Pusat Riset Perikanan Budidaya Jl. Ragunan 20 Pasar Minggu, Jakarta Selatan

877

Aplikasi deteksi Aeromonas hydrophila penghasil aerolysin ... (Lila Gardenia)

APLIKASI DETEKSI Aeromonas hydrophila PENGHASIL AEROLYSIN DENGAN MENGGUNAKAN POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Lila Gardenia, Isti Koesharyani, Hambali Supriyadi, dan Tatik Mufidah Pusat Riset Perikanan Budidaya Jl. Ragunan 20 Pasar Minggu, Jakarta Selatan 12540 E-mail: [email protected]

ABSTRAK Meningkatnya kegiatan intensifikasi budidaya telah menimbulkan dampak negatif antara lain munculnya berbagai kasus infeksi penyakit. Bakteri merupakan salah satu penyebab penyakit pada ikan. Infeksi bakteri dapat menyebabkan kematian massal dan merusak mutu ikan yang terinfeksi sehingga sangat merugikan pembudidaya. Tujuan penelitian ini adalah mengaplikasikan metode deteksi cepat dan tepat untuk mendiagnosa penyakit yang disebabkan oleh infeksi bakteri Aeromonas hydrophila penghasil aerolysin dengan teknik PCR. Pada penelitian ini dilakukan uji PCR dengan primer universal 16S rDNA untuk mendeteksi genom Aeromonas hydrophila dan primer spesifik AeroFd/AeroRs untuk identifikasi gen aerolysin dari genus Aeromonas. Sampel bakteri diambil dari beberapa jenis ikan budidaya yang rentan terhadap infeksi A. hydrophila (lele, gurame, dan patin) yang menunjukkan gejala terinfeksi bakteri tersebut. Uji awal berupa pengecatan gram, tes katalase, dan oksidase dilakukan sebelum uji PCR. Hasil analisis PCR dengan menggunakan universal primer menunjukkan 3 isolat merupakan bakteri A. hydrophila. Sedangkan dengan menggunakan primer spesifik, hanya isolat AH-26 yang mengandung gen Aerolysin, sehingga AH-26 merupakan isolat patogen yang menghasilkan toksin aerolysin. Dua isolat A. hydrophila lainnya tidak memiliki gen aerolysin, kemungkinan merupakan strain yang tidak patogen.

KATA KUNCI:

Aeromonas hydrophila, uji PCR, aerolysin, dan primer spesifik

PENDAHULUAN Peningkatan permintaan produk perikanan untuk kebutuhan domestik maupun ekspor saat ini telah menempatkan sektor perikanan pada posisi yang penting. Potensi pengembangan budidaya perikanan sangat besar yang menyebabkan intensifikasi semakin menjadi pilihan. Sayangnya, intensifikasi budidaya tersebut sering menyebabkan menurunnya kondisi lingkungan yang pada akhirnya menimbulkan masalah berupa timbulnya penyakit. Penyakit yang disebabkan oleh bakteri, selain dapat menyebabkan kematian massal juga mengganggu kualitas ikan dengan menurunkan mutu daging ikan yang terinfeksi sehingga tidak disukai oleh konsumen. Beberapa kasus wabah penyakit akibat infeksi bakteri telah menyebabkan pembudidaya mengalami kerugian besar, oleh karena itu, penanganan penyakit perlu mendapat perhatian serius.

Aeromonas hydrophila merupakan bakteri gram negatif berbentuk batang yang banyak ditemukan di lingkungan air tawar dan air payau. Aeromonas hydrophila dikenal sebagai bakteri oportunis karena biasanya menimbulkan masalah pada saat ikan sedang mengalami stres. Pemeliharaan pada padat tebar tinggi merupakan salah satu faktor yang menimbulkan stres pada ikan. Gejala yang terlihat pada ikan yang terinfeksi bakteri ini bervariasi, tapi umumnya ditandai oleh adanya hemoragik pada kulit, insang, rongga mulut, dan borok pada kulit. Tanda klinis yang sering dijumpai berupa eksopthalmia, asites maupun pembengkakan limfa dan ginjal. Penyebaran dapat terjadi secara horisontal lewal kontak langsung dengan air atau hati yang sakit (Irianto, 2005). Infeksi oleh bakteri A. hydrophila terjadi melalui permukaan badan yang luka, saluran pencernaan makanan atau melalui insang. Bakteri kemudian masuk dalam pembuluh darah dan menyebar pada organ dalam lain yang menyebabkan pendarahan yang disertai haemorrhagic septicaemia (Kabata, 1985). Selanjutnya, bakteri tersebut menyebar secara cepat dan dapat mengakibatkan kematian benih hingga 90%. Baru-baru ini diketahui bakteri A. hydrophila dapat bersifat zoonosis. Penelitian membuktikan bahwa beberapa strain A. hydrophila dapat menyebabkan kasus enteropathogenic, khususnya pada anak-anak, orang tua, dan penderita immunocompromised (rusaknya sistem imun akibat infeksi patogen). Beberapa gejala diare akibat A. hydrophila penyebab gastroenteritis berkaitan erat dengan

Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2010

878

diproduksinya enterotoksin oleh bakteri tersebut (Trower et al., 2000). A. hydrophila menghasilkan berbagai toksin ekstraseluler salah satunya Aerolysin yang mungkin merupakan faktor virulen (Bernheimer & Avigad, 1974). Mekanisme patogenitas A. hydrophila belum banyak diketahui, namun sedikitnya telah ditemukan 6 toksin dari galur bakteri ini (Austin & Austin, 1987). Karena akteri ini dapat memanfaatkan albumin, casein, fibrinogen, dan gelatine sebagai substrat protein maka dapat disimpulkan galur bakteri ini bersifat proteolitik (Shotts et al., 1985), sehingga berpotensi besar sebagai patogen ikan. Menurut Nieto & Ellis, 1991, sedikitnya ada 4-5 macam protease ekstraseluler dari A. hydrophila. Upaya penanggulangan penyakit yang disebabkan oleh bakteri A. hydrophila telah banyak dilakukan baik antara lain dengan antibiotik maupun cara pencegahan dengan menggunakan vaksin. Diagnosa cepat untuk deteksi awal penyakit ini perlu diterapkan agar dapat dilakukan tindakan pencegahan secepat mungkin. Selama ini diagnosa penyebab penyakit ini umumnya dilakukan secara konvensional yaitu melalui karakteristik biokimia. Namun diagnosa secara konvensional tersebut cukup kompleks, membutuhkan waktu lama, dan sering membingungkan karena bakteri anggota genus Aeromonas banyak yang memiliki karakter yang mirip antara satu dengan lainnya. Untuk mempercepat proses pengendalian penyakit akibat infeksi bakteri ini maka metoda diagnosa yang cepat, tepat, dan spesifik sangat dibutuhkan. Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan salah satu metode diagnosa yang dapat digunakan untuk mendeteksi patogen yang menginfeksi ikan (Dorsch et al., 1994). Saat ini PCR juga telah dikembangkan untuk mendeteksi gen penyebab penyakit pada Aeromonas sp. (Pollard et al ., 1990; Ù’zbas et al ., 2000). Tujuan penelitian ini adalah mengaplikasikan metode deteksi cepat dan tepat dengan teknik PCR untuk mendiagnosa penyakit yang disebabkan oleh infeksi bakteri patogen A. hydrophila penghasil toksin aerolysin. BAHAN DAN METODE Bakteri Isolat bakteri yang digunakan pada penelitian ini merupakan koleksi lingkup Pusat Riset Perikanan Budidaya, Departemen Kelautan dan Perikanan. Isolat AH-26 merupakan koleksi Balai Penelitian Budidaya Air Tawar (BPBAT) Bogor, yang diisolasi dari ikan lele (Clarias sp.) asal Parung, Jawa Barat. Isolat lainnya merupakan koleksi Pusat Riset Perikanan Budidaya yang diambil dari beberapa jenis ikan yang rentan terinfeksi A. hydrophila asal Gunung Kidul, Jogjakarta. Isolat AK-L3 berasal dari ikan lele (Clarias sp.), isolat AK-G1 berasal dari ikan gurami (Osphronemus gouramy) dan isolat AK-P3 berasal dari ikan patin (Pangasius pangasius) dengan gejala klinis terinfeksi Aeromonas sp. Kultur bakteri dimurnikan pada media TSA (Tripton Soy Agar-Difco) dengan menggunakan metode gores dan kemudian ditumbuhkan pada suhu 28°C selama 24 jam. Masing-masing isolat bakteri dipanen ke dalam mikrotube 1,5 mL berisi 750 μL ethanol 95%. Suspensi bakteri dalam alkohol tersebut disimpan sebelum dilakukan ekstraksi DNA dengan menggunakan metode pemanasan. Uji Awal Sebelum dilakukan uji PCR, empat isolat tersebut dilakukan pengujian awal berupa pengecatan gram, uji katalase dan uji oksidase. Pengecatan Gram Pengecatan gram dilakukan dengan cara mengambil sedikit isolat bakteri secara aseptik dengan menggunakan ose dan dicampurkan pada 2 tetes akuades steril di atas kaca preparat, lalu dikeringkan dengan menggunakan api bunsen. Pewarnaan dilakukan dengan cara meneteskan larutan kristal violet selama 1 menit, dibilas lalu diteteskan larutan lugol selama 3 menit. Setelah dibilas, larutan decolorized solution diteteskan selama kurang lebih 15 detik sambil digoyang dan kemudian dibilas. Larutan safranin diteteskan dan dibiarkan menyerap selama 1 menit, dibilas dan dikeringkan dengan menggunakan api Bunsen. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop dengan pembesaran 1.000x. Bakteri yang terwarna merah keunguan menandakan termasuk golongan gram positif dan yang terwarna merah muda termasuk golongan gram negatif.

