Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi kar
Néhány mikotoxin hatásmechanizmusának vizsgálata BioAréna rendszerben Doktori értekezés
Móricz Ágnes
Kémiai Doktori Iskola Vezetı: Prof. Dr. Inzelt György egyetemi tanár
Analitikai, kolloid- és környezetkémiai, elektrokémiai doktori program Vezetı: Prof. Dr. Záray Gyula egyetemi tanár
Témavezetık: Horváthné Dr. Otta Klára egyetemi docens, Ph.D. doktor Prof. Dr. Tyihák Ernı tudományos tanácsadó, az MTA doktora
Eötvös Loránd Tudományegyetem, TTK MTA Növényvédelmi Kutatóintézete Budapest 2007
TARTALOMJEGYZÉK AZ ÉRTEKEZÉSBEN HASZNÁLT RÖVIDÍTÉSEK ......................................... 4 1. BEVEZETÉS ................................................................................................................... 6 2. IRODALMI ÖSSZEFOGLALÁS ............................................................................ 8 2.1. A mikotoxinok bemutatása, különös tekintettel toxicitásukra ................... 8 2.2. Az aflatoxinok ismert anyagcsere útjai ............................................................. 12 2.3. Az ochratoxin A ismert anyagcsere útjai ......................................................... 16 2.4. Az aflatoxinok és az ochratoxin A mikroorganizmusokkal szembeni hatásai........................................................................................................................ 18 2.5. A jelen dolgozat témáját közvetlenül érintı irodalom összefoglalása .... 19 2.5.1. A formaldehid elıfordulása és szerepe az élıvilágban ..................................... 19 2.5.2. A biológiailag aktív anyagok vizsgálata, a BioAréna rendszer alkalmazhatósága ..................................................................................................... 25 2.5.3. A BioArénában, a sejt szuszpenzióhoz adagolt endogén és exogén anyagok ...................................................................................................................................... 31 2.5.3.1. Formaldehidet különbözıképpen eltávolító anyagok ............................................ 31 2.5.3.1.1. L-arginin................................................................................................................... 31 2.5.3.1.2. Redukált glutation .................................................................................................... 32 2.5.3.1.3. L-aszkorbinsav ......................................................................................................... 34 2.5.3.1.4. Se(IV) ionok.............................................................................................................. 35 2.5.3.1.5. Dimedon ................................................................................................................... 36 2.5.3.2. Formaldehid prekurzorok........................................................................................ 37 2.5.3.2.1. NG-monometil-L-arginin .......................................................................................... 37 2.5.3.2.2. Nε-monometil-L-lizin ................................................................................................ 37 2.5.3.3. A Cu(II) ionok jellemzıi ........................................................................................... 39 2.5.3.4. Különbözı típusú ózon eltávolító anyagok ............................................................. 40 2.5.3.4.1. Indigókármin ............................................................................................................ 40 2.5.3.4.2. A d-limonén .............................................................................................................. 40
3. CÉLKITŐZÉSEK ........................................................................................................ 42 4. KÍSÉRLETI RÉSZ ...................................................................................................... 43 4.1. Anyagok ........................................................................................................................ 43 4.1.1. A mikotoxinok rétegkromatográfiájához alkalmazott állófázisok, oldószerek és vegyszerek ........................................................................................ 43
1
4.1.2. A biológiai értékelés során alkalmazott baktérium sejttenyészet és vegyszerek .................................................................................................................. 43 4.1.3. A HCHO mérésére alkalmazott állófázis és vegyszerek .................................. 44 4.1.4. A H2O2 mérésnél alkalmazott vegyszerek és oldószerek .................................. 44 4.1.5. Az Fourier-transzformációs Raman és felületerısített Fouriertranszformációs Raman spektroszkópiás elemzésekhez alkalmazott oldószerek és vegyszerek ........................................................................................ 45
4.2 Eszközök ........................................................................................................................ 45 4.2.1. TLC-, és OPLC-módszerekhez használt eszközök ............................................ 45 4.2.2. A H2O2 méréséhez alkalmazott eszközök ............................................................ 45 4.2.3. Az FT-Raman és felületerısített FT-Raman elemzésekhez használt eszköz46
4.3 Módszerek ..................................................................................................................... 46 4.3.1. A mikotoxinok rétegkromatográfiás kifejlesztése ............................................. 46 4.3.2. Baktérium sejt szuszpenzió elıállítása ................................................................. 47 4.3.3. A biológiai értékelés menete ................................................................................... 47 4.3.4. HCHO mérés .............................................................................................................. 49 4.3.5. H2O2 mérés ................................................................................................................. 49 4.3.6. FT-Raman és felületerısített FT-Raman elemzések ......................................... 50 4.3.7 Az aflatoxinok demetilezési reakciójának kvantumkémiai vizsgálata........... 51
5. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK ................................................................ 52 5.1. A vizsgálati rendszer kialakítása ......................................................................... 52 5.1.1. A kromatográfiás módszer kifejlesztése .............................................................. 52 5.1.2. A biológiai detektálás elıtti és utáni mennyiségi denzitometriás értékelés .57 5.1.3. A formaldehid mérése a fertızött adszorbens rétegen ..................................... 61 5.1.4. A hidrogén-peroxid mérése az intakt (vízbe merített) és fertızött adszorbens rétegen .................................................................................................. 64 5.1.5. Az aflatoxinok demetilezési reakciójának elméleti vizsgálata, egyensúlyi állandójának meghatározása................................................................................. 66 5.1.6. Az aflatoxin B1 kromatográfiás foltjának FT-Raman és felületerısített FTRaman spektroszkópiai értékelése ....................................................................... 69 5.1.7. Néhány faktor hatása a BioAréna rendszerben végzett biológiai értékelésre ...................................................................................................................................... 77 5.1.7.1. Az inkubációs idı hatása a gátló zónák intenzitására ........................................... 77 5.1.7.2. A baktérium életkorának hatása a biológiai értékelésre ....................................... 78 5.1.7.3. A kromatográfiás foltok színének és formájának idıbeli változása biológiai elıhívás után ............................................................................................................... 80 2
5.1.7.4. A háttérhez képest sötétebb foltok kialakulásának oka (és magyarázata) a rétegen ......................................................................................................................... 81
5.2. A BioArénában, a sejt szuszpenzióhoz adagolt endogén és exogén anyagok hatása a vizsgált mikotoxinok antibakteriális - toxikus aktivitására .............................................................................................................. 83 5.2.1. Formaldehid eltávolító anyagok ............................................................................ 84 5.2.1.1. L-arginin .................................................................................................................... 84 5.2.1.2. Redukált glutation..................................................................................................... 87 5.2.1.3. L-aszkorbinsav .......................................................................................................... 90 5.2.1.4. Se(IV) ionok ............................................................................................................... 94 5.2.1.5. Dimedon ..................................................................................................................... 98
5.2.2. Formaldehid prekurzorok .................................................................................... 100 5.2.2.1. NG-monometil-L-arginin......................................................................................... 101 5.2.2.2. Nε-monometil-L-lizin............................................................................................... 104
5.2.3. A Cu(II) ion, mint formaldehid mobilizáló és szállító anyag ........................ 107 5.2.4. Ózon eltávolító anyagok ........................................................................................ 109 5.2.4.1. Indigókármin ........................................................................................................... 109 5.2.4.2. A d-limonén.............................................................................................................. 112
6. AZ EREDMÉNYEK ÖSSZEGZÉSE, AZ ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK KIEMELÉSE ..................................................................... 115 ÖSSZEFOGLALÁS ....................................................................................................... 119 SUMMARY ....................................................................................................................... 120 IRODALOMJEGYZÉK ............................................................................................... 121 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ..................................................................................... 145
3
Az értekezésben használt rövidítések AA: L-aszkorbinsav; C vitamin AFB1: aflatoxin B1 AFB2: aflatoxin B2 AFG1: aflatoxin G1 AFG2: aflatoxin G2 AFP1: aflatoxin P1 a.r.: analitikai reagens Dim: dimedon FTIR: Fourier transformation infrared; Fourier-transzformációs infravörös (spektroszkópia) FT-Raman: Fourier transform Raman; Fourier-transzformációs Raman (spektroszkópia) GSH: redukált glutation H2O2: hidrogén-peroxid HCHO: formaldehid HPLC: high performance liquid chromatography; nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia HPTLC: high performance thin-layer chromatography; nagy hatékonyságú vékonyrétegkromatográfia IARC: International Agency for Research on Cancer; Nemzetközi Rákkutató Ügynökség LC: liquid chromatography; folyadékkromatográfia Lim: (R)-(+)-limonén MMA: NG-monometil-L-arginin MML: Nε-monometil-L-lizin MS: mass spectrometry; tömegspektrometria mtsai: munkatársai MTT: 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazólium bromid, vitális festék NO: nitrogén-monoxid 1
O2: szingulett oxigén
O3: ózon OA: ochratoxin A OAHQ: ochratoxin-hidrokinon OAQ: ochratoxin-kinon OPLC: overpressured layer chromatography; túlnyomásos rétegkromatográfia Psm: Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola bab kórokozó baktérium 4
Rf: retenciós faktor Rs: felbontás SAM: S-adenozil-L-metionin SSAO: semicarbazide-sensitive amine oxidase; szemikarbazid szenzitív amino-oxidáz TLC: thin-layer chromatography; vékonyréteg-kromatográfia UV: ultraviolet; ibolyántúli (ultraibolya)
5
1. Bevezetés A penészgombával fertızött növényeken keletkezett mikotoxinok globális elterjedésük és toxikus hatásuk miatt gazdaságilag és közegészségügyileg különösen káros vegyületek. Eddig több, mint 400 mikotoxin vált ismertté, s ebbıl kb. 20 sorolható az erısen toxikus vegyületek csoportjába. A szakma által is különös figyelmet élvezı mikotoxinok kiemelkedı káros biológiai hatással rendelkeznek: az aflatoxin B1, B2, G1 és G2 (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) karcinogén, mutagén és teratogén tulajdonságokat, az ochratoxin A (OA) vesekárosító, teratogén és immunoszupresszív hatásokat mutat különbözı fajokban. A leginkább reflektorfényben lévı mikotoxin az aflatoxin B1, mely a legveszélyesebb természetes humán karcinogén. A mikotoxinok élelmiszerekbıl való teljes eliminálása lényegében nem lehetséges, ezért fontos a növényi eredető élelmiszerekben való folyamatos ellenırzésük. Hatásuk mechanizmusának vizsgálata, tisztázása és fıleg magyarázata elısegítheti az ellenük való védekezést, mezıgazdasági károkozásuk jelentıs csökkentését, és ezáltal élelmiszerbiztonsági szempontból elfogadható termékek elıállítását. Különösen fontos tisztázni a dózisfüggı nemlineáris hatásukat és magyarázni az igen kis dózisok hatását. A mikotoxinok számos metabolitját mutatták már ki, azonban a mai napig csak találgatások vannak a hatásmechanizmusukat illetıen, melynek megértését molekuláris szinten kell keresni, kölcsönhatási reakciók figyelembe vételével (pl. nyomelemek, sejtazonos, sejtidegen anyagok és mikotoxinok között). A várhatóan alternatív állatkísérleti modellnek is használható BioAréna rendszer, melyet Dr. Tyihák Ernı és mtsai. fejlesztettek ki, új módon teszi lehetıvé a hatásmechanizmus vizsgálatokat. Költségtakarékos, nagyon hatékony, a legkülönbözıbb kölcsönhatási reakciók generálására alkalmas módszer, melynek nagy elınye, hogy a kölcsönhatási reakciók (pl. spektroszkópiai technikákkal) nyomon követhetık. Munkám során a mikotoxinok antibakteriális-toxikus (antibakteriális, azaz a toxicitás alapját képezı) mechanizmusát tanulmányoztam a BioAréna rendszerben, különös tekintettel a formaldehid (HCHO) és reakciótermékeinek [pl. szingulett oxigén (1O2) és ózon (O3)] szerepét vizsgálva, melyhez különbözı direkt és indirekt analitikai, korszerő biokémiai módszereket használtam fel. Ezen a területen az elválasztástechnikák közül a réteg rendszerőek alkalmazása került elıtérbe, [vékonyréteg-kromatográfia (TLC) és a túlnyomásos rétegkromatográfia (OPLC)], mivel biológiai értékelés, s így mikrobiológiai értékelés is oszlop elrendezéső rendszerben nem lehetséges (az élı sejtek szaporodása ott nem 6
biztosítható), így azt nem lehet a BioAréna rendszerbe integrálni. A BioArénában kapott eredmények értékeléséhez denzitometriát [ultraibolya (UV) és látható tartományban], Fouriertranszformációs
és
felületerısített
Fourier-transzformációs
Raman
spektroszkópiát
alkalmaztam. Az ELTE Kémiai Technológiai és Környezetkémiai Tanszékén 1997 óta foglalkoznak mikotoxinok folyadékkromatográfiás módszerekkel történı vizsgálatával. E munkához csatlakozva kezdtem el tanulmányozni elsısorban a mikotoxinok rétegkromatográfiás vizsgálatára alkalmas rendszereket, melyek alapul szolgáltak a mikotoxinok antimikrobiális hatásának bizonyításához. Biológiai detektálást a Magyar Tudományos Akadémia Növényvédelmi Kutatóintézet Kórélettani Osztályának Biokémiai csoportjában már évek óta alkalmaznak, különös tekintette a kölcsönhatási reakciókra és a hatásmechanizmus vizsgálatokra, amely elsısorban a HCHO és speciális reakciótermékeinek szisztematikus vizsgálatát jelenti. Ebbe a munkába 2001. ıszétıl kapcsolódhattam be. Azt a munkahipotézist szerettük volna igazolni, hogy a mikotoxinok hatásmechanizmusában – az antibiotikus hatású anyagokhoz hasonlóan – a HCHO-nek és reakciótermékeinek alapvetı szerepe lehet.
7
2. Irodalmi összefoglalás 2.1. A mikotoxinok bemutatása, különös tekintettel toxicitásukra Az antibiotikumok megfigyelése az 1800-as évek végén kezdıdött el [1], mikor Pasteur észrevette (1877), hogy egyes mikrobák hatással vannak a lépfene bacillusára, s ugyanezt tapasztalták más baktériumok és gombák esetében is. Erre azonban nem figyeltek fel az orvosok, s a mikrobiológusok is csak a primitív szervezetek létért való harcának tartották. Ezért az antibiotikumok felfedezése 1928-ig váratott magára, mikor Fleming Penicillium penészgomba fajok baktériumölı aktivitását figyelte meg. A késıbbiekben a tenyészetükbıl izolált anyagot penicillinnek nevezte el [2]. A penicillin felfedezésének nyilvánosságra hozása után számos antibiotikus hatású anyagot izoláltak különbözı penészgombák tenyészetébıl. Sokról kiderült, hogy mérgezıek lehetnek állatfajokra, így toxicitásuk miatt el sem jutottak a klinikumig. Ekkor jött egy új, általánosnak nevezhetı felismerés, nevezetesen az, hogy fıleg a mikroszkópikus gombák egyes másodlagos anyagcsere termékei felelısek lehetnek állati és emberi betegségek kialakulásáért. A mikotoxinok [3] („mycos” görög gomba és „toxicum” latin méreg szavakból) penészgombák által termelt, emberekben és/vagy állatokban toxikus válaszokat indukáló anyagok, melyek széles körben elterjedtek. Elıfordulásuk természetes, ezért potenciális, nem kiküszöbölhetı
veszélyt
jelentenek.
Elsısorban
táplálkozás
útján
kerülnek
be
a
szervezetünkbe, de bırön keresztül, s inhalálás útján is bejuthatnak: mikotoxikózist okoznak [4]. Több, mint 400 mikotoxin ismert eddig, melyekbıl kiemelkedı humán- és állategészségügyi jelentıséggel kevesebb mint 20 rendelkezik. Többségük kémiai struktúrájuk szerint 5 nagy csoportba sorolható: ergotalkaloidok, aflatoxinok, trichotecének, fumonizinek és ochratoxinok [5]. A mikotoxinok léte közegészségügyi, mezıgazdasági és gazdasági szempontból fontos világmérető probléma. Ezt bizonyítja például a 2004. októberében hazánkban talált, aflatoxinnal jelentıs mértékben (az egészségügyi határérték 60szorosát is elérte egyes mintákban [6]) szennyezett pirospaprika, mely nagy botrányt robbantott ki. Elkerülhetetlen, hogy az élelmiszerek, takarmányok ne fertızıdjenek meg gombával a növény elültetésétıl a szüretelés, szállítás és tárolás során, sıt még a bolti, éttermi, otthoni raktározás során is. A toxintermelést számtalan tényezı befolyásolhatja: maga a gomba faja, mechanikai sérülés, földrajzi hely, hımérséklet és a páratartalom (fontos a termény szárítása tárolás elıtt, mert a toxinok általában nagy páratartalmú környezetben
8
termelıdnek) [5], ezért a penészgomba jelenléte nem jelenti a mikotoxin jelenlétét. Mivel a termelt toxinok gyakran nagyon stabilisak és az általános ételkészítési eljárásokkal szemben ellenállóak, így az is lehetséges, hogy az élelmiszer tartalmaz toxint, bár a gomba már nincs jelen [7]. Felismervén, hogy a mikotoxinok az egész világon elterjedtek, s az élelmiszerekbıl való teljes eliminálásuk lényegében nem lehetséges, nagy figyelmet fordítanak biológiai hatásaik vizsgálatára az egész világon. A mikotoxinok akut (heveny), szubakut (félheveny) és krónikus toxicitási tulajdonságot mutatnak állatokban és/vagy az emberben, s néhányról ismert, hogy karcinogén, mutagén, teratogén hatású [7]. Epidemiológiai vizsgálati eredmények összefüggést mutatnak néhány, a természetben elıforduló mikotoxin elterjedése, és a daganatos betegségekben szenvedı emberek nagyobb száma között [3]. Az étkezés útján a szervezetünkbe kerülı karcinogének, mint pl. a mikotoxinok, a mesterséges peszticidek, az adalékanyagok, és a fızés során keletkezı pl. heterociklikus aminok közül kiemelkednek a természetes eredető mikotoxinok, mivel a többihez képest sokkal nagyobb, százszor-ezerszer mérgezıbb a hatásuk és kémiailag igen ellenállók [3]. A penészgombák veszélyére, azok eltávolítására már az Ótestamentum (Mózes III. könyve 14:37-45) is figyelmeztet. A mikotoxinok okozta megbetegedések évszázadok óta ismertek. Már a XIII. században leírták a lovak tömeges megbetegedését és elhullását a Batu kán vezette hadjáratban. A leírások alapján ma már egyértelmően azonosítható, hogy a háttérben a stachybotriotoxikózis (Stachybotrys alternans és a S. atra) állt. Az elsı széles körben elterjedt, mikotoxin okozta betegség az anyarozs (Claviceps purpurea) mérgezés, az ergotizmus (ergot alkaloidok okozták) volt a középkorban, melyrıl csak az 1800-as években ismerték fel, hogy gomba eredető. A mikotoxinok kutatásával igazán 1960-tól kezdtek el foglalkozni, az Angliában több mint 100000 pulyka pusztulása okának vizsgálatával. Ez a súlyos állatpusztulás összefüggött a takarmányukban talált négy aflatoxinnal, az aflatoxin B1 (AFB1), B2 (AFB2), G1 (AFG1) és G2 (AFG2)-vel (B=blue és G=green a fluoreszcencia színét, a szám pedig a relatív kromatográfiás mobilitást jelöli) [5]. Az aflatoxinok (difuránkumarin származékok) (2.1. ábra), ezeket elsısorban az Aspergillus flavus és az Aspergillus parasiticus penészgombák termelik, a kevés számú, mindenütt elıforduló és szerkezetileg meghatározott környezeti karcinogének közé tartoznak, több állatfajnál tapasztalták immunotoxikus és genotoxikus tulajdonságukat. Az 1980-90-es években több esetben írtak le heveny emberi aflatoxikózist Afrikában és Ázsiában [3]. Ezek a tragikus események arra figyelmeztetnek, hogy a mikotoxinok halált is okozhatnak. Különösen fontos az óvatosság a gyerekek körében és a hepatitisz B vírust hordozóknál, mely 9
vírus további rizikót jelent az aflatoxin okozta májgyulladás kialakulásához. A takarmányok aflatoxin szennyezettségével elsısorban trópusi és szubtrópusi országokban kell számolni, ahol az aflatoxint termelı gombák számára kedvezıek az életfeltételek, és szaporodásra, toxin termelésre képesek a szabad földeken, olajos magvakon, gabonákon, főszereken és szárított fügeféléken. Figyelembe kell venni azonban, hogy az aflatoxinok nem megfelelı raktározás során, kontinentális éghajlaton is termelıdhetnek [3].
O
O
O
O
O
O
O
O
OCH3
aflatoxin B1 O
O
O
OCH3
aflatoxin B2 O
O
O
O
O O
O
OCH3
aflatoxin G1
O
O
O
O
OCH3
aflatoxin G2
2.1. ábra Az aflatoxin B1, B2, G1 és G2 szerkezeti képlete A legmérgezıbb aflatoxin az AFB1, melyet a legveszélyesebb ismert természetes humán karcinogénnek tekintik (IARC (International Agency for Research on Cancer) 1993, 1-es csoport). Az egyetlen mikotoxin, mely egy hosszú vizsgálat eredménye szerint erısen kapcsolódik a májrák kialakulásához emberben [8, 9]. Az AFB1 heveny bevitel szimptómái: hányás, hasi fájdalom, hıemelkedés, heves májgyulladás, depresszió, halál [5]. Ezért is alkalmazható biológiai fegyvernek, amit Irak el is készített belıle 1990-ben [10]. A 18 különbözı típusú aflatoxin közül a négy domináns toxicitási, karcinogenitási és mutagenitási potenciáljának sorrendje a következı: AFB1 > AFG1 > AFB2 > AFG2 [3]. Mezıgazdaságilag figyelmet keltı mikotoxinok az ochratoxinok (dehidroizokumarin származékok) is, melyeket néhány Penicillium és Aspergillus penészgomba termel.
10
Toxikológiai szempontból a legjelentısebb közülük az ochratoxin A (OA) (2.2. ábra), melynek magyarországi elıfordulása is jelentıs, a raktári penészgomba toxinok közül a leggyakoribb. 1965-ben izolálták elıször Aspergillus ochraceus-ból. Elsısorban vesekárosító (nefrotoxikus), de teratogén, immunoszupresszív és karcinogén tulajdonságait is leírták már különbözı fajoknál [7, 11]. Az IARC a lehetséges humán karcinogének csoportjába sorolja (1993, 2B csoport). Az ochratoxikózis tünetei a vese körüli fájdalom, nagy folyadék bevitel, depresszió, étvágytalanság [4].
O
O
CH3
HO H O N C
H Cl
COOH
2.2. ábra Az ochratoxin A szerkezeti képlete Az OA sok élelmiszerben jelen van, elsısorban magokban (árpa, zab, rozs, kukorica, búza), de gyümölcslevekben, borban s húsban is megtalálható az egész világon, különösen néhány mediterrán országban és a Balkánon figyeltek meg nagyobb kitettséget [3, 4]. Ott egy endemikus vese betegség (nem gyulladásos, krónikus vesebaj, melyben a vese mérete és tömege jelentısen csökken) is nagyon elterjedt [3], melyben fontos szerepet játszhat az OA. Újabban a kutatók találtak egy másik gombát is, mely azon a területen elterjedt. Kiderült, hogy az is vesekárosító patkányokban, így keresnek másik mikotoxint is, mely valószínőleg együtt hat az OA-val [4]. A fogyasztók egészségének megırzésére, legalább 77 államban szabályozzák, elıírják határértékekkel a mikotoxinok maximális megengedett mennyiségét élelmiszerekben, így az EU országaiban is (aflatoxinok és OA esetében 1-20 µg/kg) [12]. Ha több toxikus vegyület van jelen (pl. Afrikában és Ázsiában gyakori 2 vagy több mikotoxin együttes elıfordulása gabonában), még ha a biztonsági szint alatt is, komoly problémát okozhatnak esetleges szinergista, additív hatásuk miatt.
