Proteinové inženýrství: od laboratorních testů k biotechnologiím Jiří Damborský Loschmidtovy laboratoře a Centrum biokatalýzy a biotransformací, Masarykova univerzita, Kamenice 5/A4, 625 00 Brno, e-mail:
[email protected] Biotechnologie ve světě „Je nezbytné provést reorganizaci produkce potravin s využitím přírodních věd. Bude-li farmář, fyziolog a biochemik kontrolovat produkci potravin a pokud otevřou poklady přírody, pak se jim může podařit podpora lidstva v nepředstavitelných dimenzích, které zpětně pojmenujeme začátek nové éry hojnosti. Vytvoření biochemické éry je otázkou rozhodnutí.„ (Karol Ereky, 1919)
Termín „biotechnologie“ je složeninou tří řeckých slov „bios“, „techne“ a „logos“, které znamenají život, dovednost a znalost. Poprvé byl tento termín použit roku 1919 maďarským agronomem Károlym Erekym k popisu velkoobjemové produkce vepřového masa. Do podvědomí širší vědecké komunity se termín dostal díky prestižnímu časopisu Nature v kontextu „využití živých organismů – zejména plísní a baktérií – k produkci léčiv a potravin“. Tato klasická biotechnologie je reprezentována výrobou potravin, zejména sýrů, vín a octa fermentačními procesy jejichž kořeny lze nalézt ve starobylém Babylónu 5000 p.n.l. (Tabulka 1). Začátkem padesátých let devatenáctého století byla zahájena produkce antibiotik s vyžitím mikroorganismů streptomycét, vyžadující provozování obřích fermentorů za sterilních podmínek a čištění vysokomolekulárních látek pomocí chromatografických kolon. Slavná publikace Jamese D. Watsona a Francise Cricka z roku 1953 o struktuře DNA, jako nositeli genetické informace (obr. 1) a práce Paula Berga demonstrující možnosti přenosu DNA do baktérií, její pomnožení a řízení syntézy proteinů, položily základ biotechnologiím využívajícím rekombinantní organismy. Pokroky molekulární biologie vedly k oprávněnému optimismu, ale i obavám vědecké komunity a veřejnosti. Tyto obavy vyústily v roce 1975 k zorganizování slavné Asilomar konference, na které se stovka předních vědců diskutovala bezpečnostní a etické otázky spojené s využíváním technologií rekombinantní DNA. V následujících letech se podařilo díky technologiím rekombinantní DNA produkovat cenná biofarmaka interferon nebo inzulín v baktériích. V roce 1997 byly zveřejněny výsledky úspěšného klonování ovce britským týmem vedeným Ianem Wilmuthem (obr. 2). Podle druhů organismů rozlišujeme biotechnologie červené (živočichové a člověk), zelené (rostliny), modré (mořské organismy), šedé (baktérie) a bílé (enzymy a průmyslové aplikace). Počátek komercializace nových - molekulárních - biotechnologií lze vystopovat v Bay Area v San Francisku, odkud se přenesla na sever do Bostonu, přes Atlantik do Velké Británie a odtud do celé Evropy. Nejrozvinutější jsou červené biotechnologie, zastoupené především společnostmi ve Spojených státech amerických, následované Velkou Británií a zbytkem Evropy. Velmi dynamický rozvoj lze v posledních letech zaznamenat v asijských zemích Číně, Korei, Singapuru a Indii. Ve druhé vlně následovaly zelené biotechnologie zaměřené na produkci geneticky upravených plodin. V současné době jsme svědky třetí vlny biotechnologií bílých a šedých. Tyto biotechnologie kombinují enzymy k urychlení chemických reakcí - biokatalýzu - s tradičními fermentačními technologiemi využívajícími mikrooganismy. Hybnou silou rozvoje těchto biotechnologií je stále větší důraz kladený na čistotu, ekologickou nezávadnost a dlouhodobou udržitelnost průmyslových výrob. Nástup bílých a šedých biotechnologií by nebyl možný bez pokroků v molekulární genetice, - 51 -
proteinovém a metabolickém inženýrství. Tabulka 1 Mezníky světových biotechnologií. Rok Událost 5000 p.n.l. produkce piva fermentací v Babylónu 4000 p.n.l. využití kvasinek ve výrobě piva a vína v Egyptě a Číně 1919 zavedení termínu biotechnologie zemědělským inženýrem Karolem Erekym 1935 objev penicilínu Alexandrem Flemingem 1953 popis struktury DNA Jamesem D. Watsonem a Francisem Crickem 1975 produkce monoklonálních protilátek Georgem Kohlerem a Césarym Milsteinem 1977 produkce prvního lidského proteinu v buňce firmou Genentech (USA) 1980 zavedení metod rekombinantní DNA, produkce inzulínu v E. coli 1994 schválení první geneticky modifikované potraviny – rajčete 1996 klonování ovce Dolly Ianem Wilmuthem a spolupracovníky
Obr. 1 James D. Watson a Francis Crick s modelem DNA.
