STUDIUM ÚČINKŮ VETERINÁRNÍCH FARMAK VE VODNÍM PROSTŘEDÍ

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA CENTRUM PRO VÝZKUM TOXICKÝCH LÁTEK V PROSTŘEDÍ

STUDIUM ÚČINKŮ VETERINÁRNÍCH FARMAK VE VODNÍM PROSTŘEDÍ

Diplomová práce

Edita Kolářová Vedoucí práce: Mgr. Radka Zounková, Ph. D.

Brno 2014

Bibliografický záznam Autor:

Bc. Edita Kolářová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí

Název práce:

Studium účinků veterinárních farmak ve vodním prostředí

Studijní program:

Experimentální biologie

Studijní obor:

Speciální biologie – Ekotoxikologie

Vedoucí práce:

Mgr. Radka Zounková, Ph.D.

Akademický rok:

2013/2014

Počet stran:

67

Klíčová slova:

veterinární farmaka; praziquantel; mebendazol; ivermektin; doramektin; enrofloxacin; Daphnia magna; Pseudomonas putida; vodní ekosystém; životní prostředí

Bibliographic Entry Author

Bc. Edita Kolářová Faculty of Science, Masaryk University Department of Research Centre for Toxic Compounds in the Environment

Title of Thesis:

Research of effects of veterinary pharmaceuticals in aquatic environment

Degree programme:

Experimental Biology

Field of Study:

Special Biology – Ecotoxicology

Supervisor:

Mgr. Radka Zounková, Ph.D.

Academic Year:

2013/2014

Number of Pages:

67

Keywords:

Veterinary pharmaceutials; Praziquantel; Mebendazole; Ivermectin; Doramectin; Enrofloxacin; Daphnia magna; Pseudomonas putida; aquatic ecosystem; environment

Abstrakt Tato diplomová práce je zaměřena na studium účinků antiparazitárních látek v životním prostředí. Cílem práce bylo využití ekotoxikologických testů ke zhodnocení nebezpečnosti a účinku vybraných antiparazitik ve vodním prostředí. Práce je zaměřena na využití testů s hrotnatkou velkou a bakterií Pseudomonas putida. V práci bylo použito akutních a chronických testů s hrotnatkou velkou a test inhibice růstu s pseudomonádou. Výsledky z těchto testů byly statisticky zpracovány pomocí softwaru GraphPad Prism a prezentovány v experimentální části práce. Provedeným testováním bylo zjištěno, že všechna testovaná léčiva vykazovala na hrotnatku toxický účinek. Největší účinek měl doramektin v akutním testu, kde byla zjištěna EC50 = 67 ng/l. V chronickém testu byl jako nejvíce toxický zjištěn ivermektin (EC50 = 27 ng/l). Pro pseudomonádu se podařilo zjistit EC50 = 0,31 mg/l pro enrofloxacin a pro praziquantel LOEC ˃ 1000 mg/l. Na základě zjištěných údajů bylo možné porovnat experimentální hodnoty s daty dostupnými v literatuře a prokázat tak negativní účinek veterinárních farmak ve vodním prostředí.

Abstract The thesis is focused on the study of the effects of antiparasitic pharmaceuticals in the environment. The aim of this thesis was the use of ecotoxicological bioassays to assess the risk and impact of selected antiparasitic drugs in the aquatic environment. As testing organisms, Daphnia magna and Pseudomonas putida were chosen. As tools for this assessment, Daphnia acute and chronic tests and Pseudomonas putida growth inhibition test were used. Results of these tests were statistically analysed using GraphPad Prism software and presented in the experimental part of this thesis. As it is discussed below, all the tested pharmaceuticals showed toxic effect on Daphnia magna. The the greatest effect had Doramectin, which showed EC50 = 67 ng/l in the acute assay. Ivermectin with EC50 = 27 ng/l was the most toxic compound in the chronic assay. When it comes to Pseudomonas putida, Enrofloxacin showed EC50 = 0.31 mg/l and for praziquantel LOEC ˃ 1000 mg/l. Based on this data, it was possible to compare obtained results with the data available in the literature and demonstrate the negative effects of veterinary pharmaceuticals in the aquatic environment.

Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat Mgr. Radce Zounkové, Ph.D. za její vedení při vypracování této diplomové práce. Především za její trpělivost a shovívavost. Mgr. Marii Michelové za její cenné rady a trpělivost. Rodině za podporu v době studia a středisku Teiresiás, pod jehož záštitou jsem mohla i přes sluchový handicap studovat.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 15.5. 2014

……………………………… Jméno Příjmení

OBSAH 1

ÚVOD ............................................................................................................................. - 12 -

2

TEORETICKÁ ČÁST .......................................................................................................... - 13 2.1

Základní pojmy ..................................................................................................... - 13 -

2.2

Léčiva v životním prostředí .................................................................................. - 14 -

2.3

2.4

2.5

3

4

2.2.1

Vstup a výskyt léčiv v životním prostředí .............................................. - 14 -

2.2.2

Osud léčiv v životním prostředí ............................................................. - 17 -

2.2.3

Analytické metody ................................................................................. - 17 -

2.2.4

Efekty léčiv v životním prostředí ........................................................... - 18 -

2.2.5

Riziko vyplývající z přítomnosti farmak v životním prostředí ................ - 20 -

Veterinární léčiva jako specifická skupina látek .................................................. - 22 2.3.1

Veterinární antiparazitika ...................................................................... - 23 -

2.3.2

Antibakteriální látky v životním prostředí ............................................. - 25 -

2.3.3

Anthelmintika v životním prostředí ....................................................... - 26 -

Vybrané látky ....................................................................................................... - 26 2.4.1

Praziquantel ........................................................................................... - 26 -

2.4.2

Mebendazol ........................................................................................... - 28 -

2.4.3

Ivermektin.............................................................................................. - 29 -

2.4.4

Doramektin ............................................................................................ - 30 -

2.4.5

Enrofloxacin ........................................................................................... - 31 -

Modelové organismy ........................................................................................... - 32 2.5.1

Hrotnatka velká ..................................................................................... - 32 -

2.5.2

Pseudomonas putida ............................................................................. - 36 -

MATERIÁL A METODY .................................................................................................... - 39 3.1

Testované látky .................................................................................................... - 39 -

3.2

Použité chemikálie ............................................................................................... - 40 -

3.3

Metody................................................................................................................. - 41 3.3.1

Stanovení inhibice pohyblivosti Daphnia magna Straus ....................... - 41 -

3.3.2

Stanovení chronické toxicity látek pro Daphnia magna Straus ............ - 43 -

3.3.3

Zkouška inhibice růstu na Pseudomonas putida ................................... - 44 -

VÝSLEDKY ....................................................................................................................... - 47 -7-

4.1

Stanovení inhibice pohyblivosti Daphnia magna Straus ..................................... - 47 -

4.2

Stanovení chronické toxicity látek pro Daphnia magna Straus .......................... - 50 -

4.3

Zkouška inhibice růstu na Pseudomonas putida ................................................. - 56 -

5

DISKUZE ......................................................................................................................... - 58 -

6

ZÁVĚR............................................................................................................................. - 61 -

7

SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ ........................................................................................ - 62 7.1

Publikace .............................................................................................................. - 62 -

7.2

Digitální zdroje ..................................................................................................... - 66 -

-8-

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ACR

Acute to Chronic Ratio – poměr akutních a chronických efektivních koncentrací

ADaM

Aachener Daphnien Medium – médium pro chov a testy s D. magna

ANOVA

analýza rozptylu

ASTM

American Society for Testing and Materials – Americká společnost pro testování a materiály

ATCvet

Anatomicko–terapeuticko–chemický klasifikační systém pro veterinární léčivé přípravky

BCF

biokoncentrační faktor

CEN

European Committee for Standardization – Evropský výbor pro normalizaci

ČOV

čistírna odpadních vod

ČSN

česká technická norma

DDT

dichlorodifenyltrichloroethan

DMSO

dimethylsulfoxid

DOR

doramektin

EC50

koncentrace způsobující padesátiprocentní efekt

ECOTOX

ECOTOXicology database – Ekotoxikologická databáze

EFX

enroflaxacin

ELISA

enzymová imunoanalýza

EN

evropská norma

ES

Evropské společenství

FDA

Food and Drug Administration – Úřad pro kontrolu potravin a léčiv

GIT

gastrointestinální trakt

-9-

HPLC–MS/MS

spojení

vysokoúčinné

kapalinové

chromatografie

s hmotnostní

spektrometrií HPLC–UV–DAD

vysokoúčinná kapalinová chromatografie s UV diodovým polem

HSDB

Hazardous Substances Data Bank – databanka nebezpečných látek

i.m.

intramuskulární – injekční podání léku do svalu

i.p.

intraperitonealní – injekční podání léku do břišní dutiny

i.v.

intravenózní – nitrožilní injekční podání léku

ISO

International

Organization

for

Standardization

–

Mezinárodní

organizace pro normalizaci IVM

ivermektin

KOC

rozdělovací koeficient organický uhlík v půdě–voda

KOW

rozdělovací koeficient oktanol–voda

LC50

koncentrace způsobující smrt u padesáti procent jedinců

LC–MS

kapalinová chromatografie–hmotnostní spektrometrie

LD50

dávka způsobující smrt u padesáti procent jedinců

LOEC

nejnižší koncentrace testovaného vzorku vykazující sledovaný účinek

MBZ

mebendazol

MDR

multi-drug resistance –mnohačetná lékové rezistence

MRI

magnetická resonance

NA

Not Available – nedostupný

NOEC

nejvyšší koncentrace testovaného vzorku, nevyvolávající žádné pozorovatelné účinky

OECD

Organisation for Economic Co-operation and Development – Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj

p.o.

perorálně – podání léku dutinou ústní

- 10 -

PEC

predicted environmental concentration - předpokládaná koncentrace v životním prostředí

PNEC

predicted non-effect concentration - předpokládaná koncentrace bez účinku

PPCP

Pharmaceuticals and Personal Care Products – farmaka a produkty osobní spotřeby

PZQ

praziquantel

RK

rozpouštědlová kontrola

RQ

rizikový kvocient

s.c.

subkutánní - podání léku injekčně do podkoží

UF

faktor nejistoty

US EPA

U.S. Environmental Protection Agency – Agentura pro ochranu životního prostředí

VSDB

Veterinary Substances DataBase – databáze veterinárních látek

WHO

World Health Organization – světová zdravotnická organizace

- 11 -

1

ÚVOD Téma diplomové práce Studium účinků veterinárních farmak ve vodním prostředí je

v současné době velmi aktuální. Na čistotu a nezávadnost vodních zdrojů je v současnosti kladen stále větší důraz, zejména proto, že čistírny odpadních vod (ČOV) nejsou schopny úplně eliminovat zbytky léčiv ve vodě a léčiva nebo jejich metabolity se tak mohou dostat do životního prostředí a působit na necílové organismy. V dostupné literatuře nebyla nalezena data prokazující vliv léčiv ve vodě na zdraví lidí, nicméně některé studie (Richardson a Ternes, 2011; Halling–Sorensen et al., 1998; WHO, 2012; Zenker et al., 2014) naznačují, že by se riziko vyplývající z přítomnosti léčiv ve vodním prostředí

nemělo

podceňovat.

Důkazem

jsou

dostupné

ekotoxikologické

údaje

(Ferreira et al., 2007; Park a Choi, 2008; Wollenberger et al., 2000; Isidori et al., 2005) o vlivu léčiv (humánních i veterinárních) pro necílové organismy. Cílem této diplomové práce bylo využití akvatických ekotoxikologických biotestů ke zhodnocení nebezpečnosti a účinku vybraných veterinárních léčiv v životním prostředí. V rámci této práce byly použity testy na Daphnia magna (zástupce konzumentů) a Pseudomonas putida (zástupce destruentů) jako zástupce jednotlivých trofických úrovní ekosystému. Výsledky studie byly srovnány mezi sebou a byla srovnána citlivost jednotlivých organismů k daným léčivům a toxicita jednotlivých léčiv.

- 12 -

2 2.1

TEORETICKÁ ČÁST Základní pojmy K pochopení a správnému vyhodnocení ekotoxikologických testů je důležité znát základní

ekotoxikologické pojmy: 

Toxická látka: je každá látka s nepříznivým toxickým účinkem na organismus, který se může projevit již při malých dávkách, které mohou vyvolávat těžké poruchy, dočasné i trvalé účinky, popřípadě i smrt.



Xenobiotikum: je každá cizorodá látka. To znamená, že se jedná o látku, která není organismu přirozeně vlastní, není jeho produktem metabolismu ani jeho meziproduktem (léčiva či průmyslové chemikálie)



Toxicita: je definována jako schopnost látky vyvolávat poškození organismu



Riziko: je pravděpodobnost výskytu negativního účinku látky (Bardoděj, 1999).



Expozice: jedná se o vystavení účinkům dané chemické látky, při kterém dochází k průniku chemické látky do organismu. Místu, kde dochází k průniku chemikálie do organismu, se říká brána vstupu.



Doba expozice: je definována jako doba, po kterou je organismus vystaven účinku škodlivé látky (nebo směsí látek). Dobu expozice můžeme z časového hlediska rozdělit na: o Akutní expozice: nejsou tak časté, ale během velmi krátké doby proniká do organismu velké množství látky. Účinek se projeví buď okamžitě, nebo ve velmi krátkém časovém intervalu. Následky akutní expozice mohou být vážné, až smrtelné, ale jejich účinek může být i vratný. o Chronická doba expozice: jedná se o dlouhodobé, opakované působení nižších dávek chemické látky po dobu, která je delší než 10 % rozpětí života organismu. Účinky látky bývají tedy patrné až po delší době a velmi často jsou již nevratné.



Toxický účinek: jakákoliv biologická odpověď organismu na nepříznivé působení chemické látky. Může být vratný (přechodné poškození) nebo nevratný (dlouhodobé poškození). Toxický účinek se může rozdělit i podle toho, kde a jak chemická látka působí: o Orgánový toxický účinek: kdy toxická látka působí na některé orgány daleko výrazněji než na jiné (např. neurotoxicita, hepatotoxicita, hematotoxicita, nefrotoxicita, pulmotoxicita, atd.) - 13 -

o Funkční účinek: kdy toxická látka působí na celý systém (imunotoxicita, reprodukční toxicita, karcinogenita, mutagenita, alergizace, teratogenita, atd.) 

Křivka dávka–odpověď: jedná se o základní grafické zobrazení v toxikologii. Ukazuje biologickou odpověď po působení stresoru, přičemž se zvyšující se dávkou roste toxický účinek látky. Vztah mezi dávkou a účinkem není lineární a po zlogaritmování dostaneme křivku ve tvaru sigmoidy. Z ní pak odvozujeme toxikologické parametry (např. EC10, EC50, aj.) nebo doplňkové hodnoty stanovené pomocí metody analýzy rozptylu (ANOVA): o NOEC: je nejvyšší dávka, která nezpůsobila žádný pozorovatelný účinek v organismu. o LOEC: je nejnižší dávka, která už způsobila pozorovatelný negativní účinek v organismu.

2.2

Léčiva v životním prostředí V současné době se zvýšila pozornost veřejnosti k přítomnosti nadměrného množství

chemikálií zjištěných v prostředí. Mnoho z nich je škodlivých pro člověka a ekosystémy a výroba a používání velkého množství těchto látek jsou neregulované nebo nedostatečně regulované (Li, 2014). Jedním z důvodů těchto obav jsou organické kontaminanty (EOC‘s). Tento termín zahrnuje nejen nově objevené sloučeniny, ale i látky běžně používané. Mezi organické kontaminanty patří také rezidua farmaceuticky aktivních sloučenin, která dosud nebyla považována za problém, např. farmaka, prostředky pro osobní péči (PPCP), pesticidy, veterinární přípravky, atd. (Richardson a Ternes, 2011). Léčiva jsou biologicky aktivní látky většinou dobře rozpustné ve vodě a tudíž mobilní v životním prostředí. Bylo zjištěno, že tyto látky mohou mít negativní účinky na necílové organismy. Všechny tyto vlastnosti činí léky zajímavými z hlediska ekotoxikologie (Kümmerer, 2008). 2.2.1 Vstup a výskyt léčiv v životním prostředí Na pozadí stále vzrůstajícího počtu lidské populace se zároveň zvyšuje také poptávka po omezených zásobách pitné vody. To má za následek vzrůstající požadavky na ochranu integrity vodních zdrojů (Kemper, 2008). V posledních letech byl výskyt a osud léčiv ve vodním prostředí předmětem mnoha studií, prováděných v několika zemích. Například

- 14 -

více než 30 antibiotických látek bylo nalezeno ve vzorcích na vstupu a výstupu ČOV, v povrchových vodách, a dokonce i podzemní a pitné vodě (Halling–Sorensen et al., 1998).