Egyes szerzık szerint a rosszindulatú daganatos
megbetegedések száma növekszik [13], ezért egyre fontosabbá válik a toxikus, karcinogén mikotoxinok hatásmechanizmusának vizsgálata is, mely szükséges általában is a karcinogenezis alapjainak jobb megértéséhez. 11
2.2. Az aflatoxinok ismert anyagcsere útjai A mikotoxinok káros hatásainak megértéséhez szükséges a metabolizmusuk és a gazdafaj vagy fajta védekezı mechanizmusának vizsgálata. Nyilvánvalóan ezek nagyon különbözıek az egyes fajokban. Az aflatoxinok esetében a vizsgálatok elsısorban az e toxinokra nagyon érzékeny rágcsálókra illetve, mivel a legnagyobb potenciállal rendelkezı természetes humán karcinogének, az emberekre terjed ki. Az aflatoxinok közül legtoxikusabb AFB1 metabolizmusa elég jól feltérképezett [14-20] (2.3. ábra), sok anyagcsere-utat, s anyagcsere-terméket írtak le. A genotoxikus hatásában a kritikus metabolikus lépés az AFB1 aktiválása, monooxigenázok általi oxidációja AFB1-8,9epoxiddá, melynek két izomere van, az exo és az endo forma. Nagyobb mennyiségben keletkezik a sokkal reaktívabb, mintegy tízezerszer mérgezıbb exo izomer. Ez a molekula nagy affinitással kötıdik a nukleinsavak guanin bázisához AFB1-N7-guanint formálva, mely guanin – timin báziscserét, mutációt, DNS és RNS károsodást okozhat. Továbbá szérum albuminban illetve más fehérjékben lévı lizinnel is képezhet adduktot úgy, hogy az epoxid hidrolizációjával AFB1-8,9-dihidrodiol keletkezik. A dihidrodiol származék fiziológiai körülmények között átrendezıdik a dihidrofurán győrők kinyílásával, s a keletkezı fenolát ion képes Schiff bázist alkotni primer aminocsoportok lizinjével, gátolva a proteinek aktivitását, egyes enzimek mőködését, mely akut toxicitást is okozhat. A nagyon reaktív epoxid metabolit detoxifikációja glükuronsavval, szulfáttal, vagy redukált glutationnal (GSH) való konjugáción keresztül valósulhat meg. A legutóbbit a glutation-S-transzferáz katalizálja. Az aflatoxin M1, az aflatoxin Q1 és az aflatoxin P1 (AFP1) hidroxilezett metabolitok, melyek sokkal kevésbé toxikusak illetve karcinogének, mint az AFB1, szintén kötıdhetnek a DNS-hez, bár az aflatoxin Q1 képessége kisebb epoxid képzésre. Az aflatoxin M1 akut toxicitással rendelkezı, a tejjel ürülı anyagcsere termék (errıl kapta nevét is, M=milk). Az AFB1 enzimes demetilezésébıl toxicitással már alig rendelkezı AFP1 és melléktermékként formaldehid (HCHO) keletkezik [21]. Az AFB1 sokféle káros hatását írták le különbözı fajokban. Potenciális karcinogén, elsısorban a máj a károsítás célszerve, de találtak már feltételezett hatására keletkezı tumort a tüdıben, a vesében és a vastagbélben is. Kromoszóma aberrációt, nem szabályozott DNS szintézist illetve oxidatív károsodást tapasztaltak AFB1 jelenlétében [17]. Különbözı kémiai karcinogének metabolikus aktiválása során hidrogén-peroxid (H2O2) generálódik patkány máj mikroszómában [22], mint ahogy drámaian megnıtt a H2O2 szintje AFB1 injektálására is [23]. A H2O2 a hidroxil gyök (OH*) prekurzora, mely az egyik 12
legreaktívabb DNS károsító oxigén szabad gyök. A DNS oxidatív károsodása oxigén szabad gyökök által, melyek a sejt metabolizmus során keletkeznek, minden másodpercben jelen vannak, s közremőködnek a DNS károsításban, öregedésben és a rosszindulatú daganatok kialakulásában. Sok védekezı mechanizmus a szervezetben limitálja a reaktív oxigén molekulák szintjét, és így véd a DNS oxidatív károsodása ellen. A sejtvédı mechanizmusokban szerepet játszik pl. a szuperoxid dizmutáz, a kataláz, a glutation peroxidáz és ilyen lehet néhány antioxidáns (feltételezetten gátolják a szabad gyökök keletkezését, illetve semlegesítik azokat), mint a béta-karotin, a C és az E vitamin [22]. De ezt a közeljövıben feltételezhetıen további vizsgálatok fogják megerısíteni. Az AFB1 által okozott oxidatív stressz (a biológiai rendszer számára romboló szabadgyökök patológiás mértékben való felszaporodása) [24-28] elsısorban megnövekedett lipid peroxidációban és az enzimatikus és nem enzimatikus antioxidánsok csökkenésében nyilvánul meg. Ezt a káros hatást tudták csökkenteni szuperoxid dizmutázzal, katalázzal és hidroxil gyök elvonóval is, melybıl arra következtetnek, hogy a reaktív oxigén molekulák, mint a szuperoxid gyök, a hidroxil gyök és a H2O2 az AFB1 indukálta sejtkárosodás velejárója. Az AFB1 karcinogén tulajdonságát különbözı kemopreventív anyaggal tudták módosítani, mint pl. flavonoidokkal [29], teakivonatokkal, oltiprazzal és réz klorofillinnel [18]. Az oltipraz (1,2-ditiol-3-tion) képes csökkenteni a májkárosodást, mivel képes csökkenteni az epoxid metabolit detoxifikálását segítı GSH megvonását, így az aflatoxinDNS addukt mennyiségét a májszövetben. Tehát ez a hatás összefügg a glutation-Stranszferáz megnövekedett aktivitásával. A réz klorofillin (Mg helyett Cu a központi ion) szintén csökkenti a DNS addukt mennyiségét és a májrák kialakulását. Antimutagén hatásának az okai a következık lehetnek: 1. in vitro bizonyították, hogy reverzibilis komplexet alkot planáris aromás vegyületekkel, azaz az AFB1 biológiai hozzáférhetısége csökken, 2. in vivo kísérletekben mind emberi, mind állati szövetekben antioxidáns hatást mutatott.
13
OH
O
OH
O
OH
O
O O
O
H
H
H OH
OH O O
O
O
OCH3
O
OCH3
aflatoxikol H1
aflatoxikol
O
O
aflatoxikol M1
O
OCH3
O
O
O
O
OH OH O
O
OCH3
O
P-450
O
O
P-450
aflatoxin M1
O
OCH3
aflatoxin Q1
O
O
O O
O
O O
Schiff bázist alkot a fehérjével
O
P-450 O
OCH3
+ CH2O
aflatoxin B1
H
O
HO
O
O
P-450 NADPH O
O
O
O
O
pH 7,4 O
O
H+ (H+)
O
HO
O
O
OCH3
GST, GSH O
OCH3
aflatoxin B1 dihidrodiol
O O
aflatoxin B1 GSH konjugát
O
O
O
O
OH
HO
O
O HO
DNS-Gua-N7 HO O
OCH3
O OCH3
OCH3
aflatoxin B1-8,9-epoxid O
O
O
aflatoxin B1 dialdehid fenolát
DNS
HO
OH
HO
GS O
O
O
HO
O
O
HO
OH
aflatoxin P1
OCH3
aflatoxin B2a
O
O
OCH3
aflatoxin B1 dialkohol
aflatoxin B1 DNS konjugát
AFAR, NADPH
Schiff bázist alkot a fehérjével szubsztrátja a szulfotranszferáznak és/vagy UDP glukuronil transzferáznak?
2.3. ábra Az aflatoxin B1 ismert metabolikus útjai [14-20] 14
AFB1 expozíció után megtalálhatók az emberi és patkány vizeletben az AFB1 mellett a toxin metabolitjai is, mint az AFB1-DNS addukt, AFB1-glutation addukt, aflatoxin M1, aflatoxin Q1, és AFP1 [30, 31]. Sanghajban végzett kísérlet szerint a májrákban szenvedı embereknél nagyobb valószínőséggel találtak detektálható mennyiségő aflatoxin metabolitokat, s a legnagyobb kockázatot az AFP1, az AFB1 demetilezett formája jelentette, vagyis azt találták a legnagyobb mennyiségben, azaz feltételezhetıen a betegség kialakulásának oka, hogy a demetilezés során nagy mennyiségő HCHO keletkezett a szervezetben. Azonban nem találtak összefüggést az AFB1 bevitel és a másnapi vizeletben talált AFP1 között [30]. Kirby és mtsai írták le [32], hogy in vitro kísérletben az aflatoxin Q1 és AFB1-8,9-epoxid termelés a tumoros máj szövetben egyenletesen csökkent, míg az AFP1 szignifikánsan emelkedett az egészséges májszövethez képest. Korrelációt tapasztaltak az AFP1 emberi vizeletben való jelenléte és az elsıdleges máj rák kialakulása között. Szintén az AFP1 a legnagyobb mennyiségben található AFB1 metabolit a majmok vizeletében is, amibıl elıször izolálták és azonosították [33]. Patkány vizeletet vizsgálva, a legnagyobb mennyiségben aflatoxin M1-et találtak (34,5 %), 9,6 % -ban aflatoxin-N7-guanint, 8 % -ban AFP1 volt jelen, s nem volt összefüggés az aflatoxin dózisa és az AFP1 mennyisége között [31]. A DNS hipermetilezése jelen van, szerepet játszhat a HCC (Hepatocellular carcinoma) kialakulásában [34]. A legfontosabb tumor gátló gének inaktiválódnak tumoros szövetben, nem csak mutációk, hanem metilezés által is. Míg az egészséges máj szövetben nagyon ritkák, addig a tumoros szövetek nagy százalékában megtalálták a következı gének metilezett formáját [35-38]: p16 tumor gátló gén; RASSF1A (Ras ASSociation Family) gén; O6-metilguanin-DNS metiltranszferáz javító gén, mely a DNS-ben lévı guanin csoport O6 pozíciójába kötı promutagén alkil csoportokat távolítja el; GSTP1, mely kódolva a glutation-S-transzferáz π-t, megvédi a sejteket oxidánsok és elektrofilek okozta károsodástól. Statisztikailag szignifikáns összefüggést találtak tumoros szövetben e gének hipermetilezésének mértéke és a mért AFB1DNS addukt mennyisége között, a metilezés és a p53 gén mutációs státusza között, valamint a májban lévı AFB1-DNS addukt és a vérben mért AFB1-albumin addukt mennyisége között. Tehát az albumin addukt használható az AFB1 expozíció biomarkereként (biojelzıjeként) [3538]. Az eredmények azt mutatják, hogy e tumor gátló gének epigenetikusan, a metilezıdésük által inaktiválódnak a tumoros szövetben, s ez a folyamat fontos szerepet játszhat a rosszindulatú daganatok kialakulásában. Ezen kívül a természetes karcinogének, mint az AFB1, részt vehetnek – többek között – a gének aberrált metilezésében, ezen keresztül fejtve ki karcinogén hatásukat.
15
2.3. Az ochratoxin A ismert anyagcsere útjai Az OA toxicitásában szerepet játszhat a fehérje szintézis gátlása, a reaktív metabolitok keletkezése, a DNS addukt képzése, DNS károsítása, oxidatív stressz generálása, és a mitokondriális ATP szintézis gátlása [4]. Az OA nefrotoxikus hatásának az oka a fenil-alaninnel való strukturális hasonlósága. Ez azt eredményezi, hogy megköti a specifikus fenilalanil-RNS szintáz szubsztrátjait, ezzel gátolva a fehérjeszintézist [39, 40]. Ezt támasztja alá a fenil-alanin és a strukturálisan analóg Aszpartám (mesterséges édesítıszer) adagolásának az OA toxicitását gátló hatása [41, 42]. Azonban az Aszpartám gyógyászatban való alkalmazása erısen megkérdıjelezhetı, mivel rosszindulatú daganatokat indukál [43]. Az OA metabolizmusával (2.4. ábra) kapcsolatos adatok ellentmondóak. Feltételezik, hogy az OA bioaktiválása során egy reaktív, a DNS-hez kötıdı köztitermék keletkezik, mely részt vesz az OA indukálta tumor kialakulásában. Eddig azonban nem izoláltak illetve karakterizáltak reaktív termékek képzıdésére utaló stabilis metabolitokat. Calcutt és mtsai [44] írták le a hidrokinon/kinon (OAHQ/OAQ) redox pár generálódását az OA elektrokémiai és fotokémiai oxidációja által. Feltételezik, hogy az OA biotranszformációja OAHQ/OAQ-vá reaktív oxigén molekulákhoz vezethet, így oxidatív DNS károsodást segít elı. Dai és mtsai [45] demonstrálták az OA szénkötéső C8-deoxiguanozin addukt keletkezését fotóaktiváció után. Modell rendszerben (NIH/3T3 sejtek humán citokróm enzimekkel) végzett kísérletek eredményeibıl is feltételezhetı, hogy az OA citokróm P2C9 enzim által citotoxikusabb metabolitokká konvertálódik, melyek képesek DNS addukt képzıdésének indukálására [46]. Izotópos módszerrel kimutattak adduktra utaló DNS károsodást [47-49], de ezek nem bizonyítják az addukt létét, mivel a trícium-jelzett OA-val végzett kísérletben nem tapasztaltak radioaktivitást a patkányvese DNS-ében [50]. Az elektrofil OAQ reagálhat nukleofilekkel a szövetben, mint más kinonok. Az OAQ képes a GSH-t kovalens kötéssel megkötni OAQ-GSH konjugátot alakítva, sejtetve, hogy a GSH megvonás növelheti az OA toxicitását [51]. Ennek ellenére a GSH megvonás csökkentette az OA citotoxicitását, mutagenitását [52, 53], s a DNS károsodása is csökkent glutation-S-transzferáz inhibitor jelenlétében [46]. Ez az eredmény azért is meglepı, mivel a GSH általában védı hatású a reaktív metabolitokkal szemben. Ezzel összhangban van, hogy a GSH konjugátok genotoxikusak lehetnek, mivel további átalakulás után reaktív tiol termékek keletkezhetnek belılük.
16
O
O
HO H O N C
O
O
O
H O N C
CH3
O
ochratoxin A kinon H
O
ochratoxin B
HO H O N C
O
CH3
HO O
O
OH
ochratoxin A hidrokinon
COOH
O
CH3
COOH
COOH
HO H O N C
O
O
CH3
HO H O N C
CH3
COOH Cl
O
CH3 Cl
HOOC
ochratoxin α Cl O
ochratoxin A HO H O N C
COOR
ochratoxin A R (hexóz vagy pentóz) konjugát
OH
CH3 OH
Cl
COOH O
HO H O N C
O
CH2OH
Cl
COOH
10-hidroxi-ochratoxin A
O
HO H O N C
O
CH3
ochratoxin A nyitott lakton formája
OH Cl
COOH
4-hidroxi-ochratoxin A
2.4. ábra Az ochratoxin A feltételezett metabolikus útjai [44-47, 54, 58-61] Ezekbıl következik, hogy az OA mindkét aktiválási útja, az OAHQ/OAQ és az OA-DNS addukt képzıdésének szerepe az OA karcinogenitásában csak spekulatív. In vivo kísérletben nem tudták detektálni az OA-deoxiguanozin adduktot, s más OA-ból származó DNS addukt jelenléte sem volt nyilvánvaló F344 Fischer him patkány vér, máj és vese homogenizátumában LCMS/MS mérésekkel. A patkányok súlya és a vizeletük térfogata is csökkent, a vizeletben ochratoxin α-t, pentóz és hexóz konjugátot, valamint nyomokban OAHQ-t és ochratoxin B-t detektáltak [54]. Széles körben elfogadott, hogy a citokróm P450 enzimek az OA epimer hidroxi származékainak keletkezését katalizálják [55-57]. A 4R-OH–OA illetve a kisebb mennyiségben keletkezı 4S-OH-OA metabolitokat in vitro és in vivo kísérletekben is detektálták már [46, 58]. E hidroxi származékok az OA-nál kisebb genotoxikus potenciállal rendelkeznek, melyet az is bizonyít, hogy a fenobarbital, mely a citokróm P450 enzimet indukálja, megvédi a patkányokat az OA vesekárosító hatásától, s az enzimszint csökkentésével súlyosbodott a vesekárosítás [58]. OA-val inkubált majom vese sejtekben 4-[S]- és 4-[R]-hidroxi-OA és ochratoxin B származékok mellett detektáltak egy további metabolitot, az ochratoxin α-t [59]. Nyúl máj
17
mikroszómában az ochratoxin α [60] mellett a 10-hidroxiochratoxin [61] és a tirozin-OA [60] származékokat is kimutatták. Különbözı kísérletek mutatják, hogy az OA mitokondriális diszfunkciót és oxidatív stresszt okoz [62-64]. Reaktív oxigén molekulák termelése szignifikánsan nıtt OA jelenlétében patkány sejtekben (in vitro) [64], in vivo patkány, disznó vesében [65], valamint NIH/3T3 sejtekben, s mindez összhangban volt a genotoxikus hatással [66]. Szintén in vitro kísérletben, patkány vér, vese és máj homogenizátumokban, a malondialdehid (a lipid peroxidáció terméke) szintjének növekedésébıl következtettek arra, hogy az OA adagolás hatására szignifikánsan megnı a lipidperoxidáció mértéke. Ezt az oxidatív károsodást az antioxidáns hatású melatonin csökkentette [67]. Az oxidatív stressz valószínőleg fontos szerepet játszik az OA toxicitásában és karcinogenitásában. A reaktív oxigén molekulák (pl. O2·-, OH·, ROO·), melyeket a lipid peroxidáció iniciál, különféle negatív hatásokat indukálnak a célszövetben, mint pl. membránokat, fehérjéket, nukleinsavakat károsítanak. DNS károsító, láncszakadást okozó hatását egér vesében, májban, és lépben in vivo és in vitro is igazolták [68]. Feltételezik, hogy az oxidatív út a felelıs az OA indukálta DNS addukt nagy részének a kialakulásában is, aminek létezése azonban még nem bizonyított [69].
2.4. Az aflatoxinok és az ochratoxin A mikroorganizmusokkal szembeni hatásai Az aflatoxinoknak és az ochratoxin A-nak elsısorban a mutagén hatását vizsgálták mikroorganizmusokkal szemben.
A különbözı anyagok mutagenitásának kimutatására
általánosságban az Ames tesztet alkalmazzák, melyben egy pontmutáció következtében hisztidin szintézisére képtelen Salmonella-törzset használnak. Ez a hiba kijavítható egy újabb mutációval, s így általában igaz, hogy minél több baktériumtelep nı ki adott mennyiségő szer hatására hisztidinmentes táptalajon, annál erısebb mutagén a vizsgált anyag. Mivel a májban számos metabolit átalakul, ezért célszerő a vizsgálandó anyagot a baktérium-tesztet megelızıen máj kivonattal kezelni. Néha elıfordul, hogy egy szer a baktériumban nem mutagén, emberben viszont az, mivel a máj (közelebbrıl a citokróm P-450 oxidáz) tesz valami olyat e szerrel, amitıl mutagénné válik. Az ochratoxin A nem indukál mutációt Salmonella typhimurium baktériumban [70], míg az AFB1 igen [71]. Feltételezik, hogy az AFB1 baktériummal szemben mutatott direkt mutagén hatásában fontos szerepet játszik a lakton győrőben lévı kettıs kötés, mely lehetıvé teszi a DNS-hez való kapcsolódást. Salmonella typhimuriumban, máj kivonat jelenlétében,
18
kimutatták az AFB1-DNS adduktot [71], melynek a képzıdését tudták gátolni GSH illetve GSH és glutation-S-transzferáz együttes adagolásával [72]. Az AFB1 kettıs kötését telítve a lakton győrőben, a nem fluoreszcens származék mutagenitása az Ames tesztben 450-edére csökkent az AFB1-hez képest [73]. Továbbá különbözı antioxidánsok (pl. flavonoidok, karotinoidok, A, C és E vitamin, ellágsav) is mérsékelték a mutagén hatását a toxinnak az Ames tesztben. Sok mikroorganizmus esetében leírták a mikotoxinokra való érzékenységet is. Az AFB1 és az OA különösen citotoxikus, sejtszaporodás gátló hatású, pl. Escherichia coli, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica, Salmonella infantis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Lactobacillus plantarum és Lactobacillus casei baktérium törzsekkel szemben [74]. Ezt a gátlást tudták részben csökkenteni antioxidánsokkal (pl. koenzim Q10plusz, Lkarnitin), ami arra utal, hogy a mikotoxinok antibakteriális hatása az endogén reaktív oxigén szabadgyökök keletkezésével jár együtt [74], de ez a tény nem bizonyítja azt, hogy részt is vesznek a hatásban. Mind a négy általam is vizsgált aflatoxin citotoxikusnak (az erısorrend AFB1>AFG1>AFB2>AFG2 volt) mutatkozott Photobacterium phosphoreummal szemben, viszont mutagén csak az AFB1 és az AFG1 volt. Az AFB1 szignifikánsan csökkentette a gombák és baktériumok populációját a talajban is, mely hatás lucernakivonat adagolásával erısödött [75]. Ezek az ellentmondások is igénylik a téma alapvetıen új megközelítését.
2.5. A jelen dolgozat témáját közvetlenül érintı irodalom összefoglalása 2.5.1. A formaldehid elıfordulása és szerepe az élıvilágban A HCHO, a világegyetemben elsıként kimutatott szerves molekula [76], környezetszennyezı humán karcinogén (IARC, 2004, 1. csoport), mely megtalálható a dohányfüstben, kipufogógázokban, mőanyagipari üzemek levegıjében, ruhákban, faárukban [77, 78]. Az élıvilágban a HCHO minden biológiai rendszerben megtalálható kötött formákban, mint pl. hidroximetil, formil, N-, S- és O-metil csoportokban, metilezési-demetilezési folyamatok során keletkezik s mindezek alapján nélkülözhetetlen is a biológiai világban [79-81]. Tyihák és mtsai [80, 82] különbözı biológiai mintákban (pl. disznómáj, ecetfalevél, gombaspóra) mérték a HCHO mennyiségét dimedon (Dim) segítségével [83], mely irreverzibilisen köti meg a HCHO-t [84]. Lépcsızetesen növelve a Dim mennyiségét, s mindig feleslegben, egyre nagyobb mennyiségő formaldemetont mértek a telítıdésig, jelezve, hogy a HCHO fıleg kötött formában van jelen s különbözı molekulákhoz különbözı erısséggel kötötten. Kísérletekkel bizonyították, hogy a különbözı metilezett és hidroximetilezett molekulák (pl. 1’-metil-aszkorbigén,
S-adenozil-L-metionin
(SAM),
N-metil-taurin,
Nε-trimetil-L-lizin,
19
trigonellin, betain, mono-, di-, és tri-hidroximetil-L-arginin) potenciális HCHO elıanyagok [81, 82, 85-88]. Axelrod már 1956-ban leírta [86], hogy a narkotikus drogok enzimes N-demetilezése során HCHO szabadul fel. Ezt a következtetést arra alapozta, hogy a kezelt patkány és nyúl mikroszómákban HCHO képzıdött. Az S-metil csoportot hordozó aktivált L-metionin, a SAM metil donorként szolgál valamennyi enzimatikus transzmetilezési reakcióban, beleértve a DNS metilezését is [89]. A SAM demetilezési folyamata [80] analóg a Walden inverzióval [90], mely során kizárt metil kation vagy gyök képzıdése, ezzel szemben metanol képzıdik, mely tovább oxidálódik HCHOvá, azaz az enzimes transz-metilezés végül HCHO-n keresztül következik be. (Ez a reakció egyébként magyarázattal szolgál a metanol biológiai rendszerekben való természetes elıfordulására [91] is.) A HCHO képzıdését a SAM enzimatikus demetilezıdése, azaz az enzimes transzmetilezésben való részvétele során radioaktív S-metil csoportot tartalmazó SAM segítségével bizonyították [92]. Patkányvesébıl izolált, részlegesen tisztított hisztamin-metiltranszferáz felhasználásával a hisztamin N-metil-hisztaminná történı átalakítása során radioaktív formaldemeton keletkezett Dim jelenlétében, igazolva, hogy az enzimes transzmetilezés HCHO-n keresztül megy végbe. Szintén radioaktív formaldemeton képzıdését tapasztalták nyomjelzett Nε-(metil-3H) trimetil-Llizin babszövetbe való adagolása után Dim jelenlétében [85]. Kalász és mtsai a Parkinson betegség tüneti kezelésére használt N-metilezett Deprenyl [(–)N- metil -N- propinil - 1 - metil - 2 - fenil - etilamin hidroklorid] adagolás után vizeletben detektálták a HCHO-t, Dim adduktként [87].
14
C-metil jelzett Deprenyl vegyülettel
megerısítették, hogy a HCHO a drog demetilezésébıl származik [88]. A Bacillus megaterium [93], Rhodococcus erythropolis [94, 95], Pseudomonas testosteroni [96] és Pseudomonas aeruginosa [97] mikroorganizmusok, mint biokatalizátorok, valamint az emberi máj mikroszóma [98] szintén demetilezik a különbözı N-, és O-metilezett vegyületeket HCHO-t termelve. Az utóbbi évek eredményei indokolták az irodalomban megjelent metilom kifejezés bevezetését, mely egy sejt DNS metilezési folyamatainak összességét írja le [99, 100]. A metilomban való változások szorosan kapcsolódhatnak az öregedéshez, a populáció polimorf változásaihoz és a rák kialakulásához. A károsodott, metilezett bázisú DNS-ben az 1-metiladenin és a 3-metil-citozin enzimes oxidatív demetilezése során sértetlenül kapjuk vissza a DNSt, s melléktermékként HCHO keletkezik [101].
20
Modell kísérletek bizonyítják, hogy fiziológiai pH-n, HCHO jelenlétében az L-lizin ε-amino csoportja képes metilezıdni és formilezıdni, s Nε-mono-, di, tri-metil-L-lizin, illetve Nε−formilL-lizin keletkezik, melyet gátolni tudtak L-aszkorbinsav (C-vitamin) (AA) adagolásával [102104]. Ezzel szemben az L-arginin és a GSH HCHO-val való reakciójából mono-, di-, vagy trihidroximetilezett L-arginin [104, 105] illetve hidroximetil-glutation képzıdik [106] reverzibilis reakciókban, így ezen aminosavak HCHO befogó, szállító és donor molekuláknak tekinthetık. A hidroximetilezett formákból felszabaduló HCHO sokkal nagyobb hatással bír, mint a szabad HCHO [107, 108]. Ezt bizonyítja, hogy a HCHO-val kevert aminok antibakteriális hatását vizsgálva Escherichia colival szemben, az alifás aminok esetében kaptak nagy gátló hatást, melyek képesek a HCHO-val reakcióba lépni, s N-hidroximetilezett vegyületet alkotni [108]. Az Nε- tri-metil-L-lizin biológiai aktivitásai közül kiemelkedik a sejtszaporodás serkentés állat és növény szövetekben, valamint az abiotikus stressz elleni védelem [109]. A különbözı hidroximetil-L-arginin-származékok
jelentıs
tumorgátló
és
apoptózist
okozó
hatással
rendelkeznek [110-112]. Az újabb eredmények azt mutatják, hogy a hiszton metilezése szerepet játszhat a tumorgenezisben, s in vivo dinamikusan szabályozva van metiláz és demetiláz enzimekkel. A hiszton az L-arginin és az L-lizin aminosavaknál metilezıdhet, s az LSD1 (Lizin Specifikus Demetiláz) enzimfehérje a mono- vagy di-metilezett H3 lizin 4-et képes demetilezni oxidációs reakcióban, mely során HCHO generálódik. Ezt többféle úton, pl. tömegspektrometriás módszerrel is bizonyították [113, 114]. A HCHO szerepet játszik az élıvilág alapvetı biokémiai folyamataiban, mint a fotoszintézisben [110, 115, 116], a növények tavaszi megújulásában és az ıszi lombhullásban, a programozott sejthalálban [81, 82]. Izotópos kísérletekkel bizonyították a HCHO képzıdését fotoszintézis során, s a Calvin-ciklushoz kapcsolható, a szén-dioxid fixálás korai szakaszában lévı új biokémiai utat írtak le, mely során a HCHO glikolsavvá alakul át [116]. Tyihák és mtsai [81] a falevelek HCHO és potenciális generátorainak szintjét mérve a vegetációs idıszak alatt azt tapasztalták, hogy tavasszal, a megújulás során mind a HCHO, mind az N-metilezett HCHO elıanyagok szintje nagy volt, azaz transz-metilezési folyamatok indulnak be. Az „átmeneti” nyár után, ısszel a HCHO ugyancsak drámaian nıtt, míg a kvaterner aminok szintje jelentısen lecsökkent, vagyis elsısorban a demetilezési reakciók domináltak, s a keletkezı gerjesztett HCHO és reakciótermékei (pl. H2O2-vel reagálva) szerepet játszhatnak a lombhullásban, a programozott
sejthalálban,
vagyis
végeredményben
a
biológiai
rendszer
védekezı
mechanizmusában. Ezt támasztják alá azon megfigyelések is, hogy a növényt ért különbözı
21
stressz hatására [85, 115, 117, 118], mint vírusfertızés, hısokk, áztatás, sóstressz vagy fénymegvonás hatására, a HCHO szint jelentısen megnı, míg a HCHO generátorok szintje csökken. Hısokk esetén figyelték meg, hogy a keletkezı hısokkfehérjék metilezıdtek a bázikus oldalláncukon, az L-lizin és az L-arginin aminosavaknál [119]. Feltételezhetıen e metilezési folyamatban is nagy szerepe van a HCHO-nak. Az eredmények azt mutatják, hogy a HCHO-nak alapvetı funkciója lehet a sejtosztódás és a sejthalál közti egyensúly szabályozásában, s az ebben bekövetkezett hiba betegségek kialakulásához vezethet abnormális sejtszaporodáson át (nem tudnak meghalni a sejtek). Endogén HCHO keletkezhet a metil-amin oxidációjából is, mely pl. az adrenalin, a szarkozin, a kreatin és nikotin metabolitja [120, 121], s megtalálható vizeletben, vérben és szövetben. Oxidációját az SSAO (szemikarbazid szenzitív amino-oxidáz) katalizálja, s HCHO, s vele azonos moláris mennyiségő H2O2 (a víz molekulákból!) is képzıdik az ammónia mellett [122,
123].