Obr. 2 Klonování ovce Dolly Ianem Wilmuthem a spolupracovníky - 52 -
Biotechnologie v České republice "Trh s vakcínami je pro Baxter velkou příležitostí vzhledem k rostoucí světové populaci, rozsáhlejší globalizaci, vzrůstajícímu riziku rozšíření nemocí a hrozby bioterorismu. Investicemi do výzkumných a vývojových kapacit, nových technologií a produkčních kapacit očekáváme růst obchodu s vakcínami na $1 mld. v roce 2010“. (Thomas Glanzmann, president Baxter, 2002)
V českých zemích mají biotechnologie dlouhou tradici sahající do středověku s kořeny v klasických fermentačních technologiích zaměřených na produkce vína, piva, sýrů a destilátů. První písemná zmínka o produkci vína v českých zemích pochází z roku 276, kdy byly vysázeny vinice římskými legiemi v městě Pálavě na Moravě (Tabulka 2). Pro rozvoj vinařství v Českém Království byl důležitý královský dekret vydaný roku 1358 Karlem IV. První písemný záznam o českém pivovarnictví pochází z 11. století z listin krále Vratislava II. Většina českých pivovarů vznikla ve 12. století. Od svého založení prošlo pivovarnictví, ale i další obory využívající fermentační technologie rychlým vývojem. Zkušenosti získané po staletí bylo nutno systematičtěji předávat a proto byla roku 1707 založena Technologická univerzita v Praze, jako vůbec první vysoká škola tohoto typu na světě. Ve druhé polovině 19. století bylo území dnešní České republiky průmyslovým srdcem Rakousko-Uherské monarchie, což sebou přirozeně přinášelo investice do vývoje průmyslových (bio)technologií, vzdělávacího systému a výzkumných institucí, mezi něž patří i Výzkumný ústav pivovarský a sladařský založený roku 1887. Mezi osobnosti české vědy, které svými objevy ovlivnily vývoj českých i světových biotechnologií patří Jan Evangelista Purkyně a Gregor Johann Mendel (obr. 3). Purkyně formuloval buněčnou teorii důležitou pro rozvoj moderní fyziologie. Mendel svými zákony dědičnosti položil základy vědních disciplín genetiky a molekulární biologie, bez kterých by moderní biotechnologie nemohla vzniknout. Po druhé světové válce se česká biotechnologie orientovala zejména na produkci farmaceuticky zajímavých sloučenin, antibiotik a biologicky účinných látek, sekundárních metabolitů a mikrobiální modifikaci různých organických sloučenin. Expanze industriální biotechnologie vedla v roce 1966 k založení Výzkumného ústavu antibiotik a transformací. Je veliká škoda, že tento ústav dnes již neexistuje a naše země nedokázala udržet kontinuitu v problematice bílých a šedých biotechnologií, které se v současné době celosvětově rozvíjí. Biotechnologický sektor v České republice je dnes reprezentován zejména zahraničními investory. Procter&Gamble odkoupil za $ 21 mil. závod Rakona v Rakovníku vyrábějící enzymy pro prací prášky. Podobný osud potkal i další podnik využívající biotechnolgie k výrobě diagnostických setů, LACHEMA v Brně, který koupila nadnárodní farmaceutická společnost PLIVA za $ 31,5 mil. Společnost IVEX investovala $ 20,6 mil. do farmaceutické společnosti GALENA tradičně provozující fermentační výrobu antibiotik. Lonza Biotech investovala $ 6,25 mil. do závodu v Kouřimi u Prahy, produkující L-carnitin a jiné preparáty pro potravinářský a farmaceutický průmysl. Společnost Baxter finančně vstoupila do státního podniku SEVAC v Bohumili a investovala $ 77 mil. do modernizace zařízení pro výrobu buněčných kultur a vakcín (obr. 4). Kromě těchto „velkých hráčů“ v biotechnologické sektoru