SKRINING, ISOLASI, DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI METABOLIT BIOAKTIF JAMUR ENDOFIT DARI TANAMAN KINA (Cinchona pubescens Vahl.)

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

SKRINING, ISOLASI, DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI METABOLIT BIOAKTIF JAMUR ENDOFIT DARI TANAMAN KINA (Cinchona pubescens Vahl.)

SKRIPSI

NURUL ROBIATUL ADAWIYAH 109102000056

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA OKTOBER 2013

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA


SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

NURUL ROBIATUL ADAWIYAH 109102000056

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA OKTOBER 2013 ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya sendiri, dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk telah saya nyatakan dengan benar.

Nama

: Nurul Robiatul Adawiyah

NIM

: 109102000056

Tanda Tangan

:

Tanggal

: 2 Oktober 2013

iii

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI

Skripsi ini diajukan oleh : Nama : Nurul Robiatul Adawiyah NIM : 109102000056 Program Studi : Farmasi Judul Skripsi : Skrining, Isolasi, dan Uji Aktivitas Antibakteri Metabolit Bioaktif Jamur Endofit dari Tanaman Kina (Cinchona pubescens Vahl.)

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

DEWAN PENGUJI Pembimbing 1 : Dr. Andria Agusta

(

)

Pembimbing 2 : Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.Si., Apt.

(

)

Penguji

1 : Ismiarni Komala, M.Sc., Ph.D., Apt.

(

)

Penguji

2 : Puteri Amelia M.Farm., Apt.

(

)

Ditetapkan di : Jakarta Tanggal : 2 Oktober 2013

v

ABSTRAK

Nama Program Studi Judul

: Nurul Robiatul Adawiyah : Farmasi : Skrining, Isolasi, dan Uji Aktivitas Antibakteri Metabolit Bioaktif Jamur Endofit dari Tanaman Kina (Cinchona pubescens Vahl.)

Jamur endofit diketahui berpotensi sebagai sumber metabolit bioaktif untuk bahan obat-obatan salah satunya sebagai antibakteri. Dalam penelitian ini, skrining aktivitas antibakteri metabolit bioaktif terhadap 10 isolat jamur endofit dari tanaman Cinchona pubescens Vahl. telah dilakukan. Hasil skrining antibakteri dengan metode bioautografi menunjukkan bahwa ekstrak kloroform jamur endofit 3-2-1-2 dan 1-3-1-1 aktif sebagai antibakteri terhadap bakteri uji Staphylococus aureus dan Escherichia coli. Jamur endofit 1-3-1-1 yang memiliki aktivitas antibakteri paling besar di scaling up pada medium PDB (Potato Dextrose Broth) dan dikultivasi selama 3 minggu. Medium kultivasi dan biomassa jamur diekstraksi dengan kloroform dan difraksinasi untuk mendapatkan senyawa bioaktifnya. Kemudian dilakukan penentuan nilai KHM (Kadar Hambat Minimum) dari fraksi murni 3e dengan metode mikrodilusi terhadap bakteri uji Staphylococus aureus dan Escherichia coli. Hasil uji KHM menunjukkan bahwa fraksi 3e memiliki nilai MIC 32 µg/ml terhadap bakteri uji Staphylococus aureus dan >128 µg/ml terhadap bakteri uji Escherichia coli.

Key words : Kina, Cinchona pubescens Vahl., jamur endofit, antibakteri, bioautografi, KHM (Kadar Hambat Minimum).

vi

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name Program Study Title

: Nurul Robiatul Adawiyah : Farmasi : Screening, Isolation, and Antibacterial Activity of Bioactive Metabolites of Endophytic Fungi associated with Kina (Cinchona pubescens Vahl.)

Endophytic fungi are known as a potential source of bioactive metabolites for pharmaceutical products including antibacterial. In this study, screening of bioactive metabolites from 10 isoloates of endophytic fungi associated with Cinchona pubescens Vahl. for its antibacterial activity has been performed. The results assayed with bioautography method showed that the chloroform extract of endophytic fungi 3-2-1-2 and 1-3-1-1 were active againts Staphylococcus aureus and Escherichia coli. The endophytic fungus 1-3-1-1 that have the greatest antibacterial activity was scaled up in PDB medium (Potato Dextrose Broth) and cultivated for 3 weeks. The cultivation medium and the fungus biomass were extracted with chloroform and fractionated in order to get the bioactive compounds. The pure fraction, 3e was then evaluated for its MIC againts Staphylococcus aureus and Escherichia coli using microdilution method. The results showed that fraction of 3e inhibited Staphylococcus aureus and Escherichia coli growth with MIC of 32 µg/ml and >128 µg/ml partially, respectively.

Kata kunci : Kina, Cinchona pubescens Vahl., endophytic fungi, antibacterial, bioautography, MIC (Minimum Inhibitory Concentration).

vii


KATA PENGANTAR

Bismillahirrahmanirrahim Alhamdulillahirabbil’alamin, puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan

segala

rahmat

dan

karunia-Nya,

sehingga

penulis

dapat

menyelesaikan penulisan skripsi dengan judul “Skrining, Isolasi, dan Uji Aktivitas Antibakteri Senyawa Bioaktif Jamur Endofit dari Tanaman Kina (Cinchona pubescens Vahl.)”. Shalawat serta salam semoga senantiasa tercurah limpahkan pada Nabi Muhammad SAW beserta para keluarga, sahabat, dan tabi’in tabi’atnya. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat kelulusan tingkat sarjana di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Penelitian ini tidaklah dapat terselesaikan tanpa dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Dalam kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terimakasih terkhususkan kepada: 1.

Bapak Dr. Andria Agusta selaku pembimbing I dan Ibu Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.Si., Apt. selaku pembimbing II, yang telah meluangkan waktu, tenaga, dan pikiran serta dengan sabar membimbing dan mengajari penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.

2.

Kementrian Agama RI selaku pemberi beasiswa, sehingga penulis dapat mengenyam pendidikan di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.

Bapak Prof. Dr. dr. (hc). MK. Tadjudin, Sp.And. selaku Dekan Fakultas kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

4.

Bapak Drs. Umar Mansur M.Sc. selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

5.

Ibu/Bapak Dosen dan Staf Akademika Program Studi Farmasi Fakultas kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah memberikan ilmunya kepada penulis.

6.

Ibu Dr. Ir. Praptiwi, M. Agr., Ibu Dra. Yuliasri Jamal, M. Si., Kang Asep, Teh Dewi, Mba Dewi, Mas Tony, Mas Mustofa yang telah banyak membantu penulis di laboratorium Fitokimia LIPI.

viii


7.

Ayahanda tercinta, Bapak Moch. Jaja Zaenudin dan Ibunda tercinta, Ibu Rosliawati S.Pd. terima kasih atas doa yang selalu tercurah untukku, kasih sayang, semangat, dan dukungannya yang menguatkan penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

8.

Adikku tersayang Intan Nurlatifatul Hasanah dan Muhammad Fauzan Fathurrahman yang selalu mendukung, mendoakan, dan menghibur disaat penulis kesulitan.

9.

Sahabat-sahabatku yakni Ainul Mardiah, Eva Nurlatifah, Citra Rahmawati, Neng Nuramania, Setiawan Maulani, Siti Sa’adah Hanifah, Sri Mulyanti, Nia Habibatussa’diah, dan Sri Nurjannah yang selalu memberikan dukungan kepada penulis.

10. Teman-teman seperjuangan yakni Luthfiana, Nurul Fithriyah, Leliana N. Wachidah, Farichah Mansurah, Dyah Mundir Sari, Neneng Nurhalimah, Churmatul Walidah, Ferry Indar A., M. Muwaffaq Zakky, Fakhrul Umam, Yunita Sari, Vita fitria, dan Eriska Boru Saragih. 11. Keluarga besar CSS MoRA 2009, Farmasi 2009, dan AS-SHOF 2009, terima kasih atas sebuah persahabatan dan persaudaraan selama ini.

Dengan keterbatasan pengalaman, pengetahuan, maupun pustaka yang ditinjau, penulis menyadari bahwa dalam skripsi ini terdapat banyak kekurangan. Untuk itu penulis sangat mengharapkan kritik dan saran konstruktif. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi kepentingan keilmuan maupun aplikasi di bidang kesehatan.

Jakarta, 2 Oktober 2013

Penulis

ix


HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama

: Nurul Robiatul Adawiyah

NIM

: 109102000056

Program Studi

: Farmasi

Fakultas

: Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya

: Skripsi

demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya, dengan judul :


untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta. Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di

: Jakarta

Pada tanggal : 2 Oktober 2013

Yang menyatakan,

(Nurul Robiatul Adawiyah)

x


DAFTAR ISI

Halaman HALAMAN JUDUL ............................................................................ HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ............................... HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................ HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ............................................. ABSTRAK ............................................................................................ ABSTRACT .......................................................................................... KATA PENGANTAR .......................................................................... HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ......... DAFTAR ISI ......................................................................................... BAB 1 PENDAHULUAN ................................................................ 1.1 Latar Belakang ....................................................................... 1.2 Rumusan Masalah .................................................................. 1.3 Tujuan Penelitian ................................................................... 1.4 Manfaat Penelitian ................................................................. BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ...................................................... 2.1 Jamur Endofit ........................................................................ 2.2 Tanaman Kina (Cinchona pubescens Vahl.) ......................... 2.2.1 Sejarah Singkat .......................................................... 2.2.2 Klasifikasi .................................................................. 2.2.3 Deskripsi .................................................................... 2.2.4 Khasiat ....................................................................... 2.2.5 Kandungan Kimia ...................................................... 2.3 Kromatografi ......................................................................... 2.3.1 Kromatografi Kolom ................................................. 2.3.2 KLT (Kromatografi Lapis Tipis) ............................... 2.4 Antimikroba ........................................................................... 2.5 Metode Skrining Antimikroba ............................................... 2.5.1 Metode Difusi ............................................................ 2.5.2 Metode Dilusi ............................................................ 2.5.3 Metode Bioautografi .................................................. 2.6 Bakteri Uji ............................................................................. 2.6.1 Staphylococcus aureus .............................................. 2.6.2 Escherichia coli ......................................................... BAB 3 METODE PENELITIAN ..................................................... 3.1 Waktu dan Tempat ................................................................. 3.2 Alat dan Bahan ...................................................................... 3.2.1 Alat ............................................................................ 3.2.2 Bahan ......................................................................... 3.3 Tahapan Penelitian ................................................................ 3.4 Prosedur Kerja ....................................................................... 3.4.1 Skrining Aktivitas Antibakteri ................................... 3.4.2 Scaling up Jamur Endofit yang Paling Aktif sebagai Antibakteri .................................................................

xi

ii iii iv v vi vii viii ix x 1 1 3 3 3 4 4 4 4 5 5 6 6 6 6 7 8 10 11 12 12 14 14 14 15 15 15 15 15 16 17 17 19


3.4.3

Fraksinasi dan Purifikasi Metabolit Bioaktif Antibakteri ................................................................. 3.4.4 Penentuan Nilai KHM (Kadar Hambat Minimum) ... 3.4.5 Identifikasi Jamur Endofit yang Paling Aktif sebagai Antibakteri ................................................................. BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................. 4.1 Skrining Aktivitas Antibakteri Jamur Endofit Tanaman Kina 4.2 Scaling Up Jamur Endofit 1-3-1-1 pada Medium PDB ......... 4.3 Fraksinasi dan Purifikasi Metabolit Bioaktif Antibakteri ...... 4.4 Penentuan Nilai KHM (Kadar Hambat Minimum) ............... 4.5 Identifikasi Jamur Endofit 1-3-1-1 ........................................ BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ............................................ 5.1 Kesimpulan ............................................................................ 5.2 Saran ...................................................................................... DAFTAR PUSTAKA ........................................................................... LAMPIRAN ..........................................................................................

xii

20 21 24 25 25 33 35 36 38 39 39 39 40 44


DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 2.1 Gambar 2.2 Gambar 4.1 Gambar 4.2 Gambar 4.3 Gambar 4.4 Gambar 4.5 Gambar 4.6 Gambar 4.7 Gambar 4.8 Gambar 4.9

Cinchona pubescens Vahl. ................................................................ 5 Klasifikasi metode skrining aktivitas antimikroba ................................ 11 Profil KLT dari 12 ekstrak kultur jamur ................................ 25 Profil KLT dari 16 ekstrak kultur jamur ................................ 28 Reaksi garam tetrazolium menjadi formazan .................. 30 Hasil uji bioautografi ekstrak kultur jamur dengan bakteri uji S. aureus ......................................................... 31 Hasil uji bioautografi ekstrak kultur jamur dengan bakteri uji E. coli ................................................................ 31 Profil KLT-bioautografi jamur endofit 1-3-1-1 hasil scaling up ............................................................................................... 33 Profil KLT hasil fraksinasi ekstrak kloroform biomassa jamur ................................................................................................ 34 Profil KLT hasil fraksinasi fraksi 3 ................................. 35 Gambar jamur endofit 1-3-1-1 ............................................................... 33

xiii


DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 3.1 Tabel 4.1 Tabel 4.2

Data isolat jamur endofit dari tanaman Kina .................... Data bobot ekstrak kultur jamur ....................................... Data nilai KHM sampel uji ...............................................

xiv

16 27 36


DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Lampiran 2. Lampiran 3. Lampiran 4. Lampiran 5. Lampiran 6. Lampiran 7. Lampiran 8. Lampiran 9.