A
cukorbetegeknél
magas
SSAO
aktivitást
és
nagyobb
mennyiségő
enzimszubsztrátot (pl. metil-amin) mértek. A túlzott deaminálás, mely közvetlenül iniciálhat oxidatív stresszt, okozhatja a cukorbetegségben fellépı komplikációkat az érrendszerben, a szem szerkezeti fehérjéiben és a vesék mőködésében. CH3NH2 + O2 + H2O
SSAO
HCHO + H2O2 + NH3
Tény, hogy a HCHO jelenléte természetes, nélkülözhetetlen minden biológiai rendszerben [82]. Tyihák Ernı vezette be a formaldehidom kifejezést [124-126], mely az adott biológiai rendszerben található minden HCHO-val kapcsolatos reakcióutat magában foglal, így a HCHO ciklust [80, 81] is. Feltételezhetı és egyre inkább bizonyított, hogy a biológiai rendszerekben végbemenı dinamikus metilezési - demetilezési reakciók HCHO-n keresztül mennek végbe [79, 82, 85-88, 92], mint pl. a DNS metilezése, így ezen folyamatok is a formaldehidom részei. Egyre inkább megerısítést nyer, hogy a DNS aberrált metilezıdése szerepet játszik egyes anyagok toxikus és/vagy karcinogén aktivitásában. Egyes nehézfémek [127] illetve az AFB1 [38] jelenlétében is tapasztaltak megnövekedett DNS metilezıdést, s feltételezhetıen a nem genotoxikus karcinogének mechanizmusában is kulcsszerepe van [127]. Az utóbbi idık nagy felfedezése, hogy a gyomorfekélyért végül is elsısorban a Helicobacter pylori fertızés a felelıs [128], de a legújabb vizsgálatok szerint e kórokozó nagy kockázatot jelent a gyomortájékon kialakuló kóros sejtszaporodás változatok keletkezésében is [129, 130]. Krónikus gyulladást, sejtszaporodást okoz, s gyomortáji aberrált DNS metilezéssel is összefüggésben van [131]. Feltehetıen, mint sok más baktérium, toxin(ok) termelése által fejti ki hatását [129].
22
A HCHO reaktív molekula, mely szabad amino- vagy amid-csoportokkal is reagálhat, Schiffbázist, metilol csoportokat és metilén-hidakat formálva, s irreverzibilis kovalens kötéseket hoz létre fehérjék illetve fehérje és DNS között [132, 133]. A sejtekben extra- és intracellulárisan természetes alkotórészként a HCHO mellett a H2O2 is megtalálható [134], tehát e két kis molekula között kölcsönhatási reakció játszódhat le. Trézl és Pipek [135] modellreakciókban, fiziológiás körülményeket biztosítva figyelték meg, hogy a HCHO aktiválható H2O2-vel különösen L-lizin ε-amino csoportjának a jelenlétében, s szingulett oxigénre (1O2) és gerjesztett HCHO-ra jellemzı hullámhosszú fény emisszióját detektálták. Késıbb Yu és Zuo is leírták [120], hogy a metilaminból felszabaduló HCHO és a H2O2 reakciója során reaktív oxigén molekulák keletkezhetnek, melyek károsodást okoznak belhám sejtekben. A 1
O2 és a gerjesztett HCHO energiában gazdag, nagy reaktivitású molekulák, melyek
megtámadhatják a sejt összetevıit, pl. a fehérjéket, nukleinsavakat és a szöveteket. Jelenlétük a növények esetében is megerısítést nyert [118]. Stresszmentes körülmények között is keletkezhetnek kis mennyiségben, de elsısorban a stresszhelyzet kedvez képzıdésüknek, ezért a biológiai rendszerek védekezı mechanizmusában is részt vehetnek [118]. De nem csak a betegség ellenállás meghatározó faktorai, hanem egyben potenciális rizikófaktorok is lehetnek a különbözı betegségek kialakulásában. S ez érvényes a 1O2 további toxikus reakciótermékeire is. Wentworth és mtsai írták le [136-139], hogy az antitestek katalizálják a víz oxidációját 1O2 által és a H2O2 mellett az ózon (O3) kémiai jellemzıit mutató molekula is keletkezik, s ez a folyamat alkalmas baktériumok elpusztítására. Azonban a keletkezett H2O2 1-4 nagyságrenddel kisebb mennyiségő, mint ami szükséges lenne a baktériumok 50%-ának elpusztításához [136, 139]. Az újabb vizsgálatok megerısítették, hogy korábban biológiai rendszerekben nem detektált oxidánsok képzıdhetnek, mint a dihidrogén-trioxid (H2O3) és az O3, s ezek felelısek a baktériumölı hatásért. Lin és mtsai [140] in vitro vizsgálták a HCHO, a H2O2 és a kettı 1:1 arányú elegyének hatását belhám sejtekre. A DNS-fehérje átkötések számában a kontrollhoz képest mindhárom kezelés esetben koncentrációfüggı szignifikáns növekedést tapasztaltak. A növekedés mértéke az elegy használatánál volt a legnagyobb, ezt követte a tiszta HCHO, majd sokkal kisebb növekedést mutatott a H2O2 kezelés. Viszont a HCHO és az elegy közti különbség nem volt szignifikáns. A sejtek károsodását jelzı laktát-dialdehid szintje is koncentrációfüggıen növekedett a kezelések hatására. A sejtek életképessége legjobban az elegy hatására csökkent, viszont nem tapasztaltak laktát-dialdehid szint emelkedését csak HCHO-val való kezelés után. H2O2 esetén kis mértékő csökkenés volt, melyet a belıle Fenton reakcióval képzıdı hidroxil
23
gyök okozhatott. Az eredmények jelzik, hogy a HCHO és a H2O2 hatása szinergista, s hogy a HCHO illetve H2O2 önmagában sokkal kisebb kárt okoz, mint az együttes kezelésük. Tyihák és mtsai dózisfüggést tapasztaltak HCHO és különbözı endogén potenciális HCHO generátorok (pl. betainok, Nε-trimetil-L-lizin) hatásában. A HCHO kis mennyiségben sejtszaporodás serkentı, míg nagy mennyiségben sejtszaporodás gátló hatást mutat tumoros és belhám sejtkultúrákban egyaránt [141]. A formaldehidom befolyásolására alkalmas anyagok (pl. Nε-trimetil-L-lizin, betainok, Cu(II), formalin oldat) által indukált rezisztencia babnövényekben babrozsda patogén ellen szintén koncentrációfüggı [142, 143]. Ebben a hatásban is a felszabaduló HCHO szerepét feltételezik. Ezek az eredmények azt támasztják alá, hogy a HCHO alapvetı szerepet tölt be az élıvilág védekezı mechanizmusaiban. Nyilvánvaló, hogy a formaldehidom, a különbözı HCHO reakcióutak, metilezésidemetilezési folyamatok egyensúlyban tartására, befolyásolására különbözı HCHO-befogó és generáló anyagok adagolása alkalmas. Ezen anyagok hatással vannak a HCHO biológiai rendszerekben feltételezhetı védı és/vagy ölı hatására (antibiotikus, toxikus hatás) is, melyek esetleg szintén csökkenthetıek a nagyon reaktív reakciótermékek eliminálásával, mint pl. O3befogókkal. A legújabb vizsgálatok szerint a HCHO kulcsszerepet játszik az antibiotikumok hatásában. Tyihák és mtsai írták le, hogy a fitoalexin transz-rezveratrol mobilizálja a labilisan kötött endogén HCHO-molekulákat [124-126], valamint Koch és mtsai tapasztalták antraciklin vázas tumorgátlók esetében, hogy HCHO-val való konjugáltjuk sokkal hatásosabb [144].
2.5. Ábra Antibiózis A Penicillium gombatelep egy környezetében nem tudott elszaporodni a Staphylococcus aureus, mivel a Penicillium ezt meggátolta antibiotikum termelésével.
24
A biológiai rendszerekben hasonló körülmények között, antibiózis [145] során termelıdik toxin és antibiotikum. Az antibiózis (2.5. ábra) mikroorganizmusok közötti kapcsolat, amiben próbálják egymást elpusztítani vagy növekedésben, szaporodásban gátolni. Ennek érdekében termelhetnek másodlagos anyagcseretermékekként antibiotikumokat és/vagy toxinokat. Ezek tehát rokonvegyületek, mégis az ember szempontjából funkciójukban nagyon különbözıek. Meg kell azt is említeni, hogy a két vegyületcsoport teljesen nem elkülöníthetı, mivel pl. az ismert antibiotikum, a penicillin, toxikus az arra érzékenyek számára, s a toxinok pedig antibakteriális hatásúak, tehát antibiotikumok, ha nem a szó hétköznapi értelmét vesszük. Mindezek által felmerül a kérdés, hogy vajon a toxinok és az antibiotikumok hatásmechanizmusa mennyire hasonló, s a toxikus hatásban szerepet játszik-e a HCHO és reakciótermékei, mint azt egyes antibiotikumoknál tapasztalták.
2.5.2.
A
biológiailag
aktív
anyagok
vizsgálata,
a
BioAréna
rendszer
alkalmazhatósága Az elválasztástudományi technikák kifejlesztése a 20. század elején kezdıdött [146], az oszloprendszerő folyadék-kromatográfia felfedezésével (Michail Cvet, 1903), de igazán lendületet csak a 30-as évektıl vett [147], amikor Cholnoky és Zechmeister „újra felfedezte”, s leírta azt (Cvet nevezetes disszertációjával együtt). A rétegrendszerő folyadékkromatográfiás technikák közül a papírkromatográfiát próbálták elıször alkalmazni a 20. század elején, de igazán elıször az 1940-es években Martin és mtsai [148] írták le, fejlesztették módszerré. A rétegrendszerő folyadékkromatográfiás rendszerek gyors fejlıdése eredményezte az Ismailov és Schraiber [149] valamint Békésy [150] nevéhez főzıdı vékonyréteg-kromatográfia (TLC) feltalálását, melyet Kirchner és mtsai tökéletesítettek [151], Stahl és mtsai pedig standardizálták és így elterjedt az egész világon [152]. A rétegrendszerő folyadék kromatográfia fejlıdésében további nagy elırelépést a túlnyomásos rétegkromatográfia (OPLC) kifejlesztése jelentette, melyet Tyihák Ernı, Mincsovics Emil és Kalász Huba írtak le elıször [153-155]. Az OPLC integrálja a TLC - nagy hatékonyságú
vékonyréteg-kromatográfia
(HPTLC)
és
a
nagyhatékonyságú
folyadékkromatográfia (HPLC) [154, 156, 157] elınyeit. A TLC-re jellemzı, hogy a mozgó fázis migrációja a kapilláris erık hatására következik be, ezért a vándorlási sebesség idıben négyzetesen csökken a gızfázissal való érintkezésbıl adódó aktivitáscsökkenés miatt. A kis oldószer igény és a nagy minta áteresztıképesség (párhuzamosan több minta is futtatható) már jellemzı az OPLC-re is, mely egy kényszeráramlásos planáris rétegkromatográfiás technika. A
25
szélein lezárt réteglap külsı nyomás segítségével le van fedve egy inert, rugalmas lappal, s a mozgó fázist pumpa segítségével áramoltatják át a rétegen. Ezzel elérjük a gızfázis teljes eliminálását, valamint, hogy a mozgófázis áramlási sebessége lineáris. Minél nagyobb a külsı nyomás (max. 50 bar jelenleg), annál nagyobb áramlási sebességet alkalmazhatunk, ami különösen elınyös a HPTLC, vagy annál kisebb részecskemérető rétegeknél, ahol alapvetıen kisebb áramlási sebesség érhetı el a TLC-hez képest. A rövidebb analízis idı által csökken a foltok diffúziója is. A lineáris sebesség biztosítja, hogy az egész rétegen konstans a felbontás. Off-line mintafelvitel (a rétegre csöppentve) esetén az optimális nyomás és sebesség megválasztásával nem csak a hatékonyság növelhetı, hanem az elválasztás során fellépı zavaró tényezık is kiküszöbölhetık, mint az oldószer (n oldószerbıl álló elegynél n front) és a teljes nedvesedési frontok okozta problémák. Az on-line mintafelvitel (az eluensbe vezetjük) és detektálás (lefuttatva a rétegrıl, átfolyó cellás detektorral) kombinálásával a HPLC-vel analóg módszert kapunk [158, 159]. TLC-HPTLC-vel összehasonlítva, az OPLC-s elválasztás felbontásban, hatékonyságban való növekedést, kompaktabb foltokat, s ez által érzékenyebb detektálást eredményez. Az elválasztástudományi technikák 1950-es évektıl való robbanásszerő fejlıdése segítséget nyújtott a gyógyszerkutatásban és a biotechnológiában, s lehetıvé tette a biológiai felfedezések meggyorsítását. Például az antibiózis ismerete által új antibiotikumokat fedeztek fel, mely nagy jelentıséggel bír a gyógyszerkutatásban, mivel a patogének antibiotikumokkal szembeni rezisztenciája egyre nagyobb problémát jelent mind az állati mind az emberi antimikrobiális terápia területén. Ez sarkallja a kutatókat új növényekbıl, mikroorganizmusokból, vagy kombinatórikus kémia nyújtotta választékból származó antibiotikus hatású anyagok keresésére. Ehhez gyors, gazdaságos, könnyen kiértékelhetı, de szelektív, s nagy áteresztıképességő módszerek szükségesek. A természetes eredető anyagok s a biológiai minták (pl. növényi extraktum) antimikrobiális hatásának tanulmányozására többféle in vitro szőrıvizsgálat ismert, mint a diffúziós, a hígításos módszerek és a bioautográfia [160-162]. A diffúziós módszer során a fertızött szilárd táptalajra kis térfogatú antimikrobiális hatású mintát adunk, mely elpusztítja a mikrobákat, így a felvitel környékén gátlási udvar keletkezik. A minta felvitele történhet papírkoronggal (korong módszer), vagy oldatként a rétegbe fúrt lyukba (lyukasztásos módszer), vagy üvegcsı segítségével adott helyre cseppentve (cilinder módszer). A hígítási módszer lényege, hogy a vizsgált anyagot (különbözı koncentrációban) a táptalajban oldjuk, annak megszilárdulása elıtt, majd a szilárd réteget megfertızzük, s nézzük, mi a legkisebb koncentráció, ahol van hatás. A bioautográfia széles körben alkalmazott eljárás, mely lehetıvé teszi az elválasztott biológiai
26
aktivitást mutató anyagok lokalizálását a rétegkromatogramon. A módszer legfıbb elınye azon felül, hogy a már felsorolt igényeknek megfelel, hogy különösen alkalmas biológiai mátrixokban található új vegyületek kimutatására [161]. A bioautográfiának 3 típusát Rios és mtsai [163] foglalták össze, melyek a következık: kontakt, immerziós és direkt. 1946-ban Goodal és Levi [164] alkalmazta elıször a bioautográfiát papírkromatográfiával, a penicillin tisztaságának ellenırzésére. Kontakt bioautográfiát használtak, azaz a kifejlesztett papírlapot ráhelyezték 15-30 percre egy fertızött agar rétegre, így biztosítva a vegyületek diffúzióját a papírról az agar rétegbe. A TLC-vel kombinált biológiai értékelést Fischer és Lautner [165] illetve Nicolaus és mtsai [166] vezették be 1961-ben immerziós módszert alkalmazva, mely során az agart ráöntik a kifejlesztett TLC rétegre, majd megszilárdulás után megfertızik. Mindkét esetben a gátló zóna könnyen láthatóvá tehetı megfelelı vitális festékkel. Napjainkban
leggyakrabban
a
direkt
bioautográfiát
alkalmazzák,
melyben
a
mikroorganizmust közvetlenül a kifejlesztett réteg felületére juttatjuk merítés vagy permetezés segítségével. A fertızött réteget inkubáljuk megfelelı körülményt biztosítva a mikroorganizmus növekedéséhez. Az anyagok antimikrobiális hatása vitális festékkel láthatóvá tehetı, mely szintén merítéssel vagy permetezéssel kerül a réteglapra. Az eredmény szkenneléssel, fénymásolással vagy fényképezéssel dokumentálható. Tehát a direkt bioautográfiában a mikroorganizmusok közvetlenül a TLC lemezen nınek, s a módszer minden lépése (elválasztás, fertızés, sejtszaporodás, láthatóvá tétel) a rétegen történik. Nyilvánvaló, hogy oszlop technikák nem használhatók bioautográfiára, csak a nyitott, sík elrendezéső szorbenságy alkalmas az eljárás végrehajtására. A gátló illetve serkentı zóna könnyen láthatóvá tehetı megfelelı elıhívó vegyülettel. Elsısorban dehidrogenáz aktivitást detektáló reagenseket alkalmaznak, mint pl. az MTT (tetrazólium só), melyet a metabolikusan aktív mikroorganizmus képes intenzív színő MTTformazánná redukálni [167, 168]. A detergens jelenléte, mint pl. a Triton X-100, segíti a só redukálását, illetve stabilizálja, diszpergálja a keletkezı formazánt [169]. NADH NADH + MTT
dehidrogenáz
MTT-formazán + NAD+
Az eljárás során az antimikrobiális azaz gátló hatást fehér folt vagy sáv jelzi, míg a serkentı hatást az intenzívebb színő foltként vagy sávként jelenik meg a háttér színéhez képest. Biolumineszcens baktérium alkalmazása esetén nem kell festenünk, mert lumineszcencia
27
mértéke arányos az élı sejtek számával, így annak hiánya jelzi az antibakteriális hatású anyagot [170]. A direkt bioautográfia fı alkalmazási területei az új antibiotikus hatású anyagok keresése mellett, a biológiailag aktív anyagok vizsgálata különbözı mintákban (pl. szennyvíz, ivóvíz, étel, takarmány stb.), az antibiotikumok minıségi ellenırzése, a növényi patogének elleni hatásos antimikrobiális anyag keresése, valamint a toxikus anyagok detektálása és meghatározása [160]. Rios és mtsai [163] írták le összefoglalójukban a módszer standard eljárásként való használatának nehézségeit, a sok befolyásoló faktor miatt. Az optimális kromatográfiás eljárás és biológiai értékelés használata alapvetı a korrekt bioautográfiás kiértékeléshez. Az alapvetı tényezık [161, 162] között említhetı, hogy a növényi kivonatot milyen oldószer eleggyel készítjük, a kapott minta milyen koncentrációban tartalmazza a vizsgálni kívánt anyagot, azaz milyen térfogatú mintát kell a rétegre felcseppenteni a minimális detektálási mennyiség eléréséhez. Fontos a rétegkromatográfiás kifejlesztéshez alkalmazott technika (TLC, HPTLC, OPLC), az álló és a mozgó fázis kiválasztása a megfelelı hatékonyságú elválasztás érdekében. Továbbá mikrobiológiai szempontból lényeges, hogy milyen tesztmikroorganizmust alkalmazunk, annak milyen körülményt kell biztosítanunk az inkubáció során való szaporodásához. Az OPLC-s elválasztás korábban felsorolt elınyös tulajdonságaiból következik, hogy a bioautográfiában való alkalmazása célszerőbb a konvencionális réteg rendszerő elválasztásokkal szemben, különösen extraktumok, vagy több vegyület együttes vizsgálata esetén.
2.6. ábra A BioArénában végzett kísérletek lépései
28
A BioAréna [126, 171-175] (2.6. ábra) egy komplex bioautográfiás rendszer, mely a sejtszaporodást serkentı vagy gátló hatású anyagoknak nem csak a kimutatását, hanem hatásmechanizmusának vizsgálatát is lehetıvé teszi. A BioArénában fertızhetünk nekrotróf és/vagy biotróf kórokozóval ill. más mikroorganizmussal, változtathatjuk az inkubációs idıt (pl. a rövidebb inkubációs idı alkalmazásánál sokkal érzékenyebb a biotróf gombaspóra), s a rétegen lévı változásokat akár 5-6 napig figyelhetjük. Továbbá, ami talán a legfontosabb az antimikrobiális hatás mechanizmusának vizsgálata szempontjából, hogy különbözı endogén (sejtazonos) és/vagy exogén (sejtidegen) vegyületek hatását vizsgálhatjuk az elválasztott komponensek biológiai aktivitására, ha oldjuk ıket a sejt szuszpenzióban fertızés elıtt, s így eljuttatjuk a kromatográfiás foltokhoz is. Az antibiotikus hatású anyagok BioArénában való vizsgálatához is meghatározó a megfelelı rétegkromatográfiás módszer kifejlesztése. A mikotoxinok karcinogén tulajdonsága miatt, alapvetı fontosságú a kimutatásuk és mennyiségi meghatározásuk élelmiszerekben és tápanyagokban. E célra alkalmas a TLC, melyet széles körben használnak, Ennek köszönhetıen különféle futtató rendszereket fejlesztettek ki különbözı mintákból származó aflatoxinok illetve ochratoxinok elválasztására elsısorban szilikagél állófázist alkalmazva. A módszereket 1985-ben Betina [176], majd 2000-ben Sherma [177] foglalta össze. A teljesség igénye nélkül látható néhány szilikagél rétegen alkalmazott kifejlesztı elegy az 1. táblázatban.
1. táblázat Az aflatoxinok és az ochratoxin A elválasztására alkalmazott fı kifejlesztı elegyek szilikagél állófázis esetén aflatoxinok
ochratoxin A
Kloroform–metanol 97:3 (v/v)
Toluol–etil-acetát–hangyasav 5:4:1 (v/v/v)
izopropanol–aceton–kloroform 5:1:85 (v/v/v)
Benzol–ecetsav 3:1 (v/v)
kloroform–aceton 9:1 (v/v)
benzol–ecetsav–metanol 90:5:5 (v/v/v)
benzol–ecetsav–metanol 90:5:5 (v/v/v)
hexán–aceton–ecetsav 18:2:1 (v/v/v)
toluol–izo-amil-alkohol–metanol 90:32:3 (v/v/v)
OPLC-s módszert mikotoxinok elválasztására eddig csak fumonizinek [178] és aflatoxinok [179-183] esetében fejlesztettek ki.
Kétlépéses módszert (rétegen tisztítás és elválasztás)
dolgoztak ki Kátay és mtsai [178] fumonizin B1, B2, B3, és B4 fuzárium toxinok fordított fázisú rétegen való elválasztásra, melynek segítségével Fusarium gombatenyészetek toxintermelı
29
képességét vizsgálták. Az aflatoxinok OPLC-s elválasztását és kvantitatív denzitometriás meghatározását 1985-ben Gulyás [184] írta le elıször. Az aflatoxinok különbözı élelmiszerekben (kukorica, búza, mogyoró, hal, rizs és napraforgó mag) való analízisére Papp és mtsai [179-183] dolgoztak ki kétlépéses OPLC-s módszereket. Az elsı lépésben egy fordított irányú dietiléter–n-hexán (1:1 v/v) futtató eleggyel való kifejlesztéssel a minta tisztítását végezték el, majd a mátrixtól függıen kloroform–toluol–tetrahidrofurán (10:15:1 v/v/v) vagy (15:15:1 v/v/v) oldószer elegyet alkalmaztak AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2 elválasztásához. Kontakt bioautográfiás detektálást Koshinsky és mtsai [185] alkalmaztak a trichotecének csoportjába tartozó nem UV aktív T-2 és annak bomlásterméke, a HT-2 mikotoxinok kimutatására, melyek gátlást mutattak Saccharomyces cerevisiae és Kluyveromyces fragilis élesztıgombákkal szemben. A T2 toxin kvantitatív meghatározását a már korábban Betina [186] által leírt legegyszerőbb és leggyakrabban alkalmazott kvantitatív bioautográfiás analízissel végezték, a gátlási zóna átmérıje alapján végrehajtott számolással, mely érték közelítıen arányos a foltban lévı anyagmennyiséggel. Koshinsky és mtsai logaritmikus összefüggést tapasztaltak a koncentráció és a gátló zóna területe között, melyet denzitometriás értékeléssel (λ=610 nm) határoztak meg. Az aflatoxinok és az ochratoxin A jelenlétének kimutatására is alkalmaztak mikrobiológiai eljárásokat [187-190]. Általában a papírkorongos módszert alkalmazták, azaz érzékeny mikroorganizmussal (Bacillus stearothermophilus [190], Bacillus megaterium [187], Bacillus cereus mycoides [188]) fertızött agar rétegre papír korongot helyeztek, mely tartalmazta a teszt anyagot vagy a mintát. A festékkel láthatóvá tett, agar rétegbe átdiffundált antimikrobiális anyag okozta gátló zóna mérete arányos az anyag koncentrációjával [188]. Duracková és mtsai [189] az AFB1 rétegkromatográfiás elválasztásának kimutatására Artemia salina lárvákat használt fel. A kifejlesztett (kloroform–metanol 4:1 v/v) rétegrıl a kromatográfiás sávot (1,5 cm x10 cm) 1,5 cm x1,5 cm-es négyzetekre vágták fel, s a lekapart adszorbenst lárvákat tartalmazó szuszpenzióhoz adták, s a lárvák halálozási arányát nézték. Az elválasztás és a biológiai értékelés közben lehetıség van a foltok in situ kvantitatív denzitometriás értékelésére, továbbá in és ex situ, kvalitatív és kvantitatív vizsgálatokra alkalmas különbözı spektroszkópiás (vizuális, UV fény, OPLC- FTIR, MS, HPLC-MS) módszerek alkalmazására. A BioAréna különösen alkalmas antimikrobiális anyagok kölcsönhatási reakcióinak, ezáltal hatásmechanizmusának vizsgálatára rétegkromatográfiás kifejlesztés után a szorbenságyban. A sejt szuszpenzióba különbözı adalékanyagokat oldva, befolyásolható a HCHO szintje, ezáltal a H2O2-vel való reakciójából keletkezı reaktív anyagok mennyisége. Ebbe a reakciósorba nemcsak
30
a kezdeti lépésben lehet beavatkozni, hanem késıbb, pl. az O3 befogásával is. Ezáltal a BioAréna lehetıséget nyújt az antimikrobiális mikotoxinok hatásmechanizmusának vizsgálatára, annak eldöntésére, hogy a HCHO szerepet játszik-e toxikus hatásukban.
