,.DE tudományos képzési mühelyeinek támogatása"
TÁMOP-4.2.2/B-10/ 1-2010-0024
POTENCIÁLIS MIKOTOXIN TERMELŐ ASPERGILLUS IZOLÁTUMOK AZONOSÍT ÁSA HAZAI MEZÖGAZDASÁGI TERMÉKEKEN BARANYI Nikolett' - KOCSUBÉ Sándor' - TÓTHBeáta 2 -PALÁGYI Andrea'SZEKERES András1 - PÁL Rita' -SZARVAS Csilla' - GYÖRI Tamás 1 - VARGA János' 1
Stegedi Tudományegyetem, Természcnudományi és Informatikai Kar, Mikrobiológiai Tanszék, 6726 Szeged, Kötép fasor 52.; nikolett
[email protected] 2 Gabonakutaló Nonprofit Közhaszntí Kft., 6726 S7.eged. Alsó kikötö sor 9.
Bevezetés A globális klímaváltozás egyik legfontosabb hatása a mik:otoxinok szempontjából a melegkedvelő toxinterme l ő fajok megjelenése lehet a mérsékelt égövi o rszágokban , ami az itt termesztett mezőgazdasági termékek a flatoxin-szennyeződését vonhatja maga után . A jelenséggel az utóbbi években Európa számos országában. így a hazánkkal határos Szerbiában, Szlovéniában, Horvátországban, Romániában és Ukrajnában is szembesülnünk kellett (Dobolyi és mtsi 2011). Számos mezőgazdasági termék (gabonafélék, chi li, szölő. stb.) ochratoxin szennyezettségét is észlelték a közelmultban a közép-európai régióban. Ochratoxin termelő Aspergilius fajokat gyakran izolálnak importált termékekről is, mint kávébab, kakaóbab, szárított gyümölcsök és fűszerek. Ezek a megfigyelések vezettek bennünket arra, hogy vizsgáljuk a potenciális mikotoxin termelő fajok előfordulását hazai mezögazdasági termékeken. Irodalmi áttekintés
A mikotoxinok a fonalas gombák másodiagos anyagcseretermékei, amelyek egyaránt ártalmasak az emberekre és az állatokra nézve is (Varga és mts i 2009). Az aflatoxinok a legjelentősebb mik:otoxinok, melyeket az Aspergilius nemzetség fajai állítanak elö. A számos ismert aflatoxin közül az aflatoxin B l a leginkább mérgező. Erős mutagén rákke l tő hatást mutattak ki laboratóriumi állatoknál, és sok bizonyíték utal arra, hogy emberek esetén a máj rákos elváltozását okozhatja (Varga és mtsi 2009). Az aflatoxin B l a természetben előforduló legerősebb rákkeltő anyag, melynek hatására májkárosodás és májrák alakulhat ki. Az Aspergilius jlavus a legjelentösebb aflatoxin termelő faj, emelJett fontos mezőgazdasági kártevő. Különböző mezőgazdasági termények esetében (kukorica, gyapot és földimogyoró) súlyos hozamveszteséget okoz világszerte. Az atlatoxinok a legalaposabban tanulmányozott mikotoxinok. A legtöbb szubsztrát támogatja a növekedést és az atlatoxigenikus formák aflatoxin termelését. Természetes szennyeződés a gabonafélékkel, a dióval, olajos magvakkal, fügével, dohánnyal, stb. fordul elő a leggyakrabban (Bennett és Klich 2003). Hazánkban az aflatoxin termelő fajok közül az A.jlavus-t gyakran izolálják különböző mennyiségben mezögazdasági terményekből (kukorica. búza, szőlő). Az aflatoxinok a hazai éghajlati viszonyok között általában nem okoznak határérték feletti szennyezést a magyar élelmiszerekben , inkább importált mezögazdasági termékekben mutathatók ki . t
104
.,Fiatal kutatók :v egészséges élelmiszerért''
Debrecen. 20 13
Az aHatoxin tennelés kedvező környezeti fe ltételei a magas nedvességtartalom és hőmérsé klet , ezért az A. jlavus melegebb, trópusi és szubtrópusi tcrületeken képes aflatoxinokat előállítani (Varga és mtsi 2009). Következtetésképpen, a közép-
Anyag és módszer Mintavétel: A kukorica- és búzamintákat 20 10 óta gyüjtjük. különböző hazai és vajdasági gabonatermő területekről aratás után. A vizsgált gabonatclék közé tartozott a kukorica, a búza és az árpa. Emellett különböző helyről származó chilipaprikát és diót is vizsgáltunk. A mintákat felszínsterilezést követően diklorán tartalmú bengálvörös (DRBC) táptalajra helyeztük (King és mtsi !979). A lemezeket 25°C-on sötétben inkubáltuk és időszakosan ellenőriztük növekvő micéliumokat. A kinőtt micéliumot tisztítás után malátás (MEA) táptalajra oltottuk Fajazonosítás: A DNS kivonáshoz YPD (é lesztő , pcpton, D-glükóz) tápoldatban tenyésztett kultúrát használtunk, melyet 4 napig 25°C-on rázattuk 120-1 50 rpm-en. A DNS kivonáshoz az Epicentre Biotechnologies MasterPurct~• Yeast DNA Purification készletei használtuk a gyártó utasítása szerint. A fajazonosítást a kalmodulin gén egy