Obrázek 1 – Předpokládané cesty expozice životního prostředí pro různé typy léčiv. Obrázek převzat a upraven z: Halling–Sørensen et al., 1998 - 15 -

Léčiva mohou být velmi zjednodušeně rozdělena na léčiva užívána lidmi (humánní) a léčiva používána ve veterinárním lékařství. Veterinární léčivé přípravky pak můžeme dále rozdělit podle použití na léčiva určená k terapii a růstové stimulátory určené pro živočišnou produkci. V Evropské unii je používání růstových stimulátorů na bázi antibiotik, dle nařízení z 1. ledna 2006 podle Evropského společenství (ES) č. 183/2003, článku 11, odstavce 2, s konečnou platností zakázáno. Americká Správa potravin a léčiv (Food and Drug Administration, FDA) však došla k závěru, že podávání růstových stimulátorů (subletální dávkování) zvířatům určeným pro potravinovou produkci s sebou nenese žádné riziko (Marek, 2012). Dále se ve veterinárním lékařství užívají kokcidiostatika, která se používají při produkci drůbeže, terapeutika pro léčbu zvířat na polích a doplňkové látky při chovu ryb. Předpokládá se, že léčiva v životním prostředí jsou snadno biodegradovatelná (Holoubek, 2001), protože se tomu tak děje, v jisté míře, i v lidském těle. Léčiva v lidském těle mohou, ale i nemusí být metabolizována. Při užívání humánních léčiv jsou tyto látky nebo jejich metabolity vylučovány do odpadních vod a následně se dostávají do ČOV. V ČOV jsou však léčiva jen částečně eliminována, a pokud nejsou odstraněna během procesu čištění, mohou skončit v životním prostředí. Léčiva, která jsou používána pro stájová zvířata, většinou skončí ve hnoji a následně na polích. Tyto látky tedy mohou mít vliv na půdní organismy. Lze také očekávat odtok těchto látek z polí (hlavně hydrofilní látky a jejich metabolity) během deště a následně účinek ve vodním prostředí. Ke kontaminaci životního prostředí dochází také při zpracování drůbeže, zpracování masa a také od domácích zvířat (odpadní voda z akvárií, aj.). To může přispět ke zvýšení celkové koncentrace léčiv v odpadních a povrchových vodách (Kümmerer, 2009). Měření v povrchových vodách ukázalo, že se v životním prostředí vyskytuje široká škála farmak zahrnující hormony, antibiotika, cytostatika a mnoho dalších cytotoxických sloučenin, antiepileptika a látky upravující krevní tlak (Ayscough, 2000). Mezi další látky detekované v řekách patří např. beta–blokátory a beta–sympatomimetika, analgetické a protizánětlivé léky, estrogeny, stejně jako hypolipidemika, antiepileptika a další (Cleuvers, 2003). Úpravou vody na pitnou vodu se sice snižují koncentrace léčiv ve vodě, ale ČOV není schopna tyto látky zcela odstranit. Proto dokonce i ve vodě z kohoutku mohou být některé výše uvedené látky detekovány (Kümmerer, 2009).

- 16 -

2.2.2 Osud léčiv v životním prostředí Transportní procesy léčiv v životním prostředí nejsou v dostupné literatuře dobře popsány. Transport veterinárních léčiv bývá odvozován z transportního mechanismu pesticidů. Z jejich výzkumu je známo, že po zemědělském ošetření se může pesticid pohybovat pod zemí v nesaturované (zóna nad hladinou podzemní vody) i saturované zóně (zóna pod hladinou podzemní vody, kde jsou veškeré póry a pukliny vyplněny vodou) a v závislosti na hydrofilitě skončí jako mateřská sloučenina nebo její metabolity ve vodním prostředí (Halling–Sorensen et al., 1998). Látky se mohou také sorbovat na povrch částic, což vede ke snižování biodostupnosti a extrahovatelnosti (Reid et al., 2000). Xenobiotické látky mohou podléhat v životním prostředí třem různým osudům: 1. Látka je nakonec mineralizovaná na oxid uhličitý a vodu, např. procesem biodegradace (De, 2004) nebo procesem abiotické transformace, např. hydrolýza nebo fotodegradace. Účinnost fotodegradace závisí na vlastnostech látky a síle slunečního záření (Fent et al., 2006). 2. Pokud je látka lipofilní a není snadno rozložitelná, část látky bude zachována v kalu (látky vstupující do prostředí přes ČOV – např. humánní farmaka) nebo v půdě (látky vstupující do půdy – např. po aplikaci kalu jako hnojiva nebo veterinární farmaka v hnoji hospodářských zvířat) (Halling–Sorensen et al., 1998). 3. Látka nebo její hydrofilnější metabolity jsou stabilní, prochází nezměněny ČOV a skončí v povrchových vodách (recipientu). Tam mohou mít vliv na vodní organismy (Halling–Sorensen et al., 1998). Předpokládá se, že veterinární antibiotika o ostatní léčiva mohou mít stejný osud, pokud je hnůj rozložen na polích a následnými srážkami jsou pak zbytky farmak vymývány z půdní vrstvy do povrchových vod (Halling–Sorensen et al., 1998). 2.2.3 Analytické metody Od roku 1998 se začaly vyvíjet multi–analytické metody, které přispívají k realizaci studií o výskytu, transportu a degradačních procesech léčiv do a v životním prostředí. Byly navrženy analytické metody pro detekci různých léčiv, zejména v odpadních vodách a ve vodním prostředí (Hirsch et al., 1999; Golet et al., 2001).

- 17 -

V současnosti je nejvíce používanou metodou vysokoúčinná kapalinová chromatografie v kombinaci s UV detektorem s diodovým polem (HPLC–UV–DAD), kapalinová chromatografie v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (LC–MS) nebo tandemová hmotnostní spektrometrie (LC–MS/MS). Tyto analytické metody jsou zároveň nejcitlivějšími metodami (Oka et al., 2000). Další používanou analytickou metodou je enzymo–imuno analýza (ELISA), původně vyvinuta pro detekci sulfadimidinu v mléce, v plazmě, v moči a tkáních. Následně byla optimalizována pro analýzu vzorků v životním prostředí (Kemper, 2008). Limity detekce a kvantifikace různých antibiotik analyzovaných vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií v kombinaci s tandemovou hmotnostní spektrometrií (HPLC–MS/MS) se pro jednotlivé látky pohybují v jednotkách ng/l (β–laktamy, makrolidy, sulfonamidy, fluorochinolony, aj.) až v desítkách ng/l (vankomycin, tetracykliny, aj.) (Kemper, 2008). Pokročilé analytické metody jsou velmi citlivé pro měření těchto látek i při velmi nízkých koncentracích. Koncentrace v povrchových vodách, podzemních vodách a v částečně vyčištěné vodě jsou obvykle nižší než 100 ng/l, zatímco koncentrace v upravené vodě byly obecně nižší než 50 ng/l. Například v čínské studii zaměřené na léčiva v kohoutkové vodě bylo uvedeno, že v 89 % vzorků (celkem 113 vzorků z velkých měst) bylo zjištěno celkem 17 různých druhů léčiv, z toho 6 veterinárních léčiv (dimetridazol, metronidazol, thiamfenikol, sulfamethazin, sulfathiazol a tylosin), v rozmezí koncentrací 1,8 – 17,8 ng/l (Leung et al., 2013). V další studii monitorující množství rozpuštěných léčiv v lucemburských řekách v období povodní byly naměřeny hodnoty od 6 ng/l (ethinylestradiol) až po 2383 ng/l (Ibuprofen) (Meyer et al., 2011). 2.2.4 Efekty léčiv v životním prostředí Dostupná literatura neposkytuje žádné důkazy o tom, že by léčiva ve vodním prostředí představovala při expozici prostřednictvím pitné vody výraznou hrozbu pro lidské zdraví (WHO, 2012). Avšak léčiva se mohou hromadit a způsobit nevratné změny v organismu volně žijících živočichů a člověka, což je riziko, které by mělo být také zahrnuté do posouzení rizika pro lidské zdraví (Zenker et al., 2014). Některé léčivé látky (např. syntetické pohlavní hormony a antibiotika) mohou vyvolat nepříznivé účinky na vodní organismy (Kristiansson et al., 2011). Většina antibiotik je - 18 -

rozpustných ve vodě, z jedné dávky léčiva tak může být až 90 % vylučováno močí a až 75 % v trusu zvířat (Halling–Sorensen et al., 1998). Některá antibiotika mají mechanismus účinku na DNA/RNA úrovni, to může mít za následek vývoj rezistentních bakteriálních populací nebo přímé toxicity na mikroflóru a mikrofaunu (Kolodziejska et al., 2013). Účinky antibiotik na organismy žijící ve vodním prostředí, jako jsou řasy a perloočka (Cladocera), byly hlášeny v koncentracích mezi 5 – 100 mg/l (Kemper, 2008; Wollenberger et al., 2000). Dalším konkrétním příkladem může být ivermektin, který má významné dopady na přežití, reprodukci a růst hrotnatky velké ve velmi nízké nominální koncentraci (0,001 ng/l) (Brinke et al., 2010), zatímco řasy (P. subcapitata) jsou mnohem méně citlivé (nominální koncentrace 1250 µg/l a výše) (Garric et al., 2007). Podobně, při testování jiného antiparazitika abamektinu bylo zjištěno, že hrotnatka velká (Daphnia magna) byla mnohem citlivější než dánio pruhované (Danio rerio) nebo vodní řasy (Scenedesmus subspicatus). Zatímco 48hLC50 pro hrotnatku byla 0,25 µg/l, 96hLC50 pro dánio byla 55,1 µg/l a 7hEC50 pro inhibici růstu řas byla 4,4 mg/l (Tisler a Erzen, 2006). V následující tabulce je uveden přehled dalších léčiv nalezených ve vodním ekosystému (data nalezena v dostupné literatuře).

- 19 -

Tabulka 1 - Údaje o toxicitě některých veterinárních léčiv Látka

Typ testu

Doba expozice

Florfenikol

ArToxKit test protokol

24 hodin

Oxytetracyklin

Norfloxacin

US EPA–821–R– 02–012 (2002) OECD, D. Magna Reproduction Test (1996)

24/48 hodin

(1) (2) (3) (4)

Artemia parthenogenetica (Crustacean) Moina macrocopa (Crustacean) Daphnia magna (Crustacean)

21 dní

ISO/6341 (1996)

24 hodin

USEPA, EPA– 600–4–90–027F (1993)

48 hodin

NA

48 hodin

OECD 211

21 dní

OECD 203/204

14 dní

NA

21 dní

Trimethoprim

Enrofloxacin

Druh

Ferreira et al., 2007 Park a Choi, 2008 Wollenberger et al., 2000 Isidori et al., 2005

Efekt

Toxicita [mg/l]

Ref.

Imobilizace

EC50 > 889

(1)

Imobilizace

EC50 = 137,1

(2)

Reprodukce

EC50 = 46,2

(3)

EC50 = 22,64

(4)

EC50 = 18,65

(4)

EC50 = 187,4

(5)

EC50 = 8,21

(6)

EC50 = 92,66

(6)

EC50 = 11,47

(2)

Daphnia magna Imobilizace Straus (Crustacean) Ceriodaphnia dubia (Crustacean Imobilizace cladocera) Daphnia magna Letalita Straus (Crustacean) Daphnia magna Reprodukce Straus (Crustacean) Poecilia reticulata Prodloužená (Fish) toxicita Daphnia magna Reprodukce Straus (Crustacean) (5) Lu et al., 2013 (6) De Liguoro et al., 2012 NA – Not Available

2.2.5 Riziko vyplývající z přítomnosti farmak v životním prostředí Podle současných znalostí by měla být většina léčiv posuzována z hlediska účinků na lidské zdraví a životní prostředí stejně důkladně jako pesticidy. Některé skupiny léčiv vyžadují zvláštní pozornost: 

antibiotika a dezinfekční prostředky, kvůli jejich výrazné bakteriální toxicitě a jejich potenci ke vzniku rezistencí (Davies a Davies, 2010). Kromě toho mohou antibiotika představovat

nebezpečí

pro

lidské

zdraví,

jako

alergie

vyvolávající

látky

(Mellon et al. 2001) 

hormony, z důvodu jejich vysoké účinnosti (Svensson et al., 2014; Manickum a John, 2014)



chlorfenoly a chlór uvolňující činidla a jiné podobné látky, které jsou používány jako dezinfekční či bělící prostředky atd. (Lehmler et al., 2013; Holopainen et al., 2013; Igbinosa et al., 2013)

- 20 -



těžké kovy pro jejich toxicitu a schopnost kumulovat se v organismech (Stankovic et al., 2014; Croes et al., 2014)



cytostatické látky, látky obsahující platinu (Johnson et al., 2013) nebo kontrastní látky využívající se při magnetické rezonanci (MRI), obsahující gadolinium. Tyto látky nejsou rozložitelné a jsou vysoce toxické v některých oxidačních stavech.

Jiné skupiny léků, například analgetika a sedativa jsou rovněž předmětem zájmu. Stále však ani dnes nevíme vše o osudu a účinku léčivých látek, jsou–li vystaveny procesům v životním prostředí. Nalezené koncentrace návykových látek a léků v povrchových vodách jsou obecně nízké, ale jejich případné toxikologické účinky se v důsledku jejich přítomnosti ve vodním prostředí, mohou projevit na zvířatech, rostlinách i lidech. Obavy vyvolávají také možné kombinace účinků různých látek. Vzhledem k malému množství ekotoxikologických informací o

některých

těchto

látkách,

není

vědecké

posouzení

rizika

ještě

možné

(van der Aa et al., 2013). Koncentrační limity farmak v prostředí nejsou upraveny zákony. Hodnocení rizik se tedy provádí výpočtem předpokládaných koncentrací (PEC) a srovnáním s očekávanými biologicky neefektivními koncentracemi (PNEC) (Kümmerer, 2001). Posouzení zdravotního rizika pro vodní prostředí se provádí v souladu s pokyny pro posuzování rizik léčivých přípravků v životním prostředí. Hodnocení zdravotních rizik se provádí jako výpočet rizikového kvocientu (RQ) :

RQ 

EC PNEC

Kde: EC je efektivní koncentrace PNEC je nejvyšší předpokládaná koncentrace látky bez škodlivých účinků PNEC se vypočítá:

PNEC 

L EC 50 NOEC nebo UF UF

Kde: L/EC50 je nejnižší krátkodobá koncentrace způsobující 50 % letalitu (efekt) NOEC je nejvyšší koncentrace vzorku, u které ještě nedošlo k efektu UF je faktor nejistoty - 21 -

Jelikož koncentrace léčiv ve vodě bývají nízké, mají v ekotoxikologii dlouhodobé údaje přednost před krátkodobými daty. Vzhledem však k nedostatku dlouhodobých toxikologických studií, je rozšířený přístup pro výpočet hodnoty PNEC použití údajů (EC50 nebo LC50) ze studií krátkodobých (Vazquez–Roig et al., 2012). Hodnoty L(E)C50 a NOEC jsou dostupné v literatuře nebo volně v internetových databázích. Faktor nejistoty zahrnuje nejistotu dat získaných laboratorními testy na toxicitu. Je–li poměr EC/PNEC vyšší než jedna, poukazuje toto na riziko pro životní prostředí. K pokrytí celého potravního řetězce ve vodě je RQ vypočten ve třech různých trofických úrovní ekosystému (řasy, dafnie a ryby). 2.3

Veterinární léčiva jako specifická skupina látek Veterinární léčiva jsou ve velké míře používána v živočišné výrobě, tj. pro veterinární

použití, nebo byla používána jako růstové stimulátory. Stejně tak mají široké využití v akvakultuře. Dle dostupných údajů bylo v Evropě ročně spotřebováno asi 10 000 tun antibiotik, přičemž 5000 tun léčiv bylo použito pro veterinární účely (pro profylaktické použití a léčbu cca 3500 tun a jako regulátory růstu cca 1500 tun). Zbylých 5000 tun bylo použito v humánním lékařství (Halling–Sorensen et al., 1998).