2.5.3. A BioArénában, a sejt szuszpenzióhoz adagolt endogén és exogén anyagok 2.5.3.1. Formaldehidet különbözıképpen eltávolító anyagok Könnyő belátni, hogy végtelen nagy számú anyagot lehet – akár kombináltan is – a mikrobatenyészetben oldani, s így a kromatográfiás foltokhoz eljuttatni, pl. hatásmechanizmus vizsgálatokhoz. Ez érvényes jelen kísérleti sorozatra is. Az általam legjelentısebbnek talált anyagok jellemzıit az alábbiakban foglalom össze, várhatóan legkülönbözıbb eredményekhez fogunk jutni.
2.5.3.1.1. L-arginin Az L-arginin esszenciális aminosav, szükséges a mikrobák, a növényi és állati sejtek normális metabolizmusához, befolyásolja a sejthalált és a sejtszaporodást is [191]. Megvonása súlyos zavarokat okoz a sejt és a szervezet funkciójában, mely halálhoz vezethet. Ezért már korábban felvetıdött, hogy az L-arginin koncentrációjának változtatása befolyásolja a tumoros sejtek szaporodását is. Az L-arginin megvonás gátolta a HeLa sejtek szaporodását in vitro és patkány Novikoff hepatomát in vivo [192], valamint növelte a 3T3 sejtek pusztulását [193]. Tizenegy esszenciális aminosavat vizsgálva [194-197], ezek megvonása apoptotikus-szerő sejthalált okozott tumoros sejtekben. Ez a folyamat az L-arginin esetében volt a leggyorsabb. Egészséges és tumoros sejteket együtt vizsgálva, az L-arginin megvonását a normális sejtek túlélték, míg a rákosak elhaltak, tehát hatása szelektívnek mutatkozott a rákos sejtekkel szemben. Ezen eredményekbıl kiindulva vizsgálták az L-arginin mennyiségét csökkentı argináz enzim szerepét humán rákterápiában [198]. Limfómás kutyákat arginin-felesleg mellett doxorubicinnel kezelve, meghosszabbodott a betegségmentes idıszakuk és az élettartamuk [199]. Weisburger és mtsai megfigyelték, hogy az arginin-glutamát
csökkentette
a
különbözı
acetamin-származék
karcinogén
hatását
patkányokban [200]. Ebbıl következıen, daganatos betegeknek arginin-gazdag étkezést ajánlottak a rákellenes kemoterápiával kombinálva [201]. In vivo kísérletekben azonban a nagy
31
dózisú L-arginin segítette a Yoshida illetve Ehrlich rosszindulatú daganat fejlıdését Wistar patkányokban [202]. Az ellentmondásos hatásait az aminosav különféle metabolikus utjai magyarázhatják, köztük a nitrogén-monoxid (NO) képzıdés [203] és a különösen fontosnak tőnı metilezési és hidroximetilezési reakciók [112]. A sejtekben az L-argininbıl NO képzıdhet. A folyamat során az NO-szintáz katalizátor hidroxilezi az L-arginint, majd az N-hidroxi-L-arginin további oxidációjából citrullin és NO keletkezik [203]. A NO kétarcú molekula, befolyásolja a sejtszaporodást és a sejthalált is, részt vesz a sejt védekezı vagy szabályozó funkcióiban, de nagy mennyiségben citotoxikus hatású [204].
2.7. ábra Az L-arginin és a formaldehid reakciója Az L-arginin guanidin csoportja képes megkötni egy, kettı vagy három HCHO molekulát, s spontán, vagy a transzmetiláz enzim által katalizált reakcióban a viszonylag stabilis mono-, di-, illetve tri-hidroximetilezett L-arginin származékok keletkeznek (2.7. ábra) [105]. A reakció végbemenetelét
modellreakcióban,
L-arginin
és
HCHO
elegyében
is
bizonyították,
tömegspektrométerrel azonosítva a hidroximetilezett származékokat, majd kimutatták e vegyületek jelenlétét karalábé kivonatban is [104]. A hidroximetil csoportok reverzibilisen kapcsolódnak az L-arginin guanidin csoportjához [110], a hidroximetilezett L-arginin demetilezése közvetlenül HCHO-t generál, ami felelıs lehet az apoptotikus hatásért [80, 205]. Vagyis az L-arginin HCHO befogó molekulának tekinthetı.
2.5.3.1.2. Redukált glutation A GSH tripeptid, azaz 3 aminosavból (cisztein, glutaminsav és glicin) álló molekula, mely megtalálható a sejtekben. Különbözı sejt funkciókban van szerepe, mint aminosav transzport és koenzimek termelése, valamint sok toxikus anyag detoxifikációjában is részt vesz, kötıdik
32
nehézfémekhez, mikotoxinokhoz (pl. AFB1, AFG1 [14] és OA [51]), peszticidekhez, oldószerekhez, s vizelettel vagy epével ürülı adduktot képez velük. Fontos azonban megjegyezni, hogy egyes anyagokkal képzett konjugátuma is lehet toxikus, így ez esetben a folyamat nem nevezhetı detoxifikálásnak. A GSH fontos intracelluláris antioxidáns, mely redox pufferként mőködik óvva a redukált intracelluláris környezetet. Csökkenti a reaktív oxigén fajták szintjét, így védı hatást mutat a daganatos betegségek néhány formája ellen és a szív és érrendszeri betegségekkel szemben is [206]. Számos betegség esetén, mint a rákformák, vírus fertızés és immunbetegségek vizsgálata során, alacsonyabb GSH szint tapasztalható, aminek a nagyobb mennyiségő reaktív oxigén fajták képzıdése lehet az oka. A sejten belüli GSH és a diszulfid formájú glutation (GSSG) arányának változtatása képes hatni a jelzı (szignál) pályákra, mivel a cisztein rész fontos szerepet játszik a redox jelzésben, mert fı célpontja az oxidatív módosításoknak. Így a glutation különféle fiziológiai válaszokban vesz részt a sejtszaporodástól a gén kiválasztáson át a programozott sejthalálig [207]. Sejtkultúrán végzett kísérletben a GSH megvonás sejthalált eredményezett [208]. Neuron sejtek mitokondriumában és citoplazmájában a GSH megvonása, a reaktív oxigén fajták mennyiségének növekedését, a transzmembrán potenciáljának megváltozását és a mitokondrium mőködésének gyors hanyatlását eredményezte [209, 210].
2.8. ábra A redukált glutation formaldehiddel való reakciója AFB1-gyel kezelt patkányok májában [211], valamint patkánymáj sejt kultúrában [212] a nagyobb mértékő citotoxicitással párhuzamosan az antioxidánsok, mint a GSH szintje szignifikánsan csökkent, jelezve, hogy az AFB1 oxidatív stresszt generál. Ezt az apoptotikus hatást tudták redukálni melatoninnal illetve antioxidáns kapacitással rendelkezı növényi kivonattal, melynek adagolásával elérték az antioxidánsok mennyiségének és aktivitásának növekedését, a lipid peroxidáció, az oxidatív stressz visszaszorítását. Hasonló eredményt kaptak
33
OA-val való inkubálást követıen in vitro patkány [213] és in vivo egér [214] máj sejtekben is, ahol szintén csökkent a GSH szintje, aktivitása. A HCHO nagyon gyorsan képes nukleofilekhez kapcsolódni, mint pl. a GSH-hoz [106], Shidroximetil-glutationt eredményezve (2.8. ábra), mely HCHO dehidrogenáz által tovább alakul S-formil-glutationná. Az S-formil-glutationt bontja az S-formil-glutation hidroláz, így visszakapjuk a GSH-t s melléktermékként hangyasav keletkezik [215]. Annak ellenére, hogy a GSH általánosan a sejtek védelmi rendszerében játszik szerepet, a citokróm P2C9 enzimet tartalmazó NIH/3T3 sejtekben a GSH megvonás az OA citotoxicitásának csökkenését eredményezte [52].
2.5.3.1.3. L-aszkorbinsav Az AA ismert természetes antioxidáns (2.9. ábra). Kemoterápiában való használatát ajánlják, az irodalom azonban nagyon ellentmondásos a rosszindulatú daganatos betegségek és az AA kapcsolatát illetıen [216]. Az AA-ban gazdag gyümölcsök és zöldségek rendszeres fogyasztása védelmet jelent a daganatos és a szívbetegségek ellen, viszont in vivo kísérletek nem bizonyították az AA antioxidáns tulajdonságának szerepét ebben a jótékony hatásban [217]. Citotoxikus hatást mutatott egyes tumoros sejtekkel szemben, a rosszindulatú daganatok kialakulását megelızte, növekedését gátolta [216]. Mint sok más természetes antioxidáns, az AA is képes eltolni az antioxidáns-prooxidáns (reaktív oxigén molekulák képzıdését generáló hatás) egyensúlyt mindkét irányba. Prooxidáns hatást figyeltek meg kis koncentrációjú AA esetében [218-220], s ugyanúgy nagy koncentrációnál is képes oxidatív károsodást elıidézni nagy mennyiségő átmeneti fém (pl. Cu(II), Fe(III) ionok) jelenlétében [219]. OH O HO
OH
OH O - H+
O
HO
O
+ H+ pK=11.8
+ H+ HO
OH
-O
pK=4.1
O
HO
-O
OH AA-
L-aszkorbinsav AA
OAA2-e-
-eO
O
OH
O
HO -
O
H+ + H+
.O
OH
OH
OH HO
O
- H+
pK=-0.86
.O
O-
O
HO
O
-eO
O
2.9. ábra Az L-aszkorbinsav oxidációja
34
Az étkezés során bevitt AA csökkentette az aflatoxinok káros hatásait, mint a DNS addukt képzıdését [221], a mutagén aktivitást [221], a citotoxicitást [222] és a karcinogenitást [223]. In vitro kísérletekben az AFB1 és az AFG1 O-demetilezésének megnövekedését tapasztalták AAval etetett patkányok máj preparátumában, melyet a reakcióban melléktermékként jelentkezı nagyobb mennyiségő HCHO-val mutatták ki [224]. Az így keletkezı demetilezett aflatoxinok gyakorlatilag nem toxikusak [16]. Biológiai rendszerekben AA jelenlétében a H2O2 szint emelkedik [216], s feltételezhetıen az AA képes a HCHO szintjét csökkenteni [102, 225]. Modell rendszerben demonstrálták az AA és a HCHO közötti addíciós reakciót [225]. A reakció során az AA enediol csoportjának a keto-enol tautomerizmusa a keto forma felé tolódik el, a HCHO a C2 szénhez kötıdik, s hidroximetil csoportot eredményez, s végül győrős ketál szerkezet keletkezik (2.10. ábra). Trézl és mtsai [102], az L-lizin HCHO-val való reakcióját vizsgálva modell rendszerben, azt tapasztalták, hogy az AA képes teljesen gátolni az L-lizin spontán metilezését és formilezését, redukálva a HCHO-t etilén glikollá. In vitro kísérletben sikerült a HCHO-t máj homogenátumból eliminálni, kihasználva, hogy az AA képes kémiailag megkötni a HCHO-t [225]. OH
OH O
HO
O
HO
H
+ HO
OH
HO O
O
O O
C=O H O
CH2OH
O
OH
OH
CH2OH OH
2.10. ábra Az L-aszkorbinsav és a formaldehid közötti reakció [225]
2.5.3.1.4. Se(IV) ionok
A szelén (Se) minden élı szervezet számára nélkülözhetetlen, szükséges a megfelelı biokémiai és fiziológiai folyamatok fenntartásához. Sok fehérje (szelenofehérje) és enzim (szelenoenzim) építıköve, mint ahogy pl. az antioxidáns aktivitását a glutation peroxidázon keresztül fejti ki [226]. A megvonása Keshan betegséget okoz, míg a túlzott bevitele toxikus hatásokat eredményezhet emberben és emlısökben: pl. szırzet elvesztése, körömtöredezés, fokhagyma szagú lehelet és idegrendszeri elváltozások [227].
35
A Se rákgyógyászatban való alkalmazása is felmerült. Klinikai kísérletek bizonyítják, hogy a Se-vel való táplálék kiegészítés szignifikánsan csökkenti a prosztata, a vastagbél és a tüdırák valószínőségét [228]. A leghatásosabb kemopreventív Se vegyületek az emlıs ráksejtekkel szemben a Se-metilszelenocisztein és szelenobetain, melyek a monometilezett Se vegyületek prekurzorai az emberi szervezetben. A monometilezett Se vegyületek képesek tovább alakulni dimetilezett vegyületekké [228, 229]. A Se-ben gazdag növényekben (pl. brokkoli, fokhagyma, hagyma) épp a legérdekesebb, monometilezett Se vegyületek dominálnak, azaz ezért érdemes ezeket fogyasztani, mert nem kell a szervezetben a monometilezett vegyületek képzıdésére várni. A szerves és a szervetlen Se vegyületek metilezıdnek különbözı szervezetekben. A Se metilezıdése szerepet játszhat a kemopreventív hatásban, pl. megvédve ezzel a DNS-t az aberrált metilezıdéstıl, melynek mechanizmusa tisztázatlan [230]. A Pseudomonas syringe baktérium is metilezi a Se vegyületeket, pl. a Na-szelenitet, hogy eltávolíthassa a sejtbıl, kipárologtathassa dimetil-szelenid illetve dimetil-diszelenid formájában [231].
2.5.3.1.5. Dimedon
A mesterséges, exogén (sejtidegen) Dim általános aldehid-reagens. A HCHO-val irreverzibilis reakcióban reagál, s ezáltal alkalmas a HCHO mennyiségi meghatározására [84]. Két Dim molekula képes egy HCHO-t befogni, s egyesülve formaldemeton képzıdik (2.11. ábra).
2.11. ábra A dimedon és a formaldehid közötti irreverzibilis reakció egyenlete
36
2.5.3.2. Formaldehid prekurzorok 2.5.3.2.1. NG-monometil-L-arginin
Az L-arginin mind szabadon, mind fehérjében (peptidkötésben) kötött formában nagyon reaktív. HCHO-val spontán reakcióban is reagál, mely során hidroximetilezıdik [104]. Már kb. 40 éve felfedezték, hogy a fehérjék szerkezete megváltozhat pl. oldalláncaik poszttranszlációs átalakításával [232]. A metiltranszferázok két osztályát írták le emlısökben, melyek átviszik a SAM metil csoportját feltehetıen HCHO-n keresztül [92] az L-arginin guanidin csoportjára, katalizálva az NG-monometil-L-arginin (MMA) képzıdését fehérjékben [233, 234]. Az L-arginin metilezıdését elsısorban olyan fehérjék esetében észlelték, mint az RNS-kötı fehérjék és a hisztonok. Azonban az utóbbi idıben sok arginin-metilezett fehérjét találtak, melyek szerepet játszanak különbözı sejtben végbemenı folyamatban, mint a citokinek és az interferonok általi jelzésben, valamint a T-sejt jelzésben [235]. Az L-arginin metilezett és hidroximetilezett származékainak sejtszaporodás gátló hatását egészséges és tumoros sejtek esetében is leírták. Az MMA szignifikánsan gátolta a dohány szövet kultúra valamint a magról ültetett saláta gyökerének növekedését agar tápközegben [109]. Az NG-hidroximetil-L-arginin dózis-függıen szignifikáns gátlást, nagyarányú apoptotikus hatást mutatott in vitro különbözı tumoros egér és emberi sejtekben [205], valamint in vivo gátolta Swiss egerekben az Ehrlich hasi tumor növekedését [202]. Nagy argináz termelı MDH-MB-468 sejtek proliferációját gátolta az N-omega-hidroxi-L-arginin is s apoptózist indukált [193]. Az MMA hatását okozhatja az, hogy gátolja az NO képzıdését [203] L-argininbıl, mivel az L-argininhez hasonlóan képes a katalizátor aktív helyéhez kötni, annak szubsztrátja [236], így az NO-n keresztül befolyásolhatja a sejtszaporodást és a sejthalált [204]. Az MMA hatásának másik lehetséges módja abból adódik, hogy ezek a molekulák HCHO generátorok, s a metilezett Larginin származékok demetilezésébıl származó HCHO szintje döntıen befolyásolhatja a molekula hatását [104].
2.5.3.2.2. Nε-monometil-L-lizin
A szabad L-lizin amino csoportja spontán metilezıdhet és formilezıdhet [102, 104, 237], ami során potenciális HCHO elıanyagok, mint Nε-monometil-L-lizin (MML), di-, és trimetil L-lizin, valamint formil-L-lizin keletkezhet. Modell reakcióban, HCHO és lizin elegyében a labilis
37
hidroximetil-L-lizin közti termékbıl keletkeznek a metilezett lizinek [104]. A trimetil-L-lizin-t karalábé kivonatban [104] és bab növény levelében [237] is kimutatták. Az utóbbinál megfigyelték, hogy hısokk után a levélben megnıtt a HCHO mennyisége, míg ezzel párhuzamosan a mért N-metilezett HCHO generátorok, mint a trimetil-L-lizin szintje csökkent [237], jelezve, hogy az N-metil csoportok demetilezıdésével szabadult fel a HCHO, mint ahogy az MML enzimatikus dealkilezése során is HCHO szabadul fel [238]. Az Nα-acetil-L-lizin metilamid, mint a kötött formájú L-lizin modell vegyülete, hasonlóan metilezıdhet, mint a szabad L-lizin, bizonyítva, hogy a fehérjében kötött L-lizin is metilezıdhet [103]. A kötött formákból felszabaduló reaktív HCHO metilezheti, formilezheti illetve átkötheti a lizinben gazdag hisztonokat a DNS-ben és az RNS-ben, a gének kikapcsolását indukálva [140]. A hiszton metilezés általános reverzibilitását mostanában fedezték fel humán hiszton demetilázok azonosításával, melyek különbözı reakció mechanizmussal mőködnek [113, 239], katalizálhatják a biogén aminok vagy az N-metilezett fehérje szubsztrátok, pl. a hisztonok oxidációs reakcióit [240]. Az LSD1 flavin tartalmú fehérje specifikusan a mono- és di-metilezett hiszton H3-lizin4-et demetilezi oxidációs reakción keresztül, a JmjC részt tartalmazó fehérjék (pl. JHDM1A) szintén specifikusan bizonyos helyeken lévı lizineknél demetilezik a hisztonokat [113, 241]. A hiszton demetilezése során HCHO szabadul fel [113, 239, 241]. Az LSD1 által katalizált demetilezési reakció feltételezhetı mechanizmusa, melyet a HCHO keletkezésének tényébıl kiindulva írtak fel, a 2.12. ábrán látható [113].
2.12. ábra A hiszton demetilezésének feltételezett reakciója, melynek során formaldehid keletkezik [113] FAD – hidrogénátvivı koenzim
Az Nε-metilezett lizinek (mono-, di- és tri-) erısen befolyásolják a sejtszaporodást mind a növényi mind az állati szövetekben (az egészségesekben és a tumorosakban is). A trimetil-lizin különösen szignifikánsan növelte a sejtszaporodást [91, 104, 109, 242, 243], valamint védı
38
hatást mutatott abiotikus stresszel szemben [243]. Mind a védıhatásban, mind a sejtszaporodásban szerepet játszik a metilezett lizinek dealkilezésébıl származó HCHO is, így feltételezhetı, hogy ezek a metilezett vegyületek a HCHO-n keresztül érik el hatásukat. 2.5.3.3. A Cu(II) ionok jellemzıi
A nyomelemek, mint a Cu(II) ionok, fontos szerepet játszanak az élı szervezetben. Nyomnyi mennyiségő katalitikus jelenlétük nélkül sok alapvetı biokémiai reakció nélkülözhetetlen kofaktora hiányozna, de ha koncentrációjuk nagyobb, mint az optimális (természetes) szint, akkor toxikussá válhatnak a sejtekre, s károsíthatják a sejt összetevıket, betegségeket okozhatnak [244]. A Cu(II) mérgezı az alacsonyabb rendő szervezetekre. A baktériumok és más mikrobák elpusztulnak a rézedényben tartott vízben, a réz vegyületek általánosságban gátolják az algák növekedését, s a rézszulfát jól ismert fungicid (gombaölı), melyet pl. peronoszpóra ellen használnak a szılıben [244]. Ennek ellenére a réz ion esszenciális a növények, az állatok és az ember számára, hiánya a világszerte elterjedt anémia és neutropénia betegségek okozója [245]. A biológiai rendszerekben oxidált (Cu(II)) és redukált (Cu(I)) formában is jelen van, ami lehetıvé teszi, hogy kulcsfontosságú szerepe legyen a sejt fiziológiában, mint különbözı enzimek katalitikus kofaktora, szabad gyök fogó, s szerepet játszik a mitokondriális légzésben és a Fe(II) oxidációjában [244]. A réz ionok nagy reaktivitású oxigén fajtákat generálnak, melyek felelısek a membránokban lejátszódó lipid peroxidációért, a fehérjék közvetlen oxidációjáért és a nukleinsavak (DNS, RNS) károsodásáért [246]. Így a réz túladagolása is káros a szervezetre, mivel oxidatív stresszt idéz elı, s feltételezhetıen ez a hatása felelıs a különbözı kórok kialakulásáért, mint a rosszindulatú daganatok, az idegrendszer betegségei illetve az öregedés [247]. A Cu(II) ionok a két vegyértékő ionok közül a legnagyobb affinitással kötıdnek a DNShez, így gyorsítják a DNS oxidációját [248]. Az irodalomban találhatók adatok arra vonatkozóan, hogy a Cu(II) ionok milyen befolyással voltak az AFB1 és az OA aktivitására. Tengerimalacoknál figyelték meg a májkárosodás súlyosbodását, mikor az önmagában károsodást nem okozó mennyiségő rézzel együtt etettek AFB1-et, összehasonlítva a csak AFB1-et evıkkel [249, 250]. Ezzel szemben, antimutagén hatást mutatott patkány máj mikroszóma aktiváló rendszerrel kezelt Salmonella typhimurium baktériumban [251]. Feltételezték, hogy ez a hatás a Cu(II) ionok enzimekkel való kölcsönhatásán alapszik, befolyásolva az AFB1 reaktív metabolitjának enzimatikus keletkezését illetve detoxifikálását, csökkentve az AFB1 mutagenitását. A Cu(II) képes elısegíteni az OA
39
DNS károsítását, oxidálhatja azt OA-quinonná és hidroxilezett származékokká [252]. A Cu(II) hatása az OA aktivitására sztöchiometriai függést mutatott. Amikor a Cu mennyiségének aránya az OA-hoz képest 1 és 2 közötti volt, akkor mutatta a legerısebb szinergista hatást, viszont ennél több Cu(II) jelenlétében a hatás gyengébbnek mutatkozott. Korábban tapasztalták, hogy a réz növeli a csíraölı HCHO-kondenzátum antimikrobiális hatását fémfeldolgozás során alkalmazott folyadékokban [253]. Minden esetben a Cu(II) növelte a HCHO baktérium ellenes hatását, azaz bizonyították a réz és HCHO közötti szinergista hatást. 2.5.3.4. Különbözı típusú ózon eltávolító anyagok 2.5.3.4.1. Indigókármin
Az O3 gyorsan reagál az indigókárminnal, izatin-szulfonsavvá oxidálja (2.13. ábra), így az indigókármin alkalmas a biológiai rendszerben [137], a levegıben [254] vagy vizes oldatban [255] lévı O3 kimutatására. Azonban lehet más elfogadható magyarázata is az izatin-szulfonsav képzıdésének indigókárminból. Újabb eredmények bizonyítják, hogy ezt az átalakítást a szuperoxid is képes elvégezni [256], s a kék festéket más oxidánsok, mint a hipoklóros sav és a 1
O2 is kifehérítik [137, 257].
2.13. ábra Az indigókármin reakciója az ózonnal 2.5.3.4.2. A d-limonén
A monoterpén (R)-(+)-limonén (Lim) (2.14. ábra) természetes antioxidáns hatású vegyület, mely elsısorban a citrusfélék illóolajának összetevıje, elterjedten alkalmazzák italok, péksütemények, jégkrém és puding ízesítésére, illetve kozmetikumok illatosítására.
40
Mint számos, az élelmiszerekben megtalálható monoterpén, a Lim is rendelkezik tumorgátló hatással, s nem csak a rák kialakulásától és fejlıdésétıl véd, hanem a létezı rosszindulatú daganatot is képes visszaszorítani. Általánosan elfogadott sok rákfajta elleni kemopreventív hatása [258, 259]. In vivo kísérletben gátolta a tumor növekedést [260] és az áttételek kialakulását [260, 261], s hatása erısödött citotoxikus anyaggal való együttes kezelés során [260]. Inhalálással asztmára érzékenyített patkányok szervezetébe juttatva Lim-et (telítetlen), védı hatást mutatott az asztma tüneteivel szemben, míg a szerkezetileg hozzá közel álló, azonban telített eukaliptol illóolaj-összetevı hatástalannak mutatkozott [262]. A Lim gyulladásgátló hatását patológiai paraméterekkel, mint a kis hörgık és az ér körüli gyulladás megszőnésével is igazolták. Ez az eredmény is alátámasztja a hipotézist, mi szerint az asztma során a tüdıben lévı gyulladás kialakulásában részt vehet az O3 [262], mert a gyulladást meg tudták szüntetni az elektronban gazdag olefinnel, az O3-befogó Lim-mel. A Lim-nek kettı kettıs kötése van (2.14. ábra). O3-mal való reakciója a Criegee mechanizmus szerint zajlik le [263], s legalább 4 Criegee-féle karbonil-oxid köztitermék és más karbonil vegyületek, ozonidok, peroxidok keletkeznek [264, 265], melyek tovább alakulhatnak. Lim és O3 reakció elegyében különbözı karbonsav, keton és aldehid termékeket mutattak ki [264, 266]. A Lim, mint természetes O3-befogó molekula, eliminálja az O3-t a rendszerbıl, ezzel védi azt, viszont reakciójuk során erısen ingerlı anyagok keletkeznek, mint pl. HCHO vagy az akrolein [264, 266], melyek irritációt okoznak a felsı légutakban [266, 267].
