., majd az adatokat megfelelı formában egy Video Encoder-nek továbbítja, ami analóg videókimenetet szolgáltat a valós idejő megfigyeléshez. Mivel a kamera egységekben analóg és digitális mőködéső alkatrészek is vannak, két tápfeszültség-forrás szükséges. Ezeket egy-egy lineáris mőködéső feszültség-szabályozó IC állítja elı.

A 16 elemő PC mátrix részletes leírása A PC mátrixban párhuzamos feldolgozás történik, így minden elem a kamera egység digitális kimenı jelének csak egy részét kapja meg. Az adatot egy FPGA fogadja, majd továbbítja egy FIFO memória felé. A HEX CPU feldolgozó egység PCI Express buszon keresztül fogadja az adatokat, ezért szükséges egy memória busz – PCIe busz illesztı IC. A HEX CPU munkáját egy nagy számítási teljesítményő másod-processzor segíti. A PC mátrix elemeinek kimenı jele Gigabit Ethernet kapcsolaton keresztül egy hálózati Switch-be fut be, ami az irányító-kiértékelı PC-vel áll kapcsolatban.

Az I/O egység részletes leírása Az I/O egységhez csatlakoznak a szenzorok kimenı jelei. Ezek analóg jelkondicionálás után digitalizált formában jutnak az egység mőködését vezérlı FPGA-ba, majd onnan a megfelelı illesztés után az irányító-kiértékelı PC-be. Amennyiben szükséges, a PC vezérlı utasításokat ad ki, melyek alapján az FPGA egy DAC-t hajt meg. Az átalakító analóg jelét megfelelıen erısítve kapjuk a fényforrások, szelepek illetve motorok mőködéséhez szükséges feszültségeket. A kamera egységek mőködése az irányító PC által, az I/O egységen keresztül konfigurálható.

5

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

19”-os ELEKTRONIKAI RACK SZEKRÉNY

6

MELLÉKLETEK

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

16 elemő PC mátrix

7

MELLÉKLETEK

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

8

MELLÉKLETEK

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

9

MELLÉKLETEK

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

10

MELLÉKLETEK

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

11

MELLÉKLETEK

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

12

MELLÉKLETEK

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

MTA-SZTAKI MELLÉKLETEK SZTAKI-3 MELLÉKLET DHM Teljes Optikai Rendszerterv Bevezetés A kitőzött feladat elvégzéséhez több optikai architektúra kipróbálására van szükség. Ezek különböznek majd az elérhetı felbontás, átvizsgálható térfogat (bonyolultság, feldolgozás igény, képminıség stb.) tekintetében. Kísérleti kipróbálásuk szükséges az optimális elrendezés (feladattól függı) kiválasztásához. Mindazonáltal, bizonyos egységek minden elrendezés esetén hasonlóak lesznek, ezért ezen modulok optimalizált összeállítása, megtervezése fontos feladat. Általános megjegyzések Mivel alakfelismerés a cél, ezért mindenképp csak egy kombinált – hagyományos, fluoreszcens és digitális holografikus elemeket tartalmazó – mikroszkóp összeállítása vezethet eredményre. A feladattól függ, hogy mennyi a felismerendı célobjektum száma, illetve mennyi egyéb szennyezés (buborék, törmelék, homokszemcse) található az átvizsgálandó térfogatban. Amennyiben nagyon ritkán fordulnak elı objektumok (csapvíz, kútvíz), akkor nagy térfogatott kell átvizsgálni a megfelelı statisztikai becslés eléréséhez. Ellenben, ha sok célobjektum van (sőrő minták,sőrő szőretlen vizek) akkor kisebb térfogat átvizsgálása elegendı, viszont valószínőleg sokkal több a szennyezés, tehát sokkal fontosabb, informatívabb a fluoreszcens elıfeldolgozás után vizsgálni a mintákat. A holografikus elrendezés elınye a hagyományos mikroszkópiával szemben a nagy átvizsgálható térfogat. Azaz ekkor a hagyományos mikroszkópiában megszokott nagy felbontáshoz tartozó kicsiny mélységélesség nem limitálja az átvizsgálható térfogatot. Ugyanakkor, a koherens megvilágítás (koherens optikai átviteli függvény és speckle zaj) és az inline elrendezés ikerképe – amely a nagyobb látótér biztosításához elkerülhetetlennek látszik komoly zajokat visz a rendszerbe, ami jelentısen nehezítheti az alakfelismerés megvalósítását. Ezeknek a zajoknak a csökkentése még jelentıs kutató-fejlesztı munkát igényel. Nagyobb felbontáshoz kisebb látótér és mélységélességi tartomány, így kisebb látótérfogat tartozik, tehát bármilyen architektúrát alkalmazzunk is, kompromisszumot kell kötni az átvizsgálható térfogat és az elérhetı felbontás között. A vizsgálandó mkroszervezetek mérettartománya nagyságrendekkel különbözhet egymástól és a konkrét alkalmazás illetve az adott víztestben elıforduló és vizsgálandó szervezetek méreteihez kell minden esetben a berendezést, illetve azok egyes alegységeit méretezni.

13

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

A víminta sőrítése, preparálása Eddigi kísérleti eredményeink alapján a mérendı minták elıkészíétsére, preparálására több féle megoldás dolgozható ki és az adott alkalmazás körülményeitıl függ, hogy melyiket célszerő alkalmazni. Mérıcella céljára – egyik megoldásunk szerint átfolyó rendszerő berendezést használunk. Erre azért van szükség, hogy a szín információit ki tudjuk nyerni (illetve nagyfelbontású képet tudjunk róla készíteni). Ahhoz hogy a mérés helyén megfelelıen lamináris legyen az áramlás a mérıcellában, illetve, hogy a különbözı optikai elemek fizikailag elférjenek nagy munkatávolságú objektívet, kell alkalmazni. Kompromisszumot kell kötni az elérhetı felbontás és az átvizsgálható térfogat között. Tipikus esetben 1µm laterális felbontás látszik megfelelınek. Ekkor a kisebb (nem a legkisebb) objektumok még megkülönböztethetıek, és nem csökken le az átvizsgálható térfogat elfogadhatatlanul kicsiny szintre. (1µm felbontás, ~5µm mélységélesség, ~1 mm látótér). Ez a hagyományos színes mikroszkóp portra vonatkozik. Az élı anyanak a holt anyagtól való szétválasztására mindenképpen egy elıdetektort, egy un. esemény-detektor portot kell létrehoznunk. Az eseménydetektor megvalósítására többféle koncepciót dolgoztunk ki. A klorofilt és fikobiliproteineket tartalmazó növényi szervezetek illetve cianobaktériumok, valamint a fluorokróm anyagokkal megjelölhetı zooplankton és férgek elıdetektálására a fluoreszcenciamikroszkóp port bizonyult a legalkalmasabnak. Ezt kísérletileg is sikerült igazulni. Kidolgoztuk egy digitális holografikus mikroszkópiai (segéd-DHM) elıdetektor elvét is, ennek kísérleti igazolása a következı munkaszakasz feladata lesz. Elıször a lehetséges architektúrák vázlatos összeállítását mutatjuk meg, aztán az egyes modulok optikai, elektro-optikai, illetve a szükséges algoritmusokkal, idızítésekkel kiegészített tervét vázoljuk.

14

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Multi-portos architektúrák elve A következı ábra egy off-axis DHM sokportos elvi vázlatát szemlélteti: Nagyfelbontású kamera

Sárga szőrıs fluoreszcens kamera

Tubus lencse

Vörös szőrıs fluoreszcens kamera

Lézer

Megvilágító fényforrások

Objektív

Átfolyós cella

15

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

In-line DHM 4D elıdetektor, színes ROI kamerával Egy Digitális holografikus mikroszkóp vizsgál egy térfogatot viszonylag kis felbontással (256x256 512x512). Így a ritkán áthaladó objektumokról megfelelı idızítéssel mindig a fókuszsíkba érkezésükkor készítünk felvételt.

In-line DHM, színes kamerával és fluoreszcens detektorral A fluoreszcens kamera (piros négyszög) folyamatosan méri a kék LED-es EPI megvilágítással az algák klorofillje és/vagy a fikobiliproteinek által kiváltott fluoreszenciát. Amikor változást érzékel, akkor lekapcsolja a kék/zöld megvilágítást (LED vagy lézer) és felvillantja a fehér LEDet (szürke négyszög). Így az objektumok fluoreszenciája alapján az algák elválaszthatók a törmeléktıl.

ROI kamerás szembefolyó cellával: Ebben az elrendezésben egy kis felbontású kamera (esemény detektor; piros négyszög) méri egy bizonyos mélységben az objektumokat igen nagy sebességgel (1000 frame/sec). Amennyiben észleli hogy a fókuszsíkján áthalad egy objektum akkor az objektum pozíciójának megfelelı helyen (ROI) és megfelelı késleltetéssel egy sorozatfelvételt készíttet egy nagy felbontású szenzorral (zöld négyszög). Így a sorozatfelvételben (1000 frames/sec) mindig lesz az objektumról készített olyan képkocka, amelyen pont a fókuszban van.

Modulok Ugyan az in-line holografikus elrendezésnél az ikerkép és a nullad rend zaja nem elválasztható, mégis érdemes ezt használni az off-axis elrendezéssel szemben, mert így nem csökken jelentısen a rendszer látómezeje (off-axis esetén ~1/3-ára csökkén a látótér).

Automatizált sőrítés szőrı berendezés segítségével Nem csak az átfolyós cellás megoldást dolgoztuk ki, hanem alternatív tárgyprepalási eljárásokkal is végeztünk sikeres kísérleteket: Az esetek nagy többségében – különösen a kútvizek és a csapvíz esetében – elınyös a vízben levı mikroszervezetek sőrítése. Erre kétféle módszert szokás alkalmazni: a centrifugálást vagy/és a mikropórusos szőrı papiron (cellulóz vagy polikarbonát) történı vákuummal segített sőrítést. Eddigi kísérleteink azt mutatták, hogy célszerőnek tőnik az utóbbi eljárás részletes kidolgozása is és alkalmazásfüggı bevezetése. A DHM rendszer felügyelet nélküli mőködtetéséhez elengedhetelen a szőrés teljes mértékü automatizálása és a szürt mintának a mikroszkóp tárgyterébe helyezése robotizált módon.

Megvilágító és gerjesztı fényforrások kiválasztása A fényemittáló diódák (LED-ek) fejlıdése és alacsony beszerzési költségei lehetıvé teszik, hogy – a hagyományos mikroszkópiában alkalmazott költséges megoldásoktól eltérıen – LED fényforrásokat alkalmazzunk mind fehérfényő megvilágító lámpaként, mind fluoreszcencia gerjesztı fényforrásként. Elvégzett kísérleteink igazolták elképzeléseinket. Nagy koherenciájuk miatt a DHM porthoz lézerdiódákat (LD-ket) és frekvencia-kétszerezett YAG lézert alkalmazunk.

16

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

A különbözı hullámhosszakon mőködı lézerek egyidejüleg betölthetik a fluoreszcencia-gerjesztı fényforrás szerepét is.

Mikroszkóp architektúra változatok, konfigurációk különbözı vízbioloógiai alkalmazásokra Többféle kombinált sokportos DHM architektúra deszkamodelljét terveztünk meg, néhányat megépítettünk és sikeres méréseket, megfigyeléseket végeztünk. Szellemi jogvédelmi okokból (a szabadalmak benyújtása folyamatban van) jelen beszámolónkban részletes leírást, mérési jegyzıkönyvet és rajzokat nem ismertetünk. Fluor+ white 3D-s képe:

Fluor+white+RED DHM 3D-s képe:

17

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Fehér LED

Köhler megvilágítás

Mintatartó Mikroszkóp objektív Algák

Dichroikus tükör

405nm LED

CCD kamera

Az elsı megépült fluoreszcens mikroszkóp. Klorofil A autofluoreszcens és 450-700nm közötti színes kép felvételére alkalmas

18

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

SZTAKI-3A MELLÉKLET DHM változatok részletes rendszerterve DHM 3D-s rekonstrukciós rendszerterve

és

alakfelismerı

rendszer

elektronikai

Az alábbi ábra mutatja a teljes rendszer három fı rétegét. A fizikai kontroll réteg felelıs a fényforrások, kamerák, szőrık, mechanikai modulok megfelelı, szinkronizált mőködtetésért. Feldolgozó réteg (SW és futtató HW) Feladatai: kontroll, eseménydetekció, holografikus rekonstrukció, analízis és klasszifikáció Fizikai kontroll réteg (tápforrások, kontrol vezetékek, trigger áramkörök, vezérlı kártyák) Feladatai: az optikai réteg áramellátása, kontroll és trigger jelek a fényforrások és kamerák számára, adatvonal biztosítása Optikai réteg (objektívek, lézerek, LED-ek, kamerák) Feladatai: fluorescens, normál, holografikus képalkotás és érzékelés

A DHM rendszer horizontális rétegei A fizikai kontroll réteg elemei

• • • •

Áramellátást biztosító tápegységek Kontrol jeleket szolgáltató egység Kamera adatot fogadó egységek (pl. frame grabber kártyák) Egyedi tervezéső áramkörök (pl. optokapu, speciális vezérlı és adat egységek)

A kontroll jeleket szolgáltató egység nagy valószínőséggel egy PC bázisú vezérlı kártya lehet, amely több analóg és digitális vezérlı jelet képes programozottan kiadni illetve fogadni. Elérhetıek olyan rendszerek is, amelyek több kamera fogadása mellett kontroll jeleket is tartalmaz. Ezáltal lehetıvé válhat a teljes rendszert integráltan kezelı modullal történı megvalósítás.