105
,.DE tudományos képzési
műhelyeinek
támogatása''
TÁMOP-4.2.2/B-10/1-2010-0024
szakaszának amplifikálása és szekvencia analizise révén végeztük cl (Pildain és mtsi 2008). A kapon kalmodulin szckvcnciákat nukleotid-nukleotid BLAST (blastn) (hnp:/lblast.ncbi.nlm.nih.gov: Altschul és mtsi 1990) segítségével hasonlítottuk össze a Genbank-ban található szekvenciákkal és a saját adatbázisunkkal is. Atlatoxin terme l ő képesség vizsgálata: Az Aspergilius jlavus izaiátumokat 2 ml YES (2% él esztő, 20% szacharóz) tápoklatba oltottuk és 25°C-on sötétben inkubáltuk 7 napig. Az aflatoxin extrakciót 2 ml diklór-metánnal végezti.ik cl. Az izoláturnak aflatoxin terme l ő képességét vékonyréteg kromatográfiával (TLC) és HPLC-vel is elvégeztí.ik. Ochratoxin termelő képesség vizsgálata: Az Aspergilius ochraceus és Alpergillus westerdijkiae törzseket 25 ml malátakivonatot tartalmazó tápoldatha oltotluk ki. majd 25°C-on, sötétben, 7 napig inkubáltuk. Az. inkubációs idő letelte után a" extrakciót 2x5 mJ kloroformmal végeztük el. Az izolátumok allatoxin termelő képességél vékonyréteg kromatográfiával (TLC) és HPLC-vel is elvégeztük. Eredmények és értékelésük időben számos Aspergilius fajt azonosítottak, melyek képesek aflatoxinokat (Varga és mtsi 2009). Ezek a fajok könnyen elkülöníthetőek a P-tubulin vagy kalmodulin gén szekvencia analízisc révén (Varga és mtsi 20 ll ). Munkánk során vizsgáltuk a potenciális aflatoxin termelő gombák előfordulását hazai gabonaféléken. A legtöbb izo látum telcpmorfológia és mikroszkopikus jellemzőik alapján az Aspergilius nemzetség Flavi szekciójába volt sorolható. A fajazonosítás a kalmodulin gén egy szakaszának szekvencia analízise alapján történt, melynek eredményeként megállapítottuk, hogy a legtöbb izolátum az A~pergillus flavus faj ba tartozott (Tóth és mtsi 20 12). Nagyszámú (2 1) Aspergilius jlavus izolátumot azonosítottunk az ország különböző régióiból származó búzaszcmeken, melyek közi.il a legfert őzöttebbnek az Alakor (egyszcmű búza , Triticum mrmococcum) bizonyult. Az Alakor ősi diploid búzafajta, mely igen ellenálló gombabetegségekkel szemben. A vizsgált búzamintákban nem tudtunk anatoxinokat kimutatni . Az izolátumok atlatoxin terme l ő képességének vizsgálatát vékonyréteg kromatográfiával és HPLC-vel is e lvégeztük. Ennek eredményeként megállapítottuk, hogy az izolátumok nem voltak képesek atlatoxinokat
Az utóbbi
előállítani
előállítani .
A hazai és vajdasági területekről származó kukoricaminták.ról azonosított izolátumok fajazonosítása folyamatban van. Előzetes morfológiai vizsgálatok és lTS alapú szekvencia adatok alapján a lc&>több izolátum az Aspergilius nemzetség Flavi szekciójába sorolható. Vizsgáltuk továbbá chilipaprika és dióminták mikóbiótáját is, melynck során számos potenciális mikotoxin termelő Aspergilius törzset izoláltunk . Az izolátumokat 6 dió és ll paprika mintáról gyűjtötti.ik. Munkánk során 18 potenciális anatoxin termelő A. jlavus, valamint 7-7 potenciális ochratoxin termelő A. ochraceus és A. westerdijkiae izolátumot azonosítottunk. A chilipaprikáról és dióról származó A. flavu s izolátumok esetében is vizsgáltuk az atlatoxin termelő képességet. Ebben az esetben is az el őzetes vékonyréteg kromatográfiás (TLC) módszert követően HPLC-vel is elvégeztük. Vizsgálataink alapján néhány izolánun nagy mennyiségbcn termelt aflatoxinokat (l. táblázat).
