OBSAH: 1 2 3
4
5
6 7
ÚVOD....................................................................................................................... 3 CÍL PRÁCE .............................................................................................................. 4 LITERÁRNÍ PŘEHLED .......................................................................................... 5 3.1 Ovoce a zelenina............................................................................................... 5 3.2 Mikroflóra ovoce a zeleniny ............................................................................. 5 3.2.1 Mikroflóra ovoce ...................................................................................... 5 3.2.2 Mikroflóra zeleniny .................................................................................. 6 3.2.3 Charakteristika skupin bakterií osidlujících ovoce a zeleninu.................. 7 3.2.4 Nejběžnější rody kvasinek vyskytující se na ovoci a na zelenině .......... 11 3.2.5 Charakteristika plísní kontaminujících povrch ovoce a zeleniny ........... 12 3.3 Přehled tradičních metod kultivace a izolace mikroorganismů ...................... 14 3.3.1 Konvenční standardní odpočet z ploten.................................................. 15 3.3.2 Metoda nejpravděpodobnějšího počtu (MPN)........................................ 19 3.3.3 Redukce barvy ........................................................................................ 19 3.3.4 Přímý mikroskopický odpočet (DMC) ................................................... 20 3.3.5 Mikrobiologická zkouška povrchů ......................................................... 21 3.4 Biolog systém ................................................................................................. 21 3.4.1 Princip Biolog systému ........................................................................... 21 3.4.2 Biolog mikrodestičky.............................................................................. 22 3.4.3 Hustota inokula ....................................................................................... 23 MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ ........................................................... 26 4.1 Materiál ........................................................................................................... 26 4.2 Klasické mikrobiologické analýzy.................................................................. 26 4.2.1 Příprava mikrobiologických rozborů ...................................................... 26 4.2.2 Postup mikrobiologických rozborů......................................................... 29 4.3 Analýza mikroflóry s využitím Biolog systému ............................................. 31 4.3.1 Příprava mikrobiologických rozborů ...................................................... 31 4.3.2 Postup mikrobiologických rozborů......................................................... 31 VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUSE ....................................................................... 33 5.1 Mikrobiální osídlení povrchu jablek zjištěné klasickou metodou .................. 33 5.1.1 Mikroflóra povrchu jablek při 0,03% CO2 ve vzduchu ........................ 33 5.1.2 Mikroflóra povrchu jablek uchovávaných při zvýšené koncentraci CO2 (2,5428% CO2)........................................................................................................ 34 5.1.3 Mikroflóra povrchu mrkve...................................................................... 34 5.1.4 Souhrné hodnocení ................................................................................. 35 5.2 Mikroflóra jablek testovaná Biolog systémem ............................................... 36 5.2.1 Mikroflóra povrchu jablek – vzdušná atmosféra (0,03% CO2) .............. 36 5.2.2 Mikroflóra povrchu jablek – prostředí 2,5428% CO2............................. 37 5.2.3 Mikroflóra povrchu mrkve...................................................................... 38 5.2.4 Souhrné hodnocení ................................................................................. 39 ZÁVĚR ................................................................................................................... 41 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY .................................................................... 42
1
Seznam tabulek a grafů
Tab. 1 Seznam substrátů použitých při analýze Biolog Tab. 2 Mikrobiální osídlení povrchu tří odrůd jablek uchovaných při běžné koncentraci CO2 ve vzduchu (0,03% CO2) Tab. 3 Mikrobiální osídlení povrchu jablek uchovávaných při zvýšené koncentraci CO2 (2,5428% CO2) Tab. 4 Mikroflóra mrkve Tab. 5 Substráty odlišené mikroorganismy při analýze Biolog při vzdušné atmosféře Tab. 6 Substráty odlišené mikroorganismy se zvýšeným obsahem CO2
Graf č. 1 Procentické zastoupení substrátů intenzivně využívaných mikroorganismy ve vzdušné atmosféře Graf č. 2 Procentické zastoupení substrátů intenzivně využívaných mikroorganismy v atmosféře se zvýšeným obsahem CO2 Graf č. 3 Procentické zastoupení mikroorganismů intenzivně využívajících substráty na povrchu mrkve
2
1
ÚVOD Ovoce a zelenina ve spojení s mateřskou rostlinou jsou proti rozkladné činnosti
chráněny vlastní životní činností, která hmotu za normálních podmínek chrání před jakýmkoli rozkladem. Teprve po sklizni, kdy se dále nevyvíjí, ale jsou stále živé, se objevují podstatnější změny, podmíněné jednak samotným látkovým složením pletiv, ale i vnějšími činiteli. Příčinou fyzikálně chemických změn nemusí být jen biochemické děje, podmíněné činností enzymatických komplexů, ale i spontánně probíhající procesy zejména mikrobiálního původu, které zhoršují hodnotu a využitelnost těchto potravin. Existující látkovou rovnováhu ovoce a zeleniny významně narušují mikroorganismy tím, že si vlastním enzymatickým systémem zpřístupňují zásobní a výstužné látky rostlinných pletiv, které přeměňují na jednodušší zplodiny. Při tomto rozkladu dochází k podstatným ztrátám živin, jakož i k hlubokým změnám vnějších vlastností hmoty, spojených se zhoršením chutnosti a produkcí látek zdraví škodlivých. Mikroorganismy tedy zásadně narušují normální posklizňový metabolismus, zejména u plodin již oslabených a znesnadňují jejich obranné reakce na infekci. (GOLIÁŠ, 1996)
3
2
CÍL PRÁCE Hlavním cílem této diplomové práce je posouzení a charakteristika fyziologické
diverzity mikroflóry ovoce a zeleniny. Byly vytyčeny tyto dílčí cíle: a) možnost použití systému Biolog pro mikrobiologickou charakteristiku ovoce a zeleniny b) konfrontace získaných dat použitím technologie Biolog a dat dosažených běžnými mikrobiologickými technikami c) zpracování literární rešerše o dosavadních zkušenostech s aplikací systému Biolog při analýzách mikrobiologických společenstev
4
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.1 Ovoce a zelenina Mezi ovoce jsou zahrnuty plody a semena stromů, keřů nebo bylin, uváděné do oběhu bezprostředně po sklizni nebo po určité době skladování v původním syrovém stavu. Podle struktury ovocných plodů a jejich semen se ovoce dělí na jádrové (jablka, hrušky), peckové (třešně, švestky, broskve), bobulové (borůvky, maliny, jahody), skořápkové (ořechy). Mezi ovoce je dále řazeno i jižní ovoce (pomeranče, banány, citrony). (GÖRNER, VALÍK, 2004) Zelenina zahrnuje jedlé části rostlin, zejména kořen, bulvy, listy, nať, květenství, plody jednoletých nebo víceletých rostlin uváděných do oběhu bezprostředně po sklizni nebo po určité době skladování v původním syrovém stavu. Rozeznáváme zeleninu košťálovou (květák, kapusta, zelí, brokolice), kořenovou (mrkev, petržel, celer), listovou (salát, čínské zelí), luskovou (fazole, hrách, cizrna), plodovou (paprika, rajčata), cibulovou, natě, klasy a dužnaté výhonky (VLASÁK, ústní sdělení, 2007).
3.2 Mikroflóra ovoce a zeleniny
3.2.1
Mikroflóra ovoce Dužnina ovoce, zvláště
poraněného,
nechráněného
souvislou
slupkou
je vhodným živným prostředím pro rozvoj mikroorganismů. (FORSYTHE, 1998) Typickou mikroflóru ovoce tvoří především plísně, kvasinky a bakterie. Bakterie jsou zastoupeny méně, jelikož dávají přednost neutrálním hodnotám pH. Ovoce má nižší hodnotu pH, což je způsobeno přítomností ovocných organických kyselin. Výjimkou jsou bakterie mléčného (Lactobacillus) a octového (Acetobacter) kvašení, které se dobře rozvíjejí v kyselém prostředí. (MÜLLER, 1997) Ovoce je více kyselé (pH pod 4,4) než zelenina (pH 5,0 – 6,5). Výjimkou jsou rajčata, kde je vyšší kyselost (pH pod 4,3). Tyto hodnoty nedokáží inhibovat růst většiny mikroorganismů. (KOPEC, 1998) Některé látky přítomné v prostředí mají na mikroorganismy nepříznivý vliv a to v důsledku svého specifického chemického složení. Antimikrobiální látky buď pouze 5
