9/30/2013
Mikroba = kel jasad hidup berukuran kecil dng kisaran ukuran sel sekitar 0,1 – 10 µm (1 µm = 10-6)
BIOTEKNOLOGI MIKROBA Teknik dasar kultur mikroba Perbaikan strain mikroba Pembuatan inokulum pupuk hayati Pertemuan ke 5
TEKNIK DASAR KULTUR MIKROBA • Dapat ditumbuhkan dlm medium padat (misal: tempe, tape, oncom, jamur konsumsi) dan medium cair (misal: untuk menghasilkan antibiotik, etanol, asam asam amino, nata de coco). • Berdasarkan komposisi medium utk menumbuhkan mikroba : - medium lengkap - medium minimal
• Perbedaan mikroba dng jasad hidup lain<, satu sel mikroba adalah satu individu. • Mikroba ada 3 kelompok utama : - Prokaryot - Eukaryot - Archaea Contoh prokaryot: bakteri Eschericia coli Contoh eukaryot: Khamir Saccharomyces cerevisiae
Medium lengkap : bahan organik atau anorganik yg dapat memenuhi kebutuhan mikroba utk pertumbuhan dan aktivitas metabolismenya shg mikroba dpt tumbuh scr optimum. Contoh bahan organik: ekstrak daging, ekstrak taoge, ekstrak kentang, dll Medium minimal: suatu bahan kimia (umumnya bahan anorganik) dng komposisi terbatas yg digunakan utk pertmbhn mikroba.
1
9/30/2013
Contoh Medium lengkap Komposisi media nutrien cair dan nutrien agar untuk bakteri: Nutrien cair:
Bahan medium: bahan kimia buatan pabrik atau bahan alami yang diproses untuk memenuhi kebutuhan C, unsur makro dan mikro serta senyawa lain yang dibutuhkan untuk pertumbuhan
2 g nutrien broth + aquades 250 ml Nutrien agar: 2 g nutrien broth + aquades 250 ml + 3 g agar
Media cair steril
Komposisi media taoge cair dan taoge agar untuk jamur/khamir: Taoge cair: 25 g taoge + 15 g gula pasir + aquades 250 ml
Taoge agar: 25 g taoge + 15 g gula pasir + aquades 250 ml + 3 g agar
TEKNIK KULTIVASI MIKROBA 1. KULTUR BATCH (sekali panen) Mikroba ditumbuhkan dlm medium sampai mencapai fase pertumbuhn maksimal kemudian dipanen produknya (sel/biomassa atau produk metabolitnya) 2. KULTUR KONTINYU Mikroba ditumbuhkan terus menerus pada fase paling optimum (eksponensial) shg pemanenan produk dapat dilakukan berulang ulang tanpa mengulangi kultivasi dari awal.
BAHAN MEDIUM BANYAK TERSEDIA, MUDAH DIDAPAT DAN MURAH HARGANYA: -SISA TANAMAN/HEWAN, LIMBAH ORGANIK, KOMPOS. -Bahan medium dianalisis kandungan C, N, P, K, apabila kandungan unsur tersebut kurang maka ditambah BAHAN KIMIA TEKNIS - Kebutuhan C, N, P, K untuk pertumbuhan mikroba dapat diketahui dengan perhitungan atau percobaan pendahuluan
KULTUR BATCH • Pola pertumbuhan SIGMOID - fase pertmbhn lag / adaptasi Belum ada penambhan jumlah sel lamanya tergtg : status fisiologis mikroba, macam mikroba, perbedaan kondisi pertumbhn sebelum mikroba ditumbuhkan dlm medium lengkap kemudian ke medium minimal.
2
9/30/2013
Grafik pertumbuhan mikroba dalam satuan bilangan logaritma
-Fase pertmbhn dipercepat fase ini berlgs cepat karena mikroba kan masuk ke fase berikutnya.
