Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2014 – 2015
Scheiding en analyse van glycoproteïnen
Sarah De Saeger Promotor: Prof. Dr. Yves Briers Co-Promotor: Dr. Ingeborg Stals
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master of Science in de industriële wetenschappen: biochemie
Auteursrechtelijke bescherming “De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.” 21 augustus 2015 Promotor
Auteur
Prof. Dr. Yves Briers
Sarah De Saeger
Woord vooraf Deze masterproef draag ik voor als afsluiter van mijn studie aan de Universiteit Gent, namelijk Master of Science in de industriële wetenschappen: biochemie, optie biotechnologie. Ongeveer een jaar geleden werden de mogelijke thesisonderwerpen beschikbaar gesteld. Een keuze maken uit deze lange lijst met veel interessante projecten, was voor mij geen eenvoudige opdracht. Na wat wikken en wegen heb ik de stap gezet om bij Dr. Ingeborg Stals navraag te doen naar enkele onderwerpen. Uit de extra informatie die ik kreeg, bleek dat dit project mij het meeste interesseerde, dus stelde ik mij kandidaat. Al snel kreeg ik de bevestiging dat het onderwerp aan mij werd toegewezen. Gedurende het afgelopen jaar ben ik meer te weten kwam over de verschillende aspecten die in deze masterproef aan bod komen. Dit is een proces geweest met veel vallen en opstaan, maar het traject dat ik doorlopen heb om deze thesis waar te maken, was een leerrijke ervaring en is voor mij een absolute meerwaarde. Deze thesis heeft mij veel bijgebracht en zou niet tot stand zijn gekomen zonder hulp van verschillende personen. Langs deze weg wil ik deze mensen hiervoor graag bedanken. Eerst en vooral wil ik een woord van dank richten aan Dr. Ingeborg Stals om mij dit onderwerp aan te reiken. Wanneer ik ergens meer uitleg over wou kon ik hiervoor ook steeds bij haar terecht. Voor het praktische werk heeft Ir. Natalie Bouly mij goed op weg geholpen met onder andere SDS-PAGE. Later kreeg ik ook hulp van Sylvie Vandoorne voor de IEF. Drs. Ir. Maria Fonseca stond ook steeds klaar voor mij wanneer ik haar hulp of advies nodig had. Sinds mei heeft Prof. Dr. Yves Briers mij zeer goed begeleid en met een kritisch oog mijn werk gelezen en bijgestuurd, waarvoor ik hem zeer dankbaar ben. In tussentijd kon ik terecht bij Prof. Dr. Anita Van Landschoot. De boog kon natuurlijk niet altijd gespannen staan, daaraan hebben de andere studenten die in het labo aan hun thesis werkten zeker hun steentje bijgedragen. Bij deze een woord van dank aan Ann Lefere, Jeroen Feys en Arne Dumarey. Ook de bachelorstudenten met een onderwerp gelijkaardig aan dat van mijn thesis zorgden voor een leuke sfeer in het labo. Bedankt Jelle Christiaens, Kevin Sabbe, Warre Schauwvliege en Lieselot Van Cauter voor de toffe samenwerking. Tenslotte richt ik graag een woord van dank aan mijn familie, studiegenoten en vrienden, voor de steun die zij mij gaven.
Sarah De Saeger
Samenvatting Glycoproteïnen zijn eiwitten met één of meerdere suikergroepen aan gebonden. Aan de hand van scheiding en detectie van deze glycoproteïnen, is het mogelijk om het gehalte van glycoproteïnen ten opzichte van het totale proteïnegehalte te bepalen in bloedplasma. Er werden stalen varkensplasma, concentraat en –poeder verzameld van Veos (Zwevezele) en stalen kippen-, runds-, varken- en humaan plasma van Sigma-Aldrich. Het eiwitgehalte werd bepaald aan de hand van de Biorad DC eiwitanalyse. Voor de scheiding en detectie zijn meerdere technieken voorhanden. Voor de analyse van de eiwitprofielen werd gekozen om gebruik te maken van SDS-PAGE en IEF. Voor het kleuren van de eiwitgels werden zowel colorimetrische als fluorescente kleuringen uitgetest, inclusief specifieke kleuringen voor de detectie van de glycoproteïnen. Hierbij werden telkens eerst enkel de glycoproteïnen gekleurd. Dit gebeurde met de PAS-kleuring of met de fluorescente Pro-Q Emerald kleuring. Vervolgens werden alle proteïnen gekleurd met Coomassie briljant blauw R-250 of met de fluorescente SYPRO Ruby-kleuring. Uit de resultaten bleek dat er bij de specifieke kleuringen meerdere problemen voorkwamen. Vervolgens werd er een poging gedaan om de glycoproteïnen te scheiden van de niet-geglycosyleerde eiwitten met behulp van affiniteitschromatografie. Hiervoor werd een lectinekolom aangemaakt van geïmmobiliseerd Concanavaline A, een α-mannose/α-glucosebindend lectine dat bindt aan N-glycanen. Voor het opstellen van de chromatogrammen werden de eiwitconcentraties van de opgevangen fracties bepaald aan de hand van de absorbantie bij een golflengte van 280 nm. Kernwoorden Glycoproteïnen - SDS-PAGE – IEF - SYPRO Ruby - Pro Q Emerald 300 - lectinen – Concanavaline A
Abstract Glycoproteins are proteins with one or more sugar moieties bound to it. After separation and detection of these glycoproteins, it is possible to determine the fraction of glycoproteins compared to the total protein content in blood plasma. Samples porcine plasma, concentrate and powder were obtained from Veos (Zwevezele) and samples of chicken, beef, pork and human plasma from Sigma-Aldrich were ordered. The protein content was determined using the Biorad DC protein analysis. For the separation and detection several techniques are available. For the analysis of the protein profiles was decided to use SDS-PAGE and IEF. For the staining of the protein gels both colorimetric and fluorescent stains were tested, including specific staining for the detection of the glycoproteins. The glycoproteins were stained first. This was done by the PAS stain or by the Pro-Q Emerald fluorescent staining. Afterwards, all proteins were stained by Coomassie brilliant blue R-250 or by the fluorescent SYPRO Ruby staining. The results showed that at the specific stains several problems occurred. Subsequently, an effort was made to separate the glycoproteins of the non-glycosylated proteins by affinity chromatography. Therefore, a lectin column was prepared with immobilized Concanavalin A, an α-mannose/α-glucose-binding lectin that binds to N-glycans. For the chromatograms the protein concentrations of the collected fractions were determined based on the absorbance at a wavelength of 280 nm. Keywords Glycoproteins - SDS-PAGE - IEF - SYPRO Ruby - Pro Q Emerald 300 - lectins - Concanavalin A
Inhoudsopgave Auteursrechtelijke bescherming .............................................................................................................. 2 Woord vooraf ........................................................................................................................................... 3 Samenvatting ........................................................................................................................................... 4 Abstract.................................................................................................................................................... 5 Inhoudsopgave ........................................................................................................................................ 5 Lijst met figuren ....................................................................................................................................... 7 Lijst met tabellen ...................................................................................................................................... 9 Lijst met gebruikte afkortingen............................................................................................................... 10 Inleiding ................................................................................................................................................. 12 1.
Literatuurstudie .............................................................................................................................. 13 1.1
Post-translationele modificaties (PTM’s) en eiwitdiversiteit .................................................. 13
1.2
Glycoproteïnen ...................................................................................................................... 13
1.2.1
Soorten glycosylatie en mechanismen .......................................................................... 14
1.2.2
Glycoproteïnen in relatie tot diabetes, kanker en andere ziekten ................................. 18
1.3
Bloed ...................................................................................................................................... 19
1.3.1
Bloedcellen .................................................................................................................... 20
1.3.2
Plasma ........................................................................................................................... 21
1.3.3
Eiwitsamenstelling bloedplasma .................................................................................... 22
1.3.4
Staalname en bewaring ................................................................................................. 26
1.3.5
Anti-coagulantia ............................................................................................................. 26
1.4
Eigenschappen en toepassingen plasmapoeder afkomstig van varkensbloed .................... 27
1.5
SDS-PAGE ............................................................................................................................ 29
1.6
IEF ......................................................................................................................................... 30
1.7
2D elektroforese .................................................................................................................... 31
1.8
Kleuren van de gel ................................................................................................................. 31
1.9
Detectie en kleuring van alle proteïnen ................................................................................. 31
1.9.1
Colorimetrische kleuring: coomassie brilliant blauw (CBB) ........................................... 31
1.9.2
Fluorescente kleuring: SYPRO Ruby ............................................................................ 33
1.10
Specifieke detectie en kleuring van glycoproteïnen .............................................................. 34 5
1.10.1
Colorimetrische kleuring: Periodic acid-Schiff (PAS) .................................................... 34
1.10.2
Fluorescente kleuring: Pro-Q Emerald 300 ................................................................... 35
1.11 2.
Materiaal en methoden .................................................................................................................. 38 2.1
Staalname en –bewaring ....................................................................................................... 38
2.2
Bepaling eiwitgehalte ............................................................................................................. 38
2.2.1
BIO-RAD DC eiwitanalyse ............................................................................................. 38
2.2.2
Wet van Lambert-Beer................................................................................................... 40
2.3
Scheiding van de plasmaproteïnen ....................................................................................... 40
2.3.1
SDS-PAGE .................................................................................................................... 40
2.3.2
IEF ................................................................................................................................. 45
2.3.3
Lectinekolom ConA........................................................................................................ 47
2.4
Detectie glycoproteïnen ......................................................................................................... 49
2.4.1
Colorimetrische kleuring: PAS-methode........................................................................ 49
2.4.2
Fluorescente kleuring: Pro-Q Emerald 300 ................................................................... 50
2.5
3.
Affiniteitschromatografie ........................................................................................................ 36
Detectie proteïnen ................................................................................................................. 52
2.5.1
Colorimetrische kleuring: Coomassie Briljant Blauw ..................................................... 52
2.5.2
Fluorescente kleuring: Sypro Ruby ............................................................................... 53
Resultaten en discussie ................................................................................................................. 55 3.1
Bepaling eiwitgehalte ............................................................................................................. 55
3.1.1
Varkensplasma – stalen Veos ....................................................................................... 55
3.1.2
Plasmastalen Sigma-Aldrich .......................................................................................... 56
3.2
Vergelijking eiwitprofielen ...................................................................................................... 57
3.2.1
SDS-PAGE met coomassiekleuring .............................................................................. 57
3.2.2
SDS-PAGE met SYPRO-Ruby kleuring ........................................................................ 60
3.2.3
IEF ................................................................................................................................. 62
3.3
Lectinekolom ConA ............................................................................................................... 68
Conclusie ............................................................................................................................................... 73 Referenties ............................................................................................................................................ 75
6
Lijst met figuren Figuur 1: Visualisatie van de impact van de verschillende oorzaken van toename in eiwitdiversiteit .. 13 Figuur 2: Vereenvoudigde voorstelling van de mechanismes van de verschillende soorten glycosylatie: ............................................................................................................................................................... 14 Figuur 3: Structuur en samenstelling van het precursorglycaan Glc3Man9GlcNAc2-PP-dolichol ........ 16 Figuur 4: Voorstelling van het mechanisme van N-glycosylatie; na de aanmaak van de precursormolecule wordt dit getransloceerd naar het ER-lumen en kan dit aan het proteïne gekoppeld worden ................................................................................................................................................... 16 Figuur 5: Maturatie van N-geglycosyleerde proteïnen in het Golgi-aparaat ......................................... 17 Figuur 6:Samenstelling bloed (Dean, 2005) .......................................................................................... 20 Figuur 7: Schematische weergave van het productieproces van plasmapoeder met de verschillende processtappen, vertrekkende vanuit varkensbloed en afbeelding van het uiteindelijke plasmapoeder (Veos) .................................................................................................................................................... 28 Figuur 8: Moleculaire structuren, formule en moleculair gewicht .......................................................... 32 Figuur 9: Het absorptiespectrum van Coomassie Brilliant Blauw ongebonden (rode lijn) en eiwitgebonden (groene lijn). Na binding verschuift het absorptiemaximum van 465 nm naar 595 nm (Bradford, 1976). ................................................................................................................................... 33 Figuur 10: Structuur van SYPRO Ruby kleuring; een ruthenium-bevattend organisch complex (Demchenko, 2011). .............................................................................................................................. 33 Figuur 11: Excitatie- (stippellijn) en emissie- (volle lijn) spectra van SYPRO Ruby proteïne kleuring .. 34 Figuur 12: Reactiemechanisme PAS-kleuring (Wako Pure Chemical Industries, 2013). ..................... 35 Figuur 13: Excitatie- (A) en emissie- (B) spectra van Pro-Q Emerald 300 glycoproteïnekleuring (volle lijnen) en SYPRO Ruby proteïne kleuring (stippellijnen) met aanduiding van de pieken. .................... 35 Figuur 14: Voorbeeld chromatogram (Blaber, 1998) ............................................................................. 36 Figuur 15: Structuur van het lectine Con-canavaline A (ConA) met een resolutie van 2,4 Å (Hardman & Ainsworth, 1972) .................................................................................................................................... 37 Figuur 16: Voorbeeld BSA-standaardcurve via de BIO-RAD DC eiwitanalyse ..................................... 39 Figuur 17: Apparatuur voor SDS-PAGE; glasplaten, kammetjes, houders (A en B), elektroforesecel met houder, hulpstukken voor laden van de stalen en rechts het elektroforeseapparaat (BIO-RAD) .. 41 Figuur 18: “Phastsystem Separation and control unit” (Pharmacia); toestel voor uitvoering van IEF .. 45 Figuur 19: Phastgel Staal applicator (GE lifesciences) voor laden van de stalen ................................. 45 Figuur 20: Overbrengen van stalen van de “sample well stamp” naar de staal applicator. .................. 46 Figuur 21: Samenvatting protocol PAS-kleuring (Lifetechnologies, bewerkt) ....................................... 50 Figuur 22: UV transiluminator met verschillende filters (BIO-RAD); toestel waarmee fluorescente kleuringen op SDS-PAGE gels kunnen gevisualiseerd worden en vervolgens verwerkt met de bijhorende software; Imagelab. ............................................................................................................. 52
7
Figuur 23: SDS-PAGE gel gekleurd met CBB; bovenaan de figuur zijn de laantjes genummerd overeenkomend met tabel 11; links en rechts van de gel zijn de moleculaire gewichten aangeduid van de geladen standaarden in laantje 1 en 10. .......................................................................................... 58 Figuur 24: Iklijn SDS-PAGE gel aan de hand van moleculaire ladders waarbij het verband is weergegeven tussen de afgelegde afstand van de gescheiden eiwitten en de log van hun moleculaire 2
gewichten, met vermelding van de bekomen vergelijking en de waarde van R . ................................. 59 Figuur 25: Bandenpatroon plasmapoeder Veos bekomen met SDS-PAGE, 1 mg/ml geladen en gekleurd met CBB ................................................................................................................................. 60 Figuur 26: Resultaat SYPRO-Ruby kleuring op SDS-PAGE gel........................................................... 61 Figuur 27: Vergelijking bandenpatroon plasmapoeder Veos op twee verschillende gels na SDS-PAGE; links 1 mg/ml geladen en gekleurd met CBB; rechts 1000 x verdund en gekleurd met SYPRO-Ruby 62 Figuur 28: IEF-gels met pH 3-9, beiden gekleurd met CBB R-250. De rechtergel werd vooraf gekleurd met PAS-kleuring. De volgorde en concentraties van stalen en standaarden zijn weer te vinden in tabel 13 .................................................................................................................................................. 63 Figuur 29: Resultaat IEF met pH-gradiënt van pH 3 tot 9, gekleurd met CBB R-250, met links van de figuur aanduiding van de pH-gradiënt en rechts de aanduiding van de standaarden met vermelding van de bijhorende pI-waarden. De volgorde en concentratie van de geladen stalen en standaarden is weergegeven in tabel 13. ...................................................................................................................... 64 Figuur 30: Resultaat IEF met pH-gradiënt van pH 5 tot 8, gekleurd met CBB R-250, met links van de figuur aanduiding van de pH-gradiënt en rechts de aanduiding van de standaarden met vermelding van de bijhorende pI-waarden. De volgorde en concentratie van de geladen stalen en standaarden is weergegeven in tabel 14. ...................................................................................................................... 65 Figuur 31: SDS-PAGE gel gekleurd met Pro-Q Emerald 300 (links) en vervolgens met SYPRO Ruby (rechts) Zie tabel 12 voor de volgorde en geladen concentraties van de stalen en standaarden. ....... 67 Figuur 32: SDS-PAGE gel gekleurd met Pro-Q Emerald 300 en sterk gecontamineerd na contact met handschoenen. ...................................................................................................................................... 67 Figuur 33: Chromatogram van ConA-kolom na lading van 5 mg BSA en 5 mg ovalbumine. Per fractie werd ongeveer 1 ml opgevangen. De eerste twee fracties zijn flow-through (FT); fractie 3 tot 13 zijn het wassen (W) van de kolom en de overige fracties zijn de elutie (E). ............................................... 69 Figuur 34: SDS-PAGE gel gekleurd met CBB, ...................................................................................... 70 Figuur 35: Chromatogram van ConA-kolom na lading van 0,5 mg ovalbumine. Per fractie werd ongeveer 1 ml opgevangen. De eerste vijf fracties zijn flow-through (FT); fractie 6 tot 16 zijn het wassen (W) van de kolom en de overige fracties zijn de elutie (E)....................................................... 71 Figuur 36: Chromatogram van ConA-kolom na lading van 2 mg ovalbumine. Per fractie werd ongeveer 1 ml opgevangen. De eerste twee fracties zijn flow-through (FT); fractie 3 tot 13 zijn het wassen (W) van de kolom en de overige fracties zijn de elutie (E). .......................................................................... 72
8
Lijst met tabellen Tabel 1: Eigenschappen plasmaproteïnen varken (Lampreave & Pineiro, 1992; Uniprot & Protparam) ............................................................................................................................................................... 22 Tabel 2: Eigenschappen plasmaproteïnen mens (Lundblad, 2003; Uniprot & Protparam) .................. 23 Tabel 3: Karakteristieken plasmapoeder, bron: Veos ........................................................................... 28 Tabel 4: Keuze polymeer voor gelelektroforese naargelang de toepassing. ........................................ 29 Tabel 5: Relatie % AA tot grootte van te scheiden moleculen .............................................................. 29 Tabel 6: Samenstelling scheidings- en stapelgel voor SDS-PAGE, gel met 7,5 % AA en dikte 0,75 mm. ............................................................................................................................................................... 42 Tabel 7: Eiwitten aanwezig in de Candycane standaard met vermelding van de moleculaire gewichten en de glycosylatie, waarbij “X” wijst op een geglycosyleerd eiwit ......................................................... 43 Tabel 8: Eiwitten aanwezig in LMW en HMW standaarden, met vermelding van MM.......................... 44 Tabel 9: Standaarden aanwezig in Broad Range pl 4.45-9.6 (BIO-RAD), met vermelding van de pIwaarden ................................................................................................................................................. 45 Tabel 10: Condities van de verschillende stappen tijdens de IEF......................................................... 47 Tabel 11: Volgorde van stalen en standaarden geladen op gel voor SDS-PAGE ................................ 57 Tabel 12: Volgorde van stalen en standaarden geladen op gel voor SDS-PAGE ................................ 61 Tabel 13: Volgorde van de stalen en standaarden IEF-gel met vermelding van de concentratie. ....... 62 Tabel 14: Volgorde van stalen en standaarden geladen op gel voor IEF met vermelding van de verdunning/concentratie ........................................................................................................................ 65 Tabel 15: Volgorde van stalen en standaarden geladen op gel voor SDS-PAGE ................................ 69
9
Lijst met gebruikte afkortingen AA: Acrylamide AAG: α1-zuur glycoproteïne ABS: Absorbantie APS: Ammonium persulfaat Asn: Asparagine AZ: Aminozuur BSA: Bovine Serum Albumine CAS: Chemical Abstracts Service ConA: Concanavaline A dH2O: gedestilleerd water EDTA: Ethyleendiaminetetra-azijnzuur ER: Endoplasmatisch reticulum GDP: Guanosinedifosfaat Glc: Glucose GlcNAc: N-acetylglucosamine GTF: Glycosyltransferase HMWS: Hoog moleculair gewicht standaard IE: Internationale eenheid IEF: Iso-elektrische focusering LMWS: Laag moleculair gewicht standaard Man: Mannose PAS: Periodic-Acid-Schiff reagent PTM: Post-translationele modificatie pI: Iso-elektrisch punt 10
RBC: Rode bloedcel SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfaat – polyacrylamide gelelektroforese Ser: Serine TCA: Trichloorazijnzuur TEMED: N,N,N’,N’-Tetramethylethyleendiamine Thr: Threonine UDP: Uridinedifosfaat WBC: Witte bloedcel WGA: Tarwekiem agglutinine JAC: Jacaline
11
Inleiding Het doel van deze thesis is om enkele beschikbare methodes voor scheiding en detectie van glycoproteïnen uit te testen en te combineren, en dit toegepast op bloedplasma. Met behulp van de meest geschikte methodes zou er vervolgens een methode op punt gesteld kunnen worden voor de verhouding van het gehalte aan glycoproteïnen ten opzichte van het totaal proteïnegehalte te kunnen bepalen. Glycoproteïnen zijn eiwitten met één of meerdere suikergroepen aan gebonden. De glycosylatie is een post-translationele modificatie (PTM) en vindt plaats in het endoplasmatisch reticulum (ER) en het Golgi-apparaat, wat verklaart waarom deze modificatie enkel voorkomt bij eukaryoten, eubacteriën en archeabacteriën. Bloed is een complexe matrix die veel verschillende componenten bevat, wat bij analyses voor problemen kan zorgen. Om de analyseresultaten zo min mogelijk te beïnvloeden dienen de procedures voor staalname, behandeling en bewaring zo veel mogelijk gestandaardiseerd te zijn. Het bloedplasma bestaat voornamelijk uit water, maar ook uit eiwitten, suikers, vetdeeltjes en andere organische en anorganische stoffen. Plasma bevat ook nog fibrinogeen, een stollingseiwit. Om stolling te vermijden worden hier dus vaak anti-coagulantia aan toegevoegd, welke kunnen interfereren met analysetechnieken. Serum daarentegen bezit geen fibrinogeen meer aangezien dit wordt bekomen door het bloed eerst te laten stollen alvorens de cellen worden afgescheiden met behulp van centrifugatie. Varkensplasma wordt verwerkt tot poeder en vindt in deze vorm verschillende toepassingen in de voedingsindustrie. Het gehalte aan glycoproteïnen heeft mogelijks een invloed op bepaalde toepassingen, maar om dit te achterhalen dient het plasma eerst getest te kunnen worden op het gehalte aan glycoproteïnen. Dit laatste is dan ook het uiteindelijke doel van deze thesis. Er werden stalen varkensplasma, -concentraat en –poeder gecollecteerd van Veos (Zwevezele), daarnaast werd er ook varkens-, runds-, kippen- en humaan plasma besteld bij Sigma-Aldrich. De eiwitprofielen van de verschillende plasmastalen werden geanalyseerd met SDS-PAGE en IEF, waarbij deze gels gekleurd werden met colorimetrische of fluorescente kleuringen. Hierbij werden eerst de glycoproteïnen specifiek gekleurd met de PAS-kleuring of de fluorescente Pro-Q Emerald 300-kleuring en vervolgens werden alle eiwitten gekleurd met coomassie briljant blauw R-250 of de fluorescente SYPRO Ruby-kleuring.
