RESEPTOR MELANOKORTIN 4) PADA MONYET EKOR PANJANG

POLIMORFISME GEN PENYANDI KARAKTER OBESITAS (MC4R/RESEPTOR MELANOKORTIN 4) PADA MONYET EKOR PANJANG (Macaca fascicularis) ASAL BALI, JAWA TIMUR DAN SUMATERA

I GUSTI AGUNG ARTA PUTRA

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

SURAT PERNYATAAN Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Polimorfisme Gen Penyandi Karakter Obesitas (MC4R/Reseptor Melanokortin 4) pada Monyet Ekor Panjang (Macaca Fascicularis) Asal Bali, Jawa Timur dan Sumatera adalah karya saya sendiri dengan arahan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun pada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir disertasi ini.

Bogor, 30 November 2009

I Gusti Agung Arta Putra NIM P067050011

ABSTRACT I GUSTI AGUNG ARTA PUTRA. Polymorphism of Coding Gene of Obesity Character (MC4R/Melanocortin 4 Receptor) in Cynomolgus Macaque Originated from Bali, East Java and Sumatera. Under the direction of DONDIN SAJUTHI, DEDY DURYADI SOLIHIN, and R.R. DYAH PERWITASARI Melanocortin 4 receptor (MC4R) is one of G protein-coupled receptors that plays an important role in regulation of energy homeostasis. MC4R mutations constitute the most common cause of human obesity. Since cynomolgus macaque is one of animal models, the study on adult male macaque was conducted in order to investigate the polymorphism of MC4R gene, phenotype of obesity and the association of MC4R mutation with obesity phenotype. Fifty six adult male macaques from Bali (Ubud and Uluwatu), East Java (Alas Purwo and Baluran), and Sumatera island (Palembang) were used in this research. The animals had been anaesthetized using ketamine (10 mg/kg of body weight) and xylazine (2 mg/kg of body weight) before phenotype data and blood samples were collected. The phenotype parameters measured in this study were body weight, crown rump length, body mass index; circumference of triceps, chest, waist, and thigh; skin fold thickness of abdomen, thigh, back, triceps, and dorsal neck. Blood samples were used as source of DNA. To determine MC4R polymorphism, coding region of this gene was amplified and sequenced. The results showed that there were 20 polymorphism sites identified and 13 of them are non-synonymous. Among the non-synonymous mutations, five mutations were only found in obese cynomolgus macaques; two mutations were found in both obese and non-obese macaques; and six mutations were only found in nonobese macaques. In addition, there were significant difference (P<0.05) of phenotype parameters among the study sites.

Keywords: cynomolgus macaque (Macaca fascicularis), obesity, melanocortin-4 receptor (MC4R).

RINGKASAN I GUSTI AGUNG ARTA PUTRA. Polimorfisme Gen Penyandi Karakter Obesitas (MC4R/Reseptor Melanokortin 4) pada Monyet Ekor Panjang (Macaca fascicularis) Asal Bali, Jawa Timur dan Sumatera. Dibimbing oleh DONDIN SAJUTHI, DEDY DURYADI SOLIHIN, dan R.R DYAH PERWITASARI. Obesitas pada manusia merupakan predisposisi utama untuk terjadinya penyakit terutama sindroma metabolik, diabetes melitus tipe 2 dan hipertensi. Saat ini, obesitas dianggap penyakit kompleks multifaktor yang disebabkan oleh faktor genetik dan lingkungan. Gen yang berkaitan dengan kejadian obesitas pada manusia telah diinventarisasi sebanyak 127 gen kandidat. Dari 127 gen tersebut, sebelas di antaranya bersifat monogenik sehingga apabila gen tersebut bermutasi akan menyebabkan obesitas. Dari sebelas gen yang bersifat monogenik, gen reseptor melanokortin 4 (MC4R) diwariskan secara dominan. Mutasi MC4R merupakan hal yang paling umum menyebabkan obesitas pada manusia. MC4R adalah salah satu reseptor berprotein-G yang berperan penting dalam pengaturan homeostasis energi. Reseptor ini banyak ditemukan di dalam otak dan berfungsi dalam penghantaran isyarat kekenyangan. Bila reseptor ini tidak berfungsi akan menyebabkan nafsu makan berlebihan dan dapat menyebabkan terjadinya obesitas. Monyet ekor panjang merupakan hewan model untuk penelitian yang hasilnya dimanfaatkan untuk kepentingan manusia. Monyet ekor panjang menunjukkan gejala obesitas yang mirip dengan kejadian obesitas pada manusia. Kejadian obesitas banyak dijumpai pada monyet ekor panjang jantan yang ada di kawasan wisata di Bali. Kejadian obesitas ini merupakan salah satu alasan untuk melakukan penelitian tentang polimorfisme gen MC4R pada monyet ekor panjang. Penelitian ini bertujuan untuk 1) mengidentifikasi variasi gen MC4R pada monyet ekor panjang asal Bali, Jawa Timur dan Sumatera, 2) mengkaji variasi fenotipe obesitas pada monyet ekor panjang asal Bali, Jawa Timur dan Sumatera, 3) mendapatkan asosiasi mutasi gen MC4R dengan obesitas pada monyet ekor panjang. Penelitian ini menggunakan monyet ekor panjang jantan dewasa sebanyak 56 ekor yang berasal dari Bali (Ubud dan Uluwatu), Jawa Timur (Alas Purwo dan Baluran) dan Sumatera (Palembang). Monyet asal Bali dan Jawa Timur ditangkap langsung di lokasi sedangkan monyet asal Sumatera diperoleh di penangkaran PSSP-IPB. Monyet dibius dengan ketamine (10 mg/kg bobot badan) dan xylazine (2 mg/kg bobot badan) sebelum dilakukan pengukuran data fenotipe dan pengambilan darah. Fenotipe yang diukur adalah bobot badan, tinggi duduk, indeks massa tubuh (IMT); lingkar lengan atas, dada, pinggang dan paha; serta tebal lipatan kulit di daerah perut, paha, punggung, trisep, dan leher bagian dorsal. IMT merupakan rasio bobot badan (kg) per tinggi duduk (m2). Ekstraksi DNA (deoxyribonucleic acid) total dari darah menggunakan QIAamp DNA Blood Kits. Amplifikasi daerah penyandi gen MC4R dilakukan dengan primer forward (5’–AATAACTGAGACGACTCCCTGAC–3’) dan reverse (5’– CAGAAGTAC AATATTCAGGTAGGG–3’) berdasarkan Yeo et al. (1998) dengan teknik polymerase chain reaction (PCR). Pengurutan produk PCR menggunakan ABI 3730XL sequencer (Applied Biosystem). Data fenotipe dianalisis menggunakan program Minitab 14, sedangkan data molekuler dianalisis dengan program Mega 4.0 dan Arlequin 3.11.

Berdasarkan data fenotipe, seluruh (100%) monyet ekor panjang jantan asal Bali menunjukkan obesitas (IMT>30kg/m2). Persentase obesitas monyet asal Baluran dan Alas Purwo masing-masing adalah 30% (3/10) dan 28,6% (2/7). Di lain pihak, monyet asal Palembang tidak ada yang menunjukkan obesitas. IMT yang tinggi disebabkan oleh bobot badan yang tinggi. Di Uluwatu, ditemukan monyet dengan bobot badan 16 dan 17 kg. Monyet yang mengalami obesitas (IMT>30kg/m2), sebagian besar disertai dengan lingkar pinggang yang lebih besar dari 39 cm dan tebal lipatan kulit perut lebih besar daripada 5 mm. Oleh karena itu, lingkar pinggang dan tebal lipatan kulit perut perlu dipertimbangkan dalam penentuan obesitas pada monyet ekor panjang disamping IMT. Hasil analisis urutan gen MC4R (48 urutan) menunjukkan adanya 20 situs polimorfik yang terdiri dari tujuh situs bersifat sinonim dan 13 situs bersifat nonsinonim. Situs polimorfik ditemukan paling banyak pada monyet asal Alas Purwo sedangkan yang paling sedikit ditemukan pada monyet asal Uluwatu. Dari 13 situs yang bersifat nonsinonim, lima situs ditemukan hanya pada monyet yang mengalami obesitas. Kelima mutasi tersebut adalah Asn3His, Leu250Pro, Leu300Arg, Leu 328Trp, dan Ser329Ala. Dua situs mutasi ditemukan baik pada monyet gemuk maupun monyet tidak gemuk. dan enam situs mutasi ditemukan hanya pada monyet tidak gemuk. Kejadian substitusi nukleotida yang bersifat transversi lebih besar daripada substitusi yang bersifat transisi. Hal ini diduga ada kaitannya dengan komposisi basa nukleotida dari gen MC4R. Kandungan adenina (A) dan timina (T) adalah lebih besar daripada kandungan guanina (G) dan sitosina (C). Kemungkinan substitusi transversi akan meningkat sesuai dengan peningkatan kandungan basa nukleotida A dan T. Analisis filogeni menunjukkan bahwa keseluruhan sampel berada dalam satu kelompok dan terpisah dari simpanse. Filogeni yang dibuat dari gen MC4R ternyata tidak dapat membedakan monyet yang berasal dari daerah yang berbeda. Bila dibandingkan dengan spesies lain, monyet ekor panjang satu kelompok dengan monyet dalam genus yang sama (Macaca mulatta). Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa mutasi nonsinonim MC4R terjadi baik pada monyet gemuk maupun yang tidak gemuk. Dari 48 sampel urutan, sebanyak 26 ekor monyet ekor panjang tergolong gemuk dan 22 ekor tidak gemuk. Sebanyak 11,5% monyet gemuk dan 22,7% monyet tidak gemuk merupakan pembawa mutan MC4R. Monyet gemuk asal Uluwatu dan Ubud, membawa mutasi sinonim dan nonsinonim pada gen MC4R, tetapi obesitas mungkin juga hasil gen non-MC4R atau perubahan pada bagian promoter genMC4R. Kata kunci: monyet ekor panjang (Macaca fascicularis), obesitas, reseptor melanokortin-4 (MC4R)

©Hak Cipta milik IPB, tahun 2009 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

POLIMORFISME GEN PENYANDI KARAKTER OBESITAS (MC4R/RESEPTOR MELANOKORTIN 4) PADA MONYET EKOR PANJANG (Macaca fascicularis) ASAL BALI, JAWA TIMUR DAN SUMATERA

I GUSTI AGUNG ARTA PUTRA

Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Mayor Primatologi

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

Penguji pada Ujian Tertutup : Prof. Dr. Ir. Hadi S. Alikodra, MS. Prof. Dr. Ir. Cece Sumantri, M.AgrSc.

Penguji pada Ujian Terbuka : Prof. Dr. Ir. Muladno, MSA. Prof (R). Dr. Ir. M. Bismark, MS.

PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa, karena berkat rahmat-Nya disertasi yang berjudul ” Polimorfisme Gen Penyandi Karakter Obesitas (MC4R/ Reseptor Melanokortin 4) pada Monyet Ekor Panjang (Macaca fascicularis) Asal Bali, Jawa Timur dan Sumatera” dapat diselesaikan. Selama menyelesaikan penelitian dan penulisan disertasi, penulis mendapatkan bantuan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada Prof. drh. Dondin Sajuthi, MST., Ph.D, Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA, dan Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari, M.Sc

selaku komisi pembimbing yang telah meluangkan waktu

untuk membimbing baik selama penelitian maupun penulisan disertasi ini. Ucapan terimakasih juga penulis tujukan kepada Dekan Fapet dan Rektor UNUD yang telah memberikan izin tugas belajar untuk mengikuti program doktor (S3) di Program

Studi/Mayor

Primatologi

(PRM),

Sekolah

Pascasarjana

IPB.

Terimakasih juga kepada Rektor IPB, Dekan Pascasarjana IPB, Ketua Mayor PRM serta seluruh staf pengajar dan administrasi

PRM.

Terimakasih juga

kepada tim manajemen Beasiswa Program Pascasarjana (BPPS) Dirjen Dikti Depdiknas yang memberikan dana pendidikan S3. Terimakasih juga kepada team hibah doktor IPB, Yayasan Damandiri dan APPERI atas batuannya. Penulis juga menyampaikan terimakasih kepada drh. Nengah Budiarsa (APPERI), Prof. Dr. Ir. Sri Supraptini Mansjoer, Prof. Dr. IDK Harya Putra, Prof. Dr. IB. Sudana, Prof. Dr. Ir. Hadi S. Alikodra, MS., Prof. Dr. Ir. Cece Sumantri, M.AgrSc., Prof. Dr. Ir. Muladno, MSA., Prof (R). Dr. Ir. M. Bismark, MS., Prof. Dr. Agustin Fuentes, Kelly Lane, MSc. Dr. drh. I Nengah Wandia,

drh. Aida LT

Rompis, Dr. drh. I Kt. Suatha, drh. IGd. Soma MKes, drh. I Pt. Yasa, drh. Sri Kayati Widyastuti MSi, drh I Putu Gede Yudi Arjentinia, Dr. drh. W. Batan MSi dan staf pengelola Jurnal Veteriner, Dr. drh. N. Suarsana, MSi., Muharam Saepulloh SSi., MSc., dr. Anwar Wardi SpS, M Nasir Spt., MSi., drh. Susana Widjaya, Keni Sultan SPt., MSi., Ria Oktarina SPt., MSi., Nurjayanti Spt., Yana dan teman lainnya yang tidak bisa disebutkan satu persatu. Terimakasih juga penulis sampaikan kepada Dr. drh. Joko Pamungkas, MSc., beserta staf, Dr. drh. Diah Iskandriati beserta staf,

drh. Diah Pawitri

beserta staf, drh. Prasojo Waludjo beserta staf, drh. Nyoman Sri Widiasih beserta

staf, di PSSP-IPB, Novita Anggraeni SPt., dan Ramdan di Laboratorium Biologi dan Reproduksi PSSP-IPB, Dr. Soaloon Sinaga, Dr. Fitma, Dr. Roza Elvyra, Dr. Agus Nuryanto, Dr. Agus Nasri, Dr. Jakaria, Pak Heri, Pak Pras, teman-teman Punhawacana Bali dan adik-adik di Asrama Brahmacarya Cikuray 10 Bogor. Kepada keluarga tercinta anak, istri, kakak, adik, Ibu, Bapak, dan seluruh keluarga

besar,

penulis

menyampaikan

terimakasih

pengertian, dorongan dan doanya yang tak pernah putus.

atas

pengorbanan,

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bindu (Bali) , 30 November 1962. Penulis merupakan anak ke empat dari delapan bersaudara dari pasangan I G A N Kembar dan I G A K Rai. Penulis menikah dengan AAA Alit Adiari, SH dan dikaruniai dua putri yaitu A A Angga Primantari (16 tahun) dan A A Anisca Primadwiyani (13 tahun). Pendidikan sarjana ditempuh di Fakultas Kedokteran Hewan, IPB dan lulus dokter hewan pada tahun 1988. Pada tahun 1994 penulis mendapat beasiswa dari Tim Manajemen Program Doktor (TMPD) untuk studi S2 di Program Studi Biologi, Program Pascasarjana IPB dan lulus tahun 1996. Penulis kembali mendapat beasiswa dari Beasiswa Program Pascasarjana (BPPS-DIKTI) untuk melanjutkan program doktor pada Program Studi Primatologi, perguruan tinggi yang sama.

Sampai saat ini, penulis

masih bekerja sebagai dosen pada

Fakultas Peternakan, Universitas Udayana sejak tahun 1989.

DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL .......................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR .....................................................................................

xiv

DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................

xv

PENDAHULUAN ..........................................................................................

1

Latar Belakang ..................................................................................

1

Tujuan Penelitian...............................................................................

4

Hipotesis ...........................................................................................

4

Manfaat Penelitian ............................................................................

5

Kerangka Pemikiran ..........................................................................

5

TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................

7

Monyet Ekor Panjang ........................................................................

7

Obesitas ............................................................................................

9

Melanokortin ......................................................................................

12

Reseptor Melanokortin 4 ...................................................................

14

Perubahan MC4R dan Akibatnya ............................................

15

Mutasi Gen MC4R ...................................................................

16

Klasifikasi Mutasi MC4R..........................................................

18

Mekanisme Molekuler Homeostasis Energi ......................................

20

Teknik PCR .......................................................................................

22

MATERI DAN METODE...............................................................................

24

Waktu dan Lokasi Penelitian..............................................................

24

Materi.................................................................................................

24

Monyet Ekor Panjang ...............................................................

24

Bahan dan Alat Pengambilan Sampel Darah dan Data Fenotipe ...................................................................................

25

Bahan dan Alat Isolasi DNA......................................................

25

Bahan dan Alat Analisis PCR...................................................

26

Bahan dan Alat Elektroforesis................................................... Metode...............................................................................................

26

Pengambilan Darah dan Data Fenotipe....................................

26

Ekstraksi DNA dari Darah.........................................................

27

Amplifikasi Gen MC4R.............................................................

28

Elektroforesis DNA Total dan Produk PCR..............................

29

26

Pengurutan Produk PCR..........................................................

30

Analisis Data......................................................................................

30

Analisis Data Fenotipe..............................................................

30

Analisis Data Molekuler............................................................ HASIL DAN PEMBAHASAN.......................................................................

32

Keragaman Fenotipe Obesitas Monyet Ekor Panjang.......................

34

Indeks Massa Tubuh, Bobot Badan dan Tinggi Duduk............

34

Lingkar Pinggang, Dada, Paha dan Lengan Atas....................

38

Tebal Lipatan Kulit Perut, Trisep, Paha, Punggung dan Leher.........................................................................................

34

40

Analisis Korelasi Parameter Fenotipe.......................................

43

Analisis Komponen Utama........................................................

44

Obesitas dan Struktur Sosial.................................................... Karakteristik Genetik Gen MC4R Monyet Ekor Panjang...................

46

Amplifikasi Gen MC4R.............................................................

47

Keragaman Intra Populasi........................................................

48

Keragaman Antar Populasi.......................................................

48

Komposisi Nukleotida dan Asam Amino...................................

49

Analisis Filogeni........................................................................

50

Perbandingan Gen MC4R Monyet Ekor Panjang dengan Organisme Lainnya................................................................... Polimorfisme Gen MC4R pada Monyet Ekor Panjang.............

47

55 55

Asosiasi Mutasi MC4R dengan Fenotipe Obesitas pada

57 Monyet Ekor Panjang ............................... ........................................................... 60 PEMBAHASAN UMUM................................................................................ Fenotipe Obesitas....................................................................

60

Polimorfisme MC4R..................................................................

62

Hubungan Kegiatan Konservasi dengan Monyet Gemuk........ SIMPULAN DAN SARAN...........................................................................

66

Simpulan...................................................................................

67

Saran........................................................................................

67

67

DAFTAR PUSTAKA...................................................................................

68

LAMPIRAN .................................................................................................

75

DAFTAR TABEL

1

Halaman Jumlah monyet ekor panjang jantan yang digunakan dalam penelitian ini................................................................................................. 24

2

Indeks massa tubuh, bobot badan, dan tinggi duduk.................................. 34

3

Lingkar pinggang, dada, paha dan lengan atas ........................................ 38

4

Tebal lipatan kulit perut, trisep, paha, punggung dan leher ....................... 41

5

Nilai korelasi Pearson dan nilai P antar parameter fenotipe........................ 43

6

Rata-rata jumlah nukleotida dan asam amino yang berbeda pada gen MC4R monyet ekor panjang dalam masing-masing populasi .............. 48

7

Matriks perbedaan basa nukleotida gen MC4R monyet ekor panjang antar populasi............................................................................................... 49

8

Matriks perbedaan asam amino gen MC4R monyet ekor panjang antar populasi............................................................................................... 49

9

Rata-rata komposisi nukleotida (%) pada gen MC4R monyet ekor panjang.......................................................................................................... 49

10 Rata-rata komposisi asam amino (%) gen MC4R pada monyet ekor panjang ................................................................................................ 50 11 Polimorfirme gen MC4R pada monyet ekor panjang ................................... 56 12 Jumlah substitusi transisi dan transversi pada gen MC4R monyet ekor panjang..................................................................................... 57 13 Mutasi nonsinonim daerah penyandi gen MC4R monyet ekor panjang....... 57 14 Mutasi sinonim pada gen MC4R monyet ekor panjang................................ 59

DAFTAR GAMBAR Halaman 1

Kerangka pemikiran...................................................................................... 6

2

Obesitas pada monyet ekor panjang ........................................................... 10

3

Sinyal protein G yang mengatur produksi cAMP ......................................... 13

4

Organisasi gen MC4R ................................................................................. 14

5

Kejadian mutasi MC4R pada manusia ........................................................ 17

6

Klasifikasi mutasi MC4R pada manusia ..................................................... 19

7

Hormon yang mengatur nafsu makan ........................................................ 21

8

Peta lokasi asal monyet ekor panjang yang digunakan dalam penelitian... 25

9

Lokasi pengukuran lingkar bagian tubuh dan tebal lipatan kulit................... 27

10 Rata-rata indeks massa tubuh (IMT) monyet ekor panjang.......................... 35 11 Persentase kejadian obesitas monyet ekor panjang..................................... 35 12 Rata-rata tinggi duduk (TD) monyet ekor panjang........................................ 36 13 Rata-rata bobot badan (BB) monyet ekor panjang....................................... 37 14 Rata-rata lingkar pinggang (LPi), dada (LD), paha (LPh), dan lengan atas (LTr) ............................................................................................................. 39 15 Rata-rata tebal lipatan kulit perut (TLkAb), leher (TLkLh), punggung (TLkPg), paha (TLkPh), dan trisep(TLkTr) ................................................. 42 16 Plot komponen utama pertama dan komponen utama kedua.................... 45 17 Skema letak penempelan primer MC4R foward dan MC4R reverse untuk mengamplifikasi gen MC4R monyet ekor panjang ............................ 47 18 Hasil elektroforesis beberapa produk PCR gen MC4R yang diamplifikasi menggunakan pasangan primer MC4R .................................. 47 19 Filogram antar populasi yang dibuat dengan metode Neighbor Joining (NJ) berdasarkan perbedaan nukleotida ...................................................... 51 20 Filogram antar populasi yang dibuat dengan metode NJ berdasarkan perbedaan asam amino................................................................................. 51 21 Filogram monyet ekor panjang menggunakan metode NJ dan model p distance dari nukleotida MC4R (999pb)..................................................... 52 22 Filogram monyet ekor panjang menggunakan metode NJ dan model p distance dari asam amino MC4R (332 aa) .............................................. 53 23 Filogram menggunakan metode NJ dan model p distance dari nukleotida gen MC4R (999pb) berbagai spesies primata...................... 55 24 Situs mutasi pada MC4R monyet ekor panjang............................................ 63

DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1

Penjajaran nukleotida (n=999) gen MC4R monyet ekor panjang hasil penelitian dengan urutan gen yang sama yang diperoleh dari GenBank..................................................................................................... 76

2

Penjajaran asam amino (n=332) gen MC4R monyet ekor panjang hasil penelitian dengan urutan gen yang sama yang diperoleh dari GenBank ...................................................................................................

94

3

Analisis varian parameter fenotipe obesitas monyet ekor panjang........... 101

4

Nilai eigen dan loading factor pada analisis komponen utama................. 103

5

Kejadian mutasi pada MC4R pada monyet ekor panjang.......................... 104

PENDAHULUAN Latar Belakang Saat ini, obesitas dianggap penyakit kompleks multifaktor yang disebabkan oleh interaksi faktor genetik dan lingkungan (Hill dan Peters 1998). Menurut WHO (World Health Organization 1997), obesitas merupakan salah satu dari 10 kondisi yang berisiko di seluruh dunia dan salah satu dari 5 kondisi yang berisiko di negara-negara berkembang. Obesitas merupakan predisposisi utama untuk kondisi terjadinya penyakit, terutama sindroma metabolik, diabetes melitus tipe 2 (DM tipe2) dan hipertensi.

Sindroma metabolik merupakan kelainan akibat

gangguan metabolik yang ditandai dengan hiperinsulinemia, resistensi insulin, hiperglikemia, dislipidemia aterogenik dan hipertensi. Semua gejala ini merupakan faktor risiko penting untuk penyakit kardiovaskuler. Di samping itu, obesitas dianggap mempunyai andil dalam terjadinya berbagai penyakit kanker seperti

kanker

kolon,

payudara

(pada

wanita

setelah

berhenti

haid),

endometrium, ginjal, esofagus (adenocarcinoma), lambung, pankreas, kandung kemih, dan hati (Calle dan Kaaks 2004). Pada umumnya kejadian obesitas banyak ditemukan pada usia dewasa namun demikian obesitas dapat terjadi pada usia muda (anak-anak). Kejadian yang dilaporkan WHO (2005) adalah sekitar 400 juta orang dewasa dan 20 juta anak-anak mengalami obesitas.

Pada anak-anak, ada yang dikenal dengan

sindroma MC4R (melanocortin 4 receptor) ditandai dengan peningkatan pertumbuhan, peningkatan lemak dan kepadatan mineral tulang, hiperfagia dan hiberinsulinemia, yang akhirnya menyebabkan obesitas (Farooqi et al. 2000). Hewan model (tikus dan monyet ekor panjang) juga menunjukkan gejala obesitas yang mirip dengan manusia. Pada monyet ekor panjang, obesitas terjadi pada monyet dewasa baik pada jantan maupun betina (Putra et al. 2006) Walaupun demikian, monyet ekor panjang jantan pradewasa juga ada yang menunjukkan gejala obesitas. Secara fenotipik, obesitas dapat dilihat antara lain dari IMT (indeks massa tubuh) yang ditentukan oleh bobot badan dan tinggi duduk, dan timbunan lemak di daerah perut yang ditunjukkan oleh tebal lipatan kulit. Monyet ekor panjang mempunyai kemiripan pola obesitas dengan manusia yang ditunjukkan dengan adanya penimbunan lemak di sekitar perut. Pada monyet gemuk, timbunan lemak di daerah perut dapat dilihat dari adanya lipatan kulit yang menggantung bila monyet tersebut berdiri atau berjalan. Timbunan

2 lemak ini juga dapat dilihat jelas bila monyet dalam keadaan duduk. Pada posisi ini, perut monyet kelihatan buncit sebagai akibat dari adanya timbunan lemak tersebut. Keadaan obesitas pada monyet ekor panjang banyak dijumpai pada monyet-monyet yang hidup di kawasan wisata di Bali.