19

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Computer

data

Control module

Camera 1.

Camera k.

Light 1.

Light k.

Mechanic module

Power 1.

Power k.

Power n.

Fizikai kontroll réteg elvi felépítése A fizikai kontroll réteg feladatai közé tartozik a megvilágító egységek összehangolt, szinkronizált vezérlése, a kamerák triggerelése, speciális érzékelık pl. optokapuk vezérlése és kimenı jeleik feldolgozása, mechanikai egységek (pl. szőrık, adagolók, mozgatók) irányítása. Vezérlési szekvenciák Jelen stádiumban pontos mőködtetési eljárást nem lehet specifikálni, mivel a kutatási szakaszban számos alternatívát szükséges kipróbálni és tesztelni. Az egységek vezérlése során 10-100 ms-os megvilágítási és expozíciós idık valószínősíthetık az eddigi kísérletek szerint, így ezek kontrollját nagy biztonsággal meg tudjuk valósítani a jelenleg piacon kapható eszközökkel. Az alábbiakban a mőködési módok számos alternatíváját mutatjuk be mint lehetséges megoldásokat. A következıekben feltételezzük, hogy a minta folyamatosan átáramlik a vizsgálati részben. Az alábbi üzemmódban a holografikus egység három rövid idejő expozícióval készít több felvételt (stroboszkóp szerően) egy képre. Az áramlási sebesség olyan módon kerül kiválasztásra, hogy egy objektum legalább kétszer teljes terjedelmében látható legyen a felvételen. Ezzel lehetıség adódik az objektum helyének és várható megjelenési idejének meghatározására a normál kamera fókuszsíkjában. Ennek ismeretében történik a normál kamerával a felvétel. Az ábra szerint a normál kamera információjának feldolgozása után lehet újabb holografikus felvételt készíteni. Ebbıl adódik ki a mőködtetési sebesség. Ez a mód a kezdeti kísérletek idején fog ebben a formában megvalósulni, a késıbbiekben a feldolgozás „off-line” módon történhet a képfelvételtıl függetlenül. Így a rendszer tényleges sebességét a holografikus rész fogja meghatározni.

20

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Holographic Microscope 3-flash mode Light - Laser

3-flash mode

Exposure Read Analysis

Operation Normal Color Microscope Light - LED Exposure

Read Analysis

Operation

Holografikus és normál egység vezérlése A következı vezérlési szekvencia az autofluoreszcens és normál kamerát mutatja. Ebben a módban az esemény detektor szerepét tölti be az autofluoreszcens kamera, amely egyben arról is ad információt, hogy mely objektumok hol és mekkora méretben láthatóak. Itt is olyan módon valósul meg a vezérlés, ahol a megvilágítások szétváltan kerülnek alkalmazásra. A késıbbiekben lehetséges lehet az egyidejő mőködtetés is. Autofluorescence Microscope Light - LED Exposure Read Analysis

Operation Normal Color Microscope Light - LED Exposure

Read Analysis

Operation

Autofluoreszcens és normál egység vezérlése A következı üzemmódban az eseménydetekció szerepét egy fotokapu látja el. Ez mőködhet normál, látható tartományban, vagy az ábra szerint autofluoreszcens effektust kihasználva. Mőködést tekintve ez lehet a leggyorsabb megoldás, feltételezve, hogy a kamera adatainak feldolgozása a képkészítéstıl függetlenül valósul meg. A fotodetektor jelei triggerelik a normál kamera megvilágítását és magát a kamerát is. Új esemény csak a normál kamera adatának kiolvasása után indíthat újabb felvételt, illetve kamerától függıen (pl. rolling shutter, belsı buffer) ez történhet korábban is.

21

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Autofluorescence Detection Light - LED Detector Enable Normal Color Microscope Light - LED Exposure Read 1

Camera

Read 2 Analysis 1

Operation

Analysis 2

Autofluoreszcens detekció és normál egység vezérlése A következı vezérlési szekvencia azt mutatja, ahol a holografikus és autofluoreszcens egység is szerepet kap az eseménydetekcióban, és az együttes elemzés alapján kerül sor a normál kameraegység vezérlésére. Ebben a módban a normál kamera adatának kiolvasásakor már tudható, hogy mely objektumok autofluoreszcensek, ezzel a klasszifikációt is segítve. Holographic Microscope 3-flash mode Light - Laser

3-flash mode

Exposure Operation

Read

Analysis

Autofluorescence Microscope Light - LED Exposure Operation

Read Analysis

Normal Color Microscope Light - LED Exposure Read Analysis

Operation Time period

22

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Holografikus, autofluoreszcens és normál egység együttes vezérlése Az alábbi vezérlési szekvencia arra ad példát hogyan kombinálható a fotodetektor (itt autofluoreszcens) és az autofluoreszcens és a normál kamera. Azt az esetet tételeztük fel, hogy a detektor trigger jelére elıszır az autofluoreszcens kamera, majd utána a normál kamera készít felvételt. Feltételeztük, hogy a két megvilágításnak függetlennek kell lenni, így a két kamera is más-más fókuszsíkban helyezkedik el. Ehhez kell igazítani az áramlási sebességet is. A maximális ismétlési frekvenciát (végsı soron az átvizsgálható folyadékmennyiséget) a két kamera expozíciós ideje és adat transzfere határozza meg. A feldolgozás itt is „off-line” módon történik. Autofluorescence Detection Light - LED Detector Enable Autofluorescence Microscope Exposure Read A1

Camera

Read A2 Analysis A1

Operation Normal Color Microscope Light - LED Exposure Camera

Read N1

Read N2 Analysis N1

Operation Time period

Autofluoreszcens és normál mikroszkópok szinkronizált vezérlése autofluoreszcens esemény hatására Alternatív megoldásként felmerült a folyamatos minta áramoltatás helyett, hogy a folyadékot elsı lépésben sőrítjük, és egy speciális szőrın fogjuk fel. Ezután ezt az elıkészített mintát a mikroszkóba helyezve történik a különbözı kamerákkal a vizsgálat. Ehhez a sőrítési, szőrési, mintatartóba helyezést kell automatizálni a képkészítés mellett. Jelenleg ennek az elvi lehetıségeit kell még tisztázni, pl. vizsgálható-e a szőrı anyagon lévı minta, anélkül, hogy a felismerést megakadályozná.

23

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

SZTAKI-4 MELLÉKLET A DHM 3D-s rekonstrukciós szoftverének rendszerterve
Elkészült a DHM 3D-s rekonstrukciós szoftverének rendszerterve, ezek a különféle DHM változatok szerint különbözıek o Továbbá a hullámterjesztés néhány modellje és azok MATLAB implementációi

Hullámterjesztési algoritmusok, numerikus hologram rekonstrukció A DHM mőködésének kulcskérdése az, hogyan tudjuk a CCD/CMOS kamerával felvett hologramból rekonstruálni a tárgyhullámot és továbbterjesztésével képalkotásra bírni. A terjesztés során alkalmazhatunk numerikus lencséket, illetve fáziskorrigáló numerikus lemezeket a valódi optikai lencsén, illetve az egész optikai rendszeren, valamint a numerikus terjesztés során fellépı torzítások és aberrációk kompenzálására. Többféle hullámoptikai modell létezik, melyeket algoritmizálva numerikusan implementálhatunk. A fény transzverzális elektromágneses hullám, melynek terjedését szigorúan csak polarizált vektorhullámként modellezhetjük. Azonban a fénymikroszkópiában a nem túl nagy felbontások tartományában a fényhullám terjedése jól közelíthetı skaláris modellekkel. Sıt a skaláris hullámokra további közelítı modelleket is alkottak. Azonban a mai nagyteljesítményő számítógépekkel többé nem szükséges a számítás igényes módszereket mellıznünk. Numerikus diffrakció Leegyszerősítve a következı modelleket érdemes figyelembe vennünk: 1. Huygens konvolúciós módszer (gömbhullám közelítés) 2. Fresnel-transzformációs módszer (parabolikus approximáció) 3. Síkhullám dekompozíciós (irány-spektrum) módszer Ezek közül az utolsó, a síkhullám dekompozíciós (síkhullámok irányspektruma) módszert érdemes alkalmazni, mivel ez írja le a legpontosabban a skaláris hullámok terjedését. A hologram síkjából kilépı hullámok síkfelületen értelmezett komplex függvények – melyek a hologramban rögzített intenzitás eloszlásnak és az azt „megvilágító” rekonstruáló hullám függvény szorzatai. Ezeknek a Fourier komponensei különbözı szögekben elhajlított súlyozott amplitúdójú síkhullámoknak felelnek meg. Tehát az igen hatékony FFT (gyors Fourier transzformációs) algoritmusokkal egyszerő módon számíthatjuk a hullámterjedést. Az így rekonstruált tárgyhullámokat olyan távolságra kell terjesztenünk, ahol a tárgy valamely pontjai leképzıdnek (fókuszálódnak.). Mivel hologrammal térbeli testekrıl fázisérzékenyen rögzítünk információt, a hullámterjesztés során különbözı képsík távolságokban kapjuk vissza a tárgy különbözı síkjait. Ez a módszer teszi lehetıvé, hogy egyetlen expozícióval felvett hologramból rekonstruáljuk a víz különbözı mélységeiben úszó szervezetek térbeli, síkonkénti képét. Illetve felvételsorozatból lehessen azok térbeli mozgását követni.

24

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Síkhullám dekompozíciós (irány-spektrum) numerikus diffrakció: terjedés a szabad térben 1 síkhullám-dekompozíció → propagáltatás → kompozíció ≡ Fourier-transzformáció → szorzás a terjedési faktorral → inverz-Fourier-transzformáció, → négyzetre emelés. Így a receptünk arra, hogy a fényt (annak komplex amplitúdóját) a z = 0 helyrıl a z = d távolságra propagáltassuk a szabad térben: 1. Számoljuk ki az f ( x, y , z = 0) függvény F (ν x ,ν y , z = 0) = F [ f ( x, z , = 0)] Fouriertranszformáltját.

F (ν x ,ν y , z = 0) Fourier-transzformáltat az e ( − i ⋅k z ⋅d ) 2. Szorozzuk meg az fázistényezıvel (ami valójában a síkhullám térfrekvencia átviteli függvénye).

terjedési

3. Számoljuk ki az inverz Fourier-transzformáltat, így megkapjuk a diffrakciós komplex amplitúdót a z = d távolságban: f ( x, y, z = d ) = F −1 [ F (ν x ,ν z , z = d )] , ez tartalmazza a hullámfront magnitúdóját és fázisát is. Az utóbbi a fáziskontraszt numerikus szimulálásában játszi fontos szerepet. 4. Számoljuk ki a komplex amplitúdó négyzetét így megkapjuk a diffrakció intenzitás képét a z =d helyen: I ( x, y, z = d ) = [ f ( x, y, z = d )] 2 . Ez a módszer skaláris hullámokra approximációmentes, ellentétben a Fresnel- vagy a Fraunhoffer-közelítésekkel. Viszont számolni kell azzal, hogy mind a CCD véges mérete egy ugrásfüggvényekkel leírható ablakot jelent, melynek a Fourier-komponensei teleszórják a teret, mind a terjesztés során a transzverzális síkokat reprezentáló mátrixok mérete véges. Ezért simító ablak-függvényekre és megnövelt mátrix méretre van szükség (zéró-padding) van szükség. Felmerül a következı kérdés: Melyik a legmegfelelıbb simító ablak-függvény (apodizáló függvény)?