Kurva pertumbuhan mikroba dalam kultur tertutup (batch culture)
Skema dasar bioreaktor sistem batch
- Fase eksponensial pertambahan jumlah sel berlgs secara logaritmik mikroba mencapai status isiologis yg optimum. - Fase pertmbhn diperlambat nutrien berkurang karena digunakan untuk pertumbuhan - Fase stationer sebagian sel mengalami kematian shg rasio jumlah sel yg hidup dan yg mati seimbang dan jd jml sel total tdk meningkat.
3
9/30/2013
KULTUR KONTINYU Ada 2 cara : 1. KEMOSTAT : Menambahkan nutrien dlm suatu tangki shg komposisi nutrien di dlm fermentor tempat kultivasi mikroba selalu dlm keadaan tetap. 2. TURBIDOSTAT Menambahkan nutrien secara kontinyu shg kerapatan sel selalu dlm keadaan tetap. Dlm turbidostat aliran medium diatur berdasarkan kerapatan optik kultur mikrobia.
Kemostat untuk Bioreaktor sel kontinyu
Contoh bioreaktor kultur cair yang digunakan untuk kultur kontinyu:
Fermentor skala laboratorium
PEMANFAATAN MIKROBA DALAM INDUSTRI BIOTEKNOLOGI 1. Produk pangan yg dikonsumsi secara langsung 2. Produksi bahan baku utk pangan 3. Produksi bahan utk mendukung tahapan sebelum panen (misal biofertilizer, biopestisida, bioaktivator kompos) 4. Produksi bahan bahan utk pengelolaan kesehatan 5. Produksi bahan bahan pendukung utk industri yg lain Dlm industri bioteknologi semacam ini mikroba dapat digunakan sbg : 1. agensia produksi (untuk produksi alkohol, asam sitrat, keju, enzim, insulin, antibiotik, dll) 2. produk hasil akhir yang digunakan secara langsung (tempe, yogurt, biofertilizer, biopestisida)
4
9/30/2013
PERBAIKAN STRAIN MIKROBA PENINGKATAN KEMAMPUAN FISIOLOGIS MIKROBA: 1.Teknik Konvensional a. Teknik mutagenesis secara acak - mutagenesis dg mutagen kimia - mutagenesis dg mutagen fisik - mutagenesis secara terarah. b. Fusi protoplas (dipelajari pada pertemuan ke 7)
2.Teknik modern (non-konvensional) Dipelajari setelah DNA rekombinan, pada bioteknologi mikroba penambat nitrogen (setelah mid)
Teknik Konvensional Pembuatan Pupuk Hayati Penambat Gas Nitrogen Bisakah menanam bakteri penambat N2? Jawabnya tentu bisa Mau mencoba? Caranya bagaimana?
Mulai dari isolasi, kultur & perbanyakan Untuk apa? Untuk pupuk hayati pengganti pupuk N kimia
PEMBUATAN PUPUK HAYATI • Merupakan sel mikroba yang dapat berfungsi sebagai pupuk. • Sering disebut sebagai inokulum pupuk hayati • Produknya berisi sel-sel mikroba dengan kemampuan khusus, misal: - mikroba penambat nitrogen - mikroba pelarut fosfat, dll
PRINSIP PEMBUATAN INOKULUM • I. ISOLASI, PEMILIHAN, DAN PEMELIHARAAN KULTUR • II. TEKNIK PERBANYAKAN MIKROBA • III. FORMULASI • IV. PACKING DAN PENYIMPANAN
Produknya disebut apa? Inokulum bakteri penambat nitrogen
