Toxikologická analýza v moči – drogy, léky a jejich metabolity Viktor Voříšek Ústav klinické biochemie a diagnostiky g y LF UK a FN v Hradci Králové
Problematika klinické toxikologie • Diferenciální diagnostika bezvědomí g neznámé etiologie • Konfirmace diagnózy • Monitoring M it i vývoje ý j iintoxikace t ik • Od Odhalení a e abusu • Zjištění nadužívání preskribovaného lč
Toxikologické rozdělení noxskupiny • • • •
chemikálie h ikáli v zemědělství ěděl t í ( h herbicidy) bi id ) léčivé p přípravky p y ( zejména j HVLP vč drog g) potravinářská aditiva ( konzervancia ) průmyslové substance ( rozpouštědla rozpouštědla, mazadla, meziprodukty chem. výrob aj.) • přírodní ří í jedy rostlinného é i živočišného ž čš é původu ( fytotoxiny, mykotoxiny, anorganické látky-minerály) • spalné p p produkty y(p pohonných ý hmot např.) p )
Kvalitativní analýza • systematické hledání neznámé noxy • rozlišení mezi skutečnou či zdánlivou intoxikací • neznámá á á anamnéza é • nejasný ejas ý klinický c ý obraz ob a stavu sta u • toxické projevy indikující celou skupinu ( betablokátor di betablokátory, diuretika, retika la laxativa) ati a) • kombinované otravyy ( alkohol + léčiva )
Kvantitativní analýza • strategie detoxikace a léčby otravy ( antidota, např. paracetamol v. acetylcystein) • monitoring úspěšnosti detoxikace • stanovení prognózy otravy (paraquat) • rozlišení mezi toxickou a terapeutickou dávkou • kombinovaná otrava ( př př. ethanol + methanol) • toxikokinetické kalkulace • toxikologický monitoring (expozice těžkými kovy)
MOČ-oblíbená tělní tekutina analytického toxikologa • prolongace výskytu noxy a jejich p krvi metabolitů oproti • poměry metabolitů II.biotransformační fáze k volným formám • kvantita v moči v komparaci ke kvantitativní analýze v krvi
Odběr vzorků a jeho vliv na bioanalýzu xenobiotik • Krev, resp. serum (plazma) vypovídá o aktuálním stavu vyšetřovaného, vyšetřovaného klinický význam, analyticky problematické s ohledem na LOD, LOQ • Moč: obsahuje původní látky a jejich metabolity několik dní až týdnů po jednorázovém požití drogy klinický i forenzní význam, drogy, význam analyticky dobře řešitelný problém • Žaludeční obsah: prognóza otravy • Sliny: pro nelaboratorní složky, diskutabilní • Pot: aktuální stav • Vlasy: obsahují původní látky a jejich metabolity až 3 měsíce po jednorázovém abusu
MOČ-neoblíbená matrice analytického toxikologa • biochemické složení moči má několik g dopadů p na analytický y ý výsledek ý negativních • interference řady látek na úrovni – detekční separační, detekční, separační hrozí devastace určitých částí instrumentu při nedodržení správné á é laboratorníí praxe při ř přípravě ří ě y vzorku analytického
ODBĚRY MOČE • alterace primárního vzorku ze strany testované osoby y • velikost objemu dle analytické techniky • jednorázová j d á á moč č • opa opakované o a é odbě odběryy p při odhalování od a o á abusu
Zbarvení moče • červený/růžový odstín: p , , y, p , , g, ampicilin,anilin,borůvky,ibuprofen,Pb,Hg,fe nytoin,chinin,rifampicin • oranžový: warfarin,rifampicin,paprika warfarin rifampicin paprika • hnědý: nitrofurantoin
INSTRUMENTÁLNÍ IMUNOCHEMICKÉ METODY V ANALYTICKÉ TOXIKOLOGII • RIA • ENZYME MULTIPLIED IMMUNOASSAY TECHNIQUE (EMIT) • FLUORESCENCE UO SC C POLARIZATION O O IMMUNOASSAY (FPIA) • KINETIC INTERACTION OF MICROPARTICLES IN SOLUTION (KIMS) • CLONED ENZYME DONOR IMMUNOASSAY (CEDIA) • ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY ( (ELISA) )
RYCHLÁ IA – on site devices • pro extralaboratorní terén • policie • riziková pracoviště • školy • nutnost konfirmace v laboratoři • v laboratoři NEJSOU NA MÍSTĚ
Trendy Pro extralaboratorní terén kapesní reflektometry • RapiScan - Cozart • ORALSCREEN hand-held Analyzer – Avitar • ENVITEC ( pot) t) • UltiMed
pro laboratoře EIA, ELISA mikrotitrační destičky, mikročipy
IMUNOANALÝZA – TROCHA HISTORIE • EMIT, využití pro detekci THC poprvé publikována NIDA ( Maryland, p y , USA,, Ed. R.E.Villette) v roce 1976 • K. K E. E Rubenstein et al. al , Homogeneous enzyme immunoassay. A new immunochemical technique, Biochem. p y Res. Comm. 1972, 47, 846– Biophys. 851.(PubMed) první publikace
FPIA • W. B. Dandliker et al. , Fluorescence polarisation immunoassay. p y Theory y and experimental method, Immunochemistry, 1973 10 1973, 10, 219–227 219 227.