Monyet-monyet ini

menunjukkan tanda-tanda obesitas dengan IMT sampai 61.57 kg/m2 pada jantan dan 60.07 kg/m2 pada betina (Putra et al. 2006). IMT ini jauh lebih tinggi dibandingkan dengan IMT normal pada manusia yaitu 18.5-24.9 kg/m2 (WHO 2005). Lebih jauh, dinyatakan bahwa 100% monyet jantan yang ada di Uluwatu mengalami obesitas, sedangkan kejadian obesitas di daerah lainnya seperti Sangeh, Alas Kedaton, Ubud, Pulaki, dan Bukit Gumang adalah bervariasi antara 12-75%. Kejadian obesitas ini tidak pernah ditemukan pada monyet anakan dan remaja. Padahal obesitas pada manusia dapat terjadi baik pada bayi, anakanak, remaja maupun dewasa. Gen yang berkaitan langsung maupun tidak langsung dengan kejadian obesitas pada manusia telah diinventarisasi ada sebanyak 127 gen kandidat. Dari 127 gen tersebut, sebelas diantaranya bersifat monogenik sehingga apabila gen tersebut mengalami mutasi akan berakibat langsung pada timbulnya obesitas (Rankinen et al. 2006). Mutasi pada gen tersebut berupa substitusi, delesi, dan insersi. Hal ini telah dilaporkan terjadi pada gen MC4R. Lebih jauh dinyatakan bahwa kejadian obesitas pada manusia akibat dari mutasi MC4R (monogen) ini diwariskan secara dominan (Dubern et al. 2001; Challis dan Yeo 2002) walaupun prevalensi kejadiannya hanya berkisar antara 4-6% dari individu yang mengalami obesitas (Lubrano-Berthelier et al. 2003). Individu lain yang tidak mengalami mutasi pada gen MC4R tetapi secara fenotipik individu tersebut gemuk maka diduga kejadian tersebut berasal dari pengaruh kandidat gen lain yang berkontribusi pada obesitas (Mutch dan Clément 2006).

Hal tersebut

pernah dilaporkan pada tikus yang menunjukkan obesitas akibat terjadinya mutasi pada gen LEPR (leptin receptor) padahal gen MC4Rnya tidak mengalami mutasi (Pomp 1999). MC4R adalah satu dari lima reseptor berprotein-G yang mengikat melanokortin berperan mengatur perilaku makan dan homeostasis energi. Gen MC4R pada manusia telah diurut secara penuh oleh Kopatz et al. (2003) dan urutan urutannya telah dilaporkan dan dicatat dalam GenBank (NCBI=National Center for Biotechnology Information) dengan kode akses AY236539. Gen ini

3 diketahui pertamakali oleh Yeo et al. (1998) sebagai gen yang berkontribusi atau mempunyai asosiasi dengan obesitas akibat mutasi pada gen tersebut.

Tao

(2005) melaporkan lebih dari 70 jenis mutasi MC4R pada manusia yang menyebabkan berkurang sampai hilangnya fungsi MC4R.

Bila MC4R tidak

berfungsi maka tidak ada pengisyaratan kekenyangan pada otak sehingga terjadi peningkatan asupan pakan.

Peningkatan nafsu makan yang tidak disertai

dengan peningkatan penggunaan energi menyebabkan terjadinya penimbunan energi dan mengarah pada obesitas. Para peneliti telah banyak menggunakan primata

nonmanusia sebagai

model penelitian untuk mengetahui hubungan antara obesitas dengan penyakit metabolik (Banks et al. 2003). Penelitian obesitas pada primata nonmanusia dilakukan baik dengan memanipulasi dietnya (Astuti et al. 2007) maupun dengan cara mengontrol aktivitas fisik dalam kandang individu (Hansen 2001). Pada penelitian model obesitas secara alami pada kelompok monyet rhesus yang hidup bebas di Pulau Cayo Santiago,

didapatkan terjadinya obesitas pada

populasinya sebanyak 7% (Schwartz et al. 1993). Belakangan ini, pada baboon dewasa liar telah menunjukkan kejadian yang mirip sindroma metabolik yaitu adanya peningkatan kadar leptin dalam serum darah, obesitas, hiperlipidemia dan resistensi insulin (Banks et al. 2003). Walaupun dalam penelitian sebelumnya lebih banyak menggunakan rodensia sebagai hewan model untuk penelitian tentang obesitas, saat ini monyet ekor panjang telah digunakan sebagai hewan model penelitian yang berkaitan dengan obesitas (Chen et al. 2003). Banyak kesamaan fisiologi antara manusia dan monyet ekor panjang yang menyebabkan monyet ekor panjang merupakan hewan model obesitas yang lebih realistik dibandingkan spesies lain seperti rodensia. Berdasar pada urutan gen MC4R yang telah diteliti oleh Kopatz et al. (2003) dapat dibandingkan baik asam amino maupun nukleotida dari gen MC4R manusia dengan monyet ekor panjang. Data MC4R monyet ekor panjang yang didapatkan oleh Kusuda et al. (2002) dan tercatat di GenBank (NCBI) dengan kode akses AB083317) menunjukkan kemiripan susunan asam amino (dari total 332 asam amino) dengan MC4R pada manusia yaitu sebesar 98.5%. Sedangkan, MC4R tikus (kode akses NC_000084) mempunyai kesamaan 93.4% dengan MC4R manusia. Studi obesitas pada manusia bukan hal yang mudah karena pengaruh dari faktor-faktor yang berkaitan dengan obesitas itu sendiri seperti heterogenitas,

4 serta interaksi gen-gen dan gen-lingkungan yang tak terkendali. Di samping itu, karena alasan etika, penggunaan teknik invasif pada manusia untuk mengukur ekspresi gen di dalam hipotalamus tidak dapat dilakukan. Oleh karena itu, penggunaan hewan model merupakan suatu keharusan. Penggunaan hewan model

dalam

penelitian

penyakit

manusia

memberi

keuntungan

untuk

mengungkap sifat (trait) yang heterogen dan poligen. Penjelasan tentang gen yang menyebabkan obesitas pada hewan model memberikan pengertian

pada mekanisme molekuler yang mengatur proses

fisiologi seperti keseimbangan energi. Seperti telah diungkapkan di atas, mutasi MC4R pada manusia menunjukkan asosiasi dengan obesitas.

Pada hewan,

seperti babi, adanya mutasi gen MC4R menyebabkan peningkatan ketebalan lemak punggung (Kim et al. 2000). Demikian juga pada tikus, bila gen MC4R ini ditiadakan (knock out) maka tikus akan mengalami obesitas (Huszar et al. 1997). Penelitian mengenai mutasi gen yang terkait dengan obesitas (MC4R) pada monyet ekor panjang belum pernah dilakukan walaupun monyet ekor panjang menunjukkan pola obesitas yang mirip dengan manusia. Untuk itu, perlu dilakukan penelitian polimorfisme gen MC4R pada monyet ekor panjang untuk menunjang pengembangan monyet ekor panjang sebagai hewan model obesitas pada manusia. Polimorfisme gen yang berkaitan dengan obesitas pada monyet ekor panjang dapat memperjelas mekanisme obesitas di tingkat molekuler yang dapat dimanfaatkan sebagai hewan model bagi manusia. Tujuan Penelitian 1. Mengidentifikasi variasi gen (MC4R) yang berhubungan dengan obesitas pada monyet ekor panjang di Bali, Jawa Timur dan Sumatera. 2. Mengkaji variasi fenotipe obesitas pada monyet ekor panjang di Bali, Jawa Timur dan Sumatera. 3. Mendapatkan asosiasi mutasi gen MC4R dengan obesitas monyet ekor panjang Hipotesis 1. Ada variasi fenotipe pada monyet ekor panjang gemuk. 2. Ada mutasi gen MC4R pada monyet ekor panjang. 3. Ada asosiasi mutasi pada gen MC4R dengan obesitas

5 Manfaat Penelitian 1. Memberikan informasi tentang mutasi gen MC4R pada monyet ekor panjang 2. Sebagai data dasar untuk penelitian obesitas pada manusia. 3. Memberikan gambaran gen yang ikut terlibat dalam obesitas hewan model. 4. Pengembangan penanda genetik obesitas Kerangka Pemikiran Saat ini, obesitas pada

manusia dianggap sebagai penyakit multi

kompleks dan merupakan predisposisi penyakit diabetes, kardiovaskuler dan kanker. Obesitas disebabkan oleh faktor genetik dan lingkungan atau interkasi kedua faktor tersebut. Adanya mutasi pada gen MC4R dianggap berperan dalam terjadinya obesitas.

Sementara itu pada hewan model, misalnya tikus, yang

dihilangkan (knock out) gen MC4Rnya menunjukkan gejala obesitas. Sebagai hewan model, monyet ekor panjang banyak dipakai dalam penelitian biomedis baik

sebagai

model

penyakit

maupun

untuk

pengujian

obat

sebelum

diaplikasikan pada manusia karena monyet ekor panjang memiliki kemiripan dengan manusia. Di samping itu, hewan ini juga dapat

menunjukkan gejala

obesitas. Kejadian obesitas pada hewan ini banyak ditemukan di Bali terutama monyet ekor panjang yang hidup di daerah pariwisata. Walaupun demikian, penelitian tentang variasi gen terkait dengan obesitas pada monyet ekor panjang belum pernah dilakukan. Hal ini sangat penting untuk diteliti apakah kejadian mutasi gen MC4R yang terkait obesitas pada manusia juga terjadi pada monyet ekor panjang yang mengalami obesitas. Lingkungan, habitat, dan pengelolaan yang berbeda dapat menyebabkan perbedaan fenotipe obesitas. Hal ini berkaitan dengan

ketersediaan pakan bagi monyet ekor panjang.

Untuk itu, perlu

dilakukan pendekatan genotipe dan fenotipe obesitas monyet ekor panjang yang berasal dari berbagai lokasi sehingga diperoleh gambaran obesitas pada monyet ekor panjang. Di samping itu, penelitian ini membuka peluang untuk pengembangan marka genetik obesitas pada monyet ekor panjang. Skema kerangka pemikiran disajikan pada Gambar 1.

6

Gambar 1 Kerangka pemikiran

TINJAUAN PUSTAKA Monyet Ekor Panjang Monyet ekor panjang termasuk kelompok monyet dunia lama (Old World monkey) dan diklasifikasikan sebagai berikut (Wilson dan Reeder 2005): Kelas

: Mammalia

Ordo

: Primates

Subordo

: Haplorrhini

Infraordo

: Simiiformis

Superfamili : Cercopithecoidea Famili

: Cercopithecidae

Subfamili

: Cercopithecinae

Genus

: Macaca

Spesies

: Macaca fascicularis (Raffles, 1821).

Monyet ekor panjang sering disebut juga crab-eating macaque atau cynomolgus macaque. Lebih jauh, dinyatakan bahwa monyet ekor panjang terdiri atas 10 subspesies yaitu: M. f. fascicularis, M. f. aurea, M. f. umbrosa, M. f. atriceps, M. f. condorensis, M. f. fusca, M. f. lasiae, M. f. tua, M. f. karimondjawae, dan M. f. philippinensis. Di lain pihak, Supriatna dan Wahyono (2000) melaporkan ada empat subspesies monyet ekor panjang di Indonesia, yaitu M. f. fascicularis, (Pulau Sumatera, Kalimantan, Jawa, Bali, Lombok, Sumbawa, Flores, Sumba dan Timor), M. f. fusca (Pulau Simaleu, Sumatera), M. f. karimondjawae (Pulau Karimunjawa, Jawa Tengah), dan M. f. lasiae (Pulau Lasia). Monyet ekor panjang menyebar di Asia Tenggara (termasuk Burma bagian Selatan), Thailand bagian Timur, Kamboja, Laos bagian Selatan, Vietnam, dan Malaysia. Di samping itu, monyet ekor panjang telah diintroduksi ke beberapa lokasi antara lain: Hong Kong, Papua dan Tinjil di Indonesia, Pulau Angaur di Palau, dan Mauritius (Kemp dan Burnett 2003). Di Indonesia, monyet ini ditemukan di Pulau Sumatera, kepulauan Lingga dan Riau, Bangka, Belitung, Banyak, Batu; Kalimantan dan pulau di sekitarnya; kepulauan Karimata, kepulauan Anabas, kepulauan Tambelan, Natuna, Pulau Simalur, Pulau Nias, Pulau Jawa, Pulau Bali, Pulau Lombok, Pulau Matasari, Pulau Bawean, Maratua, Timor, Sumba, Sumbawa dan Flores (Supriatna dan Wahyono 2000). Habitat monyet ekor panjang adalah di daerah tepian sungai, danau, sepanjang pantai

8 dan hutan sekunder. Hutan tropis Indonesia mempunyai kerapatan primata yang tinggi. Alikodra (2002) menyatakan bahwa daya hidup, natalitas dan mortalitas sangat berkaitan dengan kondisi habitat primata. Tingkat ketersediaan pakan juga mempengaruhi penyebaran, kerapatan, dan gerakan-gerakan musiman. Kegiatan konservasi yang berkaitan dengan monyet ekor panjang telah diungkapkan oleh Ong dan Richardson (2008). Spesies ini dimasukkan ke dalam apendiks II CITES (Convention on International Trade in Endangered Species). Di samping itu, spesies ini terdaftar pada Schedule I, Part I, Indian Wildlife (Protection) Act, 1972-2002, dan Schedule III, Bangladesh Wildlife (Protection) Act A 1974.

Monyet ekor panjang merupakan spesies yang dilindungi di

Myanmar. Di samping itu, monyet ini juga dilindungi dengan Dekrit 32, Apendiks 2B di Viet Nam. Monyet ekor panjang berjalan dengan empat kaki (quadrupedalism), memiliki ekor yang lebih panjang dari panjang kepala dan badan, serta memiliki bantalan duduk (ischial callosity) yang melekat pada tulang duduk. Monyet ini menunjukkan perbedaaan antara jantan dan betina (sexual dimorphism). Bobot badan, panjang kepala dan badan, dan panjang ekor pada yang jantan masingmasing adalah 4.7-8.3 kg, 412-648 mm, dan 435-655 mm, sedangkan pada yang betina masing-masing adalah 2.5-5.7 kg, 385-503 mm, dan 400-550 mm (Rowe 1996).

Putra et al. (2006) mendapatkan bahwa bobot badan monyet ekor

panjang jantan bervariasi antara 3-12 kg, sedangkan yang betina berkisar antara 3-10 kg.

Warna tubuhnya bervariasi mulai dari abu-abu sampai kecoklatan

dengan bagian ventral putih, sedangkan anak yang baru lahir warna rambutnya hitam (Supriatna dan Wahyono 2000). Monyet ekor panjang hidup dalam kelompok yang terdiri dari banyak jantan dan banyak betina. Jumlah anggota kelompoknya berkisar antara 10 sampai lebih dari 100 ekor, namun ukuran kelompok biasanya antara 20 dan 50 ekor (Fuentes 2007).

Di dalam kelompok, betina dewasa biasanya lebih banyak

daripada jantan dewasa dan aktivitas sosialnya berputar di antara kelompok betina yang berhubungan (Berkovitch dan Huffman 1999). Monyet ekor panjang umumnya memakan segalanya, namun mereka lebih memilih buah-buahan. Mereka juga memakan daun dan serangga. Di samping itu, monyet ekor panjang juga mengonsumsi dan merusak tanamam pertanian (Kemp dan Burnett 2003). Di Bali, monyet ekor panjang yang hidup di sekitar pura dan lokasi wisata sering makan sisa persembahan yang dilakukan umat

9 Hindu di samping makanan yang diberikan oleh pengelola, dan pengunjung (Putra et al. 2001). Makanan ini sering berlebih jumlahnya sehingga tidak jarang monyet yang ada di daerah tersebut mengalami obesitas. Obesitas Obesitas merupakan kejadian kelebihan timbunan lemak sebagai akibat dari ketidakseimbangan pemasukan dan penggunaan energi. Asupan makanan semakin meningkat karena ketersediaan makanan yang semakin banyak, dan mudah didapat, sedangkan aktivitas fisik semakin

berkurang.

Hal ini

mengakibatkan energi yang masuk lebih besar daripada energi yang digunakan, yang pada giliranya menyebabkan obesitas (Chen et al. 2000).

Secara

sederhana, obesitas dapat dilihat dari penampilan luar seperti perut yang membesar akibat dari timbunan lemak subkutan. Di samping itu, obesitas dapat ditentukan dengan menghitung IMT. Pada manusia, IMT ditentukan dengan perbandingan bobot badan (kg) dan tinggi badan kuadrat (m2) sedangkan pada monyet, IMT dihitung berdasarkan bobot badan dan tinggi duduk (panjang dari bagian tertinggi kepala sampai pangkal ekor/crown rump length).

IMT yang sama atau lebih besar dari 30

digolongkan ke dalam obesitas (WHO 2005). Obesitas ditentukan oleh faktor gen dan lingkungan (Hill dan Peters 1998). Faktor genetik sangat terlibat dalam akumulasi jaringan lemak perut (Bouchard et al. 1990). Lebih lanjut dinyatakan bahwa obesitas melibatkan multi gen, lingkungan, dan

interaksi antara kedua faktor tersebut.

Ada 244 gen, bila

mengalami mutasi atau diekspresikan sebagai transgen pada tikus, yang berpengaruh pada bobot badan dan adiposit (Rankinen et al. 2006). Seperti halnya manusia, primata nonmanusia

juga menunjukkan gejala

obesitas spontan pada populasi yang makanannya tersedia dalam jumlah yang banyak. Obesitas juga dapat terjadi pada monyet yang digunakan sebagai hewan model dan dipelihara di laboratorium dalam kandang yang ukurannya terbatas (Chen et al. 2000). Ukuran kandang yang terbatas akan mengurangi aktivitas dari monyet tersebut. Monyet ekor panjang yang ada di daerah pariwisata di Bali banyak yang menunjukkan gejala obesitas (Gambar 2) karena banyaknya pakan baik yang diberikan oleh pengunjung maupun pengelola.

10

Gambar 2 Obesitas pada monyet ekor panjang

Hotta et al. (1996) melakukan penelitian lebih lanjut pada monyet rhesus. Mereka meneliti kaitan antara gen gemuk (ob gen) dengan bobot badan. Mereka menemukan bahwa ada hubungan antara kadar ob mRNA dengan bobot badan. Mereka juga menemukan hubungan yang signifikan antara ob mRNA dengan insulin puasa, walaupun stimulasi insulin selama 100-140 menit,

euglikemia/

hiperinsulinemia tidak menyebabkan perubahan pada kadar ob mRNA. Kadar ob gen yang menghasilkan leptin juga berkaitan secara signifikan dengan bobot badan. Jadi, ekspresi gen ob berkaitan dengan bobot badan dan tidak secara akut diatur oleh insulin. Eisner et al. (2003) menemukan bahwa depot lemak intra-abdominal dan abdominal total meningkat pada monyet rhesus betina dewasa yang terkena kelebihan androgen saat prenatal. Hasil penelitian ini menunjukkan perubahan pada adipositas abdominal sebagai konsekuensi lain kelebihan androgen prenatal terhadap gangguan sekresi insulin yang diamati pada hewan ini pada saat dewasa. Selanjutnya, Angeloni et al. (2004) melakukan penelitian tentang karakterisasi gen ghrelin pada monyet rhesus. Ghrelin merupakan hormon yang

11 dihasilkan oleh saluran pencernaan.

Mereka mengatakan bahwa ghrelin

merangsang penglepasan growth hormone (GH) dari hipofisa, merangsang nafsu makan, dan mempengaruhi proses metabolik pada jaringan lain yang mempunyai reseptor GH. Dengan demikian ghrelin dapat mempengaruhi tingkah laku dan jalur endokrin yang berperan dalam pertambahan bobot badan. Kadar grelin dipengaruhi oleh faktor umur dan adipositas pada monyet rhesus. Tigno et al. (2004) mengamati hubungan perubahan parameter metabolik dengan umur pada monyet rhesus.

Mereka menemukan bahwa laju

penghilangan glukosa, laju sensitivitas insulin dan kadar HDL (high density lipoprotein) berubah secara signifikan pada kelompok yang tidak menderita diabetes dengan umur yang berbeda.

Pada kelompok monyet rhesus yang

menderita diabetes, penurunan toleransi glukosa terlihat pada umur pertengahan (14th), dan ditemukan ada peningkatan insulin puasa sebelum menderita diabetes, dan kemudian menurun dengan bertambahnya umur. Peneliti lainnya, seperti Takahashi et al. (2006) melakukan penelitian pada monyet Jepang (M. fuscata). M. fuscata gemuk di Wakasa tidak mengalami kelainan/penyakit yang berkaitan dengan obesitas seperti diabetes.

Dalam

kelompok Wakasa, frekuensi gemuk tinggi dalam garis maternal. Hal ini menunjukkan bahwa faktor genetik obesitas dapat diwariskan melalui garis ini. Penelitian genetika juga dilakukan oleh Comuzzie et al. (2003) pada baboon (genus Papio).

Mereka menemukan bahwa pola akumulasi jaringan

lemak mirip dengan yang terjadi pada manusia. Lebih jauh, dikatakan bahwa ada pewarisan genetik pada fenotipe yang berkaitan dengan obesitas. Chen et al. (2002) melakukan penelitian tentang hubungan antara bobot badan dengan parameter biokimia serum dan hematologi pada monyet ekor panjang betina. Mereka mengatakan bahwa obesitas adalah faktor risiko yang memicu berbagai penyakit metabolik. Monyet ekor panjang (M. fascicularis) menunjukkan obesitas yang spontan pada saat dewasa dan hal ini mirip dengan manusia. Untuk menjelaskan

karakter yang berkaitan dengan obesitas pada

monyet ekor panjang betina, mereka menggunakan analisis regresi sederhana dan berganda untuk menentukan hubungan antara bobot badan dan parameter biokimia serum dan hematologi seperti hormon yang berkaitan dengan obesitas (leptin dan insulin). Analisis regresi sederhana menunjukkan bahwa bobot badan secara nyata

berhubungan dengan

kadar leptin, insulin, konsentrasi

hemoglobin, nilai hematokrit, mean corpuscular volume (MCV), konsentrasi

12 glukosa dan konsentrasi trigliserida. Di samping itu, model regresi berganda yang mengandung kadar leptin, insulin, MCV, dan eritrosit menjelaskan 66.9% keragaman dalam bobot badan. Oleh karena itu, monyet ekor panjang betina menunjukkan karakter obesitas yang mirip dengan manusia, yaitu obesitas berkaitan dengan meningkatnya sintesis dan ekskresi leptin oleh adiposit, berisiko tinggi menderita diabetes melitus, dan kadar hematosit yang tinggi. Lebih lanjut, Chen et al. (2003) mengatakan bahwa leptin berkorelasi positif dengan insulin dan persentase lemak sedangkan adiponektin berkorelasi negatif baik pada M. fascicularis jantan dan betina.

Mereka mencoba untuk

menunjukkan bahwa rasio leptin dan adiponektin (L/A) merupakan indeks yang potensial untuk menentukan obesitas pada monyet ini.

Mereka menemukan

bahwa rasio leptin dan adiponektin secara nyata meningkat pada monyet yang persentase lemaknya melebihi 40%. Melanokortin Melanokortin (hormon adrenokortikotropik dan a, ß, ?-MSH) berasal dari prekursor protein pro-opiomelanokortin (POMC) Hormon ini bekerja melalui pasangan protein G dengan merangsang adenilat siklase (Mountjoy et al. 1992). Melanokortin memiliki aksi fisiologi yang luas termasuk penglepasan agen neurohormonal seperti hormon prolaktin dan hormon pelutein/luteinizing hormone (Ellerkmann

et al. 1992), mengatur sistem kardiovaskuler (Li et al. 1996),

obesitas (Fan et al. 1997), pewarnaan pigmen melanosit, termoregulasi, memori, pembelajaran, tingkah laku, rasa sakit/analgesia, dan amina biogen, efek imunomodulator, sifat neurotropik dan terlibat pada proses kelahiran (Blondet et al. 2005) Peptida yang dihasilkan oleh gen POMC berperan dalam proses fisiologi seperti steroidogenesis adrenal, pigmentasi kulit, analgesia dan inflamasi. Pada saat ini, ditemukannya bukti pada tikus dan manusia bahwa sinyal melanokortin berperan pada neuron hipotalamus yang mengekspresikan POMC dalam mengatur nafsu makan dan bobot badan (Yeo et al. 2000) Gen POMC diekspresikan dalam nukleus arcuata hipotalamus dan nucleus tractus solitarius (Yeo et al. 2000). Di samping itu, gen POMC diekspresikan secara fisiologi di dalam sejumlah jaringan seperti hipofisa anterior dan intermedia, kulit, dan sistem kekebalan. (POMC)

pecah

menjadi

sejumlah

Pada jaringan ini, peptida prekursor peptida

yang

lebih

kecil

seperti

13 adrenokortikotropin (ACTH), ß-endorfin dan a, ß, ?-MSH. Kumpulan produk yang berasal dari POMC ditentukan oleh jaringan dengan kekhasan endoprotease (konvertase) yang diekspresikan dalam jalur sekresi.

Dengan demikian,

kortikotrof hipofisa anterior mengekspresikan prohormon konvertase-1 (PC1) dan memecah POMC menjadi ACTH, sementara melanotrof dalam lobus intermedia (pada hewan yang lebih rendah) mengekspresikan prohormon konvertase-2 (PC2) dan memecah ACTH menjadi a-MSH. Jadi, ACTH yang disekresikan oleh hipofisa anterior merupakan pengendali utama dari steroidogenesis adrenal. Pada amfibia dan rodensia, a-MSH dari lobus intermedia hipofisa terlibat dalam pengaturan warna kulit dan rambut. Mamalia juga mengekspresikan

POMC

dalam kulit, dan secara lokal menskresi a, ß, ?-MSH, ACTH dan ß-endorfin, walaupun fungsi fisiologinya tidak diketahui.

Kepentingan peptida ini pada

pigmentasi manusia ditunjukkan dengan hubungan varian reseptor melanokortin1 manusia dengan rambut merah dan kulit putih (Yeo et al. 2000). Mekanisme kerja melanokortin adalah dengan cara mengaktifkan reseptor melanokortin (MCR) yang selanjutnya mengaktifkan protein G.

Sub unit a

protein G mengikat guanosin trifosfat (GTP) dan mengalami pemisahan yang kemudian berikatan dengan enzim adenilat siklase. Adenilat siklase aktif akan mengkatalisis perubahan ATP menjadi cAMP dan fosfat. proses

ini

menyebabkan

peningkatan

produksi

cAMP

Dengan demikian, (cyclic

adenosin

monophosphate) di dalam sel. Selanjutnya, cAMP ini akan mengaktifkan molekul lain seperti protein kinase A (Gambar 3). sinyal hormon

ekstrasel adenilat siklase (AC)

membran plasma

GPCR

a

?

GDP

GTP

ß

GDP

? ß

aa

GTP GTP

AC

sitosol/ intrasel

ATP cAMP + PPi

Gambar 3 Sinyal protein G yang mengatur produksi cAMP (Diwan 2007)

14 Reseptor Melanokortin 4 Reseptor melanokortin 4

(MC4R) disandi oleh gen MC4R.

MC4R

merupakan gen berekson tunggal dengan 999 pasang basa yang menyandi 332 asam amino. Organisasi gen MC4R disajikan dalam Gambar 4. Pada manusia, gen ini terletak di dalam kromosom 18q22 (Gantz et al. 1993), demikian juga halnya pada tikus dan primata. Namun pada anjing, burung dan sapi, gen ini masing-masing terletak pada kromosom 1, 2, dan 24. Gen yang sama pada tikus mempunyai kesamaan (93%) dengan gen manusia (Alvaro et al. 1996). Sedangkan kesamaan gen MC4R antara manusia dan monyet ekor panjang adalah 98.5%. Hal ini menunjukkan bahwa gen ini sangat kekal (conserved) pada mamalia.

