Ritka betegségek diagnosztikája

1

Ritka betegségek diagnosztikája 2009. október 1. Bókay délután

Dr. Já Jávorszky Eszter

SE I. Gyermekklinika, Budapest

2

Ritka betegségek diagnosztikája:

Lehetőségek

Metabolit szintő vizsgálat kis molekulák mőszeres analitikai meghatározása

Enzim aktivitás mérés

Genetika

• sok metabolit egy mérésbıl • nem ad végsı diagnózist

egy betegségnél is akár több mint 1000 mutáció

Klinikum, tünetek

• legnehezebben kivitelezhetı • végsı diagnózist ad

rendkívül változatos, egy betegségen belül is!

• legkisebb a jelentısége a diagnózis felállításában • nem ad végsı diagnózist

3

Metabolit szintű vizsgálat • Tünetek megjelenése elıtt • újszülöttkori tömegszőrés • limitált a vizsgált betegségek száma • Tünetek megjelenése után • cél: betegségcsoport megtalálása metabolit vizsgálatok sorozata

4

Minták SORSZÁM

Figyelem! A karikákat teljesen át kell vérrel itatni!

VONALKÓD DNS BANKBA Gyermek családneve:

SORSZÁM

Beküldı intézet kódja:

VONALKÓD

Beküldı orvos pecsétszáma:

♂ Gyermek utóneve/i:

♀ Születési dátum:

Születési súly: Terhességi hét:

Vérvétel dátuma:

g Tejtáplálás kezdete:

Táplálás: anyatej

Ismételt szőrés:

tápszer

parenteralis Transzfúzió idıpontja:

idısebb>48 h

fiatalabb<48 h

<32gest. hét

transzfúzió

Anya családi és utóneve: Gyermek TAJ száma (ha van):

Elérhetıség (telefonszám):

Irányítószám:

— Település: Utca/út és házszám:

• postai úton: távolság nem akadály! • csökkent mintatérfogat (újszülöttek!) • fertızés kockázata minimális (HIV!!) • mintakezelés egyszerő, „high-throuput” • egyszerő tárolás

szőrıpapíros vérminta dried blood sample:DBS Lyukasztás géppel

tömegszőrés:

• átlagosan 2-300 minta/nap • minden vérmintából 4 lyuk 4 különbözı plate-be

5

Újszülöttkori tömegszűrés: 3 betegség fotometriás (Elisa reader) szőrése: • hipotireózis •biotinidáz defektus •galaktozémia 2007 október 1.-tıl tandem szőrés 23 veleszületett anyagcsere betegség beszárított szőrıpapíros vérmintából

Összesen 26 anyagcsere betegség Nyugat-magyaroszági régió: 57 ezer újszülött

6

Tandem tömegspektrometriás vizsgálatok egy mérés

rengeteg információ

• Aminosav profil Gly, Ala, Val, Pip, Leu/Ile, Orn, Gln/Lys, Met, Phe, Arg, Glu, Asp, Cit, Tyr

▫ Szemi-kvantitativ (Phe, Tyr, Leu kivételével) ▫ Szőrés és follow-up (pl.PKU betegek)

• Acil-karnitin profil C0, C2, C3, C4, C5, C5:1, C5-OH, C6, C8, C3DC, C4DC, C5DC, C10, C10:1, C10:2, C12, C14, C14:1, C14:2, C14-OH, C16:1, C16, C18, C18:1, C18:2, C18OH, C20:2, C20:3

▫ Szemi kvantitativ ! ▫ Szőrés és follow-up

7

Tandem tömegspektrometriás vizsgálatok aminosav profil

aminosav anyagcserezavarok

+NL (102.00): Exp 2, 0.205 to 0.482 min fromSample 90 (Sample279) of DataSET4.wiff (Turbo Spray) +NL (102.00): Exp 2, 0.205 to 0.482 min fromSample 90 (Sample279) of DataSET4.wiff (Turbo Spray)

Max. 8.4e4 cps. Max. 8.4e4 cps.