VÝHODY IMUNOANALÝZY • RYCHLOST přímá analýza v primárním vzorku bez potřeby jeho složitější předchozí úpravy • MOŽNOST PLNÉ AUTOMATIZACE není třeba analytického toxikologa k vlastnímu měření = možnost implementace metodik do celkového spektra např. biochemických metod • PŘIBLÍŽENÍ EXTRALABORATORNÍMU TERÉNU • VYSOKÁ CITLIVOST
NEVÝHODY IMUNOANALÝZY • OMEZENÝ Ý ANALYTICKÝ Ý ZÁBĚR-DNES Á Ě POTŘEBA IDENTIFIKOVAT MINIM.300 PARENTNÍCH NOX + METABOLITY, CELKEM 900 • NIŽŠÍ SPECIFITA • INTERFERENCE XENOGENNÍCH LÁTEK STRUKTURNĚ PŘÍBUZNÝCH ( NĚKDY VÝHODA)
Málo á o uváděné u ádě é nevýhody e ý ody imunochemických metod v toxikologické analýze • finanční náročnost • Nelineární nebo semilog kalibrace
PROFIL TOXI IA I. I • • • • • • • • •
BARBITURÁTY BENZODIAZEPINY TCA SALICYLÁTY PARACETAMOL OPIÁTY 6-MAM BUPRENORFIN LSD
PROFIL TOXI IA II • • • • • •
AMFETAMINY MDMA THC Met KOKAINU METHADON + TDM PROFIL ( DIGOXIN, AMIKACIN, VANKOMYCIN, CyA, Tacro, Siro, Evero?, MTX, AEP : VALPROÁT, Á FENOBARBITAL, KARBAMAZEPIN, FENYTOIN
HETEROGENNÍ IA
Figure 20.6. A heterogeneous EIA.
EMIT Princip
ZKŘÍŽENÁ REAKCE-VÝHODA I OMEZENÍ
Zkřížená reakce
KALIBRACE IA
IA-DOBRÝ NÁSTROJ PRO RYCHLOU ORIENTACI V MONITORINGU ELIMINACE URČITÉ NOXY • IA v toxikologii maximálně semikvantita dle % cross react • AVŠAK lze použít v monitorování detoxikace profil poměrů krev/moč detoxikace, • Př.: otrava diazepamem může být bez problému pomocí S-Benzo sledována
IMUNOANALÝZA- specifický přístup k řešení problémů
IMUNOANALÝZA-SOUHRN • měla, ě má á a bude mít í své é nezastupitelné místo v toxikologické bioanalýze ý g • v laboratoři jjako součást integrálního detekčního systému STA • v extralaboratorním terénu jako rychlé imunoprecipitační orientační testy s nutností laboratorní konfirmace
ROZDĚLENÍ METODIK DLE ANALYTICKÉHO CÍLE • • • • • •
SPECIÁLNÍ Á Í TLC HPLC GC-FID GC-MS LC-MS
• • • • • •
PLNÉ É AUTOMATY EMIT FPIA CEDIA ELISA HPLC TOX.I.S. (dříve REMEDi) • LC-MS Cliquid ( MS nadstavba TOX.I.S.)
LE
t [min]
EVOLUCE TLC V ANALYTICE
HPTLC
Prominence TOX.I.S. HPLC/PDA for identification of drugs in human urine-stav na ÚKBD FN HK
• Vývoj vhodné akvizice: kombinace toxikologicky g y závažných ý aktuálně se vyskytujících léčiv: alprazolam, zolpidem, karbamazepin levomepromazin karbamazepin, levomepromazin, trazodon aj. • Ilegální á í návykové á é látky: á v případě ří ěú úspěchu ě postavení výše p ý uvedené akvizice, budou o službě detekovány pouze imunochemicky a identifikace statim výše uvedených lč
RECIPE® Drogen im Urin - On-line Analytik mit TOX.I.S.™ náhrada REMEDi DPS a UBZ Dieser ClinRep® Reagenzienkit ist für die Anwendung auf dem TOX.I.S.™ System von Shimadzu konzipiert, konzipiert einem HPLC-System, welches für das Drogen Screening Drogen-Screening
TOX I.S. IS
GC MS GC-MS
Figure 28.1. A modern GC system.