zastavují rozmnožování mikroorganismů (tzv. mikrobistatické látky), nebo je usmrcují (mikrobicidní látky). Působí-li pouze na bakterie, nazývají se látky bakteriostatické nebo baktericidní, ovlivňují-li kvasinky a plísně, jde o látky fungistatické nebo fungicidní. (ŠILHÁNKOVÁ, 2002) Koliformní bakterie bývají přítomny u ovoce jen v malých množstvích. Složení i množství mikroflóry kolísá značně podle druhu ovoce a je ovlivňováno i podmínkami za jakých bylo ovoce pěstováno, sklizeno, a jaké bylo v době sklizně a před sklizní počasí. Na rozsahu kontaminace plodů má značný vliv manipulace při dopravě a čistota obalů, ve kterých je ovoce dováženo. Nevhodnou manipulací a transportem může dojít ke značnému zvýšení mikrobiologické kontaminace. Podstatný rozdíl je mezi mikroflórou zdravých a narušených plodů. Narušené, nahnilé nebo plesnivějící plody mají obsah mikrobů, hlavně kvasinek, bakterií a plísní velmi vysoký. (BARTL a kol., 1966) Čerstvé ovoce má poměrně vysoké hodnoty aw, které podporují růst mnoha hydrofilní a osmofilních plísní. Další vlastností ovoce, která podporuje výskyt mikroorganismů je vyšší obsah cukrů. (BRACKETT, 2001) Některé rostlinné druhy obsahující antibiotika, označovaná jako fytoncidy. Patří sem např. hořčičná silice, přítomná v hořčici a křenu. Rafinín je fytoncid ředkve a ředkvičky. Tomatin obsažený v rajčatech má mimo antimikrobiálních účinků i účinky antialergické a proti zánětlivé. Fytoncidní látky byly nalezeny i v zelí, kapustě hlávkové a kadeřavé, paprice a dalších zeleninách. Isothiokyanáty mají antimikrobiální a také detoxikační účinky a jsou přítomné v brukvovitých zeleninách. Allylové sloučeniny jsou obsažené v cibulových zeleninách. (KOPEC, 1998)
3.2.2
Mikroflóra zeleniny Zelenina celistvá, neporušená, je proti napadení mikroorganismy chráněna svou
biologickou strukturou. Tkáně bývají sterilní, ale někdy mohou mikroorganismy pronikat cestou cévních svazků do lodyh, listů a plodů. Je třeba počítat s tím, že i čerstvá dobře vyhlížející zelenina obsahuje mikroorganismy. (HRUBÝ, 1984) Na zelenině může být přítomno také velké množství kontaminujících mikroorganismů. Jsou to kvasinky, plísně i bakterie. Bakterie jsou mnohem častěji izolovány v počátečních stádiích kontaminace. Znečištění zeleniny může být ovlivněno způsobem obdělávání půdy, na které byla zelenina pěstována. Opakovaný růst jednoho
6
typu zeleniny na stejném území může vést k akumulaci rostlinných patogenů v půdě a tím zvýšit pravděpodobnost kontaminace. (BRACKETT, 2001) Zelenina dopravená přímo od pěstitele je silně mikrobiologicky a mechanicky znečištěná. Ulpívají na ní částečky půdy, které obsahují řádově cca 108 – 109 mikrobů na gram půdy. Kořenová zelenina je silně znečištěna hlínou, má proto podstatně vyšší počty mikrobů, než ostatní zeleniny. (BARTL,1966) Počty mikrobů na povrchu zeleniny jsou závislé na způsobu a době sklizně, dopravy a skladování. Dosahují hodnot 107.g-1 i více. Mytí odstraní až 90 % mikroflóry, ale neodstraní mikroorganismy přítomné v mucinózním povlaku. (HRUBÝ, 1984) Dekontaminaci lze podle některých autorů zvýšit chlorovanou vodou a okyselením prací vody. Kapky vody zbylé po mytí mohou být živnou půdou pro rozvoj sekundární mikroflóry. Při narušení tkáně nejen při sklizni, ale i při krájení zeleniny se uvolňují živiny a otevírá se cesta ke kontaminaci. (ŠROUBKOVÁ, 1999) Dominantní mikroflórou na zdravé zelenině jsou bakterie, časté a hojné jsou i kvasinky, méně časté plísně (FORSYTHE, 1998). Mezi nejčastější původce hnilob zeleniny patří tyto druhy: Hniloba vodnaté zeleniny - Pseudomonas syringe, druhy rodu Xanthomonas, hniloba kořenové zeleniny Erwinia carotovora, Erwina serbinowi, Xanthomonas beticola, Bacillus macerans, Agrobacterium tumefaciens; hniloba zelí a košťálovin – Xanthomonas campestris. (KYZLINK, 1980)
3.2.3
Charakteristika skupin bakterií osidlujících ovoce a zeleninu Bakterie jsou prokaryotní organismy. Řadí se do říše Procaryota. Všechna
prokaryota jsou jednobuněčné organismy. Velikost bakterií kolísá nejen podle druhu, ale i v rámci druhu. Koky mívají v průměru 0,5 až 2 µm, tyčinky mívají tloušťku koků a délku většinou do 3 µm. Vláknité formy bakterií - aktinomycety bývají dlouhé až 100 µm.
Velice
významným
znakem
některých
bakterií
je
schopnost
vytvářet
po předchozím intenzivním množení odolná stádia, zvaná spory. Spory umožňují bakteriím přežít nepříznivé podmínky prostředí. Z každé bakteriální buňky vzniká zpravidla jen jedna spora. (MADIGAN et al., 2000) Charakteristickou vlastností bakterií je obrovská rychlost rozmnožování a intenzita metabolismu, umožňující jim za vhodného pH, teploty a dostatečného množství vody rozložit, a tedy úplně znehodnotit značné množství substrátu.
7
Mimořádně vysoká rychlost rozmnožování umožňuje bakteriím za vhodného pH (kolem neutrálního bodu) a vhodné vodní aktivity prostředí úplně vytlačit kvasinky a plísně, které se rozmnožují mnohem pomaleji. Eukaryotní organismy tedy mohou konkurovat bakteriím pouze v kyselých potravinách, za snížené vodní aktivity nebo za velmi nízkých teplot (-5 až -10 ºC), kdy se zastavuje činnost psychrotrofních bakterií, hnilobné bakterie se vyskytují hojně ve vzduchu v půdě a ve vodě. U zeleniny a málo kyselých druhů ovoce napadají bakterie jen mechanicky poškozená pletiva, z nichž vytéká buněčná šťáva. Pouze bakterie fytopatogenní a symbiotické mohou pronikat do nepoškozených pletiv. Kromě hlubokého rozkladu potravin způsobují některé bakterie již velmi brzy vznik nepříjemné chuti, cizí vůně nebo nepřirozeného zbarvení. (ŠILHÁNKOVÁ, 2002)
Rozšířené rody bakterií ,vyskytující se na ovoci a na zelenině (Syntetizováno z údajů, které publikovali: HRUBÝ, 1984; SEDLÁČEK, 2007; ŠILHÁNKOVÁ, 2002; GÖRNER,VALÍK, 2004; ŽIŽKA, KORBELOVÁ, 1992) •
Acetobacter – gramnegativní aerobní tyčinky a koky. Jsou schopny růst i při pH 4,5. Bývají přítomny v kazícím se ovoci a zelenině, nevyvolávají však onemocnění z potravin. Oxiduje různé sloučeniny na organické kyseliny.
•
Aeromonas – psychrotrofní gramnegativní rovné tyčinky a koky. Škodí potravinám. Rozkládají glukózu, fruktózu a další cukry na kyseliny a plyny. Vyskytují se ve vodách, a to jak podzemních, tak i povrchových, odkud se dostávají do potravin.
•
Bacillus – aerobní i anaerobní grampozitivní peritrichní tyčinky. Mají lipolytické, proteolytické i sacharolytické vlastnosti. V přírodě jsou značně rozšířené. Na povrch ovoce a zeleniny se dostávají z půdy.
•
Citrobacter
–
gramnegativní
fakultativně
anaerobní
tyčinky
čeledi
Enterobacteriaceae. Jsou schopny využívat citrany jako zdroj uhlíku. Patří do skupiny koliformních bakterií. Laktózu zkvašují různě rychle. Tvoří sirovodík. Citrobacter se běžně vyskytuje v trávicím traktu lidí, ale ve vyšších koncentracích může způsobit onemocnění oslabených jedinců.
8
•
Clostridium – tvoří grampozitivní, peritrichální tyčinky. Tvoří též rezistentní spory. Je obligátně anaerobní. Některé druhy jsou ke kyslíku méně citlivé a jsou schopny rozmnožování i za omezeného přístupu vzduchu. Některé druhy mají proteolytické schopnosti, jiné sacharolytické. Na povrch ovoce se může dostat z půdy.
•
Enterobacter – nepatogenní, vyskytuje se ve vodě, v půdě a ve střevním traktu zdravých zvířat a lidí, ale často se nachází i na polní zelenině. Je příčinou kažení potravin. Je typickým zástupcem koliformních bakterií. Produkuje nerozpustný žlutý pigment. Ze sacharidů tvoří plyny CO2 a H2.
•
Erwinia – patří do čeledi Enterobacteriaceae. Jedná se o gramnegativní fakultativně anaerobní tyčinky. Na rozdíl od ostatních zástupců této čeledi se rod Erwinia vyskytuje na rostlinách jako epifycká, saprofytická i patogenní mikroflóra. Může vyvolávat nekrózy nebo jiná poškození rostlin a bývá příčinnou kažení plodů a zeleniny během skladování. Erwinia často při kultivaci tvoří červený pigment.
•
Escherichia - patří do čeledi Enterobacteriaceae. Bývá nazývána střevní tyčinkou, je typickým obyvatelem střeva obratlovců. Podílí se v něm na udržení optimálního mikrobiálního osídlení, produkuje vitaminy. Některé kmeny mohou způsobovat střevní onemocnění, hlavně u novorozenců a kojenců. Jiné kmeny vyvolávají průjmová onemocnění i u dospělých osob. Nesmí se vyskytovat v pitné vodě a dětské výživě. V ostatních potravinách je její obsah limitován. Slouží jako indikátor fekálního znečištění a úrovně sanitace a hygieny. Je hlavním představitelem koliformních bakterií. Pravidelně se vyskytuje v potravinářských surovinách, které byly v kontaktu s hnojenou půdou.
•
Flavobacterium – gramnegativní koky a tyčinky. Rostou aerobně až fakultativně anaerobně. Při růstu na agarových plotnách často vytvářejí žlutě nebo červeně zbarvené kolonie. Mají proteolytické vlastnosti a účastní se i rozkladu některých zelenin. Přímé onemocnění nevyvolávají.
•
Gluconobacter - gramnegativní aerobní koky a tyčinky. Oxidují ethanol v acetát, který však není dále oxidován. Způsobuje kažení jablek a hrušek.
•
Lactobacillus – dlouhé, grampozitivní, nespirálující tyčinky. Rostou anaerobně až mikroaerofilně při teplotách v rozmezí 5º - 53 ºC, pH substrátu musí být kyselé, obvykle mezi pH 5,5–5,8. Mají lipolytické schopnosti, rozkládají
9
glukózu a jiné cukry. V přírodě jsou velmi rozšířené a jsou významné z potravinářského a biotechnologického hlediska. Homofermentativní druh Lactobacillus plantarum se u nás často vyskytuje na rostlinách a uplatňuje se při konzervaci zelí a okurek mléčným kvašením. Spoluúčastní se i rozkladu ovoce. Nevyvolávají onemocnění potravin, naopak, při řízené fermentaci jsou výsledné potraviny stravitelnější. •
Micrococcus - přísně aerobní druh, tvořící shluky buněk. Grampozitivní jsou mírně proteolytické a lipolytické, alimentární onemocnění nevyvolávají. Vyskytují se hojně v přírodě, tedy i v půdě, odkud se mohou dostat na povrch ovoce a zeleniny. Řada z nich produkuje nerozpustná, karotenoidní barviva. Vyskytují se jako častá vzdušná kontaminace.