Gauss, Blackman, Henning, Hamming, blur-rölt ablak? Ezekkel kell megszorozni a bemenı képet, a CCD által felvett hologramot, as terjesztett közbensı hullámfrontokat. Mekkora az optimális keret (zéróval feltöltött, és simitó függvénnyel megszorzott keret).

Nyquist kritérium az interferencia csíkok CCD által detektálható maximális térfrekvenciája: f x = 1 /(2 p ) , ahol p = ∆x a pixel-lépés (pitch).

 λ   Ekkor a fény sugarak között megengedhetı legnagyobb szög: θ ≤ θ max = arcsin  2p  1

Itt szabad téren vákuumot vagy homogén izotróp közeget értünk.

25

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Reconstruction Algorithm Loading hologram image matrix (H) Loading reference beam image matrix (R) Ψ=H-R Convolve Ψ with G

G… Kernel function of reconstructing plane wave Fourier transform

Focus Reached?

Save reconstructed image

26

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Az alábbi képsorozat a hullámterjesztés szimulációját mutatja be. Itt a hologram felvétel egyébként optikai szakaszát is szimuláljuk. A rekonstrukció mindenképpen numerikus.

Hologram konstrukció

1. Monokromatikus fényforrás, hullámhossz: λ továbbterjesztés z1 távolságba

2. Elsı tárgy (k) megvilágítása továbbterjesztés z2 távolságba (diffrakció)

3. Második tárgy (p) megvilágítása továbbterjesztés z3 távolságba (diffrakció)

4. Két tárgy diffrakciós képe a lencsén kicsinyítés, fókuszálás, majd nagyítás

5. A hologram síkjában kapott kép megvilágítása a referencianyalábbal (konstruált hologram)

Konkrét adatok (offaxis_simulation_pinholesource_toprightfilt.m)

• • • • • • • • • • • •

fényforrás: Gauss-féle, 5x5 pixeles Blackman-nel filterezett λ: 0.5e-3 p: 5e-3 (pixelméret) képernyı szélesség, magasság (w,h): 512p, 512p fényforrás és obj1 távolság: 4 obj1 és obj2 távolság: 2 obj2 L távolság: 24 f: 16 L H távolság: 48+1 referencia: off-axis, Blackman(w,460) filter: jobb felsı képrészlet középre helyezése rekonstrukció: 12mm-ig, referencia hullámmal

27

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

A hologram

1.kép

2.kép

Két tárgy diffrakciós képe a hologram síkjában

A filterezett hologram

28

MELLÉKLETEK

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

Hologram rekonstrukció

6. Hologram megvilágítása a referencia fénnyel másodszor (ikerképhez filter) továbbterjesztés z irányban

7. Rekonstrukció (nulladrendő és ikerkép megjelenése)

Nulladrendő kép és ikerkép megjelenése zajként hat

29

megoldás: szőrı használata

MELLÉKLETEK

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

A rekonstruált elsı objektum képe

3.kép

4.kép

Az elsı tárgy (k) eredeti képe

Az elsı tárgy (k) rekonstrukciója

30

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

A rekonstruált második objektum képe

5.kép

6.kép

A második tárgy (p) eredeti képe

A második tárgy (p) rekonstrukciója

31

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Reconstruction algorithm with convolution flowchart

Inputs: lambda wavelength in millimeters p pixel pitch of the CCD N pixel number in a row L distance between pinhole and CCD T the picked intensity image n number of requested reconstructions d1 and d2 are the minimal and maximal distance between the pinhole and the requested reconstructions.

Set U:= FFT ( T )

YES

Loop m from 0 to n1 Loop over?

Set d:=d1+(d2-d1)*m/n

Set G:= FFT( convolution kernel )

Set O:= iFFT (U*G)

Shift O by N/2 in both directions and divide by N*N

Write the amplitude of O into an image file

32

END

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Aberráció kompenzáció digitális holografikus mikroszkóp rendszerben. A használt objektív és a referencia nyaláb hibái aberációnak felelnek meg ami a rekonstruált tárgyak jelentıs torzulását okozhatják. Célunk ezen hibák szőrése minimalizásása. Meg kell mérni milyen hibákat okoz a leképzı rendszer és kompenzálni kell azokat. Ez DHM esetén elsısorban digitális fázismaszk illetve megfelelı algoritmikus módszerek igénybevételét jelenti. Sok olyan hiba kijavítható, kompenzálható amely hagyományos mikroszkóppal nem. Ugyan hagyományos mikroszkópia esetén a használt objektivek aberációja kicsiny, de ez csak egy síkra (a tervezett fókuszsíkra) teljesül. Mivel DHM esetén egy nagyobb térfogatról készítünk három dimenziós rekonstrukciót így az aberációmentes leképezés már nem teljesül mindenhol automatikusan. Olcsó lencsék használata esetén még egy síkban sem teljesül az hogy kicsinyek az aberrációk. Holografikus mikroszkópia esetén a tárgy képének komplex amplitúdóját mérjük és így esély van a torzítások teljes kompenzációjára. Elıkísérleteket végeztünk ahol azt mértük fel milyen hatása van a különbözı mértékő aberrációknak a leképezésre és illetve ha azokat rossz síkban probáljuk kompenzálni. B C C A

D

F

E

Az eredeti teszt ábra (A) hullámfrontja áthalad egy aberráción (B) akkor a fáziseloszlása módosul (C) és a rekonstruált képe torz lesz (D). Amennyiben ezt kompenzáljuk, kivonjuk az aberrációkat (E) a hologram síkjában akkor jobb, de természetesen nem tökéletes rekonstrukciót kapunk (F). Korábbi eljárások során azt mérték a rekonstruált tárgy sima felületein hogyan lehet egyenletes, sima fáziseloszlást létrehozni. Tették ezt úgy, a kompenzációt kétdimenziós polinom alakban keresték a hologram síkjában. Ezzel jelentısen lehetett csökkenteni az aberációkat és gyakorlati esetekben is megvalósítható, mérhetı volt. Viszont a kompenzáció a hologram síkjában történt (legalábbis a polinóm paramétereinek az illesztéséhez az aberráció valódi helyét nem használták fel). Megvizsgáltuk hogyan változnak a különbözı aberáció komponensek a terjesztés során. Úgy tőnik érdemes olyan alakban keresni (sorbafejteni, polinom alakban) ami tartalmazza az aberráció pontos helyét is. Így talán jobban illeszthetık kisebb fokszámú polinomok használhatók és a kompenzáció így pontosabb lesz. A mérés nagyon hasonló a korábban használt módszerhez de a teszt tárgy sima részeit nem csak a hologram síkjában próbáljuk kompenzálni hanem a számított aberráció síkjában. Így nem csak a referencia hibái (például a referencia ferdesége és nem tökéletesen sík vagy annak egy nagyítással megfelelı gömbhullám volta) lesznek egyszerően javíthatóak, hanem a mikroszkóp

33

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

objektív aberrációi is. A meghatározás menete igen egyszerő. A szükséges digitális fázismaszkot két elem összegeként keressük. Egyrészt a referencia aberrációjaként (ferdesége az off-axis holografikus elrendezés következménye míg a nem tökéletes síkhullám mivolta a használt lencsék hibáiból erednek. Másrészt a tárgy leképezését végzı mikroszkóp objektív hibái. Ha kihasználjuk a holografikus rendszer felépítését és a lehetséges két helyen hajtunk végre mérést ahogy az a következı ábrán látszik akkor a két hologram síkban történı korrekció semmiképp nem optimális hiszen csak az eltérı távolságok és nem az eltérı aberrációkkal érdemes számolni (ugyan ez a helyzet ha tesztábrát használunk az aberrációk kiméréséhez és azt késıbb egy valódi tárggyal cseréljük fel.). Reference beam Aberrations Test beam (object)

Measured Complex Amplitude (hologram)

Measured Complex Amplitude (hologram)

Eddig elvégezett vizsgálatok az irodalom tanulmányozásán túl az hogy elemeztük milyen hibákhoz vezetnek a különbözı mérető aberrációk illetve milye hatása van az aberrációk fokszámára a terjesztésnek. Az elsırendő tagokra, mivel azok síkhullámoknak felelnek meg mind Zernike mind Fourier felbontás esetén. A magasabb rendőek viszont változnak. 1

3

0.9 50

50 2

0.8 100

100

0.7

1

0.6

150

150

0.5

0

200

200

0.4

-1

0.3

250

250

0.2

-2

300

300

0.1

-3 50

100

150

200

250

50

300

100

150

200

250

300

0

Aberrációk fázis és amplitúdó eloszlása cirkuláris simított apertúra esetén

34

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

3 50

50

2 100

100

1 150

150

0 200

200

-1 250

250

-2 300

300

-3 50

100

150

200

250

300

50

100

150

200

250

300

Aberrációk fázis és amplitúdó eloszlása 80mm szabad terjedés után

Látszik, hogy a terjedés a fázisképben jelentıs átrendezıdéshez vezetett. (Kvantitatív jellemzése folyamatban van) Lencse leképezését is vizsgáltuk síkhullám terjesztéses eljárással ami megfelelı mérető kép kiterjesztés (a kiterjesztett rész nullázásával) esetén tökéletesebb leírást ad mint az általánosan használt Fresnel közelítés. Ha aberrációt is keverünk a szimulált leképezéshez az jelentısen torzítja a képet. Amennyiben ezt az aberrációt korrigáljuk, de nem a megfelelı helyen akkor jelentıs hiba maradhat a képen ami egyrészt a kép torzulásában, másrészt a felbontás csökkenésében nyilvánul meg. 1.6

1.6

50

50

100

1.4

100

1.4

150

1.2

150

1.2

200

200

1

250

1

250 0.8

0.8 300

300

0.6

350 400 450

0.6

350

0.4

400

0.4

0.2

450

0.2

500

500

100

200

300

400

500

100

200

300

400

500

A lencse által leképzett kép szimulációja, illetve arra az aberrációk hatása. Látható, hogy maga a lencse is okoz képminıség romlást de az aberrációk ezt még jelenısen fokozzák. Célunk ezen minıségromlás megakadályozása.

35

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

SZTAKI-5 MELLÉKLET A hullámterjesztés néhány modellje és azok MATLAB implementációi Grafikus felhasználói interfész (GUI) fejlesztıi és hidro-biológusi változata Digitális holografikus mikroszkóp - hologram rekonstrukciós szoftver 2. verziójának dokumentációja Megjegyzés: a rekonsturáló algoritmus a skaláris síkhullám terjesztés (angular spectum) modell alapján kidolgozott algoritmusokon alapul, MATLAB kódban készült. A második verzió célkitőzései

A DHM szoftver rekonstrukciós programmoduljának második verziója az egyszerőbb kezelhetıség érdekében jött létre, célja egy gyorsabban tanulható és könnyebben alkalmazható, felhasználóbarát felület. A felületen látható két képablak segítségével könnyen átlátható a program mőködése. A 'navigációs ablak' a betöltött hologramon való kijelölést teszi lehetıvé, az emellett található 'rekonstrukciós ablak' a kijelölt képrészlet rekonstrukcióját mutatja a megadott távolságban. A tervezés célja, hogy a programban jól láthatóan elkülönítve legyenek a felhasználó által használt funkciók és a program mőködésének feltételeit megadó, paramétereket manipuláló funkciók. Így egy adott beállításhoz elég egyszer megadni bizonyos adatokat, melyekkel a hologram rekonstrukciójakor a felhasználónak már nincsen gondja. A felhasználóbarát elrendezés lehetıvé teszi a rekonstruálni kívánt képrészlet gyors és egyszerő kiválasztását, a rekonstrukciós távolság könnyő manipulálását, miközben a menüsorból elıhívható ablakok segítségével a rekonstrukciónál fontos egyéb információk módosítására is lehetıség van. Felhasználói dokumentáció

Program indítása

A program a DHMReconstruct_2_0.exe fájllal indítható. Sikeres indításkor megjelenik a programhoz tartozó fıablak (lásd ábra).

