Praktické využití serologických metod Daniel Sperling 21.3. 2014 Hotel Myslivna, Brno
Využití sérologie v diagnostice infekčních onemocnění prasat • „sérologie je vědecká disciplína zaměřená na detekci protilátek v tělních tekutinách- nikde v této definici nenajdete spojení „protektivní imunita“ Dr. Ian Tizzard
Využití: •
Detekce protilátek (IgG, IgM), dynamika humorální odpovědi s cílem demonstrovat infekci (expozici) specifickým antigenem
•
Serologické testy detekují protilátky, není možno stanovit buňkami zprostředkovanou imunitu
•
Levné, standardizované postupy s rychlým výsledkem
•
Problematické využití jako metody definitivní diagnostiky (veterinární využití ASF, humánní medicína HIV)
Praktické využití sérologie •
Serologický monitoring chovného stáda, nákup chovných zvířat, zařazení do chovu
•
Ověření infekčního statusu v rámci farmy (incidence patogenů na úrovni jednotlivých kategorií zvířat)
•
Monitoring úrovně hladiny protilátekpasivní imunita, načasování vakcinace, imunitní okno
•
Zdravotní programy, monitoring úspěšnosti eradikačních programů, systém „test and removal“
•
Ověření vakcinace
Odběr vzorků • Kvalita a uchování vzorků – Sterilní odběr, bakteriální kontaminace, uchování při 4°C (max. 7 dnů) – Delší uchování- využití vysráženého sera a následné zamražení
• Optimální počet vzorků – Odběr reprezentativního množství vzorků, při vysoké míře spolehlivosti výsledku: confidence value (95%) - hodnota konfidenčního intervalu spolehlivosti daného testu
• Obecné pravidlo – Počet testovaných vzorků by měl se spolehlivostí minimálně 95% detekovat časnou infekci s nízkou prevalencí (ø 10% prevalence) – Obecně zhruba 30 odebraných vzorků zajištuje detekci při 10% prevalenci při 95% jistotě
Výpočet dle aktuálních parametrů • n= [1- (1-a)1/D] x [N- (D-1)1/2] • • • •
n – nutný počet vzorků a - confidence value- hodnota spolehlivosti daného testu N – množství všech zvířat v dané skupině (věk, sekce...) D – množství pravděpodobně pozitivních zvířat – prevalence
• Praktický příklad aplikace výpočtu • Stádo 5000 prasnic, nízká serologická prevalence – endemická infekce App zhruba 10%, předpoklad 500 pozitivních prasnic ve stádě • Po dosazení a kalkulaci – 47 náhodně vybraných prasnic je třeba odebrat a vyšetřit • Při pozitivním záchytu je farma považována za infikovanou, v případě negativního výsledku je z 95% jistotou negativní
Počet vzorků ve vztahu k prevalenci a confidencí 95% (Segales et al., 2013)
Vývoj humorální imunitní odpovědi
Fáze virémie bakteriémie
•
Vývoj IgG doprovázený odstraněním patogenu z cirkulace
Charakter vývoje jednotlivých typů Ig (stimulace antigenem- vakcinace, nebo infekce)
Zdroj:UTEXAS Edu
Dynamika onemocnění
Prof. José M. SánchezVizcaíno OIE
Aplikace vývoje onemocnění (fází infekčního procesu) na diagnostiku- kombinace serologických metod s přímým průkazem patogenu
Charakteristika testu (ELIZA)- důležité parametry testu •
•
•
•
Diagnostická citlivost (sensitivita) schopnost testu korektně určit infikované zvířata jako pozitivní s minimem falešně negativních Analytická citlivost- minimální množství Ig detekovatelné danou metodou
Diagnostická specifita- schopnost (pravděpodobnost) daného testu korektně určit negativní zvířata s minimem falešně pozitivních Analytická specifita- schopnost minimalizovat zkříženou reaktivitu daného testu
Charakteristika testu (ELIZA)- důležité parametry testu •
Stanovení citlivosti/specifity testu na základě referenčního testu- „zlatého standartu“ např. Mycoplasma hyopneumoniae – kultivace, virové infekce SNT
•
Praktické hledisko–
nižší hodnoty výsledku = vyšší pozitivita např. u metody blocking ELISA (testy používané na PRRS)
•
Perfektně citlivé a specifické testy neexistují v praxi! Na individuální bázi sérologie na virové patogeny
•
Požadavky na obě vlastnosti se liší v praxi – Vysoká sensitivita – dovoz do chovů SPF, import na úrovni státu- minimalizace rizika zavlečení infekce Ochrana zdraví a patogeny- Salmonella, Trichinella – Vysoce specifické testy (minimalizace falešně pozitivních)- eradikace (test and removal)
M. hyopneumoniae - příklad volby serologického testu • Volba vhodného testu- praktické limitace a senzitivita daného testu • DAKO ELISA- proteinový epitop terénních kmenů + monoklonální Ig G • Vakcíny proti M. hyo indukují pouze velmi slabou imunologickou odpověď nevhodnost pro post-vakcinační monitoring
• DAKO Elisa- monitoring infekčního statusu, Tween 20 Elisa monitoring/kontrola vakcinace • Delší doba pro indukci specifických IgG, IgM v porovnání s dalšími respiračními infekcemi
Detekce specifických IgG
Pieters M.
