UJI AKTIVITAS PENANGKAPAN RADIKAL HIDROKSIL OLEH EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU DAN TEH HITAM DENGAN METODE DEOKSIRIBOSA SKRIPSI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

UJI AKTIVITAS PENANGKAPAN RADIKAL HIDROKSIL OLEH EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU DAN TEH HITAM DENGAN METODE DEOKSIRIBOSA

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh : Carla Kuntari NIM : 028114097

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2007



SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi


FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2007

ii


SKRIPSI



Telah disetujui oleh :

iii


iv


When you walk through a storm,keep your head up high and don’t be afraid of the dark. At the end of the storm is a golden sky and the sweet silver song of lark. Walk on through the wind, walk on through the rain, tho’ your dream be tossed and blown. Walk on, walk on with hope in your heart. And you’ll never walk alone. - Oscar H. -

Kupersembahkan karyaku ini kepada: kedua orangtuaku, Drs. B. Rahmanto, M.Hum. dan A.M. Budiarti, AMK. kakakku Lukas Priyambodo, S.E., sahabatku Danang Hendro Pamungkas, almamaterku, terima kasih atas doa, semangat, bantuan, dan perhatian yang besar selama penelitian dan penyusunan karyaku ini

v


PRAKATA Puji dan syukur penulis haturkan kepada Tuhan yang telah melimpahkan berkat dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Ekstrak Etanol Teh Hijau dan Teh Hitam dengan Metode Deoksiribosa” dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Selama penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari peran serta berbagai pihak yang telah memberikan bimbingan, dorongan, dan saran. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan banyak terima kasih kepada : 1. Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. 2. Dra. A. Nora Iska Harnita, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing atas bimbingan, saran, dan kritik selama penelitian sampai penyusunan skripsi ini. 3. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku dosen penguji atas saran dan kritik terhadap skripsi ini. 4. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt. selaku dosen penguji atas saran dan kritik terhadap skripsi ini. 5. Enade Perdana I, S.F., Apt. dan Romo Drs. P. Sunu H., SJ. atas diskusi, kritik, saran, dan pencarian jurnal-jurnal yang turut mendukung dalam penyusunan skripsi ini.

vi


6. PT. Pagilaran yang telah memberikan ijin kepada penulis untuk mempelajari proses pengolahan teh hijau dan teh hitam di pabrik teh PT. Pagilaran Banjarnegara, Jawa Tengah dan Samigaluh, Yogyakarta. 7. Bapak Mukmin, Bapak Prapto, Mas Parlan, Mas Kunto, Bapak Kasiran, Mas Kayat, Mas Wagiran, dan Mas Ottok atas pendampingan dan bantuan selama penelitian. 8. Rekan kerja saat penelitian : Nana, Leny, Ardhyan, dan Vini, terima kasih atas bantuan selama bekerja di “rumah kedua” dan selama penyusunan skripsi ini. 9. Sahabat-sahabat penulis : Rendeng, Bertha, Winda, Lisa, Novi, Anno, terima kasih atas jalinan persahabatan yang indah selama ini. 10. Bapak Yus, Arya, Heri, Danang, dan Kris atas bantuannya selama kunjungan di PT. Pagilaran. 11. Teman-teman praktikum kelompok D dan teman-teman Farmasi angkatan 2002, atas kebersamaannya selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. 12. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu, terima kasih atas segala dukungan moril dan materiilnya.

Penulis

vii


PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Yogyakarta, Februari 2007 Penulis

Carla Kuntari

viii


INTISARI Radikal hidroksil merupakan radikal bebas yang sangat reaktif. Radikal hidroksil dapat memecah rantai DNA dan berperan dalam karsinogenik, mutagenik serta sitotoksik. Dalam tubuh, radikal hidroksil ditangkap oleh sistem antioksidan. Saat jumlah radikal bebas melampaui kapasitas sistem antioksidan, diperlukan antioksidan eksogen. Salah satu antioksidan eksogen adalah polifenol yang terdapat pada teh hijau maupun teh hitam. Polifenol dapat bereaksi dengan radikal hidroksil membentuk produk yang kurang reaktif. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam. Nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil dinyatakan dalam persen penangkapan (% scavenging) dan nilai penangkapan efektif (effective scavenging) radikal hidroksil sebesar 50% (ES50). Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental karena ada subjek uji yang dikenakan manipulasi perlakuan. Metode penangkapan radikal hidroksil yang digunakan adalah metode deoksiribosa. Prinsip metode ini adalah degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil, yang dihasilkan oleh reagen Fenton, membentuk malondialdehid (MDA) yang dalam suasana asam dan adanya asam tiobarbiturat (TBA) menghasilkan kromogen merah muda yang diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum 532 nm. Nilai ES50 dihitung dari persamaan regresi linear antara konsentrasi ekstrak etanol teh hijau atau teh hitam terhadap % scavenging pada berbagai konsentrasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam memiliki aktivitas penangkapan radikal hidroksil dengan nilai ES50 (hasil ekstrapolasi) ekstrak etanol teh hijau adalah 0,281 mg/ml dan ekstrak etanol teh hitam adalah 0,344 mg/ml. Kata kunci : radikal hidroksil, antioksidan, polifenol, ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam, metode deoksiribosa.

ix


ABSTRACT Hydroxyl radical is very reactive free radical. Hydroxyl radical could break DNA chains and play role in carcinogenic, mutagenic, and cytotoxic. Inside the body, antioxidant system can reduce hydroxyl radical but when there is imbalance between the extent of hydroxyl radical and the antioxidant system capacity, body needs exogenous antioxidants. One of them is polyphenols that can be found in green-or black-tea. Polyphenols can react with free radical to form less reactive products. The objective of this research is to know the hydroxyl radical scavenging activity of green-and black-tea ethanolic extract. Hydroxyl radical scavenging activity expressed as percent scavenging and 50 % hydroxyl radical effective scavenging (ES50). This research is a kind of experimental research, because there is treatment to the research subject. The radical scavenging activity method was measured by the deoxyribose method. The principle of this method is degradation of deoxyribose by hydroxyl radical, which generates from Fenton Reagent, to form malondialdehid (MDA) that upon heating with thiobarbituric acid (TBA) at low pH, yield pink chromogen which can be measured in maximum wavelength at 532 nm. The ES50 value can be count by regeresion linear between green-or black-tea ethanolic extract concentration and percent scavenging in each concentration. The result of this research indicated that both of green-and black-tea ethanolic extract have hydroxyl radical scavenging activity with ES50 (extrapolated) value of green tea ethanolic extract is 0.281 mg/ml and black tea ethanolic extract is 0.344 mg/ml. Keywords : hydroxyl radical, antioxidant, polyphenols, green-and black-tea ethanolic extract, deoxyribose method.

x


DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL........................................................................................

ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..............................................

iii

HALAMAN PENGESAHAN..........................................................................

iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ......................................................................

v

PRAKATA.......................................................................................................

vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..........................................................

viii

INTISARI.........................................................................................................

ix

ABSTRACT.......................................................................................................

x

DAFTAR ISI....................................................................................................

xi

DAFTAR TABEL............................................................................................

xv

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................

xvi

DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................... xvii BAB I PENGANTAR ......................................................................................

1

A. Latar Belakang ...........................................................................................

1

1. Permasalahan .......................................................................................

4

2. Keaslian penelitian ...............................................................................

4

3. Manfaat penelitian................................................................................

4

B. Tujuan Penelitian .......................................................................................

5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA...............................................................

6

A. Radikal Bebas ............................................................................................

6

B. Antioksidan ................................................................................................

10

xi


C. Teh .............................................................................................................

11

1. Klasifikasi dan pengolahan teh ............................................................

11

2. Kandungan kimia dalam teh.................................................................

13

3. Manfaat teh ..........................................................................................

16

4. Reaksi radikal bebas dengan polifenol dalam teh ................................

16

D. Metode Deteksi Radikal Hidroksil.............................................................

19

E. Metode Deoksiribosa .................................................................................

19

F. Penyarian....................................................................................................

22

1. Cara penyarian .....................................................................................

22

2. Cairan penyari ......................................................................................

24

G. Spektrofotometri UV-Vis...........................................................................

25

H. Landasan Teori...........................................................................................

30

I. Hipotesis.....................................................................................................

31

BAB III METODE PENELITIAN ..................................................................

32

A. Jenis dan Rancangan Penelitian .................................................................

32

B. Variabel-Variabel Penelitian......................................................................

32

1. Variabel bebas......................................................................................

32

2. Variabel tergantung..............................................................................

32

3. Variabel pengacau................................................................................

32

C. Definisi Operasional ..................................................................................

33

D. Bahan-Bahan Penelitian .............................................................................

33

E. Alat-Alat Penelitian....................................................................................

34

xii


F. Tata Cara Penelitian ...................................................................................

34

1. Pemilihan sampel .................................................................................

34

2. Pembuatan ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam ...............................

35

3. Pembuatan bufer fosfat 20 mM............................................................

35

4. Pembuatan reagen ................................................................................

36

5. Pembuatan larutan deoksiribosa 2,5 mM .............................................

37

6. Pembuatan larutan ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam 1 mg/ml ....

37

7. Optimasi metode ..................................................................................

38

8. Uji aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam ........................................................................................

39

G. Analisis Hasil .............................................................................................

39

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .........................................................

41

A. Pemilihan Sampel ......................................................................................

41

B. Ekstrak Etanol Teh Hijau dan Teh Hitam ..................................................

42

C. Optimasi Metode........................................................................................

44

1. Penentuan operating time (waktu operasional)....................................

44

2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum.............................

48

D. Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Ekstrak Etanol Teh Hijau dan Teh Hitam............................................................................................

50

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN...........................................................

50

A. Kesimpulan ................................................................................................

57

B. Saran ..........................................................................................................

57

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................

58

xiii


LAMPIRAN.....................................................................................................

62

BIOGRAFI PENULIS .....................................................................................

76

xiv


DAFTAR TABEL

Tabel I.

Reactive oxygen species (ROS)......................................................

7

Tabel II.

Proses pengolahan teh hijau ...........................................................

12

Tabel III. Proses pengolahan teh hitam..........................................................

12

Tabel IV. Komposisi dari pucuk daun teh segar ............................................

13

Tabel V.

Karakteristik struktur flavonoid untuk aktivitas penangkapan radikal yang efektif ....................................................................................

17

Tabel VI. Metode dan prinsip deteksi radikal hidroksil .................................

19

Tabel VII. Pemilihan cara penyarian ...............................................................

24

Tabel VIII.Spektrum warna pada daerah visibel..............................................

29

Tabel IX. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan ekstrak etanol teh hijau pada berbagai konsentrasi..................................... Tabel X.

50

Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan ekstrak etanol teh hitam pada berbagai konsentrasi ...................................

51

Tabel XI. Persen scavenging ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam .............

52

Tabel XII.Persamaan regresi linier ekstrak etanol teh hijau sebelum dan sesudah konversi ............................................................................

54

Tabel XIII.Persamaan regresi linier ekstrak etanol teh hitam sebelum dan sesudah konversi ............................................................................

54

Tabel XIV. Persentase penangkapan efektif radikal hidroksil sebesar 50 % oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam ...................................

xv

55


DAFTAR GAMBAR

Gambar 1.

Struktur kimia catechin dalam teh dan epimernya......................

14

Gambar 2.

Struktur kimia theaflavin (a) dan thearubigin (b) .......................

15

Gambar 3.

Struktur kimia flavonol dalam teh ..............................................

15

Gambar 4.

Gambaran gugus-gugus pada flavonoid yang memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal bebas ................................................

Gambar 5.

18

Mekanisme reaksi antara gugus catechol dengan radikal hidroksil ......................................................................................

18

Gambar 6.

Struktur deoksiribosa ..................................................................

19

Gambar 7.

Reaksi penyerangan radikal hidroksil pada deoksiribosa ...........

21

Gambar 8.

Reaksi pembentukan radikal gula peroksil .................................

21

Gambar 9.

Struktur MDA .............................................................................

22

Gambar 10. Kurva hubungan waktu (menit) dengan absorbansi kromogen MDA-TBA ..................................................................................

45

Gambar 11. Reaksi pembentukan gugus enol pada TBA ...............................

46

Gambar 12. Mekanisme reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA ............

47

Gambar 13. Struktur kromogen MDA-TBA...................................................

48

Gambar 14. Kurva hubungan panjang gelombang (nm) dengan absorbansi kromogen MDA-TBA.................................................................

49

Gambar 15. Kurva hubungan antara penambahan konsentrasi ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam dengan absorbansi .................................

51

Gambar 16. Kurva hubungan antara penambahan konsentrasi ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam dengan % scavenging ............................

xvi

55


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Foto ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam ................................

62

Lampiran 2. Tabel Krejcie...............................................................................

63

Lampiran 3. Tabel random sampling ..............................................................

64

Lampiran 4. Contoh penimbangan bahan........................................................

65

Lampiran 5. Contoh perhitungan % scavenging ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam .....................................................................................

74

Lampiran 6. Contoh perhitungan ES50 ............................................................