106
.,Fiatal kutatók az. eg6sz.séges élelmiszerért"
Debrecen. 20 l 3
A'L. A. ochraceus és A. wesrerd~jkiae izolátumok ochratoxin termelő képességének vizsgálata során az e l őzetes vékonyréteg kromatográfiás (TLC) módszett követően az izolárumok - 50%-a esetében ochratoxin termelést tapasztaltunk, a pontosabb eredmények érdekében a HPLC vizsgálatok folyamatbart vannak. l . ráhlázat. Chilipaprikáról s:~;ármazó A.flavus izolátumok által termelt atlatoxinok HPLC-velmeghatározott mennyisége (J ) Izoláturu
(2) Allatoxin 8 , (ngimi)
(3) Afla toxin 81 (n elm!)
90.8
39.4
Chili4b
174,4
40.0
Chili 8a
474.4
48.0
Chili 8c
11493,6
466,2
Chili 5a
TableJ. Detection of produced aflatoxins by A.jlavus isolates by HPLC (l l Isolat: s. (2) Aflatoxin B.' ' (3) Aflawxin B1
Következtetések Vizsgálataink alapján az éghajlatváltozás következtében a mcleg-kedve lő mikotoxinogén Aspergilius fajok a mérsékelt égövi országokban, így hazánkban is egyre gyakrabban fordulnak elő különbözö mezőgazdasági termékeken (gabonafélék, paprika, dió, hagyma, stb). Egyéb mezögazdasági termékek mikobiótájának alaposabb vizsgálata is szi.ikségesnck tűnik a potenciális mikotoxin termelő AspergiLius fajok megjelenésének becslésérc, emellett nagyobb figyelmet kell fordítanunk a termő földeken a mi kotoxin-termelő penészgomba fajok elleni védekezésre. Az erre irányuló törekvések egyike lehet rezisztens gabonafajták illetve egyéb termesztett növények kifej lesztése, valamint a biológiai védekezés (pl. antagonisták alkalmazása).
Összefoglalás A globális k:límaváltozás egyik legfontosabb hatása a rnikotoxinok szempontjából a meJegkedvelö toxintermelő fajok megjelenése le het a mérsékelt égövi országokban, ami az itt termesztett mezőgazdasági termékek toxin-szennyeződését vonhatja maga után. A jelenséggel az utóbbi években Európa számos országában, így a hazánkkal határos Szerbiában, Szlovéniában, Horvátországban, Romániában és Ukrajnában is szembesülnünk kellett. Fenti észlelések hatására vizsgáltuk hazai és vajdasági gabonaszemek és termesztett növények mikobiótáját. A mintákat különbözö gabona te nnő területeken gyűjtöttü k aratás után , majd felülctsterilizálást követően szelektiv táptalajra helyeztük A'L. izolált gombatörzseket morfológiailag és szekvenciaalapú módszcrekkel azonosítottuk. Munkánk során nagyszámú Aspergilius jlavus izolátumot azonosítottunk az ország különböző régióiból származó búzas:t:emeken, valamint hazai és vajdasági kukoricaszemeken. A legfertőzöttebbnek az Alakor (egyszemíí búza, Trüicttm monococcum) bizonyult, azonban ezek az izolátumok nem termeltek aflatoxint a vizsgált körűlmények között. Munkánk során különböző helyről
107
u~»E
rudományos képzési
műhelyeinek
támogatása"
TÁMOP-4.2.2/B-1011-2010-0024
1111\rmazó füszerpaprikát, chilipaprikát és diót is vizsgáltunk. Ezen mintákról az A. /1•11'1/s mellett potenciálisan ochratoxin termel ő A. ochraceus és A. westerdijkiae lwlátumokat is sikerült azonosftanunk, melyek mikotoxin termelő képességének Vll~gálata folyamatban van.