Diagram Alur Penelitian ................................................................ 44 Diagram Skrining Aktivitas Antibakteri ................................45 Diagram Scaling Up Jamur Endofit yang Paling Aktif sebagai Antibakteri ................................................................46 Diagram Fraksinasi dan Purifikasi Metabolit Bioaktif Antibakteri ............................................................................................. 47 Perhitungan Jumlah Koloni Bakteri ................................ 48 Gambar Identifikasi Bakteri Uji ............................................................ 49 Gambar Hasil Uji KHM ................................................................ 50 Komposisi dan Cara Pembuatan Medium yang Digunakan .............................................................................................. 51 Gambar Alat-Alat yang Digunakan ................................ 54

xv


BAB I PENDAHULUAN

1.1

Latar Belakang Pencarian sumber senyawa bioaktif terus menerus dilakukan seiring makin

banyaknya penyakit-penyakit baru yang bermunculan, mulai dari penyakit infeksi, kanker, dan penyakit berbahaya lainnya. Senyawa bioaktif dapat diperoleh dari beberapa sumber diantaranya dari tumbuhan, hewan, mikroba, dan organisme lain (Prihatiningtias, 2005). Salah satu sumber senyawa bioaktif adalah mikroba endofit. Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup di dalam jaringan tanaman pada periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan inangnya. Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikroba endofit yang mampu menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder yang diduga sebagai akibat koevolusi atau transfer genetik (genetic recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikroba endofit (Tan & Zou, 2001). Jamur endofit, mikroorganisme yang berada dalam jaringan tanaman hidup, merupakan sumber potensial untuk pemanfaatan senyawa baru produk bahan alam dalam bidang obat-obatan, agrikultura, dan industri tanpa merusak atau membahayakan keberlangsungan hidup tanaman inangnya. Selain itu, pertumbuhan mikroba endofit juga lebih cepat daripada inangnya, sehingga eksplorasi endofit sebagai sumber penemuan obat baru sangat menguntungkan (Strobel & Daisy, 2003). Bakteri atau jamur endofit dapat menghasilkan senyawa metabolit yang dapat berfungsi sebagai antibiotika (antifungi/antibakteri), antivirus, antikanker, antidiabetes, antimalaria, antioksidan, antiimunosupressif (Strobel & Daisy, 2003), antiserangga (Azevedo et al., 2000), zat pengatur tumbuh (Tan & Zou, 2001), dan penghasil enzim-enzim hidrolitik seperti amilase, selulase, xilanase, ligninase (Choi et al., 2005), kitinase (Zinniel et al., 2002). Sejauh ini, penelitian melaporkan sejumlah besar senyawa antimikroba yang diisolasi dari jamur endofit, terdiri dari beberapa golongan senyawa seperti 1


2

alkaloid, peptida, steroid, terpenoid, fenol, quinines, dan flavonoid. (Yu et al., 2010). Senyawa antimikroba yang telah banyak diisolasi dari endofit hanyalah sebagian kecil dari banyaknya spesies endofit yang berbeda, hal ini menunjukkan bahwa mencari produk alam yang disintesis oleh endofit dapat menjadi salah satu solusi untuk memecahkan masalah resistensi bakteri terhadap obat yang biasa digunakan dan dapat digunakan sebagai antibiotik yang efektif secara klinis di masa mendatang (Yu et al., 2010). Pemanfaatan tanaman sebagai bahan obat telah dikenal oleh masyarakat sejak lama. Salah satunya yaitu tanaman Kina yang merupakan bahan baku farmasi yang sangat bernilai dan dikenal luas sebagai salah satu jenis tanaman obat-obat berkhasiat dan sudah lama digunakan sebagai obat antimalaria (Simanjuntak et al., 2002b). Sekitar tahun 1630, kulit Kina digunakan sebagai obat demam di Peru, dan sekitar tahun 1640, Kina diperkenalkan ke Eropa dan digunakan sebagai antimalaria (Abdi et al., 2003). Tanaman Kina menghasilkan lebih dari 30 jenis alkaloid dan yang terpenting adalah golongan kuinolin yakni kinin, kinidin, sinkonin, dan sinkonidin (McCalley, 2002). Pada tahun 2002, Simanjuntak et al., berhasil mengisolasi beberapa mikroba dari tanaman Cinchona sp., skrining dan identifikasi hasil fermentasi dalam media sintetik menunjukkan bahwa mikroba endofit tersebut dapat memproduksi senyawa alkaloid sinkona (Simanjuntak et al., 2002a dalam Simanjuntak et al., 2002b). Sejauh ini, belum ditemukan adanya penelitian mengenai aktivitas antibakteri dari jamur endofit yang diisolasi dari tanaman Kina (Cinchona pubescens Vahl.). Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengetahui adanya aktivitas antibakteri dari jamur endofit yang diisolasi dari tanaman kina.


3

1.2

Rumusan Masalah Apakah jamur endofit yang diisolasi dari tanaman Kina dapat

menghasilkan metabolit bioaktif yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli ? 1.3

Hipotesis Jamur endofit yang diisolasi dari tanaman Kina dapat menghasilkan

metabolit bioaktif yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. 1.4

Tujuan Penelitian Untuk mengetahui adanya aktivitas antibakteri jamur endofit yang diisolasi

dari tanaman Kina terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. 1.5

Manfaat Penelitian Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan informasi mengenai

aktivitas antibakteri jamur endofit yang diisolasi dari tanaman Kina sebagai bentuk pemanfaatan produk bahan alam dalam bidang farmasi.


BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1

Jamur Endofit Mikroba endofit hidup secara berkoloni di dalam jaringan internal

tanaman inang, misalnya di bagian ranting, batang, daun, akar, atau biji. Endofit biasanya memiliki hubungan saling menguntungkan atau simbiosis mutualisme dengan tanaman inangnya. Satu tanaman inang dapat menjadi inang bagi beberapa spesian mikroba endofit. Senyawa yang diperoleh dari mikroba endofit biasanya berhubungan dengan senyawa dari tanaman inangnya. Hal ini mungkin terjadi karena adanya transfer genetik antara endofit dan inangnya. (Strobel & Daisy, 2003). Jamur endofit memiliki peranan penting dalam industri farmasi karena kemampuannya dalam memproduksi senyawa metabolit yang bervariasi, baik dari struktur maupun fungsinya. Berbagai golongan senyawa metabolit sekunder seperti alkaloid, flavonoid, terpenoid, antrakuinon, kuinon, fenil propanoid, fenolik, turunan isokumarin, senyawa alifatik, peptida, dan senyawa lainnya telah diisolasi dan dikarakterisasi dari kultur jamur endofit (Agusta, 2009). Senyawa metabolit yang dihasilkan oleh jamur atau bakteri endofit dapat berfungsi sebagai antibiotika (antifungi/antibakteri), antivirus, antikanker, antidiabetes, antimalaria, antioksidan, antiimunosupressif (Strobel & Daisy, 2003), antiserangga (Azevedo et al., 2000), zat pengatur tumbuh (Tan & Zou, 2001), dan penghasil enzim-enzim hidrolitik seperti amilase, selulase, xilanase, ligninase (Choi et al., 2005), kitinase (Zinniel et al., 2002).

2.2

Tanaman Kina (Cinchona pubescens Vahl.)

2.2.1 Sejarah Singkat Kina merupakan tanaman obat berupa pohon yang berasal dari Amerika Selatan di sepanjang pegunungan Andes yang meliputi wilayah Venezuela, Colombia, Equador, Peru sampai Bolivia. Daerah tersebut meliputi hutan-hutan pada ketinggian 900-3.000 m dpl. Bibit tanaman Kina yang masuk ke Indonesia tahun 1852 berasal dari Bolivia, tetapi tanaman Kina yang tumbuh dari biji 4


5

tersebut akhirnya mati. Pada tahun 1854 sebanyak 500 bibit kina dari Bolivia ditanam di Cibodas dan tumbuh 75 pohon yang terdiri atas 10 klon (Sultoni, 1995).

2.2.2 Klasifikasi Phylum

: Tracheophyta

Class

: Magnoliopsida

Order

: Gentianales

Family

: Rubiaceae

Genus

: Cinchona

Spesies

: Cinchona pubescens

(Species 2000 & ITIS Catalogue of Life, 2013).

2.2.3

Deskripsi

( Gambar 2.1 Cinchona pubescens Vahl.) (Orwa et al., 2009)

Habitus

: Pohon, tinggi ± 17 m.

Batang

: Berkayu, berwarna coklat kehijauan.

Daun

: Tunggal, lonjong-hampir bulat, tepi rata-ujung dan pangkal tumpul, panjang 15-35 cm, lebar 9-23 cm, pertulangan menyirip, daun muda berwarna hijau setelah tua berwarna merah.

Bunga

: Majemuk, bentuk bintang, tangkai 5-11 cm, berwarna putih kekuningan, kelopak bertaju lima, bagian pangkal menyatu berwarna hijau, benang sari berjumlah lima, tangkai sari putih, kepala sari UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

6

coklat, mahkota bentuk tabung dengan ujung membesar dan berwarna coklat muda. Buah

: Lonjong, keras, coklat muda.

Biji

: Kecil, hitam.

Akar

: Tunggang, coklat keputih-putihan.

2.2.4

Khasiat Kulit batang Kina berkhasiat sebagai antimalaria, antipiretik, antiperiodik,

obat sakit perut, tonik, astringent, penambah nafsu makan (Grenish, 1920).

2.2.5 Kandungan Kimia Kulit batang Kina mengandung alkaloid, saponin, flavonoid, polifenol (Sultoni, 1995), dan tanin (Grenish, 1920).

2.3

Kromatografi Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani Rusia

Michael Tswett pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelas yang berisi kalsium karbonat (CaCO3). Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan paling sering digunakan dalam bidang kimia analisis, baik analisis kualitatif, kuantitatif, atau preparatif dalam bidang farmasi, lingkungan, industri, dan sebagainya. Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase) (Ganjar & Rohman, 2007).

2.3.1 Kromatografi Kolom Kromatografi kolom merupakan teknik analisis yang digunakan dalam penentuan jumlah komponen yang terdapat pada suatu campuran senyawa, pemisahan, dan pemurnian komponen senyawa tertentu dari campurannya. Pada pemisahan kromatografi kolom, suatu pelarut pengelusi dialirkan secara kontinu melewati kolom, kemudian komponen-komponen dari campuran senyawa yang


7

dipisahkan akan keluar dari kolom, dikumpulkan, dan difraksinasi. Proses elusinya dapat berupa elusi isokratik ataupun elusi gradien (Harvey, 2000). Kromatografi kolom termasuk kromatografi serapan yang sering disebut kromatografi elusi, karena senyawa yang akan terpisah terelusi dari kolom. Pemisahan komponen campuran melalui kromatografi adsorpsi tergantung pada kesetimbangan adsorpsi-desorpsi antara senyawa yang teradsorb pada permukaan dari fase diam padatan dan pelarut dalam fase cair. Tingkat adsorpsi komponen tergantung pada polaritas molekul, aktivitas adsorben, dan polaritas fase gerak cair. Umumnya, senyawa dengan gugus fungsional lebih polar akan teradsorb lebih kuat pada permukaan fase padatan. Aktivitas adsorben tergantung komposisi kimianya, ukuran partikel, dan pori-pori partikel (Braithwaite & Smith, 1999). Pelarut murni atau sistem pelarut tunggal dapat digunakan untuk mengelusi semua komponen. Selain itu, sistem pelarut gradien juga digunakan. Pada elusi gradien, polaritas sistem pelarut ditingkatkan secara perlahan dengan meningkatkan konsentrasi pelarut ke yang lebih polar. Pemilihan pelarut eluen tergantung pada jenis adsorben yang digunakan dan kemurnian senyawa yang dipisahkan. Pelarut harus mempunyai kemurnian yang tinggi. Keberadaan pengganggu seperti air, alkohol, atau asam pada pelarut yang kurang polar akan mengganggu aktivitas adsorben (Braithwaite & Smith, 1999).