75

xvii


BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang Radikal bebas merupakan spesi yang bersifat sangat reaktif karena adanya elektron yang tak berpasangan (Fessenden dan Fessenden, 1986) dan mempunyai kemampuan untuk menimbulkan kerusakan, termasuk peroksidasi lipid, lesi DNA (Deoxyribo Nucleic Acid), dan fragmentasi protein dalam sel. Akumulasi dari kerusakan makromolekuler intraseluler merupakan penyebab proses penuaan dini, keriput, noda hitam, dan beberapa penyakit degenerasi seperti kanker dan jantung koroner (Fulder, 2004; Syah, 2006). Manusia mempunyai sistem antioksidan yang mampu melindungi tubuh dari radikal bebas. Sistem antioksidan ini dibagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok enzimatik dan non-enzimatik. Antioksidan enzimatik terdiri dari superoxide dismutase (SOD), katalase, dan glutathione peroxidase. Antioksidan non-enzimatik terdiri dari vitamin E, A, provitamin A (beta karoten), dan vitamin C. Antioksidan enzimatik secara alamiah dihasilkan oleh tubuh sedangkan antioksidan non-enzimatik diperoleh dari luar tubuh (Fouad, 2005). Selain penggolongan antioksidan di atas, dikenal pula senyawa antioksidan alami seperti senyawa polifenol yang terdapat pada teh, buah-buahan, sayuran, anggur, bir, dan kecap (Sofia, 2005) dan senyawa antioksidan sintetik, yang lazim digunakan pada industri makanan, seperti BHA (butylated hydroxyanisole) dan BHT (butylated hydroxytoluene). Namun senyawa sintetik ini

1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2

diduga bersifat karsinogenik (Rajeshwar et al., 2005) dan bersifat toksik pada dosis tinggi (Halliwell dan Gutteridge, 1999)

sehingga mendorong semakin

banyak eksplorasi bahan alam (Kikuzaki dan Nakatani, 1993) seperti polifenol, vitamin C, dan beta karoten, sebagai sumber antioksidan. Penelitian ini merupakan salah satu perwujudan eksplorasi bahan alam khususnya teh hijau dan teh hitam sebagai sumber antioksidan. Minuman teh dikonsumsi di banyak negara, termasuk Indonesia, serta di berbagai lapisan masyarakat. Semua jenis teh dibuat dari sumber yang sama yaitu pucuk dan daun muda tanaman teh (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze.). Berdasarkan proses pengolahannya, produk teh dibagi menjadi tiga jenis yaitu teh hijau (tidak difermentasi), teh oolong (semifermentasi), dan teh hitam (fermentasi) (Tuminah, 2004). Teh mempunyai banyak manfaat pada kesehatan, diantaranya sebagai antioksidan (Hartoyo, 2003). Manfaat teh sebagai antioksidan disebabkan oleh adanya senyawa polifenol yang berperan sebagai penangkap radikal bebas, seperti radikal hidroksil (Fulder, 2004). Fenol-fenol, senyawa dengan suatu gugus –OH yang terikat pada karbon cincin aromatik, merupakan antioksidan yang efektif. (Fessenden dan Fessenden, 1986). Senyawa-senyawa ini bereaksi dengan radikal bebas dan membentuk radikal baru yang distabilisasi oleh efek resonansi inti aromatik (Cuvelier et al., 1994). Senyawa polifenol di dalam teh sebagian besar merupakan senyawa golongan flavonoid subgolongan flavan-3-ol dan flavonol. Adanya banyak gugus hidroksi pada senyawa polifenol mengakibatkan senyawa polifenol ini cenderung


bersifat polar sehingga dapat larut dalam pelarut seperti etanol atau air. Hal ini menjadi dasar pembuatan ekstrak teh hijau dan teh hitam menggunakan kombinasi cairan penyari etanol dan air. Diharapkan di dalam ekstrak etanol teh hijau maupun teh hitam senyawa polifenol dapat tersari dengan optimal. Teh hijau dan teh hitam, yang merupakan dua jenis teh yang populer di Indonesia, mengandung senyawa polifenol (pada persentase yang berbeda antara teh hijau dan teh hitam) sehingga ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam diduga memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal hidroksil. Metode pengujian yang dipilih adalah metode deoksiribosa. Metode ini menggunakan deoksiribosa sebagai model biomolekul dari gula DNA yang terdapat di dalam tubuh sehingga secara tidak langsung memberikan gambaran reaksi radikal hidroksil dalam tubuh. Selain itu, metode ini relatif sederhana dan mudah. Prinsip metode ini adalah degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil, yang dihasilkan oleh reagen Fenton, menghasilkan malondialdehid (MDA) yang dapat bereaksi dengan asam tiobarbiturat (TBA) dalam suasana asam membentuk kromogen berwarna merah muda yang menyerap pada panjang gelombang maksimum 532 nm (Kunchandy and Rao, 1990). Adanya aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam diketahui dengan persen scavenging yang diperoleh dari selisih absorbansi larutan kontrol (tanpa sampel) dan larutan dengan sampel dibagi larutan kontrol dikalikan 100%. Nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil dapat dinyatakan dalam aktivitas penangkapan efektif 50% radikal hidroksil atau effective scavenging 50% (ES50).


1. Permasalahan a. Apakah ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan dalam % scavenging? b. Berapa nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan sebagai ES50?

2. Keaslian Penelitian Sejauh pengetahuan penulis, uji aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam dengan metode deoksiribosa belum pernah dilakukan. Adapun penelitian yang telah dilakukan adalah aktivitas antioksidan dari berbagai macam ekstrak teh dikaitkan dengan aktivitas antimutageniknya (Yen dan Chen, 1995) dan validasi metode deoksiribosa sebagai uji penangkapan radikal hidroksil oleh vitamin C secara in vitro (Purwantoko, 2006).

3. Manfaat a. Manfaat teoritis Mengetahui aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam yang dinyatakan dengan % scavenging dan ES50.


b. Manfaat metodologis Memberikan dukungan dari segi penelitian mengenai aplikasi uji aktivitas penangkapan radikal hidroksil pada bahan-bahan alam khususnya ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam. c. Manfaat praktis Memberikan pertimbangan mengenai penggunaan teh hijau dan teh hitam sebagai sumber antioksidan alami.

B. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk: 1. Mengetahui aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan sebagai % scavenging. 2. Mengetahui nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan dalam ES50.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Radikal Bebas Radikal bebas adalah spesi yang dapat berdiri sendiri yang merujuk kepada atom atau gugus atom apa saja yang memiliki satu atau lebih elekron tak berpasangan (Fessenden dan Fessenden, 1986; Halliwell dan Gutteridge, 1999). Meskipun suatu radikal bebas tidak bermuatan positif atau negatif, spesi semacam ini sangat reaktif karena adanya elektron yang tak berpasangan (Fessenden dan Fessenden, 1986). Radikal dapat dibentuk dari spesi non-radikal yang kehilangan satu elektronnya, penggabungan dengan satu elektron, atau terputusnya ikatan kovalen melalui peristiwa fisi homolitik (homolytic fission). Peristiwa ini terjadi apabila satu elektron dari pasangan elektron terikat pada masing-masing atomnya (Halliwell dan Gutteridge, 1999). Sumber radikal bebas, baik endogen maupun eksogen terjadi melalui sederetan mekanisme reaksi yaitu pembentukan awal radikal bebas (inisiasi), lalu perambatan atau terbentuknya radikal baru (propagasi), dan tahap terakhir (terminasi), yaitu pemusnahan atau pengubahan menjadi radikal bebas stabil dan tak reaktif (Sofia, 2005). Reactive Oxygen Spesies (ROS) adalah suatu istilah yang digunakan para peneliti untuk mencakup tidak hanya radikal oksigen tetapi juga beberapa spesi nonradikal yang merupakan derivat O2 (Tabel I).

6


Tabel I. Reactive oxygen species (ROS) (Halliwell dan Gutteridge, 1999; Sofia, 2005) Radikal

Non-radikal

Superoksida,

O2

Hidrogen peroksida,

H2O2

Hidroksil,

OH

Asam hipoklorit,

HOCl

Peroksil,

RO2

Ozon,

O3

Alkoksil,

RO

Oksigen singlet,

∆gO2

Hidroperoksil,

HO2

Peroksinitrit,

ONOO -

Oksigen aktif dalam bentuk superoksida, hidrogen peroksida, dan radikal hidroksil merupakan hasil sampingan metabolisme normal dan menyerang molekul biologis yang dapat menyebabkan kerusakan sel atau jaringan (Yen dan Chen, 1995; Cerutti cit. Yen dan Chen, 1995). Radikal hidroksil merupakan bentuk yang amat reaktif dan dihasilkan oleh fotolisis ultraviolet hidrogen peroksida dan dapat berlaku sebagai toksikan primer dan sebagai sumber toksikan sekunder. Radikal hidroksil yang dihasilkan dekat DNA secara perlahan-perlahan dapat memecah rantai DNA dan berperan dalam karsinogenik, mutagenik serta sitotoksik (Rafat et al., cit. Roy et al., 2001). Dalam sel, ROS sangat cepat ditangkap oleh sistem pertahanan antioksidan (antioxidant defense system). Saat peningkatan pembentukan ROS tidak dapat ditanggulangi oleh sistem pertahanan antioksidan, tercetus situasi yang disebut stress oksidatif. Semua ROS bersifat sangat reaktif karena memiliki konfigurasi elektron yang tidak stabil sehingga mampu menarik elektron dari molekul lainnya dan menciptakan radikal-radikal bebas lain yang mampu bereaksi dengan lebih banyak molekul lainnya (Blokhina, 2000). Efek oksidatif radikal bebas dapat menyebabkan peradangan dan penuaan dini. Lipid yang seharusnya menjaga kulit agar tetap segar berubah menjadi lipid


peroksida karena bereaksi dengan radikal bebas sehingga mempercepat penuaan. Kanker disebabkan oleh oksigen reaktif yang intinya memacu zat karsinogenik, sebagai faktor utama kanker. Oksigen reaktif dapat meningkatkan kadar LDL (low density lipoprotein) yang kemudian menjadi penyebab penimbunan kolesterol pada dinding pembuluh darah dengan akibat timbulnya atherosklerosis (Sofia, 2005). Radikal bebas yang dikenal sangat reaktif adalah radikal hidroksil. Nilai standar potensial reduksinya adalah 2,31 V. Radikal hidroksil bereaksi sangat cepat dengan hampir semua tipe molekul dalam sel hidup, yaitu gula, asam amino, fosfolipid, basa DNA, dan asam organik. Reaksi radikal hidroksil dengan DNA mengakibatkan kerusakan penting dalam sel, mengingat kerusakan rantai DNA tidak dapat dengan mudah diperbaiki oleh sel (Halliwell dan Gutteridge, 1999). Radikal hidroksil dapat dihasilkan dari reaksi Fenton atau reaksi fisi homolitik ikatan O-O pada H2O2. Reaksi Fenton: H2O2 + Fe2+ → Fe(III) + OH ¯ + ˙OH Fisi homolitik: H

O

O

H

UV

2 OH

Selain itu, radikal hidroksil juga dapat dibentuk dari reaksi H2O2 dengan adanya ionion logam Cu+ (Halliwell dan Gutteridge, 1999). Reaksi radikal hidroksil dapat dikelompokkan menjadi tiga macam yaitu: abstraksi (pemisahan) hidrogen, adisi, dan transfer (perpindahan) elektron. Reaksi radikal bebas dengan spesi non-radikal menghasilkan radikal bebas baru yang kurang atau sama-sama reaktif dibandingkan radikal bebas awal. Contoh reaksi abstraksi hidrogen adalah reaksi antara radikal hidoksil dengan alkohol membentuk air dan satu elektron tak berpasangan pada atom karbon. Reaksi pemisahan hidrogen ini


menjadi sangat penting karena memiliki hubungan secara biologis dengan terjadinya peroksidasi lipid (Halliwell dan Gutteridge, 1999).

H

H

H

C

C

H

H

H O

+

H

H

OH

C

C

H

H

O

H

+

H2O

radikal hidroksietil

Reaksi adisi radikal hidroksil dapat terjadi pada reaksi radikal hidroksil dengan senyawa aromatik. Contohnya adisi radikal hidroksil pada cincin purin pada basa purin DNA menghasilkan radikal δ-hidroksiguanin. Radikal hidroksil juga mengalami reaksi adisi pada atom yang mempunyai ikatan rangkap. HO C

C

+

OH

C

C

Jika radikal hidroksil menyerang DNA yang menyebabkan kerusakan pada basanya (dan gula deoksiribosa) maka hal ini akan memacu pecahnya ikatan pada DNA (Halliwell dan Gutteridge, 1999). Radikal hidroksil berperan pada transfer elektron, contohnya pada reaksi dengan ion halida. Reaksi transfer elektron dapat terjadi pada reaksi antara radikal hidroksil dengan ion halida dan dengan ion nitrit. Contoh reaksi radikal hidroksil dengan ion halida adalah sebagai berikut: Cl

OH

Cl

+ Cl

Cl2

+

Cl

+

OH

Reaksi antara radikal hidroksil dengan ion nitrit adalah sebagai berikut: NO2

+

OH

NO2 + OH


B. Antioksidan Istilah antioksidan sering digunakan namun sangat jarang didefinisikan secara jelas. Menurut Fessenden dan Fessenden (1986), antioksidan merupakan suatu inhibitor reaksi radikal bebas yang kadang-kadang dirujuk sebagai suatu “perangkap” radikal bebas. Kerja yang lazim suatu inhibitor radikal bebas adalah bereaksi dengan radikal bebas reaktif membentuk radikal bebas tak reaktif dan relatif stabil. Menurut Halliwell dan Gutteridge (1999), antioksidan adalah substansi yang bila diberikan pada konsentrasi rendah dibandingkan substrat yang mudah dioksidasi, secara signifikan menunda atau menghambat oksidasi substrat tersebut. Ada dua kategori antioksidan yaitu antioksidan enzim dan antioksidan nonenzimatik (Harman, 1981). Antioksidan enzim mencakup superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT), dan glutation peroksidase (GPx). Superoksida dismutase mengubah superoksida menjadi hidrogen peroksida; katalase dan glutation peroksidase mengubah hidrogen peroksida dari reaksi SOD menjadi air. Sebagai tambahan, glutatione peroksidase dapat menurunkan peroksidasi lipid secara langsung (Blokhina, 2000). Antioksidan non-enzimatik mencakup vitamin E, vitamin C, beta karoten, glutation, asam urat, dan albumin. Bersama-sama, enzim-enzim dan antioksidan non enzimatik mengubah ROS menjadi komponen yang lebih aman sebelum ROS menyebabkan kerusakan pada sel dan jaringan (Fouad, 2005). Selain penggolongan antioksidan di atas, dikenal pula senyawa antioksidan alami seperti senyawa polifenol yang terdapat pada teh, buah-buahan, sayuran, anggur, bir, dan kecap (Sofia, 2005) dan senyawa antioksidan sintetik, yang lazim


digunakan pada industri makanan, seperti BHA (butylated hydroxyanisole) dan BHT (butylated hydroxytoluene).