36

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

menüsor

DHM PROJEKT

mélységhangolás panel

képkontroll panel

rekonstrukciós ablak

MELLÉKLETEK

navigációs ablak

információs panel

A fıablak komponensei Navigációs ablak

A betöltött hologram egészét jeleníti meg, melyen az egér segítségével kijelölhetı a rekonstruálni kívánt képrészlet.

37

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Navigációs ablak

Rekonstrukciós ablak

A rekonstrukciós ablakban láthatjuk a navigációs ablakban kiválasztott képrészletet, annak rekonstrukcióját. Képkontroll panel

A képdoboz fölötti panel a betöltött hologram megjelenítésére, mozgókép esetén a képek közötti lapozásra szolgál. A különbözı programmódokban ('Image'/'Avi'/'Camera') különbözı gombok jelennek meg a panelban. Egy betöltött kép esetén a "View Image" gomb funkciója: az aktuális kép betöltése, melyen a transzformációkat végezzük. Mozgókép betöltése esetén a "Preview" gombbal indítható a mozgókép lejátszása. Az egyes képkockák elérése a "Step Back" és "Step Forward" gombokkal lehetséges. Kamera üzemmódban a "Preview" gomb a berendezéshez csatlakoztatott kamera aktuális képét tölti be. A "Stop" gombbal lehet leállítani a kamera képének mozgását. A "Record" gomb segítségével lehet a kameráról felvételt készíteni, ez a felvenni kívánt frame-ek számának és a felvett mozgókép mentési helyének megadása után indul el. A felvételen megjelent háttérzajról készíthetı a zajszőréshez használható kép, mely a "Record Filter" gomb segítségével történik, megadott számú framerıl készült felvételek átlaga alapján.

38

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Mélységhangolás panel

A "mélységhangolás panel" a fıablak jobb felsı sarkában lévı "Reconstruction parameters" címő panel. Rekonstrukció esetén a "Reconstruction depth" feliratú mezıben látható az aktuális rekonstruált kép rekonstrukciós mélysége. Több távolságban végzett rekonstrukció esetén a "<<" és ">>" gombokkal lehet az aktuálisan látható mélységet állítani. A panel jobb szélén lévı csúszkák a mélység durva, illetve finom hangolásra szolgálnak (1mm-es és 10 mikronos nagyságrendekben állíthatjuk a rekonstrukciós távolságot). A "First", "Last", "Slices" mezık segítségével megadható egy rekonstrukciós intervallum, és az azon belül elvégzett rekonstrukciók száma. Sok rekonstrukciós sík esetén ajánlott a "Quick view" gomb megjelölése, mely rosszabb képméret mellett gyorsabb rekonstrukciót eredményez (lásd 2.2.6. "Quickview Parameter").

Mélységhangolás panel Információs panel

A fontosabb paraméterek kijelzésére szolgál. A fizikai paraméterek a "Parameters" menüpontban állíthatók. Az alábbiakban felsorolt fizikai paraméterek beállítását teszi lehetıvé. A panel szövegmezıiben a program indításakor az alapértelmezett értékek láthatók. Ezeket átírva a "Set" gomb megnyomásával lehet a paramétereket átállítani. Lehetısége van a Configuration menüpontban a fizikai paramétere mentésére, illetve egy konfigurációs fájlból való betöltésére.

39

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Menüsor

A menüsorból végezhetı a képek betöltése, az eredményül kapott képek mentése, a fizikai paraméterek és a gyorsnézet paraméterének beállítása, illetve a konfigurációs fájlok betöltése, mentése. "File" menü

Hologram betöltése: a "File" menü "Open Image" pontjára kattintva egy párbeszédablak jelenik meg, melyben kiválasztható egy hologramhoz tartozó kép. AZ Open gombra kattintva a program betölti munkaképként a kiválasztott képfájlt. Ebben az esetben a program "Picture" módra vált. Funkciója megegyezik a képkontroll panel "Image" gombjáéval. Az ajánlott képformátum: .png kiterjesztéső fájl. Hologramról felvett mozgókép betöltése: a "File" menü "Open Movie" pontjára kattintva egy párbeszédablak jelenik meg, melyben kiválasztható egy mozgókép fájl. AZ Open gombra kattintva a program betölti a mozgókép képeit munkaképekként. Ezek között a "Step Back" és a "Step Forward" gombokkal lehet váltani. A fájl sikeres betöltése után a program "Movie" módra vált. Funkciója megegyezik a képkontroll panel "Movie" gombjáéval. Az ajánlott képformátum: .avi kiterjesztéső fájl. A számítógéphez csatlakoztatott kamera élı felvételének megtekintéséhez a "File" menü "View Camera" pontjára kell kattintani. Ebben az esetben aktiválódnak a csak a kameránál használható gombok, a program "Camera" módra vált. Funkciója megegyezik a képkontroll panel "Camera" gombjával. A "File" menü "Save Image" pontja segítségével a képdobozban aktuálisan látható kép menthetı el, a megjelenı ablakban megadott név megadása és a "Save" gomb lenyomása után. "Parameters" menü

A program által használt paraméterek módosítására szolgál. 1. konfigurációs paraméterek: - "Laser wavelength [nm]": a mérésnél használt fényforrás hullámhossza nanométerben - "Source beam type": a fényforrás típusa (alapértelmezett: gömbhullám) -

"Reference

beam

type":

a

hologram

konstrukciójánál

referenciasugár típusa (alapértelmezett: gömbhullám)

40

használt

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

- "Ref. beam location": a referenciasugár helyzete a fényforráshoz képest elmozdulás mm-ben, x,y,z irányban (x: kép vízszintes tengelye, y: kép függıleges tengelye, z: fényforrás optikai tengelye, inline esetben: [0 0 z], off-axis esetben: egyéb) - "Inspected volume of

sample cell": a küvetta térfogata (szélesség,

magasság, mélység) mm-ben - "Sample cell-sensor distance": küvetta és szenzor (kamera) távolsága mmben - "Laser-sensor distance": fényforrás és szenzor távolsága mm-ben - "Sample cell-lens distance": küvetta és (ha van a rendszerben) lencse távolsága mm-ben - "Pixel pitch x és y": pixelméret x és y irányban - "Numeric aperture": lencse numerikus apertúrája - "Magnification of objective": lencse nagyítása 2. quickview paraméter: egy 0 és 1 közötti szám, mely a rekonstrukciós idı rövidítését célzó gyorsnézethez tartozó újramintavételezési arány A "Parameters" menü " Configuration Parameters" pontjára kattintva megtekinthetjük és módosíthatjuk az aktuális konfigurációs paramétereket. A megjelenı ablakban a konfigurációs paraméterek módosítását a "Save" gomb segítségével érvényesíthetjük, a "Cancel" gombbal lehetséges a módosítások mentése nélkül való kilépés. A "Parameters" menü "Load Configuration" pontjára kattintva tölthetünk be konfigurációs paramétereket (fizikai paraméterek, pixelméret és egyéb, az adott beállításra vonatkozó információk). A program csak .mat kiterjesztéső konfigurációs fájlokat tud értelmezni. A "Parameters" menü "Save Configuration File" pontjára kattintva menthetjük el az éppen aktuális konfigurációs paramétereket. A konfigurációs fájlok kiterjesztése .mat, az ebben a formátumban elmentett konfigurációs fájlok tölthetık be a programba. A "Parameters" menü "Quickview Parameters" pontja hívja meg a quickview paraméter beállítására szolgáló dialógusablakot.

41

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

"Filter" menü

A zajszőrés paramétereinek beállítására szolgál. A "Load Filter" gombra való kattintással megjelenı dialógusablakban betölthetı egy, vagy több képfájl az aktuális munkaképhez tartozó szőrı képeként, megadható a zajszőrés módja, illetve beállítható, hogy a betöltött filtert használni kívánjuk-e az aktuális hologramnál. A "View Filter" gomb megnyomásával megtekinthetı az aktuálisan beállított filterkép. A "Reset Filter Settings" menüpont segítségével minden, a "Load Filter" menüpontban megadott beállítást törölhetünk.

42

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

SZTAKI-6 MELLÉKLET A DHM 3D-s rekonstrukciós és alakfelismerı szoftverének rendszerterve Áttekintés A digitális holografikus mikroszkóp kifejlesztése lehetıvé teszi az ivóvíz vagy más természetes víz folyamatos monitorozását. A mikroszkópot mőködtetı szoftver feladata egyrészt különbözı vizsgálatok fél-automatikus elvégzése, hogy a vízbiológus szakemberek munkáját megkönnyítse, illetve a folyamatos monitorozása és automatikus elemzése az átfolyásos küvettában átáramló folyadéknak. A monitorozás magában foglalja a mikroszkóppal vizsgálható élılények jelenlétének detekcióját, háromdimenziós mozgás követést, alak és szín alapján felismerést és az azonosítás automatikus elvégzését. A szoftver lehetıvé teszi vészjel adását is, amit követıen a szakemberek a hagyományos módszerekkel elvégezhetik az ellenırzı vizsgálatokat.

Követelmények A DHM szoftver egy több kamerát együttesen kezelı alkalmazás, ahol a kamerák kontrollja mellett felügyeli a megvilágító egységek vezérlését, szinkron ütemezését. A kamerák felvételein holografikus rekonstrukciót, objektum detekciót, azonosítást végez. A feladat komplexitása és a megcélzott feldolgozási képesség miatt egy elosztott, több-processzoros megoldásra lesz szükség, amely egy többlépcsıs fejlesztési fázis sorozaton valósulhat meg. Az elsı fázis feladata, hogy koncepcionálisan igazolható legyen a feladat megoldhatósága, ehhez egy-processzoros implementációt tervezünk, ahol egy vagy kettı különálló alkalmazás hajtja végre a feladatokat. A következı fázisokban terjesztjük ki az implementációs hardverek körét, amelyek között szerepelhetnek DSP, FPGA, GPU, stb. eszközök is. A tervezés során ezért hangsúlyos szempont a moduláris megvalósítás.

43

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Rendszer követelmények

• Kamerák kezelése, kontrollja, trigger jelek megfelelı idızítése. Több kamera együttes kezelése. • Megvilágító egységek (LED, lézer) kontrollja, idızítı kártyák vezérlése. • Fluoreszcens felvételeken eseménydetekció, a normál színes és holografikus kamera triggerelése • Normál színes kamerán történı objektum szegmentáció, elemzés, kategorizálás • Holografikus felvételbıl történı objektum rekonstrukció különbözı síkokra. • Eredmények naplózása, riasztás adott eseményekre. Funkcionális és adat követelmények

Az optikai rész megcélzott képessége 1 mm3 vizsgálati térfogat esetén, 1mm2 látótér, 1mm mélység, 1µm laterális felbontással, 5µm mélységi felbontás mellett. Az egyes hardver eszközök ez alapján kerülnek tervezésre és kiválasztásra, amelyek együttesen támasztják a szoftver résszel szembeni követelményeket. Három fı feladatcsoportot különböztethetünk meg, amelyek az egyes érzékelık adatfolyamához illeszkedik. Ezek a fluoreszcens, holografikus és normál színes adatfolyamokhoz kapcsolódó feladatcsoportok. • Fluoreszcens rész: feladata az autofluoreszcencián alapuló eseménydetekció. Itt a felbontás kevésbé kritikus, elsısorban a kamera érzékenysége a mérvadó (adott megvilágítás mellett). Ugyanakkor a minél nagyobb folyadékáramlási sebesség eléréséhez az fps (frame/sec) itt is lehetıleg minél nagyobb legyen. Kiindulásként egy 128x128, 100 fps, célként 256x256, 1000 fps sebességet tőzünk ki. • Holografikus rész: feladata a térfogati vizsgálat, minél nagyobb sebesség mellett. 512x512 képméret 25-50 fps mellett, illetve 2000x2000 képméret 200 fps mellett. A második esetben ez kb 800 MB adat transzfer sebességet jelent, amelynek memóriába juttatását és alapszíntő elemzését jelenti (eseménydetekció). Szükséges rétegszám a rekonstrukciónál 100-250. A holografikus rész teszi lehetıvé az objektum követést, és 3D objektum modellezést is. • Normál színes kamera rész: feladata jó mínıségő színes képeken végzett objektum azonosítás. Ehhez nagy felbontású kamerára van szükség (4-6 Mpixel), és a sebesség növelése érdekében legyen ROI (region of interest) funkciója. Ez a rész végzi a naplózást, az eredmények archiválását. Minıségi, felhasználói szempontok

A DHM szoftver használatában három felhasználói csoportot különböztetünk meg. Mindegyik egyedi követelményeket támaszt az alkalmazással szemben. • Operátor csoport: a folytonos monitoring üzemmódot felügyelı kezelı. Itt elsıdleges szempont az egyszerő, robosztus kezelhetıség. Az alkalmazásnak lehetıleg elıre beállított mőködési paraméterek mellett kell üzembiztosan mőködnie, illetve bizonyos beállításokat automatikusan elvégezni (pl. referencia háttér kép felvétele). • Biológus csoport: a szakmai hátteret adó csoport tagjainak az alkalmazás biztosít egy félautomatikus mikroszkópot, azonosító, meghatározó funkcióval. A szoftver a mikroszkópok kezeléséhez hasonló lehetıségeket biztosít a minták vizsgálatához (részletek nagyítása,

44

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

kiválasztása, stb.). A detektált és azonosított objektumok ellenırzése, a naplózott eredmények átvizsgálása. • Mérnök csoport: az alkalmazás algoritmus fejlesztésében résztvevık számára az alkalmazás biztosítja a tesztelést, a behangoláshoz szükséges paraméterek állíthatóságát, alacsonyszintő kontroll lehetıségét, stb.