2.3.2

KLT (Kromatografi Lapis Tipis) Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan

Schraiber pada tahun 1938. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan elektroforesis. Berbeda dengan kromatografi kolom yang mana fase diamnya diisikan atau dikemas di dalamnya, pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium atau pelat plastik. Meskipun demikian, kromatografi planar ini dapat dikatakan sebagai bentuk terbuka dari kromatografi kolom.


8

Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending) atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending). Beberapa keuntungan dari kromatografi planar (Ganjar & Rohman, 2007): 1. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis. 2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet. 3. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi. 4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak. Penggunaan umum KLT adalah untuk: menentukan banyaknya komponen dalam campuran, identifikasi senyawa, memantau berjalannya suatu reaksi, menentukan efektifitas pemurnian, menentukan kondisi yang sesuai untuk kromatografi kolom, serta

untuk memantau kromatografi kolom, melakukan

screening sampel untuk obat (Ganjar & Rohman, 2007).

2.4

Antimikroba Antimikroba merupakan obat pembasmi mikroba, khususnya mikroba

yang merugikan manusia. Berdasarkan toksisitas selektif, ada antimikroba yang bersifat

menghambat

pertumbuhan

mikroba,

dikenal

sebagai

aktivitas

bakteriostatik dan ada yang bersifat membunuh mikroba, dikenal sebagai aktivitas bakterisid. Kadar minimal yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan mikroba atau membunuhnya, masing-masing dikenal dengan kadar hambat minimal (KHM) dan kadar bunuh minimal (KBM). Antimikroba tertentu aktivitasnya dapat meningkat dari bakteriostatik menjadi bakterisid bila kadar antimikrobanya ditingkatkan melebihi KHM (Setiabudy, 2007).


9

Berdasarkan mekanisme kerjanya, antimikroba dibagi dalam lima kelompok (Setiabudy, 2007) : 1. Antimikroba yang menghambat metabolisme sel mikroba Mikroba membutuhkan asam folat untuk kelangsungan hidupnya. Berbeda dengan mamalia yang mendapatkan asam folat dari luar, kuman patogen harus mensintesis sendiri asam folat dari asam amino benzoat (PABA) untuk kebutuhan hidupnya. Apabila antimikroba menang bersaing dengan PABA untuk diikutsertakan dalam pembentukan asam folat, maka terbentuk analog asam folat yang nonfungsional. Akibatnya kehidupan mikroba akan terganggu. 2. Antimikroba yang menghambat sintesis dinding sel mikroba Antimikroba menghambat reaksi dalam proses sintesis dinding sel. Dikarenakan tekanan osmotik dalam sel mikroba lebih tinggi daripada diluar sel, maka kerusakan dinding sel mikroba akan menyebabkan terjadinya lisis, yang merupakan dasar efek bakterisidal pada kuman yang peka. 3. Antimikroba yang mengganggu keutuhan membran sel mikroba Antimikroba dapat merusak membran sel setelah bereaksi dengan fosfat pada fosfolipid membran sel mikroba. Antiseptik yang mengubah tegangan permukaan (surface-active agents), dapat merusak permeabilitas selektif dari membran sel mikroba. Kerusakan membran sel menyebabkan keluarnya berbagai komponen penting dari dalam sel mikroba yaitu protein, asam nukleat, nukleotida dan lain-lain. 4. Antimikroba yang menghambat sintesis protein sel mikroba Untuk kehidupannya, sel mikroba perlu mensintesis berbagai protein. Sintesis protein berlangsung di ribosom, dengan bantuan mRNA dan tRNA. Pada bakteri, ribosom terdiri atas dua sub unit, yang berdasarkan konstanta sedimentasi dinyatakan sebagai ribosom 30S dan 50S. Untuk berfungsi pada sintesis protein, kedua komponen ini akan bersatu pada pangkal rantai mRNA menjadi ribosom 70S. Penghambatan sintesis terjadi dengan berbagai cara, diantaranya: a. Antimikroba berikatan dengan komponen ribosom 30S dan menyebabkan kode pada mRNA salah dibaca oleh tRNA pada waktu sintesis protein.


10

Akibatnya akan terbentuk protein yang abnormal dan non fungsional bagi sel mikroba. b. Antimikroba berikatan dengan ribososm 50S dan menghambat translokasi kompleks tRNA-peptida dari lokasi asam amino ke lokasi peptida. Akibatnya, rantai polipeptida tidak dapat diperpanjang karena lokasi asam amino tidak dapat menerima kompleks tRNA-asam amino yang baru. c. Antimikroba berikatan dengan ribosom 30S dan menghalangi masuknya kompleks tRNA-asam amino pada lokasi asam amino. d. Antimikroba berikatan dengan ribosom 50S dan menghambat pengikatan asam amino baru pada rantai polipeptida oleh enzim peptidil transferase. 5. Antimikroba yang menghambat sintesis asam nukleat sel mikroba Antimikroba berikatan dengan enzim polimerasi-RNA (pada sub-unit) sehingga menghambat sintesis RNA dan DNA oleh enzim tersebut. Selain itu, antimikroba juga menghambat enzim DNA girase pada kuman yang fungsinya menata kromosom yang sangat panjang menjadi bentuk spiral hingga bisa muat dalam sel kuman yang kecil.

2.5

Metode Skrining Antimikroba Skrining dapat didefinisikan sebagai prosedur awal dalam menganalisis

ada atau tidak adanya suatu analit pada sampel yang dianalisis. Metode skrining untuk deteksi aktivitas antimikroba pada produk alam terbagi menjadi tiga, yaitu metode difusi, metode dilusi, dan bioautografi. Pada dasarnya metode skrining ini merupakan pengukuran sederhana yang memberikan respon “ada/tidak”, cukup sering digunakan, memberikan sensitivitas yang lebih tinggi daripada metode lainnya. Selain itu metode-metode tersebut sederhana, murah, hemat waktu, dan tidak memerlukan peralatan

yang canggih.

Metode deteksi ini dapat

dikombinasikan dengan kromatogafi lapis cair, seperti kromatografi lapis tipis, kromatografi lapis tipis kinerja tinggi, dan kromatografi elektro planar (Choma & Grzelak, 2010).


11

Cakram Metode difusi

Silinder Uji plat lubang

Klasifikasi metode skrining aktivitas antimikroba

Dilusi agar Metode dilusi

Cara tabung Kontak

Bioautografi

Imersi/ Overlay Langsung

Gambar 2.2. Klasifikasi metode skrining aktivitas antimikroba (Choma & Grzelak, 2010) 2.5.1

Metode Difusi Metode Difusi sering digunakan untuk uji antimikroba pada senyawa

murni, terutama untuk senyawa polar. Metode cakram secara resmi telah digunakan untuk deteksi kuantitatif zat inhibitor pada susu di Amerika Serikat. Dalam prosedur ini, cakram kertas saring (dengan diameter ± 6 mm), mengandung senyawa uji, ditempatkan pada permukaan agar yang sebelumnya diinokulasi dengan mikroorganisme uji. Agen antimikroba berdifusi ke dalam agar-agar dan menghambat pertumbuhan mikroba uji tersebut. Cawan petri diinkubasi dan zona inhibisi diukur (Choma & Grzelak, 2010). Prosedur yang sama dilakukan dalam E-test, di mana garis-garis yang digunakan sebagai pengganti cakram. Dalam metode silinder, stainless steel atau porselen silinder dengan ukuran seragam (biasanya 8 mm x 6 mm × 10 mm) ditempatkan pada permukaan agar yang diinokulasi dalam cawan petri, dan diisi dengan sampel dan standar. Setelah inkubasi, silinder diambil dan zona inhibisi diukur. Metode silinder adalah metode yang sering digunakan untuk deteksi kuantitatif pada residu laktam. Untuk uji plat lubang, lubang berdiameter beberapa milimeter dipotong di permukaan agar kemudian diinokulasi dan diisi dengan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

12

sampel. Larutan senyawa uji yang berdifusi kedalam media agar akan menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Kemudian, zona inhibisi diukur (Choma & Grzelak, 2010).

2.5.2

Metode dilusi Keuntungan utama dari metode dilusi adalah dapat

memperkirakan

konsentrasi senyawa uji dalam medium agar atau suspensi kaldu, hal ini biasanya digunakan untuk penentuan nilai KHM (Paxton, 1991 dalam Choma & Grzelak, 2010). Metode dilusi ini dapat diaplikasikan pada ekstrak yang kompleks, zat murni, sampel polar dan non polar. Dalam prosedur dilusi agar, berbagai konsentrasi senyawa uji dicampur dengan agar nutrien. Plat agar diinokulasi kemudian diinkubasi. Konsentrasi terendah dari senyawa antimikroba yang menunjukkan nilai KHM yaitu pada saat tidak terdeteksinya pertumbuhan mikroorganisme. Dalam uji tabung, berbagai konsentrasi senyawa uji dicampur dengan suspensi bakteri dalam serangkaian tabung, konsentrasi terendah menyebabkan penghambatan pertumbuhan mikroorganisme sesuai dengan nilai MIC. Dalam uji mikrodilusi, mikroorganisme tumbuh dalam sumuran plat, dengan

penambahan

berbagai

konsentrasi

senyawa

uji.

Pertumbuhan

mikroorganisme ditunjukkan oleh adanya kekeruhan dalam sumuran plat (Otvos et al., 2007 dalam Choma & Grzelak, 2010).

2.5.3

Metode Bioautografi Bioautografi merupakan teknik laboratorium yang digunakan untuk

mendeteksi zat yang mempengaruhi tingkat pertumbuhan organisme uji dalam campuran dan matriks yang kompleks. Metode ini menggabungkan penggunaan teknik kromatografi lapis tipis dengan respon dari mikroorganisme yang diuji berdasarkan aktivitas biologi dari suatu analit yang dapat berupa antibakteri, antijamur, antitumor, antriprotozoa. (Choma, 2005). Aplikasi dari metode bioautografi ini, diantaranya (Choma, 2005): 1. Mencari zat antibiotik, antijamur, antitumor, dan antiprotozoa baru dengan mempelajari aktivitas biologis zat yang berasal dari tanaman, mikroorganisme, atau kombinasi secara kimia. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

13

2. Penelitian antibiotik dan senyawa biologis aktif lainnya dalam air limbah, air minum, cairan tubuh, pakan, dan makanan. 3. Kontrol kualitas obat-obatan antibiotik. 4. Mencari senyawa antimikroba yang efektif melawan bakteri dan jamur patogen pada tanaman. 5. Deteksi dan penentuan senyawa toksin (misalnya, aflatoksin) atau fototoksik (misalnya, furokumarin). Metode bioautografi dibedakan menjadi tiga, yaitu (Choma, 2005): 1. Bioautografi kontak Bioautografi kontak dilakukan dengan meletakkan plat KLT hasil elusi senyawa yang akan diuji di atas media padat yang sudah diinokulasi dengan mikroba uji. Adanya senyawa antimikroba ditandai dengan adanya daerah bening yang tidak ditumbuhi mikroba. 2. Bioautografi imersi atau bioautografi agar overlay Pada bioautografi agar overlay, plat KLT hasil elusi senyawa yang akan diuji dilapisi dengan agar yang masih cair yang sudah diinokulasi dengan mikroba uji. Setelah agar mengeras, plat KLT diinkubasi dan diwarnai dengan reagen warna tetrazolium. Penghambatan dapat dideteksi dengan terbentuknya pita (band). 3. Bioautografi langsung Bioautografi langsung dilakukan dengan menyemprotkan mikroba uji pada plat KLT hasil elusi senyawa yang akan diuji atau dengan mencelupkan plat KLT pada suspensi mikroba uji yang telah ditumbuhkan pada medium kaldu yang cocok dan diinkubasi. Zona hambat yang terbentuk divisualisasikan dengan menyemprot plat KLT dengan reagen warna tetrazolium. Keuntungan metode bioautografi ini diantaranya, sifatnya yang efisien untuk mendeteksi adanya senyawa antimikroba karena letak bercak dapat ditentukan walaupun berada dalam campuran yang kompleks sehingga memungkinkan untuk mengisolasi senyawa aktif tersebut (Pratiwi, 2008).