C. Teh Semua jenis produk teh berasal dari sumber yang sama yaitu pucuk dan daun muda tanaman teh (Camellia sinensis). Keberagaman berbagai jenis teh yang ada disebabkan karena adanya perbedaan dalam proses pengolahannya (Werkhoven, 1988). 1. Klasifikasi dan pengolahan teh Secara umum, daun teh diolah menjadi teh hijau, teh oolong, dan teh hitam. Teh hijau dan teh hitam telah umum diproduksi di Indonesia sedangkan teh oolong diproduksi di China. Perbedaan antara teh hijau dan teh hitam adalah pada ada tidaknya reaksi enzimatik yang berlangsung selama proses pengolahan teh. Pada teh hitam, dikenal adanya proses fermentasi sedangkan pada teh hijau proses fermentasi justru dicegah (Werkhoven, 1988). Pada teh oolong, proses pemanasan daun terjadi dalam waktu singkat setelah penggulungan sehingga disebut teh semifermentasi. Karakteristiknya berada di antara teh hitam dan teh hijau (Syah, 2006). Proses pengolahan teh hijau dapat dilihat pada tabel II sedangkan proses pengolahan teh hitam dapat dilihat pada tabel III. Pada proses fermentasi dalam pengolahan teh hitam, enzim polifenol oksidase akan mengubah senyawa polifenol menjadi theaflavin dan thearubigin. Secara umum, theaflavin berperan dalam kecerahan (brightness) dan ketajaman (astringentcy) seduhan teh hitam (Syah, 2006). Pada tanaman, enzim polifenol tidak


kontak langsung dengan polifenol karena polifenol terdapat dalam vakuola sel sedangkan enzim polifenol oksidase terdapat dalam sitoplasma (Werkhoven, 1988; Syah, 2006). Tabel II. Proses pengolahan teh hijau (Hartoyo, 2003) Tahap pengolahan Pemanasan Penggulungan Pengeringan

Sortasi

Tujuan

Pelaksanaan

Menginaktifkan enzim oksidase dan mengurangi kadar air daun sehingga mudah digulung. Membuat bentuk daun menjadi tergulung dan memeras cairan sel ke permukaan. Mengurangi kadar air, mematikan enzim yang mungkin masih punya aktivitas, memperpanjang masa simpan, dan membentuk daun menjadi keriting dan berbutir.

Daun segar dimasukkan dalam rotary panner suhu 90-100°C selama 5 menit. Daun digulung dengan orthodox roller kecil selama 10-20 menit.

Memisahkan partikel bukan teh, menyeragamkan ukuran dan bentuk partikel, dan menggolong-golongkan dalam grade teh.

Pengeringan secara bertahap. 1. Tahap 1: menggunakan pengering sinambung suhu 100 °C selama 20-22 menit. 2. Tahap 2 : menggunakan pengering berputar (rotary drier atau boll tea) dengan suhu 80°C selama 60-80 menit. Mengayak, menghembus, menghilangkan serat dan tangkai, dan memotong (bila perlu).

Tabel III. Proses pengolahan teh hitam (Hartoyo, 2003; Werkhoven, 1988; Syah, 2006) Tahap pengolahan Pelayuan

Tujuan

Pelaksanaan

Mengurangi kadar air daun sehingga mudah digulung dan dihancurkan.

Daun segar dialiri udara hangat (≤ 30°C) dan kelembaban moderat (RH 60%) selama 18-20 jam. Pucuk layu digulung bertahap dengan mesin ortodhox roller (Primary rolling selama 40 menit, rotavane selama 2 menit, dan secondary rolling selama 15 menit). Meletakkan pucuk tergulung pada baki selama 30 menit dengan suhu ruangan 26-28°C dan kelembaban 85-95%. Pengeringan secara sinambung dengan suhu 90-100°(inlet) selama 25-30 menit. Mengayak, menghembus, menghilangkan serat dan tangkai, dan memotong (bila perlu).

Penggulungan

Memperkecil ukuran partikel daun dan menciptakan kondisi fisik terbaik untuk mempertemukan polifenol dengan enzim polifenol oksidase.

Fermentasi

Mempertemukan polifenol dengan enzim polifenol oksidase.

Pengeringan

Menghentikan aktivitas enzim memperpanjang umur simpan.

Sortasi

Memisahkan partikel bukan teh, menyeragamkan ukuran dan bentuk partikel, dan menggolong-golongkan dalam grade teh.

dan


2. Kandungan kimia dalam teh Daun teh memiliki banyak senyawa kimia yang merupakan zat bioaktif. Gambaran mengenai komposisi pucuk daun teh segar disajikan pada tabel IV. Tabel IV. Komposisi dari daun teh segar (Werkhoven, 1988) Senyawa

%

Polifenol yang dapat difermentasi Polifenol lain Kafein Gula dan zat bergetah Asam amino Mineral Larut dalam air, total

Senyawa

20 10 4 3 7 4 48

Fiber kasar, selulosa, lignin Protein Lemak Klorofil dan pigmen Pektin Amilum Tidak larut dalam air, total

%

22 16 8 1,5 4 0,5 52

Polifenol, kafein, asam amino, asam organik, mineral, dan gula terdapat dalam vakuola sel. Enzim-enzim terdapat dalam sitoplasma. Protein, lemak, dan tepung terdapat dalam protoplasma. Selulosa, pektin terdapat terdapat dalam dinding sel (Syah, 2006). Secara garis besar, senyawa-senyawa aktif dalam daun teh dapat digolongkan menjadi empat kelompok, yaitu: substansi fenol, substansi bukan fenol, substansi penyebab aroma, dan enzim (Syah, 2006). a. Substansi fenol. Polifenol dalam teh terdiri dari senyawa golongan flavonoid terutama subgolongan flavanol dan flavonol. Flavanol dalam teh secara struktural termasuk subgolongan flavan-3-ol. Catechin utama dalam teh terdiri dari (-)-Epicatechin, (-)-Epigallocatechin, (-)-Epicatechin 3-gallate, (-)-Epigallocatechin 3-gallate (Hartoyo, 2003; Syah, 2006). Kandungan catechin dalam produk teh hijau adalah 16-30% berat kering teh (Syah, 2006). Gambar struktur kimia senyawa catechin dapat dilihat pada gambar 1.


Dalam proses pengolahan teh hitam, catechin dioksidasi oleh enzim polifenol oksidase menjadi theaflavin dan thearubigin. Secara garis besar, theaflavin terdiri dari theaflavin, theaflavin 3-galat, theaflavin 3´galat, theaflavin 3,3´ digalat, yang terbentuk karena adanya reaksi yang terjadi antara quinon (turunan catechin) dengan gallocatechin (Roy et al., 2001; Hartoyo, 2003). OH

OH

OH

OH HO

HO

O

O

R1

R1 OR2

OR2

OH O

OH

OH O

OH OH

Galat (X) = OH

(-)-Epicatechin: R1 = R2 = H (-)-Epigallocatechin: R1 = OH, R2 = H (-)-Epicatechin gallate: R1 = H, R2 = X (-)-Epigallocatechin gallate: R1 = OH, R2 = X

OH

X= OH

(-)-Catechin: R1 = R2 = H (-)-Gallocatechin: R1 = OH, R2 = H (-)-Catechin gallate: R1 = H, R2 = X (-)-Gallocatechin gallate: R1 = OH, R2 = X

Gambar 1. Struktur kimia catechin dalam teh dan epimernya (Hartoyo, 2003)

Gambar struktur kimia theaflavin dan thearubigin dapat dilihat pada gambar 2. Kandungan theaflavin di dalam teh hitam adalah 0,3-2% dan thearubigin adalah 10-20% dari berat kering teh (Syah, 2006). Flavonol utama dalam teh adalah quercetin, kaemferol, dan myricetin yang ada dalam jumlah 2-3%. Gambar struktur kimia flavonol dalam teh disajikan pada gambar 3. Flavonol ini, terutama terdapat dalam bentuk glikosidanya dan sedikit dalam bentuk aglikonnya (Hartoyo, 2003). Flavonol merupakan salah satu antioksidan alami yang terdapat dalam tanaman dan mempunyai kemampuan mengikat logam. Aktivitas antioksidan flavonol bertambah besar seiring dengan bertambahnya gugus hidroksil dalam cincin A dan B (Syah, 2006).


OH

OH

R

OR2

HO

OH

O

HO

O

COOH COOH

HO

OH

O

HO

O O

O OR1 OH

OH

OH

R

O

OH

Galat =X =

OH

R = Galat

(a)

(b)

Theaflavin: R1 = R2 = H OH Theaflavin 3-galat: R1 = X, R2 = H Theaflavin 3'-galat: R1 = H, R2 = X Theaflavin 3,3'-digalat: R1 = X, R2 = X Gambar 2.

OH

Struktur kimia theaflavin (a) dan thearubigin (b) (Hartoyo, 2003; Lambert dan Yang, 2003) R2 OH B

HO

O A

R3

C

R1 OH

O

Myricetin: R1 = R2 = R3 = OH Quercetin: R1 = R2 =OH, R3 = H Kaemferol: R1 = OH, R2 = R3 = H Gambar 3. Struktur kimia flavonol dalam teh (Hartoyo, 2003)

b. Substansi bukan fenol. Termasuk di antaranya adalah karbohidrat (sukrosa, glukosa, dan fruktosa), pektin, alkaloid (kafein), klorofil, dan zat warna yang lain, protein dan asam amino, asam organik, substansi resin, vitamin (C, K, A, B1, dan B2), mineral (Mg, K, F, Na, Ca, Zn, Mn, Cu, dan Se). Selama proses pengolahan teh, vitamin C mengalami oksidasi sehingga jumlahnya menjadi semakin kecil. Laju oksidasi vitamin C dipacu oleh temperatur yang tinggi (Syah, 2006).


c. Substansi penyebab aroma. Munculnya aroma pada teh hitam langsung atau tidak langsung selalu dihubungkan dengan terjadinya oksidasi senyawa catechin. Substansi penyebab aroma teh digolongkan menjadi empat yaitu fraksi karboksilat, fenolat, karbonil, dan fraksi netral bebas karbonil. Ada pendapat lain yang menyatakan bahwa aroma teh berasal dari penguraian protein, oksidasi karotenoid menjadi senyawa yang mudah menguap atau karena adanya minyak essensial dalam teh (Syah, 2006). d. Kandungan enzim. Enzim yang terkandung dalam daun teh adalah invertase, amilase, β-glukosidase, oksimetilase, protease, dan peroksidase. Enzim lain yang tidak penting dalam proses kehidupan tanaman namun penting dalam proses pengolahan teh adalah polifenol oksidase (Syah, 2006).

3. Manfaat teh Teh mempunyai banyak manfaat pada kesehatan, diantaranya antioksidan, menghambat oksidasi LDL (Low Density Lipoprotein), mereduksi kolesterol, antitrombosis, antimikroba, antivirus, memberikan perlindungan terhadap kanker, menurunkan tekanan darah, mengurangi kadar gula darah, mempertahankan berat tubuh ideal, dan mengurangi stress (Hartoyo, 2003).

4. Reaksi radikal hidroksil dengan polifenol dalam teh Potensi teh sebagai antioksidan disebabkan oleh adanya senyawa polifenol yang merupakan senyawa flavonoid subgolongan flavan-3-ol dan flavonol. Senyawa tersebut mampu menangkap radikal bebas karena gugus hidroksi fenolik yang


terdapat dalam strukturnya. Reaksi antara gugus tersebut dengan radikal bebas akan membentuk radikal baru yang distabilisasi oleh efek resonansi inti aromatik (Cuvelier et al., 1994). Tabel berikut menyajikan karakteristik dari struktur flavonoid yang turut menentukan aktivitas flavonoid sebagai penangkap radikal bebas yang efektif (Middleton et al., 2000). Gambaran gugus-gugus yang tercantum pada tabel V disajikan pada gambar 4. Menurut Amić et al. (2003), setelah melakukan analisis hubungan struktur-aktivitas penangkapan radikal, diindikasikan bahwa flavonoid yang memiliki gugus catechol pada cincin B dan atau gugus hidroksi pada C3 memiliki aktivitas penangkapan radikal yang tinggi. Mekanisme reaksi flavonoid dalam teh dengan suatu radikal bebas, misalnya radikal hidroksil, ditunjukkan pada gambar 5. Tabel V. Karakteristik struktur flavonoid untuk aktivitas penangkapan radikal yang efektif (Middleton et al., 2000)

• Gugus catechol (O-dihidroksi) pada cincin B, memberikan kemampuan penangkapan yang besar. • Gugus pyrogallol (Trihidroksi) pada cincin B, memberikan aktivitas yang lebih tinggi lagi, seperti pada myricetin. Ikatan rangkap C2-C3 pada cincin C memperlihatkan peningkatan aktivitas penangkapan karena memberikan stabilitas pada radikal fenoksi yang dihasilkan. • 4-oxo (gugus keton pada posisi 4 di cincin C), bila berhubungan dengan ikatan rangkap pada C2-C3 maka aktivitas penangkapan akan meningkat dengan cara delokalisasi elektron dari cincin B. • Gugus 3-OH pada cincin C menghasilkan penangkapan yang sangat besar. Kombinasi ikatan rangkap pada C2-C3 dan 4-oxo memperlihatkan kombinasi terbaik di atas gugus catechol. • Gugus 5-OH dan 7-OH juga menambah potensi penangkapan pada beberapa kasus.


OH 3' 2' 1 O

8

HO

3'

5'

2

2'

6'

C 3 OH

4

1 O

8

HO

6 5

OH

B

7 A

OH 4'

B 2

OH 4'

5'

7

OH

6'

A

C 3

OH

Epicatechin

6 5

4

= gugus catechol OH = gugus pyrogallol = gugus 4-oxo = gugus 3-OH = gugus 5-OH, 7-OH = kombinasi gugus 4-oxo dan ikatan rangkap C2-C3

OH

O

Myricetin

Gambar 4. Gambaran gugus-gugus pada flavonoid yang memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal bebas (Middleton et al., 2000) OH O

O

O

H

OH

OH

OH

-H2O

O

O

O O

O

H

OH

-H2O

O O

Gambar 5. Mekanisme reaksi antara gugus catechol dengan radikal hidroksil

OH


D. Metode Deteksi Radikal Hidroksil Metode dan prinsip deteksi radikal hidroksil dapat dilihat pada tabel VI. Tabel VI. Metode dan prinsip deteksi radikal hidroksil (Bors et al., 1979; Halliwell and Gutteridge, 1999) Metode

Prinsip Metode

Pemucatan p-nitrosodimetilanilin (p-NDA)

p-nitrosodimetilanilin bereaksi cepat dengan radikal hidroksil tetapi tidak bereaksi dengan O2˙¯ atau singlet O2. Reaksi ini akan diikuti pemucatan warna kuning. Metode deoksiribosa Reaksi antara radikal hidroksil dengan deoksiribosa menghasilkan MDA, lalu dipanaskan dengan asam tiobarbiturat pada pH rendah, akan menghasilkan warna merah muda. Metode triptofan Reaksi antara radikal hidroksil dengan triptofan akan menghasilkan satu set produk yang khas. Metode dimetilsulfoksida Radikal hidroksil bereaksi dengan (DMSO) dimetilsulfoksida (DMSO) menghasilkan antara lain gas metana yang dideteksi dengan Gas Liquid Chromatography atau formaldehid yang dideteksi secara kolorimetri.