Ekson 999pb 5’

3’

Gambar 4 Organisasi gen MC4R

MC4R merupakan gen yang paling erat hubungannya dengan bobot badan (Yeo et al. 2000). Peran utama MC4R dalam mengatur bobot badan ditunjukkan pertamakali pada hewan pengerat (rodensia). Kenyataan bahwa reseptor ini mengatur asupan pakan dan penggunaan energi didasarkan pada gen target pada mencit yang menyebabkan obesitas dan disertai hiperfagia (makan berlebihan), hiperinsulinemia (kadar insulin darah meningkat), dan hiperglikemia (gula darah meningkat) (Huszar et al. 1997). MC4R adalah pasangan protein G, reseptor transmembran-7 yang banyak diekspresikan di hipotalamus yaitu bagian otak yang terlibat dalam pengaturan nafsu makan (Mountjoy et al. 1994). Ekspresi gen ini pada manusia ternyata dikontrol oleh beberapa anggota faktor transkripsi Sp/specific protein (Blondet et al. 2005).

Pengisyaratan MC4R diatur

oleh agonis a-MSH endogen dan

antagonis AGRP (Schwartz et al. 2000).

Perkembangan selanjutnya

menunjukkan bahwa selain a-MSH, ada peptida turunan POMC yang berfungsi sebagai agonis MC4R (Nickolls et al. 2003). MC4R ditemukan terutama di dalam otak dengan analisis Northern blot dan teknik hibridisasi in situ (Gantz et al. 1993). Sebaran reseptor ini di dalam otak

15 lebih luas dari sebaran MC3R dan meliputi korteks, talamus, hipotalamus, batang otak, dan medula spinalis.

Namun, MC4R tidak ditemukan pada sel perifer.

Sebaran MC4R ini konsisten dengan keterlibatannya dalam fungsi otonom dan neuroendokrin. Perubahan MC4R dan Akibatnya Pengaruh MC4R pada obesitas manusia telah dipelajari sejak 1997. Hubungan obesitas (IMT, massa lemak, %lemak) dengan MC4R dideteksi dalam studi keluarga orang Kanada (Chagnon et al. 1997). Variasi missense V103I (perubahan asam amino valina pada posisi 103 menjadi isoleusina) pertama kali ditemukan pada laki-laki Inggris (Gotoda et al. 1997) tetapi tidak ada asosiasi (hubungan) dengan obesitas. Penggantian asam amino isoleusina pada posisi 137 menjadi treonina (I137T) menyebabkan gangguan fungsi reseptor dan berhubungan dengan obesitas. Perubahan (mutasi) reseptor ini berhubungan dengan obesitas dan ternyata kejadian ini dapat diwariskan. Bukti mengesankan pertama kali bahwa obesitas manusia diwariskan secara dominan dan berhubungan dengan mutasi gen MC4R dilaporkan pada tahun 1998 (Yeo et al. 1998).

Pewarisan (h2)

karakter obesitas seperti IMT pada baboon dapat mencapai 0.46 sedangkan pada manusia bervariasi antara 0.26-0.54 (Cai 2004). Mutasi gen ini pada hewan juga menyebabkan adanya perubahan fenotipe. Mutasi gen MC4R pada babi juga dinyatakan berhubungan dengan ketebalan lemak punggung (Kim et al. 2000). Demikian juga SNP (Single Nucleotide Polymorphism) pada daerah penyandi gen MC4R sapi dilaporkan merupakan hal yang khas terjadi pada jenis (breed) sapi tertentu (Haegeman et al. 2001). Mencit yang kekurangan MC4R homosigot tidak berespon terhadap efek anoreksia dari a-MSH. Hal ini menunjukkan bahwa a-MSH menghambat asupan pakan melalui pengaktifan MC4R. Mencit yang kekurangan MC4R meningkatkan efisiensi kalori, yang mirip dengan kejadian yang diamati pada mencit dengan sindroma obesitas agoti dan tanpa MC3R.

Di samping itu, mencit yang

kekurangan MC3R dan MC4R secara signifikan lebih berat daripada yang hanya kekurangan MC4R.

Hal ini menunjukkan bahwa kedua reseptor tersebut

berfungsi mengatur homeostasis energi. Lebih jauh, disebutkan bahwa mencit yang kehilangan

kedua alel MC4Rnya menunjukkan gejala sangat

gemuk,

16 sedangkan yang hanya kehilangan satu alel saja (heterosigot)

menunjukkan

gejala obesitas sedang (Huszar et al. 1997). Kepentingan MC4R dalam pengaturan bobot badan manusia pertama kali muncul pada tahun 1998, ketika ditemukan bahwa mutasi frameshift heterosigot dalam MC4R sebagai penyebab dominan obesitas (Yeo et al.

1998).

Selanjutnya dilaporkan bahwa ada asosiasi antara varian mutan MC4R dan obesitas (Hinney at al. 1999). Mutasi ini merupakan kerusakan monogen yang paling umum diketahui sebagai penyebab obesitas pada manusia (Farooqi et al. 2000) dan dilaporkan mencapai 4-6% dari individu gemuk (Lubrano-Berthelier et al. 2003). Saat ini, mutasi MC4R dianggap memberikan pengaruh utama pada obesitas (Hinney et al. 2003). Mutasi yang ditemukan pada MC4R adalah mutasi frameshift (Yeo et al. 1998), nonsense

(Hinney et al. 1999) dan missense

(Gotoda et al. 1997). Mutasi Gen MC4R Walaupun heritabilitas IMT cukup tinggi, mutasi yang menyebabkan keadaan sangat gemuk telah ditemukan hanya dalam satu gen, yaitu gen MC4R yang menyandi reseptor melanokortin 4.

Reseptor ini berhubungan dengan

sinyal oreksigenik (nafsu makan) dan anoreksigenik di dalam hipotalamus dan tempat lain di dalam sistem saraf pusat untuk mengatur asupan pakan dan penggunaan energi. Gen MC4R hanya terdiri dari satu ekson dan dapat diterima untuk analisis mutasi yang tersedia secara klinik. Yeo et al. (1998) pertama kali melaporkan bahwa mutasi frameshift MC4R heterozigot berhubungan dengan keadaan sangat gemuk. Sejak saat itu, lebih dari 70 mutasi dilaporkan pada berbagai studi populasi dan kebanyakan dengan keadaan sangat gemuk. Temuan tersebut meliputi keadaan hiperfagia (makan berlebihan), percepatan pertumbuhan pada anak-anak (walaupun tinggi badan akhir tampak normal), peningkatan kepadatan tulang yang umum dijumpai dalam keadaan obesitas. Individu dengan mutasi MC4R homozigot lebih gemuk daripada saudaranya yang heterozigot. Hal ini menunjukkan bahwa cara pewarisannya bersifat kodominan. Sampai saat ini, mutasi yang dilaporkan terjadi adalah dalam bentuk nonsinonim (n=57), nonsense (n=5), dan frameshift (n=10) yang ditemukan pada 140 dari 6134 orang yang sangat gemuk dalam berbagai sampel penelitian (Hinney et al. 2006). Prevalensi mutasi MC4R yang bersifat patogen dalam populasi tersebut

17 bervariasi antara 0.5-5.8% (Kublaoui dan Zinn 2006). Posisi mutasi MC4R pada manusia disajikan dalam Gambar 5.

luar sel membran plasma

sitosol

Gambar 5 Kejadian mutasi MC4R pada manusia (Tao 2005) Mutasi merupakan perubahan yang terjadi pada urutan DNA (deoxyribo nucleic acid). Urutan DNA biasanya disalin dengan tepat pada saat replikasi kromosom. Kesalahan kadang-kadang terjadi sehingga terjadi urutan yang baru. Kesalahan inilah yang dikenal dengan mutasi. Mutasi dapat terjadi pada sel somatik maupun sel kecambah. Karena mutasi sel somatik tidak diturunkan, hal ini dapat diabaikan dalam konteks evolusi. Mutasi dapat digolongkan berdasarkan panjang urutan DNA yang dipengaruhi kejadian mutasi. Misalnya, mutasi dapat terjadi pada satu nukleotida (point mutation) atau beberapa nukleotida yang berdekatan. Mutasi juga dapat digolongkan berdasarkan pada tipe perubahan yang disebabkan oleh kejadian mutasi yaitu, (1) substitusi, penggantian satu nukleotida oleh yang lain, (2) delesi, kehilangan satu atau lebih nukleotida dari DNA, (3) insersi, penambahan satu atau lebih nukleotida ke dalam urutan DNA, dan (4) inversi, rotasi 180o segmen DNA untai ganda yang terdiri atas satu atau lebih pasang basa.

18 Substitusi dibagi menjadi dua yaitu, (1) transisi dan (2) transversi. Transisi adalah substitusi antara A dan G (purin) atau antara C dan T (purimidin). Transversi adalah substitusi antara purin dan pirimidin.

Substitusi nukleotida

yang terjadi pada daerah penyandi protein dapat digolongkan berdasarkan pada efek pada produk proteinnya. Mutasi yang tidak menyebabkan perubahan asam amino disebut sinonim sedangkan yang menyebabkan perubahan asam amino disebut nonsinonim.

Mutasi nonsinonim terdiri atas mutasi missense

dan

nonsense. Mutasi missense mengubah kodon menjadi kodon yang menyandi asam amino yang berbeda sedangkan mutasi nonsense mengubah kodon menjadi kodon terminal (stop codon) Delesi dan insersi dapat terjadi dengan beberapa mekanisme. Salah satu mekanismenya adalah unequal crossing over.

Mekanisme ini dapat terjadi

antara dua kromosom yang menghasilkan delesi segmen DNA pada salah satu kromosom dan penambahan pada kromosom yang lain.

Mekanisme lainnya

adalah replication slippage atau slipped-strand mispairing. Mekanisme ini bisa menyebabkan perubahan cetakan asam amino di daerah penyandi protein dan disebut mutasi frameshift (Li 1997). Klasifikasi Mutasi MC4R Penelitian saat ini tentang kelainan fungsi varian MC4R yang berhubungan dengan obesitas menunjukkan adanya kelainan dalam banyak hal. Tao (2005) menggolongkan mutasi MC4R menjadi lima klas (Gambar 6). 1) Klas I: Tanpa mutasi.

Sintesis protein yang tidak sempurna dan/atau

degradasi protein yang cepat menyebabkan tidak adanya reseptor di dalam sel. Mutan W16X, Y35X, dan L64X diduga ke dalam klas ini, walaupun penelitian tentang ekpresinya masih diperlukan untuk membuktikan dugaan ini. 2) Klas II: Mutan yang terperangkap di dalam sel. Reseptor mutan ini diproduksi tetapi tetap berada di dalam sel,

kemungkinan besar di dalam retikulum

endoplasma karena dideteksi sebagai lipatan yang keliru oleh sistem pengendalian mutu sel tersebut. Klas ini merupakan kumpulan mutasi MC4R yang terbanyak dilaporkan saat ini termasuk mutasi frameshift ?CTCT pada kodon 211, insersi TGAT pada kodon 244, dan ?750-751GA, S58C, N62S, P78L, N97D, G98R, I102S, L106P, I125K, R165Q, R165W, N240S, L250Q, Y287X, C271R, C271Y, P299H, I316S, I317T.

19

Gambar 6 Klasifikasi mutasi MC4R pada manusia (Tao 2005) 3) Klas III: Mutan yang cacat bidang pengikatannya.

Reseptor mutan ini

diekspresikan di permukaan sel tetapi cacat pada ligan pengikatnya, baik yang kemampuan pengikatannya dan/atau afinitasnya menurun, sehingga menyebabkan gangguan pemberian isyarat yang dirangsang oleh hormon. Mutan ini meliputi N97D, L106P, I125K, I137T, I316S, ?88-92, I102S, dan I102T. 4) Klas IV: Mutan yang cacat pemberian isyaratnya. Mutan ini diekspresikan pada permukaan sel, aktivitas ligan pengikatnya normal, tetapi cacat dalam pemberian isyarat yang dirangsang oleh agonis (kemampuan dan/atau kemanjurannya menurun). Mutan yang termasuk dalam golongan ini adalah D90N, I137T, A175T, dan V253I.

Mutan V253I ditemukan memiliki respon

maksimum yang relatif normal, walaupun EC50 (konsentrasi hormon yang diperlukan untuk menghasilkan 50% respon maksimum) meningkat tiga kali lipat. Namun, Marti et al. (2003) menemukan bahwa ada mutan V253I pada subjek yang bobot badannya normal. Hal ini menunjukkan bahwa varian ini memiliki fungsi yang relatif normal.

20 5) Klas V: Mutan yang fungsinya normal. Mutan yang termasuk dalam golongan ini adalah T11A, D37V, P48S, V50M, F51L, A154D, I170V, M200V, N274S, dan S295P. Mutan ini menunjukkan ekspresi permukaan sel, pengikatan ligan dan cAMP terpacu secara normal.

Mekanisme varian ini dalam

menyebabkan ketidakseimbangan energi dan kegemukan masih belum jelas. Perbedaan varian ini dengan polimorfisme yang lain seperti V103I dan I251L adalah bahwa varian ini tidak ditemukan pada subjek yang normal. Mekanisme Molekuler Homeostasis Energi Penyimpanan lemak yang terdapat di dalam tubuh ternyata bukan merupakan hasil dari kebiasaan buruk yang bersifat pasif seperti yang diduga sebelumnya. proses

Ternyata jaringan lemak (adiposa) berperan pada pengaturan

homeostasis

energi,

yaitu

suatu

proses

yang

membutuhkan

keseimbangan antara asupan energi (asupan makanan) dan pengeluaran energi (metabolisme dan gerak) serta ukuran cadangan energi (massa lemak) dalam tubuh (Woods dan Seeley 2002).

Sistem yang mengatur asupan makanan,

mengontrol seberapa sering dan seberapa banyak makanan yang dimakan, dan memperbaiki ketika keseimbangan jangka panjang terganggu, merupakan suatu masalah yang kompleks dan belum dipahami dengan jelas. Salah satu fungsi sistem ini antara lain mengatur bobot badan jangka pendek, seberapa sering dan berapa banyak makanan yang dimakan dalam waktu tertentu. Fungsi lainnya adalah mengatur asupan makanan dalam jangka waktu yang lebih panjang (Gambar 7).

Beberapa tahun terakhir ini, para peneliti telah menemukan

sejumlah komponen yang terlibat dalam sistem ini. Adanya dua hormon peptida, yaitu ghrelin dan peptida YY (PYY) yang diproduksi oleh saluran pencernaan diketahui mempengaruhi perilaku makan jangka pendek, sedangkan leptin dan insulin mengatur bobot badan dalam jangka waktu bulanan atau tahunan. Para peneliti obesitas telah menghasilkan kemajuan untuk memahami efek hormon di atas. Mereka menemukan daerah di otak, seperti arcuate nucleus (nukleus arkuata) pada hipotalamus, berperan penting menggabungkan aktivitas hormon tadi, memberikan sinyal kepada tubuh untuk mengatur keseimbangan asupan makanan dan pemakaian energi (Marx, 2003).

21

Gambar 7 Hormon yang mengatur nafsu makan. Leptin yang diekskresikan dari jaringan lemak dan insulin dari pankreas menurunkan nafsu makan. Dalam nukleus arkuata hipotalamus, hormon ini menghambat neuron yang menghasilkan neuropeptida Y (NPY) dan agouti-related protein (AgRP) yang merangsang neuron penghasil melanokortin. NPY dan AgRP adalah peptida yang merangsang makan. Hormon perangsang melanosit-a (a-MSH), dihasilkan dengan pemrosesan pro-opiomelanokortin, adalah ligan endogen untuk reseptor melanokortin MC3R dan MC4R yang mengisyaratkan kekenyangan. Ghrelin yang dihasilkan dari lambung merangsang nafsu makan dengan mengaktifkan neuron penghasil NPY/AgRP. PYY3-36 yang dihasilkan dari kolon bertindak melalui reseptor Y2 neuropeptida dan menghambat neuron NPY/AgRP, dan akhirnya menurunkan nafsu makan (Schwartz dan Morton 2002). Nukleus arkuata memiliki dua tipe neuron yang memiliki aksi berlawanan. Pengaktifan neuron tipe pertama, yang memproduksi neurotransmiter peptida yaitu neuropeptida Y (NPY) dan agouti-related peptide (AgRP), merangsang selera makan sambil mengurangi metabolisme. Sebaliknya, pengaktifan neuron tipe lainnya, yang dikenal sebagai neuron POMC/CART (pro-opiomelanocortin /cocain and amphetamine-regulated transcript), akan melepaskan a-melanocytestimulating hormone (a-MSH) yang dapat menghambat keinginan untuk makan. Ketika cadangan lemak dan konsentrasi leptin menurun, neuron NPY dan AgRP diaktifkan dan neuron POMC dihambat sehingga terjadi kenaikan bobot badan.

22 Namun pada hewan yang tidak tahan, peningkatan cadangan lemak dan konsentrasi leptin dapat menghambat neuron NPY/AgRP dan mengaktifkan neuron POMC yang akhirnya menyebabkan penurunan bobot badan. Neuron NPY/AgRP dan POMC/CART menyampaikan sinyalnya melalui otak di beberapa bagian lainnya menuju nucleus tractus solitarius dari pusat otak, kemudian akan dihantarkan ke seluruh tubuh (Marx 2003). Sejak ditemukannya leptin (hormon polipeptida yang dihasilkan oleh adiposit), banyak kemajuan telah terjadi dalam menjelaskan jalur saraf yang mengatur homeostasis energi.

Sejumlah peptida, termasuk neuropeptida Y

(NPY), ghrelin, peptida mirip glukagon, hormon melanin, oreksin (hipokretin) dan melanokortin, dinyatakan terlibat dalam pengaturan keseimbangan energi. Sirkuit melanocortin-leptin berperan dalam pengaturan keseimbangan energi ini (Tao 2005).

Dalam sirkuit ini, leptin yang diproduksi oleh adiposit dapat

menembus sawar (barrier) darah otak, berikatan dengan reseptornya pada dua neuron di nukleus arkuata hipotalamus.

Neuron yang satu mengekspresikan

NPY dan AGRP, sedangkan neuron lainnya mengekspresikan POMC/CART. POMC diproses dalam jaringan menjadi melanokortin, termasuk a, ß, ?-MSH dan ACTH oleh prohormon konvertase. Selanjutnya melanokortin bekerja mengikuti jalur penyinyalan protein G. Teknik PCR Reaksi berantai polimerase (polymerase chain reaction, PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk menggandakan secara eksponensial suatu urutan nukleotida tertentu dengan cara in vitro. Metode ini pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis seorang peneliti perusahaan CETUS Corporation.

Metode ini sekarang telah banyak digunakan untuk berbagai

macam manipulasi dan analisis genetik. Pada awal perkembangannya, metode ini hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, tetapi kemudian dikembangkan

lebih

lanjut

sehingga

dapat

digunakan

pula

untuk

melipatgandakan dan melakukan kuantitasi molekul m-RNA. Teknik PCR tersebut sangat sensitif dan dapat digunakan untuk melipatgandakan satu molekul DNA.

Metode ini sering digunakan untuk

memisahkan gen-gen berkopi tunggal dari kelompok urutan genom.

Dengan

menggunakan metode PCR, dapat diperoleh pelipatgandaan suatu fragmen DNA sebesar 200 000 kali setelah dilakukan 20 siklus reaksi selama 220 menit. Hal

23 ini menunjukkan bahwa pelipatgandaan suatu fragmen DNA dapat dilakukan secara cepat. Kelebihan lain dari metode PCR adalah bahwa reaksi ini dapat dilakukan dengan menggunakan komponen dalam jumlah sedikit, misalnya DNAcetakan yang diperlukan hanya sekitar 5µg, oligonukleotida yang diperlukan hanya sekitar 1 mM dan reaksi ini bisa dilakukan dalam volume 50-100 µl. DNAcetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu sehingga metode PCR dapat digunakan untuk melipatgandakan suatu urutan DNA dalam genom bakteri hanya dengan mencampurkan kultur bakteri di dalam tabung PCR (Yuwono 2006). Siklus PCR meliputi beberapa tahap yaitu 1) tahap denaturasi fragmen DNA, 2) tahap penempelan, dan 3) tahap elongasi. Pada tahap pertama terjadi pemisahan rantai ganda DNA menjadi rantai tunggal akibat suhu tinggi ( 95oC) sedangkan pada tahap kedua terjadi penempelan primer pada DNA-cetakan yang sesuai pada suhu

55oC. Tahap ketiga (elongasi) dilakukan pada suhu

72oC. Pada tahap ini Taq DNA Polymerase melakukan aktivitas polimerisasi unit DNA dengan arah 5’ ke 3’ yang komplementer dengan urutan DNA-cetakan yang diapit oleh satu set primer. Fragmen DNA hasil polimerisasi ini selanjutnya menjadi cetakan untuk siklus berikutnya sehingga produk akhir fragmen sangat banyak. Siklus PCR biasanya dilakukan sebanyak 30 kali ditambah satu siklus setelah siklus ketiga puluh dengan waktu elongasi yang lebih panjang (5 menit). Waktu elongasi yang lebih panjang memberi kesempatan untuk fragmen DNA teramplifikasi secara keseluruhan (Becker et al. 1996). Efisiensi PCR sangat dipengaruhi oleh konsentrasi berbagai komponen. Komponen yang terlibat yaitu Taq DNA Polymerase, dNTP (deoksinukleosida trifosfat), ion Mg, DNA-cetakan dan primer. Selain itu suhu dan waktu masingmasing tahap dalam setiap siklus PCR akan mempengaruhi kualitas dan spesitas produk PCR (Becker et al. 1996).

MATERI DAN METODE Waktu dan Lokasi Penelitian Pengambilan data fenotipe dan contoh darah di Uluwatu, Ubud, dan Pusat Studi Satwa Primata-Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat, Institut Pertanian Bogor (PSSP-LPPM, IPB), dilakukan pada bulan Juni sampai dengan Desember tahun 2007. Pengambilan contoh darah dan data fenotipe di Alas Purwo dan Taman Nasional Baluran (Jawa Timur) dilakukan tahun 2005. Analisis laboratorium dilakukan di Laboratorium Biologi dan Reproduksi, PSSPLPPM, IPB, Bogor

dan Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat Penelitian

Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB Bogor mulai Agustus 2007 sampai Agustus 2008. Pengurutan produk PCR menggunakan jasa Macrogen, Korea. Materi Monyet Ekor Panjang Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) jantan dewasa sebanyak 56 ekor (Tabel 1). Monyet ekor panjang jantan tidak terpengaruh oleh siklus kebuntingan sehingga bobot badan dan data fenotipe obesitas tidak dipengaruhi oleh siklus tersebut.

Umur

ditentukan berdasarkan gigi geligi yaitu: a) muda/remaja dengan ciri taring permanen dan molar permanen ke tiga belum tumbuh dan rambut sudah kecoklatan; b) pra dewasa dengan ciri gigi geligi sudah permanen tetapi molar ke tiga belum tumbuh dan rambut kecoklatan; dan c) dewasa dengan ciri gigi taring sudah panjang (pada jantan) dan molar permanen berjumlah 12 buah dan rambut kecoklatan. Tabel 1 Jumlah monyet ekor panjang jantan yang digunakan dalam penelitian ini Pulau/Kawasan Bali Jawa Timur Sumatera Jumlah

Asal Ubud Uluwatu Alas Purwo Baluran Palembang*

Kode UB UW AP BL Pal

Jumlah 13 11 7 10 15 56

*Sampel asal Palembang diambil di PSSP-IPB Monyet ekor panjang tersebut berasal dari Bali (Uluwatu, dan Ubud), Jawa Timur (Alas Purwo dan Taman Nasional Baluran) dan Sumatera (Palembang).

25 Sampel asal Palembang diambil di PSSP-LPPM, IPB. Lokasi asal populasi monyet yang digunakan dalam penelitian ini ditunjukkan pada Gambar 8.

Baluran

Alas Purwo Ubud U 50 50

00

50 Km 50 Kilometers

Uluwatu

Gambar 8 Peta lokasi asal monyet ekor panjang yang digunakan dalam penelitian Bahan dan Alat Pengambilan Sampel Darah dan Data Fenotipe Pengambilan sampel darah monyet menggunakan bahan-bahan yaitu: alkohol 70%, EDTA (ethylene diamine tetraacetic), ketamin, xylazine dan kapas, sedangkan alat yang digunakan adalah tulup, pistol, spuit, tabung vacutainer, spidol permanen, kotak pendingin, dan lemari pendingin (freezer). Alat yang digunakan untuk mendapatkan data fenotipe adalah pita ukur (skala terkecil 1 mm), timbangan (skala terkecil 0.1 kg), kaliper (skala terkecil 1 mm), alat tulis dan kertas. Bahan dan Alat Isolasi DNA Bahan yang digunakan dalam isolasi DNA dari darah adalah etanol absolut, larutan penyangga AW1, AW2, AL dan AE, proteinase K (produk Qiagen), sedangkan alat yang digunakan adalah mikro pipet

beserta ujung

26 pipetnya dengan ukuran 20, 200, dan 1000 µl, tabung 1.5 ml, QIAamp spin coloum, water bath, alat mikrosentrifugasi, termometer, rak dan vorteks. Bahan dan Alat Analisis PCR Bahan yang digunakan untuk PCR adalah ddH2O, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP), primer (forward dan reverse), larutan penyangga 10X, Taq polimerase (Invitrogen), MgCl2, DNA, dan alkohol 70%. Alat yang digunakan adalah pipet beserta ujung pipetnya ukuran 10, 20, 200 µl, rak, tabung PCR 200 µl, tabung 1.5 ml, tisu, rak pendingin sampel, alat mikrosentrifugasi (Eppendorf) tipe 5415C, penstabil voltase (Voltage Stabilizer Ferro Resonant 1500 ICA) dan mesin PCR (Gene Amp PCR System 2400, Perkin Elmer). Bahan dan Alat Elektroforesis Bahan yang digunakan untuk elektroforesis adalah agarosa, loading dye, penanda 100 pb, TBE 1X (1M Tris, 0.9 M Asam Borat dan 0.01 M EDTA pH 8.0) dan etidium bromida.