12
1. Literatuurstudie 1.1
Post-translationele modificaties (PTM’s) en eiwitdiversiteit
Het humaan genoom bestaat uit 20 000 à 25 000 genen, het proteoom is nog veel groter, het bestaat naar schatting uit meer dan 1 miljoen verschillende eiwitten. Dit grote verschil wijst er op dat genen coderen voor meerdere eiwitten. Dit fenomeen wordt weergegeven in figuur 1. Mechanismen zoals genomische recombinatie, alternatieve promotors en alternatieve splicing zorgen voor verschillende mRNA-transcripten van een enkel gen (Ayoubi & Van De Ven, 1996). Vervolgens zorgen ook post-translationele modificaties (PTM’s) voor een toename in functionele diversiteit van het proteoom. Deze modificaties beïnvloeden vele aspecten van de celbiologie en pathogenese. Hierdoor is het bestuderen van deze PTM’s dan ook cruciaal om inzicht te krijgen in de celbiologie en behandeling en preventie van ziekten.
Figuur 1: Visualisatie van de impact van de verschillende oorzaken van toename in eiwitdiversiteit
Voorbeelden van post-translationele modificaties zijn glycosylatie (aanhechting van suikereenheid), fosforylatie (aanhechting van een fosfaatgroep), ubiquitinatie (aanhechting van ubiquitine), nitrosylatie (aanhechting van stikstofoxide), methylatie (aanhechting van methylgroep), acetylatie (aanhechting van acetylgroep), lipidatie (aanhechting van vetzuur), en proteolyse (afbraak van eiwitten tot kleinere peptide-eenheden). In dit eindwerk wordt dieper ingegaan op glycoproteïnen en de verschillende types glycosylatie.
1.2
Glycoproteïnen
Glycoproteïnen zijn eiwitten waaraan één of meerdere suikergroepen gebonden zijn. Ongeveer de helft van de eiwitten die tot expressie komen in de cel, zijn geglycosyleerd. De glycosylatie of aanhechting van de suikereenheden aan de proteïnen is een post-translationele modificatie (PTM). 13
Dit proces vindt plaats in het endoplasmatisch reticulum (ER) en in het Golgi-apparaat. Glycosylatie komt dus enkel voor bij eiwitten van eukaryoten, eubacteriën en archaebacteriën. De glycosylatie van eiwitten heeft geen eenduidige functie maar kan verschillende redenen hebben. Zo kan de aanhechting van suikers invloed hebben op de oplosbaarheid, op de structuur van allergene domeinen, bescherming bieden tegen proteolyse, invloed hebben op de positie ten opzichte van het membraan… (Wormald et al., 2002). Er zijn verschillende methodes voor de scheiding en detectie van glycoproteïnen voorhanden. De gebruikte methoden worden besproken in deel 2 van dit eindwerk.
1.2.1 Soorten glycosylatie en mechanismen Glycoproteïnen verschillen op basis van glycosidische binding, lengte, samenstelling, structuur en aantal vertakkingen van de suikerketen. Glycopeptidische bindingen worden vervolgens ingedeeld op basis van het type suiker-peptidebinding, namelijk N-gebonden glycosylatie (de suikergroepen worden aan de aminogroep van asparagine gebonden), O-gebonden glycosylatie (monosachariden worden één voor één gebonden aan de hydroxylgroep van serine of threonine), glypiatie (glycaanketen verbindt een fosfolipide en een proteïne), C-gebonden glycosylatie (mannose bindt aan de tryptofaanring) en fosfoglycosylatie (glycaan bindt aan serine via een fosfodiesterbinding). Deze indeling wordt voorgesteld in figuur 2. De twee belangrijkste soorten peptideglycosylatie zijn Nglycosylatie, waarbij het oligosaccharide wordt gekoppeld aan asparagine, en O-glycosylatie, waarbij het oligosacharide wordt gekoppeld aan serine of threonine (Dell & Morris, 2001; Thermo Fisher Scientific, 2015).
Figuur 2: Vereenvoudigde voorstelling van de mechanismes van de verschillende soorten glycosylatie: N-glycosylatie, O-glycosylatie, glypiatie, C-glycosylatie en fosfoglycosylatie
14
In tegenstelling tot de eiwitsynthese, welke genetisch vastgelegd is, wordt de glycosylatie van deze eiwitten enzymatisch geregeld (Rudd & Dwek, 1997). Vanwege het groot aantal enzymen dat betrokken is bij deze reacties, wordt glycosylatie gezien als één van de meest complexe posttranslationele modificaties. Glycosylatie vindt plaats in het ER en Golgi-apparaat en bestaat uit een complexe reeks van reacties die gekatalyseerd worden door membraangebonden glycosyltransferases en glycosidases. Dit omvat de aaneenhechting van monosachariden, transport van suikereenheden van de ene molecule naar de andere en verwijdering van suikereenheden van de glycaanstructuur. Deze processen gebeuren stapsgewijs en in een welbepaalde volgorde. Glycosyltransferases zijn enzymen die zorgen voor de overdracht van de suikereenheden van de donormoleculen naar de groeiende suikerketens aan de proteïnen. De hydrolyse van de glycosidische bindingen voor de afsplitsing van suikereenheden wordt gekatalyseerd door glycosidasen die specifiek bepaalde suikereenheden verwijderen. Veel van deze enzymen zijn zeer gevoelig aan andere activiteiten in de cel waarin het glycoproteïne tot expressie komt. Hierdoor is de suikerketen die aan het proteïne gehecht wordt afhankelijk van het celtype en de fysiologische toestand van de betreffende cel, en dus gelinkt aan de ontwikkeling van de cel en ziekteregulatie (Dell & Morris, 2001). Proteïnen zijn vaak geglycosyleerd op meerdere plaatsen, met verschillende soorten glycosidische bindingen. Deze glycosylatie hangt af van volgende factoren: beschikbaarheid van enzymen, aminozuursequentie en eiwitopvouwing. De voornaamste glycosidische bindingen (N- en O-glycosylatie) worden hieronder kort toegelicht.
1.2.1.1
N-Glycosylatie
Dit type glycosylatie is een co-translationele modificatie, waarbij de suikergroepen aan de aminogroep van asparagine (Asn) van het proteïne worden gebonden tijdens de translatie en het transport naar het ER. Een potentiële positie voor N-glycosylatie bestaat uit Asn – X – Ser/Thr, waarbij X gelijk mag zijn aan elk aminozuur behalve proline (Wormald et al., 2009). Oligosachariden gebonden via een N-glycosylate zijn afgeleid van een precursor molecule bestaande uit 14 suikereenheden, namelijk N-acetylglucosamine (GlcNAc), mannose (Man) en glucose (Glc). Deze suikers worden gebonden aan dolicholpyrofosfaat, gekoppeld aan het ER-membraan (Burda & Aebi, 1999; Dean, 1999). De structuur van deze precursormolecule is afgebeeld in figuur 3.
15
Figuur 3: Structuur en samenstelling van het precursorglycaan Glc3Man9GlcNAc2-PP-dolichol
De eerste 7 suikereenheden zijn afkomstig van suikernucleotiden (UDP- en GDP-suikers) in het cytoplasma en worden gebonden aan dolichol via een pyrofosfaatbinding (-PP-). Na vorming van Man5GlcNAc2-PP-dolichol, wordt dit complex getransloceerd naar het ER-lumen. Hieraan worden vervolgens de overige 7 suikereenheden afkomstig van Man- en Glc-P-dolichol aangehecht met als resultaat het Gcl3Man9GlcNAc2-PP-dolichol precursor glycaan. Dit proces wordt weergegeven in figuur 4.
Aanmaak precursorglycaan
Aanhechting precursorglycaan
Figuur 4: Voorstelling van het mechanisme van N-glycosylatie; na de aanmaak van de precursormolecule wordt dit getransloceerd naar het ER-lumen en kan dit aan het proteïne gekoppeld worden
16
Alle N-gelinkte oligosachariden in zoogdieren hebben een gemeenschappelijke trimannosylchitobiosekern, afkomstig van de biosynthetische precursor Glc3Man9GlcNAc2. Deze wordt cotranslationeel gebonden aan polypeptiden in het ER. De drie glucosylresiduen (Glc) worden nadien verwijderd door glucosidasen. Tot hier gebeurt de glycosylatie identiek voor elk proteïne, de overige Man9GlcNAc2 wordt verder verwerkt in het Golgi apparaat (Figuur 5). Dit proces bestaat uit stapsgewijze trimming door exoglycosidasen en toevoeging van nieuwe suikereenheden door glycosyltransferases (Dell & Morris, 2001).
Figuur 5: Maturatie van N-geglycosyleerde proteïnen in het Golgi-aparaat
Na maturatie in het Golgi-apparaat kunnen de N-geglycosyleerde eiwitten worden ingedeeld in drie types: hoog mannose, complex en hybride (Dell & Morris, 2001). Het hoog mannose type bevat vooral mannose, het complex type bevat verschillende soorten suikereenheden en het hybride type bevat zowel veel mannose als andere suikers en is dus een combinatie van de eerste twee types Nglycosylatie.
17
1.2.1.2
O-Glycosylatie
Bij deze post-translationele modificatie worden monosachariden één voor één gebonden aan de hydroxylgroep van serine of threonine. Dit gebeurt in het Golgi-apparaat. O-glycosylering kan ook optreden op hydroxylysine en hydroxyproline, geoxideerde vormen van respectievelijk lysine en proline, die worden aangetroffen in collageen (Gemmill & Trimble, 1999). O-gekoppelde glycanen hebben gewoonlijk een veel eenvoudigere oligosaccharide structuur dan N-gekoppelde glycanen. Er kan dus algemeen gesteld worden dat het mechanisme van O-glycosylatie minder complex is dan de N-glycosylatie. Wanneer eiwitten reeds N-geglycosyleerd zijn, sluit dit niet uit dat deze achteraf ook nog Oglycosylaties ondergaan. Het is namelijk zeer gebruikelijk dat O-glycosylatie optreedt bij proteïnen die eerder N-geglycosyleerd werden in het ER. Eiwitten
gemodificeerd
in
het
Golgi-apparaat
zijn
meestal
O-geglycosyleerd
door
N-
acetylgalactosamine (GalNAc) transferase, welke een enkele GalNAc residu overdraagt aan de β-OH groep van serine of threonine. Afhankelijk van de cel en species worden sommige eiwitten Ogeglycosyleerd met GlcNAc, fucose, xylose, galactose en/of mannose (Spiro, 2002; Dell & Morris, 2001).
Zoals
bij
N-glycosylering,
worden
suikernucleotiden
gebruikt
als
donors
van
de
monosacchariden voor O-glycosylering. Na het eerste suiker worden achtereenvolgens een zeer variabel aantal suikers (van slechts enkele tot meer dan 10) toegevoegd aan de groeiende glycanketen. O-glycosylering kan ook voorkomen in het cytosol en de celkern om genexpressie en signaaltransductie te reguleren via andere glycosyltransferasen (GTF’s) (Lamarre-Vincent & HsiehWilson, 2003). O-glycoproteïnen spelen een sleutelrol in celbiologie (Gemmill & Trimble, 1999). Dit type glycosylering is onder andere essentieel voor de biosynthese van mucinen, een familie van zware Ogeglycosyleerde, hoogmoleculaire eiwitten die slijmafscheidingen vormen, bv. in speeksel. Oglycosylering kan ook voorkomen in het cytosol en de nucleus, voor regulatie van de genexpressie of singaaltransductie (Lamarre-Vincent & Hsieh-Wilson, 2003). Daarnaast zijn ook antilichamen vaak sterk O-geglycosyleerd.
1.2.2 Glycoproteïnen in relatie tot diabetes, kanker en andere ziekten Algemeen Vele ziekten blijken een afname te veroorzaken van de albuminebinding met geneesmiddelen, wat een invloed heeft op de werking van de medicatie. Dit kan het gevolg zijn van hypoalbuminemie (een verlaagd gehalte aan eiwitten in het bloed) of wijziging van de albuminestructuur (door bv. glycosylatie). Anderzijds zijn er ook ziekten waarbij de binding van albumine met geneesmiddelen toeneemt door een verhoogde concentratie aan AAG (α1-zuur glycoproteïne), zoals eerder vermeld bij kanker, of aan lipoproteïnen (Zini et al., 1990). Er werd ook aangetoond dat het gehalte aan AAG in 18
serum van 17 patiënten met levercirrose was gedaald tot gemiddeld 73,4 % ten opzichte van 15 gezonde vrijwilligers als controle (Fraeyman et al., 1988). Diabetes Het gehalte aan geglycosyleerde plasmaproteïnen is hoger bij diabetespatiënten dan bij personen die niet
lijden
aan
deze
aandoening.
De
glycosylatie
van
serum
albumine
leidt
tot
een
conformatieverandering waardoor de ligandbindende eigenschappen worden beïnvloed vanwege veranderingen ter hoogte van de bindingsplaats van de werkzame stof op het albumine. Hierdoor neemt de bindingsaffiniteit van albumine met medicatie en polyfenolen af, waardoor de opname van de werkzame stof daalt en er dus een grotere hoeveelheid zou toegediend moeten worden (Xu et al., 2014). Kanker Het is bewezen dat glycosylatie betrokken is bij pathways geassocieerd met de transformatie van een normale cel tot een kankercel. Glycosylatie is gerelateerd met kanker aangezien glycosylatie ook een invloed heeft op interacties tussen tumorantigenen en receptoren, zoals vb. CA125 en galactine bij eierstokkanker (Yang & Hancock, 2004). Er werd ook aangetoond dat het gehalte aan AAG in serum van 14 patiënten met longkanker was toegenomen tot gemiddeld 180,7 % ten opzichte van 15 gezonde vrijwilligers als controle (Fraeyman et al., 1988).
1.3
Bloed
Bloed is een vloeibaar weefsel en bestaat uit cellen opgelost in een vloeistof. Deze vloeistof wordt plasma genoemd. Een volwassen persoon bezit gemiddeld meer dan 5 liter bloed. Bloed heeft tal van functies die zorgen voor het optimaal functioneren van het lichaam. Dit vloeibaar weefsel transporteert zuurstof en nutriënten doorheen het lichaam naar de cellen en zorgt voor de afvoer van hun afvalstoffen. Ook de immuuncellen voor bestrijding van infecties bevinden zich in deze vloeistof. Wanneer een proefbuis gevuld met bloed wordt gecentrifugeerd, ontstaan er drie te onderscheiden lagen. Deze scheiding is weergegeven in figuur 6. De bovenste laag bestaat uit plasma, de middelste laag uit witte bloedcellen en bloedplaatjes, de onderste laag bestaat uit rode bloedcellen (Dean, 2005). De eigenschappen en functies van de verscheidene bloedcellen en het plasma worden besproken in hoofdstuk 1.3.1 en 1.3.2.
19
60 %
Plasma Witte bloedcellen en bloedplaatjes Rode bloedcellen
40 %
Figuur 6:Samenstelling bloed (Dean, 2005)
De bloedsomloop en –samenstelling zijn dynamische systemen die zich aanpassen aan de noden van het lichaam. Zo zal het hart sneller pompen tijdens fysieke inspanningen om zo meer zuurstof te leveren aan de spieren en zullen er bij een infectie meer immuuncellen worden getransporteerd naar de plaats van de infectie (Dean, 2005). Hierdoor kunnen verschillende bloedwaarden (vb. hematocrietwaarde, 1.3.1) dienen als biomerker aangezien ze sterk gerelateerd zijn aan verscheidene aandoeningen.
1.3.1 Bloedcellen Er zijn drie typen bloedcellen aanwezig in bloed: Rode bloedcellen (RBC) of erytrocyten Deze cellen hebben als voornaamste functie zuurstoftransport tussen de longen en de andere weefsels in het lichaam. Hemoglobine, een ijzerbevattend en zuurstofbindend eiwit speelt hier een grote rol in. Dit eiwit zorgt ook voor de rode kleur van bloed. De ABO-bloedgroep wordt bepaald door de antigenen die zich bevinden op het membraan van de RBC’s. De RBC is het meest voorkomende celtype in bloed. Een kubieke millimeter bloed bevat gemiddeld 4 tot 6 miljoen RBC´s. Deze cellen hebben een diameter van amper 6 µm waardoor ze zelf in de kleinste bloedvaatjes passen. Na ongeveer 120 dagen te circuleren in het lichaam, of na beschadiging, worden ze afgebroken in de milt of lever door macrofagen. In tegenstelling tot RBC´s van andere gewervelden (vissen, vogels, reptielen en amfibieën), bevatten de RBC´s van zoogdieren geen celkern. Hierdoor beschikt de cel over meer ruimte voor hemoglobine (zuurstofbindend eiwit) zodat er meer transport van zuurstof mogelijk is. De hematocriet is het gehalte aan rode bloedcellen in het totale bloedvolume en wordt uitgedrukt in procent. Bloedarmoede of anemie is een aandoening waarbij de patiënt een tekort heeft aan hemoglobine. Symptomen zijn vermoeidheid en een bleke huid (Dean, 2005).