GC-MS V ANALYTICKÉ TOXIKOLOGII • • • • • •
STÁLE Á ZLATÝ Ý STANDARD EXTRAKCE PŘÍPADNÁ DERIVATIZACE SCREENING IDENTIFIKACE KONFIRMACE
GC MS spektrum GC-MS kt psilocinu il i
LC MS MS LC-MS-MS
IONIZACE ZA ATMOSFERICKÉHO TLAKU • nejčastěji používané rozhraní pro spojení ( ) konfigurace g LC(HPLC)-MS • kombinace thermální a pneumatické desolvatace • limitace průtoku mobilní fáze nL/minmL/min • ESI • APCI
ESI ElectroSpray Ionization ESI-ElectroSpray • Princip: analyzovaný vzorek je rozprašován p do oblasti s vysokým y ý potenciálovým spádem ( rozdílem). Potenciál tvoří sestava dvou elektrod: tryska ESI + vstupní elda MS optiky • Výhody: ý výborná ý á pro polární, á í iontové é nebo y které nesou basické sloučeninyy – všechny, výrazný náboj, excelentní pro biopolymery
APCI-Atmospheric Pressure Chemical Ionization • Princip: Ionizace v plynné fázi v oblasti y p pole koronového výboje ý j vysokého • Výhody: výborná pro méně polární analyty • Nevýhoda: N ýh d nelze l analyzovat l t nad d 2000 D Da
Trazodon 2-[3-[4-(3-Chlorophenyl)-1–piperazinyl]propyl]-1,2,4–triazolo[4,3-a]pyridin–3(2H)-on
KOLONA: ASCENTIS-RP-AMIDE, SUPELCO, 50 x 4.6. mm,3 µm
RT: 0.00 - 16.00 SM: 7G NL: 1.79E6 m/z= 175.41176.41 MS ICIS S169K_Z_ 04
RT: 3.15 AA: 12934987 SN: 20351
100 95 90 85 80 75 70 65
Relative Abundance
60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 RT: 2.25 AA: 68389 SN: 139
5
RT: 4.09 AA: 59032 SN: 34
0 0
1
2
3
4
5
RT: 5.92 AA: 10392 SN: 11 6
7
8 Time (min)
9
10
11
12
13
14
15
MATRICE (MATRIX) MOČI Č • voda • endogenní interferenty nízkomolekulární • endogenní d í iinterferenty t f t vysokomolekulární • exogenní interferující látky ( konkurence mezi analyty na úrovni ZI), soli – suprese iontů • částice sedimentu
HYDROLÝZA KONJUGOVANÝCH METABOLITŮ Zisk Zi k volných l ý h forem f z důvodů: dů dů ◊ zisk zplynitelných py ý forem pro p GC ◊ nedostupnost kalibrantů konjugátů ◊ nízké koncentrace ( dle IA screeningu) Chemická ( kyselá n. bazická ) Enzymatická – vhodnější ( degradace deg adace 6 6-MAM po kyselé yse é hydrolýze )
ŘEDĚNÍ V PŘÍPADĚ LC-MS LC MS Možnost ž přímého ří éh nástřiku á řik za předpokladu, že: • Očekáváná koncentrace analytu > LOD • Vodou n. n MF • nebezpečí kontaminace vnitřní optiky
Photograph of a meniscus of polyvinyl alcohol in aqueous solution showing a fibre drawn from a Taylor cone by the process of electrospinning
APCI perspektivní ZI s ohledem na vzorky moči
Porovnání doby přípravy anal.vz. ve screeningu GC/ITD v. LC/LIT KROK
GC/ITD
LC/LIT
centrifugace
5
5
LL extrakce
10
10
supernatant
1
1
Odpařování pod N2
5
5
derivatizace
30
0
rekonstituce
1
1
finální filtrace 0
5
celková doba
27
52
Příklad 2/vzorek 2_1302 2 1302
MS2 klonazepam v plném skenu/+APCI
Pozitivní forensní případy záchytu drog a léčiv v dopravě 2008
jiná lč
benzo
morfinany
amfetaminy
kannabis