172.3 172.3

8.4e4 8.4e4 8.0e4 8.0e4

•fenilketonuria •jávorfaszörp betegség (MSUD) •tirozinémia I és II •argininoszukcinát szintáz és liáz hiány •homocisztinuria

7.5e4 7.5e4 7.0e4 7.0e4 6.5e4 6.5e4 6.0e4 6.0e4 5.5e4 5.5e4 5.0e4 5.0e4 4.5e4 4.5e4 4.0e4 4.0e4

•nonketotikus hiperglicinémia •ureaciklus zavarok •mitokondriális defektusok

3.5e4 3.5e4 3.0e4 3.0e4

146.3 146.3

2.5e4 2.5e4 2.0e4 2.0e4

186.3 186.3 188.2 188.2

1.5e4 1.5e4

162.3 162.3

1.0e4 1.0e4

150.3 150.3

5000.0 5000.0 110 110

120 120

134.3 134.3 130 140 130 140

150 150

160 160

173.2 173.2 170 170

228.3 228.3

191.2 191.2

174.3 174.3

160.0 158.2160.0 158.2

212.3 212.3

189.2 176.2 189.2 176.2 192.3 192.3 180 190 200 210 180 190 200 210 m/z, amu m/z, amu

222.2 222.2

220 220

238.3 238.3

227.3 227.3 230 230

244.1 244.1

240 240

250 250

260 260

organikus aciduriák acilkarnitin profil zsírsav oxidáció •b-ketotioláz hiány

270 270

280 280

•rövid szénláncú (SCAD) •glutársav acidémia (GA-I) •közép szénláncú(MCAD) •izovaleriánsav acidémia •hosszú szénláncú hidroxi(IVA) acil(LCHAD) acidémia •metilmalonsav •nagyon hosszú szénláncú (MMA) (VLCAD) acidémia (PA) •propionsav •többszörös (MADD vagy •3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA GAII) liáz hiány (HMG) •karnitin palmitoil transzferáz •3-metil-krotonil-CoA hiány I és hiány II (CPT-I és CPT-II) karboxiláz (MCC) •karnitin transzport zavara •többszörös karboxiláz hiány (CT) (MCD)

290 290

+Prec (85.00): Exp 1, 0.139 to 0.416 min fromSample 90 (Sample279) of DataSET4.wiff (Turbo Spray) +Prec (85.00): Exp 1, 0.139 to0.416 min fromSample 90 (Sample279) of DataSET4.wiff (Turbo Spray)

300 300

Max. 2.1e4 cps. Max. 2.1e4 cps.

260.4 260.4


218.4 218.4

1.3e4 1.3e4 1.2e4 1.2e4 1.1e4 1.1e4 1.0e4 1.0e4

227.2 227.2

459.4 459.4

9000.0 9000.0

456.5 456.5

8000.0 8000.0

263.3 263.3

7000.0 7000.0 6000.0 6000.0 5000.0 5000.0 4000.0 4000.0 3000.0 3000.0

311.5 311.5

202.4 202.4

2000.0 2000.0 1000.0 1000.0

205.3 205.3

200 200

221.3 221.3 219.3 219.3

243.6 243.6

237.1 237.1

220 220

347.4 347.4

274.4277.5 274.4277.5 291.4 291.4

240 240

264.5 288.3 302.0 302.0 341.3 264.5 288.3 341.3 275.4 306.4 336.7 336.7 275.4 306.4

260 260

280 280

300 300

482.3 482.3

437.4 437.4

484.6 484.6

358.3 358.3

320 320

340 340

369.5 369.5 374.4 374.4 389.7 404.4 404.4 389.7

360 360 m/z, amu m/z, amu

380 380

400 400

428.4 428.4438.9 438.9

420 420

440 440

457.9 457.9

460 460

480.3 480.3

480 480

497.7 497.7510.5 510.5 500 500

520 520

8

Tandem tömegspektrometriás vizsgálatok: eredmények értelmezése, határértékek A diagnózishoz általában több paramétert használunk fel: Pl. fenilketonuria esetében • fenilalanin • fenilalanin/tirozin A határértékek: saját magunk számoljuk statisztika alapján

gyakoriság

• percentilis függvény (50 ezer fıs populációra számolva) • CDC ajánlások

99,9%

koncentráció

9

Tandem tömegspektrometriás vizsgálatok: gyakoriság-koncentráció függvény 50 ezer fő (C8-karnitin: MCAD; C4-karnitin:SCAD)