14

2.6

Bakteri Uji

2.6.1 Staphylococcus aureus S. aureus ditemukan pertama kali oleh Koch tahun 1878. Aureus dalam bahasa Yunani berarti “emas”, hal ini dikarenakan S. aureus memiliki pigmen karotenoid berwarna kuning muda sampai jingga tua. S. aureus termasuk ke dalam familia micrococcacea, merupakan bakteri Gram positif dan berbentuk kokus dengan diameter 0,5-1,5 μm baik berpasangan maupun bergerombol. Bakteri ini bersifat tidak motil, dapat hidup secara aerob dan anaerob fakultatif, pertumbuhan paling cepat pada temperatur 37 0C. Pembentukan pigmen paling baik pada bakteri ini adalah disuhu kamar, yaitu berkisar antara 20-25 0C, serta memiliki pH optimum 7,0-7,5 (Pelczar & Chan, 1986). S. aureus merupakan penyebab berbagai infeksi pada manusia dan hewan. Bakteri ini dapat menyebabkan penyakit pneumonia (infeksi paru-paru), osteomyelitis (infeksi pada tulang), sinusitis, tonsilitis (radang amandel), dan abses (penimbunan nanah akibat infeksi bakteri), sedangkan pada hewan S. aureus menyebabkan penyakit mastitis (pembengkakan payudara) pada sapi dan biri-biri, pustular dermatitis (radang kulit) pada anjing, serta abses pada unggas (Todar, 2002).

2.6.2 Escherichia coli E. coli merupakan bakteri penghuni usus besar manusia dan hewan tingkat tinggi lainnya. E. coli adalah mikroflora normal dalam tubuh manusia dengan menghasilkan bakteriosin sebagai pelindung terhadap terjadiya kolonisasi bakteri patogen. Galur-galur tertentu dari E. coli dapat menyebabkan penyakit pada manusia dan hewan. Penyakit yang disebabkan oleh bakteri ini antara lain gastroenteritis, diare dan infeksi saluran urin (Pelczar & Chan, 1986). E. coli termasuk ke dalam famili Enterobacteriaceae, merupakan bakteri Gram negatif, bersifat anaerob fakultatif. Bakteri ini berbentuk batang pendek dengan lebar kurang 1,1-1,5 μm dan panjang sekitar 2,0-6,0 μm. Nilai pH optimumnya 7,0-7,5 dan suhu optimum 37 0C dengan kisaran suhu pertumbuhan 10-40 0C (Holt et al., 1994).


BAB III METODE PENELITIAN

3.1

Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Fitokimia, Pusat Penelitian

Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong. Waktu pelaksanaan penelitian dimulai dari bulan April sampai dengan Agustus 2013.

3.2

Alat dan Bahan

3.2.1 Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: autoklaf (Hiclave HVE 5.0 Hirayama), Lamina Air Flow (LAF), UV cabinet (Camag), cawan petri, kawat ose, lampu bunsen, pipet tetes, pipet mikro, tip, pipa kapiler, pinset, spatel, hot plate (Cimarec 2), shaker incubator, erlenmeyer (Pyrex), vacuum rotary evaporator (Eyela SB-1000), labu evaporator (Pyrex), chamber, kolom kromatografi, micropipet Effendorf Referance 200 μL, 96 well microtiter plate, vial, spreader, corong pisah, dan mikroskop cahaya (Nikon). 3.2.2 Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: isolat murni jamur endofit yang diisolasi dari bagian daun (1 isolat), tangkai daun (6 isolat), dan bunga (3 isolat) tanaman Kina (Cinchona pubescens Vahl.) koleksi Laboratorium Mikrobiologi Puslit Biologi LIPI Cibinong (Tabel 3.1). Bahan lainnya meliputi bakteri uji Staphylococcus aureus LIPIMC 114 dan Escherichia coli LIPIMC 186 (koleksi Laboratorium Mikrobiologi Puslit Biologi LIPI Cibinong), media PDA (Potato Dextrose Agar - Difco TM), PDB (Potato Dextrose Broth – Difco

TM

), GYP (Glucose Yeast extract Peptone), MHA (Mueller Hinton

Agar - Criterion), MHB (Mueller Hinton Broth – Criterion), NA (Nutrient Agar – Criterion), BHI (Brain Heart Infusion-BBL

TM

), silika gel GF 254, silika gel 70-

230 mesh (Merck), Seasand (Merck), pelarut kimia etil asetat, aseton, kloroform, diklorometan, metanol, etanol, n-heksana, aquadest, dimetil sulfoksida (DMSO), pereaksi penampak noda serium sulfat, pereaksi Dragendorff, pereaksi warna INT

15


16

(2-(4-Iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-fenil-2H-tetrazolium klorida), trypan blue, crystal violet, safranin, larutan lugol, antibiotik kloramfenikol dan eritromisin.

Tabel 3.1 Data isolat jamur endofit dari tanaman Kina (Cinchona pubescens Vahl.)

3.3

No

Kode Isolat

Asal Isolat

1

5-1-8-5

Daun

2

1-2-5-3

Tangkai daun

3

2-2-6-4

Tangkai daun

4

3-2-10-2

Tangkai daun

5

2-3-4-2

Bunga

6

3-3-4-2

Bunga

7

1-2-4-4

Tangkai daun

8

1-2-6-3

Tangkai daun

9

3-2-1-2

Tangkai daun

10

1-3-1-1

Bunga

Tahapan Penelitian

3.3.1 Skrining aktivitas antibakteri jamur endofit dari tanaman Kina (Cinchona pubescens Vahl.) 3.3.2 Scaling up jamur endofit yang paling aktif sebagai antibakteri 3.3.3 Fraksinasi dan purifikasi metabolit bioaktif antibakteri 3.3.4 Penentuan nilai KHM (Kadar Hambat Minimum) 3.3.5 Identifikasi secara makroskopik dan mikroskopik jamur endofit yang paling aktif sebagai antibakteri


17

3.4

Prosedur Kerja

3.4.1 Skrining Aktivitas Antibakteri Jamur Endofit dari Tanaman Kina (Cinchona pubescens Vahl.) 3.4.1.1 Kultivasi Jamur Endofit Proses kultivasi dilakukan terhadap 10 isolat murni jamur endofit yang diisolasi dari bagian daun, tangkai daun, dan bunga tanaman Kina yang dibagi menjadi 2 tahap kultivasi: kultivasi pertama dilakukan terhadap 6 isolat jamur (isolat no. 1-6) dan kultivasi kedua dilakukan terhadap 4 isolat jamur (isolat no. 7-10). Setiap isolat diambil sebanyak 1 ose dari stock culture pada medium PDA (Potato Dextrose Agar) miring dan diinokulasikan pada masing-masing 40 mL medium PDB (Potato Dextrose Broth) dan GYP (Glucose Yeast extract Peptone) yang sudah steril, proses inokulasi ini dilakukan secara steril di dalam laminar air flow. Proses kultivasi jamur dilakukan selama 3 minggu pada suhu ruang.

3.4.1.2 Ekstraksi Kultur Jamur Endofit Sebanyak 6 kultur jamur endofit (isolat no. 1-6) yang sudah dikultivasi tahap pertama pada medium PDB dan GYP diekstraksi dengan pelarut etil asetat:metanol (4:1), sedangkan untuk 4 kultur jamur (isolat no. 7-10) yang dikultivasi tahap kedua pada medium PDB dan GYP diekstraksi dengan etil asetat:metanol (4:1) dan fraksi airnya diekstraksi lagi dengan kloroform. Jumlah pelarut yang digunakan pada masing-masing ekstraksi sebanyak 40 mL yaitu 1:1 dengan jumlah medium kultur jamur. Proses ekstraksi dilakukan menggunakan corong pisah sebanyak tiga kali. Untuk ekstraksi dengan pelarut etil asetat:metanol (4:1) diambil lapisan atas (fraksi etil asetat:metanol), sedangkan untuk ekstraksi dengan pelarut kloroform diambil lapisan bawah (fraksi kloroform). Masing-masing fraksi dipisahkan dan dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator. Ekstrak pekat yang didapat dari masing-masing fraksi ditimbang dan dilarutkan dengan metanol dalam jumlah tertentu sehingga masingmasing ekstrak diperoleh konsentrasi 10 mg/mL. Selanjutnya dilakukan uji KLT dengan menggunakan fase gerak diklorometan:metanol (7:1) dan hasilnya diamati dibawah sinar UV 254 nm dan UV 366 nm serta disemprot dengan pereaksi


18

penampak noda serium sulfat untuk skrining metabolit sekunder dan pereaksi Dragendorff untuk skrining senyawa alkaloid.

3.4.1.3 Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode Bioautografi a) Identifikasi Bakteri Uji dengan Pewarnaan Gram Identifikasi bakteri uji dengan pewarnaan Gram ini dilakukan berdasarkan panduan Alexander et al., (2004) dengan cara: 1. Kaca objek dibersihkan dengan alkohol 70% dan dikeringkan. 2. Aquadest steril diteteskan pada kaca objek kemudian diinokulasikan bakteri uji menggunakan ose dan difiksasi diatas api bunsen. 3. Diteteskan crystal violet, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air selama 5 detik. 4. Diteteskan dengan larutan lugol, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air selama 5 detik. 5. Dihilangkan warnanya dengan alkohol 95% selama 15-30 detik, kemudian dicuci dengan air selama 5 detik. 6. Diteteskan zat warna safranin dan didiamkan selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air selama 5 detik.. 7. Preparat difiksasi diatas api bunsen dan diamati dengan mikroskop cahaya dengan skala perbesaran 400x dan 4000x. b) Persiapan Suspensi Bakteri Stok bakteri uji S. aureus dan E. coli yang telah diremajakan pada medium NA (nutrient Agar) miring diambil 1 ose, lalu disuspensikan dalam 20 mL medium BHI (Brain Heart Infusion), kemudian diinkubasi dalam shaker incubator dengan kecepatan 100 rpm pada suhu 37 0C selama 18 jam. c) Persiapan Sampel Uji Semua sampel dibuat konsentrasi menjadi 10 mg/mL, kemudian sebanyak 10 µL dari masing-masing sampel ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada plat KLT. Sebagai kontrol positif digunakan antibiotik kloramfenikol dengan konsentrasi 1 mg/mL dan kontrol negatif medium PDB, GYP, dan pelarut metanol.


19

d) Uji Bioautografi Plat KLT yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalam suspensi bakteri uji dan diinkubasi pada suhu 37 0C selama 18 jam, kemudian disemprot dengan pereaksi warna INT (4 mg/mL) dan diinkubasi selama 1 jam. Keberadaan aktivitas antibakteri ditentukan dengan terbentuknya zona hambat yang tampak karena penyemprotan INT yang dikonversikan terhadap warna formazan pada mikroorganisme hidup.

3.4.2 Scaling up Jamur Endofit yang Paling Aktif sebagai Antibakteri pada Medium PDB 3.4.2.1 Pembuatan Medium Kultivasi Medium PDB dibuat sebanyak 2 Liter dengan komposisi 24 gram PDB dalam 1 Liter aquadest. Setelah semua komponennya larut, medium dibagi ke dalam 4 erlenmeyer berukuran 2 Liter yang masing-masingnya diisi 500 mL. Medium tersebut disterilisasi dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 0C.

3.4.2.2 Kultivasi Jamur Endofit Berdasarkan hasil skrining antibakteri, ekstrak kultur jamur yang paling aktif sebagai antibakteri yaitu ekstrak kloroform dari isolat jamur endofit no. 10 (isolat 1-3-1-1) yang dikultivasi pada medium PDB. Isolat yang telah diregenerasi pada medium PDA diambil sebanyak ±3 ose dan diinokulasikan ke dalam 4x500 mL medium PDB yang sudah steril. Proses inokulasi ini dilakukan secara steril dalam laminar air flow. Setelah itu, kultur jamur endofit diinkubasi pada suhu ruang selama 3 minggu.