E. Metode Deoksiribosa Deoksiribosa (2-deoksi-D-ribosa) merupakan gula yang mempunyai lima atom karbon yang merupakan turunan dari suatu gula pentosa yaitu ribosa. Gula ini merupakan bagian dari DNA. Gambar struktur deoksiribosa disajikan pada gambar 6.

Gambar 6. Struktur deoksiribosa


Beberapa produk degradasi deoksiribosa, saat dipanaskan pada pH rendah terdekomposisi menjadi malondialdehid (MDA), yang dapat dideteksi dengan penambahan asam tiobarbiturat (TBA) menghasilkan kromogen MDA-TBA yang berwarna merah muda. Pembentukan MDA dari deoksiribosa menjadi dasar uji penangkapan radikal hidroksil (uji deoksiribosa) (Halliwell dan Gutteridge, 1999). Proses degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil terjadi melalui beberapa tahap. Tahap-tahap ini terjadi pada saat campuran reaksi yang terdiri dari reagen Fenton (FeCl3, EDTA, H2O2, vitamin C) dan deoksiribosa diinkubasi pada suhu 37ºC selama 30 menit. Tahap-tahap reaksi tersebut adalah reaksi pembentukan radikal hidroksil dari reaksi Fenton dan degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil (Halliwell dan Gutteridge, 1999). Tahap I. Reaksi pembentukan radikal hidroksil. Radikal hidroksil dihasilkan melalui reaksi Fenton. Dalam reaksi Fenton, vitamin C berfungsi sebagai reduktor yang mempercepat proses reduksi Fe3+ menjadi Fe2+. Semakin cepat Fe3+ direduksi menjadi Fe2+ maka semakin cepat pembentukan radikal hidroksil karena Fe2+ akan bereaksi dengan H2O2 dan menghasilkan radikal hidroksil (•OH). Penambahan suatu ligan (EDTA) pada besi dapat meningkatkan konstante kecepatan reaksi antara Fe2+ dengan H2O2. Reaksinya adalah sebagai berikut : Fe3+EDTA + Asam Askorbat Fe2+EDTA + H2O2

Fe2+EDTA + Asam Dehidro Askorbat Fe3+EDTA + -OH + •OH

Tahap II. Degradasi deoksiribosa. Radikal hidroksil akan menyerang deoksiribosa dan mendegradasinya menjadi fragmen-fragmen. Semua posisi pada struktur gula deoksiribosa memungkinkan untuk diserang oleh radikal hidroksil


membentuk radikal deoksiribosa melalui reaksi abstraksi hidrogen (gambar 7) yang dengan adanya O2 akan diubah secara cepat menjadi radikal gula peroksil (gambar 8). Selanjutnya terjadi serangkaian reaksi yaitu disproporsionasi, penataan ulang, eliminasi air, dan pemecahan ikatan C–C menghasilkan produk karbonil yag bervariasi. Konstante kecepatan reaksi orde dua dari reaksi antara radikal hidroksil dengan gula deoksiribosa pada pH 7,4 adalah 3,1 x 109 M-1s-1 (Halliwell dan Gutteridge, 1999). Beberapa produk degradasi deoksiribosa, saat dipanaskan pada pH rendah akan terdekomposisi menjadi MDA (gambar 9) (Halliwell dan Gutteridge, 1999). HO

HO O

H2C

O H

HO

OH

+

_ HO 2

O

H2C

O H

H

HO

Deoksiribosa

Gambar 7. Reaksi penyerangan radikal hidroksil pada deoksiribosa (Halliwell dan Gutteridge, 1999) HO

HO O

H2C

O

O

H2C

O

H

H +

HO

O

O HO

OO

Radikal Gula Peroksil Gambar 8. Reaksi pembentukan radikal gula peroksil (Halliwell danGutteridge, 1999).


O

O

H

H

Gambar 9. Struktur MDA

F. Penyarian Penyarian adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Secara umum, cara penyarian dapat dibedakan menjadi infundasi, maserasi, perkolasi, dan penyarian berkesinambungan. Sebagai cairan penyari digunakan air, eter, atau campuran etanol air. Penyarian dengan campuran etanol dan air dilakukan dengan cara maserasi atau perkolasi (Anonim, 1986). 1. Cara penyarian a. Infundasi. Cara infundasi adalah proses penyarian yang umumnya digunakan untuk menyari zat kandungan aktif yang larut dalam air dari bahan-bahan nabati. Sari yang dihasilkan tidak stabil dan mudah dicemari oleh kuman dan kapang. Oleh sebab itu sari yang diperoleh dengan cara ini tidak boleh disimpan lebih dari 24 jam. Infundasi dibuat dengan cara menyari simplisia dengan air pada suhu 90°C selama 15 menit (Anonim, 1986) b. Maserasi. Cara maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari sehingga cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif. Adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel mengakibatkan pendesakan larutan terpekat dari


dalam sel ke luar sel. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel (Anonim, 1986). Maserasi dapat dilakukan modifikasi misalnya dengan teknik remaserasi. Pada teknik ini, cairan dibagi menjadi 2 kemudian seluruh serbuk simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah dienaptuangkan dan diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari kedua (Anonim, 1986). c. Perkolasi. Cara perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Cairan penyari akan dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk kemudian cairan akan melarutkan zat aktif di dalam sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh. Serbuk simplisia yang akan diperkolasi dibasahi terlebih dahulu dengan cairan penyari kemudian dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam alat perkolasi (perkolator) sambil tiap kali ditekan. Serbuk kemudian ditutup dengan kertas saring dan cairan penyari dialirkan hingga di atas permukaan massa masih terdapat lapisan cairan penyari. Setelah 24 jam, keran dibuka dan diatur hingga kecepatan penetesan adalah 1 ml per menit. Akhir proses perkolasi ditentukan dengan pemeriksaan zat secara kualitatif pada perkolat terakhir. d. Penyarian berkesinambungan. Proses ini merupakan gabungan antara proses untuk menghasilkan ekstrak cair dan proses penguapan. Alat yang digunakan misalnya Soxhlet. Pada penyarian ini, cairan penyari dipanaskan hingga mendidih, kemudian uap penyari akan naik ke atas kemudian akan mengembun karena didinginkan oleh pendingin balik. Embun akan turun melalui serbuk simplisia sambil melarutkan zat aktif serbuk simplisia.


Pemilihan cara penyarian disesuaikan dengan zat aktif yang akan disari, misalnya dari segi ketahanan zat aktif terhadap adanya proses pemanasan. Selain itu, bentuk, nilai terapeutik, dan nilai ekonomis juga perlu diperhitungkan. Salah satu contoh pemilihan cara penyarian dapat dilihat pada tabel VII. Tabel VII. Pemilihan cara penyarian No

1 2 3 4 5 6 7 8

Perihal

Simplisia keras Simplisia lunak dan parenkimatik Sulit diserbuk seperti asam Bahan tidak kompak seperti Benzoin Nilai terapeutik besar, misal kina Nilai terapeutik kurang, misal aroma Harga mahal Harga murah

Perkolasi

Maserasi

+ + + + + + + +

2. Cairan penyari Pemilihan cairan penyari harus mempertimbangkan banyak faktor. Cairan penyari yang baik harus memenuhi kriteria yaitu murah dan mudah didapat, stabil secara fisika dan kimia, netral, tidak mudah menguap atau terbakar, selektif, tidak mempengaruhi zat berkhasiat, dan diperbolehkan oleh peraturan (Anonim, 1986). Farmakope Indonesia Edisi III menetapkan bahwa sebagai cairan penyari adalah air, eter, atau campuran etanol air. Etanol dapat melarutkan alkaloid basa, minyak menguap, glikosida, kurkumin, kumarin, antrakinon, flavonoid, steroid, damar, dan klorofil. Lemak, malam, tanin, dan saponin hanya sedikit larut di dalam etanol. Campuran etanol dan air dapat digunakan untuk meningkatkan penyarian (Anonim, 1986).


G. Spektrofotometri UV-Vis Teknik spektroskopik adalah salah satu teknik fisiko-kimia yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik. Tiga hal yang mungkin

terjadi

sebagai

akibat

interaksi

atom

molekul

dengan

radiasi

elektromagnetik adalah hamburan (scattering), absorpsi (absorption) dan emisi (emission) (Mulja dan Suharman, 1995). Spektrofotometri UV-Vis merupakan anggota teknik analisis spektroskopik yang dihasilkan dari absorpsi radiasi elektromagnetik oleh atom atau molekul memakai sumber radiasi elektromagnetik ultra violet dekat (190-380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm) dengan menggunakan instrumen spektrofotometer (Mulja dan Suharman, 1995). Ada empat macam transisi elektron di dalam suatu molekul. (1) Elektron yang tidak berada dalam ikatan. Energi eksitasi elektron ini sangat tinggi dan tidak memiliki kontribusi pada absorbsi di daerah visibel maupun UV. (2) Elektron pada ikatan kovalen tunggal (elektron sigma, σ). Energi eksitasi elektron ini juga terlalu tinggi sehingga tidak memberikan kontribusi pada absorpsi di daerah visibel atau UV (contohnya pada ikatan kovalen hidrokarbon jenuh). (3) Pasangan elektron bebas pada kulit terluar (elektron n), contohnya pada N, O, S, dan halogen. Elektron ini cenderung diikat kurang kuat dibandingkan elekton sigma dan dapat tereksitasi oleh radiasi visibel atau UV. (4) Elektron pada orbital π (pi), contohnya pada ikatan rangkap dua atau tiga. Elektron ini paling mudah tereksitasi dan bertanggung jawab pada sebagian besar spektra pada daerah visibel dan UV (Christian, 2004).


Efek absorpsi radiasi pada molekul menghasilkan transisi elektron ke tingkat yang lebih tinggi yang dikenal sebagai orbital antibonding. Transisi yang paling umum adalah transisi dari π atau n menuju π* (Christian, 2004). Eksitasi elektron σ→σ* yang diberikan oleh ikatan tunggal, sebagai contoh pada alkana, membutuhkan energi yang paling besar. Eksitasi elektron π → π* diberikan oleh ikatan rangkap dua dan tiga (alkena dan alkuna). Pada gugus karbonil (dimetil keton dan asetaldehid) terjadi eksitasi elektron n → σ* dan eksitasi elektron n → π* yang terjadi pada λ = 280-290 nm tetapi eksitasinya terlarang karena memberikan nilai

ε=12-16 cm-1mol-1L (Mulja dan Suharman, 1995). Senyawa organik pada umumnya dan semua gugus atau gugusan atom yang mengabsorpsi radiasi UV-Vis disebut sebagai gugus kromofor (Mulja dan Suharman, 1995). Gugus kromofor terdiri dari gugus tak jenuh yang menjalani transisi π → π* dan n → π*. Contoh beberapa kromofor adalah sebagai berikut :

C

C

C

C

O N

N

NO2

C

(Fessenden dan Fessenden, 1986). Pada gugus organik dikenal pula gugus auksokrom, yaitu gugus fungsionil yang mempunyai elektron bebas seperti –OH, -NH2, dan OCH3 yang memberikan transisi (n→σ*). Terikatnya gugus auksokrom oleh gugus kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang yang lebih panjang (pergeseran merah = batokromik) disertai peningkatan intensitas (efek


hiperkromik). Pergeseran batokromik juga terjadi pada dua ikatan rangkap yang terkonjugasi butadien (

C H

C H

C H

)(Mulja dan Suharman, 1995).

C H

Kuantitas energi yang diserap oleh suatu senyawa berbanding terbalik dengan panjang gelombang radiasi: ∆E = hv =

hc λ

dengan ∆E = energi yang diabsorpsi (erg); h = tetapan Planck (6,6 x 10 -27) erg-det; v = frekuensi (Hz); c = kecepatan cahaya (3 x 1010 cm/det); λ = panjang gelombang (cm) (Fessenden dan Fessenden, 1986). Analisis dengan spektrofotometer UV-Vis melibatkan pembacaan absorban radiasi elektromagnetik oleh molekul atau radiasi elektromagnetik yang diteruskan. Keduanya dikenal sebagai absorban (A) tanpa satuan dan transmitan dengan satuan persen. Hubungan antara intensitas radiasi elektromagnetik yang diserap oleh sistem (Io) dengan intensitas radiasi yang ditransmisikan (It) dapat dijelaskan dengan hukum Lambert-Beer yang menyatakan hubungan antara transmitan dan absorbansi terhadap intensitas radiasi atau konsentrasi zat yang dianalisis dan tebal larutan yang mengabsorbsi. Hubungan tersebut dapat dirumuskan sebagai berikut :

T=

It = 10 Io

A = log

−ε c b

1 = ε.c.b T


dimana T = persen transmitan; Io = intensitas radiasi yang datang; It = intensitas radiasi yang diteruskan; ε = serapan molar (L.mol-1.cm-1); c = konsentrasi (mol.L-1); b = tebal larutan (cm); A = absorban (Mulja dan Suharman, 1995). Komponen-komponen pokok spektrofotometer meliputi sumber (1) tenaga radiasi yang stabil, (2) sistem yang terdiri atas lensa-lensa, cermin, dan celah-celah, (3) monokromator untuk mengubah radiasi menjadi komponen-komponen panjang gelombang tunggal, (4) tempat cuplikan yang transparan, dan (5) detektor radiasi yang dihubungkan dengan sistem meter atau pencatat (Sastrohamidjojo, 2001). Kolorimetri adalah suatu teknik pengukuran cahaya yang diabsorpsi oleh suatu zat yang berwarna, baik warna yang terbentuk dari asalnya (senyawa tersebut memang berwarna) maupun warna yang dibentuk dari hasil reaksi dengan zat lain (Khopkar, 1990). Perubahan warna yang dibentuk dari hasil reaksi dengan zat lain dapat terjadi karena zat tersebut mengalami perpanjangan gugus kromofor oleh penambahan zat lain yang sebelumnya juga tidak berwarna dalam suatu larutan atau karena pembentukan suatu komplek yang berwarna. Pengukuran serapan larutan berwarna tersebut dilakukan pada panjang gelombang daerah sinar tampak (380-780 nm) (Mulja dan Suharman, 1995). Warna dapat dihasilkan oleh proses absorbsi cahaya dengan panjang gelombang tertentu oleh suatu zat. Senyawa organik dengan konjugasi yang ekstensif menyerap cahaya dengan panjang gelombang tertentu, karena adanya transisi π → π* dan n → π*. Apa yang tampak bukanlah warna yang diserap melainkan komplemennya, yang dipantulkan (tabel VIII) (Fessenden dan Fessenden, 1986).