Peralatan yang digunakan untuk elektroforesis adalah

ujung pipet T-300 (axygen), mikropipet 10 P (Gilson), gelas ukur, timbangan elektronik (AD HX 100), pengaduk bermagnet (magnetic stirrer MG78), pemanas litrik,

piranti

Submarime

Electrophoresis

(Hoeffer

USA),

power

supply

electrophoresis, alat foto UVi dan disket ukuran 3.5 inci. Metode Pengambilan Darah dan Data Fenotipe Monyet dibius dengan campuran ketamin (10 mg/kg bobot badan) dan xylazine (2 mg/kg bobot badan). Obat bius disuntikkan secara intramuskuler dengan alat bantu berupa tulup atau senapan. Darah diambil dengan spuit dari vena femoralis sebanyak 5 ml dan selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung yang mengandung EDTA. Darah ini disimpan pada suhu -20oC yang selanjutnya diekstrak untuk mendapatkan DNA. prosedur

yang

telah

disetujui

Tata cara pengambilan darah mengikuti

Komisi

Pengawasan

Kesejahteraan

dan

Penggunaan Hewan Penelitian PSSP-IPB (ACUC No. 07-A004-IR). Fenotipe obesitas yang diukur adalah bobot badan, tinggi duduk, tebal lipatan kulit (di daerah perut, lengan, paha, leher dan punggung) serta lingkar pinggang, dada, paha, dan lengan.

Tinggi duduk (crown rump length/CRL)

diukur dari bagian atas kepala (vertex) sampai pangkal ekor (Kaufman et al. 2005).

IMT dihitung dari bobot badan (kg) dibagi tinggi-duduk

kuadrat (m2)

27 (Angeloni et al. 2004; Kaufman et al. 2005).

Monyet digolongkan gemuk

(mengalami obesitas) bila IMT lebih besar atau sama dengan 30 kg/m2 (WHO 2005; Kaufman et al. 2005). Lokasi pengukuran lipatan kulit perut, lengan, paha, leher dan punggung masing-masing adalah pusar, trisep, pangkal paha (selangkangan), leher bagian dorsal, dan lumbal. Tebal lipatan kulit diukur dengan skinfold lange caliper. Lingkar pinggang, dada, paha dan lengan atas (trisep) diukur dengan pita ukur.

Lingkar pinggang, dada, paha dan lengan

masing-masing diukur di daerah umbilikus, penonjolan bagian kaudal dari tulang sternum, pangkal paha, dan trisep (Gambar 9). Alat yang digunakan adalah timbangan (skala terkecil 0.1 kg), pita ukur dan kaliper (skala terkecil 1 mm).

Gambar 9 Lokasi pengukuran lingkar bagian tubuh dan tebal lipatan kulit Keterangan : (1) lokasi pengukuran tebal lipatan kulit pada bagian leher dorsal, (2) lokasi pengukuran tebal lipatan kulit punggung, (3) lokasi pengukuran lingkar paha, (4) lokasi pengukuran lingkar lengan atas, (5) lokasi pengukuran lingkar pinggang, (6) lokasi pengukuran tebal lipatan kulit trisep, (7) lokasi pengukuran tebal lipatan kulit paha, (8) lokasi pengukuran tebal lipatan kulit perut, dan (9) lokasi pengukuran lingkar dada Ekstraksi DNA dari Darah Ekstraksi DNA menggunakan QIAamp DNA Blood Kits (Qiagen) dengan cara sebagai berikut: (1) Sebanyak 20 µl proteinase K Qiagen, 200 µl sampel darah, dan 200 µl larutan penyangga AL dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml

28 yang selanjutnya dicampur dengan menggunakan vorteks selama 15 detik. Campuran ini diinkubasi

pada suhu 56oC selama 10 menit, kemudian

disetrifugasi beberapa saat. (2) Sebanyak 200 µl etanol (96-100%) ditambahkan pada

sampel,

dicampur

menggunakan

vorteks

selama

15

detik,

dan

disentrifugasi beberapa saat. (3) Campuran ini dimasukkan ke dalam QiAamp spin column dan disetrifugasi dengan kecepatan 6 000 x g (8 000 rpm) selama satu menit setelah ditutup terlebih dahulu. Selanjutnya, QiAamp spin column ini diletakkan di dalam tabung dua ml yang bersih, dan tabung yang mengandung filtrat dibuang. (4) Tutup spin column dibuka dengan hati-hati, dan 500 µl larutan penyangga AW1 dimasukkan. QiAamp spin column ditutup kembali, dan disentrifugasi dengan kecepata 6 000 x g (8 000 rpm) selama satu menit. QiAamp spin column diletakkan di dalam tabung dua ml yang bersih, dan tabung yang mengandung filtrat dibuang. (5) Sebanyak 500 µl larutan penyangga AW2 dimasukkan ke dalam QiAamp spin column, dan disentrifugasi dengan kecepatan 20 000 x g (14 000 rpm) selama tiga menit. (6) QiAamp spin column dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml, ditambahkan 200 µl larutan penyangga AE, diinkubasi pada suhu ruangan (15-25oC) selama satu menit, dan disentrifugasi dengan kecepatan 6 000 x g (8 000 rpm) selama satu menit.

Tabung terakhir

mengandung DNA yang selanjutnya dapat digunakan untuk PCR. Hasil ekstraksi dilihat dengan elektroforesis pada gel agarosa 1.2% dalam larutan TBE 1x dalam piranti Submarine Eletrophoresis (Hoefer, USA). Fragmen dimunculkan dengan pewarna etidium bromida setelah dimigrasikan selama 40 menit dengan voltase 85 V. Fragmen DNA yang terwarnai dilihat di bawah iluminasi ultraviolet. Konsentrasi DNA ditentukan dengan spektrofotometer. DNA dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml dan disimpan di dalam lemari pendingin dengan suhu -20oC untuk proses berikutnya. Amplifikasi Gen MC4R Amplifikasi daerah penyandi gen MC4R menggunakan primer forward (5’– AATAACTGAGACGACTCCCTGAC–3’)

dan

reverse

(5’–CAGAAGTACA

ATATTCAGGTAGGG–3’) (Yeo et al. 1998) dengan teknik PCR.

Setiap unit

reaksi PCR mengandung ddH2O, larutan penyangga 1X, MgCl2 1.5 mM; dNTP masing-masing 0.2 mM (invitrogen); sepasang primer masing-masing 0.4 µM; Taq DNA Polimerase sebanyak 1.25U, dan 100 ng DNA. Konsentrasi DNA

29 ditentukan dengan spektrofotometer dan diencerkan dengan ddH2O sehingga konsentrasi seluruh sampel sama dengan 25 ng/µl. Setiap tabung untuk satu unit reaksi PCR (volume reaksi 50 µl) ditambahkan 5 l larutan penyangga 10x, 1.5 µl MgCl2 50 mM, 5µl dNTP mix 2mM, primer 10µM masing-masing 2 µl, 0.25 µl Taq Polymerase (5 U/µl), 4 l DNA (25 ng/µl), dan 30.25 l ddH2O. Campuran divorteks dan

disentrifugasi

®

sebentar. Amplifikasi menggunakan mesin GeneAmp PCR sistem 2400 (Perkin Elmer) dengan kondisi sebagai berikut: denaturasi awal selama 5 menit pada suhu 95oC selanjutnya diikuti dengan 35 siklus (95oC selama 45 detik untuk denaturasi,

57oC selama 1 menit untuk penempelan primer, 72oC selama 1

menit untuk perpanjangan); kemudian diakhiri 7 menit pada 72oC. Produk PCR dari gen MC4R

adalah sebesar 1146 pb (angka ini diperoleh dengan

menjajarkan primer forward dan reverse dengan urutan MC4R monyet ekor panjang yang ada di GenBank). Elektroforesis DNA Total dan Produk PCR DNA total dan produk PCR dideteksi dengan cara dimigrasikan pada gel agarosa 1.2 %. Gel ini dibuat dengan melarutkan 0.6 g agarosa dengan 50 ml TBE 1X, kemudian dipanaskan sampai mendidih, diaduk dengan pengaduk bermagnet, kemudian ditambahkan etidium bromida sebanyak 2.5 l (10mg/ml) dan dibiarkan sebentar agar dingin.

Sebelum membeku, agarosa tersebut

dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan, kemudian dipasang sisir untuk 12 sampel dan dibiarkan sampai membeku selama 50 menit. Gel yang telah membeku selanjutnya direndam dalam piranti elektroforesis yang telah diisi larutan penyangga TBE 1X. Sebelum menjalankan elektroforesis, campuran sampel (5 l) dan loading dye (1

l) dimasukkan ke dalam sumur sampel (agarosa).

Elektroforesis

dilakukan dengan Submarine Electrophoresis (Hoeffer USA) yang menjalankan sampel dari kutub negatif ke kutub positif dengan voltase 85V selama 40 menit. Hasil elektroforesis diamati dengan bantuan sinar UV (gelombang 200-400 nm), difoto dengan Gel DOC (UVi), dan disimpan dalam disket 3.5 inci. Adanya DNA total atau produk PCR ditunjukkan dengan adanya pita (band) dalam gel hasil elektroforesis.

30 Pengurutan Produk PCR Reaksi pengurutan dilakukan dalam MJ Research PTC-225 Peltier Thermal Cycler menggunakan ABI PRISM BigDye TM Terminator Cycle Sequencing Kits dengan AmpliTaq DNA polymerase (FS enzyme) (Applied Biosystems) mengikuti prosedur yang disediakan oleh pabrik pembuatnya. Produk PCR dari gen MC4R pada monyet ekor panjang diurutkan menggunakan primer forward (5’–AATA ACTGAGACGACTCCCTGAC–3’) dan reverse (5’–CAGAAGTACAATATTCA GGTAGGG–3’) (Yeo et al. 1998).

Dengan demikian, urutan yang didapat

terkoreksi dari arah yang berlawanan (dua arah). Tahapannya adalah sebagai berikut: fragmen berlabel fluorescen dimurnikan dengan prosedur presipitasi etanol, selanjutnya sampel dilarutkan kembali dalam air terdestilasi dan diurut dalam ABI 3730XL sequencer (Applied Biosystems). Analisis Data Analisis Data Fenotipe Untuk mengetahui perbedaan antar lokasi, data fenotipe dianalisis dengan analisis deskriptif dan analisis varian dengan program MINITAB Statistical Software, Release 14

(Minitab Inc. 2003). Sebelum analisis, data diuji

normalitasnya dengan uji Anderson-Darling. Bila sebaran data tidak normal, data ditransformasi dengan box-cox tranformation (? antara -5 sampai dengan 5). Bila analisis varian berbeda nyata, dilanjutkan dengan uji beda Tukey.

Analisis

komponen utama (AKU) juga dilakukan dengan program yang sama. Persamaan yang digunakan untuk analisis statistika deskriptif dan analisis varian (Minitab Inc. 2003) adalah: Rata-rata (

)

Simpangan baku (

)

Koefien keragaman (KK)

31 Derajat bebas (db)

db (faktor) = r–1 db (galat) = nt –r db (total) = nt –1 Jumlah kuadrat (JK)

dengan:

rata-rata pengamatan ke i = rata-rata semua pengamatan nilai pengamatan ke j dan faktor ke i

Kuadrat tengah (KT)

F hitung

Uji Tukey

dengan :

= rata-rata pengamatan faktor ke i = rata-rata pengamatan faktor ke j = jumlah pengamatan ke i = jumlah pengamatan ke j

r = jumlah level s = simpangan baku Q = persentil a dengan distribusi r dan derajat bebas

32 Persamaan untuk analisis komponen utama adalah: Nilai Eigen:

ragam komponen utama Z = A Y dengan:

Z = skor matriks komonen utama (n*m) Y = matriks data terstandar (n*p) A = matriks faktor eigen (p*m) Proporsi:

proporsi ragam yang dijelaskan oleh komponen utama ke k = k 1

...

2

dengan:

p

adalah nilai eigen ke k

k

Proporsi

Proporsi total ragam yang dijelaskan oleh komponen utama

total:

sejumlah k pertama = 1

+

+

k

1

+

+

p

2

+ ...

2

+ ...

dengan:

k

adalah nilai eigen ke k

Vektor eigen (Loading factor) diperoleh dengan rumus: R = V L V dengan:

R = matriks kovarian V = matrriks vektor eigen L = matriks diagonal nilai eigen

Analisis Data Molekuler Hasil urutan DNA diedit dan dijajarkan dengan menggunakan program Mega 4.0 (Tamura et al. 2007). Dengan program yang sama, ditentukan jarak genetik (p distance), diversitas nukleotida (p) dan pohon filogeni dengan metode bootstrap Neighbor-Joining (NJ) dengan 1000 kali pengulangan.

Penentuan

jumlah mutasi dan situs polimorfik juga menggunakan program yang sama.

33 Penentuan mutasi yang bersifat transisi dan transversi menggunakan program Arlequin 3.11 (Excoffier et al. 2005). Persamaan yang dipakai dalam perhitungan p distance, dan diversitas nukleotida (Nei dan Kumar 2000) sebagai berikut: p distance ( )

dengan : nd = jumlah perbedaan nukleotida antar dua urutan, dan

n = jumlah total nukleotida yang di uji. diversitas nukleotida ( )

dengan : q= jumlah alel total, xi = frekuensi populasi dengan alel ke i, xj= jumlah frekuensi populasi dengan alel ke j, dan

dij =jumlah perbedaan nukleotida antara alel i dan j

HASIL DAN PEMBAHASAN Keragaman Fenotipe Obesitas Monyet Ekor Panjang Indeks Massa Tubuh, Bobot Badan dan Tinggi Duduk Indeks massa tubuh (IMT) monyet ekor panjang jantan dewasa berkisar antara 17.7-64.0 kg/m2 dengan koefisien keragaman (KK) intra populasi adalah antara 9.3-19.9 (Tabel 2). Keragaman tertinggi terdapat di Uluwatu sedangkan yang terendah ada di Ubud. Keragaman yang tinggi ini ditunjukkan oleh kisaran data IMT monyet yang berasal dari Uluwatu lebih lebar daripada yang berasal dari daerah lainnya. Tabel 2 Indeks massa tubuh, bobot badan, dan tinggi duduk Parameter* IMT (kg/m2) KK (%) Kisaran BB (kg) KK (%) Kisaran

Palembang n=15 23.9±2.3d 9.7 17.7-27.8

Baluran n=10 29.4±3.2c 10.9 22.6-34.7

Asal Alas Purwo n=7 28.6±3.7c 13.0 23.6-34.7

Uluwatu n=11 47.3±9.4a 19.9 38.5-64.0

Ubud n=13 39.1±3.6b 9.3 33.8-47.7

4.3±0.4c 10.0 3.2-4.9

7.0±1.2b 16.5 5.0-9.0

7.0±1.0b 14.3 5.0-8.0

11.9±2.9a 24.2 8.0-17.0

10.0±0.9a 9.5 8.5-11.5

TD (cm) 42.6±1.4b 48.7±3.2a 49.4±1.9a 50.0±2.2a 50.5±1.6a KK (%) 3.3 6.6 3.9 4.5 3.2 Kisaran 39.0-45.0 45.0-55.0 46.0-51.0 45.0-53.0 45.0-53.0 * KK=koefisien keragaman, IMT=indeks massa tubuh, BB=bobot badan, TD=tinggi duduk. Nilai IMT, BB, dan TD disajikan dalam rata-rata ± simpangan baku. Rata-rata dengan huruf yang berbeda pada baris yang sama adalah berbeda nyata (P<0,05) IMT monyet asal Uluwatu adalah lebih tinggi (P<0.05) daripada IMT monyet yang berasal dari daerah lainnya. Rata-rata IMT monyet ekor panjang jantan yang berasal dari Uluwatu dan Ubud lebih besar dari 30 kg/m2 ( Gambar 10). Raman et al. (2005) menyatakan bahwa pada Macaca mulatta jantan mengalami obesitas bila IMT-nya berkisar antara 32-44 kg/m2. Sedangkan Kaufman et al. (2005) menemukan bahwa pada Macaca radiata jantan yang mengalami obesitas mempunyai rata-rata IMT sebesar 35.3 kg/m2. seluruh

Pada penelitian ini,

monyet ekor panjang jantan yang berasal dari Uluwatu dan Ubud

(100%) mengalami obesitas. Monyet yang berasal dari Baluran dan Alas Purwo masing-masing persentase obesitasnya adalah

30% (3/10) dan 28.6% (2/7).

35 Seluruh monyet asal Palembang tidak ada yang mengalami obesitas (IMT lebih kecil dari 30 kg/m2) (Gambar 11).

60

IMT (kg/m2)

50 40 30 20 10 0

Palembang (n=15)

Baluran (n=10)

Alas Purwo (n=7)

Uluwatu (n=11)

Ubud (n=13)

Asal populasi

Gambar 10 Rata-rata indeks massa tubuh (IMT) monyet ekor panjang

Persentase gemuk (%)

120 100 80 60 40 20 0

Palembang (n=15)

Baluran (n=10)

Alas Purwo (n=7) Asal Populasi

Uluwatu (n=11)

Ubud (n=13)

Gambar 11 Persentase kejadian obesitas monyet ekor panjang Formula IMT sangat tergantung pada bobot badan dan tinggi duduk. Rata-rata BB monyet yang berasal dari Uluwatu dan Ubud lebih tinggi (P<0.05) dibandingkan dengan yang berasal dari daerah lainnya. Rata-rata BB monyet ekor panjang jantan asal Ubud dan Uluwatu masing-masing adalah 10.0 0.9 kg 11.9 2.9 kg. Di Uluwatu, ditemukan monyet yang mempunyai bobot badan 16

36 dan 17 kg. Hal ini sangat berkontribusi dalam terjadinya keragaman bobot badan yang sangat tinggi di daerah ini. BB yang paling beragam juga terjadi pada populasi monyet ekor panjang jantan yang berasal dari Uluwatu (Tabel 2) dengan koefisien keragaman 24.2%.

Data BB monyet ekor panjang dewasa yang

diperoleh melebihi data monyet ekor panjang jantan dewasa yang dilaporkan oleh Rowe (1996) yaitu antara 4.7-8.3 kg ataupun yang dilaporkan oleh Andrade et al. (2004) adalah berkisar antara 3.5 sampai 9 kg. BB yang tinggi diakibatkan oleh adanya makanan tambahan dari pengunjung, pengelola dan sisa persembahan di pura. Karena makanan banyak tersedia secara mudah maka aktivitas untuk mencari makan di lokasi tersebut menjadi berkurang. Akibatnya, terjadi keseimbangan energi positif yang berarti energi tersimpan lebih banyak daripada energi yang digunakan.

Hal serupa juga terjadi pada sekelompok

baboon (Papio cynocephalus) yang hidup di

daerah yang banyak sampah

dapur/sisa makanan. Kelompok baboon ini menunjukkan IMT yang lebih tinggi daripada kelompok yang di alam bebas dan tidak mendapatkan akses ke sampah dapur (Banks et al. 2003). Tinggi duduk (TD) juga merupakan komponen yang menentukan IMT. Keragaman tinggi duduk (TD) monyet ekor panjang jantan dewasa yang diperoleh dalam penelitian ini adalah paling kecil dibandingkan dengan IMT dan BB. Hal ini menunjukkan bahwa TD monyet ekor panjang dewasa hampir sama (Gambar 12). Ukuran tinggi duduk monyet jantan dewasa berkisar antara 39-53 cm.

Hasil ini masih dalam kisaran CRL (crown rump length) M. fascicularis

60

TD (cm)

50 40 30 20 10 0 Palembang (n=15)

Baluran (n=10)

Alas Purwo Uluwatu (n=11) (n=7) Asal populasi

Gambar 12 Rata-rata tinggi duduk (TD) monyet ekor panjang

Ubud (n=13)

37 jantan yang dilaporkan oleh Andrade et al. (2004) yaitu 37-62 cm. Tidak ada perbedaan (P>0.05) TD antar lokasi kecuali monyet asal Palembang, karena monyet asal Palembang mempunyai tinggi duduk yang lebih kecil jika dibandingkan dengan monyet asal daerah lainnya. Seperti disebutkan di atas bahwa TD yang ditemukan pada berbagai lokasi penangkapan (Ubud, Uluwatu, Baluran dan Alas Purwo) adalah tidak berbeda nyata. Hal ini diduga akibat terhentinya pertumbuhan tulang setelah monyet mencapai usia dewasa (Ankel-Simons 2007), sehingga TD juga tidak banyak berubah.

Karena TD relatif stabil setelah monyet berusia dewasa maka bobot

badan cenderung lebih banyak mempengaruhi IMT dibandingkan dengan TD itu

BB (kg)

sendiri.

16 14 12 10 8 6 4 2 0

rata-rata BB rata-rata BB monyet gemuk

Asal Populasi

Gambar 13 Rata-rata bobot badan (BB) monyet ekor panjang Berdasarkan data bobot badan yang dikaitkan dengan IMT lebih besar atau sama dengan 30 kg/m2 maka monyet yang memiliki kriteria gemuk bobot badannya lebih besar atau sama dengan 7 kg (Gambar 13).

Walaupun

demikian, hal ini masih harus dipertimbangkan lagi karena dalam beberapa kasus walaupun IMT melebihi 30 kg/m2 dan BB lebih besar atau sama dengan 7 kg tetapi lipatan kulit perut belum terlihat jelas. Kriteria gemuk pada manusia selain didasarkan pada IMT, juga didasarkan pada lingkar pinggang dan pinggul serta tebal lipatan kulit (Han dan Lean 2001). Oleh karena itu, lingkar pinggang dan tebal lipatan kulit monyet ekor panjang.

perlu dipertimbangkan sebagai kriteria obesitas pada

38 Lingkar Pinggang, Dada, Paha dan Lengan Atas Lingkar pinggang (LPi) monyet ekor panjang yang diperoleh dalam penelitian ini berkisar antara 28.0-90.0 cm (Tabel 3).

LPi tertinggi (P<0.05)

ditemukan pada monyet asal Uluwatu sedangkan yang terendah ditemukan pada monyet asal dari Palembang. Lingkar pinggang dari 3 ekor monyet gemuk di Baluran berkisar antara 39-47 cm, sedangkan 2 ekor monyet di Alas Purwo berkisar antara 39-42 cm. LPi monyet gemuk dari Ubud dan Uluwatu selalu di atas monyet asal Baluran dan Alas Purwo. Lingkar pinggang lebih dari 39 cm dapat dijadikan sebagai kriteria gemuk pada monyet ekor panjang. Tabel 3 Lingkar pinggang, dada, paha, dan lengan atas Parameter*

Asal Alas Purwo Uluwatu n=7 n=11 38.7±3.8c 60.7±13.9a 9.9 22.8 33.0-42.0 47.0-90.0

LPi(cm) KK (%) Kisaran

Palembang n=15 30.0±1.4d 4.6 28.0-33.0

Baluran n=10 40.9±3.1c 7.5 37.0-47.0

Ubud n=13 48.8±4.4b 8.9 41.0-54.0

LD(cm) KK (%) Kisaran

33.1±1.4d 4.3 31.0-35.0

38.7±4.5c 11.7 35.0-49.0

37.3±1.4c 3.7 35.0-39.0

51.6±6.5a 12.6 43.0-65.0

46.3±2.4b 5.2 43.0-50.0

LPh(cm) KK (%) Kisaran

19.5±1.3c 6.6 17.0-21.0

23.0±2.2b 9.6 20.0-26.0

22.9±1.9b 8.2 20.0-26.0

28.0±3.1a 11.1 22.0-33.0

27.1±1.3a 4.9 25.0-30.0

LTr(cm) 15.4±1.2c 17.2±1.4b 17.4±1.4b 19.7±2.1a 21.0±1.3a KK (%) 7.7 9.0 8.0 10.9 6.1 Kisaran 13.0-17.0 15.0-19.5 15.0-19.0 15.0-22.0 19.0-23.0 * KK= koefisien keragaman, LPi=lingkar pinggang, LD=lingkar dada, LPh=lingkar paha, LTr= lingkar lengan atas. Nilai LPi, LD, LPh dan LTr disajikan dalam rata-rata ± simpangan baku. Rata-rata dengan huruf yang berbeda pada baris yang sama adalah berbeda nyata (P<0.05) Lingkar dada (LD) monyet ekor panjang yang diperoleh dalam penelitian ini berkisar antara 31.0-65.0 cm.

LD tertinggi (P<0.05) ditemukan pada monyet

yang berasal dari Uluwatu sedangkan yang terendah ditemukan pada monyet yang berasal dari Palembang. Rata-rata LD monyet gemuk juga lebih tinggi dari yang tidak gemuk. Semua monyet gemuk yang berasal dari Uluwatu dan Ubud memiliki lingkar dada lebih dari 40 cm. Monyet gemuk asal Baluran dan Alas Purwo mempunyai lingkar dada berkisar antara 35-49 cm dan 37-39 cm. Lingkar dada lebih dari atau sama dengan 35 cm dapat dijadikan sebagai kriteria obesitas pada monyet ekor panjang.

39 Lingkar paha (LPh) monyet ekor panjang berkisar antara 17.0-33.0 cm. Rata-rata LPh monyet yang berasal dari Uluwatu tidak berbeda (P>0.05) dengan yang berasal dari Ubud. Demikian juga rata-rata LPh monyet yang berasal dari Baluran dan Alas Purwo.

Namun, ada perbedaan LPh antara monyet yang

berasal dari Bali, Jawa Timur dan Palembang (Sumatera). Lingkar lengan atas (LTr) monyet ekor panjang berkisar antara 13.0-23.0 cm. Berdasarkan pada analisis statistik, ada perbedaan rata-rata LTr (P<0.05) monyet ekor panjang yang berasal dari Bali, Jawa Timur dan Palembang (Sumatera). Rata-rata LPi lebih besar daripada LD ditemukan pada kelompok monyet asal Baluran, Alas Purwo, Uluwatu dan Ubud, sedangkan kelompok monyet asal Palembang menunjukkan lingkar dada yang lebih besar daripada lingkar pinggang.

Hal ini dipengaruhi oleh

tingkat obesitas dari monyet tersebut.

Semua monyet yang tergolong gemuk (IMT

30 kg/m2)

memiliki lingkar

pinggang lebih besar daripada lingkar dadanya (Gambar 14). Besarnya LPi ini dipengaruhi oleh timbunan lemak baik timbunan lemak subkutan maupun lemak omentum dan mesenterium (Muroyama et al. 2006). Selanjutnya, ada pola yang khas pada monyet gemuk yaitu lingkar pinggang selalu lebih tinggi kemudian diikuti oleh lingkar dada, paha dan lengan atas (Gambar 14).

80 70 60 50 40 30 20 10 0

LPi (cm) LD (cm) LPh (cm) LTr (cm)

Palembang (n=15)

Baluran (n=10)

Alas Purwo Uluwatu (n=7) (n=11)

Ubud (n=13)

Asal populasi

Gambar 14 Rata-rata lingkar pinggang (LPi), dada (LD), paha (LPh), dan lengan atas (LTr)

40 Keragaman LPi monyet yang berasal dari Alas Purwo, Uluwatu dan Ubud lebih besar daripada keragaman lingkar bagian tubuh lainnya (Tabel 3). Sedangkan monyet yang berasal dari Palembang, lingkar lengan atasnya (LTr) memiliki keragaman yang tertinggi. Hal yang berbeda terlihat pada populasi di daerah Baluran. Di daerah ini, lingkar dada memiliki keragaman yang tertinggi. Perbedaan tersebut menunjukkan adanya variasi individu dalam perkembangan tubuhnya.

