PROPOSAL PENELITIAN PEMULA
PEMBENTUKAN HEWAN MODEL FIBROSIS HATI MENGGUNAKAN BERBAGAI TINGKATAN DOSIS KARBON TETRAKLORIDA (CCL4)
Diajukan Oleh: Fahri Fahrudin, M.Si (Dosen Fakultas Sains dan Teknologi)
PUSAT PENELITIAN DAN PENERBITAN (PUSLITPEN) LP2M UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 2016 1
ABSTRAK
Hati merupakan salah satu organ yang berperan dalam memelihara keseimbangan metabolik di dalam tubuh. Kerusakan hati secara akut maupun kronis berdampak pada fibrosis hati. Pembuatan hewan model fibrosis hati yang tepat sangat bermanfaat dalam rangka pencarian bahan obat untuk penanganan fibrosis hati. Tujuan penelitian ini adalah mendapatkan kondisi optimal induksi CCl4 pada tikus dalam pembuatan hewan model fibrosis hati. CCl4 diberikan secara per oral selama 6 minggu berturut-turut. Sebanyak 25 ekor tikus jantan galur SpragueDawlay (SD) dibagi ke dalam 5 kelompok perlakuan (P1-P5), yaitu P1 adalah kelompok normal mendapat pembawa minyak kelapa 1 ml/kg BB, P2 mendapat CCl4 (40%) 1 ml/kg BB 3 kali seminggu, P3 mendapat CCl4 (40%) 0.5 ml/kg BB 3 kali seminggu, P4 mendapat CCl4 (10%) 1 ml/kg BB 3 kali seminggu, dan P5 mendapat CCl4 (10%) 1 ml/kg BB 2 kali seminggu. Parameter yang dianalisis meliputi aktivitas enzim hati dalam darah (alanine transaminase, aspartate transaminase, dan alkalin phosphatase), gambaran makroanatomi hati dan histopatologi hati (tingkat perlemakan dan pembentukan jaringan ikat kolagen) serta persentase kematian hewan. Penelitian ini diharapkan mendapatkan dosis yang optimal dalam pembentukan hewan model fibrosis hati, sehingga dapat menjadi acuan para peneliti yang akan mengkaji berbagai kandidat obat fibrosis hati. Kata Kunci: hewan model, fibrosis hati, enzim hati, histopatologi, kolagen.
i
DAFTAR ISI
ABSTRAK ........................................................................................................................... i DAFTAR ISI ........................................................................................................................ ii
PROPOSAL
Halaman
A. Latar Belakang Masalah ........................................................................................... 1 B. Permasalahan Penelitian ........................................................................................... 1 C. Literature Review ..................................................................................................... 2 D. Landasan Teori dan Kerangka Konseptual .............................................................. 2 E. Hipotesis ................................................................................................................... 6 F. Metode Penelitian ..................................................................................................... 6 G. Hasil yang Diharapkan ............................................................................................. 7 H. Waktu dan Tempat Penelitian .................................................................................. 7
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................................... 8 LAMPIRAN ......................................................................................................................... 11
ii
A. Latar Belakang Hati berperan dalam memelihara keseimbangan metabolik di dalam tubuh, seperti metabolisme protein, karbohidrat, lipid, vitamin, sintesis protein, sekresi empedu serta detoksifikasi. Hati merupakan organ tubuh yang berkaitan erat dengan metabolisme nutrisi dan xenobiotik. Senyawa xenobiotik yang masuk ke dalam tubuh dan tidak dibutuhkan oleh tubuh merupakan senyawa yang bersifat toksik bagi tubuh, sehingga hati menjadi rentan terhadap kerusakan (Panjaitan, 2008). Kerusakan pada hati baik secara akut (Maiti et al., 2007) maupun kronis (Jeon et al., 2003; Tang et al., 2012) akan berdampak pada fibrosis hati. Fibrosis hati ditandai dengan meningkatnya sel myofibroblast dan ekstracellular matrix, serta dapat dilihat dari gejala histologi dan fisiologi. Tang et al. (2012) melaporkan bahwa fibrosis hati adalah penyebab utama gagal hati