působí šest desítek malých a středních firem, které jsou často zdrojem inovací a nových technologií. Z 65 biotechnologických firem operujících v České republice v roce 2005 působilo 38% v oblasti výroby, 30% ve vývoji a výzkumu, 23% poskytuje služby a 9% v ostatních oblastech biotechnologií. Tyto firmy jsou často lokalizovány v blízkosti velkých vzdělávacích a výzkumných center (obr. 5). Univerzity v současné době poskytují vzdělání 298 tis. studentů, z nichž 56 tis. studuje přírodní vědy. Další rozvoj biotechnologií v České republice bude do velké míry záviset na schopnosti vzdělávacích institucí nabídnout dostatek kvalifikovaných pracovníků pro výzkumná pracoviště i výrobní provozy. - 53 -
Tabulka 2 Mezníky českých biotechnologií. Rok 276 1358 1707 1837 1861 1866 1887 1928 1949 1965 1966 1991 1999 1991 2001 2002
Událost první zmínka o produkci vína královský dekret o produkce vína v Českých zemích vydaný Karlem IV. založení Technické univerzity v Praze formulování buněčné teorie Janem Evangelistou Purkyně grafický zápis chemických struktur Janem Josefem Loschmidtem formulování zákonů dědičnosti Gregorem Johannem Mendelem založení Výzkumného ústavu pivovarského a sladařského průmyslová produkce kyseliny citrónové průmyslová produkce penicilínu v Roztokách u Prahy průmyslová výroba pracích prášků v Rakovníku založení Výzkumného ústavu antibiotik a transformací akvizice podniku RAKONA v Rakovníku společností Procter&Gamble akvizice LACHEMA v Brně společností PLIVA výstavba nového závodu SEVAC v Bohumili akvizice GALENA v Opavě společností IVEX výstavba nového závodu LONZA-Biotec v Kouřimi
Obr. 3 Jan Evangelista Purkyně – tvůrce buněčné teorie, Jan Josef Loschmidt – otec molekulového modelování a Gregor Johann Mendel – zakladatel genetiky.
- 54 -
Obr. 4 Historie a současnost biotechnologické výroby v Bohumili.
- 55 -
Obr. 5 Geografické rozložení počtu studentů vysokých škol (nahoře), výzkumných pracovišť (uprostřed) a biotechnologických firem (dole). Czech Biotechnology Report, Jihomoravské inovační centrum, Brno, 2006.
- 56 -
Proteinové inženýrství Proteinové inženýrství je společně s metabolickým inženýrstvím důležitým pilířem bílých a šedých biotechnologií. Proteinové inženýrství studuje vztahy mezi strukturou a funkcí proteinů s cílem zkonstruovat proteiny s vylepšenými vlastnostmi. Přirozené proteiny izolované z živých organismů často nevyhovují požadavkům průmyslového využití a proteinové inženýrství nabízí řešení v podobě pozměněných proteinů. Tyto změny jsou formou mutací vnášeny do DNA kódující příslušný enzym. Mutovaná DNA je vložena klonováním do buňky, která pak vyprodukuje protein s novou strukturou a novými vlastnostmi. Vnáší-li se mutace jednotlivě na základě počítačového modelovaní metodou místněcílené mutageneze, hovoříme o tzv. racionálním designu (obr. 7). Tento přístup vyžaduje detailní znalost struktury proteinu z krystalografické analýzy nebo nukleární magnetické rezonance. Řízenou evolucí nazýváme postupy, při kterých jsou náhodně generovány rozsáhlé knihovny mutovaných genů, ve kterých jsou následně výběrem nebo selekcí hledány ty s nejlepšími vlastnostmi. Knihovny jsou konstruovány molekulárně-biologickými metodami náhodně-chybující PCR, DNA hybridizací, mutátorovými kmeny, nebo cirkulární permutací. Řízená evoluce napodobuje za laboratorních podmínek evoluční procesy probíhající v přírodě. Tyto procesy však významně urychluje a směřuje k získání požadovanému proteinu.