Obrázek 2 – Veterinární antibiotika v prostředí. Obrázek převzat a upraven z: Kemper, 2008

- 22 -

2.3.1 Veterinární antiparazitika Veterinární antiparazitika jsou hojně užívanou skupinou veterinárních léčiv. Opatření proti vnitřním parazitům u zvířat lze rozdělit na terapii při onemocnění (způsobena vnitřními parazity) a na opatření preventivní. V obou případech tak sice dochází k aplikaci antiparazitik, ale jejich využití se liší. Terapie je založena na znalosti biologie parazitů, jejich patogenitě a klinických příznacích. Naopak prevence vychází především ze znalostí nauky o infekčních nemocech zvířat (epizootologie) způsobených vnitřními parazity. Základním cílem preventivních opatření je snížení možnosti výskytu parazitárních infekcí. Prvním a nejdůležitějším krokem při terapii i profylaxi je výběr antiparazitika. Výběr musí vycházet ze znalosti výskytu jednotlivých skupin parazitů, navíc dlouhodobé podávání jen jednoho typu antiparazitika po celou dobu, vede obvykle ke zvýšenému výskytu parazitů jiné skupiny. Obecně platí, že je lepší antiparazitikem mírně předávkovat, než podat nedostatečnou dávku, která umožní přežití některých jedinců s možností vzniku rezistentní populace. Tato léčiva mohou být rozdělena do několika skupin a to podle jejich účinku. Obecně dělíme skupinu antiparazitik na: 

antiprotozoární přípravky – přípravky účinné proti prvokům;



anthelmintika – přípravky účinné proti cizopasným červům. Mohou být dále dělena na léky používané proti tasemnicím (anticestodika), motolicím (antitrematodika) a hlísticím (antinematodika);



antiektoparazitika – přípravky účinné proti zevním parazitům, včetně látek proti svrabu a repelenty.

Antiparazitární léky se nejčastěji používají buď ve formě perorální (p.o.), nebo nitrožilní (i.v). V případě antiektoparazitik také ve formě šamponu (vši, blechy, aj.). V novější literatuře se nyní můžeme setkat také s pojmem endoektoparazitika. Jedná se o skupinu nových preparátů, které jsou využitelné díky svému účinku jak na endoparazity, tak i na ektoparazity. Patří sem především skupina avermektinů (např. ivermektin, doramektin, aversektin C aj.). Některé nové komerční preparáty představují navíc kombinaci endoektoparazitik s dalšími antiparazitiky (Lefnerová a Šimůnek, 2000).

- 23 -

Anthelmintika Nejvýznamnější skupinou antiparazitárních látek jsou anthelmintika. Ta primárně slouží k léčení helmintóz, ale také k preventivnímu tlumení populace dalších parazitů. Každé anthelmintikum by mělo být ideálně bezpečné, snadno dávkovatelné a aplikovatelné a vyznačovat se širokým spektrem účinku. Dále je důležitý larvicidní efekt, aby nedocházelo k zavlečení parazitóz mezi zvířaty (např. během jejich přesunu). V současnosti však stále není běžně dostupný žádný preparát, který by vykazoval stoprocentní larvicidní efekt již po prvním použití. Antinematoda Antinematoda jsou léky účinné proti infekcím způsobeným oblými nesegmentovanými červy z kmene Nematoda. Tyto infekce jsou lokalizovány především v gastrointestinálním traktu (GIT) a játrech nebo ve výjimečných případech také v respiračním aparátu domácích a divokých druhů savců a ptáků. Do této skupiny anthelmintik patří: 

Benzimidazoly: látky, které působí proti dospělým i vývojovým stádiím parazita, některé účinkují i ovicidně (např. thiabendazol, albendazol, febantel, fenbendazol, flubendazol, mebendazol, oxibendazol, aj.)



Imidazothiazoly: (např. levamisol, butamisol, aj.)



Tetrahydropyrimidiny: tyto látky byly v roce 1966 zavedeny jako širokospektrální anthelmintika (např. pyrantel, morantel, oxantel, aj.)



Makrocyklické laktony: jedná se o fermentační produkty aktinomycet rodu Streptomyces avermitilis a jejich deriváty, jejichž účinek je zaměřen proti vnitřním i proti vnějším parazitům, patří tedy k tzv. endektocidům. Nejsou však účinné proti motolicím a tasemnicím. o Avermektiny

(např.

ivermektin,

abamektin,

doramektin,

eprinomektin,

selamektin, aj.) o Milbemyciny (např. moxidektin, milbemycin, aj.) (Dobšíková, 2012) Antitrematoda Antitrematoda jsou léky proti infekcím způsobeným motolicemi z třídy Trematoda. Tyto infekce jsou lokalizovány především v GIT, játrech nebo ve žlučových cestách hostitelského organismu. Do této skupiny anthelmintik patří: 

Benzimidazoly: viz kapitola Antinematoda - 24 -



Další látky: rafoxanid, klorsulon a praziquantel (Dobšíková, 2012)

Anticestoda Anticestoda jsou léky proti infekcím způsobeným segmentovanými plochými červy z třídy Cestoda (tasemnice). Do této skupiny anthelmintik patří: 

Benzimidazoly



Další látky: niklosamid, nitroskanát a praziquantel (Dobšíková, 2012)

Antiektoparazitika Jedná se o insekticidní látky sloužící ke kontrole blech, vší, všenek, klíšťat, střečků a dalších zevních parazitů. Do této skupiny patří: 

Organofosfáty: o pyrofosfáty (např. dichlorvos, tetrachlorvinfos, aj.) o thio–adithiofosfáty (např. diazinon, phoxim, dimpylat aj.)



Karbamáty (např. carbaryl a propoxur)



Pyretriny a pyretroidy (cyflutrin, permetrin, deltametrin, tetrametrin, cypermetrin, flumetrin, aj.)



Neonikotinoidy (např. imidacloprid, aj.)



Fenylpyrazoly (např. fipronil, pyriprol, aj.)



Makrocyklické laktony: viz kapitola Antinematoda



Nezařazené látky (např. amitraz, metaflumizon, fenoxycarb, methopren, aj.) (Dobšíková, 2012)

2.3.2 Antibakteriální látky v životním prostředí Antibakteriálními látkami, jejich výskytem a účinky v životním prostředí se zabývá spousta studií, např. (Kümmerer, 2001; Kemper, 2008; Jorgensen a Halling–Sorensen, 2000). Jedná se o nejvíce používanou skupinu léčiv ve veterinární medicíně, a proto se v životním prostředí vyskytují v nejvyšších koncentracích (Rocha et al., 2014; Guerra et al., 2014; Lawrence et al., 2005).

- 25 -

2.3.3 Anthelmintika v životním prostředí Existuje značné riziko, že antiparazitární látky mohou v určitých koncentracích ovlivňovat parazity v životním prostředí (Morley, 2009) stejně jako i jiné organismy, které se vyskytují v půdě nebo ve vodním prostředí (Yoshimura a Endoh, 2005). Celkové množství anthelmintik vstupujících do životního prostředí bude záviset především na systému chovů a výskytu hostitelských zvířat, která jsou cílem parazitů (Horvat et al., 2012). Je proto zřejmé, že existuje riziko, že v přírodě žijící parazité mohou být ovlivněni koncentracemi antiparazitárních látek, jenž byly nalezeny v životním prostředí. Expozice nízkými koncentracemi antiparazitárních látek v životním prostředí mohou rovněž podporovat rozvoj rezistentních kmenů (Horvat et al., 2012). Tato diplomová práce je primárně zaměřená na antiparazitické látky, účinky antibakteriálních látek jsou předmětem jiných diplomových prací. V následující kapitole a v experimentální části bude zahrnuta jedna antibakteriální látka (enrofloxacin – fluorochinolonové antibakteriální chemoterapeutikum), sloužící pouze pro srovnání této skupiny léčiv s antiparazitiky. 2.4

Vybrané látky

2.4.1 Praziquantel Obecná charakteristika Celý systematický název praziquantelu (PZQ) je (11bRS)–2–(cyklohexankarbonyl)– 1,2,3,6,7,11b–hexahydro–4H–pyrazino[2,1–a]ischinolin–4–on. PZQ je bílý až téměř bílý krystalický prášek hořké chuti. Za normálních podmínek je stabilní a taje za současného rozkladu při teplotě 136 – 140 °C. Je hygroskopický. PZQ je snadno rozpustný v chloroformu a dimethylsulfoxidu, rozpustný v etanolu a velmi málo rozpustný ve vodě. Použití a dávkování PZQ patří do farmakologické skupiny anthelmintik. Používá se u psů, koček a koní, naopak není využíván pro léčbu hospodářských zvířat. U psů a koček je nejčastěji používán proti tasemnici bezbranné (Taenia spp), tasemnici psí (Dipylidium caninum), tasemnice liščí (Echinococcus multilocularis), měchožilu zhoubném (Echinococcusgranulosus) a ostatním rodům tasemnic (Mesocestoides spp).

- 26 -

U koní se užívá proti třem druhům tasemnic, pro které je kůň definitivním hostitelem (Anoplocephala perfoliata, Anoplocephala magna a Paranoplocephala mamillana). Dále je používán u ryb, u kterých jsou PZQ léčeny parazitární choroby vyvolané tasemnicemi, motolicemi a zástupci jednorodých (např. kožní červ Gyrodactylus spp.) (Schmahl a Taraschewski, 1987). Je možné jej použít také u ovcí (Dayan, 2003). Možnost podání je perorální (p.o)., intramuskulární (i.m.) či subkutánní (s.c.). U ryb se PZQ užívá formou léčebných koupelí (Schmahl a Taraschewski, 1987) a jako medikovaná krmná směs. Mechanismus účinku Mechanismu účinku PZQ není přesně znám, ale jedná se o rychle působící látku poškozující tělní pokryv parazita a paralyzující svalové kontrakce parazitů, následovaný jejich smrtí a vyhoštěním (Dayan, 2003). PZQ mění energetický metabolismus parazitů tím, že blokuje vychytávání glukózy a stimuluje vylučování laktátu (Kohler, 2001). Výskyt a účinky v životním prostředí PZQ, jako minoritní léčivo (používané jen v relativně malých množstvích a ne pro hospodářská zvířata) není nijak intenzívně studován a studií o jeho výskytu v životním prostředí je velmi málo. Nicméně byl detekován ve Španělsku v řece Llobregat v koncentracích 102,3 – 109,9 μg/l (Zurncic et al., 2014) a v odpadních vodách z farmaceutického průmyslu, v koncentracích 0,003 – 0,4 μg/l (Babic et al., 2010). Při testování na larvách vrubouna posvátného (Aphodius constans), vykazoval PZQ velmi malou toxicitu (LC50 > 1000 mg/kg suché váhy hnoje) (Hempel et al., 2006). V genotoxických testech na bakteriích, kvasinkách, savčích buňkách a drozofile vykazoval PZQ sice negativní výsledek, ale v rozporu s těmito daty byly výsledky některých studií na myších a lidech, které vykazovaly komutagenní efekt (nemutagenní látky, které při spojení s mutagenem zvyšují sílu mutageneze) PZQ s některými karcinogeny (Montero a Ostrosky, 1997). Tabulka 2 – Vybrané ekotoxikologické údaje pro PZQ KORÝŠI

RYBY

Daphnia magna

ČERVI

Clarias gariepinus 1

EC50 = 30,07 mg/l LC50 = > 12,2 mg/l 1. VSDB: Veterinary Substances Database 2. ECOTOX Database - 27 -

1

Macrogyrodactylus clarii (E)LC50 = 0,2 – 10 mg/l2

2.4.2 Mebendazol Obecná charakteristika Jeho celý systematický název je methyl–(5–benzoyl–1H–benzimidazol–2–yl)karbamát. Jedná se o bílý nebo téměř bílý prášek, který je prakticky nerozpustný ve vodě, v etanolu (96 %) a v dichlormetanu. Použití a dávkování Mebendazol (MBZ) patří do farmakologické skupiny anthelmintik. Je užíván u koček, ovcí, psů (včetně koťat, jehňat a štěňat) a u březích zvířat (Dayan, 2003). Je užíván při léčbě infekcí způsobených hlísticemi rodu Trichuris, Ancylostoma, Uncinaria, Ascaris, Toxocara, Toxascaris a Strongyloides. Způsob podání je p.o., přičemž jednotlivá dávka závisí na vyvolávajícím agens. Mechanismus účinku Mechanismus účinku nebyl stále plně objasněn, avšak zdá se, že lék způsobuje selektivní a ireverzibilní inhibice. Dochází k inhibici vychytávání glukózy a dalších nízkomolekulárních látek u helmitů. Inhibice vychytávání glukózy vede k endogennímu vyčerpání zásob glukózy (MBZ neinhibuje vychytávání glukózy u savců) (HSDB, 2006). Hlavním účinkem léku je blokáda transportu sekrečních granulí v mikrotubulárním systému. To má za následek narušení cytoskeletu i mitotické (dělící) aktivity parazita. To vede k nevratnému poškození a smrti parazita (Květina et al., 2000). Výskyt a účinky v životním prostředí Při výrobě a využití MBZ jako anthelmintika u lidí i zvířat, může dojít k jeho úniku do životního prostředí prostřednictvím různých toků odpadů. V případě uvolnění do ovzduší, bude MBZ existovat pouze ve fázi částic v atmosféře. Částice MBZ pak budou z atmosféry odstraněny mokrou nebo suchou depozicí. V půdě se očekává nízká mobilita na základě jeho rozdělovacího koeficientu organický uhlík–voda (KOC). Následné odpařování z půdy by nemělo mít významný vliv na životní prostředí. Jestliže došlo k uvolnění MBZ do vody, očekává se ze stejného důvodu jeho adsorpce na nerozpuštěné látky a sediment. Bioakumulační faktor MBZ (BCF = 83) naznačuje mírnou bioakumulaci ve vodních organismech (HSDB, 2006).

- 28 -

MBZ byl také detekován ve Španělsku v řece Llobregat v koncentracích 90,4 – 93,8 μg/l (Zurncic et al., 2014). Tabulka 3 - Vybrané ekotoxikologické údaje pro MBZ KORÝŠI NA 1.

RYBY

ČERVI

Clarias gariepinus

Pseudodactylogyrus sp.

LC50 = 267 – 371 mg/l 1

EC100 = 1500 µg/l1

ECOTOX Database

2.4.3 Ivermektin Obecná charakteristika Jedná se o směs dvou izomerů označovaných jako H2B1a a H2B1b. Je to bílý nebo žlutobílý krystalický prášek, který je slabě hygroskopický. Je prakticky nerozpustný ve vodě, dobře rozpustný v etanolu (96 %) a snadno rozpustný v dichlormetanu. Použití a dávkování Ivermektin (IVM) patří do farmakologické skupiny anthelmintik. Užívá se při léčbě proti parazitickým hlísticím a některým ektoparazitům (vši, střečci, zákožky). Některá plemena psů jsou zvláště citlivá na toxické účinky IVM (dáno genetickou mutací MDR1 genu). Také je někdy používán jako akaricid u plazů. Možnost podání je p.o., i.m., s.c. a pour–on (nalévání na hřbet). Mechanismus účinku IVM se váže selektivně a s vysokou afinitou na glutamát–receptorové chloridové kanály ve svalové tkáni a nervových buňkách bezobratlých. Takto navázaný, zvyšuje permeabilitu buněčné membrány pro chloridové ionty, což vede k hyperpolarizaci buňky (snížená dráždivost), paralýze a smrti parazita. U IVM se také předpokládá, že působí jako agonista Gama–aminomáselné kyseliny (GABA neurotransmiter), dochází tak k zablokování převodu impulzů v motorických dráhách helmitů a jejich následnému ochrnutí (Květina et al., 2000). Výskyt a účinky v životním prostředí IVM je hydrofobní látka s velkou molekulovou hmotností, účinná proti mnoha živočišným škůdcům a hmyzu. Provedené studie účinků shledaly IVM jako látku, která je

- 29 -

imobilní v půdě (Koc ≥ 4000) a rychle fotodegradabilní ve vodě. Metabolismus a degradace IVM může vést ke snížení toxicity pro hrotnatku velkou (Halley et al., 1993). Studie zabývající se testováním na larvách vrubouna posvátného (Aphodius constans) uvádí, že IVM byl nejtoxičtější z testovaných látek (LC50 = 0,88 – 0,98 mg/kg suché váhy hnoje) (Hempel et al., 2006). Tabulka 4 - Vybrané ekotoxikologické údaje pro IVM KORÝŠI

RYBY

ČERVI

Daphnia magna

Oncorhynchus mykiss

Tubifex tubifex

48hLC50 = 25 ng/l1 LC50 = 3 mg/l2 1. Horvat et al., 2012 2. VSDB: Veterinary Substances Database 3. ECOTOX Database

EC50 = 1,8 mg/l3

2.4.4 Doramektin Obecná charakteristika Doramektin (DOR)

je

derivát

IVM.