atau sirosis hati. Tubuh manusia sering terpapar kemudian terakumulasi beragam senyawa xenobiotik maupun radikal bebas lain yang menyebabkan fibrosis hati. Hati mempunyai antioksidan sebagai sistem protektor untuk melindungi diri dari kelebihan radikal bebas (Edward, 2012). Apabila terjadi ketidakseimbangan antara radikal bebas dengan antioksidan, maka akan terjadi stres oksidatif, dimana kelebihan radikal bebas akan sangat merusak sel-sel hati (Zainuri dan Wanandi, 2012) dan dapat menimbulkan dampak negatif pada membran sel (Edward, 2012). Menurut Tang et al. (2012) pengobatan terhadap kerusakan hati atau fibrosis hati belum efektif, karena obat fibrosis hati yang kurang aktif maupun pembuatan hewan model dalam kondisi fibrosis hati yang kurang optimal. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian untuk membentuk hewan model fibrosis hati. Hewan yang digunakan adalah tikus jantan galur Sprague Dawlay (SD). Penggunaan tikus jantan pada penelitian ini untuk menghindari siklus hormonal pada saat penelitian, sehingga diharapkan hasil yang seragam diakhir penelitian. Senyawa yang sering digunakan sebagai agen perusak hati dalam penelitian fibrosis hati adalah karbon tetraklorida (CCl4) (Jeon et al., 2003; Panjaitan, 2008; Ko et al., 2010; Edward, 2012). CCl4 merupakan senyawa yang terbukti hepatotoksik (Venukumar dan Latha, 2002; Panjaitan, 2008; Ko et al., 2010) dan dapat menimbulkan kerusakan pada sel-sel hati (Edward, 2012). Tujuan penelitian ini adalah (1) mendapatkan kondisi optimal hewan model fibrosis hati dan (2) mempelajari mekanisme pembentukan kolagen akibat terjadinya fibrosis hati.
B. Permasalahan Penelitian Fibrosis hati merupakan kondisi kerusakan hati yang berkelanjutan dan dapat menyebabkan kegagalan hati. Pengobatan terhadap kerusakan hati atau fibrosis hati belum 1
efektif, karena obat fibrosis hati yang kurang aktif maupun pembuatan hewan model dalam kondisi fibrosis hati yang kurang optimal. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian untuk pembentukan hewan model fibrosis hati yang optimal.
C. Literature Review Penelitian tentang penanganan atau pengobatan fibrosis hati banyak dilakukan, namun banyak penelitian terkait yang hanya mengeksplorasi obat untuk fibrosis hati. Padahal aspek lain yang lebih penting adalah penggunaan hewan model dalam kondisi fibrosis hati yang tepat. Untuk mendapatkan kondisi hewan model fibrosis hati yang tepat, maka harus dicari mekanisme pemberian dosis senyawa atau zat perusak hati yang optimal. Kondisi hewan model fibrosis hati yang optimal harus mempunyai beberpa kriteria penting, diantaranya adalah aktivitas enzim hati dalam darah meningkat, memiliki presentasi kematian yang rendah, gambaran makroanatomi yang tidak normal, dan secara histopatologi organ hati dipenuhi oleh perlemakan, sel radang, dan serabut kolagen.
D. Landasan Teori dan Kerangka Konseptual
Organ Hati Hati adalah organ metabolik terbesar dan sebagai pabrik biokimia utama di dalam tubuh (Sherwood, 2009). Hati merupakan organ pertama yang menghadapi proses pencernaan nutrisi, vitamin, logam, obat-obatan, dan bahan toksik dari lingkungan yang masuk ke dalam vena porta (Klaassen, 2008). Hati tersusun menjadi unit-unit fungsional yang disebut lobulus (susunan jaringan berbentuk heksagonal yang mengelilingi satu vena sentralis). Pada masingmasing sudut lobulus terdapat tiga pembuluh yaitu arteri hepatika, vena porta, dan duktus biliaris (Sherwood, 2009). Hati menerima suplai darah dari arteri hepatika dan vena porta, kemudian darah mengalir melalui perifer lobulus ke ruang kapiler yang disebut sinusoid. Organ hati merupakan jalur utama proses sintesis, metabolisme, dan ekskresi bahanbahan kimia yang masuk ke dalam tubuh (Klaassen, 2008). Hati sangat efisien sebagai organ penyerap bahan-bahan dari darah untuk proses katabolisme, penyimpanan, dan sekresi. Menurut Sherwood (2009) hati juga melakukan berbagai fungsi yang tidak berkaitan dengan pencernaan, diantaranya: 1. Memproses secara metabolis tiga kategori utama nutrien (karbohidrat, protein, dan lemak) setelah zat-zat tersebut diserap oleh saluran cerna.