20
Witte bloedcellen (WBC) of leukocyten Deze cellen spelen een grote rol in het immuunsysteem. Leukocyten spelen zowel een rol in de aangeboren als in de adaptieve immuunrespons. In vergelijking met rode bloedcellen zijn de witte bloedcellen veel groter, maar zijn ze in een kleinere hoeveelheid aanwezig. Er zijn verschillende soorten WBC´s met verschillende groottes en vormen. Deze worden verdeeld volgens de aan- of afwezigheid van granulen. Elk type leukocyt heeft een specifieke functie. Er bestaan drie soorten granulebevattende leukocyten (ook wel granulocyten genoemd), namelijk basofiele, neutrofiele en oesinofiele granulocyten. De agranulocyten bevatten geen granulen en worden onderverdeeld in lymfocyten, monocyten en macrofagen. Het gehalte aan witte bloedcellen neemt toe bij infecties en tumoren. Het type WBC geeft meer informatie over de infectie. Zo zal het gehalte aan neutrofielen stijgen in het beginstadium van de infectie, terwijl er in het verloop van de infectie meer lymfocyten zullen aangemaakt worden. Worminfecties hebben dan weer een toename in oesinofielen als gevolg, terwijl allergische reacties een toename van de basofielen veroorzaken (Dean, 2005). Bloedplaatjes of trombocyten Deze cellen helpen bij de bloedstolling door vorming van een zogenaamde bloedprop. Hierdoor wordt het bloedverlies door een beschadigd bloedvat beperkt. Bloedplaatjes zijn celfragmenten met een onregelmatige vorm die circuleren in het bloed tot ze ofwel worden geactiveerd voor het vormen van een bloedprop of verwijderd door de milt. Een kubieke millimeter bloed bevat gemiddeld tussen de 150.000 en 400.000 bloedplaatjes. Als het aantal beneden dit bereik ligt, neemt het risico op ongecontroleerde bloedingen toe, deze aandoening wordt trombocytopenie genoemd. Omgekeerd is trombocytemie een hoog gehalte bloedplaatjes, wat een verhoogd risico geeft voor het vormen van bloedklonters. Deze kunnen essentiële organen, zoals het hart en de hersenen, ontnemen van hun bloedtoevoer, met hartaanvallen en beroertes, respectievelijk als gevolg (Dean, 2005).
1.3.2 Plasma Plasma is de vloeibare fase van bloed en bestaat hoofdzakelijk uit water, maar bevat ook eiwitten (vb. albumine, stollingsfactoren, antilichamen, enzymen…), suikers (glucose), vetdeeltjes en andere organische en anorganische stoffen. Ongeveer 55 à 60 % van het bloedvolume bestaat uit plasma. Plasma wordt bekomen uit bloed door de bloedcellen af te scheiden met behulp van centrifugatie. Om stolling te vermijden kan een anticoagulant (antistollingsmiddel) toegevoegd worden meteen na de staalname. In 1.3.4 worden de voornaamste anticoagulanten besproken. Serum wordt bekomen door het bloed te laten stollen alvorens te centrifugeren. Aangezien het fibrinogeen zich in de gestolde fase bevindt is het serum zelf vrij van dit stollingseiwit. In plasma daarentegen is er wel nog fibrinogeen aanwezig (Lundblad, 2003). 21
Fibrinogeen, ook wel stollingsfactor I genoemd, zorgt voor de bloedstolling. Dit eiwit wordt aangemaakt in de lever en wordt bij een bloeding door het enzym trombine omgezet in fibrine. Voor bepaalde biochemische analysetechnieken wordt de voorkeur gegeven aan serum aangezien hier geen stollingsproducten aan zijn toegevoegd, welke de resultaten zouden kunnen beïnvloeden. Plasma heeft dan weer het voordeel dat dit stabieler blijkt. Er werd aangetoond dat eiwitprofielen van plasma en serum sterk verschillend zijn (Hsieh et al., 2006).
1.3.3 Eiwitsamenstelling bloedplasma In onderstaande tabel zijn de voornaamste plasma-eiwitten bij varkens weergegeven met vermelding van enkele belangrijke parameters. Deze eiwitsamenstelling varieert in functie van de ouderdom, en aangezien biggen geslacht worden wanneer ze ongeveer 6 maand oud zijn, werd er gekeken naar de samenstelling op deze leeftijd. Tabel 1: Eigenschappen plasmaproteïnen varken (Lampreave & Pineiro, 1992; Uniprot & Protparam)
Eiwit
Accession
Sequence
number
identifier
(AC)
(ID)
pI
MM
MM
Aantal
% in
GP?
(g/mol)
(kDa)
amino
plasma
Type
-zuren
glycosylatie
Serum albumine
5,84
66797,7
66,8
Albumine 1
5,52
22363,4
22,4
Albumine 2
6,12
22116,3
22,1
Albumine 3
7,07
22372,9
22,4
9,01
27040,7
27,0
Lage affiniteit
P08835
Q28942
ALBU_PIG
FCGR3_PIG
583
40
/
238
26
64: N
immunoglobuline
134:N
gamma Fc regio 162: N
receptor III
181: N
(=IgG) Serotransferrine
P09571
TRFE_PIG
6,93
76967,9
77,0
696
4
25: N 497: N
Alfa-2-HS-
P29700
FETUA_PIG
glycoproteïne
5,40
36688,5
36,7
347
1,3
96: N 153: N
22
(= fetuïne A) Alfa-1-antitrypsine
173: N P50447
A1AT_PIG
5,54
44792,1
44,8
397
0,25
73: N 110: N
Wanneer er gekeken wordt naar de eiwitsamenstelling in humaan plasma, zijn hier veel gelijkenissen. In onderstaande tabel worden de voornaamste plasma-eiwitten bij de mens weergegeven, met vermelding van enkele eigenschappen, analoog aan bovenstaande tabel. Tabel 2: Eigenschappen plasmaproteïnen mens (Lundblad, 2003; Uniprot & Protparam)
Eiwit
Accession
Sequence
pI
number
identifier (ID)
MM
MM
Aantal
Conc.
GP?
(g/mol)
(kDa)
amino
in pla-
Type
-zuren
sma
glyco-
(mg/ml)
sylatie
(AC)
Serum albumine
P02768
ALBU_HUMAN
5,67
66472,2
66,5
585
Albumine 1
5,69
22269,4
22,3
192
Albumine 2
5,35
21791,8
21,8
193
Albumine 3
7,59
22507,0
22,5
198
50
Immunoglobuline G
15
Fibrinogeen
3
Alfa-keten
P02671
FIBA_HUMAN
5,79
91358,8
91,4
831
Beta-keten
P02675
FIBB_HUMAN
7,95
50762,9
50,8
447
Gamma-keten
P02679
FIBG_HUMAN
5,24
48483,0
48,5
427
P02787
TRFE_HUMAN
6,70
75195,4
75,2
679
Serotransferrine
51:O 432:N 491:N 630:N
Haptoglobine
P00738
HPT_HUMAN
23
6,13
43349,0
43,3
388
2,0
184:N
207:N 211:N 241:N Alfa-keten
5,57
15945,7
15,9
142
Beta-keten
6,32
27265,0
27,3
245
Alfa-2-HS-
P02765
glycoproteïne
FETUA_HUMA
156:N
N
176:N
(= fetuïne A)
256:O 270:O 339:O 346:O
Keten A
4,53
30221,9
30,2
282
Keten B
10,8
2740,2
2,7
27
6 Immunoglobuline A Alfa-1-antitrypsine
2,6 P01009
A1AT_HUMAN
5,37
44324,4
44,3
394
2,7
70:N 107:N 271:N
Alfa-2macroglobuline
P01023
A2MG_HUMA N
5,98
160809, 8
160,8
1451
2,7
55:N 70:N 247:N 396:N 410:N 869:N 991:N 1424: N
24
Zoals eerder vermeld werd kunnen ook de plasma-eiwitten, net als de bloedcellen fungeren als biomerkers. Niet enkel het gehalte aan een bepaald eiwit, maar ook de PTM’s dat dit eiwit heeft ondergaan zoals glycosylatie, kan wijzen op een aandoening. De voornaamste eiwitten worden hieronder algemeen besproken. Serum albumine Het hoofdeiwit van bloedplasma is serum albumine. Dit eiwit heeft een grote bindingscapaciteit voor 2+
+
+
water, Ca , Na , K , vetzuren, hormonen, bilirubine (afbraakproduct van hemoglobine) en medicatie. De voornaamste functie van albumine is de regulatie van de osmotische druk van het bloed. Albumine zorgt ook voor het transport van zink en bindt ongeveer 80 % van het zink aanwezig in plasma (Uniprot). Transferrine Transferrinen zijn ijzerbindende transporteiwitten die twee Fe
3+
ionen kunnen binden in combinatie
met de binding van een anion, meestal bicarbonaat. Dit eiwit is verantwoordelijk voor het transport van ijzer van absorptielocaties en degradatie van het ijzer naar plaatsen waar dit wordt opgeslagen en/of gebruikt. Serumtransferrine kan ook een rol spelen bij het stimuleren van celproliferatie (Uniprot). α2-HS-glycoproteïne Dit eiwit bevordert endocytose, bezit opsonische eigenschappen en beïnvloedt de minerale fase van het bot. Dit glycoproteïne toont affiniteit voor calcium en barium-ionen. (Uniprot) α1-antitrypsine Dit eiwit is een inhibitor van serine proteasen. α1-antitrypsine bindt hoofdzakelijk aan elastase, maar heeft ook een matige affiniteit voor plasmine en trombine (Uniprot). Fibrinogeen Fibrinogeen (stollingsfactor I) is een eiwit dat verantwoordelijk is voor de bloedstolling. Dit eiwit wordt gevormd uit drie monomeren, namelijk fibrinogeen α, β en γ. Deze polymerisatie gebeurt met behulp van thrombine. Het resulataat is een onoplosbare fibrinematrix. Dit fibrine heeft een belangrijke functies bij de hemostase en wondheling. Fibrinogeen draagt bijvoorbeeld bij tot aggregatie van de bloedplaatjes. Tenslotte is maternaal fibrinogeen essentieel voor een succesvolle zwangerschap (Uniprot). α1-zuur glycoproteïne (AAG) AAG functioneert als transporteiwit in de bloedstroom. Dit door binding met verschillende liganden, ook synthetische drugs en zo hun distributie en beschikbaarheid in het lichaam beïnvloedt. Dit eiwit blijkt ook te functioneren bij het moduleren van de activiteit van het immuunsysteem gedurende de acute-fase reactie (Uniprot).
25
1.3.4 Staalname en bewaring Er werd aangetoond dat de procedures voor de monstername de grootste invloed hebben op de profilering van het proteoom, terwijl procedures voor de staalbehandeling en de bewaarcondities een relatief kleinere invloed hebben (Hsieh et al., 2006; Luque-Garcia & Neubert, 2007). Tuck M. et al. (2009) vermelden volgende factoren die een invloed kunnen hebben op resultaten van analysen op plasma en serum: (1) het type additief aanwezig in de collectietubes; (2) tijd en temperatuur bij staalname ; (3) hemolyse van het staal; (4) staalbewaring ; en (5) het aantal vries-dooi cycli. Deze factoren hebben namelijk een invloed op de stabiliteit van eiwitten en andere stoffen aanwezig in de serum- en plasmastalen. Eiwitprofielen van plasmastalen veranderen naargelang de tijd tussen staalname en de scheiding van het plasma en de bloedcellen varieert. Bij serumstalen werden er veranderingen in eiwitprofielen waargenomen naargelang de stollingstijd varieert (Hsieh et al., 2006).Ondanks dat serum voor vele analysen de voorkeur geniet omdat bij plasma de anti-coagulantia de resultaten zouden kunnen beïnvloeden, blijkt plasma stabieler te zijn dan serum. De eiwitprofielen van plasma en serum blijken zeer verschillend te zijn (Hsieh et al., 2006; Banks et al., 2005). Voor langdurige bewaring van zowel plasma als serum, werden er geen grote verschillen waargenomen bij -20 en -80°C (Rai et al., 2005; West-Nielsen et al., 2005). Herhaaldelijk dooien en ontdooien heeft wel een verandering van de samenstelling van het serum/plasma als gevolg. Dit is hoofdzakelijk te wijten aan aggregeren, neerslaan en de vasthechting aan oppervlakken van de eiwitten (Villanueva et al., 2005; Baumann et al., 2005).
1.3.5 Anti-coagulantia Anti-coagulatia
of anti-stollingsmiddelen zijn additieven die de stolling van het bloed of plasma
inhiberen. Zoals eerder werd vermeld, worden er aan plasma antistollingsmiddelen toegevoegd. Dit gebeurt meestal meteen na de staalname aan het gecollecteerde bloed, voor het centrifugeren. Vaak zijn de anti-coagulantia reeds aanwezig in de collectietubes. Er dient rekening mee geworden te houden dat wanneer deze in vloeibare vorm aanwezig zijn in de collectietubes, ze de plasmaconcentratie zullen verlagen. De werking van de anti-coagulantia is gebaseerd op het binden van calciumionen (EDTA en citraat) of op de inhibitie van de activiteit van thrombine (heparinaten en hirudine) (WHO, 2002). De meest gebruikte antistollingsmiddelen worden hieronder kort toegelicht. Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) Zouten van ethyleendiaminetetra-azijnzuur, namelijk dipotassium- (K2), trikalium- (K3) en dinatrium(Na2) zouten worden gebruikt in concentraties van 1,2 tot 2,0 mg/ml bloed (4,1-6,8 mmol/l bloed), gebaseerd op watervrij EDTA (WHO, 2002). 26
Citraat Trinatriumcitraat met 0,100-0,136 mol/l citroenzuur of gebufferd citraat met pH 5,5-5,6 (84 mmol/l trinatriumcitraat met 21 mmol/l citroenzuur). Voor coagulatietesten wordt een mengsel van 1 deel citraat met 9 delen bloed aanbevolen, voor bepaling van de bezinkingssnelheid van het bloed is dit 1 deel citraat met 4 delen bloed (WHO, 2002). Heparinaten 12 tot 30 IE/ml ongefractioneerd natrium-, lithium- of ammoniumzout van heparine met een moleculair gewicht van 3-30 kD wordt aanbevolen voor het verkrijgen van gestandaardiseerd gehepariniseerd plasma. Calcium-getitreerd heparine in een concentratie van 40 tot 60 IE/ml bloed (droog heparinisaat) en 8-12 IE/ml bloed (vloeibaar heparinisaat) wordt aanbevolen voor het bepalen van geïoniseerd calcium (WHO, 2002). Hirudine Hirudine is een antitrombine dat gewonnen wordt uit bloedzuigers of bereid wordt met behulp van genetische manipulatie. Hirudine inhibeert trombine door vorming van een 1:1 hirudine-trombine complex. Hirudine wordt toegepast in een concentratie van 10 mg/l (WHO, 2002).
1.4
Eigenschappen en toepassingen plasmapoeder afkomstig van varkensbloed
Varkensbloed is een reststroom van het slachtingproces, en kan gevaloriseerd worden door dit te verwerken tot plasmapoeder. In deze vorm vindt het plasma verscheidene toepassingen in de vleesverwerkende industrie (gekookte vleeswaren en visproducten). Het albumine aanwezig in plasma zal namelijk een driedimensionaal netwerk vormen bij een temperatuur boven 65 °C. Dankzij de hoge waterbindende capaciteit van de plasma-eiwitten is dit product bovendien goed oplosbaar in pekel, waardoor het bijvoorbeeld geïnjecteerd kan worden in gekookte ham. Andere vleeswaren waaraan dit product kan worden toegevoegd zijn gekookte worst, samengestelde ham, gefermenteerde worst, leverpastei, paté, bloedworst en vleeswaren in blik. Vanwege de sterk emulgerende en gelvormende eigenschappen welke zorgen voor stabilisatie van water en vet wordt de samenhang van deze verwerkte vleesproducten verhoogd waardoor deze vleeswaren snijdbaarder zijn en een stevigere beet (bijvoorbeeld bij ‘knack’-worsten) wordt bekomen. Dankzij de stijging van het eiwitgehalte, met een groot gehalte aan essentiële aminozuren, wordt ook de voedingswaarde verbeterd. De oorspronkelijke reststroom werd dus gevaloriseerd waardoor het zelfs een meerwaarde kan zijn voor de vleesindustrie. Plasmapoeder kan ook worden toegevoegd aan diervoeder voor huisdieren, veevoeder en visvoer (Actipro). Behalve plasmapoeder zijn er ook andere producten verkrijgbaar die afkomstig zijn van varkensbloed. Zo worden bijvoorbeeld rode bloedcellen vanwege hun hoog gehalte aan hemoglobine, een natuurlijke rode kleurstof, opgezuiverd om toe te voegen aan vleesproducten. Hierdoor kan bij gebruik van PSEvlees. in bv. worst of paté toch een mooie vleeskleur bekomen worden. PSE staat voor pale (bleek), 27
soft (zacht) en exudative (vochtafgevend) en komt voor bij vlees met een lage pH, wat wordt veroorzaakt door stress voor het slachtproces. Ook bij bloedworsten kan hemoglobine of rode bloedcellen gebruikt worden als alternatief voor vers bloed. Aangezien het om natuurlijke producten gaat, dient er geen E-nummer vermeld te worden op de verpakking bij toevoeging van deze supplementen (Vepro). De productfiche van het plasmapoeder is terug te vinden in bijlage. De eigenschappen van het gebruikte plasmapoeder zijn opgesomd in tabel 3. Tabel 3: Karakteristieken plasmapoeder, bron: Veos
Producteigenschappen Eiwitgehalte; Kjeldahl-N-gehalte x 5,7 (%)
69
Vochtgehalte (%)
7
pH 10 %- oplossing bij 20 °C
9
Oplosbaarheid (%)
95
2
Gelsterkte (g/cm )
250
Bacteriologie Totaal aeroob kiemgetal (/g)
< 100.000
E. coli (/10g)
afwezig
Salmonella (/25g)
afwezig
Bij de productie van plasmapoeder wordt vertrokken van varkensbloed, dit wordt door middel van centrifugatie gesplitst in plasma en bloedcellen. Er werden geen anti-stollingsmiddelen of andere additieven
toegevoegd.
Vervolgens
wordt
het
plasma
verder
verwerkt
tot
poeder.
Dit
verwerkingsproces is schematisch weergegeven in onderstaande figuur. Naargelang het proces vordert, stijgt het gehalte aan drogestof, en dus ook het eiwitgehalte.
Varkensbloed Centrifugatie Bloedcellen
Plasma Indampen
Concentraat Sproeidrogen n
Poeder Figuur 7: Schematische weergave van het productieproces van plasmapoeder met de verschillende processtappen, vertrekkende vanuit varkensbloed en afbeelding van het uiteindelijke plasmapoeder (Veos)
28
1.5
SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfaat - polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) is een scheidingsmethode waarbij de eiwitten migreren op basis van hun moleculair gewicht. Scheiding van moleculen met behulp van gel elektroforese is gebaseerd op het verschil in snelheid van migratie van de moleculen door de gelmatrix dankzij een aangelegd elektrisch veld. Deze migratiesnelheid is afhankelijk van de grootte, vorm en lading van de moleculen, de sterkte van het elektrisch veld en de samenstelling en concentratie van de gelmatrix. Onderstaande tabel geeft een beeld van de mogelijke matrices om een gel te vormen, de keuze wordt bepaald door de aard en grootte van de te scheiden moleculen (Boyer, 2012). Tabel 4: Keuze polymeer voor gelelektroforese naargelang de toepassing.
Polymeer
Toepassingen
Cellulose en cellulose acetaat
Koolhydraten en aminozuren
Polyacrylamide
Eiwitten
Agarose
DNA, RNA
Bij SDS-PAGE wordt gewerkt met gedenatureerde eiwitten met een gelijke negatieve lading afkomstig van de SDS (1,4 g SDS per g eiwit). De sterkte van het elektrisch veld, de samenstelling en concentratie van polyacrylamide zijn constant. Hierdoor is de migratiesnelheid bij SDS-PAGE enkel nog afhankelijk van de grootte van de eiwitmoleculen. Hoe groter het gehalte aan polyacrylamide, hoe kleiner de poriën van de gelmatrix. Een te hoog gehalte zal er voor zorgen dat de moleculen worden tegengehouden en dus niet kunnen migreren doorheen de gel. Een te lage concentratie zal dan weer als gevolg hebben dat alle moleculen zich snel doorheen de gel zullen verplaatsen. Het gehalte aan polyacrylamide kan dus worden aangepast om de scheiding te optimaliseren (tabel 5). Tabel 5: Relatie % AA tot grootte van te scheiden moleculen
Moleculair gewicht proteïnen
% polyacrylamide in scheidingsgel
< 10.000
> 15 %
10.000 – 80.000
10-15%
20.000 - 150.000
5-10 %
> 100.000
3-5 %
Aangezien de eiwitten een moleculair gewicht hebben van ongeveer 20.000 tot 80.000 Da (tabel 1 en 2) werd gekozen voor een gel met 7,5% polyacrylamide (AA). De 7,5 % AA geldt voor de scheidingsgel, de stapelgel bestaat steeds uit slechts 4,5 % AA.