Tabel VIII. Spektrum warna pada daerah visibel (Skoog et al., 1994) Rentang Panjang Gelombang (nm)

Warna yang diabsorbsi

Warna Komplementer (warna yang terlihat)

400– 435 435 – 480 480 – 490 490 – 500 500 – 560 560 – 580 580 – 595 595 – 650 650 – 750

Ungu Biru Biru-Hijau Hijau-Biru Hijau Kuning-Hijau Kuning Orange Merah

Kuning-Hijau Kuning Orange Merah Merah lembayung Ungu Biru Biru-Hijau Hijau-Biru

Pada kolorimetri yang ditentukan kadarnya adalah serapan cahaya pada larutan berwarna. Oleh karena itu, diperlukan suatu larutan dengan kadar tertentu yang diketahui dengan konsentrasi yang menaik dan membandingkan warnanya dengan senyawa yang hendak dianalisis. Pada warna yang sama, maka konsentrasinya adalah sama (Rooth dan Baschke, 1994). Konjugasi beberapa gugus kromofor dengan gugus kromofor lain yang sama akan menyebabkan spektrum absorpsi senyawa hasil konjugasi tersebut sangat berbeda dengan spektrum absorpsi masing-masing gugus tunggalnya. Dari hasil konjugasi ini diperoleh kromofor baru. Energi yang dibutuhkan elektron untuk eksitasi menjadi berkurang dan absorpsi cahaya bergeser ke daerah panjang gelombang panjang. Jika jumlah gugus terkonjugasi cukup banyak, maka senyawa akan menjadi berwarna dan mengabsorpsi dalam daerah sinar tampak (Rooth dan Baschke, 1994). Beberapa kriteria yang harus dipenuhi dalam analisis secara kolorimetri adalah selektif, sensitif, ada kesebandingan antara warna dengan konsentrasi, warna yang dihasilkan stabil, reprodusibel, dan larutan jernih (Vogel, 1994).


H. Landasan Teori Radikal hidroksil merupakan contoh radikal bebas yang sangat reaktif dan dapat berlaku sebagai toksikan primer dan sebagai sumber toksikan sekunder. Radikal hidroksil dapat memecah rantai DNA dan berperan dalam karsinogenik, mutagenik serta sitotoksik. Reaksi radikal hidroksil dengan DNA mengakibatkan kerusakan penting dalam sel, mengingat kerusakan rantai DNA tidak dapat dengan mudah diperbaiki oleh sel. Dalam tubuh, radikal hidroksil sangat cepat ditangkap oleh sistem pertahanan antioksidan yaitu melalui kerja enzim-enzim antioksidan. Saat peningkatan pembentukan ROS tidak dapat ditanggulangi oleh sistem pertahanan antioksidan, tercetus situasi yang disebut stress oksidatif. Pada kondisi ini, diperlukan tambahan antioksidan eksogen. Salah satu antioksidan eksogen alami adalah senyawa polifenol yang terdapat di dalam teh. Senyawa polifenol dalam teh merupakan senyawa golongan flavonoid yaitu golongan flavan-3-ol dan flavonol. Teh hijau maupun teh hitam sama-sama mengandung flavonoid namun jumlahnya saja yang berbeda. Perbedaan ini dikarenakan proses oksidasi enzimatik pada polifenol selama pembuatan teh hitam. Senyawa flavonoid dapat larut dalam cairan penyari yaitu etanol karena senyawa flavonoid memiliki banyak gugus hidroksi sehingga cenderung bersifat polar. Oleh karena itu, dapat diindikasikan bahwa di dalam ekstrak etanol teh hijau maupun teh hitam terdapat senyawa flavonoid. Adanya gugus hidroksi fenolik di dalam struktur flavonoid menyebabkan adanya kemampuan untuk menangkap radikal hidroksil


yang reaktif membentuk radikal bebas baru atau senyawa non radikal yang tidak reaktif dan relatif stabil. Metode yang digunakan untuk mengetahui aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam adalah metode deoksiribosa. Metode ini menggunakan spektrofotometri visibel untuk mengukur produk degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil yang dihasilkan oleh reagen Fenton. Produk degradasi deoksiribosa yaitu MDA, yang dalam suasana asam akan bereaksi dengan TBA membentuk kromogen berwarna merah muda (kromogen MDA-TBA) yang menyerap maksimum pada 532 nm (Kunchandy dan Rao, 1990). Adanya senyawa penangkap radikal hidroksil di dalam ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam akan menurunkan jumlah MDA sehingga jumlah kromogen MDA-TBA akan berkurang yang ditunjukkan dengan penurunan absorbansi larutan sampel dibandingkan dengan larutan kontrol. Aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak teh hijau dan teh hitam dinyatakan dengan % scavenging dan nilainya dalam effective scavenging (ES).

I. Hipotesis Ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan dalam % scavenging dan ES50.


BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental karena ada subjek uji yang dikenakan manipulasi perlakuan.

B. Variabel-variabel Penelitian Variabel–variabel yang digunakan dalam penelitian ini meliputi : 1. Variabel bebas Dalam penelitian ini variabel bebasnya adalah konsentrasi ekstrak etanol dan jenis teh (teh hijau dan teh hitam). 2. Variabel tergantung Dalam penelitian ini variabel tergantungnya adalah persen scavenging dan ES50. 3. Variabel pengacau (a) Variabel pengacau terkendali Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah merk teh hijau dan teh hitam, bahan-bahan kimia dan alat-alat yang digunakan selama penelitian, waktu dan lama penyarian, volume cairan penyari yang digunakan, suhu dan waktu inkubasi larutan uji aktivitas penangkapan radikal hidroksil.

32


(b) Variabel pengacau tidak terkendali Jenis dan varietas teh, kondisi (iklim, media tanam, ketinggian) tempat penanaman teh.

C. Definisi Operasional 1. Ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam yang dianalisis dihasilkan melalui proses remaserasi dengan etanol 70% pada teh hijau dan teh hitam merk X. 2. Persen scavenging adalah persen yang menyatakan kemampuan suatu senyawa dalam menangkap radikal hidroksil. % Scavenging =

Absorbansi larutan kontrol - Absorbansi larutan sampel x 100 % Absorbansi larutan kontrol

3. Larutan kontrol merupakan larutan yang terdiri dari reagen Fenton, larutan deoksiribosa, bufer fosfat, asam trikloroasetat, dan asam tiobarbiturat. 4. Larutan sampel merupakan larutan kontrol yang telah diberi ekstrak etanol teh hijau atau teh hitam. 5. Effective Scavenging 50 (ES50) menyatakan besarnya konsentrasi sampel yang menghasilkan penangkapan efektif radikal hidroksil sebesar 50%.

D. Bahan-Bahan Penelitian Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian adalah teh hijau dan teh hitam (Merk X). Bahan-bahan kualitas p.a.(E.Merck) : dinatrium hidrogen fosfat (Na2HPO4), kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4), asam tiobarbiturat (TBA), asam


trikloroasetat

(TCA),

Etilendiamintetraasetat

ferri garam

klorida dinatrium

heksahidrat dihidrat

(FeCl3.6H2O),

(C10H14N2Na2O8.2H2O),

hidrogen peroksida (larutan 30% H2O2), L (+) asam askorbat (Vitamin C). Bahanbahan kualitas p.a. (Sigma, USA) : 2-deoksi-D-ribosa. Bahan-bahan kualitas farmasetis (Brataco) : etanol.. Bahan lain : akuades (Laboratorium Kimia Organik Universitas Sanata Dharma).

E. Alat-Alat Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Spektrofotometer UV-Vis (Perkin Elmer Lamda 20), pH-meter (Metrohm 632), vacuum rotary evaporator (Buchi rotavapor), waterbath (Labo-Tech; Heraeus), vortex (Janke & Kunkel), neraca elektrik (Scaltec SBC 22), mikropipet 10-100µL dan 100-1000µL (Acura 825), mikropipet 0,5-5,0 ml (Socorex), tabung reaksi bertutup (SchottGermany), dan seperangkat alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis.

F. Tata Cara Penelitian 1. Pemilihan sampel Sampel yang digunakan berupa teh hijau dan teh hitam yang sudah dikemas dan dipasarkan dengan merk X. Sampel diambil sebanyak 80 bungkus untuk tiap jenis teh dari 100 bungkus yang ada. Pengambilan 80 bungkus sampel dilakukan dengan teknik random sampling menggunakan tabel bilangan random (Lampiran 3).


2. Pembuatan ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam Sebanyak 20 bungkus sampel dari tiap jenis teh, dihomogenkan kemudian digiling dan dihaluskan dengan menggunakan blender. Serbuk diayak menggunakan ayakan dengan derajat halus 4/18 (digunakan ayakan nomor mesh 12 sampai 50). Serbuk disimpan dalam botol coklat. Serbuk sebanyak 300 g dimasukkan dalam bejana tertutup kemudian direndam dengan cairan penyari yaitu etanol 70 % sebanyak 1 liter dan didiamkan selama 24 jam. Cairan penyari kemudian dikeluarkan dan ditampung dalam wadah bertutup. Ampas dimaserasi kembali selama 24 jam dengan 500 ml cairan penyari. Cara ini diulang hingga didapatkan maserat yang jernih. Maserat dikumpulkan dan disaring kemudian diuapkan pelarutnya dengan bantuan vacuum rotary evaporator pada tekanan rendah hingga seluruh etanol diperkirakan telah menguap. Ekstrak kental dikumpulkan dan diuapkan kembali di atas waterbath dengan suhu 50°C hingga diperoleh ekstrak kering. Ekstrak hasil pengeringan kemudian ditimbang dan disimpan dalam desikator.

3. Pembuatan bufer fosfat 20 mM a. Pembuatan dinatrium hidrogen fosfat 20 mM Timbang saksama 1,42 g Na2HPO4 dan larutkan dalam akuades hingga 500,0 ml. b. Pembuatan kalium dihidrogen fosfat 20 mM Timbang saksama 0,68 g KH2PO4 dan larutkan dalam akuades hingga 250,0 ml


Bufer fosfat dibuat dengan bantuan pH meter. Larutan KH2PO4 ditambahkan secara bertetes-tetes pada larutan Na2HPO4 hingga tercapai pH 7,4.

4. Pembuatan reagen a. Larutan FeCl3 1 mM Sebanyak lebih kurang 13,52 mg FeCl3.6H2O ditimbang saksama dan dilarutkan dalam akuades hingga 10,0 ml. Dari larutan tersebut diambil sebanyak 2,0 ml, dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda. b. Larutan EDTA 1 mM Sebanyak lebih kurang 18,61 mg Na2EDTA.2H2O ditimbang saksama dan dilarutkan dalam akuades hingga 10,0 ml. Dari larutan tersebut diambil sebanyak 2,0 ml, dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda. c. Larutan Vitamin C 1 mM Sebanyak lebih kurang 17,61 mg vitamin C ditimbang saksama dan dilarutkan dalam akuades hingga 10,0 ml. Dari larutan tersebut diambil sebanyak 1,0 ml, dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda. Larutan ini harus selalu dibuat baru. d. Larutan H2O2 20 mM Sebanyak 0,091 ml larutan H2O2 30 % dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml dan ditambah akuades hingga tanda. Dari larutan tersebut diambil sebanyak


2,5 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda. e.

Larutan TCA 5 % Sebanyak 1,25 g TCA ditimbang saksama dan dilarutkan dalam akuades

hingga 25,0 ml. f. Larutan TBA 1 % Sebanyak 0,25 g TBA ditimbang saksama, dimasukkan ke dalam beaker glass 100 ml, ditambah akuades secukupnya kemudian dipanaskan di atas hot plate pada suhu 50-55°C hingga larut. Larutan dimasukkan ke dalam labu ukur 25,0 ml dan ditambah akuades hingga tanda.

5. Pembuatan larutan deoksiribosa 2,5 mM Sebanyak lebih kurang 20,12 mg deoksiribosa ditimbang saksama dan dilarutkan dalam akuades hingga 10,0 ml. Dari larutan tersebut diambil sebanyak 4,2 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda.

6. Pembuatan larutan ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam 1 mg/ml Sebanyak lebih kurang 25 mg ekstrak etanol teh hijau atau hitam ditimbang saksama dan dilarutkan dalam akuades hingga 25,0 ml.


7. Optimasi metode a. Penentuan operating time (waktu operasional) Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan sebanyak 600 μl larutan deoksiribosa 2,5 mM, 300 μl FeCl3 1 mM, 300 μl EDTA 1 mM, 300 μl H2O2 20 mM, 4500 μl bufer fosfat pH 7,4, dan 300 μl vitamin C 1 mM. Inkubasi pada suhu 37 ºC selama 30 menit. Setelah itu, larutan ditambah 1 ml TCA 5 % dan 1 ml TBA 1 % kemudian dipanaskan dengan waterbath pada suhu 80ºC selama 30 menit. Tabung reaksi yang berisi campuran didinginkan di bawah air mengalir selama 5 menit. Larutan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum teoritis 532 nm selama 1 jam. b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan sebanyak 600 μl larutan deoksiribosa 2,5 mM, 300 μl FeCl3 1 mM, 300 μl EDTA 1 mM, 300 μl H2O2 20 mM, 4500 μl bufer fosfat pH 7,4, dan 300 μl vitamin C 1 mM. Inkubasi pada suhu 37 ºC selama 30 menit. Setelah itu, larutan ditambah 1 ml TCA 5 % dan 1 ml TBA 1% kemudian dipanaskan dengan waterbath pada suhu 80ºC selama 30 menit. Tabung reaksi yang berisi campuran didinginkan di bawah air mengalir selama 5 menit. Larutan dibaca absorbansinya dari panjang gelombang 400-600 nm.


8. Uji aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan sebanyak 600 μl larutan deoksiribosa 2,5 mM dan ekstrak etanol teh hijau atau teh hitam sebanyak 200; 400; 600; 800; dan 1000 μl, kemudian pada masing-masing tabung ditambahkan 300 μl FeCl3 1 mM, 300 μl EDTA 1 mM, 300 μl H2O2 20 mM, bufer fosfat pH 7,4 (penambahan bufer fosfat disesuaikan dengan volume ekstrak etanol yang ditambahkan sehingga volume akhir larutan adalah 6 ml) dan 300 μl vitamin C 1 mM. Inkubasi pada suhu 37 ºC selama 30 menit. Setelah itu, larutan ditambah 1 ml TCA 5 % dan 1 ml TBA 1 %. kemudian dipanaskan dengan waterbath pada suhu 80ºC selama 30 menit. Larutan kemudian didinginkan di bawah air mengalir selama 5 menit. Larutan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. Buat larutan kontrol.