Praktické využití sérologie M. hyopneumoniae Využití predikce klinického onemocnění a jeho závažnosti na základě prevalence v době odstavu (Pijoan, 2006)
Pieters M.
Serologie Actinobacilus pleuropneumoniae
Sérologie App •
Detekce Apx 4 toxinu- princip DIVA, 99.8% specificita, 80.8% sensitivita ELISA
•
Problematika sérologie App obecně- častý status nosičství, kolonizace epitelu (lymfatická tkáň tonzil)- špatná humorální odpověď bez možnosti detekce u některých zvířat
•
U některých infikovaných zvířat nedochází k vývoji protilátek vůbec
•
ELISA testy jsou založené: 1. na specifickém LPS (serotypovém určení) 2. detekce společného antigenu (sérotypově nespecifická)- dobrá korelace 3. detekce toxinů (APX1 a APX2)- zde pozor na nespecifické reakce (A. suis)
•
Konfirmace vakcinačních protilátek- problematická pokud komerční kyty nebyly již dříve validovány ne detekci post-vakcinačních protilátek!
App sérologie • Počet infikovaných/sérologicky pozitivních zvířat je velmi závislý na sérotypu – subklinické infekce a infekce některými vysoce virulentními sérotypy (1,5) nízká nebo žádná séro-konverze
• Důležitá vlastnost- korelace kontagiosita (infektivity) se schopností produkovat optimální množství Ig • Sérotypy vysoce virulentní s nízkou kontagiositou (1,5) x vysoce kontagiózní (3,6,8,12)
Sérokonverze a výběr vhodných zvířat Serologický status chovu • Multi-site production- pro monitoring nejlépe zvířata z finální fáze výkrmu • Obdobně možno postupovat i u farow to finish uspořádání- serokonverze ovšem nastává dříve • Sérokonverze po ústupu mateřských protilátek (4-8 týden) zhruba 4 týdny až 10-12 týdnů- počet infikovaných v době odstavu, typ chovu Typická sérokonverze dle uspořádání chovu Farow to finish
Multi site
Postup v případě pozitivity bez klinické manifestace onemocnění •
Vhodná kombinace s další diagnostickou metodou- PCR, kultivace hlubokých stěrů tonzil
•
Přednostně zvířata označena sérologicky jako pozitivní
•
Vyšetření tonzil x plíce bez patologického nálezu nevhodné i přes séropozitivitu daného jedince
•
Seškrab x vyšetření celé mandle (ekonomická hodnota daného zvířete)
•
Zejména důležité- nákup chovných zvířat v mladém věku z nedávno ozdravených chovů SPF Odběr tonzil (AASV)
Využití sérologie v diagnostice Ileitis prasat • Metoda nepřímé imunofluorescence (IFAT), ELIZA • Vysoká senzitivita (přibližně 90 %) a specifita (téměř 100 %) • Sérokonverze – 2 týdny po infekci , IgG přetrvávají od 3- 13, typ infekce (PHE nebo PIA) • Vyšší a déle přetrvávající titry protilátek jsou zjišťovány především u PHE formy infekce
• U prasat s chronickou formou infekce L. intracellularis jsou titry většinou nízké (1: 30) a jsou zjistitelné pouze několik týdnů • Seroprofil- inherentní variabilita, všechny vzorky nutno vyšetřit najednou
% sero-positive
100 80
60 40 20 0
Typ farmy- farow to finish (přítomnost reprodukce a výkrmu, kontinuální systém chovu, příklad využití stanovení serologického profilu, semikvantitativní stanovení Imunofluorescencí
Séro-profil- Lawsonia
Multi-site produkce, oddělená reprodukce od produkčních jednotek, pozdní typ nástupu infekce po naskladnění do výkrmu
• Děkuji za pozornost!
