Technische aspecten van NietInvasieve Prenatale Testen (NIPT)
Dr Brigitte Faas Laboratorium specialist Klinische Genetica
SPN, bijscholing counseling NIPT
Introductie 1997: Lo et al.: Free fetal DNA in the maternal plasma/serum (Lancet 1997;350:485-487)
Circulating cell-free fetal DNA (ccffDNA) afkomstig van apoptotische cytotrophoblast cellen Fragmenteerd Aanwezig vanaf week 5 van zwangerschap 5-15% van het ccfDNA in het maternale plasma is van foetale origine
Introductie Lo LYM, Chiu RWK. Nat Rev Genet, 2007;8:71-77.
Trisomie 21 sample
% foetaal DNA
chr 21 (%)
chr 21 (-voud)
vlok
100%
50%
1.5
maternale plasma
~10%
5%
1.05
maternale plasma
4%
2%
1.02
een techniek om subtiele verschillen aan te tonen en / of een techniek om de regio van interesse te verrijken
Introductie Next Generation Sequencing (NGS) Miljoenen tot biljoenen baseparen sequencen per run Door gebruik te maken van patient-specifieke barcodes is parallel sequencen van meerdere patiënten simultaan in 1 run mogelijk
Massively Parallel Sequencing (MPS)
Introductie
PNAS, 2008 Oct 21;105(42):16266-71.
PNAS, 2008 Dec 23;105(51):20458-63.
Introductie
Chiu et al., PNAS, 2008 Dec 23;105(51):20458-63
Targeted approach Whole genome approach
Introductie Sequence reads = X
Sequence reads = 10X
Sequence reads = 100X
Verschil aantonen tussen ~1.32% en~1.27%
http://www.illinoisgenetics.org/web/wp-content/uploads/2013/02/Grobman-Non-invasive-prenatal-testing-update.pdf
Bepalen of er van een chromosoom meer (of minder) materiaal aanwezig is, ten opzichte van een referentie set van normale individuen / plasma’s Z-score (Chiu et al., 2008) Normalized Chromosome Value (Sehnert et al., 2011) student’s t -test-based (Jiang et al., 2012) WISECONDOR (Straver et al., 2013) .....
WIthin-SamplE COpy Number aberration DetectOR
triploidie en gebalanceerde rearrangements worden niet gedetecteerd!
Trisomie 21
Nijmegen T21 28 3x11+ 5x 12+ 7x13+ 1x14+ 4x15+ 1x18+ 1x20+ 1x21+ 1x22+ 4 onbekend Totaal
T18 7 2x12+ 2x13+ 1x20+ 2x21+
T13 4 +1 1x11+ 1x12+ 2x19+
anders 12
normaal 307
359
Alleen afwijkingen >20 Mb: geen vals-positieven / negatieven
High risk population
Sensitiviteit: T13: 92% T18: 97% T21: 99%
N
N T21
Sensitivity
Specificity
Chiu 2011
232
86
100%
97,9%
Ehrich 2011
449
39
100%
99,8%
Palomaki 2011
1683
212
98,6%
99,8%
Sehnert 2011
47
13
100%
100%
Ashoor 2012
397
50
100%
100%
Bianchi 2012
493
89
100%
100%
Lau 2012
108
11
100%
100%
Norton 2012
3080
81
100%
99,97%
Sparks 2012
167
36
100%
100%
Jiang 2012
903
16
100%
100%
Liang 2013
412
40
100%
100%
Nicolaides 2013
242
25
100%
100%
T13, T18 en geslachtschromosomen:
lager dan T21, afhankelijk van techniek, maar wel zeer hoog
Flow Nijmegen Week 1, ma / di:
Binnenkomst materiaal
Afdraaien plasma scheiden van buffy coat Week 1, di / woe:
DNA isolatie
Week 1, do / vrij
Library prep
Week 2, ma /di
ePCR en starten NGS machine (5500xl)
t/m week 3, woe
Runnen NGS machine
Week 3, do / vrij
Data analyse en interpretatie
Uiterlijk week 4, ma
uitslag
Tip van Flip! 10 ml EDTA buis, vol, let op positie sticker!!