Jeho

celý

systematický

název

je

(1'R,2S,4'S,5S,6R,8'R,10'E,12'R,13'S,14'E,20'R,21'R,24'S)–6–cyklohexyl–21',24'–dihydroxy12'– {[(2R,4S,5S,6S)–5–{[(2S,4S,5S,6S)–5–hydroxy–4–methoxy–6–methyloxan–2–yl]oxy}–4 methoxy–6–methyloxan–2–yl]oxy}–5,11',13',22'–tetrametyl–5,6–dihydro3',7',19'trioxaspiro [pyran–2,6'tetracyclo[15.6.1.14,8.020,24]pentakosan]–10',14',16',22'–tetraen–2'–on. Na rozdíl od IVM, který se používá spíše u psů a koček, se DOR používá spíše u skotu, prasat a ovcí. Použití a dávkování DOR patří do farmakologické skupiny anthelmintik. Je to veterinární lék určený k léčbě parazitů u skotu (GIT škrkavky, červi, vši a svrab) a koní (škrkavky, plicní a vnější parazité). Má široké spektrum aktivity např. pro plicníka jeleního (Dictyocaulus viviparus), střečka lidského (Dermatobia hominis), klíšťata (rod Boophilus microplus), prašivku tuří (Psoroptes bovis) a podobné vnitřní a vnější parazity. Způsob podání je i.m., s.c. nebo p.o. Mechanismus účinku DOR má stejné účinky na parazity jako IVM. Mechanismus účinku je popsán výše v kapitole 4.3.3. - 30 -

Výskyt a účinky v životním prostředí DOR je látka s vysokou toxicitou pro ryby a extrémní toxicitou pro bezobratlé živočichy. Z tohoto důvodu se musí zabránit likvidaci zbytků DOR (např. v prázdných kontejnerech) do vodních toků. Pro životní prostředí také existuje určité riziko vznikající splachy z polí, kde se vyskytuje ve větší míře skot. DOR je špatně rozpustný ve vodě, v půdě ale může být rozkládán mikroorganismy. Poločas biotransformace v půdě se pohybuje v rozmezí 60 – 80 dní. DOR není bioakumulativní, ale ze zvířat je částečně vylučován stolicí, což může mít negativní dopad na koprofágní bezobratlé organismy (larvy much, brouků, atd.) (Webb et al., 2010). Toxicita DOR byla studována zatím jen na půdních organismech. Efektivní koncentrace na reprodukci u Folsomia candida a Enchytraeus crypticus se pohybují v rozmezí 40 – 170 mg/kg suché hmotnosti půdy (Kolar et al., 2008). Tabulka 5 - Vybrané ekotoxikologické údaje pro DOR KORÝŠI

RYBY

ČERVI

Daphnia magna

Danio rerio

NA

48hEC50 = 100 ng/l1 1. Kolodziejska et al., 2013 2. ECOTOX Database

EC50 = 580 µg/l2

2.4.5 Enrofloxacin Obecná charakteristika Enrofloxacin (EFX) je širokospektrální baktericidní antibiotikum používané k léčbě různých infekcí, včetně E.coli, Enterobacter, Campylobacter, Shigella a Salmonella (VSDB, 2011). Jeho systematický vzorec je 1–cyklopropyl–7–(4–ethyl–1–piperazinyl)–6– fluor–1,4–dihydro–4–oxo–3–quinolonekarboxylové kyseliny. EFX je žlutá krystalická látka. Použití a dávkování EFX je chemoterapeutický lék ze skupiny fluorochinolonů. Prokázal antibakteriální účinek pro gram negativní i gram pozitivní bakterie. Účinný proti bakteriím druhu Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Chlamydia trachomatisa dále rody Klebsiella, Enterobacter, Campylobacter, Shigella, Salmonella, Aeromonas, Haemophilus, Proteus, Yersinia, Serratia, Vibrio, Brucella, Staphylococcus, Mycoplasma a Mycobacterium. Není účinný proti aerobním bakteriím a může mít různý účinek pro rod Streptoccocus.

- 31 -

Způsob podání je p.o., s.c. nebo i.m. EFX byl zakázán pro použití u drůbeže, kvůli nežádoucím účinkům. Dále není doporučován u rychle rostoucích zvířat (mláďat), kvůli možným abnormalitám na chrupavkách (Forney, 2004). Mechanismus účinku Mechanismus účinku EFX je velmi složitý a není dosud zcela objasněn. Principem mechanismu

účinku

fluorochinolonů

je

zablokování

bakteriální

gyrázy,

enzymu

s důležitou roli při replikaci DNA. Inhibice tohoto enzymu vede k buněčné dysfunkci, blokace mnoha fází syntézy proteinů, s následnou smrtí bakteriální buňky (Vijan a Giosanu, 2012). Výskyt a účinky v životním prostředí Ve východní Číně bylo sledováno 24 odpadních vod z živočišné výroby, 8 odpadních vod ze zvířecích farem, 18 říčních vod a 8 rybníků na rezidua EFX. Byl zjištěn u 87 % vzorků, maximální nalezená koncentrace byla 8,77 µg/l (Wei et al., 2012). V Rakousku byl nalezen EFX v prasečím trusu v koncentracích 13 – 0,75 mg/kg a v kuřecím a krůtím trusu 2,8 a 8,3 mg/kg (Martinez–Carballo et al., 2007). V Itálii byl EFX zjištěn v odpadních vodách z vepřínů v koncentračních rozsazích 270 – 510 µg/l (Pierini et al., 2004). EFX je toxický pro vodní organismy. Hodnota EC50 pro hrotnatky se pohybovala mezi 46 – 76 mg/l v závislosti na pH (Kim et al., 2010). Tabulka 6 - Vybrané ekotoxikologické údaje pro EFX

2.5

KORÝŠI

RYBY

ČERVI

Daphnia magna

Rainbow trout

NA

48hEC50 = 56,7 mg/l1 1. Park a Choi, 2008

96hLC50 =>10 mg/l1

Modelové organismy

2.5.1 Hrotnatka velká Je

jedním

z nejstarších

modelových

organismů

používaných

v ekotoxikologii

pro testování toxicity již od roku 1940 (Koivisto, 1995), je sladkovodní korýš hrotnatka velká (Daphnia magna Straus). Hrotnatka je široce používaný organismus, který je používán na testy akutní a chronické toxicity (Smutná et al., 2014; Ton et al., 2012; Jo et al., 2012; Deleebeeck et al., 2008). Mezi sledované „endpointy“ testů s hrotnatkou patří např. pohyblivost, reprodukce, přežití aj. Nejčastěji hodnoceným kritériem v akutních testech je pak hodnota koncentrace, - 32 -

která je potřebná k dosažení imobility (nehybnosti) u poloviny jedinců (50 %), tato koncentrace je pak značena jako EC50.

Obrázek 3 – Vyfotografováno pomocí mikroskopu + program QuickPHOTO MICRO 2.3

Anatomie hrotnatky velké Hrotnatka velká je největší perloočko (řád Cladocera) na severní polokouli, s velikostí v rozsahu 0,2 až 5 mm. Hrotnatky jsou často označovány také jako „vodní blechy“ pro jejich specifický styl plavání. Jedná se o poměrně velký druh zooplanktonu, který je velmi citlivý na predaci ryb. Z tohoto důvodu se vyskytují hlavně na efemérních (krátkodobých) stanovištích, jako jsou např. malé rybníky a skalní jezírka, kde je výskyt predátorů vzácný. Tělo je rozděleno do dvou segmentů. Hlava se slučuje s tělem a je skloněná k tělu s viditelným zářezem dělící tělo na dvě části. U většiny druhů je tělo kryto krunýřem, s ventrálními mezerami, ve kterých je pět nebo šest párů nohou. Krunýř je z velké části tvořen z chitinu. Mezi nejvýznamnější části těla patří složené oči, antenuly a dva páry břišních štětin. Pod mikroskopem můžeme díky průhlednému tělu pozorovat hýbající se vajíčka v zárodečném prostoru, nebo krvinky čerpané oběhovým systémem s jednoduchým srdcem.

- 33 -

Krevní oběh hrotnatek je otevřený. Srdce je uloženo v horní části zad, těsně za hlavou. Průměrná tepová frekvence je přibližně 200 tepů za minutu při laboratorní teplotě a klesá se snižující se teplotou (Ebert, 2005).

Obrázek 4 – Anatomie hrotnatky. Převzato a upraveno z: http://www.flickr.com/photos/laimagendelmundo/5978947132/

Rozmnožování hrotnatek Životní cyklus hrotnatky velké se liší od ostatních druhů perlooček. Velké perloočky produkují velký počet nových jedinců, zatímco malé druhy perlooček naopak. Samci a samice hrotnatek jsou morfologicky odlišní. Samec se od samice liší tím, že je menší, má větší antenuly, modifikovaný abdomen a na prvním páru nohou má háčky sloužící k přichycení k samici. Hrotnatky se nejčastěji rozmnožují partenogenezí, a to obvykle v období od jara až do konce léta. Čerstvě vylíhlá mláďata několikrát svlékají krunýř, než jsou zcela vyvinuté, což trvá přibližně po dobu dvou týdnů. Dospělé samice jsou schopny produkovat nové potomstvo, pokud k tomu mají optimální podmínky, přibližně každé tři nebo čtyři dny (Clare, 2002; OECD; Green, 1956).

- 34 -

Pokud se blíží zimní období, období sucha, nebo nastanou jiné nepříznivé podmínky, přestanou se hrotnatky rozmnožovat partenogenezí a dávají přednost pohlavnímu rozmnožování. Tato „zimní“ oplodněná vajíčka, vybavena vrstvou krunýře, se nazývají efípia. Tato vrstva zachovává a chrání vajíčko, dokud nenastanou příznivější podmínky.

Obrázek 5 - Schéma rozmnožovacího cyklu hrotnatky velké. Převzato a upraveno z: http://bioweb.uwlax.edu/bio203/2010/carroll_chri/reproduction.htm

Potrava hrotnatek Hrotnatky obvykle konzumují částice od 1 µm až do 50 µm. Občas spolknou i malé korýše nebo vířníky, většinou se však krmí hlavně jednobuněčnými řasami a různým organickým detritem, včetně prvoků a baktérií. V laboratorních podmínkách jsou často krmeny kvasnicemi nebo jednobuněčnými řasami. Zabarvení hrotnatek ovlivňuje potrava. Pokud budou krmeny zelenými řasami, budou transparentní s nádechem zelené nebo žluté. Zatímco pokud budou krmeny bakteriemi, budou bílé nebo lososově růžové. V naší laboratoři jsou hrotnatky krmeny koncentrovanou suspenzí řas rodu Scenedesmus dimorphus a občas jsou přikrmovány potravinářským droždím. - 35 -

Využití hrotnatek Zvláště užitečné jsou hrotnatky při testování účinků toxikantů v životním prostředí. Volba hrotnatky velké jako standardního modelového organizmu byla ovlivněna jeho vhodnými vlastnostmi. Je malé velikosti a snadno se kultivují v laboratoři. Partenogeneze během příznivého období umožňuje testování klonů, které má kladný vliv na reprodukovatelnost a opakovatelnost výsledků zkoušek. Navíc mají relativně krátký reprodukční cyklus, a proto jsou dobře použitelné pro chronické testování (Mansour a Gad, 2010). Z těchto důvodů je hrotnatka nejčastěji testovaným sladkovodním druhem v testech akutní a chronické toxicity (Ratte et al., 2003). Testy toxicity s hrotnatkou se využívají k předvídání účinků chemických látek v životním prostředí. Za účelem zvýšení spolehlivosti a opakovatelnost testů v rámci jedné laboratoře a stejně tak pro usnadnění srovnání výsledků mezi laboratořemi, byly vyvinuty standardizované zkušební metody (různé organizace – EPA, ASTM a OECD). Testy na hrotnatkách jsou standardizovány, nicméně v určitých bodech se liší. Standardní doba expozice je 48 hodin při akutním testu, ale je možné exponovat hrotnatky i jen 24 hodin (Seco et al., 2003). Při reprodukčním testu je doba expozice 21 dní (OECD). Standardizace postupů je velmi důležitá. Díky tomu může test zopakovat kdokoliv a ve kterékoliv laboratoři, přičemž rozdíl výsledků by měl být statisticky nevýznamný. Testy jsou podrobně popsány v legislativě. Pro reprodukční test se jedná o normy ISO 10706 z roku 2000. U nás je norma ISO 10706 shodná s normou ČSN EN ISO 10706. Pro akutní test existuje norma ISO 6341 z roku 1996, se kterou je shodná česká norma ČSN EN ISO 6341. Existují také normy OECD 202: Akutní test imobilizace a OECD 211: Reprodukční test s hrotnatkou velkou. Normy OECD jsou volně dostupné na internetu. 2.5.2 Pseudomonas putida Pseudomonas putida patří do lékařsky, ekologicky a vědecky významné třídy Gamma proteobacteria z kmene Proteobacteria. Čeleď těchto saprofytických půdních bakterií je Pseudomonadaceae a řád Pseudomonales (Ningthoujam, 2010). Jedná se o gram negativní bakterii, oficiálně objevenou v polovině 19. století (Hamilton, 2007). Obývá půdu, kořeny rostlin a prostředí přírodních stanovišť, ve kterém se - 36 -

pohybuje prostřednictvím jednoho nebo více polárních bičíků. Metabolismus bakterie je aerobní a stanoviště, která obývají, jsou bohaté na kyslík a organické živiny. Optimální teplota pro růst těchto bakterií se pohybuje mezi 25 – 30°C. P.putida je nepatogenní bakterie, občas však hodnocena jako oportunní patogen (při příležitosti napadá oslabené jedince).

Obrázek 6 – Pseudomonas putida, převzato z: http://2013.igem.org/Team:Valencia_Biocampus/Project

Použití Bakterie patřící do rodu Pseudomonas jsou využívané pro své pozoruhodné bioremediační vlastnosti. Konkrétně P. putida je účinná pro léčbu kontaminovaných zemin, které jsou kontaminovány např. nikotinem, naftalenem, toluenem nebo oleji. Dokáže také degradovat plast či polystyren do jednodušších a tím biologicky odbouratelných forem (Ningthoujam, 2010). U P. putida bylo prokázáno, že má schopnost odbourávat mnoho organických toxinů, včetně atrazinu. P. putida je tak efektivní, že snižuje poločas rozpadu atrazinu (8 let) na pouhých 5 ½ hodiny (Hamilton, 2007). U rostlin napomáhá absorpci živin z půdy a také v boji proti patogenním houbám (Fusarium a Pythium). Využití Pseudomonas putida v ekotoxikologii Zkouška inhibice růstu s P. putida se využívá k testování povrchových, podzemních a odpadní vod na přítomnost chemických látek a předvídání jejich účinků v životním prostředí. Chronický test s P. putidaje standardizován, nicméně v určitých bodech se liší. Standardní doba inkubace podle normy je 16 – 22 hodin, ale v naší laboratoři jsme pro lepší výsledky inhibice, inkubovali po dobu 24 hodin. - 37 -

Test je podrobně popsán v legislativě. Jedná se o normu ČSN EN ISO 10712 – Jakost vod – Zkouška inhibice růstu na Pseudomonas putida (zkouška inhibice rozmnožování buněk Pseudomonas), shodná s mezinárodní normou ISO 10712: 1995.