Setelah dewasa, perkembangan tubuh terjadi pada otot maupun

akumulasi lemak. Akumulasi lemak ini banyak ditemukan di daerah perut dan hal ini akan mengarah kepada terjadinya obesitas sentral seperti yang terjadi pada manusia. Tebal Lipatan Kulit Perut, Trisep, Paha, Punggung dan Leher Tebal lipatan kulit menggambarkan tebal atau banyaknya timbunan lemak subkutan pada monyet tersebut. Dalam penelitian ini, tebal lipatan kulit diukur di berbagai bagian tubuh untuk mengetahui penyebaran penimbunan lemak subkutan. Rata-rata tebal lipatan kulit di berbagai bagian tubuh pada monyet ekor panjang jantan disajikan dalam Tabel 4. Tebal lipatan kulit perut (TLkAb) monyet ekor panjang yang diperoleh dalam penelitian ini berkisar antara 2.0-67.0 mm. Hal ini menunjukkan adanya variasi penimbunan lemak di bawah kulit setelah monyet itu dewasa. TLkAb tertinggi (P<0.05) ditemukan pada monyet yang berasal dari Uluwatu sedangkan yang terendah ditemukan pada monyet yang berasal dari Palembang. Tebal lipatan kulit trisep (TLkTr) monyet ekor panjang yang diperoleh dalam penelitian ini berkisar antara 1.0-4.0 mm.

Hasil analisis statistik

menunjukkan TLkTr monyet ekor panjang dewasa dari berbagai lokasi adalah sebagian besar tidak berbeda nyata (P>0.05) kecuali antara monyet yang berasal dari Uluwatu dan Palembang.

Adanya kesamaan ini menunjukkan

bahwa penimbunan lemak di bawah kulit di daerah trisep tidak dapat digunakan untuk membedakan tingkat obesitas dari monyet tersebut. Tebal lipatan kulit paha (TLkPh) monyet ekor panjang yang diperoleh dalam penelitian ini berkisar antara 1.5-12 mm.

Rata-rata TLkPh

tertinggi

(P<0.05) ditemukan pada monyet yang berasal dari Uluwatu. Sedangkan TLkPh monyet yang berasal dari Palembang, Baluran dan Alas Purwo tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (P>0.05).

41 Tabel 4 Tebal lipatan kulit perut, trisep, paha, punggung dan leher Parameter*

Asal Alas Purwo Uluwatu n=7 n=11 6.5±2.2c 27.7±15.0a 33.8 54.0 2.5-9.0 15.0-67.0

TLkAb(mm) KK (%) Kisaran

Palembang n=15 3.4±0.9d 25.1 2.0-5.0

Baluran n=10 2.4±0.6d 24.7 2.0-3.5

Ubud n=13 19.0±3.0b 15.8 14.0-22.0

TLkTr (mm) KK (%) Kisaran

1.7±0.4b 21.7 1.0-2.0

1.9±0.2ab 11.1 1.5-2.0

1.9±0.4ab 20.4 1.0-2.0

2.3±0.6a 28.5 2.0-4.0

1.9±0.3ab 14.4 1.0-2.0

TLkPh(mm) KK (%) Kisaran

2.5±0.4c 24.8 1.5-4.0

2.4±0.7c 29.1 2.0-4.0

2.5±0.4c 16.3 2.0-3.0

8.5±2.5a 30.1 5.0-12.0

5.7±1.7b 29.3 4.0-10.0

TLkPg(mm) KK (%) Kisaran

3.7±0.5c 14.3 3.0-5.0

4.3±0.5c 12.7 3.5-5.0

4.7±0.5c 10.4 4.0-5.0

11.4±7.5a 65.9 5.0-30.0

6.5±1.5b 22.2 4.0-9.0

TLkLh(mm) 3.8±0.6d 4.8±0.6c 5.0±0.6c 12.5±4.4a 7.6±0.5b KK (%) 14.5 13.2 11.6 35.6 14.9 Kisaran 3.5-5.0 4.0-6.0 4.0-6.0 8.0-20.0 5.0-10.0 * KK= koefisien keragaman, TLkAb=tebal lipatan kulit perut, TLkTr=tebal lipatan kulit trisep, TLkPh=tebal lipatan kulit paha, TLkPg=tebal lipatan kulit punggung, TLkLh=tebal tipatan kulit leher. Nilai TLkAb, TLkTr, TLkPh, TLkPg dan TLkLh disajikan dalam rata-rata ± simpangan baku. Rata-rata dengan huruf yang berbeda pada baris yang sama adalah berbeda nyata (P<0.05) Tebal lipatan kulit punggung (TLkPg) monyet ekor panjang yang diperoleh dalam penelitian ini berkisar antara 3.0-30.0 mm.

Rata-rata TLkPg tertinggi

(P<0.05) juga ditemukan pada monyet yang berasal dari Uluwatu. sedangkan yang terendah ditemukan pada monyet yang berasal dari Palembang. Tebal lipatan kulit leher (TLkLh) monyet ekor panjang yang diperoleh dalam penelitian ini adalah berkisar antara 3.5-20.0 mm. Rata-rata TLkLh tertinggi (P<0.05) ditemukan pada monyet yang berasal dari Uluwatu. Akan tetapi, tidak ditemukan perbedaan (P>0.05) TLkLh antara monyet yang berasal dari Baluran dan Alas Purwo. Berdasarkan data di atas, keragaman tebal lipatan kulit ini sangat bervariasi pada berbagai bagian tubuh. Dilihat dari besarnya keragaman tebal lipatan kulit di berbagai bagian tubuh pada monyet asal Palembang, ternyata keragaman tebal lipatan kulit perut

paling tinggi dibandingkan dengan tebal

lipatan kulit pada bagian tubuh lainnya.

Namun keragaman tersebut tidak

konsisten dengan kelompok monyet yang berasal dari daerah lainnya. Monyet

42 asal Uluwatu misalnya, keragaman tebal lipatan kulit punggung paling tinggi jika dibandingkan dengan tebal lipatan kulit pada bagian tubuh lainnya. Ketidakkonsistenan keragaman tersebut didukung oleh ketidakkonsistenan rata-rata tebal lipatan kulit. Kelompok monyet asal dari Alas Purwo, Uluwatu dan Ubud menunjukkan rata-rata tebal lipatan kulit perut yang lebih tinggi daripada tebal lipatan kulit pada bagian tubuh lainnya (Gambar 15). Monyet asal Baluran, belum menunjukkan peningkatan tebal lipatan kulit perut walaupun berdasarkan IMT ada monyet yang tergolong gemuk. Hal ini diduga berkaitan dengan alur peningkatan massa lemak yang dimulai dari omentum majus, kemudian sekitar ginjal dan subkutan dan penghilangan massa lemak mengikuti urutan sebaliknya (Koganezawa 1995). Dengan demikian, tidak adanya peningkatan tebal lipatan kulit perut pada monyet asal Baluran diakibatkan oleh dua kemungkinan yaitu tidak ada peningkatan lemak subkutan atau lemak subkutan terpakai sebagai energi untuk aktivitas. Walaupun demikian, ada hal sangat konsisten dalam hal tebal lipatan kulit ini yaitu, tebal lipatan kulit lengan atas selalu paling kecil jika dibandingkan dengan lipatan kulit pada bagian tubuh lainya dan hal ini ditemukan pada seluruh kelompok monyet. Hal ini mengindikasikan bahwa penimbunan lemak sub kutan di daerah trisep tidak begitu banyak jika dibandingkan dengan

45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

TLkAb (mm) TLkLh (mm) TLkPg (mm) TLkPh (mm)

ud Ub

u Ul

uw

at

o rw Al

as

Pu

lu Ba

ba m le Pa

ra n

TLkTr (mm)

ng

Tebal lipatan kulit (m m )

penimbunan lemak di bagian tubuh lainnya.

Asal populasi Gambar 15 Rata-rata tebal lipatan kulit perut (TLkAb), leher (TLkLh), punggung (TLkPg), paha (TLkPh), dan trisep (TLkTr)

43 Secara umum, monyet yang mengalami obesitas menunjukkan TLkAb yang paling besar (Gambar 15) kemudian diikuti ketebalan TLkLh, TLkPg, TLkPh, dan TLkTr. Gambar tersebut juga memperlihatkan bahwa monyet yang tidak mengalami obesitas, terutama yang berasal dari Palembang, memiliki ratarata TLkAb lebih kecil dari 5 mm. Berdasarkan data di atas, tebal lipatan kulit perut perlu dijadikan sebagai kriteria obesitas pada monyet ekor panjang selain IMT.

Kriterianya adalah

monyet dengan tebal lipatan kulit perut lebih besar atau sama dengan 5 mm dapat digolongkan ke dalam monyet gemuk. Analisis Korelasi Parameter Fenotipe Secara umum, semua parameter fenotipe berkorelasi positif satu dengan yang lainnya (Tabel 5). Bobot badan berkorelasi positif (P<0.01) dengan IMT, TD, LPi, LD, LPh, LTr, TLkAb, TLkTr, TLkPh, TLkPg, dan TLkLh. Bobot badan mempunyai korelasi yang paling tinggi ( 0.965) dengan lingkar pinggang dan terendah (0.524) dengan tebal lipatan kulit trisep (P<0.01). Hal ini berarti bahwa bila lingkar pinggang meningkat maka bobot badan juga akan meningkat. Tabel 5 Nilai korelasi Pearson dan nilai P antar parameter fenotipe

Keterangan:

TD=Tinggi duduk, LPi= lingkar pinggang, LD=lingkar dada, LPh = lingkar paha, LTr=lingkar lengan atas,TLkAb=tebal lipatan kulit perut, TLkTr=tebal lipatan kulit trisep, TLkPh=tebal lipatan kulit paha, TLkPg=tebal lipatan kulit punggung, TLkLh=tebal lipatan kulit leher, IMT = Indeks massa tubuh, BB = bobot badan

44 Tinggi duduk memiliki korelasi yang positif (P<0.01) dengan parameterparameter lainnya. Korelasi tertinggi (0.779) adalah dengan lingkar paha. Hal ini menunjukkan bahwa bila lingkar paha meningkat maka

tinggi duduk juga

meningkat. Indek massa tubuh juga memiliki korelasi yang positif dengan parameterparameter lainnya (P<0.01).

Korelasi yang tertinggi (0.963) adalah dengan

bobot badan (P<0.01). Hal ini karena cara penentuan IMT adalah bobot badan (kg) dibagi tinggi duduk (m2). Walaupun demikian IMT juga mempunyai korelasi yang tinggi (0.944) dengan lingkar pinggang.

Dengan demikian, bila lingkar

pinggang meningkat maka IMT juga meningkat. Di antara tebal lipatan kulit yang diukur, TLkLh lebih besar korelasinya dengan IMT (0.937) jika dibandingkan dengan tebal lipatan kulit di daerah lainnya. Hal ini diduga dipengaruhi oleh struktur kulit di daerah leher lebih keras (didasarkan pada pengamatan di lapangan) dibandingkan dengan kulit perut. Walaupun demikian, tebal lipatan kulit perut perlu dipertimbangkan dalam penggolongan monyet ekor panjang gemuk karena ditunjang oleh korelasi lingkar pinggang yang sangat tinggi dengan IMT. Sebaliknya, tebal lipatan kulit trisep ternyata tidak menunjukkan korelasi yang tinggi dengan obesitas pada monyet ekor panjang. Analisis Komponen Utama Varian komponen utama pertama (PC1) adalah 502.02 dan menjelaskan 90.1% dari varian total, sedangkan varian komponen utama ke dua (PC2) adalah 25.57 dan menjelaskan 4.6% dari varian total (Lampiran 4). Secara bersamasama PC1 dan PC2 menjelaskan varian data sebesar 94.7% dari varian total. Komponen utama lainnya hanya menjelaskan variabilitas dalam proporsi yang kecil. Persamaan komponen utama pertama adalah PC1= -0.138BB -0.433IMT 0.111TD -0.560LPi -0.334LD -0.147LPh-0.088LTr -0.509TLkAb -0.010TLkTr 0.108TLkPh -0.172TLkPg -0.160TLkLh dan persamaan komponen utama kedua adalah PC2= 0.112BB +0.242IMT +0.312TD +0.152LPi +0.334LD +0.299LPh +0.156LTr -0.722TLkAb +0.020TLkTr +0.005TLkPh -0.229TLkPg -0.040 TLkLh. Persamaan PC1 dan PC2 disusun berdasarkan loading factor dari masingmasing variabel (Lampiran 4).

Penentuan koefisien dari parameter adalah

berubah-ubah (Costello dan Osborne 2005). Koefisien yang lebih besar dari 0.4 dapat digunakan sebagai penentu komponen utama.

Lebih jauh dijelaskan

45 bahwa komponen utama ditentukan minimal oleh tiga parameter. Berdasarkan persamaan PC1, terlihat bahwa ada 3 parameter yang sangat menentukan PC1 yaitu TLkAb, LPi, dan IMT dengan koefisien (loading factor) masing-masing adalah 0.509, 0.560 dan 0.433. Kalau dikaitkan dengan obesitas, berarti ke tiga faktor ini (TLkAb, LPi dan IMT) sangat berpengaruh dalam penggolongan obesitas pada monyet ekor panjang.

60

Obesitas gemuk tidak gemuk

Komponen ut ama kedua ( 4.6% )

Bl8 Uw2 Uw6

50 Uw1

40

Bl12Bl1

Ap8 Bl5 Bl9 Ub10 Ub11 Bl11 Uw11Ub4 Ub7 Ap15 Bl7 Ub6 Bl6 Ub1 Ub3 Ub2 Bl10 Ap13 Uw13 Ub12 Ap4 Uw3 Ub5 Uw4 Ap14 Ap7 Bl4 Uw15 Uw8 Ub13 Pal5 Ub15 Pal1 Pal14 Ap1 Pal3 Ub14 Pal7 Pal11 Pal4 Pal6 Pal12 Pal10 Pal13 Uw5 Pal8Pal2 Pal9 Pal15

30

Uw7

20 -150

-125 -100 -75 Komponen utama pertama (90.1% )

-50

Gambar 16 Plot komponen utama pertama dan komponen utama kedua

Sebagian besar monyet ekor panjang gemuk berkelompok dalam posisi yang berdekatan (dalam lingkaran), walaupun ada beberapa ekor (Uw1, Uw6 dan Uw7) monyet gemuk yang letaknya berjauhan (Gambar 16).

Hal ini

mengindikasikan bahwa monyet gemuk yang posisinya berjauhan dari kelompok gemuk dapat digolongkan kedalam monyet yang sangat gemuk. Di lain pihak, monyet asal Palembang mengelompok di luar lingkaran (sebelah kanan). Monyet asal Palembang ini tidak termasuk dalam kriteria obesitas karena tidak memenuhi kriteria obesitas baik IMT, lingkar pinggang dan lipatan kulit perut. Walaupun demikian, beberapa

monyet asal Baluran dan Alas Purwo ada

berdekatan dengan kelompok monyet yang mengalami obesitas. disebabkan oleh

adanya parameter yang terukur memenuhi

Hal ini

batas minimal

kriteria obesitas misalnya bobot badan melebihi atau sama dengan 7 kg atau

46 lingkar pinggang melebihi 39 cm walaupun IMTnya tidak memenuhi kriteria obesitas. Obesitas dan Struktur Sosial Monyet ekor panjang hidup dalam kelompok sosial multi male dan multi female yang berarti banyak jantan dewasa dan betina dewasa ada dalam satu kelompok. Sebuah kelompok sosial sering terbagi menjadi subkelompok (Rowe 1996). Adanya lebih dari satu jantan dewasa dalam sebuah kelompok sosial sering menimbulkan ketegangan di antara jantan sekelompok.

Keadaan ini

menimbulkan hirarki dominansi pada jantan dalam kelompok tersebut. Perilaku sosial anggota kelompok sangat dipengaruhi oleh hirarki dominansi.

Secara

umum, hirarki dominansi tertinggi diduduki oleh jantan dewasa yang dikenal dengan jantan- (Swindler 1998). Monyet ekor panjang jantan yang ditangkap di lokasi penelitian mempunyai hirarki yang berbeda dalam kelompoknya.

Monyet jantan yang

paling dominan dalam kelompoknya biasa disebut jantan a. Monyet jantan yang hirarkinya lebih rendah disebut jantan ß. Jantan a biasanya lebih besar dari jantan lainnya. Jantan a dalam kelompok tersebut pasti ikut tertangkap karena monyet ini selalu berada di depan kelompoknya ketika akan dibius baik dengan alat tulup maupun senapan. Di samping itu, penangkapan jantan a merupakan strategi di lapangan untuk menghindari serangan dari monyet. Monyet jantan lainnya relatif lebih mudah ditangkap setelah jantan a tertangkap. Variasi karakter fenotipe obesitas pada monyet ekor panjang ditentukan pula oleh tingkatan struktur sosial dari monyet tersebut. Monyet dominan cenderung menentukan saat makan bagi yang lain pada lokasi tertentu. Dalam kelompok yang dikandangkan, monyet subordinat akan makan hanya setelah hewan dominan puas.

Pola tingkah laku seperti ini menghasilkan kelebihan

asupan energi pada monyet dominan. Obesitas ini terutama akibat dari organisasi sosial. Dalam keadaan ini, monyet lebih banyak mengakumulasikan lemak abdominal. Lebih jauh, bila organisasi sosial kacau, seperti bila hewan berada dalam lingkungan urban atau bila kelompok sosial diubah dengan menambahkan anggota baru, obesitas mungkin dihambat dengan pengrusakan hirarki dominan ini.

Penelitian pada kelompok monyet ekor panjang jantan

menunjukkan bahwa perubahan struktur sosial dapat dilakukan dengan memasukkan monyet baru pada suatu kelompok untuk memicu stress (Jayo et al. 1993).

47 Karakteristik Genetik Gen MC4R Monyet Ekor Panjang Amplifikasi Gen MC4R Sebanyak 48 sampel yang berhasil diamplifikasi dengan primer MC4R forward dan reverse. Produk PCR tersebut berukuran 1146 pb yang di dalamnya mengandung ORF (open reading frame) gen MC4R secara utuh yaitu sebesar 999 pb dan terdiri dari 332 asam amino. Lokasi penempelan primer disajikan pada Gambar 17 sedangkan hasil elektroforesis produk PCR tersebut disajikan pada Gambar 18. Hasil penyejajaran seluruh urutan nukleotida dan asam amino masing-masing disajikan dalam Lampiran 1 dan Lampiran 2.

MC4R forward

Ekson 999pb

MC4R reverse

5’

3’

Produk PCR 1146pb

Gambar 17 Skema letak penempelan primer MC4R forward dan MC4R reverse untuk mengamplifikasi gen MC4R monyet ekor panjang

1000pb

1146pb

500pb

Gambar 18 Hasil elektroforesis beberapa produk PCR gen MC4R yang diamplifikasi menggunakan pasangan primer MC4R Keterangan: M = DNA penanda 100pb 1-11 = contoh produk PCR dari beberapa sampel

48 Keragaman Intra Populasi Semua urutan produk PCR (1146 pb) diedit dan disejajarkan dengan program Mega 4.0 serta diperoleh urutan seluruh daerah penyandi gen MC4R sepanjang 999 pb. Berdasarkan urutan yang disejajarkan tersebut diperoleh perbedaan nukleotida dan asam amino di antara individu dalam populasi (Tabel 6). Jumlah perbedaan nukleotida intra populasi yang tertinggi ada di kelompok monyet di Alas Purwo dan rataan perbedaaan nukleotida intra populasi ( ) adalah 1.832.

Hal ini menunjukkan bahwa perubahan nukleotida gen MC4R

paling banyak terjadi pada individu asal Alas Purwo. Perubahan asam amino MC4R yang paling tinggi terdapat di antara individu dalam populasi asal Alas Purwo dan yang terendah adalah populasi asal Uluwatu dan rata-rata diversitas asam amino ( ) intra populasi adalah 0.97. Hal ini disebabkan oleh pola mutasi yang berbeda, yaitu ada mutasi yang bersifat sinonim dan ada mutasi yang bersifat nonsinonim. Mutasi yang bersifat sinonim tidak menyebabkan perubahan pada asam amino sedangkan mutasi yang bersifat nonsinonim menyebabkan terjadinya perubahan asam amino. Tabel 6 Rata-rata jumlah nukleotida dan asam amino yang berbeda pada gen MC4R monyet ekor panjang dalam masing-masing populasi Asal populasi Palembang (n 15) Alas Purwo (n=4) Baluran (n=7) Ubud (n=12) Uluwatu (n=9)

Jumlah nukleotida yang berbeda 1.505 (0.15%) 4.000 (0.40%) 1.430 (0.14%) 1.282 (0.13%) 0.944 (0.09%)

Jumlah asam amino yang berbeda 0.533 (0.05%) 3.000 (0.30 %) 1.143 (0.11%) 0.154 (0.01%) 0.000 (0.00%)

Keragaman Antar Populasi Perbedaan nukleotida tertinggi didapatkan antara populasi Ubud dan Alas Purwo

sedangkan yang terendah adalah antara populasi Ubud dan Uluwatu

(Tabel 7). Perbedaan asam amino antar populasi yang tertinggi adalah antara populasi Alas Purwo dan Baluran

sedangkan yang terendah adalah antara

populasi Uluwatu dan Ubud (Tabel 8).

Perbedaan yang sangat kecil ini

menunjukkan bahwa mutasi pada gen MC4R pada tingkat spesies sangat rendah. Hal ini berkaitan dengan kecilnya perubahan nukleotida yang terjadi di daerah penyandi gen MC4R.

49 Tabel 7

Matriks perbedaan basa nukleotida gen MC4R monyet ekor panjang antar populasi.

Populasi Palembang Alas Purwo Baluran Uluwatu Ubud

Palembang

Alas Purwo

2.733 1.581 1.244 1.508

Baluran

2.643 2.556 3.038

Uluwatu

1.270 1.846

1.248

Keterangan: Angka tersebut ditentukan dengan program Mega 4.0 dan diperoleh dari rata-rata perbedaan basa per urutan dari seluruh pasang urutan antar kelompok dan didasarkan pada analisis berpasangan dari 48 urutan (999 pb). Tabel 8 Matriks perbedaan asam amino gen MC4R monyet ekor panjang antar populasi. Populasi Palembang Alas Purwo Baluran Uluwatu Ubud

Palembang

Alas Purwo

1.767 0.838 0.267 0.344

Baluran

2.000 1.500 1.577

Uluwatu

0.571 0.626

0.077

Keterangan: Angka tersebut ditentukan dengan program Mega 4.0 dan diperoleh dari rata-rata perbedaan asam amino per urutan dari seluruh pasang urutan antar kelompok dan didasarkan pada analisis berpasangan dari 48 urutan (332 asam amino). Komposisi Nukleotida dan Asam Amino Secara umum, komposisi nukleotida gen MC4R yang diperoleh pada monyet ekor panjang dari berbagai lokasi penelitian menunjukkan komposisi yang hampir sama (Tabel 9). Komposisi A dan T dari gen MC4R monyet ekor panjang berkisar antara 53.9-54.1 sedangkan komposisi G dan C nya berkisar antara 45.9-46.0. Komposisi nukleotida kodon ketiga yang paling banyak adalah C (36.4%) kemudian berturut-turut adalah T (28.3%), G (21.9%), dan A (13.7%). Komposisi nukleotida kodon kedua yang paling banyak adalah T (40.5%) sedangkan pada kodon pertama yang paling banyak adalah A (33.9%). Tabel 9 Rata-rata komposisi nukleotida (%) pada gen MC4R monyet ekor panjang No 1 2 3 4 5 6 R

T 31.1 31.0 30.9 31.0 31.0 31.0 31.0

C 24.5 24.5 24.6 24.6 24.5 24.5 24.5

A 22.9 23.1 23.0 23.0 23.1 23.1 23.1

G 21.4 21.4 21.4 21.4 21.4 21.4 21.4

A+T 54.0 54.1 53.9 54.0 54.1 54.1 54.0

G+C 45.9 45.9 46.0 46.0 45.9 45.9 45.9

T-1 24.3 24.3 24.2 24.3 24.3 24.3 24.3

C-1 17.7 17.7 17.8 17.7 17.7 17.7 17.7

A-1 34.2 33.9 33.9 33.9 33.9 33.9 33.9

G-1 23.7 24.0 24.1 24.0 24.0 24.0 24.0

T-2 40.5 40.5 40.3 40.5 40.5 40.5 40.5

C-2 19.5 16.6 19.7 19.6 19.5 19.5 19.6

A-2 21.6 21.6 21.6 21.6 21.6 21.6 21.6

G-2 18.3 18.3 18.4 18.3 18.3 18.3 18.3

T-3 28.5 28.2 28.2 28.3 28.3 28.2 28.2

C-3 36.3 36.3 36.4 36.3 36.1 36.3 36.3

A-3 12.9 13.7 13.6 13.5 13.7 13.6 13.6

Keterangan : 1= GenBank, 2=Palembang, 3=Alas Purwo, 4=Baluran, 5=Ubud, 6=Uluwatu, rata-rata (hasil penelitian), A=adenina, T=timina, C=sitosina, G=guanina

G-3 22.2 21.9 21.8 21.9 21.9 22.0 21.9

R=

50

Asam amino penyusun produk gen MC4R terdiri atas 20 asam amino (Tabel 10). Rata-rata komposisi asam amino leusina (Leu) merupakan penyusun terbesar dan yang terkecil adalah triptofan. Komposisi asam amino dari masingmasing individu menunjukkan adanya perbedaan karena adanya mutasi dari beberapa asam amino penyusun MC4Rnya. Komposisi asam amino ternyata mempunyai korelasi dengan ekspresi gen (Raghava dan Han 2005). Residu alanina (Ala), glisina (Gly), arginina (Arg), dan valina (Val) diketahui mempunyai korelasi positif terhadap ekspresi gen, sedangkan residu asam aspartat (Asp), leusina (Leu), asparagin (Asn), dan serina (Ser) mempunyai korelasi negatif. Tabel 10 Rata-rata komposisi asam amino (%) gen MC4R pada monyet ekor panjang Asam Amino Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr Total

GenBank 6.33 4.52 3.01 2.11 5.52 4.52 3.31 11.45 2.41 12.05 3.92 4.52 2.41 1.81 3.61 10.54 5.12 7.83 0.90 4.22 332

Palembang (n=15) 6.33 4.50 3.01 2.11 5.52 4.84 3.31 11.45 2.41 12.03 3.92 4.52 2.45 1.81 3.29 10.54 5.12 7.81 0.92 4.22 332

Alas Purwo (n=4) 6.48 4.52 3.01 2.11 5.42 4.74 3.39 11.45 2.41 11.82 3.92 4.44 2.48 1.81 3.39 10.47 5.12 7.83 0.98 4.22 332

Baluran (n=7) 6.41 4.52 3.01 2.11 5.52 4.78 3.27 11.40 2.41 12.05 3.92 4.56 2.45 1.81 3.31 10.54 5.12 7.79 0.90 4.22 332

Ubud (n=13) 6.33 4.52 3.01 2.11 5.42 4.82 3.29 11.45 2.41 12.05 3.92 4.52 2.43 1.81 3.31 10.54 5.12 7.83 0.90 4.22 332

Uluwatu (n=9) 6.33 4.52 3.01 2.11 5.42 4.82 3.31 11.45 2.41 12.05 3.92 4.52 2.41 1.81 3.31 10.54 5.12 7.83 0.90 4.22 332

Analisis Filogeni Kelompok Ubud berdekatan dengan kelompok Uluwatu (Gambar 19). Kelompok Bali lebih dekat jarak genetiknya dengan kelompok Palembang daripada dengan kelompok Jawa Timur.