2.14. ábra A d-limonén szerkezeti képlete
41
3. Célkitőzések Antibiózis során a mikroorganizmusok antibiotikumokat illetve toxinokat termelnek életterük bıvítése, illetve védelme céljából. E két vegyületcsoport tagjai rokonságuk ellenére merıben eltérı hatással rendelkeznek; a toxinok lehetnek pl. antibakteriális tulajdonságúak, azaz antibiotikumok, míg egyes antibiotikumok, mint pl. a penicillin lehet toxikus hatású az arra érzékeny egyedek számára. Munkám során az AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2, valamint az OA toxicitásának alapját képezı antibakteriális (antibakteriális-toxikus) hatását tanulmányoztam a BioAréna rendszerben Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola (Psm) bab kórokozó baktériummal szemben. A kísérletek elsısorban a formaldehid (HCHO) és a hidrogén-peroxid (H2O2) a BioArénában való elıfordulásának bizonyítását célozták, s e két molekula kölcsönhatási reakciójából származó szingulett oxigén képzıdésének igazolását. Vizsgálataim továbbá a szingulett oxigén által a víz oxidációját feltételezve, ez utóbbi reakcióból származó, s közvetetten jobban mérhetı, alapvetıen fontosnak tőnı ózon tanulmányozására irányultak. Munkám során a következı vizsgálati célokat tőztem ki: 1. Az AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2 elválasztására, valamint az OA kifejlesztésére egyszerő, gyors rétegkromatográfiás módszer kidolgozása, melyek segítségével kapott rétegkromatogramok a toxin foltokkal egy következı lépésben alkalmasak lehetnek a BioAréna rendszerben való felhasználásra hatásmechanizmus vizsgálatokhoz. 2. Az AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2, valamint az OA baktériumellenes hatásának vizsgálata a BioAréna rendszerben rétegkromatográfiás kifejlesztés után. A toxinok mennyisége, az inkubációs idı és a baktériumok életkora, mint az antibiotikus hatást befolyásoló tényezı vizsgálata. 3. A HCHO és a H2O2 kimutatása a BioArénában vizsgálatra kerülı réteglapokon (pl. inkubáció után). 4. Az aflatoxinok valószínősíthetı demetilezıdésének elméleti és spektroszkópiás tanulmányozása BioAréna rendszerben. 5. A BioArénás kísérletek során a baktérium sejt szuszpenzióban oldott HCHO-befogóeltávolító, HCHO prekurzor, HCHO-mobilizáló és O3-befogó-eltávolító anyagok hatásának vizsgálata a mikotoxinok antibakteriális-toxikus aktivitására.
42
4. Kísérleti rész 4.1. Anyagok A vizsgált mikotoxinok, az AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2, valamint az OA a Sigma Aldrich Rt. (Budapest, Hungary) terméke volt, melyeket kromatográfiás tisztaságú (LiChrosolv®), Merck (Darmstadt, Németország) gyártmányú metanolban oldottam.
4.1.1. A mikotoxinok rétegkromatográfiájához alkalmazott állófázisok, oldószerek és vegyszerek
Az OA és az AFB1 BioArénában való biológiai értékeléséhez TLC kifejlesztést alkalmaztam, melyhez Merck (Darmstadt, Németország) gyártmányú, 20 µm vastagságú, szilikagél (TLC silica gel 60 F254) adszorbensréteg-lapok (TLC-adszorbensréteg) szolgáltak [126, 268270] állófázisként. Az AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2-t a bioautográfián alapuló biológiai értékelése elıtt OPLC-s módszerrel választottam el. Az OPLC-kifejlesztésekhez az elıbb említett minıségő, általam elızetesen széleken lezárt (szélimpregnált) 20 cm x 20 cm-es réteglapokat alkalmaztam [6, 172, 268-271] állófázisként. A mikotoxinok kifejlesztéséhez alkalmazott oldószerelegyekhez használt kloroform, aceton és metanol kromatográfiás tisztaságú (LiChrosolv®), Merck termék volt. A kloroformból az etanolt analitikai reagens (a.r.) minıségő nátrium-hidrogénkarbonát (Reanal, Budapest) desztilláltvizes oldatával (0,5 %-os) távolítottam el. 50 ml kloroformot 3x100 ml nátriumhidrogénkarbonát oldattal kiráztam, majd a nyomokban benne maradt víz eltávolítására kristályvízmentes a.r. tisztaságú nátrium-szulfátot (Fisher Scientific UK Ltd., Loughborough, Nagy-Britannia) alkalmaztam.
4.1.2. A biológiai értékelés során alkalmazott baktérium sejttenyészet és vegyszerek A mikotoxinok mikroorganizmusokkal szembeni hatását Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola (Psm) bab kórokozó baktérium 6. rasszán (Biológiai Tudományok Tanszéke, Wye, Londoni Egyetem, Nagy-Británnia) vizsgáltuk. A baktériumokat King’s B tápoldatban (1,5 g/l K2HPO4, 10 g/l glicerin, 20 g/l Proteose pepton (Sigma Rt., St. Louis, Amerikai Egyesült
43
Államok), 1,5 g/l MgSO4 × 7H2O, pH = 7,0) [272] tenyésztettük az MTA Növényvédelmi Kutatóintézetében. A mikotoxinok antibakteriális hatásának befolyásolására felhasznált L-arginin (> 98 %), redukált glutation (> 98 %, γ-Glu-Cys-Glu), (R)-(+)-limonén (> 97%), indigókármin (> 75%) és a.r. minıségő dimedon (5,5-dimetil-1,3-ciklohexándion) Sigma (St. Louis, Amerikai Egyesült Államok) termék volt, az a.r. minıségő L(+)-aszkorbinsav, nátrium-szelenit és kristályvizes rézszulfát Reanal (Budapest, Magyarország) gyártmányú volt, s a szintén a.r. minıségő NGmonometil-L-arginin és Nε-monometil-L-lizin vegyszereket pedig a Serva (Heidelberg, Németország) állította elı [126, 172, 268-271]. A mikotoxinok hatásának láthatóvá tételére a.r. tisztaságú MTT (3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]2,5-difenil-tetrazólium bromid) vitális festék reagens (Sigma) szolgált, melynek vizes oldatához Triton X-100 tapadószert is adagoltam [126, 172, 268-271].
4.1.3. A HCHO mérésére alkalmazott állófázis és vegyszerek A biológiai rendszer HCHO szintjének méréséhez a.r. minıségő dimedont alkalmaztam. A HCHO Dim adduktját (formaldemeton) a.r. minıségő kloroformmal (Reanal, Budapest, Magyarország) extraháltam a fertızött rétegrıl lekapart adszorbensrıl. A mennyiségi meghatározására szilika-gél állófázison (TLC silica gel 60 F254) végzett TLC kifejlesztés, majd ezt követı denzitometriás értékelés szolgált [271, 273]. A kifejlesztéshez a.r. minıségő, Reanal (Budapest, Magyarország) gyártmányú kloroformot és diklór-metánt elegyítettem. Az azonosításhoz szükséges formaldemeton tesztanyagot (1,1’,3,3’-tetraketo-5,5,5’,5’-tetrametil2,2’-diciklohexil-metán) az MTA Növényvédelmi Kutatóintézete laboratóriumában állították elı és tisztították (99,2 %, OPLC) [271, 273].
4.1.4. A H2O2 mérésnél alkalmazott vegyszerek és oldószerek A méréshez szükséges enzimcella elkészítéséhez mikrobiológiai tisztaságú szarvasmarha szérum (Bovine serum) albumint (Phylaxia), fehérjemembránt (sertésvékonybél, kereskedelmi), kataláz enzimet (E.C.1.11.1.6., 2390 U/g, Bovine Pancreas, Sigma Chemical Co., St. Louis, MA, USA) és a.r. minıségő glutáraldehidet alkalmaztunk [274, 275]. A mozgó fázis Carlo Erba (Milano, Olaszország) gyártmányú, HPLC minıségő szerves oldószerekbıl készült, melyben ferrocén-monokarbonsavat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MA, USA), mint vezetısót
44
oldottunk. A minta elıkészítéséhez, azaz a fertızött illetve baktérium-mentes vékonyrétegrıl lekapart adszorbens extrahálására acetát puffer (0,2 M, pH=6) szolgált, mely a.r. tisztaságú nátrium-acetátból készült.
4.1.5.
Az
Fourier-transzformációs
Raman
és
felületerısített
Fourier-
transzformációs Raman spektroszkópiás elemzésekhez alkalmazott oldószerek és vegyszerek Az ex situ Fourier-transzromációs (FT) Raman elemzésekhez a baktériummentes (kontroll) illetve a fertızött rétegrıl lekapart adszorbens réteget HPLC tisztaságú metanollal (Reanal, Budapest,
Magyarország)
extraháltuk.
A
felületerısített
FT-Raman
spektroszkópiás
felvételekhez használt spektroszkópiai tisztaságú fémezüst a Sigma (St. Louis, Amerikai Egyesült Államok) terméke volt [276].
4.2 Eszközök 4.2.1. TLC-, és OPLC-módszerekhez használt eszközök A HCHO mennyiségi meghatározásához a Linomat IV-Y (Camag, Muttenz, Svájc) készülékkel 3 mm sávszélességben [271,
273], a mikotoxinok rétegkromatográfiás
kifejlesztéséhez Hamilton (Bonaduz, Svájc) mikrofecskendıvel pontban vittem fel a toxinmintákat [126, 172, 268-271]. A hagyományos TLC elválasztásokat telítetlen kamrában (egyenes aljú, 200 mm x 100 mm mérető réteg kifejlesztésére alkalmas, vastag falú, fém fedelő Desaga kifejlesztı kád) [126, 268-270], az OPLC-kifejlesztéseket a Personal OPLC BS 50 (OPLC-NIT Kft.,
Budapest, Magyarország) önmőködı túlnyomásos rétegkromatográf
segítségével végeztem [6, 172, 268-271]. A kifejlesztett kromatogramokat érzékszervileg UV lámpa (Camag, Muttenz, Svájc) alatt (365 nm-en), mőszeresen pedig CS-930 (Shimadzu, Kyoto, Japán) pásztázó spektrofotométerrel értékeltem, mely alkalmas a kromatográfiás foltok UV-VISszínképének felvételére is [126, 172, 268-271].
4.2.2. A H2O2 méréséhez alkalmazott eszközök A minták H2O2 tartalmának meghatározását folyamatosan áramló rendszerben, injektálásos technikával végeztük. A rendszer (Központi Élelmiszer-tudományi Intézet, Budapest; Adányiné Kisbocskói Nóra dr.) (4.15. ábra) a következı részekbıl épült fel: HPLC pumpa (ESA, USA),
45
injektor, melynek mintahurkába lett az enzimcella beszerelve (Rheodyne Inc., Cotati, CA, USA), vékonyréteg típusú amperometriás cella (Mo. 5040, ESA, USA) és elektrokémiai detektor (ESA Coulochem II, USA) [274, 275].
4.15. ábra A H2O2 mérésére alkalmazott rendszer felépítése
4.2.3. Az FT-Raman és felületerısített FT-Raman elemzésekhez használt eszköz Az FT-Raman és felületerısített FT-Raman elemzéseket a Bio-Rad (Hercules, USA) cég FT-Raman spektrométere (Pannon Egyetem, Analitikai Kémia Intézeti Tanszék, Veszprém; Horváth Erzsébet dr.) segítségével végeztük, Nd–YAG lézert alkalmazva 500 mW teljesítményen [276].
4.3 Módszerek 4.3.1. A mikotoxinok rétegkromatográfiás kifejlesztése TLC-kifejlesztés: A BioArénában végzett kísérletek elsı lépése a vizsgálni kívánt anyagok, esetemben a mikotoxinok, vékonyréteg-kromatográfiás kifejlesztése. Ehhez 3 órán át 130 oC-on szárított TLC-minıségő szilikagél állófázist alkalmaztam [126, 172, 268-271]. Az AFB1, az AFG2 illetve az OA hagyományos rétegkromatográfiás kifejlesztését telítetlen kádban, szobahımérsékleten végeztem. A toxinokat 4 csoportban (4x3 pont) 0,1 0,5 és 1 µg mennyiségben, 20 cm x 10 cm mérető rétegre 1,2 cm magasságban, pontban vittem fel. A mintafelviteli pontok között 9 mm, a csoportok szélsı pontjai közt 22 mm, s a 2 szélsı pont és az adszorbens ágy széle között 31 mm volt. A kromatografálást a teljes szorbenságy hosszán, az AFB1 és AFG2 esetén kloroform-aceton 9:1 (v/v), az OA esetében kloroform-metanol 8:2 (v/v) mozgófázisok segítségével végeztem [126, 268-270].
46
OPLC-kifejlesztés: Az AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2 OPLC-s elválasztása elızetesen impregnálással széllezárt 20 cm x 20 cm mérető, szárított TLC szilika-gél réteglapon történt. Három csoportban (3x4 pont), a réteg alsó szélétıl 25 mm-re vittem fel pontban 1-1 µg toxint. A pontok között 12 mm, a csoportok szélsı pontjai közt 24 mm, a 2 szélsı pont és az adszorbens ágy széle között 22 mm távolság volt [6, 172, 268-271]. Az OPLC kifejlesztést az alábbi paraméterekkel végeztem el:
Mozgófázis
kloroform-aceton 9:1 (v/v)
Külsı nyomás
50 bár
Kezdeti térfogat
400 µl
Kifejlesztési térfogat
4500 µl
Áramlási sebesség Kifejlesztési idı
400 µl/min 685 s
A kifejlesztés után a réteglapokat megszárítottam hideg levegı áramban, hogy a biológiai értékelést esetlegesen zavaró oldószer molekulákat eltávolítsam róluk. A kromatogramokat érzék-szervileg 365 nm-es UV-fényben vizsgáltam, s aflatoxinok esetében 365 nm-en, OA esetében 330 nm-en végeztem el a denzitometriás értékelést. Ezután feldaraboltam a réteglapokat a biológiai értékeléshez. A hagyományos TLC-s kifejlesztés után 4 cm x 10 cm-es, míg az OPLC kifejlesztést követıen 6 cm széles lapokra vágtam fel a rétegeket.
4.3.2. Baktérium sejt szuszpenzió elıállítása A Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola baktérium sejtek King’s medium B agarlemezeken lettek tárolva. Szaporításuk King’s medium B folyékony táptalajon történt 28 oCon, vízszintes keverés mellett (170 rpm), míg el nem érték a késı exponenciális fázist (OD560nm=0,7 (optikai sőrőség)), mely kb. 1,5 x 109 sejt/ml sejtszámnak felel meg [126, 172, 268-271]. A sejt szuszpenzióhoz 50 % friss tápoldatot adtunk közvetlenül a felhasználása elıtt.
4.3.3. A biológiai értékelés menete A mikotoxinokat tartalmazó kifejlesztett, megszárított réteglapokat 20 másodpercre a baktérium sejt szuszpenzióba merítettem, majd mattá válásuk után inkubátorba kerültek,
47
megfelelı körülményeket (28
o
C, 100 % relatív páratartalom) biztosítva a baktériumok
szaporodására közvetlenül az adszorbens ágyban. Bizonyos inkubációs idı után (általában 2 óra), a mikotoxinok biológiai hatásának láthatóvá tételére, a bioautogramok 5 másodpercre MTT vizes oldatába (80 mg MTT és 100 mg Triton X100 100 ml vízben) lettek merítve, s ismét mattá száradva folytatódott az inkubáció. Az élı sejtek képesek redukálni a sárga MTT-t kék színő MTT-formazánná. Az élı sejtek száma és az MTT-formazán termelés, azaz a kék szín intenzitása között lineáris összefüggés van [169]. Ebbıl következik, hogy a háttérnél világosabb folt sejtszaporodás (anyagcsere) gátló, míg a sötétebb szín sejtszaporodás serkentı hatást jelez. A Triton X-100 diszpergálja és stabilizálja az MTTformazánt [169]. Az eredmény figyelemmel kísérése a festést követı 1 órán belül megkezdıdik, mikor a gátló zónák elıtőnnek, s esetenként 5-6 napig, vagy tovább tart, a foltok változásának folyamatos követésével. A dokumentáció a réteglap digitális fényképezésével, számítógépbe való beolvasásával, valamint a gátló zónák denzitometriás (λ=590 nm) kvantitatív értékelésével történik [126, 172, 268-271]. Különbözı anyagok, mint HCHO befogók, elıanyagok, mobilizáló, O3 befogók a mikotoxinok antibakteriális – toxikus hatására való befolyásának vizsgálata során a kísérlet menete az alábbiakban leírttal megegyezik, csak a réteg fertızése elıtt a baktérium sejt szuszpenzióhoz hozzáadagoljuk, feloldjuk benne a megfelelı endogén vagy exogén anyagot, melyeket a következı koncentrációkban alkalmaztam [126, 172, 268-271]:
L-arginin
1, 2, 4 illetve 8 mg/ml
redukált glutation
2 mg/ml
L(+)-aszkorbinsav
10, 50, 100 mg/100 ml
nátrium-szelenit dimedon G
N -monometil-L-arginin Nε-monometil-L-lizin kristályvizes réz-szulfát
0,1; 0,5 illetve 1 mg/100 ml 10 illetve 20 mg/100 ml 1 mg/ml 0,1; 0,5 illetve 1 mg/ml 5 mg/100 ml
indigókármin
20; 30 illetve 40 mg/100 ml
(R)-(+)-limonén
50; 250 illetve 500 µl/100 ml
48
4.3.4. HCHO mérés A biológiai rendszerben kötött formákból felszabaduló HCHO dimedon segítségével mérhetı. A dimedon irreverzibilis reakcióban képez adduktot a HCHO-val, mely során formaldemeton keletkezik [271, 273]. A BioArénában végzett HCHO vizsgálathoz 5-5 µg mikotoxint vittem fel a rétegre, s kádban, hagyományos TLC-s módszerrel kromatografáltam. A kifejlesztett rétegeket dimedont tartalmazó (40 mg/ 100 ml) baktérium sejt szuszpenzióba merítettem. 18 óra inkubációs idı után kapartam le a toxin foltot és egy vele azonos területő toxinmentes, kontroll foltot (kb. 1 cm2) Eppendorf csıbe. A lekapart adszorbenshez 75 µl kloroformot adtam, 10 másodpercig kevertettem (Vortex), majd egy nap szobahımérsékleten, sötétben való állás után újból megkevertettem (10 s). Centrifugálás (20 perc, szobahımérséklet, 10000 rpm) után a felülúszóból TLC-elemzéssel végeztem el a BioArénában keletkezett formaldemeton mennyiségi értékelését. Ezekben a mérésekben az állófázis TLC-minıségő szilikagél, a mozgófázis kloroform―diklórmetán = 35 : 65 arányú térfogatelegye [149] volt. A mintákból 3 mm sávszélességben 25-25 µl-t, formaldemeton tesztanyag metanolos oldatából 2 µg-nak megfelelı mennyiséget vittem fel 20 cm x 10 cm mérető rétegre 12 mm magasságban. A sávok között 8 mm, a szélsı sáv és a réteg széle között 20 mm távolság volt. A kifejlesztést telítetlen kádban, a szorbens ágy teljes hosszában (10 cm) végeztem. Kifejlesztés után a kromatogramokat 5 percig szárítottam hideg levegıárammal, majd érzékszervileg 254 nm-es UV-fényben vizsgáltam. A foltok színképének felvétele (a kapott színképeket az azonosítás mellett a megfelelı kiértékelési hullámhossz megállapítására használtam) után a mőszeres kvantitatív kiértékelést 265 nm-es hullámhosszon végeztük [271, 273].
4.3.5. H2O2 mérés A H2O2 szintjének BioArénában való meghatározásához a következı mintaelıkészítést alkalmaztam: a 2-2 µg mennyiségő toxinokat 1,5 cm-es sávszélességben vittem fel a rétegre, s a kromatogramot a 4.1.1 fejezetben leírtak szerint hagyományos TLC módszerrel fejlesztettem ki. A hideg levegıáramban való szárítása után a réteget desztillált vízbe (viszonyítónak) vagy Psm sejt szuszpenzióba merítettem. 1 vagy 18 óra inkubáció (a baktérium szaporodásának megfelelı körülményeket biztosítva) után a nedves rétegekrıl lekapartam Eppendorf csıbe a toxin foltját, illetve egy vele azonos területő toxinmentes foltot. A lekapart adszorbenshez 100 µl vizes
49
nátrium-acetát puffert (0,2 M, pH=6) adtam, 10 másodpercig kevertettem (Vortex), majd 10 perc centrifugálás (5 oC, 10000 rpm) után a felülúszót külön Eppendorf csıbe téve lefagyasztottam. A minták csak közvetlen a mérés elıtt lettek kiolvasztva. A kiolvasztást követıen az oldatokból (acetát pufferes) 10-10 µl-t 1990 µl vezetısó tartalmú acetonitrilhez (0,75 mg ferrocén-monokarbonsav 100 ml acetonitrilben) adtam. Így 0,5 % acetát puffer tartalmú mintákat kapunk. Az acetát puffer mennyisége fontos, hogy az enzim megırizhesse aktivitását és ne denaturálódjon. A mérés alapjául a H2O2 katalitikus bontása szolgál, mely kataláz enzim segítségével megy végbe. Az eredeti minta (a mintahurokban, azaz az enzimcellában csak pillanatokig tartózkodott), és a két percet kataláz enzim jelenlétében töltött (2 percet állt a mintahurokban, azaz az enzimcellában) minta amperometriás jelének a különbsége valamint a mintában található H2O2 mennyisége között lineáris összefüggés van [274, 275]. A HPLC mintahurkába bekötött enzimcellában a kataláz enzim a következık szerint lett rögzítve [274, 275]: 30 mg kataláz enzim és 5 mg bovin serum albumin 200 µl nátrium-acetát pufferrel valamint 50 µl 2,5 %-os glutáraldehiddel lett összekeverve, s felvittük egy természetes fehérjemembránra, mely 2 teflonlap közé lett kifeszítve. Az alsó tömör, míg a felsı (a membrán azon oldala, ahova fel lett vive az enzim) teflonlapon egy 120 mm hosszú, 2,5 mm széles U alakú járat lett kialakítva. E járatban áramlik és kerül kölcsönhatásba az oldat a rögzített enzimmel. A HPLC pumpával áramoltatott oldószerelegy 0,75 mg/100 ml ferrocén-monokarbonsavat (vezetısó) és 0,5 % 0,2 M-os pH=6-os acetát puffert (enzim aktivitásának megırzésére) tartalmazó acetonitril volt. Szobahımérsékleten, 0,8 ml/perc áramlási sebességet alkalmazva végeztük a méréseket [274, 275]. A 0 illetve 2 percet az enzimcellában töltött minták amperometriás jeleit +590 mV polarizációs feszültség mellett mértük, így követve a H2O2 fogyását. Ezzel a módszerrel kiszőrhetı az adalékanyagok illetve egyéb elektrokémiailag aktív anyagok hatása.
4.3.6. FT-Raman és felületerısített FT-Raman elemzések FT-Raman és felületerısített FT-Raman elemzéshez 5-5 µg AFB1-et vittem fel TLC minıségő szilikagél rétegre, s hagyományos TLC módszerrel kromatografáltam. In situ elemzésekhez baktériummentes (viszonyító) és 18 órás inkubációs idı után megszárított fertızött
50
(nem festett!) rétegek toxin és háttérfoltjairól készültek spektrumok. A felületerısített FT-Raman kísérletekhez a vizsgált foltra Ag szol (10-5 M) lett csöppentve, majd rászárítva [276]. Ex situ felületerısített FT-Raman elemzésekhez a toxint tartalmazó, TLC módszerrel kifejlesztett, baktérium mentes kromatogramokról és a fertızött réteglapokról (nem festett, 18 órán át inkubált) lekaparással eltávolítottuk a vizsgálni kívánt foltokat. Az Eppendorf csıbe lekapart adszorbenshez 500 µl metanolt adtam, s a keveréket 20 másodpercig rázattam (Vortex). 20 percen át tartó centrifugálást (szobahımérséklet, 10000 rpm) követıen 20 µl felülúszót adtam 200 µl ezüst szolhoz (10-5 M). A felületerısített FT-Raman elemzés elvégzése az extraktumot tartalmazó ezüst szol 2 órás szárítása után történt [276]. A méréshez szükséges ezüstszolt a módosított Lee és Meisel-féle eljárással állítottuk elı [277]. A felvételeket 500 és 4000 cm-1-es hullámszám tartományban végeztük. A felbontás 2 cm-1, a használt nyílás 4 mm átmérıjő volt. A szoftver 3000 felvétel átlagából számította ki a végleges színképet [276].
4.3.7 Az aflatoxinok demetilezési reakciójának kvantumkémiai vizsgálata A számításokat a Gaussian 98 programcsomaggal [278] hajtottuk végre. Töltéssőrőség módszert használtunk a Becke3P86 funkcionállal és a 6-31G* báziskészlettel. Elsı lépésben meghatároztuk a négy aflatoxin és demetilezett származékaik optimalizált molekulaszerkezetét és a hozzájuk tartozó energiákat. A számítások második részében megkaptuk a molekulák rezgési erıállandóit, illetve az izolált molekulák elektronenergiáját (Ee), belsı (termikus) energiáját (U), az entalpiáját (H) és a Gibbs-féle szabad energiáját (G). A moláris értékek (∆Um, ∆Hm és ∆µ) felhasználásával történt a molekulák entrópiájának (Sm), s a demetilezési reakciók reakcióhıjének (∆rHm), szabad energiájának (∆rµ), és egyensúlyi állandójának (K) kiszámítása. A molekulák rezgési színképeinek kvantumkémiai modellezésére alkalmazott normálkoordináta analízishez saját, házilag készített programot használtunk [270, 279].