3.4.2.3 Ekstraksi Kultur Jamur Endofit Hasil Scaling Up Hasil kultivasi jamur endofit no.10 (isolat 1-3-1-1) dipisahkan antara medium dan biomassanya dengan cara disaring. Medium diekstraksi dengan pelarut kloroform sebanyak 2 Liter dengan perbandingan 1:1 terhadap jumlah medium, sedangkan untuk biomassa dimaserasi terlebih dahulu dengan aseton 3x24 jam, diuapkan asetonnya menggunakan vacuum rotary evaporator sehingga didapat fraksi air yang kemudian diekstraksi dengan pelarut kloroform dengan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

20

perbandingan 1:1 terhadap jumlah fraksi airnya. Proses ekstraksi ini dilakukan secara berulang sebanyak 3 kali. Lapisan bawah yang merupakan fraksi kloroform dari medium dan biomassa jamur dipisahkan dan dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator. Ekstrak pekat yang didapat dilarutkan dengan metanol dan dilakukan uji KLT dengan menggunakan fase gerak diklorometan:metanol (15:1) dan hasilnya diamati dibawah sinar UV 254 nm dan UV 366 nm serta disemprot dengan pereaksi penampak noda serium sulfat.

3.4.2.4 Uji KLT-Bioautografi Ekstrak Jamur Endofit Hasil Scaling Up Berdasarkan proses ekstraksi pada kultur jamur endofit no. 10 (isolat 1-3-1-1) hasil scaling up, didapat 2 ekstrak sampel yaitu: ekstrak kloroform medium jamur dan ekstrak kloroform biomassa jamur. Ekstrak tersebut dibuat konsentrasi menjadi 10 mg/mL, kemudian sebanyak 10 µL dari masing-masing ekstrak ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada plat KLT dan dielusi menggunakan pelarut diklorometan:metanol (15:1). Setelah itu, plat KLT dicelupkan kedalam suspensi bakteri uji dan diinkubasi pada suhu 37 0C selama 18 jam. Plat KLT yang telah diinkubasi disemprot dengan reagensia pewarna INT (4 mg/mL) dan diinkubasi selama 1-2 jam. Selanjutnya dilakukan penghitungan nilai Rf (Retardation factor) terhadap senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri. Keberadaan aktivitas antibakteri ditentukan dengan terbentuknya zona hambat yang tampak karena penyemprotan INT yang dikonversikan terhadap warna formazan pada mikroorganisme hidup.

3.4.3 Fraksinasi dan Purifikasi Metabolit Bioaktif Antibakteri Berdasarkan

hasil

pengamatan

uji

KLT-bioautografi,

selanjutnya

dilakukan fraksinasi dan purifikasi metabolit bioaktif dari ekstrak kloroform biomassa jamur (161,7 mg) dengan kromatografi kolom menggunakan fase diam silika gel 70-230 mesh dan fase gerak kloroform:metanol (30:1). Fase diam disuspensikan kedalam fase gerak (eluen) kemudian dimasukkan secara perlahan melalui corong ke dalam kolom yang telah diisi kapas dan seasand di bagian bawah kolom. Untuk penyempurnaan proses pemisahan, fase diam dipadatkan dengan cara menurunkan fase gerak serta dinding kolom diketok-ketok secara UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

21

perlahan. Setelah padat, ekstrak pekat yang telah dilarutkan dengan eluen dimasukkan ke dalam kolom menggunakan pipet tetes, lalu dielusi dengan eluen yang telah ditentukan sebelumnya dengan KLT. Fraksi yang keluar ditampung dalam tabung reaksi dan dimonitor dengan KLT menggunakan eluen diklorometan:metanol (15:1). Selanjutnya, fraksi-fraksi yang memiliki pola kromatogram yang sama digabung menjadi satu fraksi sehingga didapatkan 8 fraksi dan dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator. Fraksi 3 (10,4 mg) yang masih menunjukkan beberapa noda, difraksinasi kembali dengan kromatografi kolom menggunakan fase diam silika gel 70-230 mesh dan fase gerak n-heksana:etil asetat (3:1). Fraksi yang keluar ditampung dalam tabung reaksi dan dimonitor dengan KLT menggunakan eluen n-heksana:etil asetat (2:1). Selanjutnya, fraksi-fraksi yang memiliki pola kromatogram yang sama digabung menjadi satu fraksi sehingga didapatkan 6 fraksi dan dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator.

3.4.4 Penentuan Nilai KHM (Kadar Hambat Minimum) 3.4.4.1 Persiapan Medium Medium yang digunakan yaitu medium MHB (Mueller Hinton Broth) untuk pertumbuhan bakteri uji dan medium MHA (Mueller Hinton Agar) untuk perhitungan jumlah koloni bakteri uji. a) Medium MHB dibuat dengan komposisi: medium MHB 1 dibuat dengan melarutkan 21 g MHB dalam 1 Liter aquadest dan medium MHB 2 dibuat dengan komposisi 2x medium MHB 1 (42 g MHB dalam 1 Liter aquadest). Setelah larut, medium disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 0C selama 15 menit. b) Medium MHA dibuat dengan melarutkan 38 gram MHA dalam 1 Liter aquadest. Setelah larut, medium disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 0C selama 15 menit. Setelah itu, medium dituang dalam beberapa cawan petri steril dan dibiarkan memadat.


22

3.4.4.2 Persiapan Larutan Uji Larutan uji yang digunakan yaitu fraksi 3e. Larutan uji dibuat konsentrasi 512 µg/mL dengan menggunakan pelarut DMSO 30%. Fraksi 3e (1,4 mg) dilarutkan dalam 1,4 mL metanol, kemudian dipipet sebanyak 512 µL ke dalam vial dan dikeringkan dengan nitrogen. Setelah itu, dilarutkan dengan pelarut DMSO 30% (DMSO 300 µL dan aquabidest 700 µL).

3.4.4.3 Persiapan Bakteri Uji Bakteri uji yang digunakan yaitu S. aureus dan E. coli. Persiapan bakteri uji terdiri dari: a) Pembuatan suspensi bakteri Sebanyak 1 ose isolat bakteri diinokulasikan ke dalam 20 mL medium MHB. Kemudian diinkubasi dalam shaker incubator dengan kecepatan 100 rpm pada suhu 37 0C selama 18 jam. b) Pengenceran suspensi bakteri Suspensi bakteri uji diencerkan untuk mempermudah perhitungan koloni, yaitu dengan cara dipipet 50 µL suspensi bakteri ke dalam 4.950 µL aquadest steril sehingga didapat pengenceran 10-2, dari suspensi bakteri pengenceran 10-2 dipipet 50 µL ke dalam 4.950 µL aquadest steril sehingga didapat pengenceran 10-4. Suspensi tersebut diencerkan lagi dengan cara yang sama hingga didapat suspensi dengan pengenceran 10-6, 10-8, dan 10-10 . c) Perhitungan jumlah koloni bakteri Suspensi dengan faktor pengenceran 10-6, 10-8, dan 10-10, diinokulasikan sebanyak 100 µL kedalam medium MHA, disebarkan menggunakan spreader. Kemudian diinkubasi dalam incubator pada suhu 37 0C selama 18 jam. Koloni bakteri yang muncul dihitung (Lampiran 5). Koloni yang muncul x faktor pengenceran

Jumlah koloni bakteri = Volume yang dipipet


23

d) Pengenceran bakteri untuk uji KHM Stok bakteri yang digunakan untuk uji KHM dibuat dengan cara mengencerkan suspensi bakteri awal menjadi 105 CFU/mL berdasarkan hasil dari perhitungan jumlah koloni bakteri yang digunakan (Lampiran 5).

3.4.4.4 Pengenceran Larutan Uji Pengenceran larutan uji dari konsentrasi 512 µg/mL menjadi 128 µg/mL, 64 µg/mL, 32 µg/mL, 16 µg/mL, 8 µg/mL, 4 µg/mL, dan 1 µg/mL menggunakan 96 well microtiter plate dengan komposisi sebagai berikut: a) Sumur A1-A9 diisi dengan 100 µL medium MHB 2. b) Sumur B1-H9 diisi dengan 100 µL medium MHB 1. c) Sumur A1-A3 diisi dengan 100 µL sampel uji. d) Sumur A4-A6 diisi dengan 100 µL eritromisin (antibiotic control). e) Sumur A7-A9 diisi dengan 100 µL kloramfenikol (antibiotic control). f) Dari sumur A1-A9 masing-masing diambil 100 µL dan dimasukkan dalam sumur B1-B9, begitu seterusnya sampai sumur H1-H9. Pada sumur H1-H9 diambil 100 µL dan dibuang. g) Sumur A10 diisi 200 µL dengan medium MHB 2 (sterility control). h) Sumur B10 diisi 200 µL dengan medium MHB 1 (sterility control). i) Sumur C10-D10 diisi 100 µL dengan medium MHB 1 (growth control). j) Sumur E10-F10 diisi 100 µL dengan medium MHB 2 dan 100 µL DMSO 30% dan dibuang 100 µL (solvent control). k) Sumur G10-H10 diisi 100 µL dengan medium MHB 2 dan 100 µL etanol 30% dan dibuang 100 µL (solvent control). l) Masing-masing sumur ditambah dengan bakteri uji 100 µL kecuali sumur untuk sterilitiy control.

3.4.4.5 Inkubasi Microtiter Plate yang Berisi Sampel Uji Microtiter plate yang berisi sampel uji diinkubasi dalam incubator pada suhu 37 0C selama 18 jam.


24

3.4.4.6 Penentuan Nilai KHM Nilai KHM ditetapkan secara visual sebagai kadar larutan uji antibakteri terendah yang terlihat bening setelah penambahan reagensia pewarna INT (4 mg/mL) tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji.

3.4.5 Identifikasi Secara Makroskopis dan Mikroskopis Jamur Endofit yang Paling Aktif sebagai Antibakteri (Isolat 1-3-1-1) Identifikasi dilakukan berdasarkan panduan Gandjar et al. (1999) dengan mengamati beberapa karakter morfologi baik secara makroskopis maupun mikroskopis. Secara makroskopis karakter yang diamati meliputi: warna dan permukaan koloni (granular, seperti tepung, menggunung, licin), tekstur, garisgaris radial dan konsentris, warna balik koloni (reverse color), dan tetes eksudat. Pengamatan secara mikroskopis meliputi: ada tidaknya septat pada hifa, pigmentasi hifa, dan bentuk spora. Identifikasi secara mikroskopik dilakukan dengan cara: a) Membersihkan kaca objek dan kaca penutup dengan alkohol 70%. b) Meletakkan setetes zat pewarna trypan blue di tengah kaca objek. c) Mengambil sedikit hifa jamur dengan jarum preparat dan diletakkan pada tetesean zat pewarna trypan blue dalam kaca objek dan ditutup dengan kaca penutup secara hati-hati. d) Preparat diamati di bawah mikroskop cahaya dengan skala perbesaran 1000x.


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Skrining

Aktivitas

Antibakteri

Jamur

Endofit

Tanaman

Kina

(Cinchona pubescens Vahl.) Skrining aktivitas antibakteri jamur endofit ini dilakukan terhadap 10 isolat murni jamur endofit yang diisolasi dari bagian daun (1 isolat), tangkai daun (6 isolat), dan bunga (3 isolat) tanaman Kina (Cinchona pubescens Vahl.), masing-masing isolat dikultivasi pada 40 mL medium PDB dan GYP yang merupakan medium umum untuk pertumbuhan jamur dan dilakukan pada suhu ruang selama 3 minggu. Proses kultivasi ini dibagi menjadi 2 tahap: kultivasi tahap pertama dilakukan terhadap 6 isolat jamur (isolat no. 1-6) dan kultivasi tahap kedua dilakukan terhadap 4 isolat jamur (isolat no. 7-10). Sebanyak 12 kultur jamur yang telah dikultivasi pada tahap pertama diekstraksi secara partisi menggunakan corong pisah dengan pelarut etil asetat:metanol (4:1) sebanyak 3x40 mL. Pelarut etil asetat:metanol (4:1) merupakan pelarut dengan tingkat kepolaran tertinggi yang dapat memisah dengan air, sehingga diharapkan pelarut yang digunakan dapat mengekstraksi senyawa sebanyak mungkin. Dari proses ekstraksi ini diperoleh 12 ekstrak kultur jamur yang kemudian ditimbang dan dibuat konsentrasi 10 mg/mL dengan cara melarutkannya dalam metanol dengan jumlah tertentu sesuai dengan masingmasing bobot ekstrak pekat yang diperoleh. Data bobot masing-masing ekstrak yang diperoleh dapat dilihat pada Tabel 4.1. Masing-masing ekstrak diidentifikasi dengan KLT, sebagai proses awal digunakan eluen diklorometan:metanol (7:1), diamati dibawah sinar UV 254 nm dan UV 366 nm dan disemprot dengan penampak noda serium sulfat yang bertujuan untuk melihat adanya metabolit sekunder dari masing-masing ekstrak. Pada plat KLT yang berbeda, dilakukan juga identifikasi terhadap masing-masing ekstrak dengan menggunakan pereaksi Dragendorff yang bertujuan untuk mendeteksi adanya senyawa alkaloid yang biasanya terdapat pada tanaman Kina. Profil KLT dari 12 ekstrak yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat dan pereaksi Dragendorff dapat dilihat pada Gambar 4.1 25


26

(a)

(c)

(b)

(d)

Gambar 4.1 Profil KLT dari 12 ekstrak yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat dan pereaksi Dragendorff Eluen : diklorometan:metanol (7:1) Keterangan : (a) Ekstrak etil asetat:metanol (4:1) kultur jamur yang dikultivasi pada medium PDB yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat. (b) Ekstrak etil asetat:metanol (4:1) kultur jamur yang dikultivasi pada medium PDB yang disemprot dengan pereaksi Dragendorff. (c) Ekstrak etil asetat:metanol (4:1) kultur jamur yang dikultivasi pada medium GYP yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat. (d) Ekstrak etil asetat:metanol (4:1) kultur jamur yang dikultivasi pada medium GYP yang disemprot dengan pereaksi Dragendorff.