•
Pseudomonas – jeden z nejrozsáhlejších rodů. Patří mezi gramnegativní tyčinky, které rostou výhradně aerobně, nejčastěji v rozmezí teplot od 4 ºC do 43 ºC. Je mezi nimi mnoho psychrotrofních druhů s metabolickou aktivitou i při teplotách pod 0 ºC. Mají lipolytické a proteolytické schopnosti, rozkládají i řadu pesticidů.
•
Salmonella – gramnegativní fakultativně anaerobní tyčinky patřící do čeledi Enterbacteriaceae. Má přibližně 1200 sérotypů. Při růstu tvoří plyn. Všechny druhy zkvašují glukózu. Jsou obligátně patogenní, některé pouze pro člověka, většina pro zvířata i pro člověka. Vytvářejí termostabilní endotoxiny. Vyskytují se v zažívacím traktu domácích zvířat a hlodavců, nemocných lidí a bacilonosičů, v drůbežích vejcích. Přenášejí se masem, masnými a vaječnými surovinami, polotovary, potravinami a vodou.
•
Shigella – další rod z čeledi Enterobacteriaceae, který je schopen vyvolat alimentarní onemocnění. Jsou to gramnegativní fakultativně anaerobní tyčinky Od salmonel se taxonomicky liší tím, že glukóza je zkvašována za tvorby kyselin, ale bez vzniku plynu a všechny kmeny jsou nepohyblivé. Vyskytují se v přírodě, v trávicím ustrojí lidí a v odpadních vodách ze sídlišť. Do potravin se dostávají výhradně sekundární kontaminací. Přenašečem jsou poživatiny, které se tepelně neupravují.
10
3.2.4
Nejběžnější rody kvasinek vyskytující se na ovoci a na zelenině Kvasinky jsou chemoheterotrofní eukaryotické organismy patřící mezi houby,
v přírodě jsou velmi rozšířené. Vyskytují se běžně v přírodě, kde jsou šířeny různými přenašeči, hlavně hmyzem a větrem. Ve vzduchu je hodně kvasinek v době květu. Buňky kvasinek se skládají z polopropustné stěny, tvořené polysacharidy, cytoplazmatické membrány, která obklopuje cytoplasmu s jádrem. Velikost buněk kolísá od 2 do 10 µm. Kvasinky aerobních druhů se shlukují na povrchu substrátů jako kožky, mázdra a křís. Kvasinky se množí pučením, dělením nebo sporulací. Kvasinky jsou na vegetační podmínky náročnější něž plísně. Vyžadují kyselé prostředí s obsahem alespoň malého množství kyslíku, různé růstové látky, amoniakální dusík a také fosfor, draslík, hořčík a síru. (KYZLINK, 1980) Kvasinky vyžadující pro růst kyselé prostředí (jejich optimální pH se pohybuje mezi 4,2–5,5) a již slabě alkalické ústojné prostředí (pH kolem 7,5) zastavuje jejich růst (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Kvasinky jsou velmi přizpůsobivé organismy, tentýž druh si může navyknout na různá prostředí a na další funkce (KYZLINK, 1980). Negativně se uplatňují patogenní kvasinky, hlavně Candida albicans, Criptococcus neoformans, dále rody Filobasidiella a Malasseria. Většinou tyto kvasinky způsobují vážná onemocnění pouze u oslabených jedinců nebo při poškození imunitního systému (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Při masivní kontaminaci mohou kvasinky způsobit lehčí onemocnění trávicího traktu. Kromě toho se mohou vyskytovat v potravinách také patogenní kvasinky způsobující především kožní onemocnění trávicího a dýchacího ústrojí (HRUBÝ, 1984).
Rozšířené rody kvasinek, vyskytující se na ovoci a na zelenině •
Saccharomyces – rozmnožují se vegetativním multilaterálním pučením, ale netvoří pravé mycelium. Vyskytují se na ovoci a v ovocných produktech. Zkvašují glukózu, galaktózu, sacharózu, maltózu a rafinózu.
•
Candida – tvoří pseudomycelium. V přírodě se na ovoci velice často vyskytuje Candida albicans, která u lidí se sníženou imunitou vyvolává kožní nemoci a onemocnění sliznic.
11
•
Cryptococcus – má buňky většinou kulaté nebo oválné. Často tvoří sliz. Vyskytuje se v přírodě, na potravinách a nápojích. Některé druhy způsobují nemoci zvířat a lidí.
•
Rhodotorula – buňky jsou kulaté, oválné nebo podlouhlé. Tvoří pigmenty karotenového charakteru červené a oranžové barvy. Nezkvašují žádné cukry.
•
Torulaspora – tvoří buňky kulaté nebo trochu oválné. Jsou výrazně halotolerantní, mají schopnost růst v prostředí, které obsahuje až 24 % NaCl. Vyskytují se v solných nálevech, v přírodě na některých rostlinách a v půdě. (GÖRNER,VALÍK, 2004)
3.2.5
Charakteristika plísní kontaminujících povrch ovoce a zeleniny Plísně jsou vícebuněčné, eukaryotní, chemoheterotrofní mikroorganismy,
saprofytické nebo parazitické. Některé druhy plísní jsou rozšířeny po celém světě. Velká morfologická rozmanitost a schopnost přizpůsobit se nejrůznějším ekologickým podmínkám umožňuje jejich výskyt tam, kde existuje organická hmota. Spory plísní jsou jednobuněčné nebo vícebuněčné výtrusy a slouží k jejich rozmnožování a přežívání. Jsou přítomny v ovzduší, půdě, vodě, na povrchu živých a odumřelých organismů na různých předmětech, v krmivech apod. Velmi vhodným substrátem pro osídlení, růst a rozmnožování plísní jsou potraviny. (OSTRÝ, 2000) Hlavním rezervoárem plísní je půda, z níž se dostává do vzduchu a na organický materiál převážně rostlinného původu. Různá barviva konidií i endospor plísní (a v některých případech i mycelia) chrání tyto buňky před nepříznivými účinky ultrafialové složky slunečního světla, a proto se plísně vyskytují jako velmi častá vzdušná kontaminace. (ŠILHÁNKOVÁ, 2002) Význam plísní je dán jejich fyziologickými vlastnostmi. Vzhledem k přísně aerobní povaze se mohou rozmnožovat většinou pouze na povrchu napadeného materiálu. Tyto materiály napadají, jsou-li uložené ve vlhkém prostředí a tím způsobují vysoké ztráty. Schopnost rozmnožovat se i za nízkého pH umožňuje plísním uplatnit se i tam, kde většina bakterií již není schopna metabolické činnosti. (ŠILHÁNKOVÁ, 2002) Optimální pH většiny plísní je poblíž neutrálního bodu, avšak mohou se rozmnožovat ve velmi širokém rozmezí pH (1,2–11). Při silně kyselém pH (0,5–2,0)
12
se rozmnožují především druhy tvořící značné množství organických kyselin (např. některé aspergily a penicilin). (ŠILHÁNKOVÁ, 2002) Některé plísně rostou i za velmi nízké teploty (dokonce i při -10 ºC). Na rozdíl od bakterií se plísně rozmnožují mnohem pomaleji a proto mohou bakteriím konkurovat pouze v extrémních podmínkách. Oproti kvasinkám a bakteriím mají plísně výhodu v tom, že jsou schopny napadat i neporušená rostlinná pletiva, čímž otevírají cestu bakteriálnímu rozkladu. (ŠILHÁNKOVÁ, 2002) Mimořádně vysoký negativní význam mají plísně z hlediska tvorby mykotoxinů. Nebezpečnými mykotoxiny u ovoce a zeleniny jsou patulin a fusariové mykotoxiny. Patulin je produkován některými druhy rodu Penicillium a Aspergillus a nachází se v různých druzích ovoce, zejm. v jablkách a výrobcích z nich. U patulinu byly prokázány karcinogenní, mutagenní a teratogenní účinky. V různých poživatinách se nalézá řada plísní, jejichž izobáty jsou v různých testech toxicity i genotoxicity pozitivní, aniž by byl dosud znám jejich toxický metabolit. (HRUBÝ, 1996)
Rozšířené rody plísní, vyskytující se na ovoci a na zelenině (Syntetizováno z údajů, které publikovali: ŠILHÁNKOVÁ, 2002; GÖRNER, VALÍK, 2004.)
Třída Zygomycetes •
Mucor – je nejrozsáhlejším rodem této třídy, který zahrnuje přes 100 druhů. Na ovoci a zelenině tvoří volně vláknitý, většinou bělavý porost s kulovitými nahnědlými sporangii, jejichž kolumela má různý tvar. Některé druhy produkují lykotoxiny, jiné jsou navíc ještě patogenní.
•
Rhizopus – v přírodě je velmi rozšířený. Způsobuje kažení ovoce a jiných potravin. Některé druhy tvoří mykotoxiny, některé jsou patogenní.
Třída Deuteromycotina •
Alternaria – způsobuje ve skladištích zeleniny hlavně skvrnitost košťálovin a černou hnilobu mrkve. Některé kmeny produkují mykotoxiny. Tmavá barva spor (zelenočerná až hnědočerná) i tmavé zbarvení mycelia chrání tuto plíseň před nepříznivými účinky slunečního světla, a proto se vyskytují často ve vzduchu v přírodě i v různých potravinářských provozech.
13
•
Botrytis – kolonie jsou z počátku bělavé, později šedé, hnědavo-žluté až černé. Vyskytují se ubikvitárně. Jsou to saprofyté nebo fakultativně parazitují na rostlinách. Způsobují hnilobu jádrového ovoce, šedou hnilobu bobulovin, zeleniny a částí rostlin.
•
Cladosporium - se vyskytuje ubikvitárně, saprofyticky nebo fakultativně paraziticky na rostlinách. Nachází se na obilí, ovoci a zelenině. Způsobuje zelenou hnilobu.Vyskytuje se na stěnách potravinářských provozoven. Rozkládá celulosu, pektiny a tuky.
•
Fusarium – velmi rozsáhlý rod a v přírodě velmi rozšířený. Způsobuje kažení jablek, rajčat, brambor aj. Některé druhy způsobují choroby rostlin, jiné produkují toxiny, které mohou vést k vážnému onemocnění člověka.