Monyet asal Ubud masih konsisten

berada dalam satu kelompok dengan monyet asal Uluwatu tetapi Palembang

51 masuk ke dalam kelompok ini (Gambar 20). Dengan demikian, filogram yang dibuat berdasarkan gen MC4R tidak selalu dapat menunjukkan pengelompokan monyet ekor panjang yang berada dalam lokasi habitat yang berdekatan. Jika menggunakan mtDNA (DNA mitokondria) mungkin bisa dilihat hubungan asal.

Ubud Uluwatu Palembang Baluran Alas Purwo 0.2

Gambar 19 Filogram antar populasi yang dibuat dengan metode Neighbor Joining (NJ) berdasarkan perbedaan nukleotida

Palembang Uluwatu Ubud Baluran Alas Purwo 0.2

Gambar 20 Filogram antar populasi yang dibuat berdasarkan perbedaan asam amino

dengan

metode

NJ

Bila keseluruhan hasil urutan dijadikan data penyusun filogram, terlihat bahwa Uw 7 yang sangat gemuk dekat jarak genetiknya dan berada dalam satu kelompok dengan Pal 13 (Gambar 21 dan 22). Hal ini mengindikasikan bahwa ada kecenderungan monyet ekor panjang yang sekelompok tersebut akan dapat menunjukkan obesitas bila lingkungan memungkinkan. Lingkungan dalam hal ini adalah tersedianya pakan yang cukup. Dengan demikian, jumlah asupan pakan yang banyak dan kurangnya aktivitas akan memacu terjadinya obesitas. Monyet yang sangat gemuk lainnnya yaitu Uw 1 (asal Uluwatu) berada pada kelompok yang berbeda dengan Uw 7 (Gambar 21A). Monyet Uw 1 dekat jarak genetiknya dengan beberapa monyet asal Palembang (Pal), Baluran (Bl), Alas Purwo (Ap) dan Ubud (UB). Hal ini juga mengindikasikan bahwa monyet ekor panjang yang berasal dari daerah lainnya berpeluang mengalami obesitas.

52 Kalau diperhatikan urutan asam aminonya, 40 dari 48 (83.3%) monyet yang digunakan dalam penelitian ini berada sekelompok dengan monyet yang menunjukkan gejala obesitas bahkan dengan yang sangat gemuk sekalipun. Hal ini berarti sebagian besar urutan asam amino dari gen MC4R pada sampel penelitian ini hampir sama walaupun ada sebagian kecil yang mengalami perubahan. Pal 13 UW 7 UB 7 UW 3 UB 3 24 Pal 2 UW 5 UB 15 UB 6 14 UB 5 UB 2 UB 4 Bl 1 10 UB 10 52 53 UB 11 54 UB 14 Pal 3 52 Ap 15 11 Bl 4 30 Pal 5 3 Pal 12 Pal 11 16 Pal 15 45 UB 12 Pal 8 Pal 4 UW 13 Bl 12 Ap 8 Pal 1 Bl 5 UW 1 UW 4 Ap 14 Pal 10 UB 13 Pal 7 Pal 9 UW 15 Bl 11 Ap 1 Bl 6 Pal 6 UB 1 UW 8 Bl 7 UW 11 Pal 14

Pal 3 UB 6 UB 7 UB 1 UB 3 Pal 8 Ap 1 Bl 12 Bl 5 UB 4 Pal 12 UB 11 Bl 11 Pal 4 UB 12 UW 8 Pal 13 UB 14 Bl 6 UB 2 Pal 1 Pal 9 Pal 7 Pal 15 Pal 6 UW 3 Ap 14 UW 11 UB 13 UW 15 Bl 7 UB 5 Pal 10 UW 5 UB 15 Pal 11 UW 7 UW 13 UW 4 UW 1 Pal 2 Pal 14 Ap 8 Bl 1 64 UB 10 Ap 15 65 Bl 4 Pal 5

Pan troglodytes 0.002

Pan troglodytes

A 0.001

B

Gambar 21 Filogram monyet ekor panjang menggunakan metode NJ dan p distance dari nukleotida MC4R (999pb). (A) dibuat berdasarkan seluruh kodon sedangkan (B) tanpa triplet kodon ke tiga

53 Pal 13 Pal 14 Pal 2 Pal 4 Ap 8 UB 13 UB 6 UB 12 Pal 6 Bl 11 UB 11 UW 11 Pal 7 UB 3 UB 15 Bl 7 Pal 3 Ap 14 Pal 9 UW 3 UW 15 UW 4 Ap 1 UB 14 Bl 6 UB 4 UB 5 UW 13 UW 5 Pal 15 UW 8 Pal 8 UB 7 UW 1 UB 2 63

Ap 15 Bl 4 Bl 1

64 UB 10 Pal 10 UB 1 Bl 5 Pal 5 Pal 1 Pal 11 Bl 12 Pal 12 UW 7 Pan troglodytes 0.002

Gambar 22 Filogram monyet ekor panjang menggunakan metode NJ dan p distance dari asam amino MC4R (332 aa) Pengelompokan (Gambar 21 dan 22) akan dapat berubah karena nilai bootstrap yang kecil. Hal ini juga menunjukkan kesamaan urutan gen MC4R yang tinggi antar individu.

Kesamaan yang tinggi ini disebabkan oleh posisi

urutan DNA terdapat pada daerah penyandi (coding region) yang merupakan urutan DNA yang bersifat kekal. Lebih jauh, Hughes et al. (2009) menyatakan bahwa gen MC4R merupakan gen yang sangat kekal sepanjang sejarah evolusi vertebrata.

54 Perlakuan terhadap posisi nukleotida yang berbeda dalam penyejajaran urutan DNA

adalah biasa dilakukan dalam penyusunan pohon filogeni.

Perlakuan ini diterapkan pada urutan DNA penyandi protein karena perubahan pada

masing-masing

basa

nukleotida

penyusun

triplet

kodon

berbeda

pengaruhnya pada urutan asam amino (Bofkin dan Goldman 2007). Lebih jauh, dijelaskan bahwa setiap perubahan basa nukleotida pada posisi ke dua triplet kodon menyebabkan terjadinya perubahan nonsinonim. Perubahan basa nukleotida pada posisi ke tiga dari triplet kodon hampir seluruhnya menyandi asam amino yang sama (bersifat sinonim). Oleh karena itu, pendekatan pohon filogeni berbasis nukleotida dan tidak menyertakan basa ke tiga dari triplet kodon lebih

konsisten hasilnya dengan penyusunan pohon filogeni berbasis asam

amino. Gambar 21 (B) diperoleh dengan meniadakan basa ke tiga dari triplet kodon. Dengan demikian, didapatkan gambar yang mirip dengan Gambar 22 (berbasis asam amino). Ada perbedaan antara Gambar 21(A), 21(B) dan 22. Gambar 21 (A) menunjukkan banyak percabangan walaupun nilai bootstrap-nya kecil. Perbedaan antara Gambar 21 dan 22 disebabkan oleh kejadian mutasi pada basa nukleotida lebih banyak daripada mutasi pada asam amino. Kalau ditelusuri lebih jauh ternyata sebagian besar perbedaan itu disebabkan oleh adanya mutasi nukleotida pada basa ke tiga dari triplet kodon. Gambar 21 (B) dan Gambar 22 berbeda pada individu Pal 13. Perbedaan ini disebabkan oleh mutasi pada basa ke tiga dari triplet kodon yang bersifat nonsinonim, walaupun sebagian besar (70%) mutasi pada basa ke tiga dari triplet kodon bersifat sinonim (Li 1997). Pada kasus ini, perubahan tersebut terjadi pada basa ke tiga dari triplet kodon (situs 813 T/G) yang menyebabkan perubahan asam amino sisteina (Cys) menjadi asam amino triptofan (Trp). Berdasarkan analisis filiogeni terlihat bahwa monyet yang dipakai dalam penelitian ini bergabung dalam satu kelompok. Hal ini mengindikasikan bahwa dalam hal obesitas, tidak perlu pengelompokan monyet secara geografis. Dengan demikian, daerah asal monyet tidak menjadi penentu dalam terjadinya obesitas pada monyet ekor panjang. Data fonotipe juga menunjukkan bahwa obesitas dapat terjadi di berbagai daerah dengan keadaan geografis yang berbeda.

Dalam hal ini, makanan merupakan faktor penunjang terjadinya

obesitas. Walaupun makanan tidak tersedia di dalam habitatnya, makanan yang diberikan oleh manusia sangat mendukung terjadinya obesitas.

55 Perbandingan Gen MC4R Monyet Ekor Panjang dengan Organisme Lainnya Filogram disusun berdasarkan data urutan gen penyandi MC4R beberapa monyet hasil penelitian dan organisme lainnya (Gambar 23).

Urutan daerah

penyandi gen MC4R organisme lainnya diunduh dari GenBank (www.ncbi.nlm. nih.gov/).

Organisme tersebut antara lain Callithrix jacchus (kode akses:

EF384226), Homo sapien (AY236539), Mus musculus (NC000084), Pan troglodytes (NC006451), Pongo pygmaeus (EF384226), Macaca mulatta (NW001105681), Mus musculus (NC000084). M. fascicularis ternyata berada satu kelompok dengan M. mulatta (Gambar 23). Filogram yang didapatkan oleh Hughes et al. (2009) juga menunjukkan bahwa M. fascicularis berada satu kelompok dengan M. mulatta. Hal ini berarti urutan gen MC4R sangat mirip di antara genus Macaca.

Kelompok monyet

dunia lama juga terpisah dengan C. jacchus (monyet dunia baru) berdasarkan urutan gen MC4R.

Filogram yang berdasarkan urutan MC4R juga mampu

menunjukkan bahwa simpanse (P. troglodytes) sangat dekat dengan manusia (H. sapien). Secara evolusi, manusia terpisah dari simpanse sejak 6 juta tahun yang lalu dan terpisah dari Macaca sejak 25 juta tahun tahun yang lalu (Gibbs 2007). Di samping itu, filogram ini juga menunjukkan bahwa urutan gen MC4R manusia lebih dekat dengan genus Macaca daripada dengan tikus (M. musculus). Macaca fascicular is (Jat im 1)

83

M. fascicularis (Jatim 2) 100 M. fascicular is (Bali 2) M. f ascicular is (Bali 1) M. mulatta Pongo pygm aeus Hom o sapien 93 90 Pan t r oglodyt es Challit hr ix jacchus Mus musculus

0.01

Gambar 23 Filogram menggunakan metode NJ dan model p distance dari nukleotida gen MC4R (999pb) berbagai spesies primata. M. musculus digunakan sebagai kelompok luar. Jatim 1, Jatim 2, Bali 1 dan Bali 2 adalah perwakilan sampel monyet ekor panjang Polimorfisme Gen MC4R pada Monyet Ekor Panjang Berdasar pada penyejajaran seluruh urutan (48 urutan) ditemukan sebanyak 20 lokus nukleotida beragam (polimorfik) dan 13 di antaranya adalah

56 nonsinonim (Tabel 11).

Mutasi sinonim adalah mutasi pada basa nukleotida

tetapi tidak menyebabkan terjadinya perubahan asam amino sedangkan mutasi nonsinonim adalah mutasi yang menyebabkan terjadinya perubahan asam amino. Mutasi sinonim paling banyak ditemukan pada populasi asal Uluwatu, sedangkan mutasi nonsinonim terbanyak terdapat pada populasi asal Alas Purwo. Dari 20 situs nukleotida beragam, substitusi paling sering pada basa ke dua dari triplet kodon, yaitu sebanyak 10 kali, sedangkan pada basa ke satu dari triplet kodon dan basa ketiga dari triplet kodon masing-masing adalah 2 dan 8 kali. Perubahan pada basa ke dua dari triplet kodon merupakan hal yang paling umum menyebabkan terjadinya perubahan asam amino (Bofkin dan Goldman 2007). Tabel 11 Polimorfisme gen MC4R pada monyet ekor panjang Asal Populasi Palembang (n=15) Alas Purwo (n=4)

S

Baluran (n=7) Ubud (n=13) Uluwatu (n=9) Total

N

Situs

3

4

(%) 0.15

2

6

0.40

1

4

0.14

3

1

0.12

3

0

0.09

S=519C/A, 885A/T, 927G/A N=707G/C, 764T/G, 788T/C, 813T/G S=165T/C, 927G/A N=7A/C, 698G/C, 749T/C, 899T/G, 983T/G, 985T/G S=690C/T N= 698G/C, 734T/A, 758T/C, 791A/C S=519C/A, 885A/T, 927G/A N= 791A/C S=519C/A, 954T/C, 987T/G N=0 27 (20)

12 15 (7) (13) Keterangan: S= mutasi sinonim; N=mutasi nonsinonim; = diversitas nukleotida. Angka total di dalam kurung menunjukkan jumlah jenis situs setelah dikurangi beberapa situs yang sama yang ditemukan pada asal populasi yang berbeda Diversitas nukleotida tertinggi ada pada monyet asal Alas Purwo dan yang terendah ditemukan di Uluwatu (Tabel 11). Rata-rata diversitas nukleotida pada gen MC4R dalam spesies monyet ekor panjang adalah 0.18% (0.0018). Diversitas nukleotida ini tergolong kecil. Hal ini disebabkan oleh rendahnya mutasi di daerah penyandi. Di samping itu, laju mutasi pada DNA inti adalah lebih kecil dibandingkan dengan laju mutasi pada DNA mitokondria (Pitman 2008). Lebih jauh, diungkapkan bahwa laju mutasi nukleotida berbeda pada daerah dan gen yang berbeda.

57 Substitusi nukleotida dapat pula digolongkan ke dalam substitusi transisi dan transversi (Tabel 12).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa substitusi

transversi lebih banyak terjadi dibandingkan dengan substitusi transisi. Kejadian in berkaitan dengan komposisi A (adenina) dan T (timina) dan G (guanina) dan C (sitosina) dari urutan gen MC4R. Zhang dan Zhao (2004) menyatakan bahwa kemungkinan substitusi transversi akan meningkat sesuai dengan peningkatan kandungan basa nukleotida A dan T. Pendapat ini sesuai dengan komposisi A dan T gen MC4R yang lebih besar dari komposi G dan C nya (Tabel 9). Tabel 12 Jumlah substitusi transisi dan transversi pada gen MC4R monyet ekor panjang Substitusi Palembang Alas Purwo Baluran Ubud Uluwatu Transisi 2 (5) 3 (2) 2 (1) 1 (3) 1 (1) Transversi 5 (6) 5 (2) 3 (2) 3 (11) 2 (3) Total 7 (8) 8 (2) 5 (2) 4 (11) 3 (4) Keterangan: angka dalam kurung menunjukkan jumlah individu.

Total 9 (12) 18 (24) 28 (27)

Asosiasi Mutasi MC4R dengan Fenotipe Obesitas pada Monyet Ekor Panjang Ada 13 jenis mutasi nonsinonim MC4R yang ditemukan dalam penelitian ini (Tabel 13). Kejadian terbanyak ditemukan pada jenis mutasi Gly233Ala dan His264Pro yang masing-masing ditemukan pada dua individu. Di samping itu, AP8 yang merupakan monyet asal Alas Purwo (gemuk) membawa mutan paling banyak dibandingkan dengan individu pembawa mutan lainnya. Tabel 13 Mutasi nonsinonim daerah penyandi gen MC4R monyet ekor panjang Mutasi

Nukleotida

Asn3His Gly233Ala

7A/C 698G/C 698G/C 707G/C 734T/A 749T/C 758T/C 764T/G 788T/C 791A/C 791A/C 813T/G 899T/G 983T/G 985T>G

Arg236Pro Ile245Asn Leu250Pro Val253Ala Val255Gly Leu263Pro His264Pro Cys271Trp Leu300Arg Leu328Trp Ser329Ala

Perubahan kodon AAC CAC GGT GCT GGT GCT CGC CCC ATT AAT CTG CCG GTC GCC GTT GGT CTC CCC CAC CCC CAC CCC TGT TGG CTG CGG TTG TGG TCT GCT

Individu

Status

Ap8 Ap15 BL4 Pal2 BL1 Ap15 BL1 Pal14 Pal2 BL1 Ub10 Pal13 Ap8 Ap8 Ap8

gemuk gemuk tidak gemuk tidak gemuk tidak gemuk gemuk tidak gemuk tidak gemuk tidak gemuk tidak gemuk gemuk tidak gemuk gemuk gemuk gemuk

58 Secara keseluruhan, ada mutasi yang khas dan hanya terjadi pada monyet gemuk adalah Asn3His, Leu250Pro, Leu300Arg, Leu 328Trp, dan Ser329Ala (Lampiran 5).

Mutasi ini menunjukkan adanya indikasi asosiasi ke lima situs

mutasi tersebut dengan obesitas pada monyet ekor panjang. Mutasi Asn3His berada pada ujung NH2 dari reseptor melanokortin 4 (MC4R). Srinivasan et al. (2004) menyatakan bahwa ujung NH2 sangat penting dalam aktivitas reseptor. Mutasi di daerah ujung NH2 dapat mengganggu aktivitas MC4R. Di sisi lain, mutasi pada posisi 250 ditemukan pada manusia tetapi perubahan asam aminonya adalah Leu250Gln. Pada manusia, mutan Leu250Gln dinyatakan terperangkap di dalam sel (Tao 2005) sehingga MC4R tidak dapat berfungsi dan akibatnya timbul obesitas.

Mutan Leu300Arg, Leu328Arg, dan Ser329Ala

kemungkinan dapat mengganggu fungsi MC4R karena ke tiga posisi tersebut terletak di bagian MC4R (di dalam sitosol) yang beperan dalam interaksi dengan protein G (Lodish et al. 2004). Hasil penelitian juga menunjukkan bahwa mutasi nonsinonim MC4R terjadi baik pada monyet gemuk maupun yang tidak gemuk.

Sebanyak 26 ekor dari

total 48 sampel monyet ekor panjang mengalami obesitas (54.2%) dan 22 ekor tidak gemuk (45.8%). Sebanyak 11.5% (3/26) dari monyet gemuk dan 22.7% (5/22) dari monyet tidak gemuk merupakan pembawa mutan MC4R. Di samping itu, sebanyak 88.5% (23/26)

monyet yang mengalami obesitas tetapi tidak

menunjukkan adanya mutasi nonsinonim pada MC4R. Hal ini mengindikasikan kemungkinan peran dari gen lain dalam menentukan terjadinya obesitas.

Di

samping itu, mutasi nukleotida di daerah promoter juga berperan pada obesitas pada manusia (Lubrano-Berthelier et al. 2003).

Mereka menemukan adanya

beberapa varian di daerah promoter yaitu -176 A/G, -178 A/C, dan -360 G/T. Varian tersebut ditemukan pada anak-anak, remaja dan dewasa yang mengalami obesitas. Lingkungan juga sangat berperan dalam terjadinya obesitas pada manusia (Han dan Lean 2001). Gaya hidup santai dan makan berlebihan merupakan faktor penunjang terjadinya obesitas. Monyet ekor panjang yang tidak gemuk tetapi menunjukkan mutasi pada MC4R akan berpeluang menjadi gemuk bila lingkungan mendukung. Lingkungan tersebut meliputi ketersedian pakan yang cukup dan kurangnya aktivitas. Sumber pakan bisa berasal dari habitat alami, lokasi

pertanian, pemberian

manusia, dan sampah baik berupa sisa dapur maupun persembahan di pura (Bali).

Sisa-sisa dapur dapat menyebabkan obesitas pada kelompok baboon

59 (Banks et al. 2003), walaupun belum ada laporan tentang variasi MC4R pada spesies ini. Banyak monyet gemuk tidak menunjukkan adanya mutasi nonsinonim pada gen MC4R 88.5% (23/26). Walaupun demikian, mutasi yang bersifat sinonim sebenarnya sudah terjadi pada monyet tersebut (Tabel 14). Mutasi sinonim yang paling banyak frekuensi kejadiannya adalah 519C/A sedangkan yang paling sedikit kejadiannya adalah 165T/C, 690C/T, 954T/C, dan 987T/G. Tabel 14 Mutasi sinonim pada gen MC4R monyet ekor panjang Mutasi 165T/C 519C/A

690C/T 885A/T 927G/A

954T/C 987T/G

Kejadian 1 (Ap8) 4 (Pal2,11,13,15) 9 (Ub2,3,4,5,6,7,10,12,15) 3 (Uw3,5,7) 1 (Bl4) 1 (Pal3) 2 (Ub11,14) 1 (Ap15) 5 (Pal5,11,12,15) 3 (Ub11,12,14) 1 (Uw7) 1 (Uw13)

Status gemuk tidak gemuk gemuk gemuk tidak gemuk tidak gemuk gemuk gemuk tidak gemuk gemuk gemuk gemuk

Mutasi sinonim banyak ditemukan pada monyet ekor panjang asal Ubud. Mutasi tersebut tidak menyebabkan terjadinya perubahan asam amino dan secara fisiologis, tidak bepengaruh pada fungsi reseptor. Walaupun demikian, mutasi ini menyebabkan perubahan komposisi nukleotida.

Pada bakteri,

komposisi nukleotida memberi arti bahwa tekanan mutasi dua arah antara pasangan G/C dan A/T merupakan sumber utama dari variasi. (Sueoka dan Kawanishi 2000). Lebih jauh, diungkapkan bahwa mutasi memberi arti yang penting pada evolusi dari heterogenitas intragenom dari genom mamalia.

PEMBAHASAN UMUM Fenotipe Obesitas Secara fenotipe, monyet ekor panjang yang berasal dari Bali (Ubud dan Uluwatu) memiliki rata-rata bobot badan yang lebih tinggi dibandingkan dengan monyet yang berada di lokasi lainnya. Monyet tersebut juga menunjukkan gejala obesitas. Bobot badan yang tinggi akan berakibat pada IMT yang tinggi. IMT tinggi konsisten dengan meningkatnya lingkar pinggang (LPi), lingkar dada (LD), dan lipatan kulit pada monyet yang mengalami obesitas. Penentuan obesitas pada manusia didasarkan pada IMT yang melebihi 30 kg/m2 (WHO 2005). Pada monyet ekor panjang, belum ada kategori obesitas berdasarkan IMT. Sedangkan pada M. radiata jantan dengan rata-rata IMT sebesar 35 kg/m2 telah menunjukkan sindroma metabolik (Kaufman et al. 2005).

Di samping itu, M.

mulatta jantan telah dikategorikan mengalami obesitas bila IMT berkisar antara 32-44 kg/m2. Lipatan kulit trisep tidak menunjukkan perbedaan antara monyet gemuk dan yang tidak gemuk. Tebal lipatan kulit trisep (TLkTr) dari monyet yang berasal dari berbagai lokasi sebagian besar sama kecuali monyet asal Uluwatu (Tabel 4). Korelasi antara IMT dan tebal lipatan kulit trisep paling kecil dibandingkan dengan lipatan kulit di bagian tubuh lainnya. Dengan demikian, lipatan kulit trisep tidak dapat digunakan sebagai pembeda antara monyet gemuk dan monyet yang tidak gemuk.

Jika dibandingkan dengan manusia, lipatan kulit trisep pada

individu gemuk berbeda nyata dengan lipatan kulit trisep pada individu yang tidak gemuk (Chatterjee et al. 2006; Semiz et al. 2007). mengindikasikan

Perbedaan ini

ada perbedaaan pola penyimpanan lemak subkutan antara

monyet ekor panjang dan manusia terutama di daerah lengan atas. Tebal lipatan kulit menunjukkan akumulasi lemak di bawah kulit (sub kutan).

Hamada et al. (2003) menyatakan bahwa ketebalan lipatan kulit

berhubungan dengan persentase massa lemak tubuh. Lebih jauh dinyatakan pula lemak cendrung diakumulasikan pada jaringan di bawah kulit daripada di dalam jaringan tubuh bagian dalam. Koganezawa (1995) menyatakan bahwa peningkatan massa lemak pada monyet jepang (M. fuscata)

awalnya terjadi

pada lemak penggantung usus (omentum majus), kemudian sekitar ginjal, dan akhirnya

lemak subkutan.

sebaliknya.

Penurunan massa lemak dimulai dengan urutan

61 Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa penimbunan lemak di bawah kulit terjadi

setelah bobot badan melebihi 7 kg.

Hal ini ditunjukkan oleh adanya

peningkatan tebal lipatan kulit yang nyata terjadi pada kelompok monyet yang ada di Uluwatu dan Ubud. Bila dibandingkan dengan M. fuscata, Hamada et al. (2003) menyatakan bahwa akumulasi lemak di bawah kulit pada M. fuscata jantan mulai terjadi saat bobot badan mencapai 12 kg. Monyet yang ada di daerah pariwisata dan pura di Bali banyak mendapat makanan sisa persembahan dan tergolong dalam makanan olahan. Di samping itu, pengunjung juga biasa memberi makan monyet-monyet yang ada di kawasan wisata tersebut. Pengunjung ke daerah wisata Uluwatu dan Ubud dapat melebihi 800 orang/hari (komunikasi pribadi dengan pengelola). Makanan olahan lebih tinggi indeks glikemiknya dibandingkan dengan makanan segar.

Makanan

dengan indeks glikemik yang tinggi berperan dalam peningkatan asupan pakan dan obesitas (Teff 2005).

Makanan tersebut lebih cepat dicerna dan

meningkatkan glukosa darah dibandingkan dengan makanan dengan indeks glikemik rendah. Dengan demikian, makanan olahan ini diduga sangat berperan dalam terjadinya obesitas pada monyet ekor panjang yang banyak ditemukan di Bali. Walaupun demikian, aktivitas sangat berperan dalam terjadinya obesitas. Sullivan et al. (2006) menyatakan bahwa aktivitas merupakan faktor utama yang berperan dalam perubahan bobot badan.

Sebaliknya, penelitian mereka

menunjukkan bahwa tidak ada korelasi antara asupan pakan dengan pertambahan bobot badan pada M. mulatta. Walaupun demikian, tidak dapat dipungkiri bahwa pakan tetap berperan dalam terjadinya obesitas. Variasi

obesitas muncul akibat dari adanya

perbedaan dalam masuknya kalori yang ditentukan oleh perbedaan dalam asupan pakan dan atau efisiensi penyerapan nutrien.

Astuti et al. (2007)

menyatakan pakan dengan kandungan energi sebesar 2.42 Kal/kg bobot badan dapat meningkatkan konsumsi dan kecernaan nutrien pada monyet ekor panjang.