5
9/30/2013
PEMILIHAN MIKROBA UNGGUL METODE KIMIA: -N15 UNTUK FIKSASI N2 -P TERLARUT UTK PELARUT RP. -CO2 / HARA TERSEDIA UTK PEROMBAK BAHAN ORGANIK -SULFAT UNTUK OKSIDASI SO,dll
METODE MIKROBIOLOGIS: -MEDIUM BEBAS NITROGEN
-MEDIUM + BATU FOSFAT -MEDIUM + BAHAN ORGANIK YANG DIUJI -MEDIUM + SULFUR / Fe S (PIRIT) -MEDIUM + Mn SO4, dll
PEMELIHARAAN KULTUR MIKROBA UNGGUL DIBUAT BIAKAN MURNI: -KULTUR STOK -KULTUR SEDIAAN
PENYIMPANAN KULTUR: 1. JANGKA PENDEK/SEGERA DIGUNAKAN
2. JANGKA PANJANG/ UNTUK STOK YG TAHAN HIDUP SAMPAI BEBERAPA TAHUN
BIAKAN DALAM MEDIUM PASIR ATAU TANAH BIAKAN LIOFILIK
Sistem Fermentasi untuk Perbanyakan Sel
TEKNIK PERBANYAKAN MIKROBA • PEMILIHAN MEDIUM PERBANYAKAN MIKROBA • BAHAN MEDIUM BANYAK TERSEDIA, MUDAH DIDAPAT DAN MURAH HARGANYA • MISAL SISA TANAMAN/HEWAN, LIMBAH ORGANIK, KOMPOS, dll + BAHAN KIMIA TEKNIS
BIAKAN CAIR/PASTA, PADA SUHU 5-15OC TAHAN SAMPAI 1 BULAN BIAKAN AGAR MIRING/ DISIMPAN SUHU 5-15OC TAHAN 3-6 BULAN BIAKAN AGAR MIRING + LAPISAN GLISEROL, PADA SUHU 5-15OC TAHAN SAMPAI 1 TAHUN
FERMENTASI PADAT: • • • •
DALAM NAMPAN/ KANTONG FERMENTOR KOLOM FERMENTOR DRUM PUTAR FLUIDIZED BED DEVICES
• FERMENTASI CAIR • •
KULTUR GOJOK (SHAKE CULTURE) DALAM ALAT FERMENTOR KULTUR CAIR
6
9/30/2013
TEKNIK ISOLASI MIKROBA
STERILISASI MEDIA DAN ALAT UNTUK KULTUR BAKTERI AUTOCALVE MEDIA: 121OC 15 MENIT
SEMUA ALAT YANG DIGUNAKAN DISTERILISASI
TEKNIK KERJA ASEPTIS UNTUK PENANAMAN BAKTERI
STERILISASI OSE SEBELUM DIGUNAKAN
MENANAM BAKTERI PADA PETRIDISH di laminer air flow
ALAT: 121OC 30 MENIT
Bintil akar
Isolasi Bakteri Penambat N2 Udara
Pengenceran untuk teknik isolasi taburan • Pengenceran sumber isolat dilakukan agar diperoleh koloni yang tumbuh terpisah
Bintil akar disterilkan, dipecah, diambil cairannya menggunakan jarum ose
Ose digoreskan di atas media agar
Pada isolasi teknik goresan, sumber isolat bisa diencerkan terlebih dahulu menggunakan air steril, agar diperoleh koloni terpisah. Figure 6.15
7
9/30/2013
Pembuatan kultur murni Rhizobium
DITANAM DI MEDIA AGAR MIRING
Isolasi Mikroba Pelarut Fosfat • •
Koloni hasil kultur bintil akar yang terpisah diambil dengan ose
Simpan dalam refrigerator (almari es tapi bukan di freezernya)
CONTOH ISOLAT DARI TANAH VERTISOL GADING GUNUNG KIDUL
• • •
Tanah risosfer dibuat seri pengenceran dengan air steril Masing2 pengenceran ditaburkan di medium yang mengandung P tak larut /Pikovskaya med Inkubasi suhu kamar selama 3-4 hari Mikroba yang membentuk zona jernih dimurnikan pada medium agar yg sama Dibuat biakan dalam agar miring
Pemilihan mikroba pelarut fosfat a. Pelarutan P tidak larut pada medium agar