•
Monilia – produkuje dlouhé řetězce podií, jež tvoří bělavé až oranžové povlaky na nejrůznějším materiálu. Působí velké škody na téměř všech druzích ovoce.
Třída Ascomycetes •
Aspergillus – je ubikvitární parazit. Častý původce kažení potravin a krmiv, ovoce a ovocných produktů, zeleniny a zeleninových produktů. Jako nenáročný saprofyt se vyskytuje také na obilí, mlýnských a pekařských výrobcích. Někteří zástupci jsou termorezistentní, jiní jsou producenti toxinu.
•
Penicillium – je z plísní nejrozšířenějším a nejrozsáhlejším rodem, zahrnuje asi 150 druhů. Jeho druhy tvoří kolonie s velkým množstvím žlutozelených až modrozelených konidií, které jsou na různých potravinách patrné jako zelené, sametové až moučné povlaky. Okraje kolonií, na nichž nejsou spory, jsou bílé. Příslušníci tohoto rodu způsobují kažení především ovoce a zeleniny.
3.3 Přehled tradičních metod kultivace a izolace mikroorganismů Metody analýzy vzorků Analýzy potravin na přítomnost, druh a počet mikroorganismů nebo jejich produktů jsou pro mikrobiologii potravin základní. Přestože jsou tyto zkoušky velmi důležité, žádná z běžně používaných metod neumožňuje určit v potravinářském výrobku přesné všechny mikroorganismy. Některé metody analýzy jsou sice lepší než jiné, ale každá metoda má co do jejího použití určité omezení.
14
Pro stanovení celkového počtu mikroorganismů se používají následující čtyři základní metody: •
Standardní odečet z ploten (SPC) nebo odečet aerobních organismů z ploten (APC), kterou se určuje počet životaschopných buněk nebo jednotek tvořících kolonie.
•
Metoda nejpravděpodobnějšího počtu (MPN) jako statistické určení živých buněk.
•
Techniky stanovení podle redukce barvy, pomocí nichž se odhaduje množství živých buněk, které mají schopnost redukovat barvu.
•
Přímý mikroskopický odečet (DMC), kterým se určuje počet živých i neživých buněk.
(Výhody a nevýhody uvedených základních metod podrobně popisují JAY et al., 2005).
3.3.1 Konvenční standardní odpočet z ploten Při konvenční metodě odečtu z ploten (SPC) se části vzorků potravin míchají nebo zhomogenizují, zředí ve vhodném rozpouštědle, umístí na vhodné agarové médium a inkubují při vhodné teplotě a po danou dobu, po níž se spočítají všechny viditelné kolonie. Metoda SPC je daleko nejrozšířenější používaná metoda pro určení počtu živých buněk nebo jednotek tvořících kolonie (KTJ) v potravinách. Při udávání množství živých buněk by měl být tento počet nebo četnost chápán jako funkce nejméně jednoho z následujících faktorů: •
Použitá metoda odebírání vzorků.
•
Rozdělení organismů ve vzorku potraviny.
•
Povaha bioty potraviny.
•
Povaha materiálu potraviny.
•
Historie potravinářského výrobku před zkouškou.
•
Nutriční přiměřenost použitého média.
•
Inkubační teplota a doba.
•
pH, aktivita vody (aw) a oxidačně redukční potenciál (Eh) použitého média.
•
Druh použitého rozpouštědla. 15
•
Relativní počet mikroorganismů ve vzorku potraviny.
•
Výskyt dalších konkurenčních nebo soupeřících organismů.
Kromě uvedených omezení je postup při provádění metody odpočtu z ploten pro vybrané skupiny omezen stupněm inhibice a účinností použitých selektivních a diferenciačních činidel. I když se SPC často určuje ze suspenze vzorků, které přeléváme a promícháváme s agarem, srovnatelných výsledků dosáhneme i při povrchové inokulaci. Při této metodě se používají předem připravené agarové plotny se suchým povrchem. Inoculum se umístí na povrch ploten a pomocí zahnutých skleněných tyčinek (ve tvaru hokejky) se opatrně a rovnoměrně rozdělí po celém jejím povrchu agaru. Růst striktních aerobů zřejmě tato metoda podporuje, zatímco mikroaerofilní organismy rostou spíše pomaleji. Mezi nevýhody povrchového očkování patří problém nanášení roztěru suspenze (zvláště když povrch agaru není před nanášením přiměřeně suchý).
Homogenizace vzorků potravin Až do poloviny 70. let se získávaly mikroorganismy za účelem jejich odečtu z ploten ze vzorků potravin téměř univerzálně pomocí mechanických míchadel. Okolo roku 1971 vyvinuli v Anglii Sharpe a Jackson přístroj Colwell Stomacher, který dnes používají mnohé laboratoře pro homogenizaci vzorků potravin. Stomacher je relativně jednoduché zařízení, které homogenizuje vzorky ve speciálním plastovém pytli prudkými údery dvou lopatek. Údery se potravinové vzorky řežou a mikroorganismy se uvolňují do rozpouštědla. Mnozí výzkumníci porovnávali Stomacher s vysokorychlostním míchačem pro mikrobiologickou analýzu potravin. Výsledky jejich výzkumů nejsou jednoznačné. Někteří autoři uvádějí, že použití Stomacheru usmrcuje některé mikroorganismy jako Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis a Escherichia coli. Jiný zase oznámili, že počty těchto bakterií po použití Stomacheru byly významně vyšší než po použití míchače. Zdá se, že v případě Stomacheru záleží na druhu potraviny.
16
Spirálový dávkovač Spirálový dávkovač je mechanické zařízení, které rozděluje tekuté inokulum na povrch otáčející se plotny s vhodným nalitým a ztuhlým agarovým médiem. Dávkovací rameno se pohybuje od středu plotny směrem ven a nanáší vzorek do Archimedovy spirály. Připojená speciální stříkačka dávkuje postupně se snižující dávky vzorku, takže na jedné desce je koncentrace vzorku až 10 000 : 1. Následuje inkubace při vhodné teplotě a vývoj kolonií, přičemž vyšší hustota uložených buněk je poblíž středu a směrem k okraji se hustota postupně snižuje. Odpočet kolonií na plotnách připravené spirálovým dávkovačem se provádí pomocí speciální sčítací mřížky. Spirálový dávkovač má oproti standardnímu odpočtu z ploten následující výhody: •
Používá se méně agaru.
•
Je třeba méně ploten, ředicího roztoku a pipet.
•
Za hodinu se prozkoumá třikrát až čtyřikrát více vzorků.
Mezi nevýhody patří: •
Částečky potravin mohou zablokovat dávkovací hrot.
•
Vzhledem k jeho ceně se nepředpokládá, že by se využívalo v laboratořích, kde se neanalyzuje velké množství ploten.
Membránové filtry Používají se membrány s velikostí pórů, které zachytí bakterii (obecně 0,45 µm), ale které propustí vodu a rozpouštědlo. Po odběru bakterií a přefiltrováním daného objemu se membrána položí na agarovou plotnu nebo na podložku s absorbentem, nasycenou vhodným kultivačním médiem kde proběhne inkubace. Poté, co bakterie narostou jsou spočítány. Alternativně je možno provést metodu DMC. V tomto případě lze odebrané organismy vidět a spočítat mikroskopicky, poté co byla membrána obarvena, omyta a upravena tak, aby byla průhledná. Tyto metody jsou zvláště vhodné u vzorků, které obsahují malé množství bakterií. Třebaže membránou může projít relativně velké množství vody aniž by se ucpala, lze použít pro jednu membránu pouze malý vzorek zředěné homogenizované potraviny určitého druhu.
17
Celková účinnost této metody s membránovými filtry pro určení mikrobiálních počtů metodou DMC se zvýšila zavedením fluorescentních barviv. Používání fluorescentních barviv a epifluorescentní mikroskopie k odpočtu bakterií ve vodě je široce rozšířeno od počátku 70. let.
Přímá technika s epifluorescentním filtrem Na tuto techniku se lze dívat jako na vylepšení základní metody. Při přímé technice s epifluorescentním filtrem (DEFT) se používá fluorescentní barvivo a fluorescentní mikroskopie.
Mikrokolonie – DEFT Metoda DEFT umožňuje přímé mikroskopické určení buněk. Metoda mikrokolonie – DEFT je varieta, pomocí níž můžeme určovat pouze živé buňky. Homogenizované potraviny se filtrují přes membrány používané při DEFT, které jsou potom přiloženy na povrch s vhodným kultivačním médiem, proběhne inkubace potřebná pro vývoj mikrokolonií.
Hydrofobní mřížkový membránový filtr (HGMF) Metodu hydrofobního mřížkového membránového filtru (HGMF) rozvinuli Sharpe a Michaud a od té doby byla dále rozvíjena a používána ke stanovení počtu mikroorganismů v nejrůznějších potravinářských výrobcích. Tato metoda využívá specielně postavený filtr, který se skládá z 1600 voskových mřížek na jednom membránovém filtru, který omezuje růst velikosti kolonie na jednotlivé mřížky.
Mikroskopické odpočty kolonií Při metodách mikroskopického odpočtu kolonií se počítají mikrokolonie, které se vyvíjejí na vrstvě agaru nanesené na destičce mikroskopu. Jako první to byla Frostova metoda, která spočívala v nanesení 0,1 ml směsi mléka a agaru na skleněnou destičku o ploše 4 cm2. Po následné inkubaci, sušení a barvení se mikrokolonie spočítaly pomocí mikroskopu. Při jiné metodě se smíchaly 2 ml roztaveného agaru se 2 ml teplého mléka a 0,1 ml naočkovaného agaru se nanese na plochu 4 cm2. Po obarvení thionovou modří se destička pozoruje 16 mm objektivem mikroskopu.
18
3.3.2
Metoda nejpravděpodobnějšího počtu (MPN) Při této metodě se připravují stejné roztoky potravinových vzorků jako při SPC.