2
2. Detoksifikasi atau menguraikan zat sisa tubuh dan hormon serta obat dan senyawa asing. 3. Membentuk protein plasma, termasuk protein yang dibutuhkan untuk pembekuan darah, pengangkut hormon (steroid dan tiroid) serta kolesterol dalam darah. 4. Menyimpan glikogen, lemak, besi, tembaga, dan berbagai vitamin. 5. Mengaktifkan vitamin D yang dilakukan oleh hati bersama ginjal. 6. Mengeluarkan bakteri dan sel darah merah tua yang sudah tua. 7. Mengekskresikan kolesterol dan bilirubin, bilirubin merupakan produk penguraian yang berasal dari destruksi sel darah merah yang sudah tua. Hati berkaitan erat dengan metabolisme nutrisi dan xenobiotik. Senyawa xenobiotik yang masuk ke dalam tubuh dan tidak dibutuhkan oleh tubuh merupakan senyawa yang bersifat toksik bagi tubuh, sehingga hati menjadi rentan terhadap kerusakkan (Panjaitan, 2008). Menurut Klaassen (2008) terdapat dua penyebab utama hati mudah terkena racun dan kemudian rentan mengalami kerusakan. Pertama, hati menerima lebih dari 80% suplai darah dari vena porta. Vena porta membawa zat-zat toksik dari tumbuhan, fungi, bakteri, logam mineral, dan zat-zat kimia lain yang diserap di usus kemudian ditransportasikan ke hati. Kedua, hati menghasilkan enzim-enzim biotransformasi berbagai macam zat eksogen dan endogen untuk dieliminasi di dalam tubuh. Proses tersebut dapat mengaktifkan beberapa zat menjadi bentuk lebih toksik dan dapat menyebabkan perlukaan hati. Penyakit hati atau kerusakan hati terjadi karena berbagai penyebab, termasuk infeksi virus, paparan zat toksik seperti alkohol, karbon tetraklorida, dan obat penenang tertentu. Kerusakan hati berkisar dari ringan hingga kerusakan hati yang akut dan masif dengan kemungkinan kematian dini akibat gagal hati akut (Sherwood, 2009). Semua fungsi hati dapat terganggu akibat adanya paparan akut maupun kronis oleh zat toksik yang masuk ke dalam tubuh. Klaassen (2008) menyebutkan kerusakan hati akan berpengaruh kepada beberapa jenis fungsi utama dari hati. Racun yang masuk ke dalam tubuh dapat menghambat proses sintesis dan transportasi hati sehingga terjadi disfungsi hati. Hilangnya fungsi hati (disfungsi hati) terjadi karena zat toksik atau radikal bebas merusak sel-sel hati. Ketika kerusakan sel dalam keadaan kronis terjadi pergantian sel yang rusak oleh jaringan ikat. Jaringan ikat yang berlebih akan berdampak pada akumulasi steatosis (perlemakan sel) sehingga sintesis lipoprotein dalam hati terganggu. Jaringan ikat yang diikuti oleh kematian sel akan menyebabkan kapasitas hati sebagai bitransformasi obat-obatan semakin menurun.