27

Berdasarkan profil KLT yang ditunjukkan pada Gambar 4.1 dengan penyemprotan penampak noda serium sulfat dapat diketahui bahwa pada 12 ekstrak etil asetat:metanol (4:1) kultur jamur mengandung beberapa senyawa kimia yang merupakan hasil bioproduksi metabolit sekunder hasil kultivasi tahap pertama dari 6 isolat jamur pada 2 medium yaitu medium PDB dan GYP. Sedangkan, hasil identifikasi dengan pereaksi Dragendorff menunjukkan tidak terdapatnya senyawa alkaloid (munculnya noda warna jingga) pada 12 ekstrak kultur jamur tersebut. Selain itu, digunakan juga kontrol medium PDB dan GYP yang diekstrak dengan cara yang sama yang menunjukkan tidak adanya spot pada hasil uji KLT. Hal ini dikarenakan tidak terjadinya bioproduksi metabolit sekunder pada medium PDB dan GYP tanpa kultur jamur. Kultivasi tahap kedua dilakukan terhadap 4 isolat jamur (isolat no. 7-10) yang kemudian diekstraksi secara partisi menggunakan corong pisah dengan pelarut etil asetat:metanol (4:1) sebanyak 3x40 mL. Dari hasil ekstraksi diperoleh 2 fraksi yaitu fraksi etil asetat:metanol (lapisan atas) yang kemudian dipekatkan menggunakan vacuum rotary evaporator dan fraksi air (lapisan bawah) yang kemudian diekstraksi kembali dengan pelarut klroform sebanyak 3x40 mL. Proses ekstraksi

dengan

menggunakan

pelarut

kloroform

ini

bertujuan

untuk

mengekstraksi senyawa alkaloid yang biasanya terdapat pada tanaman Kina. Selain itu, senyawa alkaloid juga termasuk ke dalam senyawa antimikroba yang telah diisolasi dari jamur endofit (Yu et al., 2010). Pemilihan pelarut kloroform ini berdasarkan pada daya larutnya yang tinggi untuk melarutkan senyawa alkaloid (Sarker et al.,2005). Dari proses ekstraksi ini diperoleh 16 ekstrak kultur jamur yang kemudian ditimbang dan dibuat konsentrasi 10 mg/mL dengan cara melarutkannya dalam metanol dengan jumlah tertentu sesuai dengan masingmasing bobot ekstrak pekat yang diperoleh. Data bobot masing-masing ekstrak yang diperoleh dapat dilihat pada Tabel 4.1.


28

Tabel 4.1 Data bobot ekstrak kultur jamur endofit No

Kode

Bobot Ekstrak Jamur (mg)

Bobot Ekstrak Jamur (mg)

Isolat

Medium PDB

Medium GYP

Ekstrak Etil

Ekstrak

Ekstrak Etil

Ekstrak

Asetat:MetOH

Kloroform

Asetat:MetOH

Kloroform

(4:1)

(4:1)

1

5-1-8-5

25,0

-

12,5

-

2

1-2-5-3

20,2

-

14,8

-

3

2-2-6-4

23,0

-

16,5

-

4

3-2-10-2

13,1

-

10,0

-

5

2-3-4-2

10,2

-

15,9

-

6

3-3-4-2

20,2

-

29,2

-

7

1-2-4-4

126,8

1,9

35,2

5,3

8

1-2-6-3

86,3

2,0

31,1

5,5

9

3-2-1-2

21,4

1,1

13,2

0,9

10

1-3-1-1

31,2

1,0

93,2

7,1

Keterangan : (-) Tidak dilakukan

Masing-masing ekstrak diidentifikasi dengan KLT, sebagai proses awal digunakan eluen diklorometan:metanol (7:1), diamati dibawah sinar UV 254 nm dan UV 366 nm dan disemprot dengan penampak noda serium sulfat yang bertujuan untuk melihat adanya metabolit sekunder dari masing-masing ekstrak. Pada plat KLT yang berbeda, dilakukan juga identifikasi terhadap masing-masing ekstrak dengan menggunakan pereaksi Dragendorff yang bertujuan untuk mendeteksi adanya senyawa alkaloid. Profil KLT dari 16 ekstrak yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat dan pereaksi Dragendorff dapat dilihat pada Gambar 4.2


29

(a)

(e)

(b)

(c)

(f)

(g)

(d)

(h)

Gambar 4.2 Profil KLT dari 16 ekstrak yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat dan pereaksi Dragendorff Eluen : diklorometan:metanol (7:1) Keterangan: (a) Ekstrak etil asetat:metanol (4:1) kultur jamur pada medium PDB yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat (b) Ekstrak etil asetat:metanol (4:1) kultur jamur pada medium PDB yang disemprot dengan pereaksi Dragendorff (c) Ekstrak kloroform kultur jamur pada medium PDB yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat (d) Ekstrak kloroform kultur jamur pada medium PDB yang disemprot dengan pereaksi Dragendorff (e) Ekstrak etil asetat:metanol (4:1) kultur jamur pada medium GYP yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat (f) Ekstrak etil asetat:metanol (4:1) kultur jamur pada medium GYP yang disemprot dengan pereaksi Dragendorff UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

30

(g) Ekstrak kloroform kultur jamur pada medium GYP yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat (h) Ekstrak kloroform kultur jamur pada medium GYP yang disemprot dengan pereaksi Dragendorff

Berdasarkan profil KLT yang ditunjukkan pada Gambar 4.2 dengan penyemprotan penampak noda serium sulfat dapat diketahui bahwa pada 8 ekstrak etil asetat:metanol (4:1) dan 8 ekstrak kloroform kultur jamur mengandung beberapa senyawa kimia yang merupakan hasil bioproduksi metabolit sekunder hasil kultivasi tahap kedua dari 4 isolat jamur pada 2 medium yaitu medium PDB dan GYP. Hasil identifikasi dengan pereaksi Dragendorff menunjukkan bahwa pada ekstrak kloroform no. 10 (d), 7 (h), 8 (h), 9 (h), dan 10 (h) menunjukkan adanya senyawa alkaloid (munculnya noda warna jingga). Untuk mengetahui adanya aktivitas antibakteri pada masing-masing ekstrak maka dilakukan uji bioautografi. Uji bioautografi ini merupakan suatu metode yang menggabungkan penggunaan teknik kromatografi lapis tipis dengan respon dari mikroorganisme yang diuji berdasarkan aktivitas biologi dari suatu analit yang dapat berupa antibakteri, antijamur, antitumor, antriprotozoa (Choma, 2005). Keuntungan metode bioautografi ini yaitu sifatnya yang efisien untuk mendeteksi adanya senyawa antimikroba karena letak bercak dapat ditentukan walaupun berada dalam campuran yang kompleks sehingga memungkinkan untuk mengisolasi senyawa aktif tersebut (Pratiwi, 2008). Dalam uji aktivitas antibakteri ini digunakan 2 bakteri uji, yaitu bakteri Staphylococcus aureus dan bakteri Escherichia coli yang telah diidentifikasi secara mikroskopis dengan metode pewarnaan Gram. Gambar hasil identifikasi dapat dilihat pada Lampiran 6. S. aureus merupakan bakteri Gram positif berbentuk kokus (bulat) yang merupakan penyebab berbagai infeksi pada manusia dan hewan (Pelczar & Chan, 1986; Todar, 2002). Sedangkan E. coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk basil (batang) yang merupakan mikroflora normal dalam tubuh manusia akan tetapi pada galur-galur tertentu dapat menyebabkan penyakit pada manusia dan hewan (Pelczar & Chan, 1986; Holt et al., 1994).


31

Uji aktivitas antibakteri ini menggunakan metode bioautografi langsung, dimana plat KLT yang telah ditotolkan dengan 10 µL dari masing-masing ekstrak yang memiliki konsentrasi 10 mg/mL, dicelupkan kedalam suspensi bakteri uji. Setelah diinkubasi pada suhu 37 0C selama 18 jam, plat KLT disemprot dengan reagen warna INT secara merata yang bertujuan untuk mewarnai adanya bakteri yang masih hidup. Hal ini terjadi karena adanya reaksi enzimatik yang mengubah garam tetrazolium menjadi formazan yang berwarna merah, sehingga akan dihasilkan zona hambat yang tidak berwarna jika spot ekstrak bersifat aktif sebagai antibakteri.

H+

Garam Tetrazolium

Formazan

Gambar 4.3 Reaksi garam tetrazolium (kuning) menjadi formazan (merah) (Senoz, 2012)

Hasil identifikasi terhadap aktivitas antibakteri dari 28 ekstrak kultur jamur dengan bakteri uji S. aureus dan E. coli dapat dilihat pada Gambar 4.4 dan Gambar 4.5.


32

(d)

(c)

(a)

(b)

(e) Gambar 4.4 Hasil uji bioautografi ekstrak kultur jamur dengan bakteri uji S. aureus

(d)

(c)

(a)

(b)

(e) Gambar 4.5 Hasil uji bioautografi ekstrak kultur jamur dengan bakteri uji E. coli Keterangan: (a) Ekstrak etil asetat kultur jamur pada medium PDB (b) Ekstrak etil asetat kultur jamur pada medium GYP (c) Ekstrak kloroform kultur jamur pada medium PDB (d) Ekstrak kloroform kultur jamur pada medium GYP UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

33

(e) Kontrol positif antibiotik kloramfenikol 5 µg (kiri) dan 10 µg (kanan)

Dari hasil uji bioautografi ini, dapat diketahui bahwa ekstrak kultur jamur endofit yang memiliki aktivitas antibakteri yaitu ekstrak no. 9 (isolat 3-2-1-2) dan no. 10 (isolat 1-3-1-1) yang dikultivasi pada medium PDB dan diekstraksi dengan pelarut kloroform. Diameter zona hambat ekstrak no. 10 (S. aureus : 0,9 cm dan E. coli : 0,8) lebih besar daripada ekstrak no. 9 (S. aureus : 0,6 cm dan E. coli : 0,6 cm), sehingga dapat dikatakan bahwa jamur endofit no. 10 memiliki aktivitas antibakteri lebih besar daripada jamur endofit no. 9. Selanjutnya dilakukan scaling up terhadap kultur jamur endofit no. 10 pada medium PDB.

4.2 Scaling Up Jamur Endofit No. 10 (Isolat 1-3-1-1) pada Medium PDB Berdasarkan hasil skrining, diketahui bahwa ekstrak kloroform kultur jamur endofit no. 10 yang dikultivasi pada medium PDB memiliki aktivitas sebagai antibakteri yang paling besar terhadap bakteri uji S. aureus dan E. coli. Maka, dilakukan scaling up terhadap kultur jamur endofit no. 10 agar metabolit bioaktif yang diperoleh lebih banyak dan mencukupi untuk dilakukan uji selanjutnya. Proses scaling up ini dilakukan pada medium PDB sebanyak 2 liter dengan masa kultivasi selama 3 minggu. Kultur jamur endofit hasil scaling up diekstraksi secara ekstrasel dan intarsel yaitu dengan cara memisahkan antara medium dengan biomassanya dengan cara disaring. Medium diekstraksi dengan pelarut kloroform, sedangkan untuk biomassa dilakukan maserasi dengan aseton sebanyak 3x24 jam. Hasil maserasi diekstraksi dengan kloroform. Semua proses ekstraksi dilakukan dengan menggunakan pelarut sebanyak 1:1 terhadap fraksi air kultur jamur dan dilakukan sebanyak 3 kali. Hal ini bertujuan agar diperoleh ekstrak sebanyak mungkin. Masing-masing fraksi yang didapat dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator. Selanjutnya dilakukan uji KLT-bioautografi pada ekstrak kloroform medium jamur dan ekstrak kloroform biomassa jamur dengan konsentrasi masingmasing ekstrak 10 mg/mL yang ditotolkan pada plat KLT sebanyak 10 µL dengan pipa kapiler, dikembangkan dengan eluen diklorometan:metanol (15:1) yang bertujuan untuk mengetahui nilai Rf dari senyawa yang aktif sebagai antibakteri. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

34

Profil KLT-bioautografi ekstrak kultur jamur endofit no.10 hasil scaling up dapat dilihat pada Gambar 4.6.