51
5. Eredmények és értékelésük 5.1. A vizsgálati rendszer kialakítása 5.1.1. A kromatográfiás módszer kifejlesztése A mikotoxinok hatásmechanizmusának vizsgálatához a komplex BioAréna rendszert (2.6. ábra) [126, 171-175] szándékoztam használni. Ez a bioautográfián alapuló eljárás magában foglal egy vékonyrétegen való elválasztást és egy utána következı biológiai detektálást. A BioAréna rendszer célszerően koordinálja a mőveleti lépéseket, ezért nagyon elınyös a használata, s addig nem ismert összefüggések feltárását ígérte. Különösen alkalmas sejtszaporodást serkentı illetve gátló aktivitást mutató anyagok hatásmechanizmusának vizsgálatára. Alkalmazása segítségével láthatóvá tehetı hogy különbözı endogén és/vagy exogén anyagok jelenléte milyen hatással van a rétegen elválasztott vegyületek biológiai aktivitására. A rendszer alkalmazhatóságának elıfeltétele a megfelelı rétegkromatográfiás elválasztás kidolgozása és a vizsgálni kívánt vegyületekre érzékeny tesztsejtek kiválasztása. A kromatográfiás elválasztás kifejlesztésénél figyelembe kell venni, hogy a használni kívánt álló és mozgó fázis a késıbbiekben ne legyen hatással a biológiai detektálásra, ne zavarja azt. Természetesen, ezeket a paramétereket maga a tesztorganizmus határozza meg. Az általam alkalmazott Psm babkórokozó baktérium a szilikagél (TLC és HPTLC is) és a cellulóz állófázisokon képes volt szaporodni, az MTT-vel való festés után bekékült a lap, azaz a sejtek éltek és szaporodtak az adszorbens rétegágyban tehát a BioAréna rendszer használható Psm baktérium tesztsejtek esetében. Ezzel szemben a fordított fázisú réteglap nem alkalmas erre a feladatra. Festés után sárga színő maradt, aminek az oka feltételezhetıen az, hogy a fordított fázisú réteg elkészítéséhez felhasznált ragasztóanyag savasan hidrolizál, s a savas pH-t nem viselték el a sejtek. Elıször ellenıriztem, hogy a vizsgált mikotoxinok adnak-e gátló zónát Psm-mel szemben. Mind a szilikagél, mind a cellulóz lapra egyszerően felcseppentett tesztanyagok világos foltként jelentek meg a sötét háttérrel szemben. A további kísérletek végzéséhez a TLC szilikagél állófázis használata mellett döntöttem, mivel azt alkalmazzák általánosan a mikotoxinok elválasztásához. Az AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2 elválasztásához OPLC technikát [153-155] használtam, mivel jobb elválasztást, nagyobb felbontást, kompaktabb kromatográfiás foltokat biztosít, mint a TLC. A korábban leírt módszert kipróbálva [179-183], azt tapasztaltam, hogy az abban alkalmazott oldószer eleggyel (kloroform–toluol–tetrahidrofurán) kifejlesztett réteglap nem
52
használható további biológiai értékelésre, mert az eluenst nem lehet teljesen eltávolítani a rétegrıl, s gátolja a baktériumokat. Ezért új OPLC-s módszert dolgoztam ki, adaptálva a TLC-s elválasztásra használt kloroform-aceton (9:1 v/v) kifejlesztı rendszert [177], melynek összetevıi szárítással könnyen előzhetık a rétegrıl, s így nem zavarják a bioautográfiát. Meg kell jegyezni, hogy a kloroformban lévı, nyomnyi mennyiségő etanolt el kell távolítani elızetesen folyadékfolyadék extrakcióval nátrium-hidrogénkarbonát vizes oldatának segítségével, különben az AFG2 az etanolnak megfelelı fronton fut, s foltja nem lesz Gauss görbéhez közeli eloszlású (5.16. ábra). A módszer nem lett teljesen optimalizálva, de az OPLC-s elválasztáshoz kikísérletezett paraméterek lehetıvé teszik a 4 aflatoxin elválasztását jó felbontással (5.17. ábra). Az OPLC-s és a TLC-s módszerrel kapott retenciós faktorok és a felbontások a 2. táblázatban találhatók. Látható, hogy az OPLC-s módszerrel nagyobb felbontásokat kaptam. Ezt a módszert alkalmaztam az oszlopon tisztított pirospaprika extraktumban lévı AFB1 és együtt a 4 aflatoxin mennyiségének meghatározására is [6]. Egyes kísérletekben nem vizsgáltam mind a négy aflatoxint, csak az AFB1-et, ekkor a korábban leírt módszert alkalmaztam [177], azaz TLC szilikagél rétegen fejlesztettem ki az AFB1-et kloroform- aceton (9:1 v/v) mozgó fázist használva.
5.16. ábra Az aflatoxinokat tartalmazó TLC réteglap UV lámpa (λ λ=365 nm) alatti képe A kromatogramot elızetesen etanoltól nem mentesített kloroformból készült kloroform-aceton 9:1 (v/v) eleggyel fejlesztettem ki.
Az OA molekulában található karboxil csoport miatt, a szilikagél rétegen való kifejlesztéshez ecetsavas illetve hangyasavas oldószer elegyeket használnak [177] a csóva képzıdésének megakadályozására, hogy kompakt kromatográfiás foltot kapjanak. Ezeket az oldószereket nem
53
találtam alkalmasnak biológiai értékeléshez, mivel a savnyomok nem távolíthatók el a szorbens rétegrıl, s a sejtekre ölı hatással rendelkeznek. Ezzel szemben, a kloroform-metanol (4:1 v/v) rendszer alkalmasnak mutatkozott vizsgálataimhoz.
5.17. ábra OPLC-vel TLC szilikagél rétegen kloroform-aceton 9:1 (v/v) mozgófázis alkalmazásával elválasztott aflatoxinok (2,5-2,5 ng) denzitometriás értékelése [6] 1—aflatoxin G2; 2—aflatoxin G1; 3—aflatoxin B2; 4—aflatoxin B1
2. táblázat Az aflatoxinok retenciós faktorának (Rf) és a felbontásának (Rs) összehasonlítása TLC és OPLC módszerek alkalmazása esetében [6] Mindkettı esetében kloroform-aceton 9:1 (v/v) mozgó fázist s normál szemcsemérető szilikagél állófázist alkalmaztunk. A TLC módszer esetében a kifejlesztési távolság 18 cm volt.
TLC Rf Aflatoxin B1
OPLC Rs
0,31
Rf 0,36
1,42 Aflatoxin B2
0,28
2,3 0,31
1,04 Aflatoxin G1
0,25
1,6 0,27
1,58 Aflatoxin G2
0,22
Rs
2,1 0,21
A kifejlesztett kromatográfiás módszerek használhatók a BioAréna rendszerben Psm teszt mikroorganizmus esetében, azaz a mikotoxinok adnak gátló zónát, detektálhatók bioautográfiás módszerrel az ıket tartalmazó kifejlesztett rétegeken (5.18.-5.20. ábra). Az ábrák azt is mutatják, hogy a kifejlesztett rétegen a toxinok foltjai denzitometriásan értékelhetık a biológiai
54
detektálás elıtt és után is. A fertızés elıtt a mikotoxinok kromatográfiás foltja UV elnyeléssel vagy fluoreszcenciával értékelhetı, míg a vizualizációt követıen a gátló zónákról a látható fény tartományban mért elnyeléssel kaphatunk negatív denzitogramokat. Az aflatoxinok esetében a legnagyobb gátló zónája szemmel láthatóan az AFB1-nek van (5.19. ábra C kép), amit a denzitometriás értékelés (5.19. ábra D kép) is alátámaszt, s ez egybeesik azzal a ténnyel, hogy toxicitásában is kiemelkedik az aflatoxinok közül.
5.18. ábra Az aflatoxin B1 antibakteriális hatása [276] A – az aflatoxin B1 kromatográfiás foltjának denzitometriás értékelése UV fény tartományban (λ=365 nm); B – az aflatoxin B1-et tartalmazó kádban kifejlesztett réteg UV (λ=365 nm) alatt; C – a biológiai detektálás eredménye látható fényben; D – az aflatoxin B1 gátló zónájának negatív denzitometriás értékelése látható fény tartományban (λ=590 nm)
A minimum aktív koncentráció meghatározásának különbözı nehézségei vannak, mivel alapvetıen a biológiai rendszer érzékenységétıl függ, a tesztsejtek állapotától, amit nehéz normalizálni. Ha detektálásra akarjuk használni a rendszert, akkor tisztában kell lennünk azzal, hogy különbözı adalékanyagokkal (erre a késıbbiekben lesz is példa), s jobb, kompaktabb foltokat eredményezı elválasztási módszerrel érzékenyebbé tehetı a rendszer, csökkenthetı a kimutatási határ. Ezen kívül az alkalmazott inkubációs idı (a fertızés és a festés közötti idı) is befolyásoló tényezı.
55
Hatásmechanizmus vizsgálatára azonban nem kell elérnünk a rendszer maximális érzékenységét, mert alapvetıen arra törekszünk, hogy nagy mennyiségő anyag kerüljön a rétegre a gátló zónák könnyebb értékelhetısége, összehasonlíthatósága érdekében.
5.19. ábra Az aflatoxin B1, B2, G1 és G2 antibakteriális hatása [273] A – az aflatoxinok kromatográfiás foltjainak denzitometriás értékelése UV fény tartományban (λ=365 nm); B – a 4 aflatoxint tartalmazó OPLC-vel kifejlesztett réteg UV lámpa (λ=365 nm) alatt; C – a biológiai detektálás eredménye látható fényben; D – az aflatoxinok gátló zónáinak negatív denzitometriás értékelése látható fény tartományban (λ=590 nm)
5.20. ábra Az ochratoxin A antibakteriális hatása
A – az ochratoxin A kromatográfiás foltjának (1 µg) denzitometriás értékelése UV fény tartományban (λ=330 nm); B – az ochratoxin A-t tartalmazó kádban kifejlesztett réteg UV (λ=365 nm) alatt; C – a biológiai detektálás eredménye látható fényben; D – az ochratoxin A gátló zónájának (1 µg) negatív denzitometriás értékelése látható fény tartományban (λ=590 nm)
56
5.1.2. A biológiai detektálás elıtti és utáni mennyiségi denzitometriás értékelés A denzitometriás értékelés lehetıvé teszi a rétegen vizsgált anyagok mennyiségi meghatározását biológiai értékelés elıtt és után is. A kis mennyiségő aflatoxin és OA alapvetıen fluoreszcencia mérésével detektálható érzékenyen, viszont a BioArénás kísérletekhez általam felvitt minimum 0,1 µg jól detektálható UV fénnyel reflexiós módban is. A biológiai detektálással kapott bioautogramok látható fény segítségével, szintén a visszaverıdött fény intenzitásának mérésével értékelhetık, amibıl negatív denzitogramokat kapunk. A TLC réteg inhomogenitása miatt, a fény a réteggel találkozva szétszóródik, visszaverıdik, elnyelıdik, s így egy egyszerő, homogén anyagot megfelelıen szimuláló modell nem alkalmazható leírására. A diffúz reflexiót írja le pl. a Kubelka-Munk-féle modell, mellyel korrigálva a visszavert fény intenzitását, kis tartományban lineáris összefüggést biztosít a rétegre felvitt anyag mennyisége és a denzitométerrel kapott csúcs alatti terület között. Az
5.21. ábra Az aflatoxin B1-bıl felvitt 5 anyagmennyiség (0,125; 0,25; 0,5; 0,75 és 1 µg) képe biológiai értékelés elıtt (A) UV lámpa (λ λ=365 nm) alatt és után (B) látható fényben
5.22. ábra Az ochratoxin A-ból felvitt 6 anyagmennyiség (0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 és 1 µg) képe biológiai értékelés elıtt (A) UV (λ λ=365 nm) alatt és után (B) látható fényben
AFB1 és az OA esetében felvitt 5 illetve 6 mennyiség (5.21. és 5.22. ábrán az A képek) már nincs lineáris tartományon belül. Az 3. és 4. táblázat tartalmazza az adott kísérleten belül mért párhuzamosokból kapott görbe alatti területeket statisztikailag kiértékelve. Mindkettı toxinnál, a görbe alatti területet koordinációs rendszerben ábrázolva a rétegre felvitt anyag mennyiségének
57
függvényében, a pontokra másodfokú függvényt illesztettem (5.23. és 5.24. ábra), mellyel a korreláció négyzetére viszonylag nagy értékeket (R2 = 0,9956 illetve 0,9976) kaptam. 3. táblázat A rétegen kifejlesztett különbözı mennyiségő aflatoxin B1 biológiai detektálás elıtti UV denzitometriás (λ λ=365 nm) értékeléssel kapott detektor jelei (a csúcsok integrált értékei) mennyiség (µ µg) 0,125 0,25 0,5 0,75 1
minta 1 1320708 2110035 2780096 3560483 3902356
minta 2 1497586 2167098 2970412 3419603 4025821
minta 3 1387733 1962604 2821007 3347700 3852002
minta 4 1421194 2209657 3057338 3630281 4112000
átlag 1406805 2112349 2907213 3489517 3973045
szórás 73540 107850 129256 128906 117957
szórás % 5,2 5,1 4,4 3,7 3,0
4. táblázat A rétegen kifejlesztett különbözı mennyiségő ochratoxin A biológiai detektálás elıtti UV denzitometriás (λ λ=330 nm) értékeléssel kapott detektor jelei (a csúcsok integrált értékei) mennyiség (µ µg) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1
minta 1 19860 31407 53734 66659 78978 92657
minta 2 20255 36098 53112 64554 81666 95023
minta 3 20148 34568 58824 75257 92092 100523
átlag 20087 34024 55223 68823 84245 96067
szórás 204 2392 3133 5670 6927 4035
szórás % 1,0 7,0 5,7 8,2 8,2 4,2
A biológiai elıhívás után kapott bioautogramokról (5.21. és 5.22. ábrán a B képek) látható tartományban (λ=590 nm) készítettem denzitogramot (5.25. és 5.26. ábra). A párhuzamos rétegekrıl felvett görbék integrálásával kapott adatok, átlag és szórás értékek az 5. és a 6. táblázatban találhatók. A szórás minden esetben kisebb volt, mint 15,2 %. A detektor jel és a rétegre felvitt anyag mennyisége közti összefüggés megállapítására a legnagyobb korrelációt adó regressziós eljárást alkalmaztam.
58
detektor jel ( λ =330 nm)
detektor jel ( λ =365 nm)
4500000 4000000 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0
y = -2E+06x2 + 5E+06x + 872891 R2 = 0,9956
0
0,5
1
1,5
a rétegre felvitt AFB1 mennyisége (µ µ g)
5.23. ábra A rétegre felvitt aflatoxin B1 mennyisége és az UV (λ λ=365 nm) denzitometriával kapott detektor jel közti másodfokú regresszió
120000 100000 80000 60000 2
40000
y = -40399x 126707x + 9160,2 +
20000
R 0,9976 =
2
0 0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
a rétegre felvitt OA mennyisége (µ µ g)
5.24. ábra A rétegre felvitt ochratoxin A mennyisége és az UV (λ λ=330 nm) denzitometriával kapott detektor jel közti másodfokú regresszió
5.25. ábra Az öt különbözı mennyiségő aflatoxin B1-et tartalmazó bioautogram (13. ábra B kép) foltjairól készített negatív denzitogramok (λ λ=590 nm)
5.26. ábra A hat különbözı mennyiségő ochratoxin A-t tartalmazó bioautogramról (17. ábra B kép) készített negatív denzitogram (λ λ=590 nm)
59
Korábban a gátló zóna átmérıje illetve területe és a minta mennyisége között találtak összefüggést, mint ahogy a területet figyelembe véve, Koshinsky és mtsai logaritmikus összefüggést tapasztalt [185]. A denzitometriás értékelésbıl kapott integrált értékek és a rétegre felvitt AFB1 mennyisége között logaritmikus (5.27. ábra) összefüggést tapasztaltam, míg az OA esetében másodfokú regressziót (5.28. ábra) alkalmazva kaptam nagyobb korrelációt. A bioautográfia utáni denzitometriás értékelés különösen fontos szerepet játszhat a látható, illetve UV
fényt
nem
abszorbeáló
mikrobiális
hatással
rendelkezı
anyagok
mennyiségi
meghatározásában. Magában hordozza a bonyolult mátrixokban lévı biológiailag aktív anyagok mennyiségi meghatározásának lehetıségét is, mivel szelektivitása miatt, az antibiotikus-toxikus anyagokat kell csak egymástól elválasztani, nem kell nagyobb felbontásra törekedni, mint más kevésbé szelektív, pl. UV spektroszkópiás detektálás esetén.
5. táblázat A rétegen kifejlesztett különbözı mennyiségő aflatoxin B1 biológiai detektálás utáni látható tartományú denzitometriás (λ λ=590 nm) értékeléssel kapott detektor jelei (a negatív csúcsok integrált értékei) mennyiség (µ µg) 0,125 0,25 0,5 0,75 1
minta 1 607834 1372608 2267863 2493652 2830042
minta 2 680426 1435645 2180943 2631967 2780120
minta 3 777422 1286138 2244722 2601404 2707613
minta 4 546456 1541352 2125854 2552457 2877942
átlag 653034 1408936 2204846 2569870 2798929
szórás 99372 107465 64219 60450 72809
szórás % 15,2 7,6 2,9 2,4 2,6
6. táblázat A rétegen kifejlesztett különbözı mennyiségő ochratoxin A biológiai detektálás utáni látható tartományú denzitometriás (λ λ=590 nm) értékeléssel kapott detektor jelei (a negatív csúcsok integrált értékei) mennyiség (µ µg) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1
minta 1 422739 719502 1217585 1701517 1940658 2487355
minta 2 498172 760733 1549808 1896370 2101804 2411432
minta 3 375976 803750 1341170 1792552 2016324 2624826
átlag 432296 761328 1369521 1796813 2019595 2507871
szórás 61656 42127 167916 97496 80623 108166
szórás % 14,3 5,5 12,3 5,4 4,0 4,3
60
3000000
detektor jel (λ =590 nm)
detektor jel ( λ =590 nm)
3500000 3000000 2500000 2000000 1500000
y = 1E+06Ln(x) + 3E+06 R2 = 0,9969
1000000 500000 0
2500000 2000000 1500000 1000000
y = -1E+06x2 + 3E+06x + 138992 R2 = 0,9916
500000 0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0
a rétegre felvitt AFB1 mennyisége (µ µ g)
5.27. ábra A rétegre felvitt aflatoxin B1 mennyisége és a látható tartományú (λ λ=590 nm) denzitometriás értékeléssel kapott detektor jel közti logaritmikus regresszió
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
a rétegre felvitt OA mennyisége (µ µg)
5.28. ábra A rétegre felvitt ochratoxin A mennyisége és a látható tartományú (λ λ=590 nm) denzitometriás értékeléssel kapott detektor jel közti másodfokú regresszió
5.1.3. A formaldehid mérése a fertızött adszorbens rétegen A HCHO minden biológiai rendszerben jelen van – általában kötött formában -, ma már tudjuk, hogy nélkülözhetetlen molekula a biológiai világban [79-81], hiszen alapvetı biokémiai folyamatokban vesz részt, mint pl. a sejtszaporodás serkentés és gátlás [81, 82, 141], a programozott sejthalál [81, 82]. A kötött formákból, mint hidroximetil, formil, N-, S- és O-metil csoportokból metilezési-demetilezési folyamatok során felszabaduló HCHO [79-81] mérhetı a különbözı biológiai mintákban (pl. disznómáj, ecetfalevél, gombaspóra) [80, 82]. Ezért feltételeztem, hogy a fertızött rétegen is jelen van a HCHO. Mennyiségi meghatározásához az általános aldehid-reagensként ismert, exogén Dim vegyületet alkalmaztam, mely irreverzibilisen köti meg a HCHO molekulát (2.11. ábra) [84]. A keletkezı formaldemeton mérését a korábban már leírt TLC-s elválasztás utáni denzitometriás értékeléssel végeztem [280]. A Dim tartalmú Psm sejt szuszpenzióba merített rétegen a toxinok (AFB1, AFG2 és OA) kromatográfiás foltjaiban és ugyanakkora területő kontroll (háttérbıl toxinmentes terület) foltokban mértem a HCHO-t. Minden toxin esetében 3-3 párhuzamost készítettem. A formaldemeton foltját tesztanyag segítségével azonosítottam (azonos retenció), s tisztaságát színképelemzéssel végeztem. Az 5.29. ábrán látható, hogy nagy egyezést mutat a laboratóriumban elıállított formaldemeton tesztanyag és a mintából nyert azonos Rf értékő kromatográfiás folt denzitométerrel felvett színképe.
61
5.29. ábra A tesztanyag formaldemeton (––) és a mintából nyert, azonos visszatartási tényezıvel rendelkezı kromatográfiás foltról (––) felvett színkép Feltételezésemnek
megfelelıen
a
5.30. ábra A fertızött réteg azonos területő aflatoxin B1 (––) és egy háttér (––) foltjából győjtött formaldemeton denzitogramjai
kontroll
foltokban
is
kimutatható
mennyiségő
formaldemetont találtam. Mivel a Dim-et a fertızés elıtt adtuk a sejt szuszpenzióhoz, így jelen volt a baktériumok és a toxinok találkozásának kezdetétıl. Megfigyelhetı, hogy a denzitometriás értékeléssel (5.30. ábra) kapott formaldemeton csúcsokat integrálva, a toxinok foltjaiban nagyobb értékeket kaptam, azaz ott több HCHO volt jelen, több szabadult fel a kötött formákból, mint a kontroll foltokban. Ez adódhat pl. abból, hogy a toxinok jelenléte stressz helyzet a baktériumok számára. Korábban már tapasztalták [85, 115, 117, 118], hogy a különbözı stressznek (pl. vírusfertızés, hı-sokk, fénymegvonás, áztatás és só-stressz) kitett növényekben a HCHO generátorok csökkenésével párhuzamosan a HCHO szint nagymértékben növekedett. Vagyis stressz helyzetben a metilezési-demetilezési egyensúly eltolódik a demetilezés irányába, s a sejtekben található kötött HCHO felszabadul. A demetilezési potenciál növekedésébıl adódik a HCHO szint emelkedésének másik lehetséges oka aflatoxinok esetében, mivel az aflatoxinok (AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2 is), mint O-metil csoportot tartalmazó molekulák (2.1. ábra), potenciális HCHO elıanyagok. Az aflatoxinok demetilezése során a megfelelı hidroxil termék mellett a metoxi csoportból metanol képzıdik, ami tovább oxidálódik HCHO-vá [21] (2.3. ábra). Más mikroorganizmusok, mint Bacillus megaterium [93], Rhodococcus erythropolis [94, 95], Pseudomonas testosteroni [96] és Pseudomonas aeruginosa [97] esetében leírták, hogy különbözı N-, és O-metilezett vegyületeket képesek demetilezni HCHO-t termelve. Tehát
62
feltételezhetı, hogy nem csak a sejtben megtalálható endogén HCHO generátorokból, hanem az exogén aflatoxinok demetilezıdésébıl is keletkezhet HCHO a baktérium sejtekben. A különbözı toxinok esetében a formaldemeton csúcs területének a háttérhez viszonyított százalékos növekedésének átlagát nézve (7. táblázat), a következı sorrend állítható fel: AFB1 >OA >AFG2. Ez megfelel annak, hogy az AFB1 és az OA toxikusabb az AFG2-nél [3], amit az EU-s élelmiszerekre elıírt határértékei is tükröznek [12]. 7. táblázat Az aflatoxin B1, aflatoxin G2 és ochratoxin A foltjaiból győjtött formaldemeton denzitometriás csúcsainak a háttérhez (azonos területő) viszonyított százaléka [273]
AFB1 kontrol AFB1 toxin/kontrol*100 AFG2 kontrol AFG2 toxin/kontrol*100 OA kontrol OA OA/kontrol*100
1. réteg 2. réteg 3. réteg átlag szórás 1255294 1109232 1053838 1614089 1395474 1262132 128,6% 125,8% 119,8% 124,7% 4,5% 1254990 1319606 1329834 1442328 1469710 1529834 114,93% 111,37% 115,04% 113,8% 2,1% 497268 410573 374701 574190 496205 484518 115,5% 120,9% 129,3% 121,9% 7,0%
biológiai egység
formaldehidom HCHO
1
+
H2O2
O2
H*CHO
H2O3
?
O3
H2O2 és 3O2
5.31. ábra A formaldehid feltételezett szerepe a reaktív oxigénfajták keletkezésében
63
Figyelembe kell venni azt is, hogy az exogén prekurzorokból, pl. az aflatoxinokból felszabaduló HCHO, mivel nincs meghatározott biokémiai útja, részt vehet in situ véletlen reakciókban, mint spontán kémiai és/vagy biológiai metilezés és formilezés, melyek a DNS és RNS kódolásának zavarát okozzák [102, 281-283], potenciális veszélyt hordozva pl. a rosszindulatú daganatok kialakulásához. A nagyobb HCHO szint növeli a H2O2-dal való reakció valószínőségét is, többek között 1O2-t és O3-t generálva (5.31. ábra), melyek képesek a sejt összetevı fehérjéket, aminosavakat károsítani [118, 135-138].