X X XX
Flow Nijmegen Week 1, ma / di:
Binnenkomst materiaal
Afdraaien plasma scheiden van buffy coat Week 1, di / woe:
DNA isolatie
Week 1, do / vrij
Library prep
Week 2, ma /di
ePCR en starten NGS machine (5500xl)
t/m week 3, woe
Runnen NGS machine
Week 3, do / vrij
Data analyse en interpretatie
Uiterlijk week 4, ma
uitslag
3 wkn
Foetale fractie Literatuur: 4% Zeer lage concentraties DNA “homeopathische bepaling”? Betrouwbaarheid?? Op welk moment in het proces meten?? Test?? •Methylatie? •SRY? •Sequentie data (SNP?)
>22.000 zwangerschappen eenling minimaal 10 wkn zw schapsduur
“The vast majority of clinical maternal plasma samples greater than 10 weeks gestational age contain an adequate fetal cfDNA proportion to allow for useful clinical results.”
Prenatal Diagnosis 2013, 33, 569–574
Totaal: 6123 Gemiddelde TAT: 5.1 werkdagen Geen uitslag voor 1 chromosoom: 2.8% Onduidelijk discordant (FPR): 0.2% Fout negatief: 0.08%
Gecanceled: 149 Technische redenen: 43 (0.7%) Administratieve redenen: 106 (1.7%)
Discrepante bevindingen
Mogelijke oorzaken voor discrepanties: Technisch (waaronder lage foetale fractie) Confined Placental Mosaicism Maternale deletie of duplicatie Maternaal of foetaal mozaiek Vanishing twin Maternale maligniteit Maternale geslachtschromosomale afwijking
Discrepante bevindingen Technisch NIPT 16.4 wkn verhoogd risico op T13 (84%) 18 wkn: Geen echo-afwijkingen Invasieve procedure Vruchtwater normaal in 50 metafasen Herhaalde NIPT in eigen lab (bloed afgenomen bij 18 wkn) Geen aanwijzing voor T13
Kindje is geboren: placenta laat geen tekenen van T13 zien
Discrepante bevindingen Placenta mozaicisme Choi et al., Prenat Diagn 2013,33,198-200 NIPT (NIFTY) trisomy 22 (duplicate measurement at two gestational ages) Normal fetus and child Lau et al., Prenat Diagn 2013, 33, 1–7 placental trisomy 22 +7, +21 disomy 22 in umbilical cord blood 49,XXX, Trisomy 16 Pan et al., Prenat Diagn 2013 Jun;33(6):598-601 Mennuti et al., AJOG 2013 47,XX,+21 and UPD21 in fetus Case 7: NIPT trisomy 13 CVS sampling FISH T13 termination of pregnancy culture 46,XY SNP array normal male profile
Case 8: NIPT trisomy 13 CVS sampling direct preparation 46,XX,+13,der(13;13)(q10;q10) long term culture 46,XX Amniocentesis 46,XX No US anomalies (child not yet born)
Discrepante bevindingen Maternale maligniteit Osborne et al., Prenat Diagn 2013,33(6),609–611 NIPT (duplo metingen) trisomie 13 (NCV 10.9) monosomie 18? (NCV -10.7) vruchtwater 46,XY en normaal array profiel Postnatale analyse van placenta biopten normaal Maternale tumor met cytogenetisch numerieke afwijkingen van zowel #13 als #18
Discrepante bevindingen Maternale geslachtschromosomale afwijkingen Yao et al., Pren Diagn 2012,32(11),1114–1116 Maternale 47,XXX Lau et al., Prenat Diagn 2013, 33,1–7 Maternale 45,X /46,XX
Searle et al., Prenat Diagn 2013,33(6),612–613 Maternale deletie op X en maternale SRY
Concluderend…. Alle academische centra Whole genome approach Verschillende platforms en analyse methoden in Nederland Geen bepaling foetale fractie Uitslagtermijn Nijmegen 3 wkn (mits op maandag of dinsdag aangeleverd) Rapportage over chromosomen 13, 18 en 21, evt “toevalsbevindingen” op andere chromosomen zullen gemeld worden Geen rapportage over geslacht of geslachtschromosomale afwijkingen Uitslag: SMS indien normaal en indien afwijkend: via gynaecoloog
> BMI is geen exclusie criterium, wel onderdeel van de studie, dus BMI gegevens zijn noodzakelijk Bevestiging: vruchtwater