H O
O R Enz
HH
X
H
O
X H O
O
O
O
R Enz
Enz
HH OH R
Schéma 1 Dehalogenace katalyzovaná enzymem halogenalkandehalogenasou. Dvoukrokovou reakcí je přeměňován halogenovaný uhlovodík na produkty halogenidový iont a alkohol. Enzymy jsou biologické katalyzátory urychlující chemické reakce v živých organismech - bez tohoto urychlení by byly reakce pro život příliš pomalé. Enzymy studované na našem pracovišti se nazývají halogenalkandehalogenasy (obr. 8),které urychlují reakce náhrady halogenu hydroxylovou funkční skupinou za vzniku příslušných alkoholů (schéma 1). V rámci projektů základního výzkumu studujeme jak se tyto enzymy v bakteriích vyvinuly a jak fungují. Ke studiu využíváme metody počítačového modelování s využitím moderních technologií internetových portálů a superpočítačů. V projektech aplikovaného výzkumu a vývoje provádíme vylepšování vlastností proteinů pro průmyslové aplikace metodami genového inženýrství. Patentované enzymy nacházejí uplatnění v bioremediacích sloužících k degradaci nebezpečných látek1, při syntéze látek na výrobu léčiv a agrochemikálií2 a v biosensorech k detekci škodlivých látek v životním prostředí (obr. 9). 1. Způsob detoxikace sulfidického yperitu působením halogenalkandehalogenas. 2005, Masarykova univerzita, Brno, Česká republika, Patentová přihláška PCT/CZ 2006/000036. 2. Způsob výroby opticky aktivních halogenalkanů a alkoholů hydrolytickou dehalogenací katalyzovanou halogenalkandehalogenasami. 2004, Masarykova univerzita, Brno, Česká republika, Patentová přihláška PCT/CZ 2005/000099.
- 57 -
Obr. 6 Racionální design a řízená evoluce představují dva koncepčně rozdílné přístupy používané při konstrukci vylepšených enzymů metodami proteinového inženýrství.
Obr. 7 Model struktury enzymu halogenalkadehalogenasy s navázanou molekulou yperitu v aktivním místě. Protein je tvořen α-šroubovicemi (červeně) a β-skládaným listem (žlutě).
- 58 -
.
AGROCHEMIKÁLIE
LÉČIVA
Obr. 8 Využití bakteriálních enzymů halogenalkandehalogenas ve vojenství k dekontaminaci bojové chemické látky yperitu (nahoře), v biokatalýze k výrobě léčiv a agrochemikálií (uprostřed) a v biosensorech k detekci chemikálií v životním prostředí (dole).