879

Aplikasi deteksi Aeromonas hydrophila penghasil aerolysin ... (Lila Gardenia)

Uji Katalase Tes dilakukan dengan cara meneteskan 2-3 tetes Hidrogen Peroksida di atas kaca objek, kemudian dicampur dengan menggunakan ose, isolat bakteri dicampur dengan larutan tersebut sampai homogen. Dilakukan pengamatan terbentuknya reaksi positif berupa munculnya gelembung udara pada larutan. Bakteri aerob bereaksi positif terhadap uji ini, sedangkan bakteri anaerob tidak menimbulkan reaksi. Uji Oksidase Tes ini dilakukan menggunakan oksidase test strip (Merck) dengan cara menggoreskan satu ose bakteri pada kertas oksidase tersebut. Setelah didiamkan selama kurang lebih 60 detik, diamati perubahan warna yang terjadi. Perubahan warna test strip menjadi biru menandakan reaksi positif dan bakteri tersebut termasuk bakteri non-enterik. Sedangkan bila tidak terjadi perubahan warna maka reaksi dinyatakan negatif yang menandakan bakteri tersebut termasuk bakteri enterik. Ekstraksi DNA Bakteri Pelet bakteri diperoleh dengan sentrifugasi pada 12.000 xg selama 10 menit. Pelet diresuspensi kembali dengan 400 μL RNAse free water dan dipanaskan pada suhu 98°C selama 10 menit sambil sesekali divortex. Setelah itu, mikrotube dimasukkan ke dalam es selama 1-2 menit dan divortex kembali. DNA bakteri diperoleh dengan sentrifugasi pada 8.000 xg selama 10 menit dan supernatan berisi DNA dipindahkan sebanyak 300 μL ke dalam mikrotube baru dan disimpan pada suhu -20°C sampai akan digunakan sebagai templat DNA. Primer dan Amplifikasi DNA Aeromonas hydrophila Urutan primer universal dan spesifik yang digunakan dalam penelitian ini beserta berat molekul target yang diperoleh dari hasil amplifikasi PCR dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Urutan primer yang digunakan dalam uji PCR untuk deteksi bakteri A. hydrophila Primer Universal 16S rDNA-1 16S rDNA-2 Spesifik AeroFd AeroRs

Posisi

Urutan nukleotida (5’-3’)

Berat molekul (bp)

451-473 5’-GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA-3’ 685 1115-1135 5’-CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3’ (Dorsch et al., 1994) 645-664 834-853

5’-CCAAGGGGTCTGTGGCGACA-3’ 5’-TTTCACCGGTAACAGGATTG-3’

209 (Pollard et al., 1990)