29
De polymerisatie van acrylamide en cross-linker N,N’-methyleen-bis-acrylamide (verhouding 37,5:1) ontstaat met behulp van een initiator-katalysator systeem. Hierbij treedt ammmoniumpersulfaat (APS) op als initiator en N,N,N’,N’-Tetramethylethyleendiamine (TEMED) als katalysator. Bij discontinue gel elektroforese bestaat de gel uit twee delen, namelijk een onderste scheidingsgel en een bovenste stapelgel. Deze gels verschillen in ionische sterkte, pH en % AA. De pI van glycine ligt dicht bij de pH van de stapelgel (6,8), waardoor dit niet sterk negatief geladen is en dus ook niet snel zal migrereren naar de positieve pool. De cholride-ionen daarentegen zijn wel sterk geladen, en ook klein waardoor ze wel snel zullen migreren richting positieve pool. In de scheidingsgel bedraagt de pH 8,8, waardoor glycine wel negatief geladen wordt en dus sneller zal migreren naar de negatieve pool, al wordt dit beperkt door de hogere concentratie aan polyacrylamide. Deze factoren zorgen ervoor dat in de bovenste gellaag de bandjes geconcentreerd worden en de resolutie van de scheiding in de onderste gel toeneemt.
1.6
IEF
Iso-elektrische focusering (IEF) is een scheidingstechniek waarbij de migratie van de eiwitten doorheen de gel met pH-gradiënt wordt bepaald door hun iso-elektrisch punt (pI), dit is de pH waarbij de eiwitten een nettolading hebben van nul ofwel neutraal geladen zijn (Amersham Biosciencces, 1998). De nettolading van een eiwit is namelijk afhankelijk van de pH waarin het zich bevindt. Wanneer de pH lager is dan de pI van het eiwit, zal het eiwit positief geladen zijn en dus migreren naar de negatieve pool, de kathode. Bij een pH groter dan de pI van het eiwit, zal dit eiwit negatief geladen zijn en dus migreren naar de positeve pool, de anode. IEF bestaat uit 3 stappen: (1) de prefocusering waarbij de pH-gradiënt wordt gevormd, (2) appliciatie van de stalen en (3) de eigenlijke focusering. Definitie van % T en % C De samenstelling van een polyacrylamidegel wordt weergegeven aan de hand van twee parameters: 1) % T = totale concentratie aan acrylamide = [g (acryl + bis) / 100 ml] x 100 Deze waarde kan in de scheidingsgel varieren van 5 tot 20 % en determineert de poriegrootte. De stapelgel heeft een zeer laag gehalte aan acrylamide (meestal 4 %T) aangezien hier een grote poriegrootte gewenst is. 2) % C = gehalte aan crosslinker in het totale acrylamide = [g (bis) / g (acryl + bis)] x 100 Het gehalte aan crosslinker bedraagt gemiddeld 2,6 % (1:37,5) voor alle gels.
30
1.7
2D elektroforese
Bij 2D elektroforese wordt IEF gecombineerd met SDS-PAGE. Hierbij worden de eiwitten eerst gescheiden op basis van hun pI met behulp van IEF, vervolgens worden de eiwitten gescheiden op basis van hun verschil in grootte met behulp van SDS-PAGE. Via deze methode is het dus mogelijk om een onderscheid te maken tussen eiwitten met eenzelfde moleculair gewicht maar verschillend pI, en tussen eiwitten met eenzelfde pI maar verschillend moleculair gewicht. Aangezien er van deze methode geen gebruik werd gemaakt, wordt hier ook niet dieper op ingegaan in deze thesis.
1.8
Kleuren van de gel
Na uitvoering van SDS-PAGE, dient de gel volgende stappen te ondergaan om de bandjes te kleuren:
Wassen van de gel met water om de elektroforesebuffer te verwijderen
Fixatie van de gel door een behandeling met een zuur of alcohol om diffusie van de eiwitbandjes te vermijden
Kleuring van de proteïnen door behandeling met de kleurstoffen
Ontkleuring van de gel om de overtollige kleurstof te verwijderen en zo de achtergrondkleur te minimaliseren
Afhankelijk van het protocol kunnen er stappen tegelijk uitgevoerd worden of net meerdere behandelingen nodig zijn per stap. Er zijn zowel kleuringsmethoden voor alle proteïnen als voor specifieke subgroepen. Zo kunnen glycoproteïnen en fosfoproteïnen specifiek gekleurd worden en zo de eiwitten worden geclassificeerd op basis van hun typerende chemische verbinding (respectievelijk polysacchariden en fosfaatgroepen). Wanneer een kleurstofbindende stof of kleurreactie kan worden ontworpen om één van deze functionele groepen te detecteren, kan dit gebruikt worden als basis voor een specifieke gelkleuring. Vervolgens kunnen de kleuringsmethden opgedeeld worden in colorimetrische en fluorescente kleuringen, waarbij de colorimetrische kleuringen meteen met het blote oog waarneembaar zijn, en zijn de fluorescentie kleuringen slechts na excitatie detecteerbaar met behulp van een transiluminator. De detectiemethoden voor het totaal proteoom en voor de glycoproteïnen die in dit eindwerk werden aangewend, worden besproken in paragraaf 1.9 en 1.10 (Thermo Fisher Scientific, 2015).
1.9
Detectie en kleuring van alle proteïnen
1.9.1 Colorimetrische kleuring: coomassie brilliant blauw (CBB) De meest aangewende kleuringsmethode voor eiwitgels is de coomassie-kleuring omdat het een eenvoudige methode is, een kant-en-klaar reagens is en de eiwitten niet chemisch worden gewijzigd. Deze kleuring is wel minder precies dan zilverkleuringen en fluorescente kleuringen en wordt hierdoor ook niet toegepast voor analytische gels (Dyballa & Metzger, 2009). Er zijn verschillende
31
samenstellingen van de kleuroplossingen terug te vinden in de literatuur waarbij gebruik gemaakt wordt van de G-250 (colloïdale oplossing) of de R-250 kleuring. Coomassie R-250 en G-250 (figuur 8) zijn twee chemische vormen van een gedisulfoneerde trifenylmethaan verbinding die gewoonlijk wordt gebruikt als basis voor kleuroplossing voor detectie van proteïnen na gelelektroforese en in Bradford-type reagentia voor eiwitkwantificering (Bradford, 1976). In deze benamingen staat de G voor “greenish” en R voor “reddish”, 250 is een maat voor de kleurintensiteit. De R-250 (rood getinte) vorm mist twee methylgroepen die aanwezig zijn in de G-250 (groen getinte) vorm, ook wel gekend als colloïdale coomassie-kleurstof. R-250 is onoplosbaar in water en dient bijgevolg eerst opgelost te worden in methanol. De G-250 vorm is wel licht oplosbaar in water, maar wordt bij voorkeur ook eerst opgelost in methanol of ethanol.
Figuur 8: Moleculaire structuren, formule en moleculair gewicht van coomassie brilliant blauw kleuringen R-250 (links) en G-250 (rechts)
Meestal worden coomassie gelkleuringen en eiwitanalyse reagentia geformuleerd als zeer zure oplossingen in 25 tot 50 % methanol. Onder zure omstandigheden bindt de kleurstof aan eiwitten via basische aminozuren (hoofdzakelijk arginine, lysine en histidine), en het aantal coomassiecomplexen gebonden aan elke eiwitmolecule is bij benadering evenredig met het aantal positieve ladingen op de eiwitten, ongeveer 1,5-3 moleculen CBB/lading (Tal et al., 1985). Zoals bij alle kleuringen detecteert coomassie blauw dus bepaalde eiwitten beter dan andere. Zo kunnen de meeste eiwitten gedetecteerd worden vanaf 25 ng per band, maar sommige eiwitten al vanaf 8-10 ng. Omdat er geen chemische modificatie optreedt, kunnen weggesneden eiwitbanden volledig ontkleurd worden en zo de eiwitten teruggewonnen en hergebruikt worden voor analyse door bijvoorbeeld massaspectrometrie of sequenering. De eiwitbinding zorgt ervoor dat de kleurstof verandert van rood-bruin tot intens blauw, er vindt dus een verschuiving plaats van de absorptiepiek van 465 nm naar 595 nm zoals weergegeven in figuur 9.
32
Figuur 9: Het absorptiespectrum van Coomassie Brilliant Blauw ongebonden (rode lijn) en eiwitgebonden (groene lijn). Na binding verschuift het absorptiemaximum van 465 nm naar 595 nm (Bradford, 1976).
1.9.2 Fluorescente kleuring: SYPRO Ruby De SYPRO Ruby kleuring is een permanente kleuring bestaande uit een ruthenium-bevattend organisch complex (figuur 10) dat niet-covalente interacties aangaat met eiwitten (Berggren et al., 2000). Doordat deze kleuring niet enkel bindt met basische aminozuren is er minder variatie in kleuring van eiwit tot eiwit dan bij andere proteïnekleuringen zoals bijvoorbeeld coomassiekleuringen.
Figuur 10: Structuur van SYPRO Ruby kleuring; een ruthenium-bevattend organisch complex (Demchenko, 2011).
De meeste proteïnen kunnen met deze methode worden gedetecteerd, inclusief glycoproteïnen, maar ook moeilijk te kleuren proteïnen. Eventuele contaminatie van nucleïnezuren daarentegen wordt niet meegekleurd. De SYPRO Ruby kleuring heeft een lage detectielimiet van 0,25 tot 2,5 ng. Het is mogelijk om deze kleuring te combineren met andere kleuringen (vb. Pro-Q Emerald 300, 1.7.2) om zo meer informatie te verkrijgen van eenzelfde gel. 33
In onderstaande figuur zijn de excitatie- en emissiemaxima weergegeven van de SYPRO Ruby
280
610
450
Fluorescente emissie (-------)
Fluorescente excitatie (- - - -)
proteïne kleuring.
Golflengte (nm) Figuur 11: Excitatie- (stippellijn) en emissie- (volle lijn) spectra van SYPRO Ruby proteïne kleuring met aanduiding van de pieken
1.10 Specifieke detectie en kleuring van glycoproteïnen Deze specifieke kleuringen dienen uitgevoerd te worden alvorens de kleuring van de totale proteïnen.
1.10.1 Colorimetrische kleuring: Periodic acid-Schiff (PAS) Deze methode is gebaseerd op oxidatie van de suikergroepen met perjoodzuur (HIO4). De ontstane aldehydegroepen kunnen vervolgens reageren met het Schiff’s reagent, een aminebevattende kleurstof. Een reductie kan tenslotte de kleurstof-eiwitbinding stabiliseren (Wako Pure Chemical Industries, 2013). Het reactiemechanisme wordt voorgesteld in figuur 12. De kleur kan variëren van rood tot blauw-paars. Naast kleuring van eiwitgels wordt de PAS-kleuring in combinatie met diastase (α-amylase), een zetmeel- en glycogeenafbrekend enzym, ook vaak toegepast om weefsels te kleuren. De detectielimiet hangt af van de mate van glycosylatie ne de grootte van het eiwit. Zo kan er tot 0,625 ng avidine en 0,16 µg mierikswortelperoxidase gedetecteerd worden per band in een SDS-PAGE gel. De kleuring wordt op eiwitgels bij voorkeur uitgevoerd alvorens alle proteïnen te detecteren met coomassie blauw (1.9.1) aangezien deze kleuringen beiden colorimetrisch zijn. De fluorescente variant van deze kleuringsmethode, de Pro-Q Emerald kleuring, wordt besproken in hoofdstuk 1.10.2.
34
Figuur 12: Reactiemechanisme PAS-kleuring (Wako Pure Chemical Industries, 2013).
1.10.2 Fluorescente kleuring: Pro-Q Emerald 300 Deze kleuring wordt bij voorkeur uitgevoerd alvorens alle proteïnen te detecteren met SYPRO Ruby (1.9.2) aangezien deze kleuringen beiden fluorescent zijn. De detectielimiet bedraagt 0,5 ng glycoproteïne per band, afhankelijk van de aard en mate van glycosylatie. Dit betekent dat deze detectiemethode ongeveer 50 keer gevoeliger is dan de PASmethode (1.10.1). De Pro-Q Emerald 300 glycoproteïne kleuring reageert (net als het PAS-reagent) met perjodaatgeoxideerde suikergroepen, waarbij een heldergroen fluorescent signaal ontstaat ter hoogte van de glycoproteïnen (Mehta-D'souza, 2012). De excitatie is maximaal bij een golflengte van 280 nm en de emissie is optimaal bij ongeveer 530 nm. In onderstaande figuur zijn de excitatie- en emissiemaxima weergegeven van de Pro-Q Emerald 300 glycoproteïne kleuring en de SYPRO Ruby proteïne kleuring.
530
Fluorescente emissie
Fluorescente excitatie
280
Golflengte (nm)
Golflengte (nm)
Figuur 13: Excitatie- (A) en emissie- (B) spectra van Pro-Q Emerald 300 glycoproteïnekleuring (volle lijnen) en SYPRO Ruby proteïne kleuring (stippellijnen) met aanduiding van de pieken.
35
1.11 Affiniteitschromatografie Chromatografie is de algemene benaming voor scheidingstechnieken waarbij de verschillende componenten in een mengsel van elkaar worden gescheiden op basis van de affiniteit van de componenten voor de mobiele en de stationaire fase. De scheiding kan gedetecteerd worden en vervolgens gevisualiseerd in de vorm van een chromatogram. Voorbeelden van types chromatografie zijn
vloeistofchromatografie,
gaschromatografie,
ionenuitwisselingchromatografie
en
affiniteitschromatografie (GE Lifesciences, 2007). Deze laatste wordt verder besproken aangezien hiervan ook gebruik werd gemaakt in dit eindwerk. Bij affiniteitschromatografie zal er een specifieke component aanwezig in het staal reversibel binden (elektrostatische of hydrofobe interacties, Van Der Waals krachten en/of hydrogene bindingen) met de stationaire fase waardoor deze gescheiden wordt van de andere compenenten aanwezig in het mengsel. Deze techniek wordt vaak gebruikt voor complexe mengsels zoals bloed, plasma en urine. Voorbeelden van biochemische interacties die toepassing vinden in affiniteitschromatografie zijn enzym-substraat, antigen-antilichaam, hormoon-receptor en lectine-glycoproteïne, zoals hier werd toegepast (GE Lifesciences, 2007). Onderstaande figuur stelt een chromatogram voor dat bekomen kan worden na affiniteitschromatografie. Hierbij bestaat de eerste piek uit niet-gebonden componenten, en zijn de tweede en derde piek eiwitten die werden tegengehouden maar verschillen in sterkte van de binding, waarbij de eiwitten in de derde piek sterker gebonden waren aan de kolom dan de eiwitten in de tweede piek, die sneller losgelaten werden. De eiwitconcentratie werd hier gemeten aan de hand van de absorbantie bij een golflengte van 280 nm. De x-as stelt de opgevangen fracties voor.
Figuur 14: Voorbeeld chromatogram (Blaber, 1998)
Voor scheiding van glycoproteïnen met behulp van affiniteitschromatografie zijn er twee vaak toegepaste mogelijkheden, namelijk lectinen en antilichamen. Deze hebben elk hun voor- en nadelen, maar lectinen worden het vaakst aangewend aangezien ze goedkoper, beter gekarakteriseerd en stabieler zijn (Cummings & Etzler, 2009). 36
Lectinen zijn suikerbindende proteïnen met een hoge specificiteit voor bepaalde suikereenheden. Ze kunnen dus gebruikt worden om glycoproteïnen en hun functies te detecteren en analyseren. Lectinen kunnen ook gelabeld worden door deze te binden aan probes (vb. mierikswortelperoxidase, fluoroforen en biotine) voor specifieke analyses en detecties en kunnen geïmmobiliseerd worden door binding aan een vaste drager (vb aan biotine via streptavidine). Lectinen speelden een sleutelrol in de ontdekking dat de antigenen van de bloedgroepen ABO glycanen zijn (Varki et al., 2009). De bindingsaffiniteit (Kd) van lectinen voor complexe glycanen ligt vaak in de range van 1 tot 10 µM. Voor complexe glycoconjugaten kan de bindingsaffiniteit waarden van slechts enkele nanomolair aannemen. De affiniteit van de meeste lectinen voor monosachariden daarentegen bevindt zich in het millimolaire gebied (Varki et al., 2009). Con-canavaline A is waarschijnlijk het meest gebruikte lectine. Dit lectine, een α-mannose/α-glucosebindend lectine, bindt aan N-glycanen. Dit lectine is het eerste waarvan de driedimensionele structuur 2+
werd achterhaald (Edelman et al., 1972). De eiwitstructuur, een homotetrameer met 4 Ca
2+
en Mn -
ionen is weergegeven in onderstaande figuur (RSCB Protein data bank, 1999).
Figuur 15: Structuur van het lectine Con-canavaline A (ConA) met een resolutie van 2,4 Å (Hardman & Ainsworth, 1972)
Er werd reeds onderzoek uitgevoerd met deze techniek, bv. naar optimale scheiding van glycoproteïnen in humaan plasma, dit met een gemixte kolom van ConA, tarwekiem agglutinine (WGA) en jacaline (JAC) vanwege hun verschillende affiniteiten voor respectievelijkN-glycanen, GlcNAc en Ogebonden glycoproteïnen welke elkaar aanvullen en samen dus nagenoeg alle glycoproteïnen kunnen capteren (Kulloli et al., 2008; Yang & Hancock, 2004). Bij lectinekolommen bestaande uit ConA werden problemen bij de elutie vastgesteld door te sterk gebonden glycoproteïnen, dit kon opgelost worden door de ionenconcentratie en pH van de elutiebuffer aan te passen (Soper & Aird, 2007).
37
2. Materiaal en methoden 2.1
Staalname en –bewaring
Stalen Veos Er werden stalen plasma, -concentraat en -poeder gecollecteerd van éénzelfde batch. Het plasma en concentraat werd verdeeld in eppendorfs (1,5 ml) en bewaard bij – 20 °C. Het poeder werd bewaard bij kamertemperatuur. De bereiding, eigenschappen en toepassingen van dit poeder werd besproken in hoofdstuk 1.3.4. Stalen Sigma-Aldrich Er werd plasmapoeder besteld van humaan, varkens-, runds- en kippenbloed met artikelnummers respectievelijk P9523, P2891, P4639 en P3266. Deze stalen zijn bereid door het gecollecteerde bloed, met antistollingsmiddel (9:1) te centrifugeren. Hierna werd het plasma gefilterd over een filter van 0,45 µm en vervolgens gevriesdroogd. De stalen bevatten in poedervorm telkens 3,8 % trisodium citraat, een anti-stollingsproduct. Dit poeder werd na ontvangst heropgelost in water en vervolgens verdeeld in eppendorfs (1,5 ml) en bewaard bij – 20 °C.
2.2
Bepaling eiwitgehalte
2.2.1 BIO-RAD DC eiwitanalyse 2.2.1.1
Reagentia
Reagentia A (BIO-RAD Laboratories): een alkalische oplossing van kopertartraat
Reagentia B (BIO-RAD Laboratories): een verdund Folin reagent
Gedestilleerd water
2.2.1.2
Apparatuur
Microtiterplaat (VWR International)
Spectrofotometer: model 680 microplate reader, (BIO-RAD Laboratories)
2.2.1.3
Standaarden en oplossingen
Er werd plasma, concentraat en poeder geleverd van varken. Deze stalen werden geleverd door Veos (Zwevezele, België), producent van functionele eiwitten voor de vleesindustrie. Het plasmapoeder van mens, kip, rund en kip is afkomstig van Sigma-Aldrich. BSA (Sigma-Aldrich) werd in poedervorm aangekocht. Hieruit werd een stockoplossing bereid van 10 mg/ml in H2O. De kwantificatie van het eiwitgehalte in de plasmastalen werd bepaald aan de hand van een ijklijn bestaande uit volgende verdunningen: 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8 en 2,0 38
mg/ml in H2O. Voor deze standaarden werd vertrokken vanuit de stockoplossing. Een voorbeeld van een BSA-standaardcurve is weergegeven in figuur 16. 0,400 y = 0,1722x + 0,0173 R² = 0,9915
0,350
Absorbantie
0,300 0,250 0,200 0,150 0,100 0,050 0,000 0
0,5
1
1,5
2
Concentratie BSA (mg/ml) Figuur 16: Voorbeeld BSA-standaardcurve via de BIO-RAD DC eiwitanalyse
2.2.1.4
Protocol
De Biorad DC eiwitanalyse is een colorimetrische methode voor de bepaling van de eiwitconcentratie van eiwitoplossingen. De reactie is analoog aan de methode van Lowry, mits enkele aanpassingen. Volgende twee stappen zorgen voor de kleurontwikkeling: de reactie tussen peptidebindingen van het 2+
eiwit en koperionen (Cu ) afkomstig van de toegevoegde kopertartraatoplossing in een alkalisch milieu (de Biureet-reactie), en de daaropvolgende reductie van het Folin reagens door het met koper behandelde tyrosine en tryptofaan zorgen voor de karakteristiek blauwe kleur. Er dient een kalibratiecurve opgesteld te worden van een proteïne standaardoplossing, bij voorkeur van dezelfde proteïnesamenstelling als deze waarvan de concentratie dient bepaald te worden. Aangezien dit meestal niet voor handen is, dient er gebruik te worden gemaakt van een eiwitoplossing met een analoge kleurverandering. Bovine Serum Albumine (BSA) wordt hier vaak voor toegepast. De eiwitconcentraties van onbekenden kunnen vervolgens bepaald worden aan de hand van deze curve. De stalen worden verdund in verschillende mate zodanig dat de concentraties binnen het bereik van de standaardcurve liggen. In een microtiterplaat werd telkens 5 µl van de BSA-standaarden en verdunde stalen in drievoud gepipetteerd, hieraan werd vervolgens 25 µl van oplossing A en 200 µl van oplossing B toegevoegd. Na 15 à 60 min reactie bij kamertemperatuur werd de absorbantie gemeten bij 655 nm.