Tři sériové alikvotní vzorky se nasadí do 9 nebo 15 zkumavek s vhodným médiem, podle toho budeme-li provádět tří nebo pětizkumavkovou metodu. Počet organismů v původním vzorku se určí pomocí standardních tabulek MPN. Jde v podstatě o statistickou metodu a výsledky MPN jsou obecně vyšší než výsledky dosažené metodou SPC. Tuto metodu představil McCrady v roce 1915. Není to přesná analytická metoda. Rozmezí 95% spolehlivosti je od hodnoty 21 do 395. Při třízkumavkovém testu odpovídá za 99 % všech výsledků 20 kombinaci testů z 62 možných a při pětizkumavkovém testu je to 49 z 314 možných kombinací. Ve společném výzkumu stanovujícím hustotu koliformních bakterií v potravinách byla hodnota 10, stanovená třízkumavkovou metodou MPN stejně vysoko jako hodnota 34, ale v jiné fázi výzkumu mohl horní limit dosahovat až hodnoty 60. Přestože Woodward uzavírá, že mnohé hodnoty metody MPN jsou nepravděpodobné, získala si tato metoda analýzy oblibu.
K výhodám této metody patří: •
Je relativně jednoduchá.
•
Je pravděpodobnější, že se u výsledků pořízené touto metodou ve dvou různých laboratořích dojde ke shodě spíše než je tomu u metody SPC.
•
Pomocí selektivních a dieferenciačních médií lze určit specifické skupiny organismů.
•
Je to metoda, která se volí pro určení hustoty fekálních koliformních bakterií.
K nevýhodám patří potřeba velkého množství laboratorního skla (zvláště u pětizkumavkové metody), málo příležitostí pozorovat morfologii kolonií organismů a malá přesnost.
3.3.3
Redukce barvy Tato procedura, pomocí které se odhaduje počet živých organismů ve vhodném
produktu využívá obvykle dvou barev: metylenové modři a resazurinu. Při této zkoušce se přidávají roztoky potravin (supernatanty) ke standardním roztokům, a to pro redukci z modré na bílou (metylenová modř), nebo z břidlicově modré na růžovou nebo bílou 19
(resazurin). Čas, potřebný k redukci barvy je nepřímo úměrný k počtu mikroorganismů ve vzorku. Redukce metylenové modři a resazurinu pomocí 100 kultur byla testována na mléce. Až na dvě výjimky byla shledána shoda mezi počtem bakterií a časem, potřebným pro redukci těchto dvou barviv. Při hodnocení redukce resazurinu, jakožto rychlé metody pro posouzení zkažení mletého hovězího masa a metod redukce do bezbarvého stavu, stavu zápachu a SPC, spolu tyto metody významně korelovaly.
Metoda otáčející se zkumavky Při této metodě se používají zkumavky nebo lahve různých velikostí opatřené šroubovacím uzávěrem. Do zkumavky se dá předem určené množství roztaveného, naočkovaného agaru a agar se nechá ztuhnout na vnitřní stěně nádoby. Následuje řádná inkubace a za otáčení nádoby se kolonie spočítají. Ukázalo se, že tato metoda je výborná pro stanovení počtu choulostivých anaerobních bakterií.
3.3.4
Přímý mikroskopický odpočet (DMC) Ve své nejjednodušší podobě metoda DMC spočívá v nanesení vrstvičky
potravinového vzorku nebo kultur na sklíčko mikroskopu, obarvení vhodným barvivem a v pozorování a spočítání buněk. Jednoduše se metoda skládá z přidání 0,01 ml vzorku do 1cm2 plochy na mikroskopickou destičku a následuje upevnění, odmaštění a moření (zbarvení) vzorku, pak jsou organismy nebo jejich shluky spočteny. Další zahrnuje užití kalibrovaného mikroskopu. Metoda poskytuje rychlou mikrobiologickou zkoušku pro jiné potravinářské produkty jako jsou sušené a zmražené potraviny. Výhodami DMC je, že je rychlá a jednoduchá, může se stanovit morfologie buňky a poskytuje fluorescentní sondy pro zlepšení efektivity. Nevýhodou je, že je to mikroskopická metoda, a proto pro analyzátora vyčerpávající. Jsou sčítány životaschopné a neživotaschopné buňky, části potravin nejsou vždy rozlišitelné od mikroorganismů, mikrobiální buňky nejsou stejně rozmístěny vzhledem k jednotlivým buňkám a shlukům, některé buňky nepřijímají moření dobře a nemohou být sečteny a součty DMC jsou stále vyšší než součty SPC. Přes tato odrazení zůstává nejrychlejším způsobem pro stanovení mikrobiálních buněk v potravinářských výrobcích.
20
3.3.5
Mikrobiologická zkouška povrchů Potřeba udržovat kontaktní povrch potravin v hygienickém stavu je samozřejmě
důležitá. Primárním problémem k vyřešení při zkoumání povrchů nebo domácích potřeb kvůli mikroorganismům je odstranění významného procenta usazené bioty. I když daná metoda nemůže odhalit všechny organismy, její důsledné užití na specifických plochách potravinářského výrobního závodu může přesto poskytnout platnou informaci.
Stěrové metoda Je to nejstarší a neužívanější metoda pro mikroskopické zkoušky povrchů nejen potravin, ale také v nemocnicích a restauracích. Spočívá ve vymezení plochy (u potravin v rozmezí cm2 a u povrchu předmětů či ploch větší), ze které jsou stěry získány mikroorganismy. Stěry se provádí vatovými tampóny (potraviny) nebo různě upravenými mopy (provozní plochy). Problémem těchto metod je izolace mikroorganismů ze stěrové pomůcky. V případě vatových tampónů většinou stačí ruční vytřepání do fyziologického roztoku. Uvolnění mikrobů z různých typů mopů lze užít ultrazvuk.
Obtiskové metody Základem obtiskových metod je umístění živného agaru na různé typy podložek. Povrch agaru je vždy kryt sterilní fólií. Po odtranění povrchové fólie se agar přitiskne na analyzovaný povrch. Poté se inkubuje v laboratoři. Vyhodnocované počty kolonií se řídí stejnými pravidly jako u plotnových metod. Tato metoda je vhodná pouze pro rovné povrchy.
3.4 Biolog systém
3.4.1
Princip Biolog systému Princip metody je založen na oxido-redukční reakci, která vyžaduje dostatečné
množství buněk naočkovaných do BIOLOG mikrodestičky. Buňky mající enzymy pro daný uhlíkatý substrát jsou schopny ho využívat. A pokud buňky jsou schopny využít daný substrát, rostou a respirují, přičemž dochází k uvolnění elektronu ze substrátu (oxidace), který přijme barvivo trifenyltetrazolium (redukce) za vzniku zbarveného
21
trifenylformazanu. Dostatečně velký počet buněk v každé jamce je zodpovědný za rychlou reakci, během několika desítek hodin. BIOLOG systémem je rychlá a relativně levná metoda, kterou se získá velké množství informací o celém společenstvu mikroorganismů. Získané informace pak nepopisují funkční potenciál každého člena společenstva, ale celkový funkční potenciál, který je složen z aktivit mikroorganismů, které jsou schopné růst za inkubačních podmínek. Pokud přijmeme tuto myšlenku, pak model získaný využíváním substrátů během inkubace enviromentálního vzorku poskytuje řadu informací. (GARLAND, MILLS, 1991)
3.4.2
Biolog mikrodestičky Společnost BIOLOG, Inc. dodává komerčně několik typů 96-ti jamkových
mikrodestiček. BIOLOG GP a GN mikrodestičky byly vyvinuté pro identifikaci gram pozitivních a gram negativních bakterií. Tyto mikrodestičky obsahují 95 různých uhlíkatých substrátů. Každá jamka obsahuje přibližně 0,17 ml živin, dále substrát, který je zdrojem uhlíku a energie a redoxní barvivo – tetrazoliovou violeť. Všechny jamky se liší jen v obsahu substrátu, který je zdrojem uhlíku a energie, kontrolní jamka neobsahuje žádný substrát. BIOLOG SF-N mikrodestička slouží pro identifkaci izolovaných hub. Tyto destičky obsahují živiny, jednotlivé substráty, ale neobsahují tetrazoliové barvivo. BIOLOG MT mikrodestičky obsahují redoxní barvivo a živiny, ale neobsahují žádné substráty, ty si tam podle své potřeby a uvážení dává sám experimentátor. (ŠVIHÁLEK, 2003) Z
dalších
praktických
důvodů,
byla
vyvinuta
společností
BIOLOG,
Inc. BIOLOG EcoPlateTM mikrodestička (Insam, 1997), která má stejný obsah jamek, co se týká živin a barviva, ale došlo zde k redukci počtu substrátů. Obsahuje jen 31 různých substrátů, které jsou uspořádany v mikrodestičce ve třech opakováních se třemi kontrolami. BIOLOG EcoPlateTM mikrodestička obsahuje substráty, které se vyskytují jak v GN tak v GP mikrodestičkách, ale obsahuje i substráty, které se v těchto mikrodestičkách nevyskytují. Z GP a zároveň z GN mikrodestičky je 17 substrátů, pouze z GP mikrodestičky jsou 2 substráty a pouze z GN je 8 substrátů a 4 substráty jsou v BIOLOG EcoPlateTM mikrodestičce nové. Substráty v BIOLOG mikrodestičkách jsou rozděleny do několika chemických skupin. Karbohydráty, estery, polymery, karboxylové kyseliny, alkoholy, aminy, amidy,
22
aromatické látky, aminokyseliny, fosforylované látky a bromované látky. (GARLAND, MILLS, 1991)
3.4.3
Hustota inokula Hustota inokula je jeden z hlavních problémů při práci s BIOLOG systémem.