G. Analisis Hasil Analisis hasil pada penelitian ini meliputi penentuan % scavenging yang dihitung dari selisih antara absorbansi larutan kontrol dan absorbansi larutan sampel dibagi absorbansi larutan kontrol dikalikan 100%. % Scavenging =

Absorbansi larutan kontrol - Absorbansi larutan sampel x 100 % Absorbansi larutan kontrol

Nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil sebesar 50% (ES50) diperoleh dari persamaan regresi linier antara % scavenging dan konsentrasi ekstrak etanol teh hijau atau teh hitam pada berbagai konsentrasi.


Persamaan regresi linier : y = bx + a Perhitungan ES50 : ES50 =

50 - a b

Keterangan:

a : intersep b : slope


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pemilihan Sampel Sampel yang digunakan berupa produk teh hijau dan teh hitam yang sudah dikemas dan dipasarkan dengan merk X. Produk teh hijau atau teh hitam yang dipilih merupakan produk yang berasal dari satu pabrik dengan nomor batch yang sama dan tanggal kadaluarsa yang sama. Diasumsikan produk yang terpilih memiliki kemiripan dalam hal jenis teh yang ditanam, lokasi dan iklim tempat tumbuh, dan cara pengolahan teh sehingga dapat meminimalkan variasi hasil penelitian. Jumlah produksi pabrik yang memproduksi teh tersebut tidak diketahui secara pasti. Oleh karena itu, ditetapkan jumlah populasi sampel penelitian yaitu 100 bungkus teh untuk masing-masing teh hijau dan teh hitam. Ukuran sampel ditentukan dengan tabel Krejcie. Menurut tabel Krejcie, penentuan ukuran sampel didasarkan atas kesalahan 5% sehingga jumlah sampel yang diambil memiliki taraf kepercayaan 95% terhadap populasi. Dari tabel tersebut, bila jumlah populasi 100 maka jumlah sampel 80 (Sugiyono, 1998). Pemilihan sampel didasarkan pada teknik sampling jenis teknik random sampling menggunakan cara randomisasi dari tabel bilangan random (De Muth, 1999). Teknik ini memungkinkan semua individu dalam populasi baik secara sendiri-sendiri atau bersama-sama memiliki kesempatan yang sama untuk dipilih menjadi anggota sampel. Cara randomisasi dari tabel bilangan random memiliki

41


kelebihan yaitu prosedurnya sangat sederhana dan dapat menghindari dari kemungkinan penyelewengan (Hadi, 1980). Caranya yaitu sebanyak 100 bungkus masing-masing jenis teh diberi nomor 001 sampai dengan 100 kemudian dipilih nomor secara random melalui tabel bilangan random hingga didapatkan 80 bungkus untuk masing-masing jenis teh.

B. Ekstrak Etanol Teh Hijau dan Teh Hitam Pembuatan serbuk bertujuan untuk memperkecil ukuran partikel simplisia sehingga permukaan simplisia yang bersentuhan dengan penyari semakin luas (Anonim, 1986). Luas permukaan yang lebih besar akan mengoptimalkan pembasahan serbuk simplisia oleh cairan penyari sehingga hasil penyarian juga optimal. Berdasarkan Materia Medika Indonesia Edisi I, kecuali dinyatakan lain, seluruh simplisia harus dihaluskan menjadi serbuk dengan derajat halus (4/18). Derajat halus dinyatakan dengan nomor pengayak. Derajat halus yang dinyatakan dengan 2 nomor (4/18) mempunyai pengertian semua serbuk dapat melalui pengayak dengan nomor terendah (4) dan tidak lebih dari 40% melalui pengayak dengan nomor tertinggi (18). Jenis pengayak yang digunakan dinyatakan dengan nomor yang menunjukkan jumlah lubang tiap cm dihitung searah panjang kawat. Penentuan jenis ayakan, yang dinyatakan dengan nomor mesh, dilakukan melalui konversi angka derajat halus yaitu mengkalikan 4/18 dengan 2,54 (1 inchi). Hasil konversi menunjukkan nomor mesh yang digunakan adalah 10/45 namun karena terbatasnya ketersediaan alat maka digunakan ayakan dengan nomor mesh 12/50.


Penggunaan nomor mesh yang berbeda ini tidak memberikan pengaruh yang berarti pada hasil penyarian karena meskipun serbuk lebih halus namun serbuk tidak masuk ke dalam maserat pada saat proses penyaringan ampas. Serbuk yang diambil adalah serbuk yang dapat melalui ayakan dengan nomor mesh 12 dan serbuk yang tidak lebih dari 40%nya melewati ayakan dengan nomor mesh 50. Produk teh yang digunakan sudah dalam bentuk sediaan yang kering. Pada sediaan ini, lapisan air pada dinding sel yang terdiri dari selulosa sudah menguap sehingga terjadi pengerutan sel. Pengerutan akan menyebabkan timbulnya pori-pori yang terisi oleh udara. Saat serbuk dibasahi oleh cairan penyari, cairan akan mengelilingi selulosa sehingga serbuk mengalami pembengkakan kembali (Anonim, 1986). Proses perendaman serbuk bertujuan memberikan kesempatan kepada cairan penyari memasuki seluruh pori-pori dalam serbuk sehingga proses penyarian menjadi lebih sempurna. Penyarian dilakukan dengan metode remaserasi. Penyari yang digunakan adalah etanol dengan konsentrasi 70% dengan pertimbangan kombinasi etanol dan air mempunyai sifat polar yang diharapkan mampu melarutkan senyawa polar maupun yang semi polar. Senyawa polifenol merupakan senyawa yang cenderung bersifat polar karena mengandung banyak gugus hidroksil sehingga diharapkan senyawa polifenol dalam teh hijau dan teh hitam dapat terekstraksi ke dalam pelarut etanol. Dengan proses remaserasi hingga diperoleh maserat jernih, diharapkan senyawa polifenol tersari optimal. Proses pemekatan bertujuan menghilangkan cairan penyari hingga didapatkan ekstrak dengan konsentrasi tertentu. Ekstrak etanol teh hijau maupun teh hitam diuapkan pelarutnya hingga


menjadi ekstrak kering. Jumlah ekstrak etanol yang diperoleh adalah 108,39 g ekstrak etanol teh hijau dengan rendemen sebesar 36,13% dan 88,59 g ekstrak etanol teh hitam dengan rendemen sebesar 29,53%.

C. Optimasi Metode 1. Penentuan operating time (waktu operasional) Penentuan operating time bertujuan mendapatkan waktu pengukuran absorbansi dengan nilai stabil. Pengukuran absorbansi saat operating time memberikan tingkat reprodusibilitas yang tinggi pada pengukuran ulang sehingga meminimalkan kesalahan hasil penelitian. Operating time ditentukan pada saat terbentuk warna yang stabil yang ditandai dengan nilai absorbansi yang stabil. Penentuan operating time dilakukan dengan mengukur absorbansi larutan kontrol dengan tujuan mendapatkan operating time senyawa kromogen MDATBA tanpa adanya gangguan dari senyawa lain. Pengukuran absorbansi dilakukan setelah larutan kontrol diinkubasi pada suhu 37°C dan 80°C kemudian didinginkan selama 5 menit di bawah air mengalir. Waktu pengukuran absorbansi larutan kontrol adalah 60 menit pada panjang gelombang teoritis yaitu 532 nm (Kunchandy dan Rao, 1990). Hasil pengukuran absorbansi menunjukkan operating time pada menit 0 sampai menit 60 dengan nilai absorbansi stabil yaitu 0,974 (Gambar 10).


Gambar 10. Kurva hubungan waktu (menit) dengan absorbansi kromogen MDA-TBA

Kestabilan nilai absorbansi menunjukkan bahwa jumlah kromogen MDA-TBA relatif stabil. Reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA dipercepat dengan adanya panas. Pada penelitian ini, panas yang diterima larutan berasal dari tahap pemanasan dengan waterbath pada suhu 80ºC. Setelah 30 menit melalui tahap pemanasan, larutan didinginkan selama 5 menit hingga suhu larutan sama dengan suhu lingkungan. Ketiadaan panas ini memperlambat reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA. Pada metode deoksiribosa, proses degradasi deoksiribosa menjadi MDA terjadi pada saat larutan campuran diinkubasi pada suhu 37ºC. Selanjutnya larutan


campuran dibuat suasana asam (pH rendah) melalui penambahan TCA. MDA kemudian akan bereaksi dengan TBA membentuk kromogen MDA-TBA. Selain memberikan suasana asam, penambahan TCA menghambat proses oksidasi Vitamin C sehingga proses reduksi Fe3+ menjadi Fe2+ terhambat pula. Terhambatnya reaksi ini mengakibatkan terhambatnya pembentukan radikal hidroksil sehingga terjadi penurunan kecepatan degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil. Selain memberikan suasana asam, penambahan TCA berfungsi sebagai katalis pembentukan kromogen MDA-TBA. Adanya H+ mengakibatkan pengubahan salah satu gugus keton pada TBA menjadi suatu gugus enol (gambar 11). Gugus enol menyebabkan TBA menjadi lebih reaktif sehingga TBA dapat bereaksi dengan MDA. Reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA dapat dilihat pada gambar 12. H

H S

N

S

O

N

O H

H H

+ H

N

N H

H O

H

H O

TBA

Gambar 11. Reaksi pembentukan gugus enol pada TBA

Senyawa MDA yang dihasilkan dari reaksi degradasi deoksiribosa merupakan senyawa yang tidak berwarna. Reaksi pengkoplingan MDA dengan TBA membentuk kromogen yang berwarna merah muda (gambar 13). Warna ini terjadi karena perpanjangan gugus kromofor dan penambahan gugus auksokrom.


H S

H

N

O

S

O H

+

N

O

O

H

+

N

H

N

H

S

H

OH

+H+

N H

H

N

H

H

H

H H

O

TBA

MDA

O

O

O H

TBA

O

+H+ H S

H

H

N

O

O

N

H

S

S

H

N

+H+

H

N

-H2O

N

O

O

H

H

N

N

S

N

H

H

H

H H

H O

H

OH

O

O

OH

OH

O

-H2O +H+

S

H

H

H N

O

O

N

+H+

S

S

N

H O

O

N

S

H H

H

N

N

N

H

H O

O

O

N

H

H

O

+H+ S HS

N

OH

HO

N

N

OH

HO

N

S

S

+H+ N N

N

N H OH OH

OH

MDA-TBA (warna merah muda)

Gambar 12. Mekanisme reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA (Purwantoko, 2006)

OH


(------) Gugus kromofor (------) Gugus auksokrom Gambar 13. Struktur kromogen MDA-TBA

2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum Panjang gelombang maksimum merupakan panjang gelombang di mana terjadi eksitasi elektronik yang memberikan absorban maksimum (Mulja dan Suharman, 1995). Tujuan penentuan panjang gelombang maksimum dalam penelitian ini adalah memperoleh panjang gelombang di mana kromogen MDATBA memberikan absorban yang maksimum. Panjang gelombang maksimum yang diperoleh digunakan untuk mengukur absorban kromogen MDA-TBA. Penentuan panjang gelombang maksimum dapat digunakan untuk identifikasi molekul yang bersifat karakteristik yang artinya panjang gelombang maksimum bergantung pada gugus molekul yang mengabsorbsi radiasi sinar UVVis dan tidak bergantung pada struktur molekul suatu senyawa. Dengan demikian, senyawa dengan spektra UV-Vis yang sama belum tentu merupakan senyawa yang identik. Hal ini menyebabkan panjang gelombang maksimum dipergunakan sebagai data sekunder dalam analisis kualitatif. Dalam analisis kuantitatif, pengukuran nilai absorban dilakukan pada panjang gelombang maksimum. Alasannya adalah perubahan absorban untuk setiap satuan konsentrasi adalah paling besar pada panjang gelombang


maksimum, sehingga akan diperoleh kepekaan analisis yang maksimum. Di samping itu, pita serapan di sekitar panjang gelombang maksimum tersebut relatif datar dan kemungkinan terjadinya kesalahan pada pengukuran ulang menjadi kecil dengan demikian memenuhi hukum Lambert-Beer (Mulja dan Suharman, 1995).

Gambar 14. Kurva hubungan panjang gelombang (nm) dengan absorbansi kromogen MDA-TBA

Penentuan panjang gelombang maksimum pada penelitian ini dilakukan pada larutan kontrol, yaitu larutan tanpa tambahan sampel dengan tujuan mendapatkan panjang gelombang maksimum senyawa kromogen MDA-TBA yang berwarna merah muda. Hasil scanning kromogen MDA-TBA yang


dilakukan pada panjang gelombang 400-600 nm menunjukkan bahwa panjang gelombang maksimum kromogen MDA-TBA adalah 531,8 nm (gambar 14). Menurut Kunchandy dan Rao (1998), panjang gelombang maksimum teoritis kromogen MDA-TBA adalah 532 nm. Selisih panjang gelombang maksimum teoritis dengan hasil penelitian adalah 0,2 nm. Selisih nilai ini masih memenuhi selisih nilai yang diperbolehkan dalam Farmakope Indonesia Edisi IV (1995) yaitu kurang dari 2 nm. D. Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Ekstrak Etanol Teh Hijau dan Teh Hitam Pada penelitian ini, penentuan aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak teh hijau dan hitam dilakukan dengan metode deoksiribosa. Berdasarkan penelitian Purwantoko (2006), metode deoksiribosa memiliki akurasi, presisi, dan linearitas yang baik sehingga dapat digunakan untuk menguji aktivitas penangkapan radikal hidroksil. Pada penelitian ini prosedur kerja maupun konsentrasi deoksiribosa mengacu pada penelitian Purwantoko (2006). Tabel IX. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan ekstrak etanol teh hijau dengan berbagai konsentrasi Replikasi

I II III IV V Rata-rata SD CV (%)

0

0,967 0,976 0,968 0,940 0,917 0,954 0,025 2,576

Konsentrasi ekstrak etanol teh hijau (mg/ml) 0,033 0,067 0,100 0,133 0,167

0,755 0,729 0,721 0,716 0,688 0,722 0,024 3,344

0,731 0,705 0,698 0,696 0,663 0,699 0,024 3,481

0,670 0,664 0,655 0,654 0,617 0,652 0,021 3,167

0,631 0,637 0,623 0,632 0,584 0,621 0,022 3,460

0,607 0,620 0,605 0,579 0,559 0,594 0,025 4,137


Tabel X. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan ekstrak etanol teh hitam dengan berbagai konsentrasi

Replikasi

I II III IV V Rata-rata SD CV (%)

0

0,982 0,986 0,955 0,921 1,004 0,970 0,032 3,334

Konsentrasi ekstrak etanol teh hitam (mg/ml) 0,033 0,067 0,100 0,133 0,167

0,674 0,670 0,650 0,619 0,671 0,657 0,023 3,527

0,647 0,651 0,620 0,601 0,662 0,636 0,025 3,932

0,638 0,626 0,585 0,584 0,641 0,615 0,028 4,591

0,629 0,591 0,578 0,581 0,616 0,599 0,022 3,750

0,620 0,572 0,548 0,577 0,601 0,584 0,028 4,750

Berdasarkan pada tabel IX dan X, absorbansi larutan kontrol lebih tinggi daripada larutan sampel karena pada larutan kontrol tidak terdapat senyawa penangkap radikal hidroksil sehingga deoksiribosa langsung didegradasi oleh radikal hidroksil. Pada larutan sampel, dimungkinkan terdapat senyawa penangkap radikal hidroksil yang mengakibatkan penurunan jumlah degradasi deoksiribosa. Terbukti dengan adanya penurunan absorbansi kromogen MDATBA dari larutan sampel pada berbagai konsentrasi. 1.200

Absorbansi*

1.000 0.800 Teh hijau

0.600

Teh hitam

0.400 0.200 0.000 0

0.05

0.1

0.15

0.2

Konsentrasi (mg/ml) Gambar 15.