Architektúra Az alábbi ábra mutatja DHM rendszer általános felépítését, amely horizontálisan három fı rétegre osztható, optikai réteg, fizikai kontroll réteg és feldolgozó réteg. Az optikai réteg tartalmazza az objektíveket, lencséket, fényforrásokat, kamerákat, mechanikus elemeket. A fizikai kontroll réteg az elızı réteg elemeit mőködtetı egységeket (tápforrás, vezetékek, kontroll kártyák és áramkörök, stb.), míg a harmadik feldolgozó réteg a rendszert mőködtetı szoftvert és a futtató hardvert tartalmazza. Ezt a feldolgozó réteget tekintjük a továbbiakban a szoftver keretének. Feldolgozó réteg (SW és futtató HW) Feladatai: kontroll, eseménydetekció, holografikus rekonstrukció, analízis és klasszifikáció Fizikai kontroll réteg (tápforrások, kontrol vezetékek, trigger áramkörök, vezérlı kártyák) Feladatai: az optikai réteg áramellátása, kontroll és trigger jelek a fényforrások és kamerák számára, adatvonal biztosítása Optikai réteg (objektívek, lézerek, LED-ek, kamerák) Feladatai: fluorescens, normál, holografikus képalkotás és érzékelés

A DHM rendszer horizontális rétegei A feldolgozó réteget és ebbıl adódóan a teljes rendszert három vertikális részre bontjuk az elızı funkcionális megfontolások alapján. Ezekre a részekre mint funkcionális egységekre tekintünk, amelyeket a különbözı implementációs fázisokban tekinthetünk önálló folyamatoknak, moduloknak, vagy akár különálló alkalmazásnak is. A tényleges megvalósítást nagymértékben befolyásolni fogja a kiválasztásra kerülı hardver eszköz. Az alábbi ábra mutatja a DHM rendszer három fı funkcionális egységét.

45

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

Fluoreszcens egység

DHM PROJEKT

Normál színes egység

MELLÉKLETEK

Holografikus egység

Feldolgozó réteg (SW és futtató HW)

Fizikai kontroll réteg (tápforrások, kontrol vezetékek, trigger áramkörök, vezérlı kártyák)

Optikai réteg (objektívek, lézerek, LED-ek, kamerák)

A DHM rendszer három fı funkcionális egysége (fluoreszcens, holografikus és normál színes) A három egység (fluoreszcens, holografikus, normál színes) fı funkcióit az elızıleg tárgyalt követelmény elemzés tartalmazza. A konkrét megvalósuló rendszerben ezek ugyanakkor opcionális elemek, amelyek a tényleges igények szerint épülnek majd fel. A továbbiakban viszont egy minél szélesebb konfigurációt tekintünk, amely tartalmazza mindhárom eszközt. Az alábbi ábra mutatja a három fı rész sematikus kapcsolódását, feltételezve az autofluoreszcens rétegrıl jövı eseménydetekció triggerelı szerepét.

46

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

Fluoreszcens egység

DHM PROJEKT

Normál színes egység

MELLÉKLETEK

Holografikus egység

Feldolgozó réteg (SW és futtató HW) ROI

Fizikai kontroll réteg (tápforrások, kontrol vezetékek, trigger áramkörök, vezérlı kártyák) trigger

Optikai réteg (objektívek, lézerek, LED-ek, kamerák)

Fluoreszcens esemény detekció trigger jelei (kamera trigger és ROI információ) Természetesen nem csak ez az eseményvezérelt jelút képzelhetı el, hiszen a további kutatási eredményektıl függ például az, hogy a holografikus részen szintén történik-e eseménydetekció. Rendszer és modul szintő kiépítés A feldolgozó egység szoftver rétegét két alrétegre bontjuk, az optikai szoftver rétegre, és az adat processzálló szoftver rétegre. Az optikai réteg felelıs a DHM fizikai komponenseinek vezérléséért (megvilágítás idızítés, kamera kontroll, képek beolvasása és tárolása, stb), míg az adat processzálló réteg az egyes egységek képeinek a feldolgozásáért. Az optikai szoftver réteg szorosan kapcsolódik az optikai és kontroll rétegekhez, ez eszköz specifikus implementációt igényel a megfelelı driverek segítségével. Ezen a szinten megjelenhetnek speciális hardver modulok, illetve a projekt keretében kifejlesztett többprocesszoros rendszerek is. Az utóbbira lehet szükség a holografikus rész rekonstrukciós moduljának implementálásában, ahol a nagymennyiségő adat real-time feldolgozására van szükség. Az adatprocesszálási réteg már lazábban függ a hardver specifikus részektıl, itt fı részben a kinyert képi adatok feldolgozása valósul meg. Emellett a képi adatokból kinyert információk elemzése, klasszifikációja történik, beleértve az archiválási (naplózási) és riasztási feladatokat is. Az alábbi ábra mutatja a szoftver két rétegét és a fıbb modulokat. A modulok mellett kiemeltünk adatmemóriákat, amelyek egyes speciális egységekhez vagy feladatokhoz kapcsolódnak.

47

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Feldolgozó réteg (SW és futtató HW) Adat processzáló szoftver réteg Fluoreszcens egység

Esemény detekció

Normál színes egység Riasztás

3D modell

Naplózás

Klasszifikáció

Elemzés, klasszifikáció

Elemzés, esemény detekció

Optikai szoftver réteg 1. Memória

Holografikus egység

4. Memória 2. Memória Rekonstrukció

Kamera olvasás

Kamera olvasás

Kamera, világítás kontroll

3. Memória Kamera olvasás

A fı modulok Eszköz kontroll Egy központi modul feladata (kamera, világítás kontroll), hogy felügyelje a három mikroszkóp egység kontrollját, szinkronizált mőködését, az adatok továbbítását. A szinkronizált mőködés egyrészt jelenti a fényforrások és kamerák megfelelı vezérlését, valamint egy adott mikroszkóp (pl. fluoreszcens vagy a holografikus) eseménydetekciójára a további mikroszkópok vezérlését. Az optikai réteg megvalósításától függ, hogy lehetséges-e egyidejőleg több fényforrás használata (eltérı spektrum tartomány és szőrık segítségével), vagy idıben kell szétválasztani az egyes megvilágító egységek mőködését. Holografikus modul A következı kitüntetett szerepő modul a holografikus egység. Ez valósítja meg a minta teljes térfogati elemzését, az egyes objektumok mélységben történı lokalizációját, majd az ennek megfelelı réteg illetve rétegek rekonstrukcióját. A további elemzések ezeken a rekonstruált rétegeken valósulnak meg. A feladat komplexitásából adódóan ezen egység implementációja jelenti majd a legnagyobb kihívást. A valós idejő rekonstrukció megvalósítása valószínőleg egy többprocesszoros egységen történik.

48

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Holografikus modul 3. Memória

Háttérzaj kompenzáció

Objektum mélység becslés

Optikai aberráció kompenzáció

Rekonstrukció

Volumetrikus torzítás kompenzáció

4. Memória

Holografikus (volumetrikus) modul Adat tárolás Az optikai szoftver rétegben kiemeltünk négy memória részt, amelyek az egyes mikroszkóp kameráihoz tartoznak. A feldolgozás fı feladatai ezek adataihoz kapcsolódnak. Az egyes memóriák a következıek: • 1. memória: autofluoreszcens mikrszokóp képe • 2. memória: normál színes mikroszkóp képe • 3. memória: holografikus mikroszkóp képe • 4. memória holografikus mikroszkóp képébıl történı többszeletes rekonstrukció Az 1. memóriánál az adatátviteli sebesség számít hangsúlyosabban, a képméret kevésbé kap szerepet. A kamera kiolvasási sebessége és a memória transzfer ideje határozza meg döntıen az eseménydetekció elérhetı sebességét. A 2. memóriánál a képméret 4-6 Mpixel mérető, de ez nemcsak egyes képet jelenthet, hanem akár videófolyamot is. Itt az adatmennyiség nagysága jelent kihívást a transzfer szempontjából. A videófolyam teszi lehetıvé a mozgás alapú szegmentációt, esetleg mozgás specifikus azonosítást is. A holografikus részhez tartozó 3. memória nagy valószínőséggel egy több csatornás adatfolyamon valósul meg, ahol a szenzort például több beolvasó processzor segíti. A rekonstrukció vagy ezeken a rész memóriákból dolgozik, vagy elıtte a részadatok egyesítésre kerülnek, és már a teljes képen valósul meg a rekonstrukció. Ennek a kérdésnek az eldöntése jelenleg kutatási fázisban van. A 4. memória tartalmazza a rekonstrukciós sorozatot több rétegrıl. Ez alapján kerül kiválasztásra az objektumokhoz tartozó optimális réteg mélység, illetve válik lehetıvé 3D objektum modellezés.

49

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Adatfolyam modell Az alábbiakban a rendszert adatfolyam szempontjából vizsgáljuk és ahhoz definiálunk feldolgozói modellt. Két fı csoportot különböztetünk meg, a „Front-end” és az „Analysis” részeket. Lásd az alábbi ábrát. Az elsı rész a „Front-end” feladata a képbeolvasás több kamerából, az eseménydetekció, és a megfelelı felvételek kiválasztása a további objektum elemzéshez. Itt kap helyet a holografikus feldolgozás is. A „Front-end” nagy része az optikai szoftver rétegben kerül megvalósításra, itt hangsúlyos szerepet kap az eszközfüggı implementáció. A holografikus számításoknál felmerült lehetıségek pl. több Pentium processzoron, vagy GPU processzorokon történı megvalósítás. Maga az eseménydetekció már átnyúlik az adatprocesszáló rétegbe, amely azt jelenti, hogy az implementáció többféle platformon, eszközön is megvalósulhat. A második „Analysis” rész feladata az objektumok elemzése, amely jelenti a szegmentációt, a tulajdonságok kinyerését és az ez alapján történı klasszifikációt. Ez teljes egészében az adatprocesszáló szoftver rétegben kap helyet. Itt nem részleteztük, hogy rendszer kiépítéstıl függıen több kép is készülhet az objektumról, holografikus rekonstruált, autofluoreszcens, és normál színes kép. Ezek együttesen kerülhetnek elemzésre az „Analysis” részben. Image Acquiring

Optional Image Acquiring

Data: ~ 4MBx200fps

Data: ~ 64kBx200fps

Event Detection

Event Detection ROI

Frame Extraction

Front-end Data: ~1-16kB x 10-50 frames

Analysis

Image Data Object segmentation

Result

Objects

Feature extraction

Feature vectors

Classification

Data: 1D vector

Database

A DHM szoftver adatfolyam modellje Az alábbi ábra részletesebben mutatja be a „Front-end” rész feladatait. A holografikus rész távlati célként kitőzött 800MB/fps adatátviteli sebessége speciális hardver tervezést igényel. Ehhez kapcsolódóan egyedi szoftverre is szükség van. Az elızetes tervek alapján egy párhuzamos architektúra körvonalazódik, ahol remélhetıleg holografikus kép egyes részein párhuzamosan tudunk futtatni eseménydetekciós algoritmusokat. Ehhez szükség lehet a részképek

50

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

alulmintavételezésére, az egyes frame-ek közötti választásra. A rekonstrukciós rész is nagy valószínőséggel egy párhuzamos architektúrán kerül implementálásra. A további kamera bementetek itt opcionálisan kerültek fel, jelezve szerepüket az eseménydetekcióban. Image Acquiring

Optional Image Acquiring

Data: ~ 4MBx200fps, holograms Data: (Full/P)x200fps

SubIm 1.