Rozdílná hustota (velikost biomasy) a fyziologický stav buněk očkovaných do BIOLOG mikrodestičky má velký vliv na vývoj barvy. Naočkované buňky mohou spolu pak ještě různě interagovat (synergismus, antagonismus) a i tento efekt může být závislý na hustotě inokula. Tyto interakce se mohou pak během inkubace měnit a tím ovlivnit reakci v jednotlivých jamkách. Proto má hustota inokula a inkubační čas největší vliv na to, jak interpretovat získané hodnoty a jak jsou tyto hodnoty reálné jako důkaz o funkci společenstva (PRESTON – MAFHAM et al., 2002). Hustota inokula ovlivňuje vývoj barvy vzorku a tím i následné hodnocení funkční diverzity. Jestliže máme dva vzorky (A a B), které jsou složeny z pěti stejných mikroorganismů ve stejném poměru, ale liší se v celkové hustotě tak, že vzorek A má 2x větší hustotu buněk než vzorek B, pak po naočkování vzorku do BIOLOG mikrodestičky a inkubaci za stejných podmínek, bude u vzorku A vyšší míra vývoje barvy. Větší zabarvení ve vzorku A oproti B ukazuje rozdíly funkční diverzity navzdory stejnému složení vzorků. Teoreticky však platí, že pokud se hustota inokula standardizuje, nikterak se nepokazí hodnocení. (GARLAND, 1997) Standardizace hustoty inokula ale omezuje použití této metody jako rychlého screeningového nástroje právě kvůli časově náročnému stanovení hustoty buněk. Navíc, pokud se standardizuje hustota či aktivita inokula, hrozí, že jako shodné se označí vzorky, u nichž je jediným rozdílem právě rozdíl v celkové míře fyziologické aktivity. Ideální hustota buněk se pohybuje v rozmezí 105 –108. Při vyšší hustotě buněk by mohl vývoj barvy odrážet metabolický profil typický pro dominantní kmen. Problém rozdílné hustoty inokula a následné zkreslení funkční diverzity lze vyřešit v podstatě dvěmi způsoby: ● Metodická standardizace. ● Normalizace výstupních dat. (GARLAND, MILLS, 1991)
23
Metodická standardizace Standardizace hustoty inokula v laboratoři lze provést tak, že se určí stávající hustota a navážka vzorků se přizpůsobí tak, že všechny vzorky mají nakonec stejnou hustotu inokula.
Standardizace výstupních dat Využití uhlíkatých substrátů pro každou mikrodestičku lze vyjádřit dvěma způsoby: ● Reálný vývoj barvy pro každý substrát tj. od absorbance jednotlivého substrátu se odečte absorbance jamky bez substrátu (kontroly). Reálný vývoj barvy nabývá hodnot od 0 do 13 a s prodlužujícím se inkubačním časem se zvyšuje. ●Ttransformací dat provedenou dělením reálného vývoje barvy hodnotou AWCD (Average Well Color Development) pro danou mikrodestičku podle vzorce (Sj-K) / [Σ(Sj-K) / ΣSj] kde Sj je jamka se substrátem a K je jamka bez substrátu, tedy kontrolní jamka. Obě metody sledují využití jednotlivých substrátů po celý čas, kdy je měřena absorbance. Hodnoty transformovaných dat se pohybují v rozmezí 0–4, přičemž hodnoty <1 představují vývoj barvy menší než je AWCD a hodnoty >1 představují vývoj barvy větší než AWCD (Garland and Mills, 1991). Jinou možností je vzorky porovnávat ve stejných hodnotách AWCD. Tento postup ovšem vyžaduje odečítání absorbance v kratších časových intervalech. (GARLAND, 1996) Tato metoda se osvědčuje pouze pro vzorky s podobnou hustotou buněk, u vzorků s výrazně rozdílnou hustotou už není tak přesná. To proto, že vzorky s nižší hustotou inokula budou mít méně pozitivních odpovědí způsobených ztrátou některých druhů při ředění a naopak při výrazně vyšší hustotě buněk, by bylo při stejné hodnotě AWCD více pozitivních substrátů. (GARLAND, 1997) Problémem při tomto hodnocení je opakovatelnost naměřeného AWCD. AWCD je závislé především na fyziologické aktivitě buněk (HOWARD, 1997). Variabilita AWCD u dvou stejných vzorků může být 10–20% (GARLAND, 1996).
24
Další metodou může být i standardizace dat získaných jako plochy pod křivkou nárustu absorbance v čase pro každý substrát (HACKETT, GRIFFITHS, 1997), kdy plocha pod křivkou pro každý substrát se vydělí průměrnou hodnotou pro celou mikrodestičku (GARLAND, 1997). MILLS and BOUMA (1997) objevili, že při vysoké hustotě buněk (<107 buněk/ml) a krátkém inkubačním čase (> 24hod.) lze stanovit s velkou přesností funkci společenstva, kterou má in situ. Platí to ale pouze pro společenstva, která nejsou složena z více než pěti členů.
25
4
MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ
4.1 Materiál Analyzovaný materiál tvoříly 3 vybrané odrůdy jablek (Golden delicious, Ontario, Idared) a mrkve (vzorek č.4) zakoupené na Zelném trhu v Brně. Mikrobiologické analýzy byly provedeny v laboratoři na ústavě agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin, MZLU v Brně. Jablka byla před vlastními mikrobiologickými analýzami uchovávána 6 dní při koncentraci CO2 běžné ve vzduchu (0,03% CO2) a při vysoké koncentraci (2,5428% CO2). Koncentrace CO2 byla nastavena pomocí roztoku nasycené kyseliny citrónové a uhličitanu sodného.
4.2 Klasické mikrobiologické analýzy Uskutečnily se ve spolupráci s Š. Miketovou (jablka) a L.Prieložnou (mrkev).
4.2.1 Příprava mikrobiologických rozborů Mytí laboratorního skla Veškeré laboratorní sklo bylo umyto v teplé vodě s přídavkem mycího prostředku, opláchnuto studenou vodou a nakonec destilovanou vodou. Na závěr bylo vloženo do sušárny a vysušeno při 100 °C.
Sterilizace laboratorního skla Veškeré laboratorní sklo bylo sterilováno v horkovzdušném sterilizátoru po dobu 1 hod při teplotě 160 °C. Petriho misky se sterilovaly zavřené. Ústí pipet (1 a 2 ml) se zazátkovaly vatovým tampónem a sterilovaly zabalené v hliníkové folii.
Sterilizace skla, stěrových pomůcek a destilované vody Vysterilizovány byly i uzavřené zkumavky s 9 ml destilované vody, byly vloženy do kádinek a zakryty hliníkovou folií. Po naplnění Erlenmayerových baněk 90 ml destilované vody, byla hrdla baněk překryta taktéž hliníkovou folií, která plnila úkol víček. Stěrové vatové tampóny byly uzavřeny do skleněné nádoby a ta uzavřena hliníkovou fólií. Vlastní sterilizace probíhala po dobu 20 min. při teplotě 121 °C. 26
Příprava a sterilizace živných půd Při výběru živných půd byl dán zřetel na předpoklad výskytu mikroorganismů, které se často vyskytují na ovoci a zelenině a na jejich požadavky na živiny. K analýze byly použity tyto druhy živné půdy: • Masopeptonový agar (MPA) pro kultivaci bakterií a stanovení celkového počtu mikroorganismů. • Czapek – Doxův agar (CZ) pro kultivaci plísní. • Škrobový agar (SK) pro kultivaci aktinomycet. • Ashbyho agar (ASH) pro kultivaci bakterií rodu Azotobacter. • Endo agar (EA) pro kultivaci koliformních mikroorganismů.
Masopeptonový agar (MPA) Složení:
hovězí odvar
5,0 g
pepton pro bakteriologii
5,0 g
živný základ č.1
6,25 g
živný základ č.2
6,25 g
chlorid sodný
2,5 g
agar
15,0 g
destilovaná voda
1000 ml
Bylo naváženo 40 g živné půdy MPA – výrobce Imuna, Šarišské Michalany, SR.
Czapek – Doxův agar (CZ) Složení:
dusičnan sodný
3,0 g
sacharóza
30,0 g
dihydrogenfosforečnan sodný
1,0 g
chlorid draselný
0,5 g
síran hořečnatý
0,5 g
síran železnatý
0,01 g
agar
20,0 g
destilovaná voda
1000 ml
27
Bylo naváženo 55 g sušené živné půdy CZ – výrobce Imuna, Šarišské Michalany, SR.
Škrobový agar (SK) Složení:
škrob
10,0 g
síran amonný
1,0 g
síran hořečnatý
1,0 g
chlorid sodný
1,0 g
uhličitan vápenatý
3,0 g
agar
20,0 g
destilovaná voda
1000 ml
Živná půda byla připravena v laboratoři smísením uvedených komponent.
Ashbyho agar (ASH) Složení:
manit (nebo glukóza)
20,0 g
hydrogenfosforečnan draselný
0,2 g
síran hořečnatý
0,2 g
chlorid sodný
0,2 g
síran draselný
0,1 g
uhličitan vápenatý
5,0 g
agar
20,0 g
destilovaná voda
1000 ml
Živná půda byla připravena v laboratoři smísením uvedených komponent. Endo agar (EA) Složení:
masový extrakt
8,55 g
pepton z hovězího masa
10,0 g
laktóza
10,0 g
chlorid sodný
5,0 g
siřičitan sodný bezvodý
1,2 g
fuchsin bazický
0,25 g
agar
12,0 g
destilovaná voda
1000 ml 28
4.2.2
Postup mikrobiologických rozborů K vyšetření povrchové mikroflóry byla použita ve všech případech stěrová
metoda.
Postup Z hliníkové fólie byly vystříhány šablony s čtvercovým otvorem o ploše 4 cm2 a šablony přiloženy na povrch analyzovaného ovoce či zeleniny.Tlakem a stálým otáčením vatového tampónu po vymezené ploše (4 cm2).Došlo k důkladnému setření mikroorganismů z vyšetřované plochy. Po provedení stěru byl vatový tampón umistěn do příslušné Erlenmeyerovy baňky se sterilní destilovanou vodou.Uzavřené Erlenmeyerovy baňky byly důkladně protřepány. Pro následné dobré počítaní vyrostlých kolonií bylo použito desítkové ředění.
Očkování vzorků K očkování živých půd byla použita suspenze o ředění 10-2. Sterilní pipetou došlo k nanesení 1 ml získané suspenze mikroorganismů na Petriho misky a následné zalití potřebným množstvím rozehřátého a opětovně chlazeného živného agaru. Homogenita byla zajištěna krouživým pohybem s uzavřenou miskou po desce stolu. Ztuhlý agar byl inkubován v termostatu při dané teplotě dnem vzhůru. Z jednoho ředění byly souběžně očkovány tři Petriho misky. U každé živné půdy byla provedena kontrola na její mikrobiální čistotu.