3
Hewan Model Hewan model merupakan hewan yang digunakan untuk eksperimen atau penelitian dalam melihat dan mempelajari sesuatu hal yang nantinya akan dikembalikan untuk kesejahteraan manusia maupun hewan itu sendiri. Suatu penelitian dianjurkan untuk menghindari penggunaan hewan, bila penelitian tersebut memungkinkan untuk menggunakan kultur organ/sel/jaringan sebagai pengganti hewan hidup. Jika harus menggunakan hewan hidup, maka disarankan untuk menggunakan hewan yang lebih rendah ordonya (Appleby et al., 2011). Penelitian dengan menggunakan hewan model telah menghasilkan kontribusi yang cukup banyak dalam pemahaman konsep biologis bagi kepentingan hewan maupun kemaslahatan manusia. Hewan model memiliki peran yang tidak tergantikan mengingat penggunaan metode alternatif apapun tidak dapat mewakili interaksi yang kompleks dalam jaringan individu (in vivo) (Tim KEH IPB, 2011). Penggunaan hewan model dalam suatu penelitian biomedis harus memenuhi kaidah ilmiah yang berstandar internasional, yaitu memenuhi azas kesejahteraan hewan (animal welfare) (Tim KEH IPB, 2011). Kesejahteraan hewan model adalah kondisi hewan model yang dipelihara untuk tujuan penelitian maupun pengajaran memiliki keadaan fisiologis dan psikologi yang sesuai untuk menunjang kualitas hidup hewan (Mangkoewidjojo, 2006) serta perawatan/perlakuan terhadap hewan tersebut (Dallas, 2006). Salah satu konsep mengenai kesejahteraan hewan harus sesuai dengan ketentuan konsep dari World Society for Protection of Animals (WSPA) yang dikenal sebagai Five Freedom (Dallas, 2006; Appleby et al., 2011). Menurut Appleby et al. (2011) ketentuan Five Freedom dari WSPA mewajibkan semua hewan yang dipelihara atau hidup bebas di alam memiliki hak-hak/kebebasan yaitu freedom from hunger and thirst (bebas dari rasa lapar dan haus), freedom from discomfort (bebas dari rasa panas dan tidak nyaman), freedom from pain, injury, and disease (bebas dari luka, penyakit dan sakit), freedom from fear and distress (bebas dari rasa takut dan penderitaan) dan freedom to express normal behavior (bebas mengekspresikan perilaku normal dan alami).
Sumber Kerusakan Hati Bahan atau senyawa yang sering digunakan sebagai sumber kerusakan hati dalam penelitian penyakit hati adalah karbon tetraklorida (CCl4) (Jeon et al., 2003; Ko et al., 2010; Khan et al., 2012), dimethylnitrosamine (Di Sario et al., 2004), arsenic (Ghatak et al., 2011), dan thioacetamide (Palacios et al., 2008; Foo et al., 2011). Senyawa-senyawa tersebut digunaka untuk penelitian permodelan kerusaskan hati. Bahan atau senyawa-senyawa tersebut 4
jika masuk ke dalam metabolisme tubuh akan menghasilkan reaksi radikal bebas, sehingga dapat menimbulkan ganguan terhadap keseimbangan metabolism sel. CCl4 merupakan senyawa tetrahedral yang terbukti hepatoksik (Venukumar dan Latha, 2002; Ko et al., 2010) dan dapat menimbulkan kerusakan pada sel-sel hati (Khan et al., 2012). Menurut Edward (2012) dan Weber et al. (2003) CCl4 dapat menimbulkan stress oksidatif pada hati, dikarenakan dapat menjadi radikal triklorometil (CCl3•). CCl4 dimetabolisme oleh sitokrom P450 2E1 (CYP 2E1) di dalam retikulum endoplasmik hati menjadi CCl3• (Boll et al., 2001; Jeon et al., 2003; Weber et al., 2003). CCl3• jika berreaksi dengan oksigen dapat membentuk radikal triklorometil peroksil (CCl3O2•). CCl3O2• dapat menyerang lipid membran retikulum endoplasmik dengan kecepatan yang melebihi CCl3• (Jeon et al., 2003; Weber et al., 2003). Klaassen (2008) menyatakan CCl4 merupakan presentative zat racun yang dapat menyebabkan terjadinya perlemakan hati (steatosis), fibrosis hati hingga sirosis hati.
Kerangka penelitian hewan model fibrosis hati dapat dilihat pada bagan berikut ini:
Gambar 1. Kerangka penelitian
5
E. Hipotesis Hipotesis yang diajukan pada penelitian ini adalah (1) pemberian karbon tetraklorida (CCl4) dengan dosis yang tepat dapat membentuk hewan model fibrosis hati yang optimal.
F.
Metodologi Penelitian Pengelompokkan Hewan Model Hewan model yang digunakan adalah tikus jantan strain Sprague Dawley (SD) usia 6-8
minggu dengan bobot badan (bb) ±180-200 gram berjumlah 25 ekor yang diperoleh dari BP POM Jakarta. Tikus diaklimatisasi selama ± 7 hari di dalam ruangan dengan siklus 12 jam (terang/gelap), kelembaban 60% ± 2%, suhu 22 0C ± 2 0C, serta mendapatkan pakan/minum secara ad libitum. Tikus dibagi ke dalam lima kelompok perlakuan, tiap kelompok terdiri atas lima ekor. Pemberian CCl4 (Sigma) dan pembawa (minyak kelapa) dilakukan secara per oral (p.o). Metode modifikasi dari Ko et al. (2010) dan Edward (2012). 1.