- 38 -

3

MATERIÁL A METODY

3.1

Testované látky

Tabulka 7 - Přehled vlastností testovaných látek Chemická látka ATCvet kód

Rozpustnost [mg/l]

Log KOW

Poločas přeměny

2,422

0,8 – 1,5 hodin (kr. sérum) 4

400 (voda)2 Praziquantel

QP52AA511

97 000 (etanol) 2 567 000 (chloroform) 2

Mebendazol

QP52AC091

71,3 (voda)4

2,833

2,5 – 5,5 hodin (játra) 4

Enrofloxacin

QJ01MA901

849,7 (voda)5

1,15

1,2 – 7,3 hodin (krev dle druhu)6

Ivermektin

QP54AA01, QS02QA031

4 (voda)2 30 000 (butanol) 2

3,28

Doramektin (1) (2) (3) (4) (5)

QP54AA031 0, 025 (voda)9 7,472 WHO Collaborating Centre for Drug Statistics Methodology VSDB: Veterinary Substances Database HSDB: Hazardous Substances Data Bank DrugBank Park a Choi, 2008

Praziquantel

Mebendazol

Ivermektin

Doramektin

- 39 -

39 hodin – 45 dní (voda)8 7dní až několik měsíců 7 0,7 – 2,7 dní (krev) 10 (6) Mitchell, 2006 (7) Horvat et al., 2012 (8) Sanderson et al., 2007 (9) Kolodziejska et al., 2013 (10) Parasitipedia

Enrofloxacin

Obrázky převzaty z: Praziquantel. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001– [cit. 2013–02–26]. Dostupné z: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Praziquantel.svg Mebendazol. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001– [cit. 2013–02–26]. Dostupné z: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Mebendazol.svg Ivermectin. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001– [cit. 2013–02–26]. Dostupné z: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Ivermectin_skeletal.svg Doramectin. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001– [cit. 2013–02–26]. Dostupné z: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Doramectin.svg Enrofloxacin. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001– [cit. 2013–02–26]. Dostupné z: http://ar.wikipedia.org/wiki/%D9%85%D9%84%D9%81:Enrofloxacin_Structural_Formulae.png

3.2

Použité chemikálie

Tabulka 8 – Přehled ostatních chemikálií, použitých při testování CHEMIKÁLIE

FIRMA

MĚSTO

STÁT

Prodac International

Cittadella

Itálie

Sigma–Aldrich

Praha

Česká republika

Penta

Chrudim

Česká republika

SeO2

Sigma–Aldrich

Praha

Česká republika

NaOH

Penta

Chrudim

Česká republika

HCl

Lach:ner

Neratovice

Česká republika

NaNO3

Lach:ner

Neratovice

Česká republika

HiMedia Laboratories

Mumbai

Indie

K2HPO4

Serva

New York

Spojené státy americké

KH2PO4

Sigma–Aldrich

Praha

Česká republika

glukósa monohydrát

Sigma–Aldrich

Lyon

Francie

Penta

Chrudim

Česká republika

Citronan železitý

Sigma–Aldrich

Seelze

Německo

K2Cr207

Sigma–Aldrich

Praha

Česká republika

DMSO

Lach:ner

Neratovice

Česká republika

Sigma–Aldrich

Praha

Česká republika

Syntetická mořská sůl CaCl2 . 2H20 NaHCO3

Bacto yeast extrakt

MgSO4.7H2O

3,5–Dichlorofenol

- 40 -

3.3

Metody

3.3.1 Stanovení inhibice pohyblivosti Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) – Zkouška akutní toxicity Metodika

biotestu

na

akutní toxicitu

s hrotnatkou

velkou

vychází z normy

ČSN EN ISO 6341 (ČSN 1996). Princip zkoušky Jedinci hrotnatky velké, mladší 24 hodin, jsou vystaveny testované látce v určitém rozsahu koncentrací po dobu 48 hodin. Imobilizaci zaznamenáváme po 24 a 48 hodinách a srovnáváme s kontrolními hodnotami. Chemikálie a materiály Zkušební organismus – Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea). K testům používáme nejméně třetí generaci, která byla získána acyklickou (nepravidelně se opakující) partenogenezí za definovaných chovných podmínek. Jedinci, kteří jsou používáni ke zkouškám, jsou mladší 24 hodin. Z tohoto důvodu musíme den před začátkem testování hrotnatky vytřídit. Pomocí dvou sítek (každé s jinou velikostí ok), přesejeme z akvárií vylovené hrotnatky, dospělé jedince vrátíme zpět do akvárií. Ředící voda – Během ročního období se může měnit složení přírodní vody. Voda dokonce může obsahovat i nežádoucí sloučeniny (organické látky, těžké kovy, apod.). Z tohoto důvodu se pro kultivaci v laboratoři používá umělé médium ADaM (Aachener Daphnien Medium) (Kluttgen et al., 1994). ADaM médium je vhodné pro dlouhodobou kultivaci a díky němu je možné test s hrotnatkami standardizovat a dobře reprodukovat. Tabulka 9 – Složení ADaM média Syntetická mořská sůl CaCI2 – roztok; 0,8 mol/l (117,6 g/l CaCl2 . 2H20) NaHCO3 – roztok; 0,3 mol/I (25,2 g/I NaHCO3) SeO2 – roztok; 0,013 mol/I (1,4 g/I SeO2)

0,333 g/l 2,3 ml/I 2,2 ml/I 0,1 ml/I

Médium se po přípravě nechá minimálně 12 hodin před testováním probublávat. Hodnota pH takto připravené ředící vody je v rozmezí 7,8 ± 0,2 a koncentrace rozpuštěného kyslíku je nad 7 mg/l.

- 41 -

Postup zkoušky Před založením samotného testu je nutné opět vytřídit hrotnatky. Připravíme si ze zásobního roztoku ředící řadu (nejčastěji dvojková ředící řada, např.: 60 – 30 – 15 – …) a naředíme roztoky na objem 50 ml (10 ml na každou hrotnatku). Do každé kádinky pipetujeme 10 ml roztoku a přidáme 5 jedinců. V každém testu musí být také založena kontrola a rozpouštědlová kontrola (pokud byla látka rozpuštěna v dimethylsulfoxidu – DMSO). Během zkoušky nejsou zkušební organismy krmeny a ve zkušebních nádobách je udržována teplota 20 °C ± 2 °C. Test vyhodnocujeme po 24 hodinách a po 48 hodinách (tolerovaná odchylka ± 2 hodiny). V kádinkách spočítáme imobilizované jedince, zapíšeme a vyhodnotíme procentuální množství imobilizovaných jedinců. Jako imobilní jsou považováni ti jedinci, kteří se nejsou schopni po mírném zamíchání roztoku do 15 sekund rozplavat. Po té je určeno koncentrační rozmezí, které způsobuje 0 % až 100 % imobilizaci a jsou zaznamenány všechny anomálie v chování organismů. Určí se hodnota 24h–EC50, přednostně 48h–EC50. Výsledky zkoušky Vyhodnocení testů spočívá ve spočítání mobilních a imobilních jedinců v jednotlivých koncentrací testované látky a výpočet procentuálního zastoupení imobilizovaných jedinců. Toto procentuální zastoupení lze vypočítat ze vztahu: I %     100 C

Kde: I je počet imobilizovaných jedinců C je celkový počet jedinců Provede se grafická interpolace (např. program GraphPad Prism) a je zjištěna 24/48hEC50. Výsledek pro chemické látky je vyjádřen v mg/l. Vyhodnocení tohoto testu bylo provedeno pro sdružený vzorek složený z výsledků alespoň tří na sobě nezávislých provedení testu.

- 42 -

3.3.2 Stanovení chronické toxicity látek pro Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) Metodika

biotestu

na

akutní toxicitu

s hrotnatkou

velkou

vychází z normy

ISO 10760, která má status české technické normy. Princip zkoušky Samičky hrotnatky velké, které jsou mladší 24 hodin, jsou exponovány v médiu po dobu 21 dní. Zaznamenávány jsou přeživší mateřské organizmy a počty živých potomků na konci zkoušky, případně anomálie v chování či velikosti organismů. Podmínky zkoušky Koncentrace rozpuštěného kyslíku musí být alespoň 3 mg/l a hodnota pH musí být 6 – 9 po celou dobu testování a nesmí se během zkoušky změnit o více než 1,5 jednotky pH. Během zkoušky se střídá fotoperioda 16 hodin světlo/8 hodin tmy. Intenzita světla musí být v rozsahu 600 – 800 lux, ale nesmí přesáhnout hodnotu 1200 lux. Teplota se během zkoušky udržuje v rozmezí 18 až 22 °C a během zkoušky nesmí kolísat o více než 2 °C. Chemikálie a materiály Zkušební organismus – Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea). Podmínky a postup třídění stejný jako u akutního testu. Ředící voda – provzdušňuje se do doby, dokud koncentrace rozpuštěného kyslíku není alespoň 95 % a nedojde k ustálení hodnoty pH. Je–li potřeba, upraví se pH pomocí roztoku hydroxidu sodného (NaOH) nebo kyseliny chlorovodíkové (HCl) na hodnotu 8,0 ± 0,5. Takto připravená ředící voda se již neprovzdušňuje. Postup zkoušky Před založením samotného testu je nutné opět vytřídit hrotnatky. Připravíme si ze zásobního roztoku ředící řadu a naředíme roztoky na objem 500 ml (50 ml na každou hrotnatku). Do každé kádinky pipetujeme 50 ml roztoku a přidáme 1 jedince. K jejich krmení jsou použity živé buňky řas, viz kapitola 5.3. Pro každou koncentraci děláme 10 opakování. V každém testu musí být také založena kontrola a rozpouštědlová kontrola (pokud byla látka rozpuštěna v DMSO). Roztoky, včetně krmení hrotnatek, se obměňují nejméně třikrát týdně. - 43 -

Výsledky zkoušky Výsledky jsou vyjádřeny v počátečních koncentracích, protože v rámci této práce nebylo prováděno měření koncentrací v průběhu testu. V tomto testu jsou spočítány celkové počty potomků vyprodukované mateřským organizmem a vypočítá se průměrný počet potomků na přeživší mateřský organizmus. Z počtu potomků se potom vypočítá procentuální inhibice reprodukce vztažená ke kontrole pro každou koncentraci. Nelineární regresí a analýzou ANOVA v programu PraphPad Prism byly získány hodnoty EC50 nebo NOEC a LOEC. 3.3.3 Zkouška inhibice růstu na Pseudomonas putida (zkouška inhibice rozmnožování buněk Pseudomonas) Metodika biotestu na P. putida vychází z normy ČSN EN ISO 10712:1995, která má status české technické normy. Princip zkoušky V tomto testu je sledován inhibiční účinek na P. putida měřením růstu buněk exponovaných určitými koncentracemi zkoušené látky a srovnáním s růstem kultury v kontrolních vzorcích (bez látky). Hodnocení testu se provádí měřením absorbance při vlnové délce 436 nm. Chemikálie a materiály Zkušební organismus – kmen Pseudomonas putida, gram negativní aerobní tyčkovitá bakterie s polárními bičíky. Běžně se vyskytuje v půdě a povrchových vodách. Kultivační médium – kultivační médium, viz tabulka 10, připravíme smícháním zásobních roztoků připravených dle tabulky 11.

Tabulka 10 – Složení kultivačního média Roztok 1 Roztok 3 Roztok 4 Sterilní voda

750 µl 750 µl 1500 µl 27 ml

- 44 -

Tabulka 11 – Složení zásobních roztoků Roztok 1 1g 0,1 g 0,24 g 0,12 g 50 ml – – –

NaNO3 Bacto yeast extrakt K2HPO4 KH2PO4 Sterilní voda glukósa monohydrát MgSO4.7H2O Citronan železitý

Roztok 2 1g – 0,24 g 0,12 g 50 ml – – –

Roztok 3 – – – – 50 ml 4g – –

Roztok 4 – – – – 100 ml – 4g 0,001 g

Postup zkoušky Necháme roztát zamraženou kulturu a inokulujeme 500 μl kultury do kultivačního média o objemu 10 ml. Po minimálně 12 hodinách inkubace (23 °C, na třepačce, ve tmě) naředíme bakterie tak, aby výsledná absorbance zákalu při 436 nm byla cca 0,3. Následně inkubujeme bakterie dalších 5 hodin na třepačce při teplotě 23 °C. Připravíme směs roztoků 2, 3 a 4 v poměru 1:1:2 v dostatečném množství (cca 4 ml). Z nakultivované bakteriální kultury připravíme inokulum s absorbancí A = 0,1. Pro každý vzorek bychom měli mít alespoň 5 koncentrací a provádět 3 opakování. Připravíme si do mikrozkumavek vzorky o daných koncentracích a přidáme k nim připravené inokulum a směs roztoků, viz tabulka 12. Součástí každého testu musí být blank, negativní a pozitivní kontrola (K2Cr2O7 nebo 3,5–dichlorfenol – DCP). Do jamek mikrodestiček pipetujeme všechny roztoky po 200 μl na jamku. Změříme absorbance roztoků v jamkách mikrodestičky při 436 nm, překryjeme parafilmem a zabalíme do alobalu. Inkubujeme 24 hod při 23 °C a změříme absorbanci na konci inkubace. Tabulka 12 – Schéma pipetování vzorků do mikrozkumavek, standardně pro 3 opakování Objem [µl]

Blank

Vzorky

Negativní kontrola

Pozitivní kontrola

Rozpouštědlová kontrola

V H2O

V DMSO

Sterilní voda

800

800

0

790

0

790

Testovaná látka

0

0

800

10µl DMSO

800

10µl vzorku v DMSO

Směs roztoků

100

100

100

100

100

100

Kultivační medium

100

0

0

0

0

0

Inokulum

0

100

100

100

100

100

- 45 -

Výsledky zkoušky Z naměřených absorbancí vypočítáme procentuální inhibici růstu. Od hodnot v čase 24 hodin (end) odečteme hodnoty v čase 0 hodin (start), od každé hodnoty odečítáme také blank. Procentuální inhibici růstu I vypočítáme jako:

 Bn   I  100    100  Bc   Kde: I je inhibice růstu v % Bn je naměřený zákal Bc je zákal v negativní kontrole Pro každou koncentraci se ze všech opakování vypočítá průměr a směrodatná odchylka. Nelineární regresí v programu GraphPad Prism byly získány hodnoty EC50. Vyhodnocení tohoto testu bylo provedeno pro sdružený vzorek složený z výsledků alespoň dvou na sobě nezávislých provedení testu.

- 46 -

4

VÝSLEDKY Pro využití výše popsaných ekotoxikologických testů byly všechny testované látky,

kromě EFX, rozpuštěny v DMSO. EFX byl rozpuštěn ve vodě. Testované koncentrace látek byly zvoleny na základě údajů dostupných v literatuře. Tam, kde data chyběla, byly provedeny předběžné testy toxicity a podle výsledků pak byly upraveny ředící řady. Pro testy s hrotnatkami jsou uváděny v grafech také nulové hodnoty (kontrola) pro vzájemné porovnání výsledků. Množství DMSO v testovaných roztocích bylo pro všechny látky 0,1 %. Množství DMSO v testech s pseudomonádou bylo 1 %. 4.1

Stanovení inhibice pohyblivosti Daphnia magna Straus

Praziquantel PZQ byl testován v koncentracích 4 – 400 mg/l. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 13 a pro lepší vizualizaci zaneseny do grafů (Graf 1), včetně chybových úseček. Nelineární regresí v programu GraphPad Prism byla vypočítaná hodnota EC50 = 33 mg/l s 95% intervalem spolehlivosti v rozmezí 30 – 35 mg/l.

Tabulka 13 – Přehled výsledků akutního testu pro PZQ Koncentrace [mg/l] 4 10 20 40 80 160 400

Ø imobilizace [%] 0 6,7 17,5 65 92,5 100 100

Závislost imobilizace na koncentraci

Závislost imobilizace na koncentraci

150

120 Imobilizace [%]

100

imobilizace [%]

SD 0 9,9 16,7 12,4 14,9 0 0

80 60 40 20

100

50

0 -20

4

10

20

40

80

160

0

400

0

koncentrace[mg/l]

1

2

3

Log C

Graf 1 – Grafické zobrazení závislosti imobilizace hrotnatky vlivem zvyšující se koncentrace PZQ (MS Excel® a nelineární regrese v GraphPad Prism) - 47 -

Mebendazol MBZ byl testován v koncentracích 0,025 – 0,4 mg/l. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 14 a pro lepší vizualizaci zaneseny do grafů (Graf 2), včetně chybových úseček. Nelineární regresí v programu GraphPad Prism byla získána hodnota EC50 = 0,11 mg/l s 95% intervalem spolehlivosti v rozmezí 0,10 – 0,12 mg/l.