Namun, hal yang menyangkut efisiensi nutrien mungkin sangat

kompleks dan melibatkan pemrosesan nutrien melalui saluran pencernaan, metabolisme energi dan efisiensi dalam penyimpanan lemak. Umur juga berperan dalam kejadian obesitas pada monyet ekor panjang. Berdasarkan pengamatan di lapangan, tidak ditemukan monyet muda yang mengalami obesitas. Di lain pihak, obesitas pada manusia dapat terjadi pada anak-anak (Hainerová et al. 2007). Selain umur, cekaman juga berpengaruh

62 pada obesitas. Pada monyet bonnet (M. radiata) remaja ditemukan kejadian obesitas (Kaufman et al. 2007), karena pengaruh perlakuan cekaman (variasi pakan) pada

masa awal kehidupan monyet tersebut.

Cekaman pakan

mengganggu perkembangan saraf dan dapat menyebabkan obesitas. Kriteria obesitas yang digunakan dalam penelitian ini adalah IMT yang ditentukan menurut Kaufman et al. (2005). Namun berdasarkan penelitian ini, IMT saja belum cukup. Beberapa monyet yang berasal dari Baluran, walaupun IMTnya melebihi 30 kg/m2, tebal lipatan kulit perutnya masih rendah bahkan relatif lebih rendah dari monyet asal Palembang. Dengan demikian, tebal lipatan kulit perut perlu diperhatikan dalam penentuan status obesitas monyet. Berdasarkan data penelitian ini, 89% (25/28) dari monyet yang mengalami obesitas memiliki tebal lipatan kulit perut yang melebihi 5 mm. Di samping itu, lingkar pinggang juga perlu dipertimbangkan menjadi kriteria obesitas pada monyet oker panjang. Berdasarkan analisis komponen utama, ada tiga parameter fenotipe yang berperan dalam kejadian obesitas pada monyet ekor panjang yaitu: indeks massa tubuh (IMT), tebal lipatan kulit perut (LPi) dan lingkar pinggang (LPi). Berdasarkan data penelitian ini, monyet ekor panjang dapat digolongkan ke dalam monyet gemuk dan sangat gemuk.

Monyet yang tergolong gemuk

2

mempunyai IMT (30-46 kg/m ), tebal lipatan kulit perut (5-30 mm) dan lingkar pinggang (39-60 cm). Monyet yang mempunyai ukuran melebihi kisaran tersebut di atas digolongkan ke dalam monyet yang sangat gemuk. Polimorfisme MC4R Mutasi MC4R pada manusia sebanyak lebih dari 70 mutasi (Tao, 2005) dan menyebabkan terjadinya obesitas. Walaupun demikian, tidak semua mutasi yang ditemukan selalu menyebabkan obesitas karena ada penelitian yang tidak menunjukkan adanya asosiasi

antara mutasi MC4R dengan obesitas seperti

yang ditemukan Gotoda et al. (1997) bahwa mutasi V103I pada laki-laki Inggris tidak ada hubungannya dengan obesitas. Hasil yang diperoleh pada penelitian menunjukkan ada 13 mutasi nonsinonim yang ditemukan pada MC4R monyet ekor panjang. Secara umum, mutasi terjadi pada monyet gemuk dan tidak gemuk. Walaupun demikian, jenis mutasi yang terjadi tidaklah semuanya sama pada monyet gemuk dan monyet tidak gemuk. Ada 5 jenis mutasi yang terjadi pada monyet gemuk, 6 jenis terjadi

63 pada monyet yang tidak gemuk, dan 2 jenis terjadi baik pada monyet gemuk maupun tidak gemuk

(Lampiran 5). Hasil ini menunjukkan bahwa ekspresi

fenotipe obesitas bergantung pada jenis (tipe) mutasi. Monyet pembawa mutasi tetapi

tidak

gemuk

mungkin

disebabkan

oleh

mekanisme

lain

yang

mempengaruhi ekspresi mutan ini. Di samping itu, kemungkinan monyet ini membawa varian lain (misalnya varian gen leptin). Mutasi MC4R ditemukan di daerah sitosol (intrasel), ektrasel, dan membran plasma (Gambar 24). Mutasi pada ujung NH3+ (ekstrasel) dari MC4R dianggap sangat berpengaruh karena ujung ini sangat penting untuk aktivitas reseptor dan berperan dalam penerimaan sinyal (Srinivasan et al. 2004). Lebih lanjut dinyatakan bahwa mutan di daerah ini belum pernah ditemukan pada manusia yang tidak gemuk. Mutan Asn3His ditemukan pada monyet gemuk asal Alas Purwo.

Perubahan asam amino menjadi His (histidin) akan mempengaruhi

struktur sekunder protein (Li dan Li 2006) sehingga konfigurasi protein akan berubah dan mengakibatkan perbedaan fungsi biologi.

N3H

E2

E1

C271W E3

Ektrasel H264P L263P V255G V253A L250P I245N

173 Membran plasma

55

230 Sitosol/ intrasel

C1

C2

C3

295 L300R

R236P G233A

309 318

S329A

L328W 329

Gambar 24 Situs mutasi pada MC4R monyet ekor panjang. Situs mutasi nonsinonim dilengkapi dengan hurup yang menunjukkan perubahan asam amino, sedangkan situs mutasi sinonim hanya ditunjukkan dengan angka. E1, E2, dan E3 adalah lengkung ektrasel. C1, C2, C2 adalah lengkung sitosol/intrasel

64 Aktivitas MC4R juga ditentukan oleh lengkung C3 dan ujung COO-. Ke dua bagian ini berperan dalam interaksi MC4R dengan protein G dalam mengaktifkan adenilat siklase (Lodish et al. 2004). Mutasi yang terjadi di daerah ini juga diduga sebagai penyebab tidak berfungsinya MC4R.

Bagian lain dari MC4R bukan

berarti tidak penting tetapi merupakan suatu kesatuan utuh supaya dapat berfungsi dengan sempurna. Peranan MC4R dalam

menghantarkan sinyal kekenyangan, melibatkan

proses pengaktifan adenilat siklase. Ujung ekstrasel MC4R akan menerima sinyal dari a-MSH sehingga MC4R menjadi aktif. MC4R aktif akan akan mengaktifkan protein G. Sub unit a protein G mengikat guanosin trifosfat (GTP) dan mengalami pemisahan yang kemudian berikatan dengan enzim adenilat siklase. Adenilat siklase aktif akan mengkatalisis perubahan ATP menjadi cAMP dan fosfat. Dengan demikian, proses ini menyebabkan peningkatan produksi cAMP (cyclic adenosin monophosphate) di dalam sel. Selanjutnya, cAMP ini akan mengaktifkan molekul lain seperti protein kinase A untuk memfosforilasi protein (peptida) sehingga bisa masuk ke dalam sel (Lodish et al. 2004). Hasil penyejajaran urutan yang diperoleh dalam penelitian ini dengan urutan yang diperoleh di GenBank (Lampiran 1) menunjukkan bahwa ada mutasi yang terjadi pada seluruh individu yakni pada posisi 499A/G dan 993G/A. Mutasi yang pertama adalah bersifat nonsinonim, sedangkan yang ke dua bersifat sinonim. Mutasi nonsinonim menyebabkan perubahan asam amino Arg167Gly. Dengan demikian, hal ini dapat dijadikan ciri khas pada monyet ekor panjang yang ada di Indonesia, walaupun masih perlu pembuktian yang lebih luas dengan melibatkan sampel dari daerah lainnya. Berbagai asumsi diungkapkan dalam menjelaskan kejadian obesitas ini. Pertama, asumsi bahwa variasi adipositas terjadi

secara epigenetik yang

melibatkan mekanisme metilasi kromatin. Epigenetik didefinisikan sebagai tidak adanya perubahan genetik tetapi menyebabkan terjadinya perubahan fenotipe. Kemungkinan perubahan terjadi

tergantung pada lingkungan yang berifat

obesogenik, saat puncak proliferasi jaringan adiposa setelah lahir, atau kandungan lemak diet mendekati 55 Kkal%. Kedua, perbedaan epigenetik di antara individu terjadi secara stokastik pada setiap tahap perkembangan dan konsekuensi dari variasi menjadi bukti pada kondisi yang cocok.

Walaupun

demikian masih ada kemungkinan lain apakah karena pengaruh epigenetik atau adanya perubahan pada daerah pengatur (upstream) dari gen yang berkaitan

65 dengan obesitas (Koza et al. 2006). Kejadian epigenetik ini dapat menjelaskan bahwa banyak monyet yang digunakan dalam penelitian ini menunjukkan gejala obesitas tetapi tidak menunjukkan mutasi pada MC4R.

Selain itu, kejadian ini

tidak terlepas dari kemungkinan pengaruh gen lainnya. Seperti telah diungkapkan sebelumnya, bahwa gen sangat berperan dalam terjadinya obesitas. Gen kelaparan/hemat (thrifty gene) dianggap berperan dalam terjadinya obesitas pada manusia maupun hewan. Pada manusia, gen ini dianggap sebagai hasil seleksi selama sejarah perkembangan manusia. Kelangsungan hidup (survival) manusia selama evolusi bergantung pada usaha untuk mendapatkan makanan, yang pada gilirannya bergantung juga pada aktivitas fisik.

Walaupun demikian, ketersediaan makanan tidak pernah

konsisten. Jadi, dapat dikatakan bahwa pemburu jaman dahulu memiliki siklus berpesta dan kelaparan, yang disela dengan periode aktivitas fisik dan istirahat. Oleh karenanya, seleksi gen kemungkinan dipengaruhi oleh aktivitas fisik dan istirahat. Untuk meyakinkan kelangsungan hidup selama periode kelaparan, gen tertentu berkembang untuk mengatur asupan dan pemanfaatan sumber energi secara efisien. Gen semacam ini disebut gen kelaparan/hemat (thrifty gene) sejak 1962.

Lebih jauh, bukti yang meyakinkan memperlihatkan bahwa gen

kuno ini tetap tidak berubah lebih dari 10 000 tahun dan tentunya tidak berubah dalam 40-100 tahun terakhir.

Walaupun asupan kalori manusia modern

nampaknya lebih rendah dibandingkan dengan leluhurnya, keseimbangan kalori positif pada mayoritas populasi orang dewasa terutama oleh meningkatnya gaya hidup santai dalam masyarakat sekarang. Kombinasi kelimpahan makanan dan ketidakaktifan fisik yang berkelanjutan dapat menghilangkan siklus biokimia yang terprogram secara evolusi yang berasal dari siklus pesta-kelaparan dan siklus aktivitas-istirahat. Kombinasi tersebut pada gilirannya mengakhiri siklus proses metabolik tertentu, akhirnya menyebabkan gangguan metabolik seperti obesitas dan DM tipe 2. Identifikasi kandidat gen kelaparan ini akan membantu pengungkapan proses patogenetik berbagai kelainan yang berhubungan dengan aktivitas fisik (Chakravarthy dan Booth 2004). Hipotesis fenotipe thrifty juga dijelaskan oleh Hales dan Barker (2001). Keadaan malnutrisi pada masa janin dan bayi akan mengarah ke obesitas. Keadaan ini diawali dengan penghematan nutrisi semasa bayi yang berdampak pada

perkembangan

organ

tubuh

tetapi

ada

perlindungan

terhadap

perkembangan otak. Pertumbuhan tersebut yang berlangsung secara permanen

66 akan mengubah struktur dan fungsi tubuh. Sekresi insulin yang tidak baik tidak merusak individu yang terus mendapat nutrisi jelek. Individu tersebut akan tetap kurus dan insulinnya menjadi peka. Ketidaktoleranan glukosa akan dipicu oleh keseimbangan kalori positif sebagai akibat dari meningkatnya asupan pakan dan menurunnya penggunaan energi. Hal ini akan mengarah pada obesitas. Di lain pihak, Chiang et al. (2009) menemukan gen (IKK e) pada tikus yang berperan dalam mengatur keseimbangan energi. Lebih lanjut, dijelaskan bahwa tikus yang dihilangkan gen IKKe-nya tidak akan menjadi gemuk walaupun diberikan makanan dengan kandungan lemak yang tinggi. Tikus tersebut memperlihatkan peningkatan penggunaan energi dan termogenesis. Disamping itu, terjadi perubahan protein enzim pengatur yang terlibat di dalam metabolisme glukosa dan lipid. Hubungan Kegiatan Konservasi dengan Monyet Gemuk Monyet ekor panjang yang hidup di Ubud dan Uluwatu (Bali) sangat dilindungi dan dianggap duwé (milik Tuhan) oleh masyarakat setempat. Sikap masyarakat seperti ini sangat berperan dalam konservasi monyet ekor panjang di daerah tersebut. Manajemen pengelolaan pada daerah tersebut juga berperan. Pihak pengelola kawasan memberikan pakan tambahan kepada monyet ekor panjang misalnya: buah-buahan, daun pepaya, ketela rambat, telur dan lain-lain. Selain itu, pemanfaatan lokasi tersebut sebagai obyek wisata sangat menunjang konservasi monyet ekor panjang. Banyaknya wisatawan yang berkunjung ke daerah tersebut sangat berperan juga. Rata-rata jumlah wisatawan yang berkunjung ke masing-masing kawasan tersebut mencapai 800 orang/hari. Pengunjung biasanya memberikan pakan pada monyet. Selain wisatawan, umat Hindu setiap hari melakukan persembahan di pura yang ada di lokasi tersebut. Sampah sisa persembahan merupakan sumber pakan bagi monyet. Monyet juga sering mengambil kue ataupun buah-buahan yang ada pada persembahan. Monyet juga mendapat pakan dari alam. Di Ubud, monyet sering memanfaatkan tanaman pertanian yang ada di sekitar kawasan sebagai sumber pakannya. Semua hal tersebut di atas merupakan faktor pendukung ketersediaan pakan bagi monyet di kawasan tersebut. Dengan demikian, usaha konservasi yang dilakukan di ke dua daerah tersebut sangat menunjang terjadinya obesitas pada monyet ekor panjang.

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan 1. Ditemukan 20 situs gen MC4R yang potensial berkontribusi mengatur obesitas, 13 di antaranya mutasi nonsinonim dan 7 mutasi sinonim. 2. Dari 13 mutasi nonsinonim, 5 di antaranya hanya terjadi pada monyet gemuk dan sisanya ada yang terjadi pada monyet gemuk dan atau tidak gemuk. Mutasi yang hanya ditemukan pada monyet gemuk mengindikasikan adanya asosiasi mutasi MC4R dengan obesitas pada monyet ekor panjang. Karena mutasi ini terjadi pada situs yang berkaitan dengan fungsi MC4R maka mutasi ini dapat dijadikan model untuk meneliti obesitas yang menunjang penelitian obesitas pada manusia. 3. Monyet gemuk asal Uluwatu dan Ubud membawa mutasi sinonim dan nonsinonim pada gen MC4R. Obesitas mungkin juga hasil gen non-MC4R atau mutasi di daerah promoter gen MC4R. 4. Monyet

yang

gen

MC4Rnya

telah

mengalami

mutasi

tetapi

belum

menunjukkan fenotipe gemuk, berpeluang gemuk bila lingkungan mendukung ekspresi gen tersebut. 5. Obesitas terjadi pada seluruh monyet jantan dewasa yang berasal Uluwatu dan Ubud (100%), sedangkan obesitas pada monyet yang berasal dari Baluran, Alas Purwo dan Palembang masing-masing adalah 30%, 28.6%, dan 0%. 6. Indeks massa tubuh, tebal lipatan kulit perut dan lingkar pinggang merupakan komponen yang paling berperan dalam keragaman fenotipe obesitas pada monyet ekor panjang.

Saran 1. Perlu

dikembangkan

penelitian

terhadap

gen-gen

lain

yang

diduga

menyebabkan terjadinya obesitas pada monyet ekor panjang. 2. Untuk meneliti genotipe monyet asal Bali lebih mendalam lagi, perlu dilakukan penelitian di daerah promoter gen MC4R dan menggunakan sampel yang lebih banyak. 3. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengembangkan metode pendekteksian obesitas pada monyet ekor panjang.

DAFTAR PUSTAKA Alikodra HS. 2002. Pengelolaan Satwaliar. Jilid 1. Bogor:Yayasan Penerbit Fakultas Kehutanan IPB. Alvaro JD et al. 1996. Morphine down-regulates melanocortin-4 receptor expression in brain regions that mediate opiate addiction. Mol Pharmacol. 50: 583-591. Andrade MCR et al. 2004. Biologic data of Macaca mulatta, Macaca fascicularis and Saimiri sciureus use for research at the Fiocruz Primate Center. Mem Inst Ozwaldo Cruz 99:581-589. Angeloni SV et al. 2004. Characterization of the rhesus monkey ghrelin gene and factors influencing ghrelin gene expression and fasting plasma levels. Endocrinology 145:2197–2205. Ankel-Simons F. 2007. Primate Anatomy An Introduction. 3rd Ed. Amsterdam: Academic Press. Astuti DA, Suprapto IH, Sajuthi D, Budiarsa IN. 2007. Nutrient intake and digestibility of cynomolgus monkey (Macaca fascicularis) fed with obese diet compared to monkey chow. Di dalam: International Symposium on Food Security Agricultural Development and Environmental Conservation in Southeast and East Asia; Bogor 4-6 Sep 2007. Banks WA, Altmann J, Sapolsky RM, Phillips-Conroy JE, Morley JE. 2003. Serum leptin levels as a marker for a syndrome X-like condition in wild baboons. J Clin Endocrinol Metab 88:1234–1240. Becker JM, Caldwell GA, Zachgo EN. 1996. Course. 2nd ed. New York: Academic Press.

Biotechnology. A Laboratory

Berkovitch F, Huffman M. 1999. The Macaques. Di dalam: Dolhino P, Fuentes A, editor. The Nonhuman Primates. New York: McGraw Hill. Blondet A, Gout J, Durand P, Bégeot M, Naville D. 2005. Expression of the human melanocortin-4 receptor gene is controlled by several members of the Sp transcription factor family. J Mol Endocrinol 34:317–329. Bofkin L, Goldman N. 2007. Variation in evolutionary processes at different codon positions. Mol Biol Evol 24:513-521. Bouchard C et al. 1990. The response to long-term overfeeding in identical twins. N Engl J Med 322:1477-1482. Cai G. 2004. Localization of Chromomal Regions Influencing the Phenotypes of the Metabolic Syndrome [Dissertation]. Austin:The University of Texas. Calle EE, Kaaks R, 2004. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nat Rev Cancer 4:579-591. Chagnon YC et al. 1997. Suggestive linkages between markers on human 1p32p22 and body fat and insulin levels in the Quebec family study. Obes Res 5:115-121. Chakravarthy MV, Booth FW. 2004. Eating, exercise, and thrifty genotypes: connecting the dots toward an evolutionary understanding of modern chronic diseases. J Appl Physiol 96:3-10.

69 Challis BG, Yeo GSH. 2002. Past, present and future strategies to study the genetics of body weight regulation. Briefing in Functional Genomics and Proteomics 1:290-304. Chatterjee S, Chatterjee P, Bandyopadhyay. 2006. Skinfold thickness, body fat percentage and body mass index in obese and non-obese Indian boys. Asia Pac J Clin Nutr 15:231-235. Chen Y et al. 2003. Ratio of leptin to adiponectin as an obesity index of cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis). Exp Anim 52:137-143. Chen Y, Ohtoh H, Yoshida T. 2000. Middle age onset of obesity in laboratoryreared female cynomolgus monkeys. J Growth 39:53-58. Chen Y, Ono F, Yoshida T, Yoshikawa Y. 2002. Relationship between body weight and hematological and serum biochemical parameters in female cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis ). Exp Anim 51:125-131. Chiang SH et al. 2009. The Protein Kinase IKKe regulates energy balance in obese mice. Cell 138:961-975. Comuzzie AG et al. 2003. The baboon as a nonhuman primate model for the study of the genetics of obesity. Obes Res 11:75-80. Costello AB, Osborne JW. 2005. Best practices in exploratory factor analysis: four recomendations for getting the most from your analysis. Practical Assesment Research & Evaluation 10:1-9. Diwan JJ. 2007. Molecular Biochemistry I. http://www.rpi.edu/dept/bcbp/ molbiochem/MBWeb/mb1/part2/signals.htm [7 Des 2007] Dubern B, Clement K, Pelloux V, Froguel P, Girardet JP, Guy-Grand B, Tounian P. 2001. Mutational analysis of melanocortin-4 receptor, agouti-related protein, and alpha-melanocyte-stimulating hormone genes in severely obese children. J Pediatr 139:177-181. Eisner JR, Dumesic DA, Kemnitz JW, Colman RJ, Abbott DH. 2003. Increased adiposity in female rhesus monkeys exposed to androgen excess during early gestation. Obes Res 11:279-286. Ellerkmann E, Nagy GM, Frawley LS. 1992. alpha-Melanocyte-stimulating hormone is a mammotrophic factor released by neurointermediate lobe cells after estrogen treatment. Endocrinology 130:133-138. Excoffier L, Lavel G, Schneider S. 2005. Arlequin ver. 3.11: An integrated software package for population enetics data analysis. Evolutionary Bioiformatics Online 1:47-50. Fan W, Boston BA, Kesterson RA, Hruby VJ, Cone RD. 1997. Role of melanocortinergic neurons in feeding and the agouti obesity syndrome. Nature 385:165-168. Farooqi IS at al. 2000. Dominant and recessive inheritance of morbid obesity associated with melanocortin 4 receptor deficiency. J Clin Invest. 106:271–279 Fuentes A. 2007. Core Concepts in Biological Anthropology. Boston: McGraw Hill. Gantz I et al. 1993. Molecular cloning, expression, and gene localization of a fourth melanocortin receptor. J Biol Chem 268:15174–15179.

70 Gibbs RA. 2007. Evolutionary and biomedical insights from rhesus macaque genome. Science 316:222-234. Gotoda T, Scott J, Aitman TJ. 1997. Molecular screening of the human melanocortin-4 receptor gene: identification of a missense variant showing no association with obesity, plasma glucose, or insulin. Diabetologia 40:976-979. Haegeman A et al. 2001. Bovine melanocortin receptor 4: cDNA sequence, polymorphisms and mapping. Anim Genet 32:189-192. Hainerová I et al. 2007. Melanocortin 4 receptor mutations in obese czech children: studies of prevalence, phenotype development, weight reduction response, and functional analysis. J Clin Endocrinol Metab 92:3689-3696. Hales CN, Barker DJP. 2001. The thrifty phenotype hypothesis. British Med Bull 60:5-20. Hamada Y, Hayakawa S, Suzuki J, Watanabe K, Ohkura S. 2003. Seasonal variation in the body fat of Japanese macaques Macaca fuscata. Mammal Study 28:79-88. Han TS, Lean MEJ. 2001. Anthropometric Indices of obesity and regional distribution of fat depots. Di dalam: Björntorp P, editor. International Textbook of Obesity. New York: Wiley. Hansen BC. 2001. Causes of obesity and consequences of obesity prevention in non-human primates and other animal models. Di dalam: Björntorp P, editor. International Textbook of Obesity. New York: Wiley. Hill JO, Peters JC. 1998. Environmental contributions to the obesity epidemic. Science 280:1371-1374. Hinney A et al. 1999. Several mutations in the melanocortin-4 receptor gene including a nonsense and a frameshift mutation associated with dominantly inherited obesity in humans. J Clin Endocrinol Metab 84:1483-1486. Hinney A et al. 2003. Melanocortin-4 receptor gene: case-control study and transmission disequilibrium test confirm that functionally relevant mutations are compatible with a major gene effect for extreme obesity. J Clin Endocrinol Metab 88:4258-4267. Hinney A et al. 2006. Prevalence, spectrum, and functional characterization on melanocortin-4 receptor gene mutations in a representative population-based sample and obese adults Germany. J Clin Endocrinol Metab 91: 1761-1769. Hotta K et al. 1996. Regulation of obese (ob) mRNA and plasma leptin levels in rhesus monkeys: Effects of insulin, body weight, and non-insulin-dependent diabetes mellitus. J Biol Chem 271:25327-25331. Hughes DA et al. 2009. Increased constraints on MC4R during primate and human evolution. Hum Genet 124:633-647. Huszar D et al. 1997. Targeted disruption of the melanocortin-4 receptor results in obesity in mice. Cell 88:131–141. Jayo JM, Shively CA, Kaplan JR, Manuck SB. 1993. Effects of exercise and stress on body fat distribution in male cynomolgus monkeys. Int J Obes 17:567-604. Kaufman D et al. 2005. Early appearance of the metabolic syndrome in socially reared bonnet macaques. J Clin Endocrinol Metab 90:404-408.

71 Kaufman D et al. 2007. Early-life stress and the development of obesity and insulin resistance in juvenile bonnet macaques. Diabetes 56:1382-1386. Kemp NJ, Burnett JB. 2003. Final Report: A biodiversity risk assesment and recomendations for risk management of long-tailed macaque (Macaca fascicularis) in New Guinea. http://www.invasivespecies.net/ [1 Okt 2009]. Kim KS, Larsen N, Short T, Plastow G, Rothschild MF. 2000. A missense variant of the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene is associated with fatness, growth, and feed intake traits. Mamm Genome 11:131–135. Koganezawa M. 1995. Body fat indices and their seasonal variations in Japanese monkeys of Nikko, Japan. Wildlife Conservation Japan 1: 31-36 Kopatz SA, Aronstam RS, Sharma SV. 2003. Isolation of complete coding sequence for melanocortin4 rreceptor (MC4R). http://www. ncbi.nlm.nih.gov. [17 Sep 2007] Koza RA et al. 2006. Change in gen expression foreshadow diet-induced obesity in genetically identical mice. Plos Genet 2:0769-0780. Kublaoui BM, Zinn AR. 2006. MC4R mutations-weight before screening. J Clin endocrinol Metab 91:1671-1672. Kusuda J, Osada N, Hida M, Sugono S, Hashimoto K. 2002. Isolation and characterization of cDNA for macaque neurological disease genes. http://www. ncbi.nlm.nih.gov. [12 Mar 2006]. Li CH, Li H. 2006. Association of MC4R gene polymorphisms with growth and body composition traits in chicken. AJAS 19:763-768. Li SJ et al. 1996. Melanocortin antagonists define two distinct pathways of cardiovascular control by a- and ?-melanocyte-stimulating hormones. J Neurosci 16:5182-5188. Li WH. 1997. Molecular Evolution. Sunderland Massachusetts, USA: Sinnauer Associates, Inc., Press. Lodish H et al. 2004. Molecular cell biology. Fifth edition. USA: W.H. Freeman and Company. Lubrano-Berthelier C et al. 2003. The human MC4R promoter: Characterization and role in obesity. Diabetes 52:2996-3000. Marti A et al. 2003. A novel nonsense mutation in the melanocortin-4 receptor associated with obesity in a Spanish population. Int J Obes Relat Metab Disord 27: 385–388. Marx J. 2003. Cellular warriors at the battle of the bulge. Science 299:846-849. Minitab Inc. 2003. MINITAB Statistical Software, Release 14 for Windows, State College, Pennsylvania. Mountjoy KG, Mortrud MT, Low MJ, Simerly RB, Cone RD. 1994. Localization of the melanocortin-4 receptor (MC4-R) in neuroendocrine and autonomic control circuits in the brain. Mol Endocrinol 8:1298-1308. Mountjoy KG, Robbins LS, Mortrud MT, Cone RD. 1992. The cloning of a family of genes that encode the melanocortin receptors. Science 257:1248-1251.