Amplifikasi PCR dengan primer universal dilakukan dengan volume reaksi sebanyak 25 μL yang berisi 12,5 μL mastermix (Fermentas); 8,5 μL RNAse free water; 1 μL masing-masing primer 16S rDNA (10 pmol) dan 2 μL template DNA. Campuran reaksi tersebut dimasukkan ke dalam thermocycler dengan program suhu sebagai berikut: tahap predenaturasi dilakukan pada 95°C selama 5 menit, kemudian 30 kali siklus berlangsung dengan tahap denaturasi pada 94°C selama 1 menit, annealing pada 56°C selama 1 menit, elongasi pada 72°C selama 1 menit dan diakhiri dengan final elongasi pada 72°C selama 10 menit. Sedangkan amplifikasi PCR dengan primer spesifik dilakukan dalam total volume 25 μL yang berisi 12,5 μL mastermix (Fermentas); 8,5 μL RNAse free water; 1 μL masingmasing primer AeroRs/AeroFd (10 pmol) dan 2 μL template DNA. Campuran reaksi tersebut kemudian dimasukkan ke dalam thermocycler dengan program suhu sebagai berikut: setelah tahap predenaturasi pada 95°C selama 4 menit dilakukan 30 kali siklus denaturasi pada 95°C selama 30 detik, annealing pada 54°C selama 45 detik, elongasi pada 72°C selama 30 detik dan diakhiri dengan final elongasi pada 72°C selama 10 menit. Hasil amplifikasi kemudian disimpan pada suhu 4°C sebelum dilakukan elektroforesis gel agarose.

880

Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2010 Visualisasi dan Dokumentasi

Hasil PCR dideteksi dengan mengelektroforesis masing-masing amplicon sebanyak 10 μL pada 1,5% gel agarose di dalam buffer 1x Tris-Acetate-EDTA (TAE buffer). Gel diwarnai dengan 0,5 μg/mL ethidium bromide selama 15 menit dan dibaca pada UV-transilluminator kemudian didokumentasikan dengan kamera polaroid. HASIL DAN BAHASAN Hasil uji awal dapat dilihat pada Tabel 2. Dari hasil tersebut, keempat isolat bakteri menunjukkan adanya kemungkinan termasuk ke dalam genus Aeromonas sp. Tabel 2. Hasil uji awal terhadap masing-masing isolat bakteri Uji Bentuk koloni Gram Katalase Oksidase

Isolat AH-26

AK-L3

AK-G1

AK-P3

Batang pendek Negatif Positif Positif

Batang pendek Negatif Positif Positif

Batang pendek Negatif Positif Positif

Batang pendek Negatif Positif Positif

Bakteri gram negatif adalah organisme yang tidak dapat menahan zat pewarna setelah dicuci dengan alkohol 95% (Kabata, 1985). Dinding sel bakteri gram negatif mengandung lebih sedikit peptidoglikan tetapi di luar lapisan peptidoglikan ada struktur membran kedua yang tersusun dari protein, fosfolipida, dan lipopolisakarida (Volk & Wheeler, 1988). Uji oksidase bertujuan untuk menentukan bakteri enterik atau non-enterik. Enzim sitokrom oksidase akan berubah menjadi bentuk tidak aktif dengan mereduksi sitokrom c. Enzim ini akan menjadi bentuk aktifnya kembali jika terjadi transfer elektron ke molekul oksigen. Keberadaan oksigen pada enzim oksidase akan mereduksi substan-substan organik di antaranya substan yang terdapat pada oxidase test strip yang mengandung

Gambar 1. Tes PCR menggunakan primer universal untuk mendeteksi Aeromonas hydrophila pada beberapa isolat bakteri. M. Marker 100 bp (Fermentas), Lane 1. Isolat AH-26; Lane 2. Isolat AK-L3; Lane 3. Isolat AK-G1; Lane 4. Isolat AK-P3

881

Aplikasi deteksi Aeromonas hydrophila penghasil aerolysin ... (Lila Gardenia)