Tabulka 14 – Přehled výsledků akutního testu pro MBZ Koncentrace [mg/l] 0,025 0,05 0,1 0,2 0,4

Ø imobilizace [%] 0 8,3 41,7 85 96,7

Závislost imobilizace na koncentraci

Závislost imobilizace na koncentraci

150

120 Imobilizace [%]

100

imobilizace [%]

SD 0 15,9 26,2 15,1 7,8

80 60 40

20

100

50

0 -20

0 -2.0

0,0250 0,0500 0,1000 0,2000 0,4000

koncentrace [mg/l]

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

Log c

Graf 2 – Grafické zobrazení závislosti imobilizace hrotnatky vlivem zvyšující se koncentrace MBZ (MS Excel® a nelineární regrese v GraphPad Prism)

Ivermektin IVM byl testován v koncentracích 25 – 200 ng/l. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 15 a pro lepší vizualizaci zaneseny do grafů (Graf 3), včetně chybových úseček. Nelineární regresí v programu GraphPad Prismbyla získána hodnota EC50 = 80 ng/l s 95% intervalem spolehlivosti v rozmezí 73 – 87 ng/l.

Tabulka 15 – Přehled výsledků akutního testu pro IVM Koncentrace [ng/l] 25 50 75 100 200

Ø imobilizace [%] 0 18,3 51,7 60 93,3 - 48 -

SD 0 18 23,3 17,1 9,9

Závislost imobilizace na koncentraci

Závislost imobilizace na koncentraci

150

100

Imobilizace [%]

Imobilizace [%]

120 80 60 40 20

100

50

0 25

50

75

100

200

0 1.0

koncentrace [ng/l]

1.5

2.0

2.5

Log C

Graf 3 – Grafické zobrazení závislosti imobilizace hrotnatky vlivem zvyšující se koncentrace IVM (MS Excel® a nelineární regrese v GraphPad Prism)

Doramektin DOR byl testován v koncentracích 25 – 400 ng/l. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 16 a pro lepší vizualizaci zaneseny do grafů (Graf 4), včetně chybových úseček. Nelineární regresí v programu GraphPad Prism byla získána hodnota EC50 = 67 ng/l s 95 % intervalem spolehlivosti v rozmezí 62 – 73 ng/l.

Tabulka 16 – Přehled výsledků akutního testu pro DOR Koncentrace [ng/l] 25 50 75 100 200 400

Ø imobilizace [%] 10 18,3 63,3 86,7 98,3 100

Závislost imobilizace na koncentraci

Závislost imobilizace na koncentraci

150

120 Imobilizace [%]

100

Imobilizace [%]

SD 18,1 21,7 35 17,8 5,8 0

80 60 40 20

100

50

0 -20

25

50

75

100

200

0

400

0

koncentrace [ng/l]

1

2

3

Log C

Graf 4 - Grafické zobrazení závislosti imobilizace hrotnatky vlivem zvyšující se koncentrace DOR (MS Excel® a nelineární regrese v GraphPad Prism)

- 49 -

Enrofloxacin EFX byl testován v koncentracích 6,25 – 200 mg/l s ředící řadou s faktorem 2. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 17 a pro lepší vizualizaci zaneseny do grafů (Graf 5), včetně chybových úseček. Nelineární regresí v programu GraphPad Prism byla získána hodnota EC50 = 58 mg/l s 95 % intervalem spolehlivosti v rozmezí 47 – 73 mg/l.

Tabulka 17 – Přehled výsledků akutního testu pro EFX Koncentrace [mg/l] 6,25 12,5 25 50 100 200

Ø imobilizace [%] 0 10 28,3 53,3 61,7 76,7

Závislost imobilizace na koncentraci

Závislost imobilizace na koncentraci

100

120 Imobilizace [%]

100

Imobilizace [%]

SD 0 13,5 23,3 23,1 18 18,8

80 60 40 20

80 60 40 20

0 -20

6,25

12,5

25

50

100

0 0.0

200

Koncentrace mg/l

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Log C

Graf 5 – Grafické zobrazení závislosti imobilizace hrotnatky vlivem zvyšující se koncentrace EFX (MS Excel® a nelineární regrese v GraphPad Prism)

4.2

Stanovení chronické toxicity látek pro Daphnia magna Straus V chronickém testu byl sledován vliv vybraných chemických látek na reprodukci

a přežívání hrotnatky velké. Byla hodnocena mortalita a počet narozených jedinců na mateřský organismus. Praziquantel V nejvyšší koncentraci 10 mg/l uhynuly do skončení testu 3 jedinci (mortalita 30 %). Zde byl také pozorován efekt na vývoj hrotnatky. Jedinci v této koncentraci byli podstatně menší oproti ostatním. V rozpouštědlové kontrole (RK) a v koncentraci 2,5 mg/l byl úhyn po 1 jedinci (mortalita 10 %). V některých koncentracích byl zaznamenán výskyt jedinců, kteří - 50 -

byli po celou dobu testu menšího vzrůstu oproti kontrole, a počet narozených mladých byl u nich nulový. Jelikož během testování PZQ byl v chovu zjištěn výskyt efipií, jednalo se s největší pravděpodobností o samce, a proto tito jedinci byli z hodnocení vyloučeni. Pro chronický test můžeme stanovit také EC50 = 11 mg/l, protože interval spolehlivosti se pohybuje v rozmezí 7,6 – 17 mg/l. Inhibice reprodukce

35 30 25 20 15 10 5 0

80

RK

0,625

1,25

2,5

5

Inibice reprodukce [%]

Mortalita [%]

Mortalita testovaných jedinců

10

60 40

20 0 -20

0

0,625

-40

Koncentrace [mg/l]

1,25

2,5

5

10

Koncentrace [mg/l]

Graf 6 – Mortalita a inhibice reprodukce testovaných jedinců během trvání testu na toxicitu PZQ

Při statistickém zpracování počtu jedinců pomocí analýzy rozptylu ANOVA s rozšířeným Dunnettovým testem pomocí programu GraphPad Prism byla zjištěna koncentrace 10 mg/l jako první, která se významně lišila od kontroly. Z toho bylo možné vyhodnotit LOEC = 10 mg/l a NOEC = 5 mg/l. Počet narozených jedinců za celé období testu 1200

Kontrola RK 1,5625 3,125 6,25 12,5 25

1100

Počet narozených jedinců

1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

Čas (dny)

Graf 7 – Celkový počet jedinců, narozených během testování toxicity PZQ (21 dní)

- 51 -

19

20

21

Mebendazol V koncentracích 12,5 µg/l a 50 µg/l uhynuly do skončení testu 4 jedinci (mortalita 40 %). V koncentraci 3,125 µg/l; 6,25 µg/l a 25 µg/l byl úhyn po 3 jedincích (mortalita 30 %). V rozpouštědlové kontrole 1 jedinec (mortalita 10 %). V kontrole a v některých koncentracích, až po koncentraci 12,5 µg/l se občasně vyskytovali jedinci menšího vzrůstu, ale okolo 14. dne již byli všichni jedinci normální velikosti. U koncentrací 25 µg/l a 50 µg/l byl pozorován efekt i na vývoj hrotnatek. U koncentrace 25 µg/l byl během prvních 4 vrhů velmi nízký počet mladých a jedna hrotnatka měla svlečený krunýř včetně zárodečného vaku. V nejvyšší koncentraci 50 µg/l se narodili za celou dobu trvání testu pouze 3 noví jedinci, kromě nich byla po celou dobu trvání testu v této koncentraci nalezena pouze „vysypaná“ vajíčka na dně kádinek.

Obrázek 7 - Vajíčka - vyfotografováno pomocí mikroskopu + program QuickPHOTO MICRO 2.3

Mortalita testovaných jedinců

Inhibice reprodukce 150

Inibice reprodukce [%]

Mortalita [%]

50 40 30

20 10 0 RK

3,125

6,25

12,5

25

50

100 50

0 -50 -100

Koncentrace [µg/l]

0

3,125 6,25

12,5

25

50

Koncentrace [µg/l]

Graf 8 – Mortalita a inhibice reprodukce testovaných jedinců během trvání testu na toxicitu MBZ

Při statistickém zpracování počtu jedinců pomocí analýzy rozptylu ANOVA, s rozšířeným Dunnettovým testem pomocí programu GraphPad Prism byla zjištěna koncentrace 50 µg/l

- 52 -

jako první, která se významně lišila od kontroly. Z toho bylo možné vyhodnotit LOEC = 50 µg/l a NOEC = 25 µg/l. Počet narozených jedinců za celé období testu 800

Kontrola RK 3,125 6,25 12,5 25 50

Počet narozených jedinců

700 600 500 400 300 200 100 0 9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

Čas (dny) Graf 9 – Celkový počet jedinců, narozených během testování toxicity MBZ (21 dní)

Ivermektin V koncentracích 12,5 ng/l a 25 ng/l uhynuly do skončení testu 4 jedinci (mortalita 40 %). V rozpouštědlové kontrole a v koncentracích 1,5625 ng/l a 6,25 ng/l byl úhyn po 1 jedinci (mortalita 10 %), v koncentraci 3,125 ng/l uhynuli 2 jedinci (mortalita 20 %). U IVM byla pozorována vyšší mortalita u dvou nejvyšších koncentrací. Tyto koncentrace měly také největší vliv na reprodukci hrotnatek. V chronickém testu můžeme stanovit EC50 = 27 ng/l, interval spolehlivosti se pohybuje v rozmezí 14 – 52 ng/l. Mortalita testovaných jedinců

Inhibice reprodukce Inibice reprodukce [%]

Mortalita [%]

50

40 30 20 10 0 RK

1,5625 3,125

6,25

12,5

25

Koncentrace [ng/l]

80 60 40 20 0 -20 -40 -60 -80

0

1,5625 3,125 6,25

12,5

Koncentrace [ng/l]

Graf 10 – Mortalita a inhibice reprodukce testovaných jedinců během trvání testu na toxicitu IVM - 53 -

25

Při statistickém zpracování počtu jedinců pomocí analýzy rozptylu ANOVA, s rozšířeným Dunnettovým testem pomocí programu GraphPad Prism byla zjištěna koncentrace 25 ng/l jako první, která se významně lišila od kontroly. Z toho bylo možné vyhodnotit LOEC = 25 ng/l a NOEC = 12,5 ng/l. Počet narozených jedinců za celé období testu 1300

Kontrola RK 1,5625 3,125 6,25 12,5 25

1200 1100 1000

Počet jedinců

900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

Čas (dny)

Graf 11 – Celkový počet jedinců, narozených během testování toxicity IVM (21 dní)

V testu s IVM se projevil poměrně výrazný rozdíl v reprodukci mezi rozpouštědlovou kontrolou a kontrolou. Ve všech ostatních testech tento rozdíl nebyl výrazný. Doramektin V

koncentracích 6,25 ng/l; 12,5 ng/l a 25 ng/l uhynulo do skončení testu

po 2 jedincích (mortalita 20 %). V rozpouštědlové kontrole uhynul 1 jedinec (mortalita 10 %). V koncentraci 3,125 mg/l neuhynul žádný jedinec (mortalita 0 %) a v koncentraci 1,5625 ng/l 3 jedinci (mortalita 30 %).

- 54 -

Mortalita testovaných jedinců

Inhibice reprodukce Inibice reprodukce [%]

Mortalita [%]

40 30 20 10 0 RK

1,5625 3,125

6,25

12,5

25

Koncentrace [ng/l]

40 20 0 0

1,5625 3,125

6,25

12,5

25

-20 -40

Koncentrace [ng/l]

Graf 12 – Mortalita a inhibice reprodukce testovaných jedinců během trvání testu na toxicitu DOR

Při statistickém zpracování počtu jedinců nebylo možné využít analýzy rozptylu ANOVA, byl použit neparametrický Kruskal–Wallisův test s rozšířeným Dunnovým testem. Pomocí programu GraphPad Prism nebyla zjištěna koncentrace, která by se významně lišila od kontroly. Hodnota LOEC je tedy vyšší než 25 ng/l.

Počet narozených jedinců za celé období testu 1200

Kontrola RK 1,5625 3,125 6,25 12,5 25

1100

Počet narozených jedinců

1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

Čas (dny) Graf 13 – Celkový počet jedinců, narozených během testování toxicity DOR (21 dní)

- 55 -

19

20

21

4.3

Zkouška inhibice růstu na Pseudomonas putida U MBZ, IVM a DOR se až do nejvyšší testované koncentrace (pro MBZ 1000 µg/l; pro

IVM 200 mg/l; pro DOR 200 mg/l) neprojevil účinek, který by byl závislý na dávce, nebylo tedy možné vyhodnotit EC50. Praziquantel PZQ byl testován v koncentracích 31,25 – 1000 mg/l. Výsledky průměrné inhibice jsou uvedeny v tabulce 18 a pro lepší vizualizaci zaneseny do grafu 14, včetně chybových úseček. Z námi naměřených dat nebylo možno vypočítat EC50, protože v nejvyšší testované koncentraci (1000 mg/l) bylo dosaženo pouze dvacetiprocentní inhibice růstu. Na základě těchto výsledků můžeme stanovit, že LOEC je větší, než 1000 mg/l. Vyšší koncentrace již nebyly testovány, protože jsou již pro životní prostředí pravděpodobně nerelevantní. V nižších koncentracích bylo naopak možno sledovat stimulaci růstu. Tabulka 18 - Přehled výsledků inhibičního testu pro PZQ Koncentrace [mg/l]

Průměr inhibice [%]

SD

31,25

-7,4

0

62,5

-6,1

0

125

-6,1

0

250

-3,2

0

500

1,8

0

750

23

0

1000

23,9

0

Průměrná inhibice 30,00 25,00

Inhibice [%]

20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 -5,00

-10,00

0

200

400

600

Koncentrace [mg/l]

Graf 14 – Závislost průměrné inhibice růstu P.putida na koncentraci PZQ - 56 -

800

1000

Enrofloxacin EFX byl testován v koncentracích 0,01 – 100 mg/l. Výsledky průměrné inhibice jsou uvedeny v tabulce 19 a pro lepší vizualizaci zaneseny do grafu 15, včetně chybových úseček. Nelineární regresí v programu GraphPad Prism byla získána hodnota EC50 = 0,31 mg/l s 95 % intervalem spolehlivosti v rozmezí 0,11 – 0,87 mg/l. Tabulka 19 - Přehled výsledků inhibičního testu pro EFX Koncentrace [mg/l]

Průměr inhibice [%]

SD

0,01

-20,8

0

0,1

22,3

0

0,25

31,2

0

0,5

61

0

1

90,1

0

10

108,3

0

100

107,6

0

Průměrná inhibice 115,00 95,00

Inhibice [%]

75,00 55,00 35,00 15,00 -5,00 -25,00

0,01

0,1

0,25

0,5

1

Koncentrace [mg/l]

Graf 15 – Závislost průměrné inhibice růstu P.putida na koncentraci EFX

- 57 -

10

100

5

DISKUZE Při testování akutní toxicity byly exponovány hrotnatky různě vysokými koncentracemi

námi vybraných látek – PZQ, MBZ, EFX, IVM a DOR. PZQ byl vybrán, protože jako minoritní látka není v centru zájmu a informací o jeho účincích na životní prostředí není mnoho. EFX byl vybrán jako srovnávací látka z jiné skupiny léčiv (antimikrobiální látka). MBZ byl vybrán z toho důvodu, že jeho bioakumulační faktor naznačuje mírnou bioakumulaci ve vodních organismech. Nicméně i přesto, že byl MBZ v životním prostředí detekován, nebyly v dostupné literatuře nalezeny žádné účinky na organismy, používané v základní baterii testů ekotoxicity (korýši, jednobuněčné řasy). IVM a DOR byly vybrány jako velmi toxické látky. DOR je navíc derivátem IVM a můžeme tak srovnat různou toxicitu zdánlivě stejných látek. V tabulce 20 je přehled zjištěných ekotoxikologických hodnot z provedených testů. Tyto výsledky jsou podrobněji diskutovány níže. Tabulka 20 – Přehled zjištěných ekotoxikologických hodnot Daphnia magna