Kelompok perlakuan 1 (P1) merupakan kelompok kontrol (mendapatkan minyak kelapa tanpa CCl4).
2.
Kelompok P2, mendapatkan CCl4 1 ml/kg BB (40% dalam minyak kelapa) tiga kali seminggu selama enam minggu.
3.
Kelompok P3, mendapat CCl4 0.5 ml/kg BB (40% dalam minyak kelapa) tiga kali seminggu selama enam minggu.
4.
Kelompok P4, mendapat CCl4 1 ml/kg BB (10% dalam minyak kelapa) diberikan tiga kali seminggu selama enam minggu.
5.
Kelompok P5, mendapat CCl4 1 ml/kg BB (10% dalam minyak kelapa) diberikan dua kali seminggu selama enam minggu. Analisis Biokimia Darah (Enzim Hati) Darah tikus diambil melalui vena orbitalis menggunakan pipa kapiler (Marienfeld) untuk
analisis enzim hati. Darah ditampung pada taunt eppendorf, kemudian disentrifugasi (Hettich zentrifugen mikro 22R) pada kecepatan 1000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 0C untuk mendapatkan serum darah. Analisis enzim hati dilakukan pada minggu ke-0 (sebelum pemberian CCl4), minggu ke-2, minggu ke-4 dan minggu ke-6 (setelah pemberian CCl4). Aktivitas enzim hati yang diamati adalah alanine aminotransferase (ALT/ALAT), aspartate aminotransferase (AST/ASAT) dan alkaline phosphatase (ALP) yang direaksikan dengn reagen-kit (DiaSys®) dan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis (Genesis 10uv). Prosedur pengukuran enzim hati mengacu pada petunjuk dari DiaSys®.
6
Persentase Kematian Hewan Model Tikus dikontrol selama penelitian dan dilakukan pencatatan kondisinya. Ditentukan persentase kematian dari masing-masing kelompok perlakuan dengan menggunakan rumus (nt0/nt1) x 100%. nt0 merupakan jumlah hewan yang mati dan nt1 adalah jumlah hewan pada awal penelitian. Analisis Makro Anatomi Hati Pada akhir penelitian tikus dikorbankan dengan cara dislokasi cervical. Tikus yang mati (dalam keadaan masih utuh) saat penelitian masih berlangsung dilakukan pembedahan untuk dilihat organ hatinya. Pengambilan gambar organ hati dilakukan ketika masih menempel pada tubuh tikus (setelah pembedahan). Analisis Histopatologi Hati Organ hati difikasasi dengan larutan buffer neutral formalin (BNF) sebelum pewarnaan didahului dengan proses deparafinisasi. Pewarnaan histopatologi hati dilakukan dengan metode pewarnaan hematoksilin-eosin (HE) (Kiernan, 2008) untuk melihat kerusakan sel hati, kemudian dilakukan juga pewarnaan mallory-heidenhain (Presnell dan Schreibman, 1997) untuk melihat pembentukkan kolagen pada sel hati. Gambar histopatologi diamati dengan mikroskop dan dilakukan skoring mengikuti kriteria publikasi Gerling et al., (1996) dan Merat et al. (2010). Analisis Data Penelitian ini menggunkaan Rancang Acak Lengkap (RAL) dimana tikus dibagi menjadi lima perlakuan dengan lima kali ulangan. Analisis enzim hati menggunakan uji ANOVA dan dilanjutkan dengan uji DUNCAN (p<0.05) menggunakan statistical software minitab 16.
G. Hasil yang Diharapkan Hasil yang diharapkan dari penelitian ini adalah mendapatkan dosis yang optimal dalam pembentukan hewan model fibrosis hati, sehingga dapat menjadi acuan para peneliti yang akan mengkaji berbagai kandidat obat fibrosis hati.
H. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian akan dilaksanakan pada bulan April – Juni 2016 di laboratorium hewan dan laboratorium farmakologi Pusat Teknologi Farmasi dan Medika (PTFM) – Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT), Serpong – Tangerang Selatan. 7
DAFTAR PUSTAKA
Appleby MC, Meneh JA, Olsson IAS, Hughes BO. 2011. Animal Welfare. 2nd Edition. Wallingford: CAB International. Boll M, Weber LWD, Becker E, Stampfl A. 2001. Mechanism of Carbon TetrachlorideInduced Hepatotoxicity: Hepatocellular Damage by Reactive Carbon Tetrachloride Metabolites. Naturforsch. 56:649-659. Dallas SE. 2006. Animal Biology and Care. 2nd Edition. Oxford: Blackwell Publishing. Di Sario A, Bendia E, Macarri G, Candelaresi C, Taffetani S, Marzioni M, Omenetti A, De Minicis S, Trozzi L, Benedetti A. 2004. The anti-fibrotic effect of pirfenidone in rat liver fibrosis is mediated by downregulation of procollagen α1(I), TIMP-1 and MMP-2. Digestive and liver Disease. 36: 744-751.doi:10.1016/j.dld.2004.05.012. Edward Z. 2009. The function utilization of gambier (Uncaria gambir) as the hepatoprotector. J. Ris.Kim. 2 (2): 1-7. Foo NP, Lin SH, Lee YH, Wu MJ, Wang YJ. 2011. Α-Lipoic acid inhibits liver fibrosis through the attenuation of ROS-triggered signaling in hepatic stellate cells activated by PDGF and TGF-β. Toxicology. 282: 39-46.doi:10.1016/j.tox.2011.01.009. Gerling B, Becker M, Waldschmidt J, Rehmann M, Schuppan D. 1996. Elevated serum aminoterminal procollagen type-III-peptide parallels collagen accumulation in rats with secondary biliary fibrosis. Journal of Hepatology. 25:79-84. Ghatak S, Biswas A, Dhali GK, Chowdhury A, Boyer JL, Santra A. 2011. Oxidative stress and hepatic stellate cell activation are key events in arsenic induced liver fibrosis in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 251: 59-69. Jeon TI, Hwang SG, Park NG, Jung YR, Shin SI, Choi SD, Park DK. 2003. Antioxidative effect of chitosan on chronic carbon tetrachloride induced hepatic injury in rats. Toxicology. 187: 67-73.doi:10.1016/S0300-483X(03)00003-9. Khan RA, Khan MR, Ahmed M, Sahreen S, Shah NA, Shah MS, Bokhari J, Rashid U, Ahmad B, Jan S. 2012. Hepatoprotection with a chloroform extract of Launaea
8
procumbens against CCl4-induced injuries in rats. BMC Complementary and Alternative Medicine. 12:114. Kiernan, JA. 2008. Histological and Histochemical Methods. Theory and Practice. 4th Edition. Canada: Pergamon Press. Hlm. 90-97. Klaassen CD. 2008. Casarett & Doull’s Toxicology: The Basic Science of Poisons. New York: McGrow-Hill. Hlm. 557-562. Ko WS, Hsu SL, Chyau CC, Chen KC, Peng RY. 2010. Compound cordyceps TCM-700C exhibits potent hepatoprotective capability in animal model. Fitoterapia. 81: 1–7. doi:10.1016/j.fitote.2009.06.018. Maiti K, Mukherjee K, Gantait A, Saha BP, Mukhrejee PK. 2006. Curcumin-phospolipid complex: preparation, therapeutic ecaluation and pharmacokinetic study in rats. Int. J. Pharmaceutic. 330: 155 163.doi:10.1016/j.ijpharm.2006.09.025. Mangkoewidjojo S. 2006. Hewan Laboratorium Dalam Penelitian Biomedik. Yogyakarta: FKH UGM. Merat S, Sameni FK, Nouraie M, Derakhsan MH, Tavangar SM, Mossaffa S. et al. 2010. A modification of the brunt system for scoring liver histology of patients with nonalcoholic fatty liver disease. Arch Iran Med. 13(1):38-44. Palacios RS, Roderfeld M, Hemmann S, Rath T, Atanasova S, Tschushner A, Gressner OA, Weiskirchen R, Graf J, Roeb E. 2008. Activation of hepatic stellate cell is associated with cytokine expression in thioacetamide-induced hepatic fibrosis in mice. Laboratory Investigation. 88: 1192-1203. Panjaitan RGP. 2008. Pengujian aktivitas hepatoprotektor akar pasak bumi (Eurycoma longifolia Jack.) [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Sherwood L. 2009. Fisiologi Manusia: Dari Sel Ke Sistem. Pendit BU, penerjemah; Surya M, Santoso N, editor. Jakarta (ID): EGC. Terjemah dari: Human Physiology: From Cells To System. Presnell MJ and Schreibman MP. 1997. Humason’s Animal Tissue Techniques.5th Edition. Canada: Johns Hopkins University Press. Hlm. 173-177.