(a)

(b)

(c)

Gambar 4.6 Profil KLT-bioautografi ekstrak kultur jamur no. 10 (isolat 1-3-1-1) hasil scaling up Eluen diklorometan:metanol (15:1) Keterangan : (a) Hasil uji bioautografi ekstrak kultur jamur no.10 dengan bakteri uji S. aureus (b) Hasil uji bioautografi ekstrak kultur jamur no. 10 dengan bakteri uji E. coli (c) Hasil uji KLT ekstrak kultur jamur no. 10 yang disemprot dengan pereaksi penampak noda serium sulfat MC : Ekstrak kloroform medium jamur no.10 BC : Ekstrak kloroform biomassa jamur no.10

Berdasarkan hasil uji KLT-bioautografi pada kedua ekstrak, dapat diketahui bahwa zona hambat pada spot ekstrak kloroform biomassa jamur lebih besar daripada ekstrak kloroform medium jamur. Zona hambat yang terlihat pada ekstrak kloroform biomassa jamur memiliki nilai Rf 0,18-0,78 (bakteri uji S. aureus) dan nilai Rf 0,25-0,72 (bakteri uji E. coli). Sedangkan untuk ekstrak kloroform medium jamur memiliki nilai Rf 0-0,53 (bakteri uji S. aureus) dan nilai Rf 0,42-0,68 (bakteri uji E. coli). Tahap selanjutnya dilakukan fraksinasi dan purifikasi metabolit bioaktif antibakteri dari ekstrak kloroform biomassa jamur.


35

4.3 Fraksinasi dan Purifikasi Metabolit Bioaktif Antibakteri dari Ekstrak Kloroform Biomassa Jamur Endofit No. 10 (Isolat 1-3-1-1) Proses pemisahan metabolit bioaktif dari ekstrak pekat kloroform dari biomassa jamur sebanyak 161,7 mg dilakukan dengan metode kromatografi kolom menggunakan fase diam silika gel 70-230 mesh. Berdasarkan hasil optimasi dengan KLT maka dipilih fase gerak kloroform:metanol (30:1). Eluat yang keluar ditampung dalam tabung reaksi dan dimonitor dengan KLT menggunakan eluen diklorometan: metanol (15:1), dari proses pemisahan ini diperoleh 42 tabung reaksi dan spot yang memiliki pola kromatogram yang sama digabung menjadi satu fraksi sehingga didapat 8 fraksi yang kemudian dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator dan diidentifikasi dengan KLT (Gambar 4.7). Adapun bobot dari masing-masing fraksi yaitu fraksi 1 (81,7 mg), 2 (20,6 mg), 3 (10,4 mg), 4 (1,9 mg), 5 (27,8 mg), 6 (5,7 mg), 7 (6 mg), dan 8 (7 mg).

Gambar 4.7 Profil KLT hasil fraksinasi ekstrak kloroform biomassa jamur setelah disemprot dengan penampak noda serium sulfat Eluen: diklorometan:metanol (15:1)

Berdasarkan pola kromatogram diatas, spot tunggal dari senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri belum didapat sehingga perlu dilakukan proses pemisahan selanjutnya. Proses pemisahan ini dilakukan pada fraksi 3 (10,4 mg) dengan metode kromatografi kolom menggunakan fase diam silika gel 70-230 mesh. Berdasarkan hasil optimasi dengan KLT maka dipilih fase gerak n-heksana:etil asetat (3:1). Eluat yang keluar ditampung dalam tabung reaksi dan dimonitor dengan KLT menggunakan eluen n-heksana:etil asetat (2:1), dari proses pemisahan ini diperoleh 44 tabung reaksi dan spot yang memiliki pola UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

36

kromatogram yang sama digabung menjadi satu fraksi sehingga didapat 6 fraksi yang kemudian dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator dan diidentifikasi dengan KLT (Gambar 4.8). Adapun bobot dari masing-masing fraksi yaitu fraksi 3a (0,7 mg), 3b (2,5 mg), 3c (2,2 mg), 3d (1,6 mg), 3e (1,4 mg), dan 3f (1,8 mg).

Gambar 4.8

Profil KLT fraksi hasil kromatografi kolom fraksi 3 setelah disemprot dengan penampak noda serium sulfat Eluen: n-heksana:etil asetat (2:1)

Berdasarkan profil KLT diatas, pemisahan senyawa dari fraksi 3 (10,4 mg) menghasilkan spot tunggal pada fraksi 3e (1,4 mg). Dikarenakan keterbatasan jumlah sampel yang didapat, uji kemurnian dari senyawa ini hanya dilakukan dengan KLT tiga sistem eluen dan KLT dua dimensi. Senyawa yang didapat berupa serbuk putih dan menimbulkan noda berwarna hijau pada KLT setelah disemprot dengan penampak noda serium sulfat. Selanjutnya dilakukan uji KHM pada fraksi murni yang didapat.

4.4 Penentuan Nilai KHM (Kadar Hambat Minimum) Uji KHM dilakukan pada fraksi 3e yang dilarutkan dengan DMSO 30% hingga didapat konsentrasi 512 μg/mL dengan rentang konsentrasi pengenceran dimulai dari 128 μg/mL hingga 1 μg/mL. Medium untuk inokulasi bakteri uji digunakan medium MHB (Mueller Hinton Broth) dan digunakan kontrol pembanding yaitu antibiotik komersial eritromisin dan kloramfenikol.


37

Gambar dari hasil uji KHM ini dapat dilihat pada Lampiran 7 dengan hasil yang diberikan pada Tabel 4.2.

Tabel 4.2 Data nilai KHM terhadap bakteri uji S. aureus dan E. coli Larutan uji

Nilai KHM (µg/mL) S. aureus

E. coli

Fraksi 3e

32

>128

Eritromisin

≤1

64

Kloramfenikol

4

8

Berdasarkan hasil uji KHM terhadap bakteri uji S. aureus didapatkan hasil bahwa fraksi 3e mempunyai nilai KHM : 32 µg/mL, untuk kontrol positif antibiotik eritromisin yaitu 1 µg/mL dan kloramfenikol 4 µg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa kekuatan antibakteri terhadap bakteri uji S. aureus dari fraksi 3e masih dibawah kekuatan antibiotik eritromisin dan kloramfenikol. Sedangkan hasil uji KHM terhadap bakteri uji E. coli didapatkan hasil bahwa fraksi 3e mempunyai nilai KHM : >128 µg/mL, dimana pada konsentrasi 128 µg/mL fraksi 3e hanya bersifat parsial menghambat pertumbuhan bakteri. Nilai KHM untuk kontrol positif antibiotik eritromisin yaitu 64 µg/mL dan kloramfenikol yaitu 8 µg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa kekuatan antibakteri terhadap bakteri uji E. coli dari fraksi 3e masih dibawah kekuatan antibiotik eritromisin dan kloramfenikol. Pada uji KHM ini digunakan beberapa kontrol yaitu sterility control untuk menunjukkan bahwa medium yang digunakan steril dan sebagai kontrol positif dengan tidak adanya pertumbuhan bakteri uji, growth control sebagai kontrol negatif dengan adanya pertumbuhan bakteri uji pada medium, dan solvent control yang digunakan untuk menunjukkan bahwa pelarut yang digunakan tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji.


38

4.5 Identifikasi Jamur Endofit 1-3-1-1 secara Makroskopis dan Mikroskopis Berdasarkan hasil pengamatan secara makroskopis jamur 1-3-1-1 pada medium PDA hari ke-7 menunjukkan bahwa koloni berwarna coklat-hijau dengan permukaan menggunung, memiliki tekstur wooly, memiliki garis radial dan lingkaran konsentris, warna balik koloni coklat-hijau, dan tidak ada tetes eksudat. Secara mikroskopis menunjukkan bahwa hifa jamur berseptat dan berpigmentasi hialin. Diduga jamur 1-3-1-1 merupakan jamur yang berasal dari kelas Coelomycetes. Coelomycetes merupakan jamur aseksual yang menghasilkan hifa yang subur, berseptat, dan bercabang (Cano et al., 2004; Duan et al., 2007; Sutton, 1999). Hasil identifikasi jamur endofit 1-3-1-1 secara makroskopis dan mikroskopis dapat dilihat pada Gambar 4.9.

(a)

(b)

(c)

Gambar 4.9 Gambar jamur endofit 1-3-1-1 (a) koloni tampak atas (b) koloni tampak bawah (reverse side) (c) hifa secara mikroskopik (skala perbesaran 1000x).


39

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 KESIMPULAN 1. Berdasarkan hasil skrining aktivitas antibakteri terhadap 10 isolat jamur endofit yang diisolasi dari bagian daun (1 isolat), tangkai daun (6 isolat), dan bunga (3 isolat) tanaman Kina (Cinchona pubescens Vahl.) yang dikultivasi pada medium PDB dan GYP, diketahui bahwa ekstrak kloroform kultur jamur 1-3-1-1 yang dikultivasi pada medium PDB memiliki aktivitas antibakteri yang paling besar. 2. Dari hasil fraksinasi dan purifikasi ekstrak kloroform biomassa jamur 1-3-1-1 yang dikultivasi pada medium PDB, diperoleh senyawa murni pada fraksi 3e sebanyak 1,4 mg. 3. Uji aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa fraksi 3e memiliki nilai KHM 32 µg/mL terhadap bakteri uji S. aureus, dan >128 µg/mL terhadap bakteri uji E. coli. 4. Berdasarkan hasil identifikasi secara makroskopik dan mikroskopik, diketahui bahwa jamur endofit 1-3-1-1 merupakan jamur kelas Coelomycetes.

5.2 SARAN 1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai penentuan struktur senyawa dari metabolit bioaktif antibakteri yang telah diisolasi. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai identifikasi jamur endofit 1-3-1-1 hingga tingkat spesies. 3. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai skrining aktivitas antibakteri terhadap jamur endofit no. 1-6 (kode isolat: 5-1-8-5, 1-2-5-3, 2-2-6-4, 3-2-10-2, 2-3-4-2, dan 3-3-4-2) yang dikultivasi pada medium PDB dan GYP dan diekstraksi dengan pelarut kloroform.


DAFTAR PUSTAKA

Abdi, Y. A., Gustafsson, L. L., Ericson, O., and Hellgren, U. 2003. Handbook of Drugs for Tropical Parasitic Infections. 2nd Edition. London: Taylor & Fancis Ltd. Agusta, A. 2009. Biologi dan Kimia Jamur Endofit. Bandung: Penerbit ITB. Alexander, Steve K., Strete, D., and Niles, M. J. 2004. Laboratory Exercise in Organismal and Molecular Microbiology. New York: McGraw-Hill. Azevedo, J. L., Maccheroni, W., Jr., Pereira, J. O., and de Araujo, W. L. 2000. Endophytic Microorganisms: A Review on Insect Control and Recent Advances on Tropical Plants. Electron. J. Biotechnol. 3 (1). Braithwaite, A. and Smith, F. J. 1999. Chromatographic Methods. 5th edition. London: Kluwer Academic Publisher. Cano, J., Guarro, J., and Gene, J. 2004. Molecular and Morphological Identification of Colletotrichum Spesies of Clinical Interest. Journal of Clinical Microbiol. 42 (6). 2450-2454. Choi, YW., Hodgkiss, IJ., Hyde, KD. 2005. Enzyme Production by Endophytes of Brucea javanica. J. Agric. Tech. 1, 55-65. Choma, Irena. 2005. The Use of Thin-Layer Chromatography with Direct Bioautography for Antimicrobial Analysis. LCGC Europe. 18 (9). Choma, Irena M and Grzelak, Edtya M. 2010. Bioautography Detection in ThinLayer Chromatography. Elsevier. 1218 (19). Duan, J.X., Wu, W.P., and Liu, X.Z. 2007. Dinemasporium (Coelomycetes). Fungal Diversity. 26: 205-218.