5.1.4. A hidrogén-peroxid mérése az intakt (vízbe merített) és fertızött adszorbens rétegen A molekuláris oxigén minden aerob mikroorganizmusban kémiailag oxidálja a redox enzimeket, mely során H2O2 termelıdik, így ez a molekula egy természetes sejt összetevı. A H2O2 potenciálisan károsíthatja a sejtet, mivel képes más enzimeket is oxidálni, illetve hidroxil gyökké alakulva mutagén károsodást, oxidatív stresszt képes indukálni [284]. Ez ellen katalázokkal és/vagy peroxidázokkal védekezik a sejt. Seaver és Imlay mérték a H2O2 keletkezésének sebességét aerob körülmények közt glükózon szaporított Escherichia coli baktérium sejtekben, mely kb. 14 µM/s-nak adódott [285]. Mivel az enzimek hajlandósága az autooxidációra az elektroneloszlásuktól és a fizikai szerkezetüktıl függ, így valószínősíthetı, hogy a H2O2 termelés mértéke változik a különbözı mikroorganizmusok esetében, attól függıen, hogy milyen típusú és mennyi enzimet tartalmaz [286]. A H2O2 mennyiségi meghatározását kataláz enzim segítségével végeztem, mely különösen szerves oldószerekben megırzi aktivitását, így szerves fázisú bioszenzorban alkalmazható. A kataláz enzim katalizálja a H2O2 és más hidroperoxid származékok bomlását, s a H2O2 fogyása detektálható elektrokémiai detektor segítségével amperometriás módszerrel, az áramerısséget mérve 590 mV állandó polarizációs feszültség mellett. A mérés alapjául a következı reakcióegyenlet szolgál: kataláz
2 H2O2
2 H2O + O2
A H2O2 fogyásának meghatározásához minden minta esetében mértem az eredeti és az enzim reakció után megmaradt szubsztrát mennyiségét is. Mivel a két mérés különbségébıl tudunk következtetni a H2O2 mennyiségére, így kiküszöböljük a mintákban lévı, az amperometriás
64
detektálást zavaró elektroaktív anyagok hatását. A mérésekhez egy, az injektor mintahurkába szerelt enzimes vékonyréteg cellát alkalmaztam. A kiindulási H2O2 szint meghatározásához a cellába injektált mintát azonnal a mérı ágba vezettem az injektor elfordításával, míg a minta újbóli injektálásánál megvárva az enzimreakciót, a cellában való 2 perc tartózkodási idı után mértem a redukálódott szubsztrát szintet. Ez az úgynevezett stopped-flow típusú kísérleti rendszer (4.15. ábra) alkalmas a H2O2 koncentrációjának mérésére, mivel a H2O2 koncentrációja és az amperometriás detektorjel között lineáris függvénykapcsolat van [275]. 8. táblázat A desztillált vízbe illetve Psm sejt szuszpenzióba merített réteglapokról 1 illetve 18 óra inkubációs idı után a toxin és kontroll (#) foltokból vett minták H2O2 tartalmának mérésekor a 0 és 2 perces enzim cellában való tartózkodásnál kapott amperometriás jelek különbsége 1. minta 2. minta
18 óra inkubáció
víz OA Psm
víz AFB1
1 óra inkubáció
Psm
víz AFB1 Psm
(nA)
(nA)
OA
387,5
412,5
#
487,5
500
OA
537,5
650
#
700
812,5
AFB1
75
50
#
175
150
AFB1
725
650
#
825
725
AFB1
200
300
#
350
375
AFB1
262,5
350
#
450
500
A vízbe merített illetve Psm baktérium sejtekkel fertızött AFB1-et illetve OA-t tartalmazó kifejlesztett réteglapokról azonos területő toxin és kontroll (toxint nem tartalmazó hely) foltok lekaparásával és extrahálásával kaptam a mintákat. Minden mintából 2-2 párhuzamost készítettem, s vezetısót tartalmazó acetonitrilhez adva belılük, megmértem a 0 és a 2 perc enzim cellában való tartózkodás után kapott amperometriás jelet. Ezek különbségét tartalmazza a 8. táblázat, melyek kb. a 0-0,02 mM-os H2O2 koncentráció tartományba esnek [275]. Látható, hogy minden esetben a Psm-mel fertızött réteglapról vett mintákban nagyobb különbséget
65
kaptunk a vizes rétegrıl nyert megfelelı mintákhoz viszonyítva. Azaz a baktérium sejtek jelenléte kimutatható mennyiségő H2O2-t eredményez. Az is megfigyelhetı, hogy az 1 óra inkubációs idı (a réteg vízbe vagy Psm sejt szuszpenzióba való merítése és az adszorbens lekaparása közti idı) után vett AFB1 és 18 óra után vett OA minták esetében a toxinos és a megfelelı kontroll minták közti különbség a Psm-esnél nagyobb, összehasonlítva a vizes rétegrıl vett hasonló mintákkal. Úgy tőnik, hogy Psm jelenlétében a toxin foltjában csökkent a H2O2 mennyisége, ami feltételezi, hogy esetleg részt vett valamilyen reakcióban, reagált valamivel. Mivel tudjuk, hogy a HCHO is jelen van a fertızött rétegen, így feltételezhetı, hogy a H2O2 egy része a HCHO-val lépett reakcióba, nagyon reaktív oxigén molekulákat eredményezve. Meg kell azonban jegyezni, hogy a 18 órás AFB1 esetében ez a többlet különbség megszőnik.
5.1.5. Az aflatoxinok demetilezési reakciójának elméleti vizsgálata, egyensúlyi állandójának meghatározása Az általam vizsgált 4 aflatoxin mindegyike O-metilezett vegyület, ezért potenciális HCHO elıanyagnak tekinthetı. Demetiláz enzim általi lebontásuk során a megfelelı demetilezett származék, és metilalkohol keletkezik. A metilalkohol HCHO-vá alakul át, melynek mérésével követhetı a demetiláz aktivitás [224]. Megfigyeltük, hogy a BioAréna rendszerben a toxinok foltjában magasabb a HCHO szint, mint egy azonos területő háttér részen. Ez származhat az endogén HCHO prekurzorokból való nagyobb mértékő HCHO felszabadulásból és/vagy az aflatoxinok demetilezésébıl. Számításokat végeztünk a Gaussian 98 programcsomag [278] segítségével, hogy a négy aflatoxin toxicitásának sorrendje (AFB1 >AFG1 >AFB2 >AFG2) és a demetilezıdési reakciójuk egyensúlyi állandója között van-e összefüggés, feltételezve, hogy a nagyobb ölı aktivitással rendelkezı toxin könnyebben demetilezıdik. Elsı lépésben meghatároztuk a négy aflatoxin és demetilezıdési reakcióik termékeinek optimalizált szerkezetét, modelleztük a rezgési színképeiket kvantumkémiai módszerrel, s végül elvégeztük a reakcióhık becslését az izolált reagáló molekulákra és termékeikre számított molekuláris energiák és termodinamikai függvények alapján.
66
AFB1
AFB2
AFG1 AFG2 5.32. ábra Az aflatoxin B1, B2, G1 és G2, valamint ezek demetilezett származékaik háromdimenziós szerkezeti képe [279]
67
A B aflatoxinok szerkezetérıl (5.32. ábra) elmondható, hogy a jobb oldali 4 győrőjük egy síkban helyezkedik el, míg a bal oldali ötös furán győrő kilóg ebbıl a síkból, de atomjai síkgyőrőt alkotnak. A G aflatoxinok (5.32. ábra) bal oldali 4 győrőjének a térszerkezete hasonló a B aflatoxinokéhoz, viszont a középsı 3 győrő síkjából a jobb oldali hatos győrő is kilóg, mégpedig abban az irányban, mint a bal oldali furán, viszont azzal ellentétben a hatos győrő nem sík. Töltéssőrőség módszerrel végzett számítások során (Becke3LYP/6-31G*) (9. táblázat) megkaptuk a molekulák elektronenergiáját (Ee), belsı (termikus) energiáját (U), az entalpiáját (H) és a Gibbs-féle szabad energiáját (G). A moláris értékek (∆Um, ∆Hm és ∆µ) felhasználásával a következı egyenletek alapján lett az entrópia (Sm), a reakcióhı (∆rHm), a reakció szabad energiája (∆rµ), s egyensúlyi állandója kiszámítva (K):
∆µ = ∆ H m − TS m ∆ r H m = ∑ν i ∆H m ,i i
∆ r µ = ∑ν i ∆µm ,i i
∆ r µ = − RT ln K Ahol ν a reakcióban szereplı anyagok sztöchiometriai együtthatója, az R pedig az univerzális gázállandó T=273.15 K hımérsékleten.
A molekuláris energiák és a termodinamikai függvények alapján a demetilezési reakciókra számított moláris entalpiaváltozások (∆rHm) és kémiai potenciálváltozások (∆rµ) nagyon kicsik, és közel állnak egymáshoz, s ugyanez elmondható az egyensúlyi állandókról (K) is (9. táblázat). Ez alapján a demetilezıdési reakciók egyensúlyának a sorrendje: AFG1 >AFG2 >AFB1 >AFB2, ami egyben a HCHO termelés relatív sorrendjét is jelenti. Ez csak külön-külön nézve a B és G aflatoxinokat felel meg a toxicitási sorrendjüknek. De mivel ezek az értékek az izolált molekulákra vonatkozó adatok alapján lett számítva, így a környezeti hatások (pl. oldószer, más oldott anyagok) módosíthatják. S mivel az egyensúlyi állandók nagyon közeliek, ezért egy biológiai rendszerben könnyen megváltozhat azok relatív sorrendje, különösen enzimek jelenlétében.
68
9. táblázat Az aflatoxin B1, B2, G1 és G2, valamint demetilezett származékaik izolált molekuláinak és a demetilezési reakcióinak fizikai-kémiai jellemzıi [279] Ee - a molekulák elektronenergiája; ∆Um – moláris belsı (termikus) energia; ∆Hm – moláris entalpia; ∆µ moláris szabad energia; ∆Sm – moláris entrópia; ∆rHm – reakcióhı; ∆rµ - a reakció szabad energiája; K – a demetilezési reakció egyensúlyi állandója ∆ Um
Ee
Molekula
∆ Hm
-1
∆S m
∆µ -1
MJ mol
-1
kJ mol
∆ rH m -1
∆r µ -1
K298
J mol K
kJ mol
1,8662 -3,6800
4,41300
1,8951 -3,4091
3,95600
1,7192 -4,1276
5,28600
1,7297 -4,0373
5,09700
AflB1-OCH3
-2912,399
738,602
741,080
569,299
576,158
AflB1-OH
-2808,816
659,392
661,871
498,916
546,552
AflB2-OCH3
-2915,746
804,022
806,501
632,905
582,241
AflB2-OH
-2812,165
724,841
727,320
562,794
551,824
AflG1-OCH3
-3110,262
755,781
758,259
583,345
586,664
AflG1-OH
-3006,682
676,424
678,902
512,515
558,066
AflG2-OCH3
-3113,608
821,162
823,643
646,712
593,429
AflG2-OH
-3010,029
744,444
744,296
575,972
564,564
Metanol
-304,661
144,488
147,024
76,369
236,978
Víz
-201,084
63,627
65,948
9,666
188,770
5.1.6. Az aflatoxin B1 kromatográfiás foltjának FT-Raman és felületerısített FTRaman spektroszkópiai értékelése Az AFB1 Raman aktív vegyület [287], detektálható s azonosítható lézeralapú Raman spektroszkópiával,
mely
érzékenyebbé
tehetı
különbözı
módszerekkel,
mint
pl.
felületerısítéssel. A felületerısített Raman szórás eléréséhez a vizsgálandó vegyületet speciális érdes felületre kell adszorbeálni, mely általában arany vagy ezüst kolloid. A TLC rétegen elválasztott anyagok felületerısített Raman spektrumát fel lehet venni közvetlenül in situ a rétegen miután a kromatográfiás foltra ezüst szolt cseppentettünk [288-291], vagy ex situ, leoldás után a száradékhoz ezüst szolt adva. Az 5.33. ábrán látható FT-Raman spektrumok közvetlenül a TLC rétegekrıl lettek felvéve, az 5.34. ábrán szintén in situ mérésbıl származó, de felületerısített FT-Raman spektrumok láthatók, míg az 5.35. ábra a rétegrıl leoldott száradékok felületerısített FT-Raman spektrumait tartalmazza. Minden esetben csak egy vakot raktam az ábrákra, mivel a fertızött és a baktériummentes rétegrıl vett kontroll foltok spektrumai nem különböztek. A spektrumok kiértékelésébıl alapvetıen azt szerettük volna megtudni, hogy milyen lehetséges változásokon megy keresztül az AFB1 a BioAréna rendszerben, különös tekintettel a demetilezıdésének
69
lehetıségére. Ehhez azonosítottuk (10. táblázat) a sávokat, s vizsgáltuk azok eltolódását és intenzitásbeli változását.
5.33. ábra FT-Raman spektrumok [276] (a) a fertızött réteg háttér foltjáról (b) AFB1 standardról (por formában) (c) a baktériummentes TLC lapon lévı AFB1 kromatográfiás foltjáról (d) a Psm-mel fertızött réteglap AFB1 foltjáról
5.34. ábra Felületerısített FT-Raman spektrumok [276] (a) a fertızött réteg háttér foltjáról (b) AFB1 standardról (por formában) (c) a baktériummentes TLC lapon lévı AFB1 kromatográfiás foltjáról (d) a Psm-mel fertızött réteglap AFB1 foltjáról
70
5.35. ábra Felületerısített FT-Raman spektrumok [276] (a) a fertızött réteg háttér foltjának metanolos kivonatáról (b) AFB1 standardról (por formában) (c) a baktériummentes TLC lapon lévı AFB1 kromatográfiás foltjának metanolos kivonatáról (d) a Psm-mel fertızött réteglap AFB1 foltjának metanolos kivonatáról
A demetilezıdés lehetıségének megválaszolása érdekében megvizsgáltuk az (O)-CH3 csoport 1386 cm-1-nél megjelenı deformációs rezgését (esernyırezgés) jellemzı sáv relatív terület arány változásait Psm jelenléte nélkül és Psm jelenlétében. A spektrumokat a Jandel Scientific PeakFit, version 4 program segítségével terület normálást követıen azonos paraméterek mellett dekonvolváltuk az 1500-1250 cm-1 spektrális tartományban. A δCH3 rezgésre jellemzı sáv Psm jelenlétében csökkenı tendenciát mutatott a TLC rétegen közvetlenül (5.33. ábra), és a rétegrıl leoldott száradékból készített felületerısített FT-Raman spektrumok esetében is (5.35. ábra). Az 5.33. ábrán bemutatott spektrumokból számolt δCH3 sáv terület csökkenése 50%-os, míg a felületerısített FT-Raman spektrumokból számolva 75%-os volt. Mivel a felületerısítés jellegébıl adódóan egy rezgés Raman aktivitását (vagyis a sávok intenzitását, a sávarányok alakulását) a felületi kiválasztási szabály határozza meg, a felületerısített FT-Raman spektrumokból számolt érték csak tendenciájában vehetı figyelembe. A δCH3 sáv területének csökkenése az aflatoxin metoxi csoportjának demetilezıdésére enged következtetni Psm jelenlétében. Meg kell jegyezni, hogy a demetilezés eredményeként képzıdı OH csoportok és a HCHO FT-Raman vagy felületerısített FT-Raman detektálása a nagyon alacsony Raman aktivitás miatt nem lehetséges. Figyelembe véve azt a tényt, hogy
71
rétegkromatográfiás módszerrel a Psm-mel kezelt réteglapon nagyobb mennyiségő HCHO mutatható ki (Dim-mel képzett adduktjaként) az AFB1 kromatográfiás foltjában, mint az azonos területő háttér (kontroll) foltban, ezért elmondható, hogy a kötött formákból képzıdı HCHO a Psm baktérium sejtekbıl és az aflatoxinból egyaránt származhat. 10. táblázat A minták sáv asszignációi [276] Standard 1747 1698 1686
TLC # 1747
Psm 1747 1698 1686
1667 1635 1616 1591 1549
1597 1554 1523 1495
1485
1616 1591 1549 1523
Száradék, Asszignációk TLC, felületerısített felületerısített [279, 292]] # # Psm Psm 1757 1747 1754 1754 ν C=O (2H-pirán győrő) 1691 ν C=O (ciklopentén győrő) és 1680 ν C=C; győrők és speciális győrők nyújtási rezgése; 1643 1643 ν C=C; 1616 1616 1616 1616 győrők és speciális győrők 1591 1591 1591 1591 nyújtási rezgése; 1551 1551 1554 1554 1524 és
1485
1490
1482
1485
1485 1474
1449
1459 1449
1456 1444
1456 1444
1447
1447
1425
1425
1417
1421
1386 1361 1350
1386
1386
1386
1386
1354
1350
1350
1350 1315
1305 1270 1242 1228 1134
1305 1275 1247 1228
1305 1270 1245 1228 1134
1305 1270 1242
1466 1456 1431 1421
1075
832
1100 1075
1270 1242
C-H deformáció
β C-H (győrő) 1412 1386
1412 1386
1353
1353
1303 1272 1245
1303 1272 1245
1128 1099
1139 1099
1055 1002
1050 1002 858 832
1075
832
δ CH3 ν C-O, ν C-C győrő(k) vázrezgése ν C-O-C; ν C-O-C(H3) ν C-O-C(H3) győrő deformáció győrő deformáció győrő deformáció ? ?
72
Az 5.33. és 5.34. ábrák alapján figyelemre méltó az a jelenség, hogy Psm jelenléte nélkül a piran győrő νC=O (a továbbiakban C=O/P) rezgése nem mutat lényeges frekvencia eltolódást a standardhoz képest. Ugyanakkor a ciklopentén győrőhöz kapcsolódó νC=O (a továbbiakban C=O/CP) rezgés 30 cm-1 nagyságú vörös eltolódást szenved, vagy meg sem jelenik. A jelenség legegyszerőbb magyarázata az, hogy az aflatoxin a C=O/CP funkciós csoporton keresztül kapcsolódik a réteghez, és ez a kapcsolódás a BioAréna rendszerben felszakad. Ezt a feltételezést megerısíti az a gyakorlati tapasztalat is, hogy az analizálandó vegyület és a TLC réteg rendszerint erıs kölcsönhatásban van egymással, így a foltokról készített Raman spektrumok nagyon jelentıs sávszélesedést és alapvonal sodródást mutatnak. Ha az analizálandó vegyület és a réteg közötti kölcsönhatás csökken vagy megszőnik, a spektrumot torzító hatások is csökkennek. Mivel a νC=O/P rezgését jellemzı 1747 ill. 1754 cm-1 sávok BioAréna nélkül intenzitás csökkenést, kismértékő sávszélesedést és minimális frekvencia eltolódást mutatnak, ez a funkciós csoport lényegesen kisebb kölcsönhatást alakíthat ki a réteggel, mint a C=O/CP. A réteghez való kötıdés következményeként azonban pl. egy gyenge H-híd kialakulása és/vagy a lokális szimmetria miatt a C=O/P csoport polarizálhatóság/Raman aktivitás csökkenést szenved, mely Psm jelenlétében megváltozik. A Raman spektrumok alapján úgy tőnik, hogy az AFB1 a demetilezıdésen kívül nem szenved más szerkezeti változást. Hangsúlyozva azt, hogy a felületerısített FT-Raman spektrumok sávarányok tekintetében nem szükségszerően egyeznek meg a konvencionális Raman spektrumokkal, az Ag-AFB1, valamint az Ag-réteg/rétegrıl leoldott anyag(ok) kölcsönhatásait is figyelembe véve a standardhoz képest mindössze a δCH3 sáv intenzitás változása számszerősíthetı. Ezért a demetilezıdési folyamaton kívül más reakció nem valószínősíthetı. Az FT-Raman spektrumok elemzéséhez felhasználtuk korábbi eredményeinket is [279], mely során a 4 aflatoxin és demetilezett származékaik infravörös spektrumát vizsgáltuk kvantumkémiai számításokat alkalmazva. A Gaussian 98 programmal, az atomok derékszögő koordinátáinak rendszerében kapott rezgési erıállandókat áttranszformáltuk az u.n. belsı koordináták rendszerébe, amelyek az atomok kötéstávolságainak, a molekulát jellemzı vegyérték és diéderes szögek változásai. Ezen erıállandók (F mátrix) és a molekula geometriai paramétereibıl és az atomtömegekbıl felépített G mátrix ismeretében a GF mátrix sajátértékei adják a rezgési frekvenciákat, s ezekbıl számítható az egyes rezgési módok jellege, azaz az egyes belsı koordináták részvételi aránya a rezgési módok energiáiban (11-12. táblázat).
73
11. táblázat Az aflatoxin B1 számított rezgési frekvenciái [279] Számított érték (cm-1)
Skálázott érték (cm-1)
Rezgés (típusa, %)
3305 3279 3272 3188 3157 3144 3126 3125 3099 3091 3091 3052 1902 1829 1712 1687 1663 1619 1546 1534 1523 1517 1497 1492 1469 1435 1419 1410 1392 1355 1338 1316 1308 1290 1285 1267 1246 1244 1219 1196 1183 1177 1172 1166 1118 1095 1088 1057 1046 1034 1029 1012 985 953
3083 3059 3052 2982 2944 2941 2924 2923 2899 2891 2883 2855 1774 1705 1597 1573 1551 1511 1443 1433 1423 1419 1399 1396 1374 1339 1324 1315 1299 1264 1249 1228 1221 1204 1200 1182 1165 1161 1138 1116 1106 1097 1096 1087 1043 1021 1015 986 975 965 961 946 919 889
νCHd 98 νCHd 99 νCHr 99 νCHs 99 νCHs 99 νCHs 99 νCHs 98 νCHs 99 νCHs 99 νCHs 98 νCHs 99 νCHs 99 νC=O 84 νC=O 92 νCCr 10 νCCr 66 νCCr 54 νCCr 17 νC-O 12 νC-O 11 νCCr 17 βCHs 14 νCCr 12 γCHs 79 γCHs 81 νC-O 26 νCCr 64 βCHd 25 νC-O 15 νC-O 15 νC-C 37 νC-C 17 νC-C 15 νC-C 10 βCHs 54 βCHs 45 βCHs 93 νC-O 24 νCCr 12 νC-O 40 βCHs 84 νC-O 38 βCHs 91 νC-O 21 νC-O 34 νC-O 28 νC-O 17 νC-O 20 νC-O 40 νC-O 56 νC-O 31 γCHs 82 νC-O 46 νC-O 17
βC-O 38 βC-C 10 νC=C 11 νC=C 56 νCCr 31 νCCr 16 νC-C 11 γCHs 85 βCHs 55
νCCr 13 γCHs 39 νCCr 22 βCHd 14 βCHs 33 βCHd 19 βCHd 18 βCHs 45 γCHs 23 γCHs 19
βC-C 26 βC-O 15 βCHr 13 βCHs 19 βCHs 14
βCHs 13 γCHs 30 γCHs 33
γCHs 11
βCHs 32
βCHs 15 βCHs 47 βC-C 11 βCHs 19 βCHs 31 γCHs 27
βCHr 19 νC-C 10 βCHs 24 γCHs 14 βCHd 14
βCHs 26 βCHr 32
νC-C 11 νCCr 11 βCHd 17 νC-C 32 νC-C 30 νC-C 12 βC=C 12 βCHs 11 γC=O 11 νC-C 25 νCCr 12
βCHd 20 νC-C 17 βC-O 36 βC=O 14 βC-O 10 βC-O 16
βC=C 14
γCHs 21
γCHs 13 βCHs 32
βC-C 15 βC-C 14 βC-C 11
βC-C 13 βC-C 10
βC=C 22
νC-C 24
βC-O 17
74
Számított érték (cm-1)
Skálázott érték (cm-1)
Rezgés (típusa, %)
932 869 νC-O 43 νC-C 32 914 853 γCHd 89 908 847 νC-C 11 βC-O 37 873 814 βC-O 28 βC-C 41 846 791 γCHs 63 γC=O 15 841 784 νCCr 15 βC-O 12 βC-C 25 824 768 βC-O 31 βC-C 44 811 756 γCHr 86 784 731 νC-O 10 βC-O 41 τCCr 10 755 704 γCHs 12 γC=O 21 τC-O 50 τC=C 12 745 694 γCHd 55 τC-O 12 730 681 τCCr 57 724 675 βC=O 20 βC-O 18 βCCr 13 τCCr 19 695 648 τCCr 66 691 644 νC=C 11 βC-C 21 βC=C 16 τCCr 13 639 596 νC-C 10 βC-O 53 βCCr 12 633 591 τC-O 36 τCCr 40 631 589 νC-C 14 βC-O 15 βCCr 18 βC=C 11 τC-O 10 581 542 νC-O 12 βCCr 16 τC-O 29 565 527 νC-C 11 βC=O 10 βC-O 22 βC-C 22 563 526 γCHs 24 γC=O 38 546 509 γCHs 10 γC=O 12 τC-C 25 τC=C 17 533 497 νC-O 11 τC-O 17 τC-C 10 500 466 νCCr 12 βC-O 21 βC-C 27 τC-C 10 465 433 βC=O 31 βC-O 38 445 415 νC-O 17 βC-O 14 βCCr 17 371 346 τC-O 62 νC-O 13 364 βC=O 12 βCCr 15 βC-C 11 τCCr 18 340 βC-O 24 342 βCCr 11 βC-C 31 319 314 γC=O 13 τC-O 17 τC-C 19 τC=C 24 293 300 νC-C 27 βCCr 16 βC-C 12 280 267 γCHs 62 τC-O 14 249 245 βC=O 16 βC-O 25 βC-C 33 228 τC-O 62 224 209 γCHs 10 210 τC-O 51 196 194 βC-O 13 τC-O 33 τCCr 24 181 177 βC-O 38 βC-C 16 τC-O 15 165 137 τC-O 28 τC=C 41 128 129 νCCr 10 βC-O 12 βCCr 16 βC-C 21 120 γC=O 16 118 τC-O 59 110 92 γC=O 19 τC-O 24 τC=C 44 86 68 τC-O 69 τC-C 12 64 τC-O 48 τC-C 40 65 61 53 τC-O 74 _ 49 36 γC=O 12 τC-O 74 34 A skálázáshoz használt faktor 0,87 volt minden koordinátánál rezgéstípusok: ν: vegyértékrezgés; β: síkbeli deformációs rezgés; γ: síkra merıleges deformációs rezgés; τ: torzió; d: C=C –hez kapcsolódás; s: C–C -hez kapcsolódás; r: aromás (győrő)
Mivel az F mátrix kvantumkémiai úton történı számítása rendszeres hibákat tartalmaz, ezért a kísérleti értékekre „skálázni” szokták ıket. Mivel nem álltak rendelkezésünkre kísérleti adatok, a véleményünk szerint elfogadható 0,87 értékő skálafaktort alkalmaztuk minden rezgési módra.