Název látky akutní

Pseudomonas putida

chronický EC50 = 11 mg/l LOEC = 10 mg/l

PZQ

EC50 = 33 mg/l

LOEC ˃ 1000 mg/l

MBZ

EC50 = 0,11 mg/l

LOEC = 0,05 mg/l

LOEC ˃ 1 mg/l

IVM

EC50 = 80 ng/l

EC50 = 27 ng/l LOEC = 25 ng/l

LOEC ˃ 200 mg/l

DOR

EC50 = 67 ng/l

LOEC ˃ 25 ng/l

LOEC ˃ 200 mg/l

EFX

EC50 = 58 mg/l

-

EC50 = 0,1 mg/l

V akutním testu s PZQ byla zjištěna EC50 = 33 mg/l, zatímco v databázi veterinárních látek je udávána EC50 = 30,1 mg/l. Námi zjištěné hodnoty se tedy shodují s daty udávanými v literatuře. Pokud srovnáme zjištěnou toxicitu pro hrotnatky s jinými vodními organismy, např. se sladkovodní rybou Clarias gariepinus (LC50 > 12 mg/l) (VSDB, 2001) nebo s cizopasným červem sladkovodních ryb Macrogyrodactylus clarii ((E)LC50 = 0,2 – 10 mg/l) (ECOTOX, 2014), můžeme říci, že jsou tyto organismy citlivější na obsah PZQ ve vodě, než hrotnatka. Srovnáme-li tyto hodnoty u akutního a chronického testu (EC50 = 11 mg/l), můžeme zjistit, že tyto hodnoty se řádově neliší, poměr akutních a chronických efektivních koncentrací (acute to chronic ratio - ACR) je tedy výrazně nižší než střední ACR pro testy s D. magna publikované v literatuře (Ahlers et al., 2006). U PZQ byl také pozorovaný účinek

- 58 -

na vývoj hrotnatek. V nejvyšší koncentraci byl pozorován výskyt podstatně menších jedinců oproti ostatním koncentracím. Pro akutní testy s hrotnatkou nebyly pro MBZ v literatuře nalezeny hodnoty LC50 ani EC50. Nemohu tedy porovnat, jak se tyto údaje shodují nebo liší s námi naměřenými hodnotami. Pokud však srovnáme zjištěnou toxicitu pro hrotnatky (EC50 = 0,11 mg/l) s jinými vodními organismy, např. se sladkovodní rybou Clarias gariepinus (LC50 = 267 – 371 mg/l) (ECOTOX, 2014) nebo s parazitickým červem ryb Pseudodactylogyrus sp. (EC100 = 1,5 mg/l) (ECOTOX, 2014), je hrotnatka řádově citlivější na přítomnost MBZ ve vodě. U MBZ byl také pozorovaný účinek na reprodukci hrotnatek. V akutním testu s IVM byla zjištěna EC50 = 80 ng/l, zatímco v dostupné literatuře byla stanovena LC50 = 25 ng/l (Horvat et al, 2012). Námi zjištěné hodnoty jsou sice vyšší, než udává dostupná literatura, řádově se však neliší. Pokud srovnáme zjištěnou toxicitu pro hrotnatky s jinými vodními organismy, např. se sladkovodní rybou Oncorhynchus mykiss (LC50 = 3 mg/l) (VSDB, 2001) nebo s nitěnkou Tubifex tubifex (EC50 = 1,8 mg/l) (ECOTOX, 2014), je hrotnatka ze všech uvedených organismů na IVM nejcitlivější. U IVM byl také pozorovaný účinek na vývoj hrotnatek. Ve dvou nejvyšších koncentracích byla pozorována mortalita skoro poloviny mateřských organismů a menší počet nově narozených jedinců na přeživší hrotnatku. Srovnáme-li opět akutní a chronický test, můžem zjistit, že jejich výsledky se řádově příliš neliší, poměr akutní a chronické toxicity tedy ani u ivermectinu není vysoký. V akutním testu s hrotnatkou byla pro DOR zjištěna EC50 = 67 ng/l, zatímco v dostupné literatuře byla nalezena EC50 = 100 ng/l (Kolodziejska et al., 2013). Námi zjištěné hodnoty jsou nižší, než udává literatura, řádově se však příliš neliší. Pokud srovnáme zjištěnou toxicitu pro hrotnatky např. s jiným modelovým organismem, sladkovodní rybkou Danio rerio (EC50 = 580 µg/l) (ECOTOX, 2014), je hrotnatka k přítomnosti DOR ve vodě řádově citlivější (rozdíl v EC50 je tři řády). Pro chronický test nelze pro DOR stanovit EC50. Analýza rozptylu ANOVA ukázala, že žádná testovaná koncentrace nezpůsobila inhibici reprodukce, která by se významně lišila od kontroly. Pokud srovnáme účinky IVM a DOR na přežití a reprodukci hrotnatky velké, vychází jako toxičtější látka IVM. Provedený akutní testu s hrotnatkou sice ukázal, že DOR je mírně toxičtější než IVM, v dostupné literatuře je tomu ale naopak. Pokud však srovnáme výsledky pro IVM a DOR z chronického testu, měl IVM vyšší mortalitu a také větší inhibici reprodukce.

- 59 -

Z tohoto můžeme usuzovat, že DOR může mít vyšší akutní toxicitu, z dlouhodobějšího hlediska je ale toxičtější IVM. To potvrzují i hodnoty NOEC a LOEC. EFX sloužil pro porovnání s ostatními látkami, proto byl na hrotnatce testován pouze v akutním testu, kde pro něj byla zjištěna EC50 = 58 mg/l, zatímco dostupné literatuře byla stanovena EC50 = 57 mg/l (Park a Choi, 2008). Námi zjištěné hodnoty se tedy shodují s daty, které uvádí literatura. Pokud srovnáme zjištěnou toxicitu EFX pro hrotnatky např. se sladkovodní rybou Oncorhynchus mykiss (96hLC50 > 10 mg/) (Park a Choi, 2008), je hrotnatka k přítomnosti EFX ve vodě méně citlivá. Test inhibice reprodukce hrotnatky na EFX byl prováděn v rámci jiného projektu, jeho výsledky nejsou v rámci této diplomové práce prezentovány. Antiparazitika mají ve srovnání s antimikrobiálními látkami jiný mechanismus účinku – jejich cílem jsou jiné metabolické pochody. Může se proto stát, že v bakteriálním testu tyto látky nebudou vyklazovat žádný účinek závislý na dávce, jak se stalo v testu s MBZ, IVM a DOR (výsledky nejsou prezentovány). V dostupné literatuře nebyly nalezeny údaje o účincích antiparazitik v bakteriálních testech toxicity, proto nemohu tuto hypotézu s jistotou potvrdit. U PZQ byl jistý účinek závislý na dávce pozorován, inhibice růstu však ani v nejvyšší koncentraci nedosáhla 50 %. Jediná z námi vybraných látek, která má prokazatelný účinek na růst bakterie Pseudomonas putida, je tedy EFX, u kterého jako u antibiotika byl tento účinek očekáván. Pro EFX se podařilo zjistit EC50 = 0,31 mg/l s 95 % intervalem spolehlivosti v rozmezí 0,11 – 0,87 mg/l. Zjištěné koncentrační hladiny vybraných léčiv v životním prostředí jsou dle dostupné literatury nízké, ale pro necílové organismy mohou představovat vysoké riziko. Například u MBZ byly akutním testem zjištěny koncentrace s negativním účinkem na necílové organismy (EC50 = 110 μg/l) v podstatě ve stejných řádech, jako byly detekovány ve Španělsku v řece Llobregat (90,4 – 93,8 μg/l) (Zurncic et al., 2014). Z toho plyne, že MBZ by v životním prostředí mohl mít již akutní účinky na živé organismy. Koncentrace s prokazatelným účinkem na reprodukci (50 µg/l) je dokonce nižší než koncentrace detekované v ŽP, což je alarmující výsledek. U ostatních látek byly sice zjištěny vyšší koncentrace než ty, které byly detekovány v životním prostředí, přesto by výskyt veterinárních farmak v životním prostředí a riziko jejich účinků na necílové organismy neměl být podceňován.

- 60 -

6

ZÁVĚR V teoretické části této diplomové práce byla vypracována rešerše zaměřená na výskyt,

efekty a riziko vyplývající z přítomnosti veterinárních léčiv – zejména antiparazitik – v životním prostředí, zejména ve vodním ekosystému. Na základě dostupné literatury pak bylo vybráno dohromady pět látek (z toho čtyři antiparazitární a jedno antibakteriální léčivo) a byla vypracována rešerše na výskyt těchto látek ve vodním prostředí a jejich ekotoxicitu. V experimentální části byl testován účinek vybraných veterinárních léčiv na dva modelové organismy (sladkovodní korýš hrotnatka velká a bakterie Pseudomonas putida). Pro hodnocení toxicity byly provedeny na hrotnatce testy akutní a chronický (reprodukční), pro P. putida byl použit test inhibice růstu. Výsledky studie byly v diskuzi srovnány mezi sebou na citlivost jednotlivých organismů k daným léčivům a toxicitu jednotlivých léčiv. Nejtoxičtější látkou zjištěnou akutním testem na hrotnatce byl DOR, následovaný IVM, MBZ, PZQ a EFX. V chronickém testu s hrotnatkou bylo pak zjištěno, že z dlouhodobého hlediska má největší vliv na vývoj a reprodukci hrotnatky IVM, následovaný DOR, MBZ a PZQ. Testem inhibice růstu, použitým na P. putida byla prokázána citlivost P. putida na přítomnost EFX v prostředí. Efektivní koncentrace některých látek byly velmi podobné koncentracím detekovaným v ŽP, u MBZ byly naměřené efektivní koncentrace dokonce nižší než koncentrace v ŽP. Tyto výsledky naznačují, že by výskyt veterinárních farmak v životním prostředí a riziko jejich účinků na necílové organismy neměl být podceňován.

- 61 -

7 7.1  



 



 

     



  

SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ Publikace Ayscough, K. (2000). Endocytosis and the development of cell polarity in yeast require a dynamic F–actin cytoskeleton. Current Biology 10, 1587–1590. J. Ahlers, C. Riedhammer, M. Vogliano, R.-U. Ebert, R. Kuehne, and G. Schueuermann (2006). Acute to chronic ratios in aquatic toxicity - Variation across trophic levels and relationship with chemical structure. Environmental Toxicology and Chemistry. 25, 2937-2945 Babic, S., Pavlovic, D.M., Aperger, D., Perisa, M., Zrncic, M., Horvat, A.J.M., and Kastelan–Macan, M. (2010). Determination of multi–class pharmaceuticals in wastewater by liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC–MS–MS). Analytical and Bioanalytical Chemistry 398, 1185–1194. Bardoděj, Z. (1999). Úvod do chemické toxikologie, Vol 1. (Praha: Karolinum). Bodeček, Štěpán; Koudela, Břetislav. Veterinární a chovatelská opatření proti vnitřním parazitům u koní. S.1–11. Dostupnéz: http://cehis.cz/publik_syst/files11/Veterinarni%20a%20chovatelska%20opatreni%20proti%20vnitrnim%20 parazitum%20u%20koni.pdf Brinke, M., Hoess, S., Fink, G., Ternes, T.A., Heininger, P., and Traunspurger, W. (2010). Assessing effects of the pharmaceutical ivermectin on meiobenthic communities using freshwater microcosms. Aquatic Toxicology 99, 126–137. Cleuvers, M. (2003). Aquatic ecotoxicity of pharmaceuticals including the assessment of combination effects. Toxicology Letters 142, 185–194. Croes, K., De Coster, S., De Galan, S., Morrens, B., Loots, I., Van de Mieroop, E., Nelen, V., Sioen, I., Bruckers, L., Nawrot, T., et al. (2014). Health effects in the Flemish population in relation to low levels of mercury exposure: From organ to transcriptome level. International Journal of Hygiene and Environmental Health 217, 239–247. ČSN EN ISO 10760 (2000). Jakost vod – Stanovení chronické toxicity látek pro Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea). Praha: Český normalizační institut. ČSN EN ISO 6341 (1997). Jakost vod – Stanovení inhibice pohyblivosti Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) – Zkouška akutní toxicity. Praha: Český normalizační institut. Davies, J., and Davies, D. (2010). Origins and Evolution of Antibiotic Resistance. Microbiology and Molecular Biology Reviews 74, 417. Dayan, A.D. (2003). Albendazole, mebendazole and praziquantel. Review of non–clinical toxicity and pharmacokinetics. Acta Tropica 86, 141–159. De, J. (2004). Mercury–resistant marine bacteria and their role in bioremediation of certain toxicants. De Liguoro, M., Di Leva, V., Dalla Bona, M., Merlanti, R., Caporale, G., and Radaelli, G. (2012). Sublethal effects of trimethoprim on four freshwater organisms. Ecotoxicology and Environmental Safety 82, 114– 121. Deleebeeck, N.M.E., De Schamphelaere, K.A.C., Heijerick, D.G., Bossuyt, B.T.A., and Janssen, C.R. (2008). The acute toxicity of nickel to Daphnia magna: Predictive capacity of bioavailability models in artificial and natural waters. Ecotoxicology and Environmental Safety 70, 67–78. Ebert, Dieter (2005). Ecology, epidemiology, and evolution of parasitism in Daphnia. Bethesda, MD: National Library of Medicine (US), National Center for Biotechnology Information. ISBN 19–328–1106–0. Fent, K., Weston, A.A., and Caminada, D. (2006). Ecotoxicology of human pharmaceuticals. Aquatic Toxicology 76, 122–159. Ferreira, C.S.G., Nunes, B.A., de Melo Henriques–Almeida, J.M., and Guilhermino, U. (2007). Acute toxicity of oxytetracycline and florfenicol to the microalgae Tetraselmis chuii and to the crustacean Artemia parthenogenetica. Ecotoxicology and Environmental Safety 67, 452–458.

- 62 -





 

 



 







 



  

Garric, J., Vollat, B., Duis, K., Pery, A., Junker, T., Ramil, M., Fink, G., and Ternes, T.A. (2007). Effects of the parasiticide ivermectin on the cladoceran Daphnia magna and the green alga Pseudokirchneriella subcapitata. Chemosphere 69, 903–910. Golet, E.M., Alder, A.C., Hartmann, A., Ternes, T.A., and Giger, W. (2001). Trace determination of fluoroquinolone antibacterial agents in solid–phase extraction urban wastewater by and liquid chromatography with fluorescence detection. Analytical Chemistry 73, 3632–3638. Green, J. (1956). growth, size and reproduction in daphnia (crustacea: cladocera)*. Proceedings of the Zoological Society of London 126, 173–204. Guerra, P., Kim, M., Shah, A., Alaee, M., and Smyth, S.A. (2014). Occurrence and fate of antibiotic, analgesic/anti–inflammatory, and antifungal compounds in five wastewater treatment processes. Science of the Total Environment 473, 235–243. Halley, B., Vandenheuvel, W., and Wislocki, P. (1993). Environmental–effects of the usage of avermectins in livestock. Veterinary Parasitology 48, 109–125. Halling–Sorensen, B., Nielsen, S.N., Lanzky, P.F., Ingerslev, F., Lutzhoft, H.C.H., and Jorgensen, S.E. (1998). Occurrence, fate and effects of pharmaceutical substances in the environment – A review. Chemosphere 36, 357–394. Hempel, H., Scheffczyk, A., Schallnass, H.J., Lumaret, J.P., Alvinerie, M., and Rombke, J. (2006). Toxicity of four veterinary parasiticides on larvae of the dung beetle Aphodius constans in the laboratory. Environmental Toxicology and Chemistry 25, 3155–3163. Hirsch, R., Ternes, T., Haberer, K., and Kratz, K.L. (1999). Occurrence of antibiotics in the aquatic environment. Science of the Total Environment 225, 109–118. Holopainen, S., Luukkonen, V., Nousiainen, M., and Sillanpaa, M. (2013). Determination of chlorophenols in water by headspace solid phase microextraction ion mobility spectrometry (HS–SPME–IMS). Talanta 114, 176–182. HOLOUBEK, Ivan (2001). Persistentní organické polutanty [online]. Brno: Ministerstvo životního prostředí, 12 s. [cit. 2014–03–01]. Dostupné z: http://www.mzp.cz/osv/edice.nsf/A0750BCC7925B390C1256FAF0048ADF9/$file/chlatky1.pdf Horvat, A.J.M., Petrovic, M., Babic, S., Pavlovic, D.M., Asperger, D., Pelko, S., Mance, A.D., and Kastelan– Macan, M. (2012). Analysis, occurrence and fate of anthelmintics and their transformation products in the environment. Trac–Trends in Analytical Chemistry 31, 61–84. Igbinosa, E.O., Odjadjare, E.E., Chigor, V.N., Igbinosa, I.H., Emoghene, A.O., Ekhaise, F.O., Igiehon, N.O., and Idemudia, O.G. (2013). Toxicological Profile of Chlorophenols and Their Derivatives in the Environment: The Public Health Perspective. Scientific World Journal. Isidori, M., Lavorgna, M., Nardelli, A., Pascarella, L., and Parrella, A. (2005). Toxic and genotoxic evaluation of six antibiotics on non–target organisms. Science of the Total Environment 346, 87–98. Jo, H.J., Choi, J.W., Lee, S.H., and Hong, S.W. (2012). Acute toxicity of Ag and CuO nanoparticle suspensions against Daphnia magna: The importance of their dissolved fraction varying with preparation methods. Journal of Hazardous Materials 227–228, 301–308. Johnson, A.C., Oldenkamp, R., Dumont, E., and Sumpter, J.P. (2013). Predicting concentrations of the cytostatic drugs cyclophosphamide, carboplatin, 5–fluorouracil, and capecitabine throughout the sewage effluents and surface waters of europe. Environmental Toxicology and Chemistry 32, 1954–1961. Jorgensen, S.E., and Halling–Sorensen, B. (2000). Drugs in the environment. Chemosphere 40, 691–699. Kemper, N. (2008). Veterinary antibiotics in the aquatic and terrestrial environment. Ecological Indicators 8, 1–13. Kim, J., Park, J., Kim, P.–G., Lee, C., Choi, K., and Choi, K. (2010). Implication of global environmental changes on chemical toxicity–effect of water temperature, pH, and ultraviolet B irradiation on acute toxicity of several pharmaceuticals in Daphnia magna. Ecotoxicology 19, 662–669.