Inkubace vzorků • Petriho misky s MPA teplota 25 °C po dobu 5 dnů. • Czapek – Dox agar při teplotě 25 °C po dobu 7 dnů. • Koliformní bakterie při teplotě 37 °C po dobu 5 dnů. • Aktinomycety inkubace probíhala při teplotě 28 °C po dobu 7 dnů. • Bakterie rodu Azotobacter inkubovány při teplotě 28 °C po dobu 7 dnů.
Vyhodnocení výsledků Po inkubaci byly vyhodnoceny počty kolonií (KTJ – kolonie tvořící jednotky).
29
V případě mikrobiálního znečištění kontrolních vzorků byly vyskytující se mikroorganismy odečteny od průměrných hodnot výsledků jednotlivých rozborů, čímž byla zohledněna případná sekundární kontaminace. Výsledné hodnoty byly vztaženy na 10 dm2.
30
4.3 Analýza mikroflóry s využitím Biolog systému
4.3.1
Příprava mikrobiologických rozborů Byly použity mikrodestičky Biolog GN s 47 uhlíkovými zdroji (výrobce
BIOLOG Inc. hayward california).
Tab. 1 Seznam substrátů použitých při analýze Biolog Karbohydráty
m-inosit L-arabinóza L-rhamnoza Dulcitol D-sorbit α-laktóza D-manitóza D-maltóza D-glukóza sacharóza xylóza
Organické kyseliny octová kyselina
Aminokyseliny norleucine
asparagová kyselina
L-cystein
citronova kyselina
histidin norvalin threonin alanin asparagin valin
Sukcinát maleinová kyselina oktanová kyselina valerová kyselina malonová kyselina mléčná kyselina
Jiné glyceric škrob dextran 500 tween 80 močovina amid kyseliny octové thymidin
kreatinin
serin fenylalanin lyzin glutamová kyselina arginin
pullulan D-fruktóza rafinóza
aminobutyric acid aminopropionic acid
4.3.2 Postup mikrobiologických rozborů Očkování vzorků Každá jamka mikrodestičky byla inokulována 125 µl suspenze o ředění 10-2. Veškeré substrátové zdroje byly obohaceny redukčním barvivem tetrazolium.
Inkubace a měření vzorků Inokulované mikrodestičky byly kultivovány při teplotě 22 ºC a následné barevné změny byly pozorovány po časových intervalech 24, 48, 72 a 96 hodin. Měřění absorbance probíhalo při vlnové délce 592 nm na přístroji SLT SPECTRA GRÖDIG RAKOUSKO. Výsledné hodnoty absorbance byly porovnávány s kontrolním měřením (pouze substrát a redukční barvivo tetrazolium).
31
Vyhodnocení výsledků Pro statistické hodnocení byla použita data zohledňující kontrolní pokus.Veškerá měření proběhla ve třech opakováních. Pro celkové hodnocení byly použity hodnoty absorbancí získané po 96 hodinách. Statistické vyhodnocení bylo provedeno pomocí softwaru CANOCO.
32
5
VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUSE Výsledky mikrobiologických analýz všech zpracovaných vzorků jsou uvedeny
v následujících tabulkách č. 2, 3, 4, 5, 6 a grafech č.1, 2, 3.
5.1 Mikrobiální osídlení povrchu jablek zjištěné klasickou metodou
5.1.1
Mikroflóra povrchu jablek při 0,03% CO2 ve vzduchu Pokus byl proveden na třech odrůdách jablek – Golden delicouis, Ontario
a Idared, zakoupených na Zelném trhu v Brně. Analýzy těchto vzorků proběhly v den jejich nákupu. Bylo využito analýzy stěrovou metodou. Výsledky jsou uvedeny jako průměry ze tří opakování, přepočteno na 10cm2 povrchu jablka (Tab. 2). Relativně nejvyšší počet mikroorganismů byl zjištěn na povrchu odrůdy Golden delicious. Naopak nejméně mikrobů bylo na povrchu odrůdy Ontario. Ve sledovaných skupinách mikroorganismů převládaly plísně, následovaly aktinomycety a bakterie.Ani na jedné z analyzovaných odrůd nebyly zjištěny koliformní bakterie.
Tab. 2 Mikrobiální osídlení povrchu tří odrůd jablek uchovaných při běžné koncentraci CO2 ve vzduchu (0,03% CO2). Údaje v KTJ x 10 cm-2 x 102. Odrůda
CPM
Koliformní
Plísně
Aktinomycety Azotobacter
bakterie Golden
125,00
0,00
141,75
197,75
8,25
Ontario
50,00
0,00
100,00
58,25
8,25
Idared
62,50
0,00
83,25
102,00
8,25
delicious
Zjištěné hodnoty se blíží k hodnotám uváděným Baďurovou (2004) a Hrdličkovou (2004). Nejhojněji zastoupenými mikroorganismy vyskytujícími se na povrchu ovoce byly plísně. Dle Polstera (1971) se na jádrovém ovoci nejvíce vyskytují plísně rodu Aspergillus, Mucor, Alternaria a Rhizopus. Všechny tyto druhy jsou původci plísňové hniloby. Odrůda Golden delicious měla největší zastoupení všech sledovaných druhů mikroorganismů. Přítomnost bakterií rodu Azotobacter, které jsou poměrně citlivé na nepříznivé změny prostředí, svěčí o tom, že povrchová mikroflóra nebyla nijak výrazně narušena.
33
5.1.2
Mikroflóra povrchu jablek uchovávaných při zvýšené koncentraci CO2 (2,5428% CO2) Analýzy vzorků s prostředím s koncentrací CO2 byly opět provedeny stěrovou
metodou.
Tab. 3 Mikrobiální osídlení povrchu jablek uchovávaných při zvýšené koncentraci CO2 (2,5428% CO2). Údaje v KTJ/10 cm2 x 102. Odrůda Golden delicious
CPM 0,38
Koliformní b. 0,00
Plísně 9,51
Aktinomycety 0,00
Azotobacter 0,00
4,89
0,00
23,91
0,38
0,38
0,38
0,00
14,01
0,00
0,00
Ontario Idared
Výsledky z tabulky č. 3 nám jasně ukazují, že zvýšení koncentrace CO2 výrazně inhibuje činnost a rozvoj mikroorganismů. Potlačeny byl především plísně a aktinomycety, k rozvoji však došlo u Azotobaktera. Přítomnost koliformních mikroorganismů se neprokázala ani při normální,ani při zvýšené koncentraci CO2 .
5.1.3
Mikroflóra povrchu mrkve
Tab. 4 Mikroflóra mrkve. Údaje v KTJ x 10 cm-2 x 102. Vzorek číslo 4
CPM
Koliformní b.
Plísně
Aktinomycety
524,00
24,00
326,00
62,00
V tabulce č. 4 jsou obsaženy hodnoty počtu mikroorganismů získaných stěrem z mrkve vyrostlých na agarových živných mediích.Ve srovnání s povrchem jablek byl povrch mrkve bohatěji osídlen především bakteriemi a plsněmi. Naopak se zde nacházelo podstatně méně aktinomycet. Zatímco u jablek nebyly nalezeny žádné koliformní bakterie u mrkve dosahovaly počty 24 KTJ x 10 cm-2 x 102.
34
5.1.4
Souhrnné hodnocení Je třeba mít na paměti, že metodika stanovení nezachycuje počet všech
metabolicky aktivních buněk, ale pouze počet tzv. kolonie tvořících jednotek (KTJ). KTJ jsou útvary, které v agarové půdě dají vznik jednotlivým koloniím. Mohou to být jednotlivé buňky, dvojice nebo shluky buněk.
35
5.2 Mikroflóra jablek testovaná Biolog systémem
5.2.1
Mikroflóra povrchu jablek – vzdušná atmosféra (0,03% CO2) Místo běžně využívaných mikrodestiček s 95-ti substráty byly zvoleny
mikrodestičky obsahující jen 47 substrátů, které ale mohly analyzované vzorky maximálně rozlišit. Byly vyřazeny zdroje peptonu. Ty prochází velmi rychlou metabolickou přeměnou při současném rychlém nárůstu biomasy mikroorganismů.Tato biomasa může být využívána dalšími mikroby.
Graf č. 1 Procentické zastoupení substrátů intenzivně využívaných mikroorganismy ve
Vzorek číslo
vzdušné atmosféře.
3
17
2
16
1
22
21
18
0
10
16
20
14
11
18
8
19
30
40
9
50
60
70
80
90
100
Procentické zastoupení karbohydráty
organické kyseliny
aminokyseliny
ostatní látky
Z grafu č. 1 lze vyčíst, že osídlení mikroorganismy je u všech tří odrůd obdobné. Nejvíce jsou zastoupeny mikroorganismy spotřebovávající substráty obsahující organické kyseliny. Následují mikroorganismy spotřebovávající aminokyseliny, průměrně 17 % mikrobů využívá tuto složku živného substrátu. Stejných průměrných hodnot nabývaly i mikroorganismy spotřebovávající karbohydráty a to totožné hodnoty 17 %. Relativně malé zastoupení mikroflóry využívající další jiné substráty svědčí o vhodnosti volby substrátů zvolených pro analýzu.
36
Ze získaných výsledků rovněž vyplývá, že použitým typem mikrodestiček bylo otestováno více než 60 % přítomné mikroflóry. Ta reprezentuje především gramnegativní bakterie. Zbývajících 40 % bodou reprezentovat grampozitivní bakterie.
Tab. 5 Substráty odlišené mikroorganismy při analýze Biolog při vzdušné atmosféře Karbohydráty L-arabinóza L-rhamnóza D-manitóza D-maltóza D-glukóza sacharóza D-fruktóza
Organické kyseliny Citronova kyselina propionová kyselina malonová kyselina mléčná kyselina
Aminokyseliny Histidin Alanin Asparagin Lyzin glutamová kyselina Arginin
Jiné škrob
Údaje v tabulce č.5 dovolují vyhodnotit rozdílnost odrůd vzhledem k fyziologii mikroorganismů. Tabulka zahrnuje seznam substrátů, kterými lze odlišit 3 sledované odrůdy jablek. Ze 47 nabídnutých substrátů 29 substrátů využívaly mikroby všech odrůd. Zatímco ve využívání 18 substrátů (především karbohydrátů a aminokyselin) se odlišovaly.