39
2.2.2 Wet van Lambert-Beer Om de eiwitconcentratie in een staal snel te bepalen, kan gebruik gemaakt worden van de wet van Lambert-Beer; A = ε x c x l, met A: absorbantie; ε: molaire extinctiecoëfficiënt in l/(mol x cm), c: concentratie in mol/l; l: lengte in cm dat de lichtstraal heeft afgelegd, m. a. w. de doorsnede van de cuvet. Aan de hand van de extinctiecoëfficient van het eiwit en de gemeten absorbantie bij een golflengte van 280 nm, kan de eiwitconcentratie in het staal geschat worden. Deze methode is niet zo nauwkeurig maar wel zeer snel. De voorwaarden zijn dat er een blanco beschikbaar moet zijn en het eiwit gekend moet zijn, dit omdat de extinctiecoëfficient geweten dient te zijn. Voordeel van deze methode is dat het staal later kan hergebruikt worden voor eventuele verdere analysen aangezien er geen reagentia aan werden toegevoegd. De benodigdheden zijn dan ook zeer beperkt, namelijk UVcuvetten (artikelnummer BR759200, Sigma-Aldrich) en een spectrofotometer (Lightwave II, WPA).
2.3
Scheiding van de plasmaproteïnen
2.3.1 SDS-PAGE 2.3.1.1
Bereiden van de gel
Apparatuur Voor de bereiding van de gel zijn de benodigdheden weergegeven in figuur 17. De gel wordt gemaakt tussen glasplaten met een tussenruimte gelijk aan de dikte van de gel, in dit geval 0,75 mm. Voordat de gel gegoten wordt, wordt de onderste glasplaat aan de zijkant bevochtigd om de plaatjes aan elkaar te “plakken”. Deze platen worden in een speciaal hiervoor ontwikkelde houder A geplaatst. Deze houder wordt vervolgens in houder B geplaatst. Door gedestilleerd water tussen de glasplaten te brengen wordt gecontroleerd of er geen lek is tussen de glasplaten en de houders. Wanneer er geen lek blijkt te zijn, wordt het water van tussen de platen verwijderd en kan vervolgens de gel gegoten worden. Bij een lek wordt voorgaande procedure herhaald totdat er geen lek meer is.
40
B
A
Figuur 17: Apparatuur voor SDS-PAGE; glasplaten, kammetjes, houders (A en B), elektroforesecel met houder, hulpstukken voor laden van de stalen en rechts het elektroforeseapparaat (BIO-RAD)
Oplossingen a) Stock acrylamideoplossing ( % T = 30 %; % C = 2,7 w/w) Voor deze oplossing wordt 73 g acrylamide samen met 2 g bis-acrylamide opgelost in water en aangelengd tot 250 ml. Deze stockoplossing blijft enkele weken stabiel in bruin glas bij 4 °C. b) Stock scheidingsgel buffer 0,2 g SDS en 9,1 g Tris base [2-amino-2-(hydroxymethyl)-propaan-1,3-diol] worden gelost in < 50 ml water, waarna de pH naar 8,8 wordt gebracht met HCl en vervolgens verder aangelengd wordt met water tot 50 ml. Voor gebruik dient de pH opnieuw gecontroleerd te worden. Deze stockoplossing (1,5 M) is maanden houdbaar bij 4 °C. c) Stock stapelgel buffer 0,2 g SDS en 3,02 g Tris base worden gelost in < 50 ml water, waarna de pH naar 6,8 wordt gebracht met HCl en vervolgens verder aangelengd wordt met water tot 50 ml. Voor gebruik dient de pH opnieuw gecontroleerd te worden. Deze stockoplossing (0,5 M) is maanden houdbaar bij 4 °C. d) Stock ammonium persulfaat (APS) Voor deze oplossing wordt 1,0 g ammonium persulfaat opgelost in 10 ml water. Deze stockoplossing blijft enkele weken stabiel in bruin glas bij 4 °C. Voor langere periodes wordt aangeraden om deze oplossing in te vriezen. e) TEMED: N,N,N’,N’-Tetramethylethyleendiamine
Methode De samenstelling van de gels is weergegeven in tabel 6. Aangezien de scheidingsgel het onderste deel is van de gel, wordt deze gel het eerst bereid. Er wordt gestart met het mengen van de 30 % AA:Bis (1:37,5), het ultrapuur water en de scheidingsbuffer. APS en TEMED worden als laatste tegelijk toegevoegd. 41
Na menging van de componenten wordt de acrylamideoplossing zo snel mogelijk tussen de platen gebracht met een pipet van 1 ml tot ongeveer 2/3 van de ruimte tussen de platen gevuld is. Voor het bekomen van een rechte scheiding wordt een kleine hoeveelheid isopropanol aangebracht boven op de acrylamideoplossing. Wanneer na ongeveer 20 minuten de polymerisatie volbracht is, kan de bovenstaande vloeistof verwijderd worden en gestart worden met de bereiding van de stapelgel. Dit gebeurt op analoge wijze als bij de scheidingsgel. Er wordt gestart met het mengen van de 30 % AA:Bis (1:37,5), het ultrapuur water en de stacking buffer. APS en TEMED worden als laatste tegelijk toegevoegd. Na menging van de componenten wordt de acrylamideoplossing zo snel mogelijk tussen de platen gebracht met een pipet van 1 ml tot de ruimte tussen de platen gevuld is. Tenslotte wordt de kam tussen de platen geplaatst om slotjes in de gel te verkrijgen. Na polymerisatie is de gel klaar voor gebruik. De gel kan tot 2 weken bewaard worden in runningbuffer bij een temperatuur van 4 °C. Tabel 6: Samenstelling scheidings- en stapelgel voor SDS-PAGE, gel met 7,5 % AA en dikte 0,75 mm. De hoeveelheden zijn gebaseerd op 1 SDS-PAGE gel. De scheidingsbuffer bestaat uit 1,5 M Tris-Hcl en heeft een pH van 8,8. De stapelbuffer bestaat uit 0,5 M Tris-HCl en heeft een pH van 6,8.
Scheidingsgel
Stapelgel
30 % AA:BIS (1:37,5)
1,25 ml
0,375 ml
Buffer (Scheidingsbuffer of stapelbuffer)
1,25 ml
0,625 ml
2,5 ml
1,5 ml
N,N,N’,N’-Tetramethylethyleendiamine (TEMED)
10 µl
10 µl
Ammonium persulfaat (APS)
25 µl
25 µl
Ultrapuur H2O
2.3.1.2
Runnen van de gel
Oplossingen a) Stock staalbuffer
9,5 ml
Ultrapuur water
4,8 ml
0,5 M Tris-Hcl buffer pH 6,8
1,2 ml
Glycerol
1,0 ml
10 % (w/v) SDS
2,0 ml
0,1 (w/v) bromofenolblauw
0,5 ml
b) Reducerende SDS staalbuffer
500 µl
β-mercaptoethanol
25 µl
Stock staalbuffer
475 µl
42
c) Runningbuffer / reservoirbuffer
2l
Tris (0,025 M)
6,0 g
Glycine (0,192 M)
28,8 g
SDS (0,1 % w/v)
2,0 g
Deze oplossing zou een pH van ongeveer 8,3 moeten hebben zonder toevoegingen.
Standaarden Mierikswortel peroxidase Dit geglycosyleerd eiwit met een moleculair gewicht (MW) van 37 kDa werd gebruikt als positieve controle. De concentratie van de stockoplossing bedraagt 2 mg/ml. Sojaboon trypsine inhibitor (STI) Dit niet-geglycosyleerd eiwit met een moleculair gewicht (MW) van 20 kDa werd gebruikt als negatieve controle. De concentratie van de stockoplossing bedraagt 2 mg/ml. Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards (BIO-RAD) Deze ladder bevat een mix van tien proteïnen met MM: 10; 15; 20; 25; 37; 50; 75; 100; 150; 250 kDa. Deze eiwitten zijn reeds blauw gekleurd. Candycane Glycoprotein Molecular Weight Standards (life technologies) Deze ladder bevat een mix van acht proteïnen met MM: 14; 18; 29; 42; 66; 82; 97; 180 kDa. Deze eiwitten zijn in volgorde van moleculair gewicht afwisselend wel en niet geglycosyleerd (tabel 7). Tabel 7: Eiwitten aanwezig in de Candycane standaard met vermelding van de moleculaire gewichten en de glycosylatie, waarbij “X” wijst op een geglycosyleerd eiwit
Eiwit
MM (Da)
Glycoproteïne?
α1-macroglobuline
180 000
X
Fosforylase b
97 000
Glucose oxidase
82 000
Bovine Serum
66 000
X
albumine α1-zuur
42 000
X
glycoproteïne Koolstofanhydrase
29 000
Avidine
18 000
Lysosyme
14 000
X
Low Molecular Weight (LMW) (BIO-RAD) Deze ladder bevat een mix van zes proteïnen met MM: 14,4; 21,5; 31; 45; 66,2; 97,4 kDa. De laatste drie komen ook voor in de HMW-ladder (tabel 8).
43
High Molecular Weight (HMW) (BIO-RAD) Deze ladder bevat een mix van vijf proteïnen met MM: 45; 66,2; 97,4; 116,25; 200 kDa. De eerste drie komen ook voor in de LMW-ladder (tabel 8). Tabel 8: Eiwitten aanwezig in LMW en HMW standaarden, met vermelding van MM.
Eiwit
MM (Da)
LMW
HMW
Myosine
200 000
X
β-galactosidase
116 250
X
Fosforylase b
97 400
X
X
Serum albumine
66 200
X
X
Ovalbumine
45 000
X
X
Koolstofanhydrase
31 000
X
Trypsine-inhibitor
21 500
X
Lysosyme
14 400
X
Staalvoorbereiding De stalen worden verdund zodat de eiwitconcentratie ongeveer 1 mg/ml bedraagt. Vervolgens wordt hiervan telkens 10 µl gemengd met 10 µl reducerende staalbuffer in een eppendorf van 1,5 ml. In de bovenkant van elke eppendorf wordt met een (hete) naald een gaatje gemaakt. De stalen worden gedurende 2 minuten gekookt zodat alle eiwitten met zekerheid gedenatureerd zijn.
Methode De gel tussen de twee glasplaten wordt in de houder van de elektroforesecel gebracht. Wanneer er slechts 1 gel gelopen wordt, dient de cel gesloten te worden met behulp van een bufferdam, dit is een speciale sluitplaat. De cel wordt gevuld met runningbuffer en gecontroleerd op lekken. Wanneer er een lek is, dient de constructie opnieuw in elkaar gezet te worden, of wordt de container gevuld met runningbuffer totdat het vloeistofoppervlak gelijk loopt met dit in de cel. De kam wordt voorzichtig verwijderd en de slotjes van de gel worden gevuld met 10 µl staal of standaard met behulp van een micropipet. Wanneer de gel geladen is, wordt de elektoforesecel verbonden worden met het elektroforese-apparaat. Het voltage wordt ingesteld op 180 V. De cel wordt onder spanning gehouden totdat de tracking dye de onderkant van de gel heeft bereikt. Na de elektroforese wordt de gel tussen de glasplaten uit de houder verwijderd. Vervolgens kan de gel van tussen de plaatjes verwijderd worden en overgebracht in de gewenste oplossing voor verdere behandeling. De methoden voor kleuren van de gel worden uitgelegd in hoofdstuk 2.4 en 2.5.
44
2.3.2 IEF De pI’s van de meest voorkomende plasma-eiwitten liggen tussen pH 5,4 en pH 9 (tabel 1). Op basis hiervan werd er gekozen voor gels met pH 3 tot 9 en pH 5 tot 8 (PhastGel, GE lifesciences). De geprogrammeerde methode op het toestel die hiermee overeenstemt is methode 1. Apparatuur
IEF-toestel “Phastsystem Separation and control unit” (Pharmacia) (figuur18)
Figuur 18: “Phastsystem Separation and control unit” (Pharmacia); toestel voor uitvoering van IEF
Staal applicator (figuur19)
Figuur 19: Phastgel Staal applicator (GE lifesciences) voor laden van de stalen
“Sample well stamp”: plaatje met relief om stalen op aan te brengen voordat deze op de staalapplicator worden aangebracht (figuur 20).
Parafilm
Standaarden en oplossingen
Broad Range pl 4.45-9.6 (BIO-RAD) De standaarden aanwezig in dit standaardmengsel zijn opgesomd in onderstaande tabel, met vermelding van de pI-waarden.
Tabel 9: Standaarden aanwezig in Broad Range pl 4.45-9.6 (BIO-RAD), met vermelding van de pI-waarden
Standaard
Kleur
pI
Fycocyanine (3 banden)
Blauw
4,45 4,65 4,75
β-Lactoglobuline B
5,1 45
Koolzuuranhydrase (rund)
6,0
Koolzuuranhydrase (humaan)
6,5
Equinemyoglobine (2 banden)
Bruin
6,8 7,0
Humaan hemoglobine A
Rood
7,1
Humaan hemoglobine C
Rood
7,5
Lentil lectine (3 banden)
7,8 8,0 8,2
Cytochroom C
Rood
9,6
Methode De methode bestaat uit 3 stappen: (1) prefocussering; (2) aanbrengen van de stalen; (3) IEF. Alvorens de precast IEF-gel aan te brengen dient het oppervlak gereinigd te worden, dit kan met ethanol 70 %. Na een druppel H2O aan te brengen op dit oppervlak kan hierop de precast IEF-gel gelegd worden op de hiervoor voorziene plaats. Vervolgens kan de methode (voor een gel met pH 3-9 is dit methode 1) gestart worden. Tijdens de prefocusering stap kunnen de stalen voorbereid worden om te laden. Dit gebeurt door parafilm aan te drukken op het voorziene plaatje waarop de spots voor de stalen zijn aangebracht in reliëf. Dit reliëf wordt overgenomen door de parafilm en kan vervolgens gebruikt worden om telkens 3 µl staal op aan te brengen. De parafilm wordt telkens ververst waardoor contaminatie vermeden wordt.
Figuur 20: Overbrengen van stalen van de “sample well stamp” naar de staal applicator.
Door capillaire krachten zal er hiervan per staal 1 µl als het ware opgezogen worden door het applicatiekammetje. Dit kammetje kan vervolgens geplaatst worden aan de anode, kathode of in het midden. Er werd gekozen om de stalen in het midden van de gel te laden. Voor het plaatsen van het kammetje dient de methode op pauze gezet te worden. 2 Vh voor de applicatie van de stalen gaat er een alarm af ter waarschuwing. De condities van de verschillende stappen voor de gebruikte methode zijn weergegeven in onderstaande tabel (Amersham Biosciences).
46
Tabel 10: Condities van de verschillende stappen tijdens de IEF. Stap 1= prefocusering; stap 2= laden v.d. stalen; stap 3= IEF
Stap 1
2000 V
2,5 mA
3,5 W
15 °C
75 Vh
Stap 2
200 V
2,5 mA
3,5 W
15 °C
15 Vh
Stap 3
2000 V
2,5 mA
3,5 W
15 °C
410 Vh
De geprepareerde PhastGel IEF-gels (GE lifesciences) zijn homogene (5 % T, 3 % C) polyacrylamide gels en bevatten 2-6 % farmalyt als amfolyt. Dit zorgt voor een stabiele en lineaire pH-gradiënt met uniforme geleidbaarheid over de volledige pH-range, en laat veldsterktes toe hoger dan 500 V/cm voor scheidingen met hoge resolutie (GE lifesciences).
2.3.3 Lectinekolom ConA Er werd gekozen voor ConA in de vorm van een suspensie (Sigma-Aldrich). Het lectine zit hierin ingebed in een matrix van 4 % cross-gelinkte agarose en is opgelost in een oplossing met pH 6,8 bestaande uit 1,0 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 en 0,02 % thimerosal. Uit 1 ml van deze suspensie kan een kolom met een bedvolume van ongeveer 0,5 ml worden bereid. De bindingscapaciteit is afhankelijk van het type eiwit. Zo zou er bijvoorbeeld 10 mg peroxidase kunnen binden met 1 ml kolom. Hier dient rekening mee gehouden te worden voor de bepaling van de mate waarin het eiwitstaal dient verdund te worden. Apparatuur
Filters
Glazen kolom met filterbed
Oplossingen
Equilibratiebuffer 50 mM azijnzuur, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, NaOH, 1 mM MnCl2 Deze buffer dient op pH 6 gebracht te worden alvorens de MnCl2 wordt toegevoegd.
Elutiebuffer 100 mM azijnzuur, 250 mM methyl-α-D-mannopyranoside (M6882, Sigma-Aldrich, NaOH Deze buffer dient op pH 4 gebracht te worden.
Beide buffers dienen voor gebruik gefilterd te worden (0,22 µm). De keuze van de equilibratie- en elutiebuffer werd gebaseerd op een artikel (Soper & Aird, 2007).
Regeneratiebuffer pH 4,5 500 mM NaCl, 100 mM azijnzuur, NaOH
Regeneratiebuffer pH 8,5 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl
47
De regeneratiebuffers werden gekozen op basis van de handleiding voor Con A SepharoseB van GE Healthcare. Ook deze buffers werden gefilterd (0,22 µm) voor gebruik.
2.3.3.1
Bereiding kolom
Voorbereiding van het kolommedium De suspensie dient eerst gewassen te worden met 10 bedvolumes equilibratiebuffer, wat dus overeenkomt met 20 keer het volume aan suspensie. Dit gebeurt door, na samenvoeging van de suspensie en buffer, dit geheel te mengen en vervolgens gedurende 5 min. te centrifugeren bij 4000 g. Vervolgens wordt het supernatans verwijderd en wordt opnieuw buffer toegevoegd zodat er een verhouding ontstaat van 75 % medium en 25 % buffer. Pakken van de kolom Alvorens hiermee gestart wordt, dient al het benodigde materiaal op de temperatuur gebracht te worden waarbij de chromatografie zal plaatsvinden. Het eerder bereide kolommedium dient ontlucht te worden. Ook de luchtbellen in de dode ruimten van de kolom dienen verwijderd te worden door deze te vullen met equilibratiebuffer. Hierna kan de slurry overgebracht worden in de kolom. Dit dient te gebeuren in een vloeiende beweging. Om vorming van luchtbellen te voorkomen wordt aangeraden de slurry te gieten langs een glazen staaf die tegen de wand van de kolom wordt gehouden. Vervolgens dient er equilibratiebuffer meteen aangebracht te worden op de kolom. Hierna is de kolom klaar voor gebruik.
2.3.3.2
Gebruik
Voor gebruik worden alle oplossingen op kamertemperatuur gebracht. Vervolgens wordt voor een scheiding van de eiwitten volgende stappen doorlopen: Equilibratie Het equilibreren van de kolom gebeurt mbv een kolomvolume equilibratiebuffer. Wanneer de kolom bewaard werd in 20 % ethanol, dient dit eerst uit de kolom verwijderd te worden door er 2 à 3 kolomvolomes equilibratiebuffer te laten doorlopen. Laden eiwitstaal Het staal wordt verdund in de mate zodat het volume dat geladen wordt een hoeveelheid eiwit bevat waarvan de geglycosyleerde fractie tegengehouden kan worden door de kolom. Wassen Het wassen van de kolom gebeurt mbv equilibratiebuffer. De niet-gebonden fractie zal samen met deze buffer door de kolom lopen. Elutie De elutiebuffer zorgt ervoor dat de gebonden eiwitten worden losgelaten door de kolom. 48
Alle fracties worden opgevangen in eppendorfs in kleine volumes waarvan de absorbantie vervolgens wordt gemeten bij een golflengte van 280 nm voor het opmaken van het chromatogram.
2.3.3.3
Bewaring
Indien de kolom later hergebruikt zal worden, dient deze eerst geregenereerd te worden door afwisselend 2 à 3 kolomvolumes van de regeneratiebuffers met pH 8,5 en pH 4,5 te laten doorlopen, dit dient drie maal te gebeuren, gevolgd door re-equilibratie met equilibratiebuffer. De kolom wordt bewaard bij een temperatuur van 4 °C in equilibratiebuffer, eventueel met 20 % ethanol.