Bining 1.

…

SubIm P.

Bining P.

Data: ~ 64kBx200fps

Event Detect

Event Detection ROI Frame Selection Data: ~ 4MB x 10-50 frames, holograms

Image Data

Reconstruction

Selective reconstruction

Data: ~ 4MB x 10-50 frames

Extraction Data: ~1-16kB x 10-50 frames

Image Data

Front-end

Analysis

Ábra – „Front-end” rész

51

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Adatbázis Az adatbázis tartalmaz normál és holografikus felvételeket is. A képhez csatolásra kerül minden fontos információ, amely az azonosításhoz szükséges, beleértve a kép készítésének idejét, helyét, biológiai meghatározást és besorolást, felvétel készítésének paramétereit. A kép mellett a következı fontosabb mezık: Vízminta típusa: Drinking water Living water (river) Still water (lake) Karst water Riverbank filtrated water Water from confined aquifer Treated water Technological water Waste water Cultured sample Baktériumok Iron Bacteria Sulphur Bacteria Contamination indicator bacteria

Biológiai kategóriák: Algae Bacteria Fungi Protozoa Worms Others

Algák: Cyanobacteria Chlorophyta Bacillariophyceae Xantophyceae Euglenophyta Chrysophyceae Haptophyta Cryptophyta Dinophyta

Gombák Aeroborne Aquatic

Férgek: Nematoda Rotatoria Gastrotricha Tardigrada Aelosomatida Oligochaeta Egg

Életforma: single cell colonial filamentous

Protozoa Flagellata Ciliata Ciliata - Holotricha Ciliata - Spirotrichia Ciliata - Peritricha Ciliata - Suctoria Rhizopoda Rhizopoda - Gymnamoebia Rhizopoda Testacealobosia Rhizopoda - Cyst Actinopoda (Heliozoea) Méret: pikoplankton (< 2 µm) nanoplankton (2-20 µm) mikroplankton (20-200 µm) mesoplankton (0.2 mm-2 mm) macroplankton (2-20 mm)

Alak:

Ostoros/nem ostoros

52

Képkészítés típusa:

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

constant varying regular irregular straight spiral twisted Képkészítés technika Normal Brightfield/Backlight Darkfield Phase contrast DIC (Differential interference contrast)

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Normal light Holographic Fluorescence

Mikroszkóp: upright inverted

Módja: Color Mono Felbontás pixel/um

Nagyítás érték

Az implementáció MySQL alapú, amely lehetıvé tette, hogy az adatbázist egy szerveren tároljuk, amely interneten keresztül elérhetı. Egy webes felületen valósul meg a képek feltöltése és az egyes adatbázis mezık meghatározása. Az adatbázis elérését a feldolgozó szoftver számára biztosítottuk, amelyet az automatikusan lekérdezhet és a tanuláshoz felhasználhat. A webes felület biztosítja a tetszıleges feltételek melletti szőrést, ezáltal lehetıvé téve a kényelmes keresést. Az alábbi két web screenshot-on látható a keresı lap kiindulási helyzete és egy konkrét kép a hozzátartozó adatokkal:

53

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

Scenedesmus March 10, 2009 - 13:22 —

Date: 2009, February 3 Sample type: Cultured sample Creator: SZTAKI

Classification Category: Algae Algae Group: Chlorophyta

Morphology Life form: colonial Size: nanoplankton (2-20 µm) Shape: regular Flagella / Cilia: No

Measurement Type: Normal light Mode: color Technique: Brightfield/Backlight Microscope: inverted Magnification: 400 x Resolution: 4.16 pixel/µm

54

MELLÉKLETEK

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

SZTAKI-7 MELLÉKLET Grafikus felhasználói felület (GUI) vízbiológusok számára, amely megkönnyíti a morfológiai adatbázis kialakítását, betanítását Az alga osztályozó (Alga Classifier) program segítséget nyújt a biológusnak a mikroszkópos felvételen található algák és más lények osztályozásához. A program mikroszkópos fényképek, vagy videofelvételek alapján szegmentálja a látómezıbe esı objektumokat és ezeket két lista alapján (természetes, illetve már szőrt vizek) a biológus csoportokba sorolhatja. Erre azért van szükség, hogy megfelelı mérető képadatbázisra tegyünk szert. Az így osztályozott lények automatikus morfológiai felismerésének tanításához egy ilyen adatbázis elengedhetetlen.

55

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

56

MELLÉKLETEK

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Példa a szegmentációs maszkra:

AClassifier telepítése és használata AClassifier telepítése 1, 2, 3,

Indítsuk el az MCRinstaller.exe nevő programot. Minden kérdésre (angol nyelv stb.) igen, OK, elfogadom a válasz... Másold át a telepítı lemezen lévı többi programot egy könyvtárba – ebbıl a könyvtáról fog mőködni az osztályozó program és az eredmények ennek egy Class alkönyvtárában lesznek találhatóak.. Az AClassifier használata

Indítsd el a Aclassifier.exe programot. 1, 2,

3,

Open file/Open Avi file menu ponttal nyiss meg egy korábban készült mikroszkópos felvételt. Avi file esetén inditsuk azt el a megjelenı Play gombbal és akkor állítsuk majd meg (STOP), amikor élesek rajta az objektumok. (ha nem mind éles, akkor a nem éleseket ki kell majd hagyni az osztályozásból..) Ha megjelenik a Segment gomb, nyomjuk meg és ezzel megkeressük a képen az objektumokat. (ezután körbe lesznek a képen rajzolva a megtalált objektumok.)

57

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

4,

5, 6,

7,

8, 9, 10, 11,

12, 13,

14,

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Várjunk amíg a Classify gomb megjelenik. (ha nem sikerült jól szegmentálni a képet akkor vagy folytassuk az avi lejátszását, vagy töltsünk be új képet és ismét használjuk a Segment gombot.) Nyomjuk meg a Classify gombot. Jobbra fent egyesével megjelennek majd sorban a szegmentált objektumok. Ezeket lehet osztályozni: vagy természetes vizek szerinti csoportokba (~33 kategória) vagy ivóvizek szerint csoportokba (~6 kategória). Ki kell választani a megfelelı csoportot – a kiválasztott név megjelenik az objektum képe alatt. Ha a szegmentálás nem jól rajzolja körbe a kiválasztott objektumot (vörös négyszög sárga transzparens háttér), akkor az egérgomb lenyomásával illetve felengedésével ez a környezet megváltoztatható. Az új keretezéssel ellátott objektum megjelenik a jobb oldalon (frissül a kép). A kép alatti szövegablakba megjegyzés írható (további osztályozás, figyelmeztetés). Amennyiben megfelel a kiválasztott osztályozás, a keret, és a megjegyzés az objektumnak, akkor az Accept gombbal elmenthetı az osztályozás eredménye. Ha nem lehet, nem kell az objektumot osztályozni, akkor a Next gombot kell megnyomni (kihagyja az objektumot, nem ment semmit a program). Figyelem, visszalépni nem lehet! Ha közben látunk olyan objektumot amit osztályozni kéne, de nincs bekeretezve (szegmentálva), akkor elıször rajzoljuk kırbe az egérrel, majd nyomjuk meg az AddRoi gombot. Ekkortól már szerepel majd a bekeretezettek között, és az osztályozás végén rá is sor kerül. Ha az összes objektum (így, vagy úgy de) osztályozva lett, akkor eltőnik az Accept és a Next gomb. Ekkor vagy töltsünk be új képet, illetve folytassuk az avi-file lejátszását a következı osztályozandó képig (play) és osztályozzunk tovább (Segment, Classify), vagy hívjuk a Correct menüpontot, amivel az addig osztályozottakat lehet ellenırizni, az osztályukat, a hozzá fúzött megjegyzést javítani, illetve az Erase gombbal törölni lehet. Ha befejeztük a munkát a Finish gombbal bármikor kiléphetünk a programból. Hiba javítás

Elıfordulhat hogy 0 mérető, vagy nem oda tartozó (nem a program által generált) file-ok kerülnek a class direktoriba. Ez futás közben hibát okozhat. Töröljük ıket! Ha sok osztályozott és már ellebırzött file győlik össze a class folderben, akkor érdemes ıket máshova átmásolni, mert lassíthatják az ellenırzés mőködését. (Változtatás, törlés esetén elılrıl kezdi az ellenırzést a program.) Bármilyen hiba panasz változtatási igény esetén, [email protected] lehet érdeklıdni.

58

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

MTA-BLKI MELLÉKLETEK Szakmai beszámoló I. munkaszakasz A munkaszakasz kezdetén a már meglévı Olympus BX51 típusú differenciál interferencia kontraszt mikroszkópot kiegészítettük egy 12,5 megapixeles Olympus DP71 digitális kamerával valamint a hozzátartozó vezérlı számítógéppel (HP). Az elkészült képek – melyek mérete gyakran meghaladja a 10-20 Mb-t – tárolásához egy Linksys NAS-200 hálózati tárolóegységet helyeztünk üzembe. Mindezeken felül a természetes vízmintákban az algák betömörítéséhez egy Z300K hőthetı laboratórium centrifugát szereztünk be. Külföldi törzsgyőjteménybıl számos, a természetben gyakran elıforduló, de nehezen izolálható és tenyészthetı algatörzset vásároltunk, elıállítottuk a tenyésztésükhöz szükséges speciális szintetikus tápoldatokat és megkezdtük laboratóriumi szaporításukat. Ezeket, valamint a már meglévı laboratóriumi algatörzseinket az MTA SZTAKI rendelkezésére bocsájtottuk az alakfelismerı program fejlesztéséhez. Folyamatos szakmai konzultációt folytattunk az MTA SZTAKI munkatársaival és javasoltuk az algák autofluoreszcenciájának felhasználását azok automatikus detektálásában. Az algák csoportosításához kidolgoztunk egy egyszerő és jól kezelhetı rendszert, melyben a rendszertani (taxonómiai), morfológiai és ökológiai szempontok egyaránt helyet kapnak. A taxonómiai szempont alapján az algákat alábbi nagyobb csoportokba soroltuk be: Cyanobacteria, Chlorophyta, Bacillarophyceae, Xanthophyceae, Chrysophyceae, Euglenophyta, Haptophyta, Cryptophyta, valamint Dinophyta. A morfológiai csoportosítás alapját a szervezıdési szinteknek megfelelıen alakítottuk ki, mely szerint az algák lehetnek egysejtőek vagy többsejtőek, ez utóbbi esetben a sejtek alkothatnak cönóbiumot (szabályosan elhelyezkedı meghatározott számú algasejt) vagy kolóniát (szabálytalan elhelyezkedéső és számú algasejt) illetve fonalas szervezıdési szintet is képviselhetnek. Alaktani szempontból további kategóriákat különböztettünk meg, mely szerint az egysejtő algák alakja lehet állandó illetve változó, a fonal alakja pedig lehet egyenes, spirális vagy csavart. Az aktív mozgás képességét az ostor megléte vagy hiánya alapján, mint egy igen fontos elkülönítési szempontot, szintén figyelembe vettük. Az ökológiai szempont alapján az algákat az alábbi, méret szerinti csoportokba soroltuk: pikoplankton (0-2 µm), nanoplankton (2-20 µm), mikroplankton (20-200 µm), mezoplankton (0.2-2 mm) valamint makroplankton (2-20 mm) kategória. A digitális kamera beüzemelése után elkezdtük a hazai felszíni vizeink leggyakoribb és legjellemzıbb algáinak összegyőjtését valamint lefényképezését. Nagy sekély állóvizeink (Balaton, Kis-Balaton), szikes tavaink (Fertı-tó, Velencei-tó, Sárkány-tó) valamint hazai víztározók (Kovácsszénája, Marcali), halastavak (Kispuszta, İrbottyán), holtágak (Csongrád, Bogyiszló, Tolna) és mocsarak (Kolon-tó) algaközösségének dokumentálását kezdtük el, összesen mintegy 20 hazai víztest közel 50 alkalommal történt mintavételezése segítségével. A vízmintákat laboratóriumban centrifugálással tömörítettük, majd a tömörített mintákat élı állapotban is vizsgáltuk, illetve belılük tartós preparátumokat is készítettünk. Az elkészített preparátumokon a lehetı legtöbb algafajt lefényképeztük, kikeresve a ritkábban elıforduló algákat is. Az elkészült honlap fénykép tartalommal való feltöltéséhez (az alga adatbázis elkészítéséhez) a képek egy részének további szerkesztését is elvégeztük Photoshop Elements 7.0 program