N, N-dimetil-1,4,-fenilen diammonium diklorida dan 1-naftol. Reaksi tersebut akan menghasilkan molekul indophenol blue yang mengakibatkan warna test strip akan berwarna biru. Ini merupakan reaksi positif untuk bakteri non enterik jika terjadi perubahan warna. Sedangkan uji katalase digunakan untuk mendeteksi adanya enzim katalase. Enzim ini terdapat pada sel-sel yang mempunyai metabolisme aerobik. Bakteri anaerob tidak mempunyai enzim katalase. Reagen yang digunakan sebagai pereaksi mengandung 3% larutan hidrogen peroksida. Enzim katalase akan bereaksi dengan hidrogen peroksida yag bereaksi dengan hidrogen peroksida yang menghasilkan gas (oksigen). Bakeri yang positif katalase ditandai terbentuknya gelembung udara pada kaca objek (David & Janet, 2001). Diagnosa awal yang dilakukan pada penelitian ini yang hanya berdasarkan bentuk morfologi, pewarnaan gram, oksidase, dan katalase tidak dapat digunakan untuk menentukan jenis bakteri penyebab infeksi. Uji awal yang dapat digunakan untuk mengindikasikan adanya kemungkinan penyebab infeksi oleh A. hydrophila antara lain berupa diperolehnya bakteri gram negatif, oksidase positif, motil, dan oksidatif-fermentatif positif. Selain itu, untuk meningkatkan ketepatan diagnoasa dapat digunakan media selektif seperti Shotts & Rimler serta media yang dikembangkan oleh Von Graevenitz & Zinterhofe (Trust & Chipman, 1979). Hasil uji PCR dengan menggunakan primer universal 16S rDNA menghasilkan amplikon dengan berat molekul 685 bp pada 3 isolat yaitu AH-26, AK-L3 dan AK-G1. Dengan demikian ketiga isolat tersebut merupakan bakteri A. hydrophila. Produk PCR pada 16S rDNA (685 bp) hanya diperoleh pada reaksi yang mengandung genomic DNA A. hydrophila. Pita pada 685 bp tersebut terdeteksi ketika genom dari Aeromonas spp. digunakan. Isolat AK-P3 tidak menghasilkan pita DNA pada berat molekul tersebut (hasil negatif), yang berarti bakteri tersebut bukan A. hydrophila. Isolat AK-P3 perlu dilakukan uji biokimiawi yang lebih lengkap sehingga jenis bakteri penyebab infeksi pada ikan patin dari Gunung Kidul tersebut dapat diketahui. AeroFd dan AeroRs merupakan pasangan primer spesifik yang hanya dapat mengamplifikasi bagian gen penghasil aerolysin dari bakteri A. hydrophila (Pollard et al., 1990). Primer ini awalnya dirancang untuk mencegah kesamaan region pada gen struktural antara gen aerolysin pada bakteri Aeromonas sobria, gen hemolisyn A pada Escericia coli dan/atau gen α-toksin Staphylococcus aureus (Lior & Johnson, 1991). Pada uji PCR, primer spesifik ini mengamplifikasi pita DNA dengan berat molekul 209 bp.

Gambar 2. Tes PCR menggunakan spesifik universal untuk mendeteksi Aeromonas hydrophila pada beberapa isolat bakteri. M. Marker 100 bp (Fermentas), Lane 1. Isolat AH-26; Lane 2. Isolat AKL3; Lane 3. Isolat AK-G1; Lane 4. Isolat AK-P3

Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2010

882

Hasil uji menunjukkan dari tiga isolat bakteri yang diduga termasuk genus Aeromonas, hanya isolat AH-26 yang menghasilkan pita DNA pada berat molekul target (209 bp). Hal ini menunjukkan isolat tersebut memiliki gen aero penghasil toksin aerolysin. Isolat lainnya tidak memiliki gen virulen tersebut, walaupun isolat AK-L3 menghasilkan pita namun pada berat molekul yang tidak spesifik (± 400 bp). Hal ini menunjukkan ada kemungkinan isolat-isolat tersebut tidak patogen (non-pathogenic). Namun tidak menutup kemungkinan merupakan isolat yang patogen bila mengandung gen virulen lain yang tidak terdeteksi dengan menggunakan primer spesifik AeroFd/AeroRs. Selain aerolysin, haemolysin, enterotoxin, α-amilase, protease, DNAse, dan kemampuan heamogglutinasi juga berperan dalam virulensi dari A. hydrophila. Cara pencegahan penyakit yang disebabkan oleh bakteri A. hydrophila ini antara lain dengan mengurangi faktor-faktor penyebab stres melalui penanganan yang baik, kepadatan yang memadai, nutrisi, transportasi, dan kualitas air. Dengan cara pencegahan tersebut hampir dipastikan ikan akan terhindar dari penyakit ini. Sanitasi dan filtrasi yang baik juga akan berpengaruh positif dalam manajemen kesehatan ikan. KESIMPULAN DAN SARAN Dari hasil analisis PCR dapat diketahui bahwa isolat AH-26 merupakan bakteri Aeromonas hydrophila yang patogen penghasil toksin aerolysin. Isolat AK-L3 dan AK-L1 merupakan bakteri Aeromonas hydrophila tetapi tidak menghasilkan aerolysin. Sedangkan isolat AK-P3 merupakan bakteri lain di luar genus Aeromonas. Primer Universal 16S rDNA digunakan untuk identifikasi bakteri Aeromonas hydrophila, tetapi primer tersebut tidak dapat mendeteksi isolat bakteri A. hydophila patogen penghasil aerolisin. Sedangkan primer spesifik AeroFd-AeroRs dapat digunakan sebagai marker gen virulen khususnya A. hydrophila patogen penghasil aerolysin. PCR sangat berguna sebagai alternatif metode identifikasi bakteri dengan karakterisasi biokimia yang kompleks karena selain spesifik, juga cepat dan sangat sensitif. Primer universal sebaiknya digunakan terlebih dahulu sebelum menggunakan primer spesifik agar diketahui kelompok isolat yang merupakan A. hydrophila. Selanjutnya primer marker gen virulen yang lain seperti aerolysin dan haemolysin dapat digunakan untuk identifikasi isolat A. hydrophila yang lebih lengkap. UCAPAN TERIMA KASIH Kami menyampaikan banyak terima kasih kepada Kepala Balai Riset Perikanan Budidaya Air TawarBogor (BRPBAT) beserta para peneliti dan staf Laboratorium Patologi-BRPBAT atas bantuannya memberikan koleksi isolat bakteri Aeromonas hydrophila AH-26. DAFTAR ACUAN Austin, B. & Austin, D.A. 1987. Bacterial fish pathogens: Disease in farmed and wild fish. Ellis Horwood. Holsted Press John Wiley dan Sons: New York. Chicaster, Brisbane, Toronto. Bernheimer, A.W. & Avigad, L.S. 1974. Partial characterization of aerolysin, a lytic exotocin from Aeromonas hydrophila. Infection and Immunity, 9: 1016-1021. Dorsch, M., Asbolt, N.J., Cox, P.T., & Goodman, A.E. 1994. Rapid identification of Aeromonas species using 16S rDNA targeted oligonucleotide primers: a molecular approach based on screening of environmental isolates. J. of Applied Bacteriology, 77: 722-726. Irianto. 2005. Patologi Ikan Teleostei. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. Kabata, Z. 1985. Parasites and diseases of fish cultured in tropics. Taylor and Francisco Ltd. London. Lior, H. & Johnson, W.M. 1991. Application of the polymerase chain reaction (PCR) to detection of the aerolysin gene in whole cell cultures of β−hemolytic Aeromonas hydrophila. Experientia, 47: 421424. Nieto,T.P. & Ellis, A.E. 1991. Heterogenicity of extracellular proteases and produced by different isolates of Aeromonas hydrophila and Aeromonas sobria pathogenic for fish. J. Fish Dis., 14: 229-235. Pollard, D.R., Johnson, W.M., Lior, H., Tyler, S.D., & Rozee, K.R. 1990. Detection of the aerolysin gene in Aeromonas hydrophila by the polymerase chain reaction. J. of Clinical Microbiology, p. 2477-2481. Shotts, E.B., Hsu, T.C., & Waltman, W.D. 1985. Extracellular Proteolytic activity of A. hydrophila com-

883

Aplikasi deteksi Aeromonas hydrophila penghasil aerolysin ... (Lila Gardenia)

plex. I., 20(1): 37-44. Trust, T.J. & Chipman, D.C. 1979. Clinical involvement of Aeromonas hydrophila. CMA J., (120). Trower, C.J., Abo, S., Majeed, K.N., & Von Itzstein, M. 2000. Bacterial pathogenicity: production of an enterotoxin by a gastro-enteritis-associated Aeromonas strain. J. Med. Microbiol., 49: 121-126. Ù’zbas, Z.Y., Lehner, A., & Wagner, M. 2000. Development of a multiplex and semi-nested PCR assay for detection of Yersinia enterocolitica and Aeromonas hydrophila in raw milk. Food Microbiology, 17: 197-203. Volk, W.A. & Wheller, M.F. 1988. Mikrobiologi Dasar. Alih Bahasa: Markham. Erlangga. Surabaya.