C 8 - k a r n itin 1100000000

10000

88000000

8000

66000000

6000

44000000

4000

22000000

2000

00

0 00,0 ,0

00,1 ,1

00 ,2 ,2

00 ,3 ,3

0 0 ,4 ,4

0 ,5 0 ,5

0 ,6 ,6 0

kk o ió (( u um mo o l/l) l/l) on n cc e en n tr tr á á cc ió

,7 00 ,7

,8 00 ,8

,9 00,9

,0 11,0

C4-karnitin gyakorisága (db)

C8-karnitin C8-karnitingyakorisága gyakorisága(db) (db)

C 4 - k a r n itin C 8 - k a r n itin

10

Tandem alapú további diagnosztika beszárított vércseppből • Galaktóz-1-foszfát ▫ Szűrésre is alkalmas ▫ Jelenleg 2nd tier tesztként használatos

• Konjugált epesavak ▫ Glicin és taurin konjugált epesavak negativ ESI-MS/MS meghatározása ▫ Szűrés hepatobiliáris megbetegedésekre

• Szukcinilaceton SORSZÁM



SORSZÁM


VONALKÓD





Vérvétel dátuma:



Ismételt szőrés:

tápszer


idısebb>48 h

fiatalabb<48 h

<32gest. hét

transzfúzió




Irányítószám:

11

Diagnosztikai séma Beszá Beszárított vé vércsepp tandem tö tömegspektrometriá megspektrometriás vizsgá vizsgálata Pozitivitá Pozitivitás eseté esetében Vizelet szerves sav vizsgá vizsgálat Pozitivitá Pozitivitás eseté esetében Enzimaktivitá Enzimaktivitás mé mérés Leí Leírt mutá mutáció ció eseté esetében Mutá Mutáció ció analí analízis

12

Megerősítő vizsgálat: vizelet szerves sav Évente ~1200 mérés

differenciál diagnosztika

utánkövetés

Abundance TIC: NagyBoglarka.D\data.ms 1500000 1400000 1300000

1. vizelet 2. szérum 3. liquor

1200000 1100000 1000000 900000 800000 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

45.00

50.00

55.00

Time-->

A szerves savak kémiai meghatározása és biokémiai kiértékelése

13

GC-MS módszerek egy mérés

rengeteg információ

• Szerves sav profil ▫ Több mint 200 kis molekulatömegű metabolikus komponens szemi-kvantitatív meghatározása (nem csak karbonsavak) • Zsírsav profil ▫ Zsírsavak kvantitatív meghatározása • Szteroid profil ▫ Koleszterin és más szteroidok kvantitatív meghatározása

14

GC-MS módszerek • mitokondriális defektusok • zsírsav oxidáció

Abundance TIC: NagyBoglarka.D\data.ms 1500000

• aminosav anyagcsere zavarok

1400000 1300000 1200000 1100000 1000000 900000 800000

• peroxiszomális defektusok laktát, piruvát acil-glicinek, dikarbonsavak szukcinilaceton, nagyon fumársav, koleszterin hosszú ketoglutársav származékok szénláncú ketosavak zsírsavak orotsav 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000

10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00

Time-->

• ureaciklus zavarok • trikarbonsav ciklus

• szteroid és koleszterin szintézis zavarok

15

HPLC-MS módszerek • Acil-karnitin kromatográfia ▫ ▫ ▫ ▫

Szérum vagy alvadásgátolt teljes vér Pentafluoro-phenacyl származékképzés Elválasztás fordított fázisú HPLC-vel, detektálás ESI-MS/MS módszerrel ~ 80 acil-karnitin kvantitatív mghatározása

• Aminosav kromatográfia ▫ Szérum, vizelet vagy liquor ▫ Ioncsere alapú extrakció, majd alkilálás ▫ Elválasztás fordított fázisú HPLC-vel, detektálás pozitív ion ESI-MS/MS módszerrel ▫ 24 aminosav kvantitatív meghatározása

• Cisztein és homocisztein meghatározása (szabad –SH tart. A.sav) ▫ ▫ ▫ ▫

Szérum, vizelet vagy liquor Minta redukciója DTT-vel vagy TCEP-pel Elválasztás cianopropil oszlopon, detektálás pozitiv ion ESI-vel Kvantitativ meghatározási módszer

16

A leggyakoribb ritka 1.: hipotireózis tömegszőrés része: gyakorisága kb.: 1:2-3000 csökkent tiroxin szint