5.2.2
Mikroflóra povrchu jablek – prostředí 2,5428% CO2 Pokud podobně vyhodnotíme mikroflóru, která se nacházela v atmosféře
2,5428% CO2 dojde k jednoznačnému závěru: výrazně se zvýšilo proporcionální zastoupení mikroorganismů využívající organické kyseliny (23,7 %), pokleslo relativní zastoupení mikrobů využívajících karbohydráty (7,4 %) a aminokyseliny (8 %). Při zvýšení CO2 bylo otestováno v průměru 65% přítomných (gramnegaže grampozitivní bakterie budou tvořit přibližně 35%. (srovnej graf č. 2 a č.1).
37
Graf č. 2 Procentické zastoupení substrátů intenzivně využívaných mikroorganismy
Vzorek číslo
v atmosféře se zvýšeným obsahem CO2 .
3
17
2
16
21
1
18
16
0
10
22
20
14
11
18
8
19
30
40
9
50
60
70
80
90
100
Procentické zastoupení karbohydráty
organické kyseliny
aminokyseliny
ostatní látky
Tab. 6 Substráty odlišené mikroorganismy se zvýšeným obsahem CO2 Karbohydráty
m-inosit L-arabinóza L-rhamnóza sacharóza D-fruktóza
Organické kyseliny
Aminokyseliny
asparagová kyselina Sukcinát maleinová kyselina
L-cystein histidin alanin
Malonová kyselina
serin glutamová kyselina arginin
V tabulce č. 6 je uveden záznam substrátů, kterých odlišně využívaly mikroorganismy při koncentraci 0,03% a 2,5428% CO2. Zvýšená koncentrace CO2 se projevila především ve využívání typů karbohydrátů. Podle počtu a typů substrátů, které využívaly mikroorganismy rozvíjející se v koncentraci 0,03% a 2,5428% CO2 lze soudit, že rozdíly ve fyziologické diverzitě byly menší než mezi sledovanými odrůdami jablek (srovnej tabulky č. 5 a č. 6).
5.2.3
Mikroflóra povrchu mrkve Z grafu č. 3 vyplývá, že mikroflóra povrchu mrkve se od mikroflóry jablek
významně lišila. Především zde naprosto převažovaly gramnegativní bakterie (grampozitivní reprezentují cca 11%). Mikroorganismy využívaly ve srovnání
38
Jiné
s mikroby
jablek podstatně intenzivněji karbohydrátů a aminokyselin. Naopak
podstatně méně organických kyselin. Graf č. 3 Procentické zastoupení mikroorganismů intenzivně využívajících substráty na
Vzorek číslo
povrchu mrkve
4
41
0
10
20
9
30
40
26
50
60
13
70
80
90
100
Procentické zastoupení karbohydráty
5.2.4
organické kyseliny
aminokyseliny
ostatní látky
Souhrné hodnocení Pozoruhodné je, že mikroorganismy rozvíjející se v atmosféře 0,03% CO2
využívaly jiných zdrojů karbohydrátů, organických kyselin a aminokyselin než mikroby z 2,5428% atmosféry CO2. Mikroorganismy porovnávaných 3 odrůd jablek udržovaných v atmosféře 0,03% CO2 se lišily ve využívání následujících substrátů: •
karbohydráty: L-arabinóza, L-rhamnóza, D-manitóza, D- manitóza, D-glukóza, sachazóza, D-fruktóza,
•
organické kyseliny: citronová kyselina, propionová kyselina, malonová kyselina, mléčná kyselina,
•
aminokyseliny: histidin, alanin, asparagin, lyzin, glutamová kyselina.
Porovnáme-li mikroorganismy rozvíjející se v atmosféře 0,03% a 2,5428% CO2, zjistíme že se lišily ve využívaní těchto substrátů: •
karbohydráty: m-inosit, L-arabinóza, L-rhamnóza, sacharóza, D-fruktóza,
39
•
organické kyseliny: asparagová kyselina, sukcinát, maleinová kyselina, malonová kyselina,
•
aminokyseliny: L-cystein, histidin, alanin, serin, glutamová kyselina, arginin.
Získané údaje naznačují, že na povrchu jablek byla bez ohledu na koncentraci CO2 zastoupeny grampozitivní bakterie zhruba 40 %, zatímco u mrkve tvořily příbližně 11 %. Tyto výsledky naznačují, že se pravděpodobně změnilo druhové zastoupení mikroorganismů.
40
6
ZÁVĚR
Studium mikroflóry vybraných druhů ovoce a zeleniny nás dovedlo k těmto závěrům: • Propojení klasických metod kultivace na pevných živných médiích s metodami posuzujícími fyziologickou diverzitu mikrobů je velmi přínosné. • Zjistění naprosto nových a odlišných informací o fyziologii mikroorganismů. • Informace o složení mikroflóry a jejich nárocích na živiny nám v budoucnu mohou pomoci při uchovávaní nutričních a senzorických vlastností potravin
41
7
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
ADAMS, D. O., YANG, S. F.: Ethylene biosynthesis. Identification of 1aminocyclopropane-1-carboxylic acid as an intermediate in the conversion of methione to ethylene. Proc. Natl. Acad. Sci, 1979, 170 – 174 s.
BADUROVA, L. Mikroflóra vzduchu, ovoce a zeleniny ve velkoprodejnách potravin. Dipl. práce. MZLU Brno, 2004. 104 s. BARTL, V. a kol.:Mikrobiologie potravin II. díl.Ústřední výzkumný ústav potravinářského průmyslu, Praha, 1966, 141 str. BRACKETT, R. E.:Fruits,Vegetables and Grains. In:DOYLE, P.M., BEUCHAT, R.L., MONTVILLE, T.J., (eds.) Food Microbiology.ASM Press,Washington D.C. 2001, str. 127 – 128, ISBN 1 – 55581 – 208 – 2c CEMPÍRKOVÁ, R.: Mikrobiologie potravin. Jihočeská univerzita, České Budějovice 1997, 165 str.,ISBM 80-7040-254-7 FORSYTHE, S. J.: Food Hygiene, Microbiology and Maryland 1998, 200 str.,ISBN 0-7514-0450-0
HACCP. Aspen Publisher,
GARLAND, J. L., MILLS A. L.:Classification and characterization oftheterotropic microbial communities on the basis of patterns of community-level-sole-carbon-source utilization. Applied and Enviromental Microbiology 57.1996
GARLAND, J. L.: Analysis and interpretation of community-level physiological profiles in microbial ecology. FEMS Microbial Ekology 24,1997.
GOLIÁŠ, J.: Skladování a zpracování ovoce a zeleniny I. Základy chladírenství. MZLU Brno 1996. 158 s. ISBN 80-7157-229-2 GÖRNER, F., VALÍK, L.: Aplikovaná mikrobiológia poživatin.Malé centrum, Bratislava, 2004, 528 str., ISBN 80-967064-9-7 HACKETT CH. A.,GRIFFITHS B. S.: Statistical analysis of the time-course of Biolog substrate utilization. Journal of Microbiological Methods 30,1997
42
HOWARD P. J. A.: Analysis of data from BIOLOG plates: comments on the metthod Garland and Mills. Soil Biology and Biochemistry 29,1997,1755-1757.
HRDLIČKOVÁ, L.: Zdroje mikrobiální kontaminace vzduchu ve velkoprodejnách ovoce a zeleniny. Dipl. práce. MZLU, Brno 2004. 69 s HRUBÝ, S.: Mikrobiologie v hygieně výživy. Avicenum – zdravotnické nakladatelství, Praha 1984,208 str. JAY J. M., LOESSNER M. J., GOLDEN D. A.: Modern food microbiology, seventh edition. Springer 2005. KOPEC, K.: Tabulky nutričních hodnot ovoce a zeleniny.ÚZPI, Praha 1998,72 str., ISBN 80-86153-64-9 KYZLINK, V.: Základy konzervace potravin.SNTL, Praha, 1980, 516 str. MADIGAN M. T., MARTINKO M. J., PARKER J.: Brock Biology of Microorganisms, Prentice Hall, 2000, 991 str. MIKETOVÁ, Š.: Vliv koncentrace CO2 na mikrobiální osídlení ovoce. Dipl. práce. MZLU, Brno 2007. 64 str. MÜLLER, G.: Mikrobiologie der Lebensmittel, Hamburg: Behrs Verlag Gmbh & Co, Hamburg 1997 OSTRÝ, V.: Nebezpečí,které číhá v domácnostech III., Test 4 , 1998 OSTRÝ, V.:Mikroskopické vláknité zdraví,Vesmír 79, str. 187-189, 2000
houby:
Účinky
mykotoxinů
na
lidské
PRIELOŽNÁ, L.:Vzájemné vztahy mezi fytopatogenyními mikroorganismy a rostlinami. Dipl. Práce MZLU Brno 2007. 46 str. PRESTON-MAFHAM J.,BODDY L.,RADERSON P. F.: Analysis of microbial community functional diversity using sole-carbon-source utilisation profiles – critique,Microbiology Ecology 42, 2002. SEDLÁČEK, I.:Taxonomie prokaryot, Přírodovědecká fakulta MU, 2007 (v tisku). ŠILHÁNKOVÁ, L.:Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology, Academia, Victoria publishing, Praha,2002, 365 str. ŠROUBKOVÁ, E.:Rozšíření sortimentu čerstvých salátů, MZLU, Brno, 1999,str.1215.
43
ŠROUBKOVÁ, E.:Technická mikrobiologie,MZLU, Brno,1996,150 str.,ISBN 807157-2266-8 ŠVIHÁLEK, J.: Využítí systému BIOLOG v analýze ekologických rizik pro půdní prostředí. Dipl. práce. Masarykova universita Brno 2003. 120 s. VELÍŠEK, J.:Chemie potravin 3. 1. vyd. Tábor: Ossis, 1999. 368 s. ISBN 80-9023915-3. ŽIŽKA, B., KORBELOVÁ, M.: Mikrobiologie I. pro SPŠ potravinářské. Praha, 1992, 152 str
44