40


41

Ganjar, G.I. dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar. Gandjar, I., R.A. Samson, K. Van Den Tweel-Vermeulen, A. Oetari, dan I. Santoso. 1999. Pengenalan Kapang Tropik Umum. Jakarta: Yayasan Obor Indonesia. Grenish, Henry G. 1920. A Text Book of Materia Medica: Being an Account of the More Important Crude Drugs of Vegetable and Animal Origin. J. & A. Churchill. Harvey, David. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York: Mcgraw-Hill Comp. Holt J. G., Krieg N. R., Sneath P. H., Stanley J.T., and Williams S. T. 1994, Burgey’s Mannual of Determinative Bacteriology, Ed ke-9. Baltimore: William Walkins. Orwa, C., Mutua, A., Kindt, R., Jamnadass, R., and Simons, A. 2009. “Agroforestree Database a Tree Reference and Selection Guide Version 4.0”. (http://www.worldagroforestry.org/af/treedb). Pelczar, M.J. and Chan, ECS. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS., Angka, S. Penerjemah; Jakarta: UI Press. Terjemahan dari: Elements of Microbiol. Pratiwi, Sylvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: Erlangga. Prihatiningtias, W. 2005. “Senyawa Bioaktif Fungi Endofit Akar kuning (Fibraurea chloroleuca Miers) sebagai Agensia Antimikroba”. Tesis. Program Studi Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana UGM. Sarker, S.D., Latif, Z., Gray, A.I. 2005. Methods in BiotechnologyTM. Natural Products Isolation. 2nd edition. New Jersey: Humana Press.


42

Setiabudy, R. 2007. Farmakologi Dan Terapi. Ed ke-5. Departemen Farmakologi dan Terapeutik FKUI, Jakarta : Balai Penerbit FKUI. Simanjuntak, P., Titi Parwati, Bustanussalam, Titik K. Prana, dan Shibuya, H. 2002b. Produksi Alkaloid Kuinina oleh Beberapa Mikroba Endofit dengan Penambahan Zat Induser (Studi Mikroba Endofit Tanaman Cinchona sp. (2)). Majalah Farmasi Indonesia 13 (1), 1-6. Species 2000 & ITIS Catalogue of Life 2013. Indexing The World’s Known Species.

Diakses

tanggal

17

Agustus

2013.

(http://www.catalogueoflife.org/col/details/species/id/9785764) Strobel, G., and Daisy, B. 2003. Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their Natural Products. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 491-502. Sultoni, A. 1995. Petunjuk Kultur Teknis Tanaman Kina. Jakarta: Asosiasi Penelitian dan Pengembangan Perkebunan Indonesia. Sutton, D.A. 1999. Coelomycetous Fungi in Human Disease. A Review: clinical entities, phatogenesis, identification and therapy. Rev. Iberoam. Micol. 16, 171179. Tan, R.X., and W.X. Zou. 2001. Endophytes : A Rich Source of Functional Metabolites. Nat. Prod. Rep. 18, 448-459. Todar, K. 2002. The Control of Microbial Growth. Wisconsin: University of Wisconsin. Yu, H., Zhang, L., Lin, L., Zheng, C., Guo, L., Li, W., Sun, P., and Qin, L. 2010. Recent Developments and Future Prospects of Antimicrobial Metabolites Produced by Endophytes. Mic. Research. Elsevier. 165, 437-449.


43

Zinniel, DK., Lambrecht, P, Haris, NB., Feng, Z., Kuczmarski, D., Higley, P., Ishimaru,

CA., Arunakumari, A., Barletta, RG., and Vidader, AK. 2002.

Isolation and Characterization of Endophytic Colonizing Bacteria

from

Agronomics Crops and Prairie Plants. Appl Environ Microbiol. 68, 2198-2208.


LAMPIRAN

Lampiran 1. Diagram Alur Penelitian

10 isolat murni jamur endofit yang diisolasi dari bagian daun (1), tangkai daun (6), dan bunga (3) tanaman Kina (Cinchona pubescens Vahl.)

Skrining aktivitas antibakteri jamur endofit

Scaling up kultur jamur endofit yang paling aktif sebagai antibakteri

Fraksinasi dan purifikasi metabolit bioaktif antibakteri

Penentuan nilai KHM

Identifikasi jamur endofit yang paling aktif sebagai antibakteri

44


45

Lampiran 2. Diagram Skrining Aktivitas Antibakteri

10 isolat murni jamur endofit

Kultivasi tahap pertama: Isolat no. 1-6 masing-masing dikultivasi pada 40 ml medium PDB dan GYP Diinkubasi selama 3 minggu pada suhu ruang

Kultivasi tahap kedua: Isolat no. 7-10 masing-masing dikultivasi pada 40 ml medium PDB dan GYP Diinkubasi selama 3 minggu pada suhu ruang

Diekstraksi menggunakan pelarut etil asetat:metanol (4:1) sebanyak 3x40 ml

Diekstraksi menggunakan pelarut etil asetat:metanol (4:1) dan fraksi airnya diekstraksi lagi dengan kloroform (1:1) sebanyak 3x40 ml

Diidentifikasi dengan KLT- Bioautografi

Terbentuk zona hambat

Tidak terbentuk zona hambat

(Aktivitas antibakteri (+) )

(Aktivitas antibakteri (-) )

Scaling Up kultur jamur endofit yang paling aktif sebagai antibakteri


46

Lampiran 3. Diagram Scaling Up Jamur Endofit yang Paling Aktif sebagai Antibakteri

Jamur endofit no. 10 (isolat 1-3-1-1) dikultivasi pada 2 liter medium PDB selama 3 minggu pada suhu ruang

Disaring untuk memisahkan biomassa dengan mediumnya

Medium

Biomassa

Dimaserasi dengan aseton 3 x 24 jam

Hasil maserasi diekstraksi dengan kloroform (1:1) sebanyak 3 kali

Fraksi kloroform (lap. bawah)

Diekstraksi dengan kloroform (1:1) sebanyak 3 kali

Fraksi air (lap. atas)

Fraksi Kloroform (lap. bawah)

Fraksi air (lap. atas)

Masing-masing fraksi dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator Dilakukan uji KLT-Bioautografi Fraksinasi dan purifikasi metabolit bioaktif antibakteri Penentuan nilai KHM


47

Lampiran 4. Diagram Fraksinasi dan Purifikasi Metabolit Bioaktif Antibakteri

Ekstrak pekat kloroform dari biomassa jamur ( 161,7 mg)  Difraksinasi dengan kromatografi kolom menggunakan silika 70-230 mesh eluen kloroform:metanol (30:1)  Dimonitor dengan KLT menggunakan eluen diklorometan:metanol (15:1), diamati dibawah sinar UV 254 dan 366 nm dan disemprot pereaksi penampak noda serium sulfat

F1 81,7 mg

F2 20,6 mg

F3 10,4 mg

F4 1,9 mg

F5 27,8 mg

F6 5,7 mg

F7 6 mg

 Difraksinasi dengan kromatografi kolom menggunakan silika 70:230 mesh eluen heksana:etil asetat (3:1)  Dimonitor dengan KLT menggunakan eluen heksana:etil asetat (2:1), diamati dibawah sinar UV 254 dan 366 nm dan disemprot pereaksi penampak noda serium sulfat

F 3a 0,7 mg

F 3b 2,5 mg

F 3c 2,2 mg

F 3d 1,6 mg

F 3e 1,4 mg

F 3f 1,8 mg

Didapat spot tunggal Dilakukan uji KHM


F8 7 mg

48

Lampiran 5. Perhitungan Jumlah Koloni Bakteri

Koloni yang muncul x faktor pengenceran

Jumlah koloni bakteri

= Volume yang dipipet

Bakteri uji S. aureus Jumlah koloni bakteri

65 x 108

=

= 6,5 x 1010

0,1 ml

Pengenceran bakteri 4.500 µl MHB

500 µl

50 µl

200 µl

107

109

Suspensi bakteri 6,5 x 1010

19.800 µl MHB

4.950 µl MHB

105

Bakteri uji E. coli Jumlah koloni bakteri

=

105 x 106

= 1,05 x 109

0,1 ml

Pengenceran bakteri 4.950 µl MHB

50 µl

Suspensi bakteri 1,05 x 109

19.800 µl MHB

200 µl

107

105 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

49

Lampiran 6. Gambar Identifikasi Bakteri Uji dengan Pewarnaan Gram dan Diamati Menggunakan Mikroskop Cahaya

Bakteri uji S. aureus (Bakteri Gram positif) Skala perbesran 400x

Bakteri Uji E. coli (Bakteri Gram negatif) Skala perbesran 4000x


50

Lampiran 7. Gambar Hasil Uji KHM

Sampel uji F.3e

Eritromisin

Kloramfenikol

128 µg/ml

Sterility

64 µg/ml

control

32 µg/ml

Growth control

16 µg/ml

DMSO

8 µg/ml

30%

4 µg/ml 2 µg/ml

Etanol 20%

1 µg/ml

Bakteri uji Staphylococcus aureus

Sampel uji F.3e

Eritromisin

Kloramfenikol Sterility

128 µg/ml

control 64 µg/ml Growth

32 µg/ml

control 16 µg/ml DMSO

8 µg/ml

30%

4 µg/ml 2 µg/ml

Etanol 20%

1 µg/ml

Bakteri uji Escherichia coli UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

51

Lampiran 8. Komposisi dan Cara Pembuatan Medium yang Digunakan

1. Medium PDB (Potato Dextrose Broth) Komposisi Medium PDB PDB Himedia

0,48 g

Dekstrosa

19,6 g

pH 5,1 ± 0,2, suhu 25 0C

Cara Pembuatan: 24 gram PDB disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit.

2. Medium GYP (Glucose Yeast extract Peptone) Komposisi Medium GYP Glucose

20,0 g

Yeast extract

1,0 g

Peptone

5,0 g

K2HPO4

0,5 g

Mg2SO4. 7H2O

0,5 g

FeSO4

0,01 g

CaCO3

1,0 g

pH 7,0 ± 0,2, suhu 25 0C Cara Pembuatan: Bahan-bahan medium GYP yang sudah ditimbang disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit.


52

3. Medium PDA (Potato Dextrose Agar) Komposisi Medium PDB Potato Starch

4,0 g

Dekstrosa

20,0 g

Agar

15,0 g

pH 5,1 ± 0,2, suhu 25 0C

Cara Pembuatan: 24 gram PDB disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit.

4. Medium BHI (Brain Heart Infusion) Komposisi medium BHI Brain Heart, Infusion from (Solids)

6,0 g

Peptic Digest of Animal Tissue

6,0 g

Sodium Chloride

5,0 g

Dextrose

3,0 g

Pancreatic Digest of Gelatin

14,5 g

Disodium Phosphate

2,5 g

0

pH 7,4 ± 0,2, suhu 25 C Cara pembuatan: 37 gram BHI disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit.

5. Medium MHA (Mueller Hinton Agar) Komposisi Medium MHA Beef Extract Powder

2,0 g

Acid Digest of Casein

17,5 g

Starch

1,5 g UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

53

Agar

17,0 g

pH 7,4 ± 0,2, suhu 25 0C Cara pembuatan: 38 gram MHA disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit.

6. Medium MHB (Mueller Hinton Broth) Komposisi Medium MHA Cassein Acid Hydrolysate

17,5 g

Beef Extract

2,0 g

Starch

1,5 g

pH 7,4 ± 0,2, suhu 25 0C Cara pembuatan: 21 gram MHB disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit.

7. Medium NA (Nutrient Agar) Komposisi Medium NA Agar

15,0 g

Gelatin Peptone

5,0 g

Beef Extract

3,0 g

pH 7,4 ± 0,2, suhu 25 0C Cara pembuatan: 23 gram NA disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit.


54

Lampiran 9. Gambar Alat-Alat yang Digunakan

Rotary evaporator

Shaker incubator

Oven

Incubator

UV Cabinet

Autoklave

Timbangan digital

Mikroskop cahaya

Laminar air flow UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

SKRINING, ISOLASI, DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI METABOLIT BIOAKTIF JAMUR ENDOFIT DARI TANAMAN KINA (Cinchona pubescens Vahl.)

Recommend Documents