- 63 -

    



     

 

  







Klüttgen, B., Dülmer, U., Engels, M. & Ratte, H.T. (1994) ADaM, an artificial freshwater for the culture of Daphnia. Water Research, 28, 743–746. Kohler, P. (2001). The biochemical basis of anthelmintic action and resistance. International Journal For Parasitology 31, 336–345. Koivisto, S. (1995). Is Daphnia magna an ecologically representative zooplankton species in toxicity tests? Environmental Pollution 90, 263–267. Kolar, L., Erzen, N.K., Hogerwerf, L., and van Gestel, C.A.M. (2008). Toxicity of abamectin and doramectin to soil invertebrates. Environmental Pollution 151, 182–189. Kolodziejska, M., Maszkowska, J., Bialk–Bielinska, A., Steudte, S., Kumirska, J., Stepnowski, P., and Stolte, S. (2013). Aquatic toxicity of four veterinary drugs commonly applied in fish farming and animal husbandry. Chemosphere 92, 1253–1259. Kristiansson, E., Fick, J., Janzon, A., Grabic, R., Rutgersson, C., Weijdegard, B., Soderstrom, H., and Larsson, D.G.J. (2011). Pyrosequencing of Antibiotic–Contaminated River Sediments Reveals High Levels of Resistance and Gene Transfer Elements. Plos One 6. Kümmerer, K. (2001). Drugs in the environment: emission of drugs, diagnostic aids and disinfectants into wastewater by hospitals in relation to other sources – a review. Chemosphere 45, 957–969. Kümmerer, K. (2008). Pharmaceuticals in the environment. 3rd rev. and enl. ed. Berlin: Springer, 2008. ISBN 978–354–0746–645. Kümmerer, K. (2009). Antibiotics in the aquatic environment – A review – Part I. Chemosphere 75, 417– 434. KVĚTINA, Jaroslav, Josef HERINK a Marie VOPRŠALOVÁ. Základy farmakologie. Vyd. 1. Brno: Veterinární a farmaceutická univerzita, Farmaceutická fakulta, 2000, 233 s. ISBN 80–730–5391–8. Lawrence, J.R., Swerhone, G.D.W., Wassenaar, L.I., and Neu, T.R. (2005). Effects of selected pharmaceuticals on riverine biofilm communities. Canadian Journal of Microbiology 51, 655–669. Lefnerová, Danuše; Šimůnek, Jan (2012). Faculty Of Medicine. Antibiotika: Doplňkový výukový text z mikrobiologie pro studium výživy člověka. Brno. Dostupné z: http://www.med.muni.cz/dokumenty/pdf/atb.pdf Lehmler, H.–J., He, X., Li, X., Duffel, M.W., and Parkin, S. (2013). Effective synthesis of sulfate metabolites of chlorinated phenols. Chemosphere 93, 1965–1971. Leung, H.W., Jin, L., Wei, S., Tsui, M.M.P., Zhou, B.S., Jiao, L.P., Cheung, P.C., Chun, Y.K., Murphy, M.B., and Lam, P.K.S. (2013). Pharmaceuticals in Tap Water: Human Health Risk Assessment and Proposed Monitoring Framework in China. Environmental Health Perspectives 121, 839–846. Li, W. C. (2014). Occurrence, sources, and fate of pharmaceuticals in aquatic environment and soil. Environmental Pollution, 187, 193-201. Lu, G.H., Li, Z.H., and Liu, J.C. (2013). Effects of selected pharmaceuticals on growth, reproduction and feeding of daphnia magna. Fresenius Environmental Bulletin 22, 2583–2589. Manickum, T., and John, W. (2014). Occurrence, fate and environmental risk assessment of endocrine disrupting compounds at the wastewater treatment works in Pietermaritzburg (South Africa). Science of the Total Environment 468, 584–597. Mansour, S.A., and Gad, M.F. (2010). Risk assessment of pesticides and heavy metals contaminants in vegetables: A novel bioassay method using Daphnia magna Straus. Food and Chemical Toxicology 48, 377– 389. Martinez–Carballo, E., Gonzalez–Barreiro, C., Scharf, S., and Gans, O. (2007). Environmental monitoring study of selected veterinary antibiotics in animal manure and soils in Austria. Environmental Pollution 148, 570–579. Mellon, Margaret, Charles Benbrook a Karen Lutz Benbrook. Hogging It: Estimates of Antimicrobial Abuse in Livestock 2001. s. 1–14. Dostupné z: http://www.ucsusa.org/assets/documents/food_and_agriculture/hog_front.pdf - 64 -



  

     

 





 

 

  

Meyer, B., Pailler, J.Y., Guignard, C., Hoffmann, L., and Krein, A. (2011). Concentrations of dissolved herbicides and pharmaceuticals in a small river in Luxembourg. Environmental Monitoring and Assessment 180, 127–146. Mitchell, M.A. (2006). Enrofloxacin. Journal of Exotic Pet Medicine 15, 66–69. Montero, R., and Ostrosky, P. (1997). Genotoxic activity of Praziquantel. Mutation Research–Reviews in Mutation Research 387, 123–139. Morley, N.J. (2009). Environmental risk and toxicology of human and veterinary waste pharmaceutical exposure to wild aquatic host–parasite relationships. Environmental Toxicology and Pharmacology 27, 161–175. OECD Test No. 211: Daphnia magna Reproduction Test (OECD Publishing). Oka, H., Ito, Y., and Matsumoto, H. (2000). Chromatographic analysis of tetracycline antibiotics in foods. Journal of Chromatography A 882, 109–133. Park, S., and Choi, K. (2008). Hazard assessment of commonly used agricultural antibiotics on aquatic ecosystems. Ecotoxicology 17, 526–538. Pierini, E., Famiglini, G., Mangani, F., and Cappiello, A. (2004). Fate of enrofloxacin in swine sewage. Journal of Agricultural and Food Chemistry 52, 3473–3477. Ratte, H.T., Hammers–Wirtz, M., and Cleuvers, M. (2003). Chapter 7 Ecotoxicity testing. In Trace Metals and other Contaminants in the Environment, A.M.B.a.H.G.Z. B.A. Markert, ed. (Elsevier), pp. 221–256. Reid, B.J., Jones, K.C., and Semple, K.T. (2000). Bioavailability of persistent organic pollutants in soils and sediments – a perspective on mechanisms, consequences and assessment. Environmental Pollution 108, 103–112. Richardson, S., and Ternes, T. (2011). Water Analysis: Emerging Contaminants and Current Issues. Analytical Chemistry 83, 4614–4648. Rocha, R., Goncalves, F., Marques, C., and Nunes, B. (2014). Environmental effects of anticholinesterasic therapeutic drugs on a crustacean species, Daphnia magna. Environmental Science and Pollution Research 21, 4418–4429. Sanderson, H., Laird, B., Pope, L., Brain, R., Wilson, C., Johnson, D., Bryning, G., Peregrine, A., Boxall, A., and Solomon, K. (2007). Assessment of the environmental fate and effects of ivermectin in aquatic mesocosms. Aquatic Toxicology 85, 229–240. Schmahl, G., and Taraschewski, H. (1987). Treatment of fish parasites .2. Effects of praziquantel, niclosamide, levamisole–hcl, and metrifonate on monogenea (gyrodactylus–aculeati, diplozoon– paradoxum). Zeitschrift Fur Parasitenkunde–Parasitology Research 73, 341–351. Seco, J.I., Fernandez–Pereira, C., and Vale, J. (2003). A study of the leachate toxicity of metal–containing solid wastes using Daphnia magna. Ecotoxicology and Environmental Safety 56, 339–350. Smutná, M., Babica, P., Jarque, S., Hilscherová, K., Maršálek, B., Haeba, M., and Bláha, L. (2014). Acute, chronic and reproductive toxicity of complex cyanobacterial blooms in Daphnia magna and the role of microcystins. Toxicon 79, 11–18. Stankovic, S., Kalaba, P., and Stankovic, A.R. (2014). Biota as toxic metal indicators. Environmental Chemistry Letters 12, 63–84. Svensson, J., Fick, J., Brandt, I., and Brunstrom, B. (2014). Environmental concentrations of an androgenic progestin disrupts the seasonal breeding cycle in male three–spined stickleback (Gasterosteus aculeatus). Aquatic Toxicology 147, 84–91. Tisler, T., and Erzen, N.K. (2006). Abamectin in the aquatic environment. Ecotoxicology 15, 495–502. Ton, S.–S., Chang, S.–H., Hsu, L.–Y., Wang, M.–H., and Wang, K.–S. (2012). Evaluation of acute toxicity and teratogenic effects of disinfectants by Daphnia magna embryo assay. Environmental Pollution 168, 54–61. van der Aa, M., Bijlsma, L., Emke, E., Dijkman, E., van Nuijs, A.L.N., van de Ven, B., Hernandez, F., Versteegh, A., and de Voogt, P. (2013). Risk assessment for drugs of abuse in the Dutch watercycle. Water Research 47, 1848–1857. - 65 -



 

   



7.2 

  



 

  

Vazquez–Roig, P., Andreu, V., Blasco, C., and Pico, Y. (2012). Risk assessment on the presence of pharmaceuticals in sediments, soils and waters of the Pego–Oliva Marshlands (Valencia, eastern Spain). Science of the Total Environment 440, 24–32. Vijan, L.E., and Giosanu, D. (2012). Binding of norfloxacin, enoxacin and enrofloxacin to calf thymus dna. Revue Roumaine De Chimie 57, 823–827. Webb, L., Beaumont, D.J., Nager, R.G., and McCracken, D.I. (2010). Field–scale dispersal of Aphodius dung beetles (Coleoptera: Scarabaeidae) in response to avermectin treatments on pastured cattle. Bulletin of Entomological Research 100, 175–183. Wei, R.C., Ge, F., Chen, M., and Wang, R. (2012). Occurrence of Ciprofloxacin, Enrofloxacin, and Florfenicol in Animal Wastewater and Water Resources. Journal of Environmental Quality 41, 1481–1486. Wollenberger, L., Halling–Sorensen, B., and Kusk, K.O. (2000). Acute and chronic toxicity of veterinary antibiotics to Daphnia magna. Chemosphere 40, 723–730. Yoshimura, H., and Endoh, Y.S. (2005). Acute toxicity to freshwater organisms of antiparasitic drugs for veterinary use. Environmental Toxicology 20, 60–66. Zenker, A., Cicero, M.R., Prestinaci, F., Bottoni, P., and Carere, M. (2014). Bioaccumulation and biomagnification potential of pharmaceuticals with a focus to the aquatic environment. Journal of Environmental Management 133, 378–387. Zurncic, M., Gros, M., Babic, S., Kastelan–Macan, M., Barcelo, D., and Petrovic, M. (2014). Analysis of anthelmintics in surface water by ultra high performance liquid chromatography coupled to quadrupole linear ion trap tandem mass spectrometry. Chemosphere 99, 224–232.

Digitální zdroje Antibiotické růstové stimulátory v živočišné výrobě v USA a v EU. MAREK, Vlastimil. Http://eagri.cz [online]. 2012 [cit. 2014–01–04]. Dostupné z: http://eagri.cz/public/web/mze/potraviny/bezpecnost– potravin/antibioticke–rustove–stimulatory–v.html Antiparazitikum. In: MAREK, Vlastimil. Http://www.vitalion.cz/ [online]. Praha, 2012 [cit. 2014–12–25]. Dostupné z: http://leky.vitalion.cz/antiparazitikum/ Clare, J. "Daphnia: An aquarist's guide" [online]. 2002 [cit. 05-03-2013] Dostupné z : http://www.caudata.org/daphnia/#anatomy. DOBŠÍKOVÁ, Radka. FARMAKOLOGIE V PRODUKCI POTRAVIN: Anthelmintika – antinematoda. In: FARMAKOLOGIE V PRODUKCI POTRAVIN [online]. 2012 [cit. 2014–03–27]. Dostupné z: http://cit.vfu.cz/farmvpp/stranky/farm3.htm DrugBank 4.0: shedding new light on drug metabolism. Law V, Knox C, Djoumbou Y, Jewison T, Guo AC, Liu Y, Maciejewski A, Arndt D, Wilson M, Neveu V, Tang A, Gabriel G, Ly C, Adamjee S, Dame ZT, Han B, Zhou Y, Wishart DS.Nucleic Acids Res. 2014 Jan 1;42(1):D1091-7. ECOTOX Database. United States Environmental Protection Agency [online]. 2014 [cit. 2014-05-03]. Dostupné z: http://cfpub.epa.gov/ecotox/advanced_query.htm FORNEY, Barbara. Enrofloxacin for Veterinary Use. In: Wedgewood Pharmacy [online]. 2004 [cit. 2014–04– 16]. Dostupné z: http://www.wedgewoodpetrx.com/learning–center/professional– monographs/enrofloxacin–for–veterinary–use.htmlWHO Collaborating Centre for Drug Statistics Methodology: http://www.whocc.no/ HAMILTON, Kris. Pseudomonas putida. In: Missouri University of Science and Technology [online]. 2007 [cit. 2014–02–09]. Dostupné z: http://web.mst.edu/~microbio/bio221_2007/P_putida.htm Hazardous Substances Data Bank (HSDB). TOXNET: Toxicology Data Network [online]. 2012 [cit. 2014-0503]. Dostupné z: http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/htmlgen?HSDB MEBENDAZOLE. In: Hazardous Substances Data Bank (HSDB): – Comprehensive, peer–reviewed toxicology data for about 5,000 chemicals. [online]. 2006 [cit. 2014–03–27]. Dostupné z: http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi–bin/sis/search/f?./temp/~qB8t7u:1 - 66 -

    

NINGTHOUJAM, Sandhyarani. Pseudomonas Putida. Buzzle: Inteligent Life on the Web [online]. November 18, 2010, [cit. 2014–04–05]. Dostupné z: http://www.buzzle.com/articles/pseudomonas–putida.html Parasities of Livestock, Dogs and Cats. Parasitipedia [online]. 2013 [cit. 2014-05-03]. Dostupné z: http://parasitipedia.net/index.php?option=com_content&view=article&id=2391&Itemid=2654 Veterinary New Drug List. Health Canada [online]. 2014 [cit. 2014–03–27]. Dostupné z: http://www.hc– sc.gc.ca/dhp–mps/vet/legislation/guide–ld/vet_drug–drogues_list–eng.php#l VSDB: Veterinary Substances DataBase. University of Hertfordshire [online]. Hertfordshire: University of Hertfordshire Press, c2001 [cit. 2014-05-03]. Dostupné z: http://sitem.herts.ac.uk/aeru/vsdb/atoz.htm W.H.O. Pharmaceuticals in Drinking–water. Technical report [online]. 2012 [cit. 2014–03–24]. Dostupné z: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/44630/1/9789241502085_eng.pdf?ua=1

- 67 -