Kurva hubungan antara penambahan konsentrasi ekstrak etanol teh hijau maupun teh hitam dengan absorbansi kromogen MDA-TBA


Seperti terlihat pada gambar 15, semakin besar konsentrasi ekstrak etanol yang ditambahkan maka terjadi penurunan absorbansi. Penurunan absorbansi ini disebabkan peristiwa penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam. Peristiwa ini mengakibatkan penurunan jumlah radikal hidroksil yang akan mendegradasi deoksiribosa akibatnya terjadi penurunan MDA. Adanya penurunan jumlah MDA mengakibatkan penurunan jumlah kromogen MDA-TBA yang ditunjukkan dengan penurunan absorbansi larutan dengan sampel pada berbagai konsentrasi dibandingkan dengan larutan kontrol. Nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau maupun teh hitam dinyatakan sebagai persen scavenging. Nilai persen scavenging dihitung dari selisih antara purata absorbansi blanko dengan purata absorbansi sampel pada konsentrasi tertentu, dibagi purata absorbansi blanko dikalikan 100%. Tabel XI. Persen scavenging ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam Konsentrasi ekstrak etanol (mg/ml)

0,033 0,067 0,100 0,133 0,167

% Scavenging Ekstrak etanol teh Ekstrak etanol hijau teh hitam

24,3 26,8 31,7 34,9 37,7

32,3 34,4 36,6 38,2 39,8

Semakin besar harga % scavenging ekstrak etanol maka semakin besar pula aktivitas penangkapan radikal hidroksilnya. Aktivitas penangkapan radikal hidroksil sangat tergantung pada konsentrasi ekstrak etanol yang ditambahkan.


Peningkatan konsentrasi ekstrak berbanding lurus dengan % scavenging seperti terlihat pada tabel XI. Besarnya konsentrasi ekstrak etanol teh hijau yang dibutuhkan untuk menangkap radikal hidroksil sebanyak 50% dinyatakan sebagai ES50 dan disajikan pada tabel XII. Nilai tersebut didapatkan dari persamaan regresi linier antara konsentrasi ekstrak etanol teh hijau atau teh hitam (x) dengan % scavenging (y). Dari hasil perhitungan diperoleh persamaan regresi linier ekstrak etanol teh hijau adalah y = 104,437 x + 20,636 dengan nilai r = 0,994 sedangkan ekstrak etanol teh hitam adalah y = 57,284 x + 30,632 dengan nilai r = 0,997. Nilai koefisien korelasi (r) yang mendekati satu menunjukkan adanya hubungan yang kuat antara variabel bebas (konsentrasi ekstrak etanol) dengan variabel tergantung (% scavenging). Kurva persamaan regresi linier yang menunjukkan pengaruh penambahan ekstrak etanol teh hijau atau teh hitam dengan berbagai konsentrasi terhadap besarnya aktivitas penangkapan radikal hidroksil tidak layak saji karena memiliki nilai α mendekati 90° (hampir tegak lurus), oleh karena itu dilakukan konversi supaya nilai α mendekati 45° sehingga kurva menjadi layak saji. Konversi dilakukan dengan mengalikan nilai x (konsentrasi ekstrak etanol) dengan angka 80. Hasil perhitungan persamaan regresi linier sebelum dan sesudah konversi disajikan pada tabel XII dan XIII.


Tabel XII. Persamaan regresi linier ekstrak etanol teh hijau sebelum dan sesudah konversi Ekstrak etanol teh hijau Sebelum konversi Setelah konversi Konsentrasi % Konsentrasi % (mg/ml) Scavenging (mg/80ml) Scavenging

0,033 0,067 0,100 0,133 0,167 a= b= r= α=

24,3 26,8 31,7 34,9 37,7 20,636 104,437 0,994 89,451°

2,64 5,36 8,00 10,64 13,36 a= b= r= α=

24,3 26,8 31,7 34,9 37,7 20,636 1,305 0,994 52,547°

Tabel XIII. Pesamaan regresi linier ekstrak etanol teh hitam sebelum dan sesudah konversi Ekstrak etanol teh hitam Sebelum konversi Setelah konversi Konsentrasi % Konsentrasi % (mg/ml) Scavenging (mg/80ml) Scavenging

0,033 0,067 0,100 0,133 0,167 a= b= r= α=

32,3 34,4 36,6 38,2 39,8 30,632 56,284 0,997 88,982°

2,64 5,36 8,00 10,64 13,36 a= b= r= α=

32,3 34,4 36,6 38,2 39,8 30,632 0,703 0,997 35,128°

Hubungan antara penambahan konsentrasi ekstrak etanol teh hijau atau teh hitam pada berbagai konsentrasi dengan % scavenging disajikan pada gambar 16.


45,0 40,0

% Scavenging

35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

Konsentrasi ekstrak etanol (mg/80ml)

Gambar 16.

Ekstrak etanol teh hijau

Ekstrak etanol teh hitam

Linear (Ekstrak etanol teh hijau)

Linear (Ekstrak etanol teh hitam)

Kurva hubungan antara penambahan konsentrasi ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam dengan % scavenging

Dari persamaan regresi linier, dapat ditentukan nilai ES50 dari ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam. Berikut adalah nilai ES50 (hasil ekstrapolasi) ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam (tabel XIV) Tabel XIV. Persentase penangkapan efektif radikal hidroksil sebesar 50 % oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam Ekstrak Etanol

ES50 (mg/ml)

Teh hijau Teh hitam

0,281 0,344

Nilai ES50 berbanding terbalik dengan kemampuan senyawa untuk menangkap radikal hidroksil. Semakin besar harga ES50 maka aktivitas penangkapan radikal hidroksil semakin kecil. Nilai ES50 ekstrak etanol teh hijau lebih kecil daripada teh hitam sehingga diindikasikan bahwa ekstrak etanol teh


hijau memiliki kemampuan penangkapan radikal hidroksil lebih besar daripada ekstrak etanol teh hitam. Senyawa di dalam ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam yang diduga memiliki aktivitas penangkapan radikal hidroksil adalah senyawa polifenol. Secara umum senyawa ini memiliki banyak gugus hidroksil yang berfungsi sebagai penangkap radikal bebas. Senyawa polifenol yang terdapat dalam teh termasuk dalam golongan flavonoid subgolongan flavan-3-ol dan flavonol. Pada teh hijau dan teh hitam sama-sama mengandung kedua golongan tersebut. Hanya pada teh hijau kandungan catechin lebih besar daripada teh hitam karena pada teh hitam terjadi oksidasi catechin menjadi theaflavin dan thearubigin. Namun meskipun kandungan catechin teh hijau lebih besar daripada teh hitam, ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam tetap memiliki aktivitas penangkapan radikal hidroksil karena catechin, theaflavin, dan thearubigin sama-sama memiliki gugus hidroksil yang mampu menangkap radikal hidroksil. Selain itu, menurut Leung et al.(2001), catechin dan theaflavin memiliki sifat antioksidan yang sebanding. Dengan demikian, radikal hidroksil, yang dibentuk melalui reaksi Fenton, dapat ditangkap oleh senyawa polifenol dalam ekstrak etanol teh hijau maupun teh hitam.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan a. Ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa yang dapat diketahui dari % scavenging masing-masing ekstrak etanol. b. Nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil pada ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam dengan metode deoksirobosa yang dinyatakan sebagai ES50 (hasil ekstrapolasi) adalah 0,281 mg/ml pada ekstrak etanol teh hijau dan 0,344 mg/ml pada ekstrak etanol teh hitam.

B. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai identifikasi senyawa polifenol yang memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal hidroksil yang terdapat pada ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam.

57


DAFTAR PUSTAKA Amić, D., Davidović-Amić, D., Bešlo, D., and Trinajstić, N., 2003, StructureRadical Scavenging Activity Relationship of Flavonoids, CCACAA, 76 (1), 55-61. Anonim, 2005, Green Tea Extract: Ancient Health Secret of the Orient, http://www.kirlian.org/life_enhancement_products/n37.html, diakses tanggal 4 April 2005. Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 2-10, 13, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 1989, Materia Medika Indonesia, Jilid I, 136, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 1979, Farmakope Indonesia, Edisi III, 9, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, 7, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Blokhina, O., 2000, Anoxia and Oxidative Stress: Lipid Peroxidation, Antioxidant Status, and Mitochondrial Functions in Plants, Dissertation, University of Helsinki. Bors, H., Michel, C., and Saran, M., 1979, On the Natural of Biochemically Generated Hydroxyl Radicals: Studies using the Bleaching of pnitrosodimethylaniline as a Direct Assay Method, Eur. J. Biochem., 95, 621-627. Cerruti, P. cit. Yen, Gow-Chin and Chen, Hui-Yin, 1995, Antioxidant Activity of Various Tea Extracts in Relation to Their Antimutagenecity, J. Agric. Food. Chem, 43(1), 27-32. Christian, G.D., 2004, Analytical Chemistry, Sixth Edition, 126-132, John Wiley & Sons, Inc., USA. Cuvelier, M.E., Richards, H., and Besset, C., 1994, Comparison of The Antioxidative Activity of some Acid Phenols: Structure-Activity Relationship, Biosci. Biotech. Biochem., 56 (2), 324-325. De Muth, J.E., 1999, Basic Statistic and Pharmaceutical Statistical Applications, 572, Marcel Dekker Inc., New York.


Fessenden, R.J. dan Fessenden, J.S., 1986, Organic Chemistry, diterjemahkan oleh Pudjaatmaka, H.A., Edisi ketiga, Jilid 1, 223-224, 240, Erlangga, Jakarta. Fouad,

T., 2005, Antioxidants, nature and chemistry, http://www.thedoctorslounge.net/medlounge/articles/antioxidants, diakses tanggal 21 Juni 2005.

Fulder, S., 2004, The Miracle of Green Tea for Your Daily Intake, diterjemahkan oleh Trisno Rahayu Wilujeng, 23, Prestasi Pustaka, Jakarta. Hadi, S., 1980, Metodologi Research, Jilid 1, 75, 77-78, Andi Offset, Yogyakarta. Halliwel, B. and Gutteridge, J.M.C., 1999, Free Radicals in Biology and Medicine, Third Edition, 368-369, 839, Oxford University Press, New York. Halliwel, B., Gutteridge, J.M.C., and Aruoma, O.I., 1987, The Deoxyribose Method: A Simple “Test-Tube” Assay for Determination of Rate Constants for Reaction of Hydroxyl Radicals, Anal. Biochem., 165, 215219, Academic Press, London. Harman, D., 1981, The Aging Process, Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 7124. Hartoyo, A., 2003, Teh dan Khasiatnya bagi Kesehatan, 9-13, 23-35, Kanisius, Yogyakarta. Khopkar, S.M., 1985, Basic Concepts of Analytical Chemistry, diterjemahkan oleh A. Saptorahardjo, 193, UI Press, Jakarta. Kikuzaki, H. and Nakatani, N., 1993, Antioxidant Effects of Some Ginger Constituents, J. Food Sci., 58 (6), 1407. Kunchandy, E. and Rao, M.N.A., 1989, Oxygen Radical Scavenging Activity of Curcumin, Inter. J. Pharm., 58, 237-240. Lambert, J.D. and Yang, C.S., 2003, Mechanisms of Cancer Prevention by Tea Constituents, Supplement: Proceedings of the Third International Scientific Symposium on Tea and Human Health, The American Society for Nutritional Sciences, J. Nutr., 133 (10), 3262S-3267S. Leung, L.K., Su, Y., Chen, R.,Zhang, Z., Huang, Y., and Chen, Zhen-Yu, 2001, Theaflavins in Black Tea and Catechins in Green Tea Are Equally Effective Antioxidants, J. Nutr., 131, 2248-2251.