TSH szint megemelkedik

TSH elúciója

Veleszületett hipotireózis: • késıbb is jelentkezhet!! • fontos aszínképzés tüneti felismerés FT4 és TSH szintek meghatározása klasszikus laboratóriumi módszerekkel

17

A leggyakoribb ritka 2.: cisztás fibrózis - Magyarországon a becsült gyakorisága 1:5000 •nem része az újszülötkori tömegszőrésnek •tünetek megjelenése utáni vizsgálat verejték teszt genetikai vizsgálatok: több mint 1000 mutáció! SORSZÁM

VONALKÓD DNS BANKBA

SORSZÁM


VONALKÓD



-Nyugat-Európa és USA: tömegszőrés vércseppbıl •immunoreaktív tripszinogén szint meghatározása •pozitivitás esetén a leggyakoribb mutációk ugyanabból a vércseppbıl Gyermek családneve:

♂

Gyermek utóneve/i:

Születési dátum:


♀ Vérvétel dátuma:

g

Tejtáplálás kezdete:

Táplálás:

anyatej

idısebb>48 h

fiatalabb<48 h

tápszer

<32gest. hét

Ismételt szőrés: parenteralis Transzfúzió idıpontja:

transzfúzió

Anya családi és utóneve:

Gyermek TAJ száma (ha van):


—

Település:

Utca/út és házszám:

Irányítószám:

18

A leggyakoribb ritka 3.: kongenitális adrenalis hiperplazia (CAH) - Magyarországon a becsült gyakorisága 1:10-15 000 •nem része az újszülötkori tömegszőrésnek •tünetek megjelenése utáni vizsgálat •szérum 17-hidroxi-progeszteron vizsgálat •részletes mellékvese funkció vizsgálat • (indokolt estben citogenetika) SORSZÁM

VONALKÓD DNS BANKBA Figyelem! A karikákat teljesen át kell vérrel itatni!

SORSZÁM


VONALKÓD


-Nyugat-Európa és USA: tömegszőrés vércseppbıl •17-hidroxi-progeszteron szint meghatározása •pozitivitás esetén a vércsepp szteroid profil GCMS-sel Gyermek családneve:

♂

Gyermek utóneve/i:

Születési dátum:

♀


Vérvétel dátuma:

g

Tejtáplálás kezdete:

Táplálás:

anyatej

idısebb>48 h

fiatalabb<48 h

<32gest. hét

Ismételt szőrés:

tápszer


transzfúzió

Anya családi és utóneve:

Gyermek TAJ száma (ha van):


—

Település:

Utca/út és házszám:

Irányítószám:

19

A leggyakoribb ritka 4.: fenilketonuria (PKU) -tömegszőrés része: •Magyarországon a gyakorisága 1:10 000 fenilalanin-4-hidroxiláz OH

fenilalanin

metanol

tandem tömegspektrométer

tirozin

+NL(102.00): Exp2, 0.205 to 0.482 min fromSample90(Sample279) of DataSET4.wiff (Turbo Spray) +NL(102.00): Exp2, 0.205 to 0.482 min fromSample90(Sample279) of DataSET4.wiff (Turbo Spray)

Max. 8.4e4cps. Max. 8.4e4cps.

172.3 172.3

8.4e 44 8.4e 8.0e 44 8.0e 7.5e 44 7.5e 7.0e 44 7.0e 6.5e 44 6.5e 6.0e 44 6.0e 5.5e 44 5.5e 5.0e 44 5.0e 4.5e 44 4.5e 4.0e 4.0e 44 3.5e 3.5e 44 3.0e 3.0e 44 146.3 146.3

2.5e 2.5e 44 2.0e 2.0e 44

186.3 86.3 1 188.2 188.2

1.5e 1.5e 44

162.3 162.3

1.0e 1.0e 44

15 0.3 15 0.3

5000.0 5000.0 110 110

120 120

134.3 134.3 130 140 130 140

174.3 174.3

160.0 .2160.0 1158 58.2 150 150

160 160

173.2 3.2 17 170 170

19 1.2 191.2

22 228.3 8.3

2222.2 22.2 21 238 .3 189.2 9.2 212.3 2.3 238.3 176.2 6.2 18 244.1 17 244.1 192.3 227.3 192.3 227.3 180 190 200 210 220 230 240 250 180 190 200 210 220 230 240 250 m/z, amu m/z, amu