- 59 -
Jan Josef Loschmidt (1821-1895) “Jeho práce tvoří významný milník, který bude viditelný, pokud věda bude existovat ... Loschmidtova neobyčejná skromnost zabránila tomu, aby byl uznáván tak, jak by mohl a jak by si zasloužil.“ (Ludwig Edward Boltzman, 1895)
Pracoviště zabývající se molekulárními biotechnologiemi a proteinovým inženýrstvím na Masarykově univerzitě nese jméno génia české chemie a fyziky Jana Josefa Loschmidta (obr. 10). Loschmidt jako první na světě správně spočítal velikost atomu1 a jeho pracím v oblasti fyziky se dostalo zaslouženého ocenění světovou vědeckou komunitou (Tab. 3). V německé literatuře se dodnes setkáváme s Loschmidtovou konstantou definující počet molekul v krychlovém metru plynu za standardních podmínek (2,6873 x 1025 m-3). Naopak nedoceněná zůstala Loschmidtova práce v oblasti chemie, přestože jeho „Chemische Studien I“ vydaná vlastním nákladem v roce 18612 patří mezi revoluční práce své doby. V práci je poprvé prezentována chemická struktura 121 organických sloučenin, včetně sloučenin aromatických (obr. 11). Josef Loschmidt svou chemickou studií předběhl o čtyři roky Augusta Kekulého s jeho vyobrazením benzenu jako cyklické struktury (obr. 12). Můžeme se jen dohadovat zda slavný německý chemik Kekulé našel inspiraci pro svůj objev ve snu nebo v Loschmidtově publikaci, kterou nepochybně četl, avšak nikdy ji necitoval (obr. 13). Oživení zapomenutého Loschmidtova díla je zajímavé nejen z hlediska historie chemie či odkazu nedostatečně známého velikána české vědy. Je aktuální i v dnešní době, kdy je etika vědecké práce konfrontována s narůstajícími požadavky grantových systémů na vysokou produktivitu a publikační výstupy vědeckého bádání. Tabulka 3 Bibliografie Jana Josefa Loschmidta. Rok 1821 1833 1837 1839 1842 1846 1856 1861 1865 1868 1869 1877 1895
Událost narozen v Počernech farní škola v Ostrově humanitní gymnázium v Praze Německá univerzita v Praze Technická univerzita ve Vídni práce ve Vídni a podnikání v Brně učitel na střední škole ve Vídni publikace „Chemische Studien I“ publikace „Zur Grősser der Luftmolecűle“ docent Univerzity ve Vídni ředitel Laboratoře fyzikální chemie děkan Filosofické fakulty zemřel ve Vídni
1. Zur Grősser der Luftmolecűle, Sitzungsber. Kais. Akad. Wiss. Wien, Math. Naturwiss. Classe, II. Abteilung 52, 395 (1866). pre-publication abstract of the author, Anzeiger Kais. Akad. Wiss. Wien, Math. Naturwiss. Classe 2, 162 (1865). 2. Chemische Studien I, Druck von Carl Gerold's Sohn, Wien 1861, 54 Seiten. Teil A: Constitutiosformeln der organischen Chemie in graphischer Darstellung. Teil B: Das Mariotte'sche Gesetz.
- 60 -
Obr. 9 Internetový portál www.loschmidt.cz věnovaný Janu Josefu Loschmidtovi.
Obr. 10 Znázornění struktur organických látek strukturním vzorcem (vlevo), kalotovým modelem (uprostřed) a schématy z Loschmidtovy práce Chemische Studien (vpravo).
- 61 -
Loschmidt 1861
Kekulé 1861 Obr. 11 Zobrazení benzenu Loschmidtem a Kekulém v roce 1861.
Obr. 12 Dopis Kekulého Erlenmeyerovi zmiňující Loschmidtovy struktury z roku 1862.
- 62 -
Internetové odkazy: James Dewey Watson http://www.quido.cz/osobnosti/watson.htm Jan Evangelista Purkyně http://www.quido.cz/osobnosti/purkyne.htm Gregor Johann Mendel http://www.quido.cz/osobnosti/mendel.htm Jan Josef Loschmidt http://www.loschmidt.cz/ Mendelovo muzeum genetiky http://www.mendel-museum.org/indexces.htm Výzkumný ústav pivovarský a sladařský http://www.beerresearch.cz/vupsONA.htm Loschmidtovy laboratoře http://loschmidt.chemi.muni.cz/peg/ Česká biotechnologická společnost http://bts.vscht.cz/ Evropská biotechnologická společnost http://www.efb-central.org/ Biotechnologický portál Gate2Biotech http://www.gate2biotech.com/ LONZA-Biotech http://www.lonzabiotec.cz/ SEVAC http://infos.kpnqwest.cz/sevac/ GALENA http://www.galena.cz/ LACHEMA http://www.lachema.cz/cz/ RAKONA http://www.procter-gamble.cz/
- 63 -