9
Tang LX, He RH, Yang G, Tan JJ, Zhou L, Meng XM, Huang XR, Lan HY. 2012. Asiatic acid inhibits liver fibrosis by blocking TGF-β/smad signaling in vivo and in vitro. PlosONE. 7(2):e31350.doi:10.1371/journal.pone.0031350. TIM Kelayakan Etik Hewan (KEH) IPB. 2011. Pedoman Kelayakan Etik Menggunakan Hewan. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Venukumar MR, Latha MS. 2002. Hepatoprotective effect of the methanolic of Curculigo orchioides in CCl4-treated male rats. Indian Journal of Pharmacology. 34: 269-275. Weber LWD, Boll M, Stampfl A. 2003. Hepatotoxicity and Mechanism of Action of Haloalkanes: Carbon Tetrachloride as A Toxicological model. Toxicology. 33(2): 1051036. Zainuri M, Wanandi SI. 2012. Aktivitas spesifik manganese superoxide dismutase (MnSOD) dan katalase pada hati tikus yang diinduksi hipoksia sistemik: hubungannya dengan kerusakan oksidatif. Media Litbang Kesehatan. 22(2):87-92.
10
Lampiran 1. Rancangan Belanja Anggaran (RBA) Penelitian
RENCANA BELANJA ANGGARAN (RBA) PENELITIAN “Pembentukan Hewan Model Fibrosis Hati Menggunakan Berbagai Tingkatan Dosis Karbon Tetraklorida (CCl4)”
No. Alat dan Bahan A. Alat dan Bahan Habis Pakai 1 Gloves 2 Mikro Tube 3 Kuvet 4 Masker 5 Minyak Kelapa 6 Yellow Tips 7 Pipa Kapiler 8 Tikus 9 Beding Tikus 10 Pakan Tikus
B. 1 2 3 4
Bahan Kimia dan Reagent Aspartate transaminase Alanine transaminase Alkaline phosphatase Larutan BNF
C. Belanja Jasa 1 Sewa Laboratorium dan alat 2 Preparat Histopatologi Pewarnaan HE Pewarnaan Mallory
D. Biaya Tidak Terduga
Satuan
Jumlah
Harga
Total
Box Box Box Box Liter Box Box ekor Bungkus Kg Jumlah
3 1 3 3 1 1 1 30 30 50
Rp. Rp. Rp. Rp. Rp. Rp. Rp. Rp. Rp. Rp.
55.000,- Rp. 200.000,- Rp. 200.000,- Rp. 55.000,- Rp. 20.000,- Rp. 200.000,- Rp. 100.000,- Rp. 30.000,- Rp. 5.000,- Rp. 6.000,- Rp. Rp.
165.000,200.000,300.000,165.000,20.000,200.000,100.000,900.000,150.000,300.000,2.500.000,-
Box Box Box Liter Jumlah
1 1 1 2
Rp. 1.300.000,- Rp. Rp. 1.300.000,- Rp. Rp. 1.300.000,- Rp. Rp. 50.000,- Rp. Rp.
1.300.000,1.300.000,1.300.000,100.000,4.000.000,-
Unit
1
Rp. 1.500.000,- Rp.
1.500.000,-
Slide Slide Jumlah
25 25
Rp. Rp.
50.000,- Rp. 75.000,- Rp. Rp.
1.250.000,1.875.000,4.625.000,-
-
Rp.
1.000.000,-
Rp.
12.125.000,-
-
-
Total Anggaran
Terbilang: Dua Belas Juta Seratus Dua Puluh Lima Ribu Rupiah
11
Lampiran 2. Road Map Penelitian Hewan Model Fibrosis Hati
12