72 Muroyama Y, Kanamori H, Kitahara E. 2006. Seasonal variation and sex differences in the nutritional status in two local populations of wild Japanese macaques. Primates 47:355-364. Mutch DM, Clément K. 2006. Unraveling the genetics of human obesity. PloS Genet 2:e188. doi:10.1371/journal.pgen.0020188. www.plosgenetics.org [17 Des 2007]. Nei M, Kumar S. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. New York: Oxford University Press. Nickolls SA et al. 2003. Molecular determinants of melanocortin 4 receptor ligand binding and MC4/MC3 receptor selectivity. J Pharmacol Exp Ther 304:12171227. Ong P, Richardson M. 2008. Macaca fascicularis. Di dalam: IUCN Red List of Threatened Species. Version 2009.1. www.iucnredlist.org [1 Okt 2009] Pitman SD. 2008. DNA Mutation and Evolution. http://naturalselection. 0catch.com/Files/dnamutationrates.html. [2 Okt 2009]. Pomp D. 1999. Animal models of obesity. Mol Med Today 5:459-460. Putra IGAA , Fuentes A, Suaryana KG, Rompis ALT. 2001. Perilaku Makan Monyet Ekor Panjang (Macaca fascicularis) di Wenara Wana, Padangtegal, Ubud, Bali. Di Dalam: Yuda P, Salasia SIO, editor. Konservasi Satwa Primata: Tinjauan Ekologi, Sosial, Ekonomi dan Medis dalam Pengembangan Ilmu Pengetahuan dan Teknologi;Yogyakarta, 7 Sep 2000. Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada Press. hlm. 132-140. Putra IGAA, Wandia IN, Soma IG, Sajuthi D. 2006. Indeks massa tubuh dan morfometri monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) di Bali. J Vet 7:119124. Raghava GPS, Han JH. 2005. Correlation and prediction of gene expression level from aminoacid and dipeptide composition of its protein. BMC Bioinformatics 6:59-72. http://www.biomedcentral.com/I47-2105/6/59 [14 Agu 2009] Raman A et al. 2005. Reference body composition in adult rhesus monkeys: Glucoregulatory and anthropometric indices. J Gerontol:1518-1524. Rankinen T et al. 2006. The human obesity gene map: the 2005 update. Obesity 14:529-644. Rowe N. 1996. The Pictorial Guide to the Living Primates. New York: Pogonias Press. Schwartz SM, Kemnitz JW, Howard CF Jr. 1993. Obesity in free-ranging rhesus macaques. Int J Obes Relat Metab Disord 17:1–9. Schwartz MW, Morton GJ. 2002. Obesity: keeping hunger at bay. Nature 418:595-597. Schwartz MW, Woods SC, Porte Jr D, Seeley RJ, Baskin DG. 2000. Central nervous system control of food intake. Nature 404:661-671. Semiz S, Özgören E, Sabir N. 2007. Comparison of ultrasonographic and anthropometric methods to assess body fat in childhood obesity. Int J Obes 31:53-58

73 Srinivasan S et al. 2004. Constitutive activity of the melanocortin-4 receptor is maintained by its N-terminal domain and plays a role in energy homeostasis in humans. J Clin Invest 114:1158-1164. Sueoka N, Kawanishi Y. 2000. DNA G+C content of the third codon position and codon usage biases of human genome. Gene 261:53-62. Sullivan EL, Koegler FH, Cameron JL. 2006. Individual differences in physical activity are closely associated with changes in body weight in adult female rhesus monkeys (Macaca mulatta). Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 291: R633-R642 Supriatna J, Wahyono EH. 2000. Jakarta: Yayasan Obor Indonesia. Swindler DR. 1998. Washington Press.

Panduan Lapangan Primata Indonesia.

Introduction to the Primates.

London: University of

Takahashi T et al. 2006. Characterization of obesity in japanese monkey (Macaca fuscata) in pedigreed colony. J Med Primatol 35:30-37. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007. Mega 4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24:1596-1599 (Publication PDF at http://www.kumarlab. net/publication) [9 Nop 2007] Tao YA. 2005. At the Cutting Edge: Molecular mechanisms of the neural melanocortin receptor dysfunction in severe early onset obesity. Mol Cell Endocrinol 239:1–14 Teff K. 2005. Carbohydrates, glycemic responses and weight control. Di dalam Mela DJ, editor. Food diet and obesity. USA: Woodhead Publishing Limited. Tigno XT, Gerzanich G, Hansen BC. 2004. Age-related changes in metabolic parameters of nonhuman primates. J Gerontol Series A: Biol Sci and Med Sci 59:1081-1088. [WHO] World Health Organization. 1997. Obesity: Preventing and Managing the Global Epidemic. Report of a WHO Consultation on Obesity, Geneva, hlm. 1276. [WHO] World Health Organization. 2005. Obesity and overweight. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs311 [17 September 2007] Wilson DE, Reeder DAM. 2005. Mammal Species of the World. A Taxonomic and Geographic Reference. http://www.bucknell.edu/msw3/browse.asp?s= y&id=12100534. [1 Okt 2009]. Woods SC, Seeley RJ. 2002. Understanding the physiology of obesity: review of recent developments in obesity research. Int J Obes 26, Suppl 4: S8-S10. Yeo GSH et al. 1998. A frameshift mutation in MC4R associated with dominantly inherited human obesity. Nat Genet 20:111–112. Yeo GSH, Farooqi IS, Challis BG, Jackson RS, O'Rahilly S. 2000. The role of melanocortin signalling in the control of body weight: evidence from human and murine genetic models. Q J Med 93:7-14. Yuwono T. 2006. Teori dan Aplikasi PCR. Yogyakarta: Penerbit Andi.

74 Zhang F, Zhao Z. 2004. The influence of neighboring-nucleotide composition on single nucleotide polymorphisms (SNPs) in mouse genome and its comparison with human SNPs. Genomics 84:785-795.

LAMPIRAN

76 Lampiran 1 Penjajaran nukleotida (n=999) gen MC4R monyet ekor panjang hasil penelitian dengan urutan gen yang sama yang diperoleh dari GenBank

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

123 ATG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

456 GTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

789 AAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 012 TCC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 345 ACC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 678 CAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

122 901 CGT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 234 GGG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 567 ATG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

223 890 CAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333 123 GCT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333 456 TCT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333 789 CTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 012 CAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 345 CTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 678 TGG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5

455 901 AAC ... ... ... ... ...

555 234 CGC ... ... ... ... ...

555 567 AGC ... ... ... ... ...

556 890 AGC ... ... ... ... ...

666 123 CAC ... ... ... ... ...

666 456 AGA ... ... ... ... ...

666 789 CTG ... ... ... ... ...

777 012 CAC ... ... ... ... ...

777 345 AGC ... ... ... ... ...

777 678 AAT ... ... ... ... ...

788 901 GCC ... ... ... ... ...

888 234 AGT ... ... ... ... ...

888 567 GAG ... ... ... ... ...

889 890 TCC ... ... ... ... ...

999 123 CTT ... ... ... ... ...

999 456 GGA ... ... ... ... ...

77 Lampiran 1 (lanjutan) Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15

999 789 AAA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 000 012 GGC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 000 345 TAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 000 678 TCT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 011 901 GAT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 111 234 GGA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 111 567 GGG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 112 890 TGC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 222 123 TAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 222 456 GAG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 222 789 CAA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 333 012 CTT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 333 345 TTT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 333 678 GTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 344 901 TCT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 444 234 CCT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

78 Lampiran 1 (lanjutan) Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11

111 444 567 GAG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 445 890 GTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 555 123 TTT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 555 456 GTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 555 789 ACA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 666 012 CTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 666 345 GGT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ...

111 666 678 GTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 677 901 ATC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 777 234 AGC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 777 567 TTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 778 890 TTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 888 123 GAG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 888 456 AAT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 888 789 ATC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 999 012 TTA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

79 Lampiran 1 (lanjutan) Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11

111 999 345 GTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

111 999 678 ATT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

122 900 901 GTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 000 234 GCA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 000 567 ATA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 001 890 GCC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 111 123 AAG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 111 456 AAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 111 789 AAG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 222 012 AAT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 222 345 CTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 222 678 CAT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 233 901 TCA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 333 234 CCC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 333 567 ATG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 334 890 TAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

80 Lampiran 1 (lanjutan) UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8

222 444 123 TTT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 444 456 TTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 444 789 ATC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 555 012 TGC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 555 345 AGC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 555 678 CTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 566 901 GCT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 666 234 GTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 666 567 GCT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 667 890 GAT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 777 123 ATG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 777 456 CTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 777 789 GTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 888 012 AGC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 888 345 GTT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 888 678 TCA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

81 Lampiran 1 (lanjutan) UW_11 UW_13 UW_15

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

222 899 901 AAT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 999 234 GGA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

222 999 567 TCA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

223 990 890 GAA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333 000 123 ACC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333 000 456 ATT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333 000 789 GTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333 111 012 ATC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333 111 345 ACC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333 111 678 CTA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333 122 901 TTA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333 222 234 AAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333 222 567 AGT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333 223 890 ACA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333 333 123 GAT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333 333 456 ACG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333 333 789 Bank gen GAC Pal_1 ... Pal_2 ...

333 444 012 ACA ... ...

333 444 345 CAG ... ...

333 444 678 AGT ... ...

333 455 901 TTC ... ...

333 555 234 ACA ... ...

333 555 567 GTG ... ...

333 556 890 AAC ... ...

333 666 123 ATT ... ...

333 666 456 GAT ... ...

333 666 789 AAT ... ...

333 777 012 GTT ... ...

333 777 345 ATT ... ...

333 777 678 GAC ... ...

333 788 901 TCA ... ...

333 888 234 GTG ... ...

82 Lampiran 1 (lanjutan) Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12

333 888 567 ATC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333 889 890 TGT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333 999 123 AGC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333 999 456 TCC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333 999 789 TTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 000 012 CTT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 000 345 GCA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 000 678 TCC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 011 901 ATT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 111 234 TGC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 111 567 AGC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 112 890 CTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 222 123 CTT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 222 456 TCA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 222 789 ATT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 333 012 GCA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

83 Lampiran 1 (lanjutan) Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5

444 333 345 GTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 333 678 GAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 344 901 AGG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 444 234 TAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 444 567 TTT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 445 890 ACT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 555 123 ATC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 555 456 TTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 555 789 TAT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 666 012 GCT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 666 345 CTT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 666 678 CAG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 677 901 TAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 777 234 CAT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 777 567 AAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 778 890 ATT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

84 Lampiran 1 (lanjutan) Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6

444 888 123 ATG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 888 456 ACA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 888 789 GTT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 999 012 AAG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 999 345 CGG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

444 999 678 GTT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

455 900 901 AGG G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G..

555 000 234 ATC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 000 567 ATC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 001 890 ATA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 111 123 AGT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 111 456 TGT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 111 789 ATC ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ..A ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ..A ..A ..A ..A

555 222 012 TGG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 222 345 GCA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 222 678 GCT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

85 Lampiran 1 (lanjutan) UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G.. G..

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

..A ..A ... ..A ... ... ..A ... ..A ... ..A ..A ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4

555 233 901 TGC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 333 234 ACG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 333 567 GTT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 334 890 TCA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 444 123 GGC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 444 456 ATT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 444 789 TTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 555 012 TTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 555 345 ATC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 555 678 ATT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 566 901 TAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 666 234 TCA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 666 567 GAT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 667 890 AGT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 777 123 AGT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 777 456 GCT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

86 Lampiran 1 (lanjutan) UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ...

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

555 777 789 GTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 888 012 ATC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 888 345 ATC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 888 678 TGC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 899 901 CTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 999 234 ATC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

555 999 567 ACC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

556 990 890 ATG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

666 000 123 TTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

666 000 456 TTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

666 000 789 ACC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

666 111 012 ATG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

666 111 345 TTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

666 111 678 GCT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

666 122 901 CTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

666 222 234 ATG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 222 223 333 333 333 444 444 444 455 555 555 556 666 666 666 777 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012

87 Lampiran 1 (lanjutan) GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

GCT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

TCT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

CTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

TAT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

GTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

CAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

ATG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

TTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

CTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

ATG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

GCC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

AGG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

CTT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

CAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

ATT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

AAG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9

666 777 345 AGG ... ... ... ... ... ... ... ... ...

666 777 678 ATT ... ... ... ... ... ... ... ... ...

666 788 901 GCT ... ... ... ... ... ... ... ... ...

666 888 234 GTC ... ... ... ... ... ... ... ... ...

666 888 567 CTC ... ... ... ... ... ... ... ... ...

666 889 890 CCC ... ... ... ... ... ... ... ... ...

666 999 123 GGC ... ... ... ... ... ... ... ... ...

666 999 456 ACT ... ... ... ... ... ... ... ... ...

666 999 789 GGT ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 000 012 GCC ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 000 345 ATC ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 000 678 CGC ... .C. ... ... ... ... ... ... ...

777 011 901 CAA ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 111 234 GGC ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 111 567 GCC ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 112 890 AAT ... ... ... ... ... ... ... ... ...

88 Lampiran 1 (lanjutan) Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... .C. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15

777 222 123 ATG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 222 456 AAG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 222 789 GGA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 333 012 GCG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 333 345 ATT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 333 678 ACT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 344 901 TTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 444 234 ACC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 444 567 ATC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 445 890 CTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C.

777 555 123 ATT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 555 456 GGC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 555 789 GTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 666 012 TTT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 666 345 GTT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ...

777 666 678 GTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

89 Lampiran 1 (lanjutan) Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

.A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

.C. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3

777 677 901 TGC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 777 234 TGG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 777 567 GCC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 778 890 CCA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 888 123 TTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 888 456 TTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 888 789 CTC ... .C. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 999 012 CAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 999 345 TTA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

777 999 678 ATA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

788 900 901 TTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 000 234 TAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 000 567 ATC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 001 890 TCT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 111 123 TGT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 111 456 CCT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

90 Lampiran 1 (lanjutan) UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15

888 111 789 CAG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 222 012 AAT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 222 345 CCA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 222 678 TAT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 233 901 TGT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 333 234 GTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 333 567 TGC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 334 890 TTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 444 123 ATG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 444 456 TCT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 444 789 CAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 555 012 TTT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 555 345 AAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 555 678 TTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 566 901 TAT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 666 234 CTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

91 Lampiran 1 (lanjutan) UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ...

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

888 666 567 ATA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 667 890 CTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 777 123 ATC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 777 456 ATG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 777 789 TGT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 888 012 AAT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 888 345 TCT ..A ..A ... ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ... ..A ..A ... ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A

888 888 678 GTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 899 901 ATC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 999 234 GAT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

888 999 567 CCT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

889 990 890 CTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

999 000 123 ATT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

999 000 456 TAT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

999 000 789 GCA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

999 111 012 CTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

92 Lampiran 1 (lanjutan)

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

999 111 345 CGG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

999 111 678 AGT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

999 122 901 CAA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

999 222 234 GAA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

999 222 567 CTG ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ..A ..A ... ... ..A ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ..A ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

999 223 890 AGG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

999 333 123 AAA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

999 333 456 ACC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

999 333 789 TTC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

999 444 012 AAA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

999 444 345 GAG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

999 444 678 ATC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

999 455 901 ATC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5

999 666 123 CCC ... ... ... ... ...

999 666 456 CTG ... ... ... ... ...

999 666 789 GGA ... ... ... ... ...

999 777 012 GGC ... ... ... ... ...

999 777 345 CTA ... ... ... ... ...

999 777 678 TGT ... ... ... ... ...

999 788 901 GAC ... ... ... ... ...

999 888 234 TTG ... ... ... ... ...

999 888 567 TCT ... ... ... ... ...

999 889 890 AGC ... ... ... ... ...

999 999 123 AGG ..A ..A ..A ..A ..A

999 999 456 TAT ... ... ... ... ...

999 999 789 TAA ... ... ... ... ...

999 555 234 TGT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ...

999 555 567 TGC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

999 556 890 TAT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

93 Lampiran 1 (lanjutan) Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A ..A

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

94 Lampiran 2 Penjajaran asam amino (n=332) gen MC4R monyet ekor panjang hasil penelitian dengan urutan gen yang sama yang diperoleh dari GenBank

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

1 1234567890 MVNSTHRGMH .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..H....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

1111111112 1234567890 ASLHLWNRSS .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

2222222223 1234567890 HRLHSNASES .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

3333333334 1234567890 LGKGYSDGGC .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

4444444445 1234567890 YEQLFVSPEV .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

95 Lampiran 2 (lanjutan)

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

5555555556 1234567890 FVTLGVISLL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

6666666667 1234567890 ENILVIVAIA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

7777777778 1234567890 KNKNLHSPMY .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

8888888889 1234567890 FFICSLAVAD .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

9999999990 1234567890 MLVSVSNGSE .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

96 Lampiran 2 (lanjutan)

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

1111111111 0000000001 1234567890 TIVITLLNST .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

1111111111 1111111112 1234567890 DTDTQSFTVN .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

1111111111 2222222223 1234567890 IDNVIDSVIC .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

1111111111 3333333334 1234567890 SSLLASICSL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

1111111111 4444444445 1234567890 LSIAVDRYFT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

97 Lampiran 2 (lanjutan)

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

1111111111 5555555556 1234567890 IFYALQYHNI .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

1111111111 6666666667 1234567890 MTVKRVRIII ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G... ......G...

1111111111 7777777778 1234567890 SCIWAACTVS .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

1111111111 8888888889 1234567890 GILFIIYSDS .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

1111111112 9999999990 1234567890 SAVIICLITM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

98 Lampiran 2 (lanjutan)

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

2222222222 0000000001 1234567890 FFTMLALMAS .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

2222222222 1111111112 1234567890 LYVHMFLMAR .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

2222222222 2222222223 1234567890 LHIKRIAVLP .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

2222222222 3333333334 1234567890 GTGAIRQGAN .......... .....P.... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..A....... .......... ..A....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

2222222222 4444444445 1234567890 MKGAITLTIL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .........P ....N..... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

99 Lampiran 2 (lanjutan)

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

2222222222 5555555556 1234567890 IGVFVVCWAP .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....G..... .......... .......... .......... .......... .......... ..A....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

2222222222 6666666667 1234567890 FFLHLIFYIS .......... ..P....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ...P...... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ...P...... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

2222222222 7777777778 1234567890 CPQNPYCVCF .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... W......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

2222222222 8888888889 1234567890 MSHFNLYLIL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

2222222223 9999999990 1234567890 IMCNSVIDPL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .........R .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

100 Lampiran 2 (lanjutan)

GenBank Pal_1 Pal_2 Pal_3 Pal_4 Pal_5 Pal_6 Pal_7 Pal_8 Pal_9 Pal_10 Pal_11 Pal_12 Pal_13 Pal_14 Pal_15 Ap_1 Ap_8 Ap_14 Ap_15 Bl_1 Bl_4 Bl_5 Bl_6 Bl_7 Bl_11 Bl_12 UB_1 UB_2 UB_3 UB_4 UB_5 UB_6 UB_7 UB_10 UB_11 UB_12 UB_13 UB_14 UB_15 UW_1 UW_3 UW_4 UW_5 UW_7 UW_8 UW_11 UW_13 UW_15

3333333333 0000000001 1234567890 IYALRSQELR .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

3333333333 1111111112 1234567890 KTFKEIICCY .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

3333333333 2222222223 1234567890 PLGGLCDLSS .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......WA. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

33] 33] 12] RY .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..

101 Lampiran 3 Analisis varian parameter fenotipe obesitas monyet ekor panjang Lampiran 3a Analisis varian bobot badan terhadap lokasi Sumber keragaman db JK KT Lokasi 4 0,285394 0,071349 Galat 51 0,039988 0,000784 Total 54 0,325383

F hitung 91,0

Lampiran 3b Analisis varian indeks massa tubuh terhadap lokasi Sumber keragaman db JK KT F hitung Lokasi 4 0,027053 0,006763 57,83 Galat 51 0,005964 0,000117 Total 54 0,033017 Lampiran 3c Analisis varian tinggi duduk terhadap lokasi Sumber keragaman db JK KT Lokasi 4 0,0014446 0,0003611 Galat 51 0,0004943 0,0000097 Total 54 0,0019388

F hitung 37,26

Lampiran 3d Analisis varian lingkar pinggang terhadap lokasi Sumber keragaman db JK KT F hitung Lokasi 4 0,0019803 0,0004951 97,7 Galat 51 0,0002582 0,0000051 Total 55 0,0022386 Lampiran 3e Analisis varian lingkar dada terhadap lokasi Sumber keragaman db JK KT Lokasi 4 0,0092372 0,0023093 Galat 51 0,0018539 0,0000364 Total 55 0,0110911 Lampiran 3f Analisis varian lingkar paha terhadap lokasi Sumber keragaman db JK KT Lokasi 4 0,0118211 0,0029553 Galat 51 0,0036287 0,0000712 Total 55 0,0154498

P 0.000

P 0,000

P 0,000

P 0,000

F hitung 63,53

P 0,000

F hitung 41,54

P 0,000

Lampiran 3g Analisis varian lingkar lengan atas terhadap lokasi Sumber keragaman db JK KT F hitung Lokasi 4 0,011068 0,002767 26,08 Galat 51 0,005412 0,000106 Total 55 0,016480 Lampiran 3h Analisis varian tebal lipatan kulit perut terhadap lokasi Sumber keragaman db JK KT F hitung Lokasi 4 51,1678 12,7920 136,55 Galat 51 4,7777 0,0937 Total 55 55,9456

P 0,000

P 0,000

102 Lampiran 3 (lanjutan) Lampiran 3i Analisis varian tebal lipatan kulit trisep terhadap lokasi Sumber keragaman db JK KT F hitung Lokasi 4 0,2918 0,0730 3,60 Galat 51 1,0339 0,0203 Total 55 1,3257 Lampiran 3j Analisis varian tebal lipatan kulit paha terhadap lokasi Sumber keragaman db JK KT F hitung Lokasi 4 0,92578 0,23144 52,62 Galat 51 0,22432 0,00440 Total 55 1,15010 Lampiran 3k Analisis varian tebal lipatan kulit punggung terhadap lokasi Sumber keragaman db JK KT F hitung Lokasi 4 0,29177 0,07294 30,45 Galat 51 0,12219 0,00240 Total 55 0,41396 Lampiran 3l Analisis varian tebal lipatan kulit leher terhadap lokasi Sumber keragaman db JK KT F hitung Lokasi 4 0,36427 0,09107 74,45 Galat 51 0,06238 0,00122 Total 55 0,42665

P 0,012

P 0,000

P 0,000

P 0,000

103 Lampiran 4 Nilai eigen dan loading factor pada analisis komponen utama

Analisis komponen utama : BB, IMT, TD, LPi, LD, LPh, LTr, TLkAbd, TLkTr, TLkPh, TLkPg, TLkLh 4 a Nilai eigen matriks kovarian PC1

PC2

PC3

PC4

PC5

PC6

PC7

PC8

PC9 PC10 PC11 PC12

Nilai eigen

502.02 25.57 10.98 8.64

3.69

2.00

1.86

1.32

0.68

Proporsi

0.901

0.046 0.020 0.016 0.007 0.004 0.003 0.002 0.001 0.001 0.000 0.000

Proporsi total 0.901

0.947 0.966 0.982 0.989 0.992 0.996 0.998 0.999 1.000 1.000 1.000

4b Loading factor Variabel BB IMT TD LPi LD LPh LTr TLkAbd TLkTr TLkPh TLkPg TLkLh

PC1 -0.138 -0.433 -0.111 -0.560 -0.334 -0.147 -0.088 -0.509 -0.010 -0.108 -0.172 -0.160

PC2 0.112 0.242 0.312 0.152 0.344 0.299 0.156 -0.722 0.020 0.005 -0.229 -0.040

PC3 0.056 -0.594 0.684 0.193 -0.046 0.113 0.111 0.213 -0.022 -0.176 -0.033 -0.183

PC4 0.040 0.143 0.082 -0.632 0.239 0.270 0.348 0.381 -0.011 0.157 -0.364 -0.134

PC5 0.131 0.399 0.149 -0.042 -0.708 0.205 0.383 -0.033 -0.009 -0.205 0.242 -0.090

0.36

0.12

0.02

104 Lampiran 5 Kejadian mutasi pada MC4R pada monyet ekor panjang INDV Pal1 Pal2 Pal3 Pal4 Pal5 Pal6 Pal7 Pal8 Pal9 Pal10 Pal11 Pal12 Pal13 Pal14 Pal15 Ap1 Ap8 Ap14 Ap15 Bl1 Bl4 Bl5 Bl6 Bl7 Bl11 Bl12 UB1 UB2 UB3 UB4 UB5 UB6 UB7 UB10 UB11 UB12 UB13 UB14 UB15 UW1 UW3 UW4 UW5 UW7 UW8 UW11 UW13 UW15

M1

M2

M3

M4

M5

M6

M7

v

M8

M9

M10

M11

M12

M13

v

v

v

v

v v

v v

v v

v

v

v

v

Total/ status* 0/TOb 2/TOb 0/TOb 0/TOb 0/TOb 0/TOb 0/TOb 0/TOb 0/TOb 0/TOb 0/TOb 0/TOb 1/TOb 1/TOb 0/TOb 0/TOb 4/Ob 0/TOb 2/Ob 3/TOb 1/TOb 0/TOb 0/TOb 0/Ob 0/Ob 0/TOb 0/Ob 0/Ob 0/Ob 0/Ob 0/Ob 0/Ob 0/Ob 1/Ob 0/Ob 0/Ob 0/Ob 0/Ob 0/Ob 0/Ob 0/Ob 0/Ob 0/Ob 0/Ob 0/Ob 0/Ob 0/Ob 0/Ob

105 Lampiran 5 (lanjutan) Keterangan: INDV = individu Total = total individu M1=N3H; M2=G233A; M3=R236P; M4=I245N; M5=L250P; M6=V253A; M7=V255G; M8=L263P; M9=H264P; M10=C271W; M11=L300R; M12=L328W; M13=S329A N= asam amino asparagin (Asn) H= asam amino histidina (His) G= asam amino glisina (Gly) A= asam amino alanina (Ala) R= asam amino arginina (Arg) P= asam amino prolina (Pro) I= asam amino isoleusina (Ile) L= asam amino leusina (Leu) V= asam amino valina (Val) C= asam amino sisteina (Cys) W= asam amino triptofan (Trp) S= asam amino serina (Ser) Ob = gemuk TOb= tidak gemuk Pal, Ap, Bl, UB, dan UW menunjukkan asal populasi yaitu Palembang, Alas Purwo, Baluran, Ubud dan Uluwatu. Angka di belakang singkatan pada kolom 1 menunjukkan nomor sampel