2.4
Detectie glycoproteïnen
2.4.1 Colorimetrische kleuring: PAS-methode Er werd gebruik gemaakt van de Pierce gylcoprotein staining kit van Lifetechnologies (zie bijlage).
2.4.1.1
Reagentia
50 % methanol
3 % azijnzuur
Oxidatiereagent
Kleurreagent
Reductiereagent
Ultrapuur water
2.4.1.2
Apparatuur
Schudtoestel
2.4.1.3
Protocol
Volgende stappen dienen onder de trekkast uitgevoerd te worden en er dient gebruik gemaakt te worden van een schudtoestel. 1. Fixatie De gel wordt gefixeerd door deze gedurende 30 min. onder te dompelen in 100 ml 50 % methanol. 2. Wassen De gel wordt gewassen door deze over te brengen in 100 ml 3 % azijnzuur gedurende 10 min. Deze stap wordt één maal herhaald. De gel kan na deze stap eventueel overnacht bewaard worden bij 4 °C. 49
3. Oxidatie van de koolhydraten De gel wordt overgebracht in 25 ml oxiderende oplossing voor 15 min. 4. Wassen De gel wordt drie maal gewassen in 100 ml 3 % azijnzuur, telkens gedurende 5 min. 5. Kleuren De gel wordt overgebracht in 25 ml kleuroplossing voor 15 min. Opm.: Wanneer er kristallen aanwezig zijn in de kleuroplossing, dienen deze door centrifugatie verwijderd te worden. Enkel het supernatant mag dus gebruikt worden, de kristallen dienen verwijderd te zijn. De oplossing mag niet verwarmd worden om de kristallen te heroplossen. 6. Reductie De gel wordt overgebracht in 25 ml reducerende oplossing voor 15 min. 7. Wassen De gel wordt grondig gewassen met 3 % azijnzuur en vervolgens met ultrapuur water. Glycoproteïnen zullen verschijnen als magentakleurige bandjes. De gel kan bewaard worden in 3 % azijnzuur. Onderstaande figuur vat dit protocol schematisch samen.
1. Fixeer de gel in 50%
2. Was de gel in 3% azijn-
3. Voeg oxiderende oplossing
4. Was de gel in 3%
methanol (30 min.)
zuur (2 x 10 min.)
toe (15 min.)
azijnzuur (3 x 5 min.)
5. Voeg kleuroplossing toe
6. Voeg reducerende oplossing
7. Was de gel in 3% azijnzuur en
(15 min.)
toe (5 min.)
vervolgens met ultrapuur H2O
Figuur 21: Samenvatting protocol PAS-kleuring (Lifetechnologies, bewerkt)
2.4.2 Fluorescente kleuring: Pro-Q Emerald 300 Dit protocol is eveneens terug te vinden in bijlage.
50
2.4.2.1
Reagentia
Fixatie-oplossing (50 % methanol en 5 % azijnzuur in dH2O)
Wasoplossing (3 % ijsazijn in dH2O)
Oxiderende oplossing (2,5 g perjoodzuur opgelost in 250 ml 3 % azijnzuur)
Kleuroplossing
2.4.2.2
Apparatuur
Schudtoestel
GelDoc toestel BIO-RAD
2.4.2.3
Protocol
Volgende stappen dienen onder de trekkast uitgevoerd te worden en er dient gebruik gemaakt te worden van een schudtoestel. 1. Fixatie De gel wordt gefixeerd door deze twee maal gedurende 30 min. onder te dompelen in 100 ml fixatie-oplossing. Deze stap kan eventueel ook overnacht gebeuren. 2. Wassen De gel wordt twee maal gewassen in 100 ml wasoplossing gedurende 10 à 20 min. 3. Oxidatie van de koolhydraten De gel wordt overgebracht in 25 ml oxiderende oplossing gedurende 30 min. 4. Wassen De gel wordt gewassen door deze onder te dompelen in 100 ml wasoplossing gedurende 5 min. Deze stap dient twee maal herhaald te worden. 5. Kleuren De gel wordt overgebracht in 25 ml kleuroplossing gedurende 90 min. in het donker. De kleuring is na 30 min. reeds detecteerbaar, na 120 min. is het signaal is maximaal. 6. Wassen De gel wordt gewassen door deze twee maal onder te dompelen in 100 ml wasoplossing gedurende telkens 15 min. Wanneer bij de visualisatie de achtergrondkleuring nog te hoog blijkt, kan de gel een extra maal gewassen worden.
Voor visualisatie van het bandenpatroon van de geglycosyleerde eiwitten dient gebruik te worden gemaakt van een 300 nm UV transiluminator (figuur 22).
51
Figuur 22: UV transiluminator met verschillende filters (BIO-RAD); toestel waarmee fluorescente kleuringen op SDS-PAGE gels kunnen gevisualiseerd worden en vervolgens verwerkt met de bijhorende software; Imagelab.
2.5
Detectie proteïnen
2.5.1 Colorimetrische kleuring: Coomassie Briljant Blauw Deze kleuring is zowel bruikbaar na SDS-PAGE als na IEF.
2.5.1.1
Reagentia
SDS-PAGE
dH2O
Kleuroplossing (3 g CBB R250 in wasoplossing, gefilterd voor gebruik)
Wasoplossing (45 % methanol, 10 % azijnzuur, 45 % dH2O)
Fixatieoplossing (20 % TCA)
Wasoplossing (3/1/6 methanol/azijnzuur/dH2O)
Kleuroplossing: 0,02 % CBB R , 0,1 % CuSO4 in wasoplossing
IEF
(voor 100 ml: 10 ml gefilterde stockoplossing*, 90 ml wasoplossing, 100 mg CuSO4) *Bereiding stockoplossing: 1 tablet (PhastGel Blue R, Sigma-Aldrich) oplossen in 80 ml dH2O door 15 min. te schudden, vervolgens 120 ml methanol toevoegen en opnieuw 2 à 3 min. schudden
2.5.1.2
Apparatuur
Schudtoestel
Plastic bakje voor reagentia te laten inwerken op de gel 52
2.5.1.3
Protocol
SDS-PAGE Voor volgende stappen dient gebruik gemaakt te worden van een schudtoestel. 1. Reinigen De gel wordt gereinigd in dH2O om overgebleven SDS te verwijderen aangezien dit interfereert met de kleuring. 2. Fixatie + kleuren De gel wordt overgebracht in 100 ml kleuroplossing gedurende 60 min. 3. Wassen De gel wordt gewassen door deze twee maal gedurende 30 min. onder te dompelen in 100 ml wasoplossing. Deze stap wordt herhaald totdat de overmaat niet gebonden kleurstof uit de gelmatrix is weggewassen en er dus geen achtergrondkleur meer zichtbaar is. IEF Voor volgende stappen dient gebruik gemaakt te worden van een schudtoestel. 1. Fixatie De gel wordt gefixeerd door deze gedurende 5 min. onder te dompelen in fixatieoplossing. 2. Wassen De gel wordt gewassen door deze gedurende 2 min. onder te dompelen in wasoplossing. 3. Kleuren De gel wordt overgebracht in kleuroplossing voor 10 min. bij een temperatuur van 50 °C. 4. Ontkleuren De gel wordt ontkleurd door deze 10 min. onder te dompelen in wasoplossing bij een temperatuur van 50 °C. Deze stap wordt herhaald totdat de overmaat niet gebonden kleurstof uit de gelmatrix is weggewassen en er dus geen achtergrondkleur meer zichtbaar is.
2.5.2 Fluorescente kleuring: Sypro Ruby Dit protocol is eveneens terug te vinden in bijlage.
2.5.2.1
Reagentia
Fixatieoplossing (50 % methanol en 7 % azijnzuur in dH2O)
Wasoplossing (10 % methanol en 7 % azijnzuur in dH2O)
Kleuroplossing
Ultrapuur water
2.5.2.2
Apparatuur
Schudtoestel 53
Plastic bakje voor reagentia te laten inwerken op de gel
GelDoc toestel BIO-RAD
2.5.2.3
Protocol
Volgende stappen dienen onder de trekkast uitgevoerd te worden en er dient gebruik gemaakt te worden van een schudtoestel. 1. Fixatie De gel wordt gefixeerd door deze twee maal gedurende 30 min. onder te dompelen in 100 ml fixatie-oplossing. 2. Kleuren De gel wordt overgebracht in 60 ml kleuroplossing overnacht. 3. Wassen De gel wordt gewassen door deze gedurende 30 min. onder te dompelen in 100 ml wasoplossing. 4. Reinigen Voor visualisatie dient de gel minstens twee maal gedurende 5 min. gereinigd te worden in ultrapuur water om zo schade aan de transiluminator te vermijden. Voor visualisatie van het bandenpatroon van de geglycosyleerde eiwitten wordt gebruik gemaakt van een 300 nm UV transiluminator (figuur 7).
54
3. Resultaten en discussie De eerder besproken methoden voor scheiding en detectie van glycoproteïnen werden aangewend om enerzijds de stalen te onderzoeken op gebied van eiwitconcentratie en –samenstelling, waarna er een vergelijking kon gemaakt worden tussen de verschillende stalen. Eerst werden de eiwitgehaltes van de verschillende stalen bepaald met de Biorad DC analyse, dit was noodzakelijk om de mate van verdunning te bepalen om deze stalen later op de SDS-PAGE en IEF-gels te laden. Met deze technieken konden de eiwitprofielen geanalyseerd en vergeleken worden. Vervolgens werd ook getracht de glycoproteïnen te detecteren op de SDS-PAGE en IEF gels aan de hand van zowel colorimetrische als fluorescente kleuringen. Tenslotte werd er gebruik gemaakt van een lectinekolom bestaande uit geïmmobiliseerd ConA met de bedoeling om op deze manier de meeste glycoproteïnen te scheiden van de andere proteïnen. Door meting van de absorbanties van de opgevangen fracties werd er een chromatogram opgesteld. Vervolgens konden de eiwitsamenstellingen van de fracties gecontroleerd worden door deze te analyseren m. b. v. SDS-PAGE.
3.1
Bepaling eiwitgehalte
Het eiwitgehalte van de stalen werd bepaald met de Biorad DC kit gebaseerd op de methode van Lowry (beschreven in hoofdstuk 2.2.1). De waarden van absorbantie met de overeenkomstige eiwitconcentraties berekend aan de hand van de standaardcurve zijn weergegeven in onderstaande tabellen. De absorbanties die niet binnen het gebied van de standaardcurve lagen, werden weggelaten.
3.1.1 Varkensplasma – stalen Veos Plasma
Mate van verdunning 100 x 50 x 25 x
ABS(1)
ABS(2)
ABS(3)
0,235 0,357 0,570
0,221 0,371 0,599
0,223 0,364 0,635
ABS(1)
ABS(2)
ABS(3)
0,173 0,257 0,327
0,184 0,260 0,325
0,177 0,295 0,347
Gem. ABS 0,226 0,364 0,601
Concentratie verdunning (mg/ml) 0,643 1,32 2,48
Concentratie staal (mg/ml) 64,3 65,9 62,1 64,1
Gem. ABS 0,178 0,271 0,333
Concentratie verdunning (mg/ml) 0,405 0,860 1,17
Concentratie staal (mg/ml) 2023 215 233 217
Concentraat
Mate van verdunning 500 x 250 x 200 x Poeder
De bekomen eiwitgehalten van het plasmapoeder variëren tussen de 700 en 850 mg/ml. Vanwege de grote variatie tussen de resultaten, kunnen deze niet betrouwbaar geacht worden. 55
Op basis van deze metingen kan dus besloten worden dat de gemiddelde concentratie aan totaal eiwit voor varkensplasma 64 mg/ml (6,4 % w/v) bedraagt en voor varkensconcentraat 217 mg/ml (21,7 % w/v). Voor het eiwitgehalte van het varkensplasmapoeder wordt verondersteld dat dit 69 % w/v bedraagt zoals vermeld staat in de productbeschrijving van de producent Veos (tabel 3). Uit deze resultaten blijkt dat de concentratiefactor van plasma naar concentraat 3,39 bedraagt, dit concentraat werd vervolgens nog 3,18 maal geconcentreerd tot poeder. De totale concentratiefactor van plasma naar poeder bedraagt dus 10,78.
3.1.2 Plasmastalen Sigma-Aldrich Rund
Mate van verdunning 100 x 50 x
ABS(1)
ABS(2)
ABS(3)
0,238 0,447
0,297 0,483
0,262 0,391
ABS(1)
ABS(2)
ABS(3)
0,127 0,169
0,111 0,155
0,104 0,177
ABS(1)
ABS(2)
ABS(3)
0,162 0,252 0,343
0,140 0,263 0,402
0,175 0,268 0,453
ABS(1)
ABS(2)
ABS(3)
0,124 0,150
0,115 0,171
0,125 0,167
Gem. ABS 0,266 0,440
Concentratie verdunning (mg/ml) 1,18 2,23
Concentratie staal (mg/ml) 118 112 115
Gem. ABS 0,114 0,167
Concentratie verdunning (mg/ml) 0,266 0,585
Concentratie staal (mg/ml) 53,1 58,5 55,8
Gem. ABS 0,159 0,261 0,399
Concentratie verdunning (mg/ml) 0,537 1,15 1,99
Concentratie staal (mg/ml) 107 115 99,3 107
Gem. ABS 0,121 0,163
Concentratie verdunning (mg/ml) 0,310 0,559
Concentratie staal (mg/ml) 31,0 28,0 29,5
Humaan
Mate van verdunning 200 x 100 x Varken
Mate van verdunning 200 x 100 x 50 x Kip
Mate van verdunning 100 x 50 x
Op basis van deze metingen kan dus besloten worden dat de gemiddelde concentratie aan totaal eiwit voor plasma van rund, mens, varken en kip respectievelijk 115 mg/ml (11,5 % w/v), 56 mg/ml (5,6 % w/v), 107 mg/ml (10,7 % w/v) en 30 mg/ml (3,0 % w/v) bedraagt.
56
Wanneer het varkensplasma van Veos wordt vergeleken met dit van Sigma-Aldrich, blijkt dat de eiwitconcentratie in het staal van Sigma-Aldrich beduidend hoger ligt (107 mg/ml) dan in het staal afkomstig van Veos (64,1 mg/ml).
3.2
Vergelijking eiwitprofielen
3.2.1 SDS-PAGE met coomassiekleuring De plasmastalen (zowel van Veos als van Sigma-Aldrich) werden samen met standaarden geladen op een SDS-PAGE gel en deze werd achteraf gekleurd met CBB. De posities en eiwitconcentraties van de stalen en standaarden die op de gel werden geladen zijn weergegeven in onderstaande tabel. Deze analyse laat toe de eiwitsamenstelling onderling te vergelijken. De stalen werden zodanig verdund dat de eiwitconcentratie telkens 1 mg/ml bedroeg. Zo kunnen de bekomen bandenpatronen vervolgens beter vergeleken worden. Tabel 11: Volgorde van stalen en standaarden geladen op gel voor SDS-PAGE
Staal of standaard
Afkomst
Concentratie eiwit geladen
1
Precision Plus Protein standaard
BIO-RAD
(onverdund)
2
Plasma
Veos
1 mg/ml
3
Concentraat
Veos
1 mg/ml
4
Poeder
Veos
1 mg/ml
5
BSA-standaard
Sigma-Aldrich
0,5 mg/ml
6
Plasma rund
Sigma-Aldrich
1 mg/ml
7
Plasma varken
Sigma-Aldrich
1 mg/ml
8
Plasma mens
Sigma-Aldrich
1 mg/ml
9
Plasma kip
Sigma-Aldrich
1 mg/ml
10
HMW-ladder
BIO-RAD
(onverdund)
Het resultaat van de SDS-PAGE, na kleuring met CBB is weergegeven in figuur 23.
57
1
2
3
4
5
6
7
250 kDa
8
9
10
200,0 kDa
150 kDa 116,25 kDa 97,4 kDa
100 kDa 75 kDa
66,2 kDa 50 kDa 45,0 kDa 37 kDa Figuur 23: SDS-PAGE gel gekleurd met CBB; bovenaan de figuur zijn de laantjes genummerd overeenkomend met tabel 11; links en rechts van de gel zijn de moleculaire gewichten aangeduid van de geladen standaarden in laantje 1 en 10.
Algemeen Ter hoogte van 66 kDa is er bij elk staal en ook bij de BSA-standaard een dikke band te zien (baantje 2 tot 9). Dit bandje bevat hoogstwaarschijnlijk het serum albumine, het voornaamste eiwit aanwezig in bloedplasma. Bovendien werd op laantje nummer 5 BSA-standaard geladen, het serum albumine afkomstig van rund en dit bevindt zich op dezelfde hoogte. Vergelijking BSA-standaard (laan 5) en plasma rund (laan 6) Opmerkelijk hierbij is dat op laantje 5 er bovenaan de gel ook lichte bandjes zichtbaar zijn, wat er op wijst dat het niet om 100 % zuiver BSA gaat. Deze bandjes zijn nochtans niet zichtbaar op laantje 6 waar het rundsplasma werd geladen. Dit doet vermoeden dat deze eiwitten niet afkomstig zijn van rundsplasma, maar een andere oorsprong hebben. Mogelijks zijn dit additieven die werden toegevoegd om bijvoorbeeld de houdbaarheid en stabiliteit van het zuivere eiwit te doen toenemen. Vergelijking stalen Veos (laan 2, 3 en 4) De bandjes op laan 2, 3 en 4 komen sterk overeen, wat logisch is aangezien het hier om verdund varkensplasma, concentraat en poeder van dezelfde afkomstgaat. Het is mogelijk dat er gedurende de processing enkele eiwitten deels verloren zouden zijn gegaan, maar indien dat het geval zou zijn is dit niet in de mate waarin dit zichtbaar is op deze gel. Vergelijking stalen Sigma-Aldrich (laan 6, 7, 8 en 9) Deze bandenpatronen zijn duidelijk verschillend. Dit was ook te verwachten aangezien het hier om plasma gaat van 4 verschillende diersoorten. Laan 9 is het meest afwijkend, dit kan verklaard worden door het feit at het hier om kippenplasma gaat, m.a.w. plasma afkomstig van gevogelte, terwijl de overige stalen allen afkomstig zijn van zoogdieren, welke dus meer gerelateerd zijn aan elkaar. Het varkensplasma in laantje 7 is het meest gelijkend met de stalen van Veos, die ook afkomstig zijn van varken. 58
Troubleshooting Op de gel zijn enkele gebreken zichtbaar, welke het resultaat negatief beïnvloeden:
Ongelijke breedte van de bandjes en schuine en gebroken bandenpatronen
Dit is te wijten aan een niet uniforme vorm van de slotjes, door luchtbellen of ontstane ongelijkheden bij het verwijderen van het kammetje net voor het laden van de stelen voor de gelelektroforese.
Lichtgekleurde bandjes bij de Precision Plus Protein Standaard (laan 1)
De bovenste 3 laantjes zijn hier veel zwakker dan de onderste 3, dit is vermoedelijk te wijten aan de CBB-kleuring die niet even sterk bindt aan elk eiwit. Aangezien dit zo is bij deze standaard, zal dit ook het geval zijn bij de stalen, waardoor de resultaten een vertekend beeld kunnen geven.
Spots tussen laantjes (tussen laan 4 en 5; 5 en 6; 7 en 8; 8 en 9)
Dit fenomeen is het gevolg van het niet precies mikken van de pipet bij het laden van de stalen, waardoor er een deel naast het slotje terecht komt. Dit komt sneller voor wanneer de slotjes niet lang genoeg zijn, of er tussenschotten afgebroken werden bij het verwijderen van de kam. Ijklijn Met behulp van de moleculaire ladders (Precision Plus Protein Standard, laan 1 en HMW-standaard, laan 10) kon er een ijklijn worden opgesteld. Deze ijklijn is weergegeven in onderstaande figuur. 3,00
y = -0,0967x + 2,4713 R² = 0,9748
Afstand (cm)
2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 0
2
4
6
8
10
12
Log (MM)
Figuur 24: Iklijn SDS-PAGE gel aan de hand van moleculaire ladders waarbij het verband is weergegeven tussen de afgelegde afstand van de gescheiden eiwitten en de log van hun moleculaire gewichten, met 2 vermelding van de bekomen vergelijking en de waarde van R .