260 260

270 270

280 280

290 290

300 300

20

A leggyakoribb ritka 5.: rövid és közép szénláncú zsírsav oxidációs zavar (SCAD és MCAD) -tömegszőrés része: •Magyarországon az összesített gyakorisága 1:8000 rövid vagy közép szénláncú Acil-KoA dehidrogenáz

metanol

tandem tömegspektrométer

+Prec (85.00): Exp 1, 0.139 to0.416min fromSample90(Sample279) of DataSET4.wiff (TurboSpray) +Prec (85.00): Exp 1, 0.139 to0.416min fromSample90(Sample279) of DataSET4.wiff (TurboSpray)

Max. 2.1e4cps. Max. 2.1e4cps.

260.4 260.4


218.4 218.4

1.3e4 1.3e4 1.2e4 1.2e4 1.1e4 1.1e4 1.0e4 1.0e4 227.2 227.2

459.4 459.4

900 0.0 900 0.0

45 6.5 456.5

800 0.0 800 0.0

263.3 263.3

700 0.0 700 0.0 600 0.0 600 0.0 500 0.0 500 0.0 400 0.0 400 0.0 300 0.0 300 0.0

100 0.0 100 0.0

311.5 .5 311

2.4 2020 2.4

200 0.0 200 0.0 205.3 205.3 200 200

221.3 221.3 21 9.3 21 9.3

243.6 243.6

237.1 237.1 220 220

347.4 347 .4

274.4277.5 77.5 274.42 291.4 291.4

240 240

264 .5 88.3 302.0 302.0 341.3 264 .5 2288.3 341.3 275.4 306.4 336.7 275.4 306.4 336.7 260 260

280 280

300 300

482.3 482.3

437 .4 437.4

484. 6 484.6

3 358.3 58.3

320 320

340 340

3 69.5 3 74.4 404.4 369.5 374.4 389.7 404.4 389.7

360 360 m/z, amu m/z, amu

380 380

400 400

42 8.4 428.4 438.9 438.9 420 420

440 440

457.9 457.9 460 460

48 0.3 480.3 497.7 510.5 497.7 510.5 480 480

500 500

520 520

21

Enzimaktivitás meghatározása ritka anyagcsere betegségek esetében • nem a klasszikus laboratóriumi enzim meghatározás!

biokatalizátorok

Enzimaktivitás meghatározása Hagyományosan: • Leukocita (EDTA vérbıl izolálva) • Limfocita (EDTA vérbıl izolálva) • Fibroblaszt (bır biopszia) • Májsejtek (májbiopszia)

Probléma: a minták gyorsan tönkremennek! •Sejtek izolálása •Enzimaktivitás mérés

23

Enzimaktivitás 2.: tárolási betegségek SORSZÁM

EDTA vér Leukocita/limfocita homogenizátum



SORSZÁM


VONALKÓD





Vérvétel dátuma:



Ismételt szőrés:

tápszer


idısebb>48 h

fiatalabb<48 h

<32gest. hét

transzfúzió



Irányítószám:


3 mm-es vércsepp

inkubálás

4-metilumberrilferil-alfa-D-glükopiranozid szubsztrát

fluoreszcens mérés

24

Enzimaktivitás 1.: biotinidáz defektus -tömegszőrés része: •Magyarországon a becsült gyakorisága 1:20 000

biocitin

biotinidáz enzim

37°C

biotin (H vagy B7 vitamin)

lizin

25

Genetikai vizsgálatok anyagcsere szőrı laboratóriumok

egy-két betegségcsoport

• leggyakoribb mutációk • szekvenálás

hálózat

26

A jövı? rengeteg ritka betegség

?

negatív a metabolit vizsgálat eredménye

• kóros metabolit nincs a könnyen vizsgálható tartományban peptid, fehérje, szénhidrát, egyéb nagyobb molekula….

mőszeres analitika (tömegspektrometria!) fejlıdése

lehetıség a metabolit vizsgálatok kiszélesítésére

27

Köszönöm a figyelmet!

KÖSZÖ SZÖNÖM A FIGYELMET!

Ritka betegségek diagnosztikája

Recommend Documents