Middleton Jr., E., Kandaswami, C., and Theoharis, C.T., 2000, The Effects of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implications for Inflammation, Heart Disease, and Cancer, Pharmacol Rev., 52 (4), 673-751. Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 19,26,27,31,32, Airlangga University Press, Surabaya. Purwantoko, A., 2006, Validasi Metode Deoksiribosa sebagai Uji Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Vitamin C secara In Vitro, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Rafat, H.S. et al., cit. Roy, M., Siddiqi, M., and Bhattacharya, R., 2001, Cancer Chemoprotection: Tea Polyphenol Induced Cellular and Mollecular Responses, Asian Pacific J. Cancer Prev., 2, 109-116. Rajeshwar, Y., Kumar, G.P.S., Gupta, M., and Mazumder, U.K., 2005, Studies On In Vitro Antioxidant Activities of Methanol Extract of Mucuna pruriens (Fabaceae) Seeds, Eur. Bull. Drug Res., 13 (1), 31-39. Robinson, T., 1991, The Organic Constituens of Higher Plants, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Edisi 6, 281-293, Penerbit ITB, Bandung. Rooth, H.J. and Blaschke, G., 1994, Pharmaceutical Analysis, diterjemahkan oleh Kisman, S. dan Ibrahim, S., 359-361, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. Roy, M., Siddiqi, M., and Bhattacharya, R., 2001, Cancer Chemoprotection: Tea Polyphenol Induced Cellular and Mollecular Responses, Asian Pacific J. Cancer Prev., 2, 109-116. Skoog, D.A., West, D.M., and Haller, F.J., 1994, Analytical Chemistry: an Introduction, Sixth Edition, 412-414, Saunders College Publishing, Florida. Sofia, D., 2005, Antioksidan dan Radikal Bebas, http://www.chem-is-try.org, diakses tanggal 4 April 2005. Sugiyono, 1998, Statistika untuk Penelitian, 62, CV.Alfabeta, Bandung. Syah, A.N.A., 2006, Taklukkan Penyakit dengan Teh Hijau, 46, 69, AgroMedia Pustaka, Jakarta. Syamsuhidayat, S.S. dan Hutapea, 1991, Inventaris Tanaman Obat Indonesia, Departemen Kesehatan RI, Jakarta.


Tuminah, S., 2004, Teh [Camellia sinensis O.K. var. Assamica (Mast)] sebagai Salah Satu Sumber Antioksidan, Cermin Dunia Kedokteran, 144, 52-54. Vogel, 1994, Buku Ajar Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik, diterjemahkan oleh Pudjaatmaka, H.A. dan Setiono, L., 846-848, EGC, Jakarta. Werkhoven, 1988, Tea Processing, 4-6, 128, FAO Agricultural Services Bulletin, Amsterdam. Yen, Gow-Chin and Chen, Hui-Yin, 1995, Antioxidant Activity of Various Tea Extracts in Relation to Their Antimutagenecity, J. Agric. Food. Chem, 43 (1), 27-32.


Lampiran 1. Foto ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam

Keterangan:

A : Ekstrak etanol teh hijau B : Ekstrak etanol teh hitam


Lampiran 2. Tabel Krejcie (Sugiyono, 1998)


Lampiran 3. Tabel bilangan random (De Muth, 1999)


Lampiran 4. Contoh penimbangan bahan M=

berat zat (g) mol ; mol = volume (L) BM (berat molekul) (g/mol)

M=

berat zat (g) 1 x BM (g/mol) volume (L)

Berat zat (g) = M (mol/L) x BM (g/mol) x volume (L) a. Bufer Fosfat pH 7,4 1) Na2HPO4 20 mM BM : 141,96 Perhitungan bobot zat yang akan ditimbang (a) : 20 x10-3 M =

1 a g x 141,96 g /mol 0,5 L

a = 20 x 10 -3 M x 141,96 g/mol x 0,5 L a = 1,4196 g Bobot zat hasil penimbangan : 1,42146 g Perhitungan kadar : M=

1,42146 g 1 x 141,96 g/mol 0,5 L

M = 0,02003 M = 20,03 mM 2) KH2PO4 20 mM BM : 136,09 Perhitungan bobot zat yang akan ditimbang (a) : a = 20 x 10 -3 M x 136,09 g/mol x 0,25 L


a = 0,68045 g Bobot zat hasil penimbangan : 0,6807 g Perhitungan kadar : M=

0,6807 g 1 x 136,09 g/mol 0,25 L

M = 0,02001 M = 20,01 mM

b. Reagen Fenton 1) Larutan FeCl3 1 mM Perhitungan bobot zat yang harus ditimbang (a) untuk mendapatkan larutan FeCl3 5 mM adalah : a = 5 x 10 -3 M x 162,21 g/mol x 0,01 L a = 0,008115 g BM FeCl3 = 162,21 g/mol BM H2O = 18,02 g/mol Bahan yang tersedia adalah FeCl3.6H2O (BM = 270,33 g/mol). Oleh karena itu, bobot FeCl3.6H2O yang harus ditimbang (b) untuk mendapatkan larutan FeCl3 dengan konsentrasi akhir 5 mM adalah : b=

270,33 x 0,008115 g 162,21

b = 0,0135165 g Bobot zat hasil penimbangan : 0,01453 g Sejumlah 0,01453 g FeCl3.6H2O yang telah ditimbang kemudian dilarutkan dalam akuades hingga 10,0 ml.


Perhitungan kadar : M=

0,01453 g 1 x 270,33 g/mol 0,01 L

M = 5,38.10-3 M Selanjutnya larutan ini diencerkan hingga mendapatkan larutan FeCl3 konsentrasi 1 mM. Volume pengambilan larutan dihitung menggunakan rumus : V1 x C1 = V2 x C2 V1 x 5,38 mM = 10,0 ml x 1 mM V1 = 1,86 ml ~ 1,9 ml. Sebanyak 1,9 ml larutan FeCl3 5,38 mM diambil, dimasukkan dalam labu ukur 10 ml kemudian ditambahkan air hingga tanda. Konsentrasi akhir larutan hasil pengenceran adalah 1,0 mM. 2) Larutan EDTA 1 mM Perhitungan bobot zat yang harus ditimbang (a) untuk mendapatkan larutan EDTA 5 mM adalah : a = 5 x 10 -3 M x 290,22 g/mol x 0,01 L a = 0,014511 g BM Na = 22,99 g/mol BM EDTA = 290,22 g/mol BM H2O = 18,02 g/mol


Bahan yang tersedia adalah Na2EDTA.2H2O (BM =372,24 g/mol). Oleh karena itu, bobot Na2EDTA.2H2O yang harus ditimbang (b) untuk mendapatkan larutan EDTA 5 mM adalah : b=

372,24 x 0,014511 g 290,22

b = 0,018612 g Bobot zat hasil penimbangan : 0,01886 g Sejumlah 0,01886 g Na2EDTA.2H2O yang telah ditimbang kemudian dilarutkan dalam akuades hingga 10,0 ml. Perhitungan kadar : M=

0,01886 g 1 x 372,24 g/mol 0,01 L

M = 5,07.10-3 M Selanjutnya larutan ini diencerkan hingga mendapatkan larutan EDTA konsentrasi 1 mM. Volume pengambilan larutan dihitung menggunakan rumus : V1 x C1 = V2 x C2 V1 x 5,07 mM = 10,0 ml x 1 mM V1 = 1,97 ml ~ 2,0 ml. Sebanyak 2,0 ml larutan EDTA 5 mM diambil, dimasukkan dalam labu ukur 10 ml kemudian ditambahkan air hingga tanda. Konsentrasi akhir larutan hasil pengenceran adalah 1,0 mM. 3) Larutan H2O2 20 mM Bahan yang digunakan : larutan H2O2 30%


BM : 34,02 g/mol Perhitungan molaritas larutan H2O2 30% M=

30 g 1 x 34,02 g/mol 0,1 L

M = 8,818 M Larutan H2O2 30% kemudian diencerkan hingga didapatkan larutan H2O2 konsentrasi 20 mM. Pengenceran dilakukan sebanyak 2 tahap. Volume pengambilan larutan dihitung menggunakan rumus: V1 x C1 = V2 x C2 Tahap 1: V1 x 8,818 x 103 mM = 10,0 ml x 80 mM V1 = 0,0907 ml ~ 0,091 ml. Sebanyak 0,091 ml larutan H2O2 30 % diambil kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml kemudian ditambahkan air hingga tanda. Konsentrasi akhir larutan hasil pengenceran adalah 80 mM. Tahap 2: V1 x 80 mM = 10,0 ml x 20 mM V1 = 2,5 ml Larutan ini diambil sebanyak 2,5 ml, dimasukkan dalam labu ukur 10 ml kemudian ditambahkan air hingga tanda. Konsentrasi akhir larutan hasil pengenceran adalah 20 mM 4) Larutan Vitamin C 1 mM Bahan yang digunakan : Vitamin C BM : 176,13 g/mol


Larutan Vitamin C 10 mM Perhitungan bobot zat yang akan ditimbang (a) : a = 10 x 10 -3 M x 176,13 g/mol x 0,01 L a = 0,01761 g Bobot zat hasil penimbangan : 0,01768 g Sejumlah 0,01768 g Vitamin C yang telah ditimbang kemudian dilarutkan dalam akuades hingga 10,0 ml. Perhitungan kadar : M=

0,01768 g 1 x 176,13 g/mol 0,01 L

M = 1,00.10-2 mM Larutan ini kemudian diencerkan hingga mendapatkan larutan Vitamin C konsentrasi 1 mM. Volume pengambilan larutan dihitung menggunakan rumus: V1 x C1 = V2 x C2 V1 x 10 mM = 10,0 ml x 1 mM V1 = 1,0 ml. Larutan ini diambil sebanyak 1,0 ml, dimasukkan dalam labu ukur 10 ml kemudian ditambahkan air hingga tanda. Konsentrasi akhir larutan hasil pengenceran adalah 1,0 mM.

c. Deoksiribosa 2,5 mM Bahan yang digunakan : 2-Deoksi-D-ribosa BM : 134,13 g/mol


Larutan Deoksiribosa 15 mM : Perhitungan bobot zat yang akan ditimbang (a) : a = 15 x 10 -3 M x 134,13 g/mol x 0,01 L a = 0,02012 g Bobot zat hasil penimbangan : 0,02114 g Sejumlah 0,02114 g Deoksiribosa yang telah ditimbang kemudian dilarutkan dalam akuades hingga 10,0 ml Perhitungan kadar : M=

0,02114 g 1 x 134,13 g/mol 0,01 L

M = 15,8.10-3 mM Larutan ini kemudian diencerkan hingga mendapatkan larutan Deoksiribosa konsentrasi 2,5 mM. Volume pengambilan larutan dihitung menggunakan rumus: V1 x C1 = V2 x C2 V1 x 15,8 mM = 25,0 ml x 2,5 mM V1 = 3,96 ml ~ 4,0 ml. Larutan ini diambil sebanyak 4,0 ml, dimasukkan dalam labu ukur 25 ml kemudian ditambahkan air hingga tanda. Konsentrasi akhir larutan hasil pengenceran adalah 2,5 mM.

d. Ekstrak etanol konsentrasi 1 mg/ml (1) Teh hijau Bobot zat yang akan ditimbang

: 0,025 g (dalam 25,0 ml)


Bobot zat hasil penimbangan Konsentrasi

=

: 0,02532 g

0,02532 g 25,0 ml

= 1,01.10-3 g/ml = 1,01 mg/ml (2) Teh hitam Bobot zat yang akan ditimbang

: 0,025 g (dalam 25,0 ml)

Bobot zat yang ditimbang : 0,02539 g Konsentrasi

=

0,02539 g 25,0 ml

= 1,02.10-3 g/ml = 1,02 mg/ml

e. TBA (Asam Tiobarbiturat) 1% Bobot zat yang akan ditimbang

: 0,025 g (dalam 25,0 ml)

Bobot zat hasil penimbangan

: 0,24967 g

Perhitungan kadar : Kadar =

0,24967 g x 100% 25,0 ml

= 0,999 %

f. TCA (Asam Trikloroasetat) 5 % Bobot zat yang akan ditimbang : 1,25 g (dalam 25,0 ml) Bobot zat hasil penimbangan : 1,23893 g


Perhitungan kadar : Kadar =

0,49556 g x 100% 25,0 ml

= 4,96 %


Lampiran 5. Contoh perhitungan % scavenging ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam Rumus yang menyatakan besar penangkapan radikal hidroksil : % Scavenging =

Absorbansi larutan kontrol − Absorbansi larutan Absorbansi larutan kontrol

sampel

a. Ekstrak etanol teh hijau % Scavenging : •

Konsentrasi 0,033 mg/ml =

0,954 − 0,722 x 100% = 24,3 % 0,954

•


0,954 − 0,699 x 100% = 26,8 % 0,954

•


0,954 − 0,652 x 100% = 31,7 % 0,954

•


0,954 − 0,621 x 100% = 34,9 % 0,954

•


0,954 − 0,594 x 100% = 37,7 % 0,954

b. Ekstrak etanol teh hitam % Scavenging : •


0,970 − 0,657 x 100% = 32,3 % 0,970

•


0,970 − 0,636 x 100% = 34,4 % 0,970

•


0,970 − 0,615 x 100% = 36,6 % 0,970

•


0,970 − 0,599 x 100% = 38,2 % 0,970

•


0,970 − 0,584 x 100% = 39,8 % 0,970

x 100%


Lampiran 6. Contoh perhitungan ES50 Perhitungan ES50 dilakukan dengan cara mencari persamaan regresi linier antara konsentrasi ekstrak etanol teh hijau atau teh hitam (sebagai nilai x) vs % scavenging (sebagai nilai y). a. Ekstrak etanol teh hijau A = 20,636 B = 104,437 r = 0,994 Persamaan regresi linier : y = 1,305 x + 20,636 ES50 =

50 − 20,636 1,305

= 22,501 mg/80ml = 0,281 mg/ml b. Ekstrak etanol teh hitam A = 30,631 B = 56,284 r = 0,997 Persamaan regresi linier : y = 0,703 x + 30,632 ES50 =

50 − 30,632 0,703

= 27,550 mg/80ml = 0,344 mg/ml


76

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Ekstrak Etanol Teh Hijau dan Teh Hitam dengan Metode Deoksiribosa” ini bernama Carla Kuntari, lahir di Yogyakarta pada tanggal 4 November 1984, anak kedua dari pasangan Drs. B. Rahmanto, M.Hum. dan A.M. Budiarti, AMK. Penulis telah menyelesaikan pendidikannya di Taman Kanak-kanak Kanisius Demangan Baru Yogyakarta pada tahun 1989, di Sekolah Dasar Kanisius Demangan Baru Yogyakarta pada tahun 1996, di Sekolah Menengah Pertama Negeri 8 Yogyakarta pada tahun 1999, dan di Sekolah Menengah Atas Stella Duce 1 Yogyakarta tahun 2002. Penulis kemudian melanjutkan studinya di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2002. Selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta penulis pernah menjadi asisten praktikum Formulasi dan Teknologi Sediaan Semi Solid, Formulasi dan Teknologi Sediaan Steril, Botani Dasar, Kimia Analisis, dan Kimia Farmasi.

UJI AKTIVITAS PENANGKAPAN RADIKAL HIDROKSIL OLEH EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU DAN TEH HITAM DENGAN METODE DEOKSIRIBOSA SKRIPSI

Recommend Documents