59

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

segítségével. A mikroszkópos felvételek nagy méretére való tekintettel a képeken csak az algasejteket és közvetlen környezetüket hagytuk meg, az egyéb élı és élettelen szervezeteket és törmelékeket szoftveresen eltávolítva. Az összegyőjtött felvételek közül az alga adatbázisba az alábbi algataxonokról készített képek kerültek feltöltésre (az adatbázis további feltöltése folyamatosan történik):

•

Acanthoceras zachariasii (Bacillarophyceae)

•

Anabaena sp. (Cyanobacteria)

•

Aphanizomenon flos-aquae (Cyanobacteria)

•

Ceratium hirundinella (Dinophyta)

•

Chaetoceras muelleri (Bacillarophyceae)

•

Chlamydomonas reinhardtii (Chlorophyta)

•

Chlamydomonas sp. (Chlorophyta)

•

Cosmarium sp. (Chlorophyta)

•

Cyclotella sp. (Bacillarophyceae)

•

Cylindrospermopsis raciborskii (Cyanobacteria)

•

Dictyosphaerium elegans (Chlorophyta)

•

Dictyosphaerium pulchellum (Chlorophyta)

•

Dinobryon divergens (Chrysophyceae)

•

Dinobryon sociale var. americanum (Chrysophyceae)

•

Elakatothrix lacustris (Chlorophyta)

•

Euglena limnophila (Euglenophyta)

•

Euglena oblonga (Euglenophyta)

•

Eunotia lunaris (Bacillarophyceae)

•

Franceia ovalis (Chlorophyta)

•

Haematococcus pluvialis (Chlorophyta)

•

Lagerheimia hindakii (Chlorophyta)

•

Lepocinclis ovum (Euglenophyta)

•

Lepocinclis sp. (Euglenophyta)

60

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

•

Micractinium pusillum (Chlorophyta)

•

Microcystis aeruginosa (Cyanobacteria)

•

Microcystis flos-aquae (Cyanobacteria)

•

Microcystis flos-aquae (Cyanobacteria)

•

Navicula sp. (Bacillarophyceae)

•

Nitzschia acicularis (Bacillarophyceae)

•

Nitzschia reversa (Bacillarophyceae)

•

Nitzschia sp. (Bacillarophyceae)

•

Oocystis lacustris (Chlorophyta)

•

Oocystis sp. (Chlorophyta)

•

Pediastrum borianum (Chlorophyta)

•

Pediastrum simplex (Chlorophyta)

•

Peridinium sp. (Dinophyta)

•

Planktolyngbya limnetica (Cyanobacteria)

•

Planktonema lauterbornii (Cyanobacteria)

•

Scenedesmus acuminatus (Chlorophyta)

•

Scenedesmus carinatus (Chlorophyta)

•

Scenedesmus protuberans (Chlorophyta)

•

Scenedesmus quadricauda (Chlorophyta)

•

Synura sp. (Chrysophyceae)

•

Tetraedron minimum (Chlorophyta)

•

Thalassiosira sp. (Bacillarophyceae)

61

MELLÉKLETEK

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

OKI MELLÉKLETEK Jogi és szabályozási háttér összefoglalása IVÓVÍZ 98/83/EK Az Európa Tanács Irányelve az emberi fogyasztásra szánt ivóvíz minıségérıl Az irányelvben a fı hangsúly az indikátor és patogén szervezetek határértékeinek meghatározására esett, vagyis a fogyasztókhoz eljutott víz minıségérıl csak utólagos információkat nyertünk. Az irányelv lehetıvé teszi, hogy a tagállamok egyedi határértékeket használjanak az I. mellékletben meghatározott paramétereken felül, ha azokat fontosnak tarják az egészséges ivóvíz ellátás szempontjából. Bár ennek az irányelvnek is fı célja az emberi egészség védelme, de az élelmiszer elıállításban már használt ún. HACCP (hazard critical control points) elvet alapul véve az irányelv jelenleg módosítás alatt áll, hiszen az irányelv 11. cikke a melléklet 5 évenkénti felülvizsgálatát írja elı. •

2003. óta megkezdıdött az irányelv felülvizsgálata, különösen hangsúlyozva a Vízbiztonsági Tervek kidolgozásának szükségességét. Vita tárgyát képezik a mintavétel, a monitoring, a bakteriológiai és kémiai paraméterek témaköre. A Vízbiztonsági Tervek szükségességével mindenki egyet ért, hiszen az alapelv az, hogy meghatározzuk azokat a veszélyeztetett pontokat, ahol szennyezıdés várható az ivóvíz elıállítása során. Így: a szabályzás alapja egy egységes kockázatkezelési stratégia, amely – minden létezı és potenciális veszélyt azonosít a forrástól a fogyasztóig; – felméri az ezekhez kapcsolódó kockázatot és azok kézbentartásának helyzetét; – azonosítja a hiányosságokat; – Korrekciós programokat tart fenn a kockázatok kezelésére

A 98/83/EK Irányelv hazai jogszabályba ültetése: 201/2001. (X. 25.) Korm. rendelet (módosítások: 47/2005. korm. rendelettel és 65/2009. kormányrendelettel) az ivóvíz minıségi követelményeirıl és az ellenırzés rendjérıl A 201/2001 korm. rendelet az európai irányelvhez képest több paraméter ellenırzését írja elı, így az ún. biológiai paramétereket is, amelyek a baktériumokhoz képest magasabb rendszertani kategóriába tartozó szervezetek jelenléte, melyek jelzik az ivóvíz esetleges szennyezıdési lehetıségeit. A 65/2009 korm. rendelet már figyelembe veszi az EU-s irányelv módosítását is, így a vízbiztonsági tervek készítését is elıírja 2012-14 között.

FELSZÍNI VÍZ 2000/60/EC Water Framework Directive (WFD) (AZ EURÓPAI PARLAMENT ÉS A TANÁCS 2000/60/EK IRÁNYELVE (2000. október 23.) a vízpolitika terén a közösségi fellépés kereteinek meghatározásáról) Fı célkitőzések:

62

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

a) megakadályozza a vízi ökoszisztémák, és – tekintettel azok vízszükségletére – a vízi ökoszisztémáktól közvetlenül függı szárazföldi ökoszisztémák és vizes területek további romlását, védi és javítja azok állapotát; b) elısegíti a hasznosítható vízkészletek hosszú távú védelmére alapozott fenntartható vízhasználatot; c) a vízi környezet fokozott védelmére és javítására irányul, többek között célzott intézkedések révén a veszélyes anyagok bevezetésének, kibocsátásának és veszteségeinek fokozatos csökkentésére, továbbá a különösen veszélyes anyagok bevezetéseinek, kibocsátásának és veszteségeinek megszüntetésére vagy fokozatos kivonására; d) biztosítja a felszín alatti vizek szennyezésének fokozatos csökkentését, és magakadályozza további szennyezésüket; és e) hozzájárul az árvizek és aszályok hatásainak mérsékléséhez Különös hangsúlyt kap a védett területek állapotának megfigyelése: IV. MELLÉKLET VÉDETT TERÜLETEK 1. A védett területek 6. cikk szerinti jegyzéke a védett területek következı típusait tartalmazza: i. az emberi fogyasztásra szánt víz kivételére a 7. cikk szerint kijelölt területek; ii. a gazdaságilag jelentıs vízi fajok védelmére kijelölt területek; iii. az üdülési célra kijelölt víztestek, beleértve azokat a területeket, amelyeket fürdıvizekként jelöltek ki a 76/160/EGK irányelv szerint; iv. tápanyagérzékeny területek, beleértve a 91/676/EGK irányelv szerint veszélyeztetett övezetekként kijelölt területeket és a 91/271/EGK irányelv szerint érzékeny területekként kijelölt területeket; és v. az élıhelyek vagy állatfajok védelmére kijelölt területek, ahol a víz állapotának megtartása vagy javítása védelmük fontos tényezıje, beleértve a 92/43/EGK (1) és a 79/409/EGK (2) irányelv szerint kijelölt Natura 2000 helyeket. Magyar jogrendbe illesztés: 219/2004. (VII. 21.) Korm. rendelet a felszín alatti vizek védelmérıl 220/2004. (VII. 21.) Korm. rendelet a felszíni vizek minısége védelmének szabályairól 221/2004. (VII. 21.) Korm. rendelet a vízgyőjtı-gazdálkodás egyes szabályairól

63

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

A 2000/60/EC Vízkeretirányelv ernyı szabályozása alá tartozik: 2006/7/EC irányelv A természetes fürdıvizek minıségi követelményeirıl Hazai jogrendbe illesztés 78/2008. (IV. 3.) kormányrendelet A természetes fürdıvizek minıségi követelményeirıl és a 76/160/ EGK irányelv hatályon kívül helyezésérıl •

Változások az elızı irányelvhez képest o Fı célkitőzés: a gasztroenterális és egyéb fürdıvíz által terjesztett megbetegedések rizikójának csökkentése o Fürdıvíz profil felvétele– tájékoztatási kötelezettségek o Cianobaktérium kockázatok becslés o Új eljárási szabályok a kijelölésben/engedélyezésben o Új felügyeleti eszközök o Új vízminıség értékelési módszer – mikrobiológiai alapon o Fürdıvíz minısítés 4 szezon alapján: E. coli- és Enterococcus- szám eloszlásfüggvény paramétere szerint

64

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Kapcsolatfelvétel vízmővekkel Az ivóvíz rendelet (201/2001. korm. rendelet 65/2009. korm. rendelettel való módosítása 2012-re elıírja a több, mint 100 000 fıt ellátó vízszolgáltatóknak, hogy vízbiztonsági tervvel kell rendelkezniük. A Fıvárosi Vízmővek több, mint 2 000 000 fı ivóvíz ellátásáról gondoskodik, ezért élen jár a terv kidolgozásban is. A HACCP elv elıírja a kritikus veszélypontok ellenırzését, ezért, fontos számukra, hogy pl. árvíz idején, a Duna vízszintjének megemelkedésekor a parti szőréső kutakba Duna víz kerülésekor a megfelelı intézkedéseket meg tudják tenni az ivóvíz ellátó rendszer, hálózat elszennyezıdésének elkerülésére. A Digitális holografikus mikroszkóp on-line üzemelésével és riasztó rendszerének jelzésével igen hatékonyan tudnak beavatkozni a veszély elhárítására. A DHM jelzi a Dunára jellemzı szervezetek bekerülését a kutakba, ezáltal tudomást szereznek a Vízmővek dolgozói arról, hogy azokat a kutakat ki kell iktatni a víz ellátásból, amelyek szennyezıdtek.