Aan de hand van de bekomen vergelijking van deze standaardcurve, kunnen de moleculaire gewichten geschat worden van de ongekende eiwitbanden van de stalen. Door omvorming van de reactievergelijking kan het moleculair gewicht als volgt geschat worden:
59
x = (y – 2,4713)/(-0,0967)
met x = log(MM) en y = afstand (cm)
Wanneer dit toegepast wordt op laantje 4 van de gel, worden volgende waarden bekomen:
2,4 cm
x = (2,4 – 2,4713)/(-0,0967) = 2,24
MM = 173,5 kDa
5,7 cm
x = (5,7 – 2,4713)/(-0,0967) = 1,92
MM = 83,2 kDa
6,7 cm
x = (6,7 – 2,4713)/(-0,0967) = 1,82
MM = 66,6 kDa
7,9 cm
x = (7,9 – 2,4713)/(-0,0967) = 1,71
MM = 51,0 kDa
Figuur 25: Bandenpatroon plasmapoeder Veos bekomen met SDS-PAGE, 1 mg/ml geladen en gekleurd met CBB
Bij het vergelijken van deze bekomen waarden met de gegevens van de gekende plasmaproteïnen (tabel 1), kan enkel het derde bandje met enige zekerheid benoemd worden met serum albumine, het meest voorkomende plasma-eiwit met een moleculair gewicht van 66,8 kDa. De overige bandjes komen niet overeen met een eiwit uit tabel 1. Een mogelijke reden hiervoor is dat vele eiwitten niet exact volgens hun MM migreren. Posttranslationele modificaties zoals glycosylaties, onvolledige denaturatie, … kunnen leiden tot beperkte afwijkingen op het verwachte migratiepatroon, wat identificatie bemoeilijkt. Trypsinatie van uit gel geëlueerde eiwitten, gevolgd door MS/MS analyse kan toegepast worden voor identificatie door vergelijking met gekende eiwitsequenties in databanken.
3.2.2 SDS-PAGE met SYPRO-Ruby kleuring De eiwitprofielen van plasma, concentraat en poeder afkomstig van varkensbloed (Veos), werden telkens in twee verschillende verdunningen geanalyseerd aan de hand van een SDS-PAGE gel waarbij de eiwitbanden gekleurd werden met de fluorescente SYPRO Ruby kleuring. In tabel 12 staat de volgorde weergegeven van de geladen stalen en standaarden, met vermelding van de verdunning.
60
Tabel 12: Volgorde van stalen en standaarden geladen op gel voor SDS-PAGE met vermelding van de verdunning; vb : 100 staat voor 100 keer verdund.
Verdunningsfactor
Eindconcentratie
1
Mierikswortel peroxidase
/
0,5 mg/ml
2
STI proteïne
/
1 mg/ml
3
Candycane ladder
/
/
4
Plasma
200
0,32 mg/ml
5
Plasma
100
0,64 mg/ml
6
Concentraat
400
0,54 mg/ml
7
Concentraat
200
1,08 mg/ml
8
Poeder
2000
0,35 mg/ml
9
Poeder
1000
0,69 mg/ml
10
LMW-ladder
/
/
Het resultaat van de gel is weergegeven in figuur 26. Op deze figuur werden de gekende moleculaire gewichten van de Candycane ladder (3
de
laantje) en de LMW-ladder (10
de
laantje) aangeduid
respectievelijk links en rechts naast de figuur (Figuur 26).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
97,0 kDa
97,4 kDa
82,0 kDa
66,2 kDa
66,0 kDa 45,0 kDa
42,0 kDa
31,0 kDa
29,0 kDa Figuur 26: Resultaat SYPRO-Ruby kleuring op SDS-PAGE gel met diverse stalen en standaarden (tabel 12)
Bij de bandenpatronen van de stalen valt ook hier op dat deze sterk op elkaar gelijken. De variatie tussen plasma, concentraat en poeder
kan als verwaarloosbaar beschouwd worden, enkel het
verschil in concentraties is zichtbaar. Vergelijking met SDS-PAGE gekleurd met CBB Bij vergelijking van figuren 23 en 26 vallen er meerdere verschillen op, deze worden geïllustreerd door de bandenpatronen van het plasmapoeder (Veos) naast elkaar te leggen (figuur 27).
61
Als referentiepunt wordt de sterkste band genomen, het serum albumine. Deze band ligt bij de eerste gel verder, dit is te wijten aan het feit dat de gelelektroforese hier langer werd gelopen en de eiwitten dus verder konden migreren. Bovendien is het bandenpatroon gekleurd met CBB wat verder uit elkaar gerokken, wat ook kan verklaard worden door een verschillende elektroforeseduur of andere elektroforesecondities. Het hiernaast afgebeelde laantje van de met SYPRO-Ruby gekleurde gel, werd geladen met 1000 x verdund plasmapoeder, wat overeenkomt met een eiwitconcentratie van 0,69 mg/ml. Bovendien is het patroon van 2000 x verdund plasmapoeder (0,35 mg/ml) ook nog zeer duidelijk bij de SYPRO Ruby-kleuring. Dit wijst erop dat de fluorescente kleuring een hogere detectie geeft dan de kleuring met CBB, waar een concentratie van 1 mg/ml werd geladen. Er is ook een duidelijk verschil in bandenpatroon merkbaar. Zo zijn er op het laantje bij de SYPRO Ruby-kleuring meer eiwitbandjes gekleurd, terwijl er bij CBB slechts enkele banden zichtbaar zijn, maar deze in verhouding wel sterker gekleurd zijn in vergelijking met de analoge banden bij de SYPRO Ruby-kleuring. Figuur 27: Vergelijking bandenpatroon plasmapoeder Veos op twee verschillende gels na SDS-PAGE; links 1 mg/ml geladen en gekleurd met CBB; rechts 1000 x verdund en gekleurd met SYPRO-Ruby
3.2.3 IEF Er werd, naast vergelijking van de eiwitprofielen op basis van verschil in moleculair gewicht, ook een vergelijking gemaakt tussen de eiwitprofielen van de stalen op basis van het verschil in pI-waarde. Dit laatste gebeurde door de eiwitten te scheiden m.b.v. IEF. Eerste IEF; pH 3-9 De eerste gel die gebruikt werd bezit een lineaire pH-gradiënt van pH 3 tot 9. De stalen werden geladen in het midden van de gel. De volgorde van de stalen en standaarden en hun geladen concentratie zijn weergegeven in tabel 8. Tabel 13: Volgorde van de stalen en standaarden IEF-gel met vermelding van de concentratie. Er werd telkens ongeveer 1 µl op de IEF-gel geladen.
Laantje
Staal
Concentratie
1
IEF standaarden “Broad Range”
/
pI 4,45-9,6 (BIO-RAD) 2
Varkensplasma Veos
25 mg/ml
3
Varkensplasma Sigma-Aldrich
25 mg/ml
4
BSA
10 mg/ml
5
Rundsplasma Sigma-Aldrich
25 mg/ml
6
Humaan plasma Sigma-Aldrich
25 mg/ml
7
Kippenplasma Sigma-Aldrich
25 mg/ml
62
IEF standaarden “Broad Range”
8
/
pI 4,45-9,6 (BIO-RAD)
Deze gel werd gekleurd met coomassie briljant blauw R-250 (figuur 28, links). Er werd ook een tweede IEF-gel gelopen met analoge positie van stalen en standaarden, deze gel werd eerst gekleurd met PAS-kleuring, wat geen zichtbaar resultaat gaf. Vervolgens werd deze gel ook gekleurd met coomassie briljant blauw R-250 (figuur 28, rechts). Op deze gel is de roze schijn, afkomstig van de PAS-kleuring nog zichtbaar. Bij de vergelijking van beide gels kan opnieuw opgemerkt worden dat de bandenpatronen over het algemeen zeer analoog zijn, zoals verwacht werd. De banden bij de eerste gel (figuur 26, links) zijn wel duidelijker te onderscheiden van de achtergrond. Voor de analyse van de scheiding m.b.v. IEF zal er dus gekeken worden naar de eerste gel (figuur 29). De bandjes van de stalen zijn over het algemeen niet sterk afgelijnd, wat wel het geval is bij de standaarden, maar vormen eerder een smeer. Dit is mogelijks te wijten aan het feit dat er veel eiwitten een pI hebben dat dicht bij elkaar ligt. Bovendien vormt het BSA (laan 4) ook een brede smeer, ook al gaat dit om een nagenoeg puur eiwit. Dit kan onder andere te wijten zijn aan een verschillende graad van post-translationele modificaties.
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
4
5
6
7
8
Figuur 28: IEF-gels met pH 3-9, beiden gekleurd met CBB R-250. De rechtergel werd vooraf gekleurd met PAS-kleuring. De volgorde en concentraties van stalen en standaarden zijn weer te vinden in tabel 13
63
1
2
3
4
5
6
7
8
3,0 3,5
Fycocyanine (4,45; 4,65; 4,75)
4,0 4,5
β-lactoglobuline B (5,1)
5,0 Koolzuuranhydrase rund (6,0)
5,5
Koolzuuranhydrase mens (6,5)
6,0 6,5
Equinemyoglobine (6,8; 7,0) Humaan hemoglobine A (7,1) Humaan hemoglobine C (7,5)
7,0 7,5 8,0
Lentil lectine (7,8; 8,0; 8,2)
8,5 Cytochroom C (9,6)
9,0
Figuur 29: Resultaat IEF met pH-gradiënt van pH 3 tot 9, gekleurd met CBB R-250, met links van de figuur aanduiding van de pH-gradiënt en rechts de aanduiding van de standaarden met vermelding van de bijhorende pI-waarden. De volgorde en concentratie van de geladen stalen en standaarden is weergegeven in tabel 13.
Wanneer er gekeken wordt naar het bandenpatroon van de standaarden (laan 1 en 8), blijkt hieruit dat de pH-gradient niet lineair van 3 tot 9 loopt zoals verwacht en aangeduid staat links van figuur 27. Dit kan te wijten zijn aan het zogenoemde plateau fenomeen (Finlayson & Chrambach, 1971) of aan een kathodische drift (Righetti & Drysdale, 1971), twee fenomenen met beide een andere pH-gradiënt dan verwacht als gevolg. De geladen standaarden konden dus ook niet met zekerheid worden benoemd, de vermoedelijke toekenning van de gekende eiwitten is aangegeven rechts van de figuur. Het is bijgevolg dus ook moeilijk om aan de eiwitbanden van de stalen een betrouwbare pI toe te kennen. Hieruit volgt dat de eiwitten aanwezig in de stalen ook niet kunnen benoemd worden. De stalen (laan 2,3, 5, 6 en 7) vertonen allen een bandenpatroon verspreid over de lengte van de gel, al bezit het kippenplasma (laan 7) minder eiwitten met een lage pI. Bij laantje 2, 3, 5 en 6 is er bovenaan de gel telkens een brede band zichtbaar die vermoedelijk het serum albumine is, aangezien de BSA-standaard (laantje 4) hiermee ongeveer gelijk loopt. Bij het kippenplasma (laan 7) is er een fijnere en duidelijker afgelijnde band zichtbaar, al loopt hier ook wel een smeer naar onderen. In dit laantje is er ook nog een licht, fijn afgelijnd bandje te zien op de hoogte van ongeveer pH 5 wat niet zichtbaar is bij de andere stalen. Deze zaken bewijzen dat het plasmaproteoom van gevogelte toch duidelijk verschillend is dan dit van zoogdieren, en dat dit verschil kan aangetoond worden m.b.v. IEF. 64
Tweede IEF; pH 5-8 Er werd een volgende IEF uitgevoerd met een gel met een lineaire pH-gradiënt van pH 5 tot 8 (tabel 14). Tabel 14: Volgorde van stalen en standaarden geladen op gel voor IEF met vermelding van de verdunning/concentratie
Laantje
Staal
Mate van verdunning/Concentratie
1
Plasma kip (Sigma-Aldrich)
Onverdund
2
Plasma mens (Sigma-Aldrich)
2x verdund
3
Plasma varken (Sigma-Aldrich)
3x verdund
4
Plasma rund (Sigma-Aldrich)
4x verdund
5
BSA-standaard (Sigma-Aldrich)
10 mg/ml
6
IEF standaarden “Broad Range”
/
pI 4,45-9,6 (BIO-RAD)
De stalen (laan 1-4) werden zodanig verdund zodat de eiwitconcentratie ongeveer 25 mg/ml bedraagt. Het resultaat van de IEF is te zien op figuur 30.
β-lactoglobuline B (5,1)
5,0 5,2 5,4 5,6 5,8
Koolzuuranhydrase rund (6,0)
6,0 6,2 6,4
Koolzuuranhydrase mens (6,5)
6,6 6,8 7,0
Humaan hemoglobine A (7,1)
7,2 7,4
Humaan hemoglobine C (7,5)
7,6 7,8
Lentil lectine (7,8; 8,0; 8,2)
8,0
Figuur 30: Resultaat IEF met pH-gradiënt van pH 5 tot 8, gekleurd met CBB R-250, met links van de figuur aanduiding van de pH-gradiënt en rechts de aanduiding van de standaarden met vermelding van de bijhorende pI-waarden. De volgorde en concentratie van de geladen stalen en standaarden is weergegeven in tabel 14.
65
Deze gel is in vergelijking met de vorige (figuur 28) duidelijker dankzij de sterker afgelijnde bandenpatronen. Vooral bovenaan de gel zijn er hier bandjes zichtbaar die op de vorige gel niet konden worden onderscheiden. Dit is te danken aan de kleinere range (pH 5-8 i.p.v. pH 3-9).
Op deze gel is bovendien de pH-gradiënt wel correct. De eiwitten van de ladder die hierdoor met grotere zekerheid benoemd konden worden zijn op figuur 29 aangeduid met een groene lijn. Volgende standaarden werden niet gedetecteerd:
Phycocyanine (4,45; 4,65; 4,75) Dit is te wijten aan het feit dat de pI-waarden van dit eiwitten niet binnen de range liggen van de gebruikte IEF-gel
Cytochroom C (9,6) Ook dit eiwit is niet zichtbaar op de gel omdat de pI buiten de pH-range ligt.
Equine myoglobine (6,8; 7,0) De reden waarom deze bandjes niet zichtbaar zijn is onduidelijk. Vermoedelijk liggen deze tegen de bandjes van het hemoglobine aan of zijn deze te zwak gekleurd waardoor deze niet te onderscheiden zijn van de achtergrond.
Er zijn ook enkele bandjes (aangeduid met rood, figuur 29) zichtbaar in de gebruikte ladder welke hierin normaal gezien niet aanwezig zijn. Deze ladder bevat dus degradatieproducten van de aanwezige standaarden of is gecontamineerd. Uit de bekomen resultaten kan besloten worden dat SDS-PAGE de voorkeur geniet voor analyse van de eiwitprofielen van plasma aangezien deze patronen duidelijker waren dan deze bekomen na IEF.
3.2.3.1
Bepaling
gehalte
glycoproteïnen
m.b.v.
combinatie
van
fluorescente kleuringen: Pro-Q Emerald 300 en SYPRO-Ruby De eerder besproken SDS-PAGE gel, gekleurd met de SYPRO-Ruby kleuring (3.1.2), werd eerder reeds gekleurd met de Pro-Q Emerald 300 kleuring. Deze zorgt voor detectie van de glycoproteïnen door enkel deze specifiek te kleuren. Bij het bekijken van de bandenpatronen van enerzijds de Pro-Q Emerald 300 en anderzijds de SYPRO-Ruby zou vervolgens duidelijk moeten zijn welke eiwitten er geglycosyleerd zijn en welke niet doordat de Pro-Q Emerald 300 kleuring enkel de glycoproteïnen kleurt. Figuur 31 geeft dezelfde gel weer met de twee fluorescente kleuringen.
66
Pro-Q Emerald 300 1
2
3
4
5
6
7
8
SYPRO Ruby 9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Figuur 31: SDS-PAGE gel gekleurd met Pro-Q Emerald 300 (links) en vervolgens met SYPRO Ruby (rechts) Zie tabel 12 voor de volgorde en geladen concentraties van de stalen en standaarden.
Bij vergelijking van de bandenpatronen valt op dat alle bandjes die gedetecteerd worden met de SYPRO-Ruby kleuring, ook gekleurd werden door de Pro-Q Emerald 300. Meer zelfs, de Pro-Q Emerald 300 kleuring detecteert meer banden dan de SYPRO-Ruby, wat wijst op een hogere gevoeligheid. Hieruit kan niet besloten worden dat alle plasmaproteïnen gegelycosyleerd zijn, want ook de niet-geglycosyleerde eiwitten die aanwezig zijn in de standaarden, werden gedetecteerd door de Pro-Q Emerald kleuring. Bij deze detectie is er dus iets fout gelopen waardoor er geen conclusies uit kunnen worden getrokken omtrent het al dan niet geglycosyleerd zijn van bepaalde plasma-eiwitten. De gevoeligheid van de Pro-Q Emerald 300 kleuring heeft ook een negatieve keerzijde, er is namelijk een sterke achtergrondvervuiling zichtbaar. Dit ondanks het feit dat er steeds met poedervrije handschoenen werd gewerkt en het oppervlak van het GelDoc-toestel waar de gel op wordt geplaatst voor de visualisatie, steeds voor en na gebruik gereinigd werd. Deze reiniging gebeurt met 70 % ethanol, wat vermoedelijk dus niet al de kleurstof zal verwijderen. Er werden alternatieve reinigingen uitgevoerd, jammer genoeg zonder resultaat. Ook het papier waarmee gereinigd wordt, geeft een kleursignaal, en dus mogen hiervan ook geen resten achterblijven op de plaat. De handschoenen zorgen tenslotte ook voor contaminatie, dit is met zekerheid te zeggen aangezien de gel op onderstaande figuur eerst nagenoeg geen vlekken vertoonde, maar na contact met de gebruikte handschoenen wel duidelijke vingerafdrukken vertoonde (figuur 32).
. Figuur 32: SDS-PAGE gel gekleurd met Pro-Q Emerald 300 en sterk gecontamineerd na contact met handschoenen.
67
3.2.3.2
Bepaling
gehalte
glycoproteïnen
m.b.v.
combinatie
van
colorimetrische kleuringen: PAS-kleuring en CBB R-250 Kleuring van de geglcosyleerde eiwitten met behulp van PAS is niet geslaagd. Er waren namelijk geen bandjes zichtbaar na de kleuring, ook niet bij de standaarden. Dit zowel bij gels na SDS-PAGE als IEF-gels. Bijgevolg konden er dus ook hier geen conclusies worden getrokken door beide kleuringen op eenzelfde gel te vergelijken.
3.3
Lectinekolom ConA
In dit experiment werd getracht een methode op punt te stellen om de plasma-eiwitten te scheiden in een geglycosyleerde en een niet-geglycosyleerde fractie met behulp van affiniteitschromatografie, meerbepaald met een lectinekolom bestaande uit geïmmobiliseerd ConA. Dit lectine heeft een specificiteit voor N-glycanen en bindt dus aan de meeste glycoproteïnen. Er werd een lectinekolom met een bedvolume van 1 ml bereid volgens de methode beschreven in 2.3.3. Er worden drie uitgevoerde experimenten besproken. Deze worden benoemd naargelang de samenstelling van de stalen of standaarden die op de kolom werden geladen. 5 mg BSA en 5 mg ovalbumine, opgelost in 1 ml equilibratiebuffer Er werd gekozen voor BSA en ovalbumine omdat BSA normaal gezien een niet geglycosyleerd eiwit is, en ovalbumine wel. Ovalbumine zou dus tegengehouden moeten worden door de ConA-kolom, aangezien het om een N-geglycosyleerd eiwit gaat. Bovendien zijn dit beide plasma-eiwitten, weliswaar van een verschillende bron; respectievelijk rund en kip. Na het laden van het staal werd de kolom gewassen met 10 ml equilibratiebuffer en tenslotte werd er 20 ml elutiebuffer geladen om de glycoproteïnen die werden weerhouden door de kolom te elueren. Dit gebeurde telkens in stappen van 5 ml. De fracties van de flow-through (niet gebonden fractie tijdens het laden van het staal), het wassen en de elutie werden opgevangen en het eiwitgehalte werd geschat door de absorbantie te meten bij een golflengte van 280 nm, zoals uitgelegd in 2.6. Met deze gegevens kon een chromatogram werden opgesteld. Voor de berekening van de eiwitconcentratie, vertrekkende van de absorbantie bij 280 nm, werd er vermenigvuldigd met factor 1,45. Aangezien er met een eiwitmengsel werd gewerkt, kon de molaire extinctiecoëfficiënt hiervoor namelijk niet gebruikt worden en werd de factor 1,45 gebruikt als alternatieve waarde. Het bekomen chromatogram is weergegeven in onderstaande figuur.