Kulcsszavak: Aspergilius, a fiatoxin, ochratoxin, klímaváltozás Köszönetnyilvánítás Jelen kutatási eredmények megjelenését ,,Az SZTE Kutatócgyetemi Kiválósági Központ ludásbáLisának kiszélesítése és hosszú távú szakmai fenntarthatóságának megalapolása 11 kiváló tudományos utánpótlás biztosításával" cím ű, T Á1\10P-4.2.2/B-l0/l-20 l 0-0012 1110nosftószámú projekt támogatja. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósul meg. Továbbá a K84122 és K84077 számú OTKA pályázatok és a Bolyai János Kutatási Ösztöndíj (Tóth B.), és c~y regionális magyar-szerb EU pályázat (HUSRB/ 1002/122/062- ToxFreeFecd) tenék lehetövé a kutatási munkát
Irodalom
Altschul S.F.- Gbh W.- Miller W.- Mycrs E.W.- Lipman DJ.: 1990. Basic local aligament search tool. J ourn~J of Molccular Biology .. 215:403-410. Benneu J .W. - Klich M.A. 2003. Mycoltlxins. Clinical Micmbiology Reviews. 16:497-516. Borbély M. - Sipos P. - Pelles F. - Oy{\ri Z.: 2010. Mycotox in contaminution in cereals. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies. 16:96-98. l)obolyi Cs.- Scbök F.- Varga J. - Kocsubé S.- Szigcti Gy. - Baranyi N. Szécsi Á.- Lustyik Gy. Micsinai A.- Tóth B.- Varga M.- Kriszt B.- Kul.olya J .: 2011 Allato~in-termeló Aspergillu.\ jlavus törzsek el őfordulása hazai kukoríca szcmtermésben. Növ~nyvédelem. 47: 125-133 (4). King A.D.Jr.- Hocking A.D. - Pitt J.T.: 1979. Dichloran-rose bengal medium for en umeration and bulalion of molds from foods. Applied and Environmental Microbiology. 37: 959- 964. Paterson R.RM. - Lima N.: 2010. How will elimate change affect mycotoxins in food? Food Research lntemational.43: 1902-1914. Pildain M.B. - Frisvad J.C. - Vaamonde G. - Cabral D. Varga J. - Sarn~on R.A.: 2008. Two novel allatoxin-producing A~pt:rgillus species from Argentincan peanuLS. lmemntional Journal ol Systematic and Evolutionary Microbiology. 58: 725-735. Timdo M.C.- Clarke R.- Jaykus L.A.- McQuatters- Gollop A. Frank .I.M.: 20 10. Climalc::: chungc and food safety: A review. Food Research .International. 43: 1745-1765. Tóth B.- Török O.- Kótai É.- Varga M.- Toldiné Tóth É.- Pálfi X. - Háfra E. - Varga J.- Téren J. MMest.erhá/y Á .: 2012. Therole of Aspergilli and PenieJilia in mycotoxin contamination of Maize in Hungary. Acta Agmnomica Hungarica 60: 143-149. Varga J. - Frisvad J.C. - Pildain M.B. - Vaamonde G.- Cabral D.- Samson R.A.: 2011. Two new aflatoxin producing species. and an overview of Aspersillus scction Flavi. Studics in Mycolngy . 69: 57-80. Varga J.- Frisvad J .C. - Samson R.A.: 2009. A reappraisn l offungi produci ng nflatoxins. World Mycotoxin Journal. 2: 263-277 Varga J. - Houbrakcn J - Saroson R.A. - Frisvad J.C.: 2008. Molecular divcrsity of Aspergilius and Pemcil/ium ~-pecies on fruits and vegetablcs. Academic p Press. New York , pp 205-223. Varga J. - RigóK.- Téren J.- Meserhá7y Á.: 2001. Recent advances in ochratoxin research l. Production. detection and occurrance of ochrntoxin. Cereal Research Communications. 29: 85-92.
108
Debrecen, 2013
,.Fiatal kutatók az egészséges élelmjszerért"
Identification of potential mycotoxin producing Aspergilli on agricultural products in Hungary [n view of agriculture, one of the most important effects of elimate chru1ge is the occurrence of thermotolerant ruycotoxin producing fungi in countries with temperate climate, causing mycotoxin contamination of agricultural products.lndeed, a sh ift has recemly been observcd in the oocurrence of allatoxin producing fungi in Europe. with consequent atlatoxin coutami nation in agricultural commodities including maize in sever.1l European countties not facing with this problem before, including Serbia. Croatia, Slovenia, Romania and Ukraine. These observations led us to cxamin e the occurrence of mycotoxin producing Aspergilli in agricultu(al products in Hungary. The samples werc colleeted fmm cercal fields in Hungary and Vojvodina after harvest. Surface-sterilízed cercal seeds were p iaccd on selectíve media, and the isolated fungal st:rains were identified using morphological mcthods. The species identification of selceted isolates was carried out using sequence-based ruethods. Several poLentiaUy aflatoxigenic A.jlavus isolates were identified on ceceals including wheat and maize. The most severe!y contaminated wheat eu Itivar was Alakor, however, none of the A. jlavus isolates camc fTom this cultivar were able to produce allatoxins. During examination of the mycobiota of red pepper. chili and nut saruples. ochratoxigenic A. m;hraceus and A. westerdijkiae isolates have also becn identified besides A.jla.vus. Ex amination of mycotox in producing abilities of the isolates is in progress.
Keywor ds: elimate chru1ge, Aspergilfus, allatoxi n, ochratoxin
109