Az adatbázis létrehozásának megkezdése Az Országos Környezetegészségügyi Intézet (OKI) a Magyar Tudományos Akadémia Számítástechnikai és Automatizálási Kutató Intézettel (SZTAKI) és a Magyar Tudományos Akadémia Balatoni Limnológiai Kutató Intézettel (BLKI) közös adatbázist hozott létre, amely a természetes és az ivóvizekben elıforduló szervezetek fényképét és legfontosabb tulajdonságait tartalmazza. Az OKI elsısorban ivóvizekben, kezelt vizekben és technológiai vizekben elıforduló mikroszkópos szervezetek fotóinak feltöltésével foglalkozott. A kategóriák kialakítása nem csak taxonómiai szempontok alapján történt, hanem a 2001/201 (X.25) Kormányrendeletben megjelenı kategóriák figyelembe vételével is. Az adatbázisban külön albumok vannak az ugyan olyan mikroszkóppal készült felvételek összegyőjtésére. Így van fluoreszcens és holografikus kategória is. Az egyes élılényekre jellemzı morfológiai mutatók és bélyegek, a március 3-4-én Tihanyban BLKI által szervezett megbeszélésen kerültek kialakításra. (sejtszervezıdés, telep, sejt morfológia, mérettartomány) Az élılények szervezıdésének leírásán kívül az adatbázisban nagy szerepet kapott a mikroszkópos technikai leírása is. Minden fotóhoz legördülı menüsorból, ki lehetetett választani vagy szabad mezıbe beírni, hogy milyen technikával (inverz vagy normál, színes vagy mono) és hogy milyen nagyítással készült a kép. Ezen kívül meghatározásra került az is, hogy egy pixelhez hány mikrométer tartozik. Ennek meghatározásához a Paint programot és egy tárgylemez mikrométer fényképét használtunk. A tárgylemez mikrométeren meghatároztuk mikroszkóp segítségével, hogy hány beosztás tartozik egy mikrométerhez, majd a tárgylemez mikrométert lefényképezve és a fényképet betöltve a Paint programba, ott megnéztük, hogy egy mikrométernek hány pixel felel meg. Ez az érték állandó, ha adott nagyítást és adott felbontást használunk. Ennek az a jelentısége, hogy ezt az értéket ismertetve bármikor meg tudjuk határozni az adott szervezet méretét, ez fontos lehet annak eldöntésére, hogy melyik fajhoz tartozik. Az OKI az adatbázis feltöltésén kívül tesztelt 2 fajta alakfelismerı programot is. Az egyik szoftver az elkészült videofelvételen vagy fényképen a kiválogatta a szervezetek képeit, majd ezeket a képekhez mi hozzárendeltük a megfelelı nevet. A másik programnál a felhasználó kézzel is ki tud válogatni objektumokat és az elıbb ismertetett módon elnevezni azokat. A két szoftver még fejlesztés alatt állnak.

65

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

A DHM adatbázisban az OKI által feltöltött szervezetek: Élılény Leptothrix Ankyra Fragilaria Tardigrada Thiotrix Vorticella Arcella Nitzschia Beggiatoa Centropyxis Nematoda Rotatoria Fungi Trinema Asterionella Aulacoseira

Fotó száma 2 db 1 db 1 db 1 db 1 db 1 db 1 db 1 db 2 db 1 db 2 db 2 db 1 db 1 db 1 db 1 db

66

MELLÉKLETEK

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Vízminták elemzése Mintavétel A Dunából 6 mintavétel történt, ebbıl 3 alkalommal a SZTAKI munkatársai hoztak az OKI Vízbiológiai és ökotoxikológiai osztályára vízmintát: 2008. december 1-és 12-én és 2009. január 27-én. Az OKI Vízbiológiai és ökotoxikológiai osztálya 3 alkalommal vett mintát 2009. február 11-én 2 helyrıl és április 20-án pedig egyrıl. Az egyik mintavételi pont a Dagály strand kifolyójának közelében volt a másik pedig a Népsziget északi csücskénél a nagy Duna felöli oldalon. Az április 20-án történt mintavétel szintén a Népsziget északi csücskénél volt. 2x másfél liter vizet hoztunk laboratóriumunkba. A vízmintákat a mintavétel utáni néhány napon belül feldolgozták addig is hőtıszekrényben tároltuk 4-6 Co körüli hımérsékleten.

Minta feldolgozás A minták feldolgozása hasonló módon történt mindegyik vízminta esetén. A mintákból, 250 ml szőrtünk le 0,45µm pórusátmérıjő cellulóz-észter membránszőrön keresztül vákuumszőrı berendezés segítségével. A membránszőrın fennmaradt üledéket 10 ml vízbe tettük, melyet a szőrés elıtt tettünk félre a mintából. Ez után az így besőrített mintát 15 percig 1500 ford./perc fordulaton centrifugáltuk és a felülúszó leszívásával különbözı töménységőre állítottuk be a mintákat. A sőrítések 25X és 250X értékek között változtak. Erre azért volt szükség, hogy megfelelı koncentrációban legyenek a szervezetek, de ne akkorában, hogy zavarják a fényképkészítést, határozást. Mindig az optimális sőrítéssel készült mintákat vizsgáltuk mikroszkóppal. Az elsı behozott vízmintából több hígítást készítettünk 1X-250X értékek között és rögzített preparátumot állítottunk elı. A tárgylemezre cseppentett mintát hagytuk beszáradni, majd Depex nevő rögzítıvel buborékmentesen ráragasztottuk a fedılemezt. Ezekbıl a mintákból tudtuk megállapítani a megfelelı hígítást ahhoz, hogy a holografikus fényképen ne fedjenek át a szervezetek. A többi mintából 50µl-t tárgylemezre cseppentettünk lefedtük fedılemezzel és ezt vizsgáltuk mikroszkóp segítségével. A vizsgálathoz hagyományos (LEICA MB 2500) és inverz (LEICA DM IRB) mikroszkópot is használtunk 200-640X nagyítások között. A fényképeket CANON POWER SHOT G9 digitális fényképezıgéppel készítettük, amelyet egy speciális közgyőrővel rögzítettünk a mikroszkóphoz. A közgyőrőben található egy 10X nagyítású lencse, így körülbelül ugyanolyan nagyítású képet készít a szervezetekrıl, mint amilyet az okuláron keresztül látunk.

Vízminták értékelése A minták egyrészét téli idıszakban vettük, így ezekben kevés szervezetet tudtunk detektálni. Ezek a december 12-i és január 27.-i minták esetében leginkább különbözı kovaalgák (Navicula sp., Cyclotella sp.) 1. ábra és néhány zöldalga (Scenedesmus sp., Chlorella sp.) 2. ábra is elıfordult a szervezetek között. Az elsı két mintavétel során videót is készítetünk a szervezetekrıl.

67

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

Kovaalga

Zöldalga (Scenedesmus sp.)

68

MELLÉKLETEK

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

A februári mintavétel során már sokkal több szervezet fordult elı a vízben, valószínősíthetıen a melegedı idıjárás következtében. Ezen mintavétel során 16 különbözı taxont találtunk a mintákban, nagyrészük itt is kovaalga és zöldmoszat, de elıfordultak házasamıbák és fonalas baktériumok is. A februári mintavétel során az élılények méretét és számát is meghatároztuk mindkét mintavételi pontra. Jelentıs különbség nem adódott köztük, csak kisebb eltérések. Az adatok 2 Excel táblázatban találhatóak a mellékletben. A táblázatban, ahol nem tudták mérni (gyors mozgás miatt, vagy egyéb okokból) ott üres maradt a mezı. A szervezetek számának meghatározásához borításos módszert használtak, azaz néhány látótér leszámolásából következtettek az egy literben lévı élılények számára. Az áprilisi mintavétel során mind fajszámban, mind egyedszámban növekedést tapasztaltak. Ez elsısorban a zöldalgáknak köszönhetı, amelyek a melegedı vízben, a több napsütés hatására egyre nagyobb biomasszával jelentkeztek. Ebben az esetben összesen 22 taxont tudtak elkülöníteni. A mellékletben található táblázatok: Az 1. táblázat a Dagály strand kifolyójánál, míg a 2 táblázat a Népsziget csúcsánál februárban vett minta, a 3. táblázat pedig az áprilisi mintavétel adatait tartalmazza. Ezeknél a több faj és egyedszám miatt már érdemes volt táblázatot készíteni.

Kovaalga (Asterionella sp.)

69

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

Kovaalgat (Aulacoseira sp.)

Kovaalga (Nitzschia sp.)

70

MELLÉKLETEK

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Véglény (Euglypha sp.) A további mintavételek során jelentısen bıvülni fog a lefotózott és megmért taxonok száma, ugyanis az idı melegedésével egyre több faj jelenik meg a természetes vizekben. Nem csak a csoportok száma nı a melegedéssel, hanem az egyedszám is. Ezért késıbb más sőrítési arányokat kell választani a minta-elıkészítés során, hogy az élılények átfedését csökkenthessük.

Adatbázis fejlesztés A lefényképezett és meghatározott szervezetek egy adatbázisba kerülnek, melyeket a SZTAKI hozott létre. Az adatbázisban az élılény nevén kívül szerepelnek az alakjára, felépítésére, méretére utaló jelzık is, valamint a felvételek nagyítása, és az adott mérethez tartozó pixelszám is. Egy szervezetrıl több fénykép is van az adatbázisban, amely segíti majd az alakfelismerı szoftver kialakítását. Az adatbázis folyamatosan növekszik, egyre több felszíni vízben és ivóvízben elıforduló szervezet fényképe kerül fel a hozzájuk tartozó adatokkal. A fényképfelvételekkel párhuzamosan videofilmeket is rögzítettünk, többféle módon. Az egyik módszer szerint, egy átfolyásos küvettán ferdén folyik át a víz, így több síkon megy keresztül a vízben lévı szervezet, míg a másik módszernél tárgylemezen a mozgó szervezetekrıl készül videó. A videofelvételekkel teszteltük a SZTAKI által készített Mintaelemzési és Felismerési Szoftvert, az OKI-ban és a SZTAKI-ban is. A Digitális Holografikus Mikroszkóp Rekonstrukciós Szoftver fejlesztést is közösen végeztük.

71

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Táblázatok Dagály strand kifolyója (2009.02.11.)

Szervezet

Csoport

Méret (hosszúságxszélesség)

Asterionella sp. Chlorella sp. Diatoma sp. Euglypha sp. Nitzschia sp. Navicula sp. Melosira sp. Cyclotella sp Scenedesmus sp. Volvox sp. Pediastrum sp. Euglena sp. Clamidomonas Bodo sp. Spirochatea sp? Fonalas bakt.

kovaalga zöld alga kovaalga véglény kovaalga kovaalga kovaalga kovaalga zöldalga zöldalga zöldalga zöldalga zöldalga véglény fonalas bakt. fonalas bakt.

40x4,2 18 22x5 34x14,3 100x3 39x9 25x20 (egy sejt) 10 14x25

Állatszám Algaszám Trofitás.

98 (nem teljes telep)

35 000 db/l 330 000 db/l szőken termı: 0,330x1000000 db/l (4-es szint)

72

Megjegyzés

db/l 8e 30 e 13 e 5e 40 e 6e 10 e 10 e 3e 20 e 10 e 28 e 80 e 20 e 48 e 74 e

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Népsziget (2009.02.11.)

Szervezet

Csoport

Méret (hosszúságxszélesség)

Asterionella sp. Chlorella sp. Diatoma sp. Euglypha sp. Nitzschia sp. Gyrosigma Gyrosigma Cyclotella sp Scenedesmus sp. Volvox sp. Euglena sp. Clamidomonas Bodo sp. Spirochatea sp? Fonalas bakt.

kovaalga zöld alga kovaalga véglény kovaalga kovaalga kovaalga kovaalga zöldalga zöldalga zöldalga zöldalga véglény fonalas bakt. fonalas bakt.

38,5x3,9 15,4 20,5x5 39x19,3 115x2 28x4,5 28x4,5 10 14x25

Állatszám Algaszám Trofitás.

36 000 db/l 397 000 db/l szőken termı: 0,397x1000000 db/l (4es szint)

73

Megjegyzés

egysejtő amıba

db/l 13 e 44 e 13 e 7,2 e 44 e 3,2 e 10 e 13 e 3,2 e 22 e 29 e 88 e 29 e 52 e 72 e

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

Népsziget (2009.04.20.)

Szervezet Asterionella sp. Surirella Diatoma sp. Nitzschia sp. Navicula sp. Aulacoseira sp. Cyclotella sp Ooccystis Chlorella sp. Scenedesmus sp. Volvox sp. Pandorina sp. Crucigenia sp. Pediastrum sp. Phacus sp. Euglena sp. Trachelomonas sp. Ankistrodesmus sp. Euglypha sp. Cilliata sp. Bodo sp. Fonalas bakt. Állatszám Algaszám Trofitás.

Csoport kovaalga kovaalga kovaalga kovaalga kovaalga kovaalga kovaalga zöldalga zöld alga zöldalga zöldalga zöldalga zöldalga zöldalga euglenophyta euglenophyta euglenophyta zöldalga véglény véglény véglény fonalas bakt.

Méret (hosszúságxszélesség) (ld. pixelben átszámítva az adatbázisban)

29000 423000 szőken termı: 0,423x1000000 db/l (4-es szint)

74

1000db/l 12 8 11 65 10 40 55 10 65 50 20 6 8 10 5 26 20 2 3 5 19

SZAKMAI BESZÁMOLÓ

nd

(2

DHM PROJEKT

MELLÉKLETEK

OKI elıadás címlapja International Conference on CEMEPE and SECOTOX)

75