Aspergillus JAMUR PELARUT FOSFAT (Sumarsih , 1986)
Inokulasi titik koloni yg membentuk zona jernih pada medium pikovskaya agar dalam petri Inkubasikan 4-5 hari pada suhu kamar Ukur luas zona jernih di sekeliling koloni Zona jernih yang terluas menunjukkan kemampuan melarutkan P yg besar
8
9/30/2013
Uji kimia :Media cair yang diberi bubuk Sulfur berubah menjadi jernih
UJI PEMILIHAN MIKROBA PENGOKSIDASI SULFUR
Uji mikrobiologis: Zona jernih di media tanda mampu mengoksidasi Sulfur
BAKTERI PETROFILIK (PEROMBAK MINYAK BUMI) dapat membentuk biomassa dengan sumber karbon minyak bumi
Minyak bumi Sulfur yang semula ditandai dengan keruh menjadi jernih di media cair
Biomassa bakteri/warna minyak bumi berubah
Uji Perombakan pati & selulosa Uji Perombakan pati
Perombakan CMC (Carboxy Methyl Cellulose)
dipindah ke fermentor sederhana
Media diberi larutan Yod. Zona jernih menunjukkan pati telah terombak
Uji perombakan selulosa mikrokristalin
Agar hasil lebih banyak dari kultur gojok dipindah ke fermentor
9
9/30/2013
Kultur murni ditanam dalam media cair bifase TEKNIK PRODUKSI / PERBANYAKAN MIKROBA SECARA SEDERHANA
PERBANYAKAN JAMUR MENGGUNAKAN MEDIA PADAT
Media dari bahan yang mudah didapat
Skala industri
Skala produksi kecil menggunakan fermentor sederhana
digojok
Perbanyakan mikroba menggunakan fermentor skala laboratorium
Starter Kultur murni
KULTUR SEDIAAN STARTER
DIPERBANYAK DALAM FERMENTOR
PERBANYAKAN BAKTERI DENGAN TEKNOLOGI MODERN
DIPERBANYAK DALAM FERMENTOR MODERN
10
9/30/2013
STARTER & PENGGANDAAN SKALA FERMENTASI STARTER UNTUK: • (a) MENGADAPTASI MIKROBA DARI MEDIUM AGAR KE MEDIUM PERBANYAKAN • (b) MEMBUAT INOKULUM DARI SKALA KECIL (BIAKAN MURNI DALAM TABUNG REAKSI) MENJADI SKALA YANG LEBIH BESAR
PENGGANDAAN SKALA UNTUK: • PRODUKSI SKALA LABORATORIUM SAMPAI SKALA PABRIK • PENGATURAN PRODUKSI DAN KONTROL KUALITAS
Kultur gojok dalam erlenmeyer 250 ml FERMENTOR SEDERHANA
volume 20 liter
Bioreaktor Skala Industri volume 1000 liter
FORMULASI INOKULAN INOKULAN: •
CAMPURAN MIKROBA + CARRIER
SIFAT BAHAN CARRIER/PEMBAWA: • • •
INERT MUDAH DICAMPUR MUDAH DIBENTUK
FORMULASI INOKULAN: • •
BAKTERI: INOKULAN UNTUK BIJI / TANAH, PADAT / CAIR JAMUR : FORMULASI VERMICULITE, TEPUNG/BUBUK, TABLET, PRIL, GEL
PACKING DAN PENYIMPANAN • PACKING: • • • •
BENTUK CAIR / PADAT KEDAP UDARA/ TIDAK KEDAP UDARA INAKTIVASI/ LIOFILISASI / +ASAM MASA AKTIF / KEDALUARSA
• PENYIMPANAN: • • •
SUHU RUANG / SUHU DINGIN / REFRIGERATOR KELEMBABAN AERASI
11
9/30/2013
Alur proses pembuatan inokulum bakteri secara industri Penggandaan skala produksi mikroba
Setelah bakteri diperbanyak dicampur dengan carrier
Beberapa bentuk produk inokulum
12