68
3 Concentratie eiwit (mg/ml)
FT
W
E
2,5 2 1,5 1 0,5 0 0
5
10
15
20
25
30
35
Fractie
Figuur 33: Chromatogram van ConA-kolom na lading van 5 mg BSA en 5 mg ovalbumine. Per fractie werd ongeveer 1 ml opgevangen. De eerste twee fracties zijn flow-through (FT); fractie 3 tot 13 zijn het wassen (W) van de kolom en de overige fracties zijn de elutie (E).
Er zijn twee pieken duidelijk te onderscheiden, de eerste piek is beduidend groter dan de tweede piek. Dit wijst er op dat er veel meer eiwitten werden doorgelaten door de kolom dan er werden weerhouden. Nochtans werd er evenveel ovalbumine als BSA geladen (5 mg van beide). Dit betekent daarom niet dat er slechts een klein gehalte van de eiwitten geglycosyleerd was. Meer waarschijnlijk is dat de kolom verzadigd was en er dus glycoproteïnen door de kolom zijn gelopen tijdens het laden en het wassen van de kolom omdat deze niet meer konden binden aan het ConA-lectine. Om te achterhalen wat de eiwitsamenstelling is van de fracties ter hoogte van de pieken, werden de eerste 4 fracties – deze bevatten de flow-through en de eerste drie wasfracties- en de eerste drie elutiefracties – deze komen overeen met de tweede piek - op een SDS-PAGE gel geladen en gekleurd met CBB R-250. Onderstaande tabel geeft de volgorde weer van de stalen en standaarden. Het resultaat is weergegeven in figuur 34. Tabel 15: Volgorde van stalen en standaarden geladen op gel voor SDS-PAGE met vermelding van de concentratie (mg/ml).
Staal of standaard
Concentratie eiwit geladen
1
Precision Plus Protein standaard
(onverdund)
2
Fractie 2 – flow-through
1 mg/ml
3
Fractie 3 – wassen
1 mg/ml
4
Fractie 4 – wassen
1 mg/ml
5
Fractie 5 – wassen
1 mg/ml
6
Fractie 14 – elutie
0,09 mg/ml
7
Fractie 15 – elutie
0,17 mg/ml
8
Fractie 16 – elutie
0,08 mg/ml 69
9
BSA
0,5 mg/ml
10
Ovalbumine
1 mg/ml
De fracties met een eiwitconcentratie groter dan 1 mg/ml werden verdund zodanig dat de concentratie 1 mg/ml bedroeg. De fracties met een lagere eiwitconcentratie werden onverdund op de gel geladen. Op de gel is duidelijk zichtbaar dat fracties 2 tot 5 (laan 2 tot 5: laden + wasen) zowel ovalbumine als een groot gehalte BSA bevatten. De volgende twee laantjes (fractie 14 en 15: elutie) bevatten ook beide eiwitten, maar de proportie van BSA is wel relatief kleiner. Laan 8 (fractie 16: elutie) tenslotte lijkt enkel ovalbumine te bevatten, of bevat een zodanig laag gehalte BSA dat dit niet detecteerbaar is met de gebruikte methode. Dit wijst er op dat zowel BSA als ovalbumine weerhouden zijn de kolom en vervolgens werden geëlueerd met slechts een heel beperkte aanrijking van ovalbumine in de elutiefracties. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat het BSA (deels) geglycosyleerd kan zijn. 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Figuur 34: SDS-PAGE gel gekleurd met CBB, volgorde en concentratie van geladen stalen en standaarden zijn vermeld in tabel 15.
0,5 mg ovalbumine opgelost in 5 ml equilibratiebuffer Bij deze scheiding werd er enkel geglycosyleerd eiwit geladen en een 10x kleinere hoeveelheid met de bedoeling dat de kolom niet verzadigd zou geraken. Vervolgens werd de kolom gewassen met 10 ml equilibratiebuffer en geëlueerd met 10 ml elutiebuffer. Wanneer al het eiwit zou weerhouden kunnen worden door de kolom, zou er geen eerste piek zichtbaar zijn bij de flow-through en het wassen van de kolom maar enkel bij de elutie. Op het chromatogram (onderstaande figuur) zijn opnieuw twee pieken te onderscheiden, maar de pieken zijn veel kleiner dan bij de vorige scheiding. Er zijn ook sterke schommelingen in concentratie zichtbaar, waardoor de pieken ook veel minder uitgesproken zijn. Vanwege negatieve waarden bij het meten van de absorbantie, gaat de grafiek bovendien tussen de twee pieken onder het nulpunt, wat in 70
realiteit onmogelijk is. Deze zaken wijzen op een grote foutmarge. Bovendien is op het einde van de metingen nog niet al het eiwit geëlueerd. Er zou dus langer geëlueerd moeten worden. 0,05 FT
W
E
Concentratie (mg/ml)
0,04 0,03 0,02 0,01 0 0
5
10
15
20
25
30
-0,01 -0,02
Fractie
Figuur 35: Chromatogram van ConA-kolom na lading van 0,5 mg ovalbumine. Per fractie werd ongeveer 1 ml opgevangen. De eerste vijf fracties zijn flow-through (FT); fractie 6 tot 16 zijn het wassen (W) van de kolom en de overige fracties zijn de elutie (E).
Uit deze resultaten blijkt duidelijk dat de kwaliteit van de kolom bij hergebruik sterk achteruit gaat, ook al werd deze bewaard zoals werd voorgeschreven, namelijk bij 4 °C in een oplossing van 20 % ethanol in equilibratiebuffer. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat de capacitiet van de kolom is afgenomen en de kolom dus sneller verzadigd was. Dit kan vermoedelijk te wijten zijn aan de ouderdom van de kolom, slijtage door het eerder gebruik of door aantasting van de ConA door de buffers en de 20 % ethanol waarin de kolom werd bewaard tussen de analyses. Een belangrijke opmerking is dat de chromatogrammen gebaseerd zijn op eiwitconcentraties, welke berekend worden uit de absorbanties bij 280 nm. De blanco waar automatisch (door de absorbantiemeter) mee rekening werd gehouden, bestaat eerst uit equilibratiebuffer en vanaf de elutie uit elutiebuffer. Ook al werd er niet met gradiëntelutie gewerkt, toch zal er een overgangsfase zijn tussen het wassen en elueren van de kolom waarbij er fracties zijn waarvan het oplosmiddel bestaat uit een mengsel van beide buffers. Aangezien er een verschil in absorbantie bestaat tussen beide buffers, zorgt dit voor afwijkende resultaten. Dit zou dus de negatieve waarden kunnen verklaren. Aangezien er enkel met ovalbumine werd gewerkt en niet met een eiwitmengsel, konden de eiwitgehaltes van de opgevangen fracties voor dit experiment wel berekend worden m.b.v. de molaire extinctiecoëfficiënt van ovalbumine. De oorspronkelijke kolom met een volume van 1 ml werd hierna uitgebreid met ongeveer 2 ml, waarna de kolom een totaalvolume heeft van ongeveer 3 ml. Dit met als doel om de capaciteit van de kolom te doen toenemen. 71
2 mg ovalbumine opgelost in 2 ml equilibratiebuffer. Na het laden van het staal werd de kolom gewassen met 10 ml equilibratiebuffer en vervolgens geëlueerd met 20 ml elutiebuffer. Op het chromatogram, figuur 33, zijn er weer twee pieken zichtbaar, bovendien is de tweede piek nu groter. Dit wijst er op dat de kolomcapaciteit inderdaad is toegenomen dankzij de uitbreiding van de kolom. De eerste piek wijst er wel op dat er opnieuw eiwitten door de kolom gelopen zijn die dus niet werden weerhouden, ook al werd er enkel geglycosyleerd eiwit geladen. Dit is niet zo verwonderlijk aangezien er vier keer zoveel eiwit werd geladen terwijl de kolom slechts drie keer vergroot is in volume, en bij de vorige scheiding ook niet al het eiwit werd weerhouden. 0,16 FT
Concentratie eiwit (mg/ml)
0,14
W
E
0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
Fractie
Figuur 36: Chromatogram van ConA-kolom na lading van 2 mg ovalbumine. Per fractie werd ongeveer 1 ml opgevangen. De eerste twee fracties zijn flow-through (FT); fractie 3 tot 13 zijn het wassen (W) van de kolom en de overige fracties zijn de elutie (E).
72
Conclusie De eiwitgehalten van het varkensplasma en -concentraat verkregen van Veos konden volgens de BIORAD DC eiwitanalyse bepaald worden en bedragen respectievelijk 64 mg/ml (6,4 %) en 217 mg/ml (21,7 %). De resultaten van het plasmapoeder waren zeer variabel. Volgens de productfiche van Veos bestaat dit poeder voor 69 % uit eiwit. Voor de plasmastalen van Sigma-Aldrich werden eiwitgehaltes bekomen van 56 mg/ml (5,6 %), 107 mg/ml (10,7 %), 115 mg/ml (11,5 %) en 30 mg/ml (3,0 %) voor respectievelijk humaan, varkens-, runds- en kippenplasma. Er blijkt dus toch een verschil te zijn tussen het varkensplasma van Veos en dit van Sigma-Aldrich, buiten het feit dat er bij Sigma-Aldrich ook een anti-stollingsmiddel (trisodium citraat) werd toegevoegd, terwijl er bij Veos geen additieven werden toegevoegd. De eiwitprofilering van de verschillende stalen gebeurde door detectie van de proteïnen, na scheiden van de eiwitten m.b.v. SDS-PAGE en IEF. De beste resultaten werden bekomen met SDS-PAGE. Hierbij blijkt de detectie met de fluorescente kleuring SYPRO-Ruby betere resultaten te geven t.o.v. coomassie briljant blauw R-250 vanwege de hogere gevoeligheid. Voor detectie van de glycoproteïnen zou de combinatie van deze kleuring met de Pro-Q Emerald 300 ideaal moeten zijn aangezien het om twee precieze fluorescente kleuringen gaat, al konden hier nog geen correcte resultaten mee worden bekomen. De resultaten van de standaarden kwamen hierbij namelijk niet overeen met de verwachtingen. Een bijkomend voordeel van de fluorescente kleuringen is dat de resultaten via het GelDoc toestel hiervan eenvoudig verwerkt kunnen worden aan de hand van de hiervoor ontwikkelde software, namelijk het programma “Imagelab”. Dit biedt tal van mogelijkheden zoals bijvoorbeeld bepaling van de verhouding glycoproteïnen tot het volledig proteoom, aan de hand van de fluorimetrische signaalsterktes van de eiwitbanden, welke densitometrische vergelijking van de bandenpatronen toelaat. De scheiding met behulp van lectinekolommen dient nog verder geoptimaliseerd te worden. Dit kan door gebruik te maken van meerdere lectines. Deze kunnen dan samengebracht worden in een gemengde kolom, of er kunnen kolommen van verschillende lectines in serie geplaatst worden, waarbij de niet weerhouden eiwitten telkens door een volgende kolom kunnen worden gestuurd. Op deze manier worden de eiwitten niet enkel opgedeeld in wel en niet geglycosyleerd, maar ook op basis van welk eiwit aan welk lectine bindt. Elk lectine heeft namelijk een andere specificiteit. De combinatie van de lectinen ConA, tarwekiem agglutinine (WGA) en jacaline (JAC) bleken het meest geschikt voor scheiding van plasmaproteïnen vanwege de combinatie van de affiniteit voor respectievelijk N-glycanen, GlcNAc en O-gebonden glycoproteïnen (Kullolli et al., 2008; Yang & Hancock, 2004;Tachibana et al., 2005).
73
De efficiënte van de scheiding met één of meerdere, al dan niet gemengde lectinekolommen kan gecontroleerd worden door de eiwitsamenstelling van verscheidene fracties te analyseren m.b.v. SDSPAGE, waarbij de gel gekleurd kan worden met de fluorescente Pro-Q Emerald 300 en SYPRO-Ruby kleuring. Wanneer de scheiding geslaagd is zouden bij de fracties van de flow-through en het wassen van de kolom enkel eiwitbandjes zichtbaar mogen zijn met de SYPRO-Ruby kleuring, en bij de fracties van de elutie zouden al de aanwezige eiwitten geglycosyleerd moeten zijn en bijgevolg dus oplichten met de Pro-Q Emerald 300 kleuring.
74
Referenties Ayoubi T. A. & Van De Ven W. J. (1996) Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB Journal, 10(4), p 453-60. Amersham Biosciences (1998) Guide to Isoelectric Focusing. Berggren, K., Chernokalskaya E., Steinberg T. H., Kemper C., Lopez M. F., Diwu Z., Haugland R. P. & Patton W. F. (2000) Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis, 21, p 2509-2521. Bradford, M. M. (1976). "Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding". Analytical Biochemistry 72: 248–254. Cummings R. D. & Etzler M. E. (2009) Antibodies and lectins in glycan analysis. Essentials of Glycobiology, 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press. Blaber M. (1998) Lecture 32: Protein Purification: Running the Experiment, Resolving Peaks. Geraadpleegd op 6 februari, 2015 van http://www.mikeblaber.org/oldwine/bch5425/lect32/lect32.htm. Burda P. & Aebi M. (1999) The dolichol pathway of N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta. 1426, 239-57. Dean L. (2005) Blood Groups and Red Cell Antigens. National Center for Biotechnology Information (US). Geraadpleegd via http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2263/ op 5 maart 2015 Demchenko A. P. (2011) Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology III, Applications in Sensing and Imaging. Springer Series on Fluorescence 10(1). Dell A. & Morris H. R. (2001) Glycoprotein structure determination by mass spectrometry. Science. 291, 2351-6. Dempski R. E., & Imperiali B. (2002) Oligosaccharyl transferase: Gatekeeper to the secretory pathway. Curr Opin Chem Biol. 6, 844-50. Dyballa N. & Metzger S. (2009) Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels. Journal of Visualized Experiments (30), 1431. Edelman GM, Cunningham BA, Reede GN, Becher JW, Waxdal MJ, Wang JL (1972) The covalent and three-dimensional structure of concanavalin A. Proc Natl Acad Sci USA 69:2580–2584 Finlayson G. R. & A. Chrambach A. (1971) Isoelectric focusing in polyacrylamide gel and its preparative application. Analytical Biochemistry 40(2), 292-311
75
Fraeyman N.F., Dello C.D. & Belpaire F.M. (1988) Alpha 1-acid glycoprotein concentration and molecular heterogeneity: relationship to oxprenolol binding in serum from healthy volunteers and patients with lung carcinoma or cirrhosis. British Journal of clinical pharmacology Jun;25(6):733-40 GE lifesciences (2007) Con A Sepharose 4B. Affinity Chromatography Gemmill T. R. & Trimble R. B. (1999) Overview of N- and O-linked oligosaccharide structures found in various yeast species. Biochim Biophys Acta. 1426, 227-37. Hardman, K.D., Ainsworth, C.F. (1972) Structure of concanavalin A at 2.4-A resolution. Biochemistry, 11, 4910-4919 Hirabayashi J. (2008) Concept, strategy and realization of lectin-based glycan profiling. J Biochem. 144(2), 139-47 Hsieh, S. Y., Chen R. K., Pan Y. H. & Lee H. L. (2006), Systematical evaluation of the effects of sample collection procedures on low-molecular-weight serum/plasma proteome profiling. Proteomics, 6: 3189–3198. doi: 10.1002/pmic.200500535 Jensen O. N. (2004) Modification-specific proteomics: Characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 8, 33-41. Kapitany R. A., Zebrowski E. J. (1973) A high resolution PAS stain for polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical biochemistry. Kulloli M., Hancock W. S. & Hincapie M. (2008) Preparation of a high-performance multi-lectin affinity chromatography (HP-M-LAC) adsorbent for the analysis of human plasma glycoproteïns. Journal of Separation Science. 31, 2733-2739. Lamarre-Vincent N. & Hsieh-Wilson L. C. (2003) Dynamic glycosylation of the transcription factor CREB: A potential role in gene regulation. J Am Chem Soc. 125, 6612-3. Lechner J. & Wieland F. (1989) Structure and biosynthesis of prokaryotic glycoproteins. Annu Rev Biochem. 58, 173-94. Lundblad R. (2003) Considerations for the use of blood plasma and serum for proteomic analysis. The Internet Journal of Genomics and Proteomics. Vol 1, nr 2. Luque-Garcia J.L., Neubert T. A. (2007) Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. Journal of chromatography. 1153(1-2):259-76. Messner P. (1997) Bacterial glycoproteins. Glycoconj J. 14, 3-11. Mehta-D'souza P. (2012) Detection of glycoproteins in polyacrylamide gels using Pro-Q Emerald 300 dye, a fluorescent periodate Schiff-base stain. Methods in molecular biology. 869:561-6. 76
Pan S., Chen R., Aebersold R. & Brentnall T. A. (2011) Mass spectrometry based glycoproteomics from a proteomics perspective. Molecular Cell Proteomics. 10. Righetti P. & Drysdale J. W. (1971) Isoelectric focusing in polyacrylamide gels. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure 236(1), 17-28. Roth J. (2002) Protein N-glycosylation along the secretory pathway: Relationship to organelle topography and function, protein quality control, and cell interactions. 102, 285-303. Rudd P. M. & Dwek R. A. (1997) Glycosylation: Heterogeneity and the 3D structure of proteins. Biochemistry and Molecular Biology. 32, 1-100. Soper A. S. & Aird S. D. (2007) Elution of tightly bound solutes from concanavalin A Sepharose Factors affecting the desorption of cottonmouth venom glycoproteins. Journal of Chromatography 1154(1-2) p 308-318. Spiro R. G. (2002) Protein glycosylation: Nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12, 43R-56R. Tachibana K., Sachiko Nakamura S., Wang H., Iwasaki H., Tachibana K., Maebara K., Cheng L., Hirabayashi J. & Narimatsu H. (2005) Elucidation of binding specificity of Jacalin toward Oglycosylated peptides: quantitative analysis by frontal affinity chromatography. Oxford Journals Vol 16(1) p. 46-53. Tal M., Silberstein A. & Nusser E. (1985) Why does Coomassie Brilliant Blue R interact differently with different proteins? A partial answer. Journal of Biological Chemistry. Thermo Fisher Scientific (2015) Protein gel stains. Geraadpleegd op 15 maart, 2015 van https://www.lifetechnologies.com/be/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learningcenter/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/protein-gel-stains.html Thermo Fisher Scientific (2015) Overview of Post-Translational Modifications (PTMs). Geraadpleegd op 12 maart, 2015 van https://www.thermofisher.com/be/en/home/life-science/protein-biology/proteinbiology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-posttranslational-modification.html. Trombetta E. S. (2003) The contribution of N-glycans and their processing in the endoplasmic reticulum to glycoprotein biosynthesis. Glycobiology. 13, 77R-91R. Tuck M. K., Chan D. W., Chia D., Godwin A. K., Grizzle W. E., Krueger K. E., Rom W., Sanda M., Sorbara L., Stass S., Wang W., Brenner D. E. (2009) Standard operating procedures for serum and plasma collection: early detection research network consensus statement standard operating procedure integration working group. Journal of Proteome Results. 8, p 113–117.
77
Van-Seuningen I. & Davril M. (1992) A rapid periodic acid-Schiff staining procedure for the detection of glycoproteins using the phastsystem. Varki A., Cummings R. D., Esko J. D., Freeze H. H., Stanley P., Bertozzi C. R., Hart G. W., Etzler M. E., (2009) Essentials of Glycobiology. 2nd edition (45). Wormald M. R., Petrescu A. J., Pao Y. L., Glithero A., Elliott T. & Dwek R. A. (2002) Conformational studies of oligosaccharides and glycopeptides: Complementarity of NMR, X-ray crystallography, and molecular modelling. Chem Reviews (102), p 371-86. Wako Pure Chemical Industries (2013) Polysaccharide Staining. Pathology Research G-2. p 16. Walsh C. (2006) Posttranslational modification of proteins : Expanding nature's inventory. Englewood, Colo.: Roberts and Co. Publishers. xxi, p 490. WHO. (2002) Use of anticoagulants in diagnostic laboratory investigations. Stability of blood, plasma and serum samples. Xu W, Chen L. & Shao R. (2014) Influence of glycation of plasma proteins in diabetes on the binding interaction with polyphenols. Curr Drug Metab. 15(1), p116-9. Zini R., Riant P., Barré J. & Tillement J. (1990) Disease-Induced Variations in Plasma Protein Levels Implications for Drug Dosage Regimens (Part I). Clinical Pharmacokinetics. Volume 19(2), p 147-159.
78
Bijlagen
Productinformatie plasmapoeder Vepro ......................................... Fout! Bladwijzer niet gedefinieerd. Protocol SYPRO Ruby .......................................................................................................................... 81 Protocol PAS-kleuring .................................................................... Fout! Bladwijzer niet gedefinieerd. Protocol Pro-Q Emerald 300 ........................................................ Fout! Bladwijzer niet gedefinieerd.1
79