75
12. táblázat Az aflatoxin B1 demetilezett származékának (AFP1) számított rezgési frekvenciái [279] Számított érték (cm-1)
Skálázott érték (cm-1)
Rezgés (típusa, %)
3784 3305 3280 3225 3158 3144 3126 3099 3092 3091 1902 1830 1713 1693 1674 1624 1549 1530 1493 1470 1459 1434 1412 1406 1359 1338 1316 1312 1293 1286 1270 1262 1247 1216 1187 1174 1168 1139 1118 1094 1082 1054 1035 1030 1012 985 962 930 914 910 873 846 841 823
3540 3092 3068 3017 2954 2941 2924 2899 2892 2892 1774 1707 1598 1580 1562 1514 1446 1427 1396 1375 1361 1338 1319 1312 1270 1249 1229 1226 1208 1202 1187 1179 1167 1136 1108 1098 1092 1063 1043 1021 1010 984 966 961 945 919 898 868 855 849 815 791 785 768
νOH 99 νCHd 98 νCHd 99 νCHr 99 νCHs 99 νCHs 99 νCHs 97 νCHs 99 νCHs 99 νCHs 98 νC=O 75 νC=O 51 νCCr 13 νCCr 61 νCCr 59 νCCr 39 νC-O 14 νC-O 12 γCHs 80 γCHs 83 νC-O 33 νCCr 39 βCHd 26 νC-O 21 νC-O 11 νC-C 36 νC-C 18 νC-C 16 νC-C 12 βCHs 72 βOH 15 νCCr 13 βCHs 93 νC-O 22 νC-O 26 βCHs 90 νC-O 31 νC-O 23 νC-O 32 νC-O 26 νC-O 17 νC-O 16 νC-O 47 νC-O 20 γCHs 78 νC-O 49 νC-O 10 νC-O 43 γCHd 87 νC-C 12 βC-O 28 γCHs 66 νCCr 14 βC-O 34
βC=O 12 βC=O 43 βC-O 40 βC-C 15 βC-O 16 βC-O 25 νCCr 44 νCCr 35
νCCr 30 βOH 10 γCHs 45 νCCr 25 βCHd 16 βCHs 36 βCHd 16 βCHd 21 βCHs 21
βC-C 21 βCCr 10 βCHr 17 νC-C 12
βC=C 17
βC=C 22 βCHs 11 βCHs 51 βC-C 10 βCHs 22 βCHs 31 γCHs 45
βCCr 10
βCHs 41 νC-C 12
βOH 14
βCHs 14
βOH 16 νCCr 10
βCHr 38 νC-C 26
βCHs 10
βCHd 31 νCCr 11 νCCr 11 βCHd 16 νC-C 34 νC-C 33 βC-C 26 βC-C 35 τC-C 15 νC-C 23 νCCr 11 νC-C 32
βC-C 21 νC-C 18 βC-O 34 βC-O 10 βC-O 25
γCHs 17
γCHs 22
βC-C 12
βC=C 12
νC-C 30
βC-O 13
βC-O 41 βC-C 41 βC-O 12 βC-C 41
βC-C 23
76
Számított érték (cm-1)
Skálázott érték (cm-1)
Rezgés (típusa, %)
794 742 γCHr 85 780 728 νC-O 11 βC-O 32 τCCr 11 754 704 νC=C 17 γCHs 18 γC=O 30 τC=C 17 743 695 γCHd 64 726 677 τCCr 59 726 677 βC=O 11 βC-O 27 τCCr 28 694 647 τCCr 67 690 644 βC-C 45 βC=C 12 τCCr 15 639 596 βC-O 39 βC-C 17 628 587 τC-O 41 τCCr 40 614 573 νC-C 23 βC -O 13 βCCr 14 βC=C 11 586 547 νC-O 10 βC-O 11 βCCr 17 τC-O 22 563 526 γCHs 42 τC-C 30 552 515 τC-C 44 539 503 νC=C 12 τC-O 18 τC-C 26 τC=C 12 527 491 νC-O 18 νCCr 12 βC-O 25 489 456 βC-O 40 βC=C 10 459 428 νC-C 11 βC=O 17 βC-O 14 βC-C 22 443 413 νC-O 13 βC-O 13 βCCr 20 βC-C 14 404 378 γOH 76 τC-O 10 367 343 τC-O 46 362 338 βCCr 18 τC-C 24 318 296 βC-O 23 βC-C 12 τC-O 12 τCCr 10 304 284 νC=C 19 τC-C 25 τC=C 19 276 257 νC-C 18 βC-O 20 βCCr 18 βC=C 14 242 226 βC-O 20 βC-C 36 τCCr 10 222 208 τC-O 64 τC-C 17 219 204 τC-O 35 τC-C 38 192 179 βC-C 13 γC=O 10 τC-O 38 τC-C 19 134 125 βC-C 10 τC-C 29 127 118 τC-C 26 104 97 νC=C 16 γC=O 17 τC-C 40 τC=C 16 82 77 τC-O 34 τC-C 55 68 64 τC-O 23 τC-C 57 53 50 τC-O 45 τC-C 17 37 35 τC-O 32 τC-C 51 A skálázáshoz használt faktor 0,87 volt minden koordinátánál rezgéstípusok: ν: vegyértékrezgés; β: síkbeli deformációs rezgés; γ: síkra merıleges deformációs rezgés; d: C=C –hez kapcsolódás; s: C–C -hez kapcsolódás; r: aromás (győrő)
τC-C 13
τC-C 14 τC-O 11
τ: torzió;
5.1.7. Néhány faktor hatása a BioAréna rendszerben végzett biológiai értékelésre 5.1.7.1. Az inkubációs idı hatása a gátló zónák intenzitására
Az inkubációs idı, azaz a fertızés és a festés közötti idı befolyásolja a biológiai értékelés érzékenységét. Az 5.36. ábra egy rövidebb (2 óra) és egy hosszabb (18 óra) inkubációs idıvel kapott bioautogramot mutat az AFB1 esetében. Látható, hogy a rövidebb inkubációs idı alkalmazásánál intenzívebb gátló zónákat adott a toxin, érzékenyebb volt a rendszer, mint ahogy már korábban is tapasztalták transz-rezverátrolnál biotróf gombaspóra [171] és Bacillus subtilis
77
baktérium tenyészet [171] alkalmazása esetében is. 18 óra inkubációs idınél a gátló zónák kevésbé világosak, s egybıl elıtőnik egy sötétebb ív a foltok felett. A rövidebb inkubálási idı esetén tapasztalt nagyobb gátlóhatás oka az lehet, hogy ezen esetben a réteg HCHO-ra és reakciótermékeire nézve nagyobb telítettségő lehet, míg hosszabb idı elteltével feltételezhetıen csökken mennyiségük, így kisebb a gátló hatásuk a baktériummal szemben, a mikroorganizmus nagyobb tért tud hódítani, kisebbek lesznek a toxinok gátló zónái. A sötétedés jelenségével egy külön fejezetben foglalkozom. A további kísérletekben az érzékenyebb, 2 órás inkubációs idıt alkalmaztam.
5.36. ábra Az aflatoxin B1 antibakteriális aktivitása a fertızés és festés közötti A – 2 óra, B – 18 óra inkubációs idı alkalmazása esetén
5.1.7.2. A baktérium életkorának hatása a biológiai értékelésre
A mikroorganizmus szaporodásgörbéje 4 nagy fázisra osztható (5.37. ábra). Az elsı a lag, vagy adaptációs fázis, mely során még nincs növekedés, a sejteknek alkalmazkodniuk kell az új környezethez, a második a log vagy logaritmusos fázis, amikor exponenciálisan növekszik a sejtek száma, majd a stacioner vagy állandósult fázisban a sejtszám változatlan marad, mivel ugyanannyi keletkezik, mint amennyi elpusztul, s végül a sejtszám csökken a hanyatlási vagy pusztulási fázisban. A szaporodási görbe mentén kiválasztott 4 pontban (5.37. ábra) néztem meg a Psm érzékenységet AFB1-el szemben. Az 5.38. ábrán látható, hogy az A és B fázisban lévı baktériumok alkalmazásával kaptam erıs gátló zónát, azaz a logaritmusos fázis elején és végén. Ez arra vezethetı vissza, hogy a különbözı korú baktériumokban más biokémiai folyamatok játszódhatnak le, a különbözı kis és nagy molekulák mennyisége, koncentrációja változhat a sejtekben az öregedés során. Analóg módon gondolhatunk például a HCHO szint változására a
78
növényekben tavasztól ıszig, azaz megújulástól a programozott sejthalálig [81, 82]. Kísérleteimhez a késıbbiek során a logaritmusos fázis végénél járó Psm baktérium sejteket alkalmaztam, mert ott erısebb hátteret kaptam, s mikrobiológiai szempontból ennek a pontnak a reprodukálása könnyebb.
5.37. ábra A mikroorganizmusok szaporodási görbéje a négy fı fázissal az idı függvényében A-D pontok megfelelnek az általunk vizsgált baktérium sejtek szaporodási állapotának.
5.38. ábra Az aflatoxin B1 antibakteriális hatása négy különbözı fejlıdési állapotban lévı baktérium sejtekre Az A-D rétegeknél alkalmazott sejtek állapota megfelel az 5.37. ábrán feltüntetett szaporodási görbe A-D pontjainak.
79
5.1.7.3. A kromatográfiás foltok színének és formájának idıbeli változása biológiai elıhívás után A biológiai vizsgálatok során, a felhasznált tesztsejtek minıségétıl és mennyiségétıl függıen, a festést követıen kb. 2 vagy csak 18 órán belül válik láthatóvá a rétegen lévı anyagok sejtszaporodásra kifejtett hatása. A hagyományos direkt bioautográfiás kísérletekben az eredmény dokumentálása után kidobják a réteglapot, míg a BioArénában tovább inkubáljuk akár 5-6 napig is, s folyamatosan figyelemmel kísérjük a változásokat.
5.39. ábra Az aflatoxinok foltjainak idıbeli változása biológiai detektálás után Az ábrák a festés után A – 2, B – 18 órával illetve C – 5 nappal készültek (ugyanazon lapról!)
5.40. ábra Az ochratoxin A foltjainak idıbeli változása biológiai detektálás után Az ábrák a festés után A – 2, B – 18 órával illetve C – 3 nappal készültek Az aflatoxinok 2 órával az MTT-vel való festés után sötét foltokként jelentek meg a háttérhez képest, 18 óra múlva világos gátló zónájuk lett, majd 5 nap múlva újból sötétebb foltokként látszottak (5.39. ábra). Az OA foltjának idıbeli változását nézve (5.40. ábra),
80
látható, hogy már kezdetben is fehér foltként tőnt elı, s a gátló zónája harmadnapra teljesen besötétült, intenzívebb színővé válik a háttérhez képest. A sötétedésnek több oka is lehet, mint pl. sejtszaporodás serkentı hatás, vagy esetleg a vizsgálni kívánt anyagok képesek redukálni a festéket, vagy a sejtekben felszabaduló HCHO, mint redukáló anyag alakítja az MTT-t formazanná.
5.1.7.4. A háttérhez képest sötétebb foltok kialakulásának oka (és magyarázata) a rétegen A rétegen a háttérnél intenzívebb szín kialakulása az MTT nagyobb mértékő redukciója miatt van. Jellemzı a sötét győrő megjelenése a kromatográfiás folt szélén (5.36. és 5.38-5.40. ábrák), ahol a Gauss eloszlás miatt eleve kevesebb toxin van jelen (5.41. ábra). Ez a győrő szélesedik befelé, s így az egész folt sötétebbé válik a környezeténél. A kék szín intenzívebbé válásának az
5.41. ábra A toxin a kromatográfiás foltban közel Gauss eloszlású, ennek megfelelıen a sötét győrő a kisebb mennyiségő toxint tartalmazó helyen alakul ki [172]
5.42. ábra Az öt vizsgált mikotoxint tartalmazó kifejlesztett rétegek, melyek MTT festék oldatába lettek bemerítve elızetes fertızés nélkül
oka lehet a sejtek számának nagyobb mértékő növekedése, azaz ha az élı sejtek redukálják a festéket, vagy elıfordulhat, hogy a fertızött rétegen pl. egy keletkezı anyag, vagy maga a toxin, mint ahogy a polifenolokról is leírták [293], képesek az MTT-t MTT-formazanná alakítani a sejtszaporodás serkentése nélkül. Baktériummentes, kifejlesztett réteglapokat megfestve MTTvel, az általam vizsgált toxinok nem tudták redukálni a festéket (5.42. ábra), nem volt tapasztalható sötét folt kialakulása. Ezért ellenıriztük az élı baktériumok számát az AFB1-et
81
tartalmazó réteglap különbözı területein, mint a kromatográfiás folt közepén, szélén és egy háttérfoltban, ahol nem lehetett toxin. Mintát véve a foltokból a fertızött adszorbensrıl, 18 órával a Psm-be való merítés után, az ott lévı élı sejtek, megfelelı hígítás után, szilárd táptalajon lettek szélesztve. Az 5.43. ábrán lévı grafikon mutatja a kinıtt baktérium telepek számát (logaritmikus skálát alkalmazva), mely a szaporodásra képes baktériumok mennyiségével arányos. Három független kísérletben is azt tapasztaltam, hogy a toxin foltjának szélén van a legtöbb szaporodásra képes baktérium, s a folt közepén a legkevesebb. Ebbıl feltételezhetı, hogy az intenzívebb szín a sejtek nagyobb számát jelzi. Viszont akkor felmerül a kérdés, hogy mi segíti, serkenti a sejtek szaporodását a toxin jelenlétében.
Baktérium telepek száma
100000
10000
1000
folt közepe háttér folt széle
100
10
1 I.
II.
III.
Kísérletek
5.43. ábra A réteg különbözı pontjaiból vett mintákból a táptalajon felszaporított baktérium telepeinek száma A toxin a kromatográfiás foltban közel Gauss eloszlású, így feltételezhetı, hogy az endogén HCHO prekurzorok és/vagy a saját maga demetilezése által generált HCHO szintje is Gauss eloszlást mutat, azaz a folt szélén a legkisebb. Tyihák és mtsai mutatták ki a sejt tenyészetekhez adagolt analitikai tisztaságú HCHO dózis-függı hatását [141]. Nagyobb koncentrációban apoptózist és sejtszaporodás gátlást, míg kis dózisnál a sejtszaporodás serkentését és az apoptózis csökkenését tapasztalták. Ebbıl következik, hogy a HCHO-nak lehet sejtszaporodás gátló és serkentı hatása itt is, koncentrációtól függıen! Ez magyarázhatja a folt besötétedését is, mivel ha a foltban a HCHO szintje folyamatosan csökken, elérhet egy olyan kis koncentrációt, hogy a foltban sejtszaporodást serkentı hatása lesz. S ezt az alacsonyabb szintet nyilvánvalóan ott éri el elıbb, ahol kevesebb toxin van, azaz a folt szélén, majd halad befelé, s eléri a folt közepét. Ezért fontos, hogy a toxinfolt közepén is van szaporodásra képes baktérium, illetve, hogy a sötétedés a folt szélén kezdıdik el.
82
5.2. A BioArénában, a sejt szuszpenzióhoz adagolt endogén és exogén anyagok hatása a vizsgált mikotoxinok antibakteriális - toxikus aktivitására Feltételeztem, hogy a HCHO-nak és reakciótermékeinek szerepe van az aflatoxinok és az OA antibakteriális-toxikus hatásában. A HCHO és a H2O2 jelenléte is kimutatható a BioArénában, ami nem törvényszerő a biológiai rendszerekben, mivel e molekulák képzıdése és kölcsönhatási reakcióik gyorsak, folyamatosak lehetnek. A fertızött rétegen a toxinok foltjaiban mért (a fertızés pillanatától győjtött) nagyobb mennyiségő HCHO képzıdhet a különbözı endogén és/vagy exogén prekurzorok stressz hatására megnövekedett demetilezésébıl ugyanúgy, mint ahogy az aflatoxinok metoxi csoportjából is. A BioAréna rendszerben az AFB1 demetilezését támasztja alá, hogy FT-Raman spektroszkópiás kísérletben csökkent a δCH3 sáv (az (O)-CH3 csoport deformációs rezgésére jellemzı sáv) relatív intenzitása Psm jelenlétében.
5.44. ábra A HCHO és a H2O2 feltételezett reakciója Piros keret jelzi, hogy melyik lépésnél próbáltam befolyásolni a reakciósort, vagyis a mikotoxinok antibakteriális-toxikus aktivitását.
83
A fertızött rétegen, az AFB1 és az OA foltjában mért H2O2 mennyisége kisebb volt a háttérhez képest, ami feltehetıen abból következik, hogy a H2O2 reagált, reakcióba lépett valamivel. A HCHO és a H2O2, e két kis molekula is reagálhat egymással, s reakciótermékeik közt nagyon reaktív oxigén molekulák találhatóak, mint az 1O2, és az O3 (5.44. ábra) [135, 139]. Kiindulva abból a hipotézisbıl, hogy a HCHO és reakciótermékei részt vesznek az aflatoxinok és az OA ölı hatásában, egyértelmő, hogy ezek eliminálásának csökkentenie, mennyisége növelésének pedig fokoznia kellene az általam vizsgált toxinok antibakteriális hatását. Feltételezésem igazolására ennek megfelelıen, a BioArénás kísérletekben, a HCHO mennyiségének csökkentésére vagy növelésére illetve O3 eltávolítására alkalmas vegyületeket oldottam a baktérium sejt szuszpenzióban. Az elıbbivel a feltételezett reakció sornak már az elsı lépésénél próbáltam beavatkozni, míg az O3-befogókkal, a sor utolsó lépésénél kívántam befolyásolni a mikotoxinok antibakteriális-toxikus hatását.
5.2.1. Formaldehid eltávolító anyagok A sejtekbe különbözı forrásokból, pl. a levegıbıl, endogén vagy exogén anyagok metilezésidemetilezési folyamata során kerülhet a HCHO [77-82], mely nagy reaktivítású, reakciótermékei közt megtalálhatók a reaktív oxigén molekulák, ezért fontos a detoxifikációs útja. A legkézenfekvıbb, ha a HCHO és reakciótermékeinek hatását mindjárt a HCHO mennyiségének csökkentésével mérsékeljük. Ehhez különbözı HCHO befogó és redukáló anyagokat alkalmaztam.
5.2.1.1. L-arginin A BioArénában L-arginin HCHO-reagenst (2.7. ábra) [105] adagolva a Psm sejt szuszpenzióba, a toxinok gátló hatása részben vagy teljesen visszaszorult. Már 1 mg/ml Larginin koncentrációnál csökkent az aflatoxinok antibiotikus hatása, kisebb lett a gátló zónák mérete a kontroll réteggel összehasonlítva. 2 mg/ml L-arginin jelenlétében még nagyobb csökkenést tapasztaltam, s az AFG2 antimikrobiális hatása teljesen eltőnt (5.45. ábra). A gátló hatás csökkenését mind a 4 aflatoxin esetében a kvantitatív denzitometriás értékelés is bizonyítja (5.46. ábra). Az integrálással kapott eredmények (13. táblázat) AFB1 esetén 29 %-os, AFB2nél 54 %-os, AFG1-nél 52 %-os gátló zóna csökkenést mutatnak a baktérium sejt szuszpenzió 2 mg/ml L-argininnel való kezelésénél a kontroll, adagolt anyagot nem tartalmazó sejt szuszpenzióval fertızött réteghez képest. Az antibakteriális foltnak nem csak az átmérıje és az
84
intenzitása lett kisebb, hanem azonnal egy sötét győrő is megjelent a világos terület körül, azaz a kromatográfiás folt szélén, ahol a Gauss eloszlás miatt eleve kevesebb toxin van jelen (5.41. ábra).
5.45. ábra Az L-arginin hatása az aflatoxinok antibakteriális aktivitására [172] A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B, C – kezelt rétegek, L-arginint (1, illetve 2 mg/ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merítettek
5.46. ábra Az L-argininnek az aflatoxinok antibakteriális aktivitására való hatásának denzitometriás értékelése
–– a kontroll rétegen található megfelelı aflatoxin folt denzitogramja (5.45. ábra A kép) –– az L-arginint tartalmazó (2 mg/ml) sejttenyészetbe merített rétegen található megfelelı aflatoxin folt denzitogramja (5.45. ábra C kép)
85
13. táblázat Az 5.46. ábrán látható denzitogramok negatív csúcsainak integrált értékei
AFB1 AFB2 AFG1 AFG2
Psm (100 %) 4624041 4022600 3560559 3330784
+ L-arginin (2 mg/ml) 3293578 1851609 1730786 -
% 71 46 48 -
5.47. ábra Az L-arginin hatása az OA Psm-mel szembeni antibakteriális hatására A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba lett merítve B, C, D, E – kezelt rétegek, L-arginint (1; 2; 4 illetve 8 mg/ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba lettek merítve
5.48. ábra Az L-argininnek az OA antibakteriális aktivitására való hatásának denzitometriás értékelése
A –a kontroll rétegen található 1 µg-os OA folt denzitogramja (5.47. ábra A kép) B, C, D, E –az L-argininnel kezelt rétegeken található 1 µg-os OA folt denzitogramja (5.47. ábra B, C, D illetve E kép)
A sötétedést, mint már korábbi fejezetben írtam, okozhatja az alacsonyabb szintő HCHO [141], melynek sejtszaporodás serkentı hatása van, s így a nagyobb festékredukció a nagyobb sejtszámból eredeztethetı.
86
Növelve az L-arginin koncentrációját a Psm sejt szuszpenzióban, az OA baktérium ellenes hatása folyamatosan csökken (5.47. ábra), a gátló zónák intenzitása gyengül, átmérıjük kisebb lesz, amit az 1 µg-os foltok denzitometriás értékelése is alátámaszt (5.48. ábra). A denzitogramok integrálásával kapott értékek is ennek megfelelıen csökkennek (14. táblázat). Míg 1 mg/ml koncentrációnál 28 %-kal, addig 8 mg/ml-nél már 80 %-kal redukálódott az antimikrobiális jel a kontrollhoz képest. Az eredmények is alátámasztják a hipotézist, hogy a mikotoxinok foltjában alapvetıen nagyobb szinten lévı HCHO szerepet játszhat toxikus hatásukban. A toxinok hatása gyengül, ha a sejt tenyészethez HCHO-befogó L-arginint adunk, s a baktériumgátló hatás arányosan gyengül a HCHO-reagens mennyiségének növelésével. 14. táblázat Az 5.48. ábrán látható denzitogramok negatív csúcsainak integrált értékei
psm + L-arginin (1 mg/ml) + L-arginin (2 mg/ml) + L-arginin (4 mg/ml) + L-arginin (8 mg/ml)
terület 2346258 1701175 1348742 871726 471099
% 100 72 57 37 20
5.2.1.2. Redukált glutation A BioAréna rendszerben GSH-t 2 mg/ml koncentrációban adagolva, az aflatoxinok gátló zónái szinte teljesen eltőntek, csak az AFB1 mutatott kicsi antibakteriális hatást (5.49. ábra). Ezt támasztja alá a gátló zónák denzitometriás értékelése is (5.50. ábra, 15. táblázat), mely 63 %-os aktivitás enyhülést mutat az AFB1 esetében, míg a többi aflatoxinnál 100%-t. Ezzel szemben az OA gátló zónája növekedett, azaz az antimikrobiális aktivitása nagyobb lett GSH kezelés (2 mg/ml) hatására. Ezt az erısödést bizonyítják a világos foltokról felvett denzitogramok is (5.51. ábra), melyek integrált értékei 50 %-os hatásnövekedést mutatnak GSH befolyására. Az aflatoxinok esetében tapasztalt aktivitásbeli csökkenés magyarázható a GSH HCHOmegkötı tulajdonságával (2.8. ábra) [106, 215]. Az OA-nál azonban nem várt eredményt kaptam. Korábbi közleményekben is utaltak arra, hogy ellentmondást tapasztaltak az OA és a GSH viszonyában. Annak ellenére ugyanis, hogy a GSH általánosan a sejtek védelmi rendszerében játszik szerepet, a citokróm P2C9 enzimet tartalmazó NIH/3T3 sejtekben a GSH megvonás az OA citotoxicitásának csökkenését eredményezte [52]. Ezt az ellentmondást feloldhatja az a feltételezett mechanizmus, hogy a GSH képezhet adduktot az OAQ-val, mely esetleg toxikus hatású, vagy ha az S-hidroximetil-glutation reagál az
87
OAQ-val, akkor melléktermékként gerjesztett HCHO keletkezhet, melyek növelhetik az antibakteriális aktivitást, s így a toxicitást is.
5.49. ábra A GSH hatása az aflatoxinok Psm-mel szembeni antibakteriális hatására A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B – kezelt réteg, GSH-t (2 mg/ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített
5.50. ábra A GSH hatása az aflatoxinok antibakteriális aktivitására; denzitometriás értékelés
–– a kontroll rétegen található megfelelı aflatoxin folt denzitogramja (5.49. ábra A kép) –– az 2 mg/ml GSH-val kezelt rétegen található megfelelı aflatoxin folt denzitogramja (5.49. ábra B kép)
88
5.51. ábra A GSH hatása az OA antibakteriális aktivitására A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B – kezelt réteg, GSH-t (2 mg/ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített
5.52. ábra A GSH hatása az OA antibakteriális aktivitására; denzitometriás értékelés
–– a kontroll rétegen található 1 µg-os OA gátló zónájának denzitogramja (5.51. ábra A kép) –– a 2 mg/ml GSH-val kezelt rétegen található 1 µg-os OA gátló zónájának denzitogramja (5.51. ábra B kép)
15. táblázat Az 5.50. és 5.52. ábrán látható denzitogramok negatív csúcsainak integrált értékei
AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 OA 1
Psm (100 %) 3456894 1970236 1473733 954500 1197152
+ GSH (2 mg/ml) 1266306 1797138
% 37 150
89
5.2.1.3. L-aszkorbinsav Az AA-t, mint HCHO eltávolító adalék anyagot alkalmazva a BioAréna rendszerben, az AA koncentrációfüggı hatást gyakorolt az aflatoxinok antibakteriális aktivitására. Kis koncentráció AA-nál (10 mg/100ml) a gátló zónák megnıttek, míg nagy mennyiségő AA-t oldva a sejt szuszpenzióban, az antimikrobiális hatás szinte teljesen eltőnt mind a 4 aflatoxin esetében (5.53. ábra). Mind a 4 aflatoxinra hasonló hatással volt a különbözı koncentrációjú AA, ami azt jelzi, hogy az antibakteriális-toxikus aktivitásuk alapja azonos. Összehasonlítva egy AA-val kezelt és egy adalékanyag mentes Psm-be merített réteglap különbözı pontjaiban lévı szaporodásra képes baktériumok mennyiségét, azt tapasztaltam, hogy az AFB1 foltban az AA jelenlétében 200 %kal több volt a sejtek száma, míg a háttérben 35 %-kal csökkent (5.54. ábra). Az eredmény azt bizonyítja, hogy az AA valóban csökkentette az AFB1 antibakteriális hatását, s a gátló zóna eltőnését nem (csak) az AA festéket redukáló hatása okozta. Az AFB1 gátló zónájáról készített denzitogramok (5.55. ábra) és az integrált értékek (16. táblázat) bizonyítják az AA dózistól függı kétféle hatását. A kontrollhoz képest a 10 mg/100 ml koncentrációnál 62 %-kal nıtt a gátló zóna, míg 50 illetve 100 mg/100 ml AA adaléknál 21 illetve 80 %-os gátló zóna csökkenést tapasztaltam az AFB1 esetében.
5.53. ábra Az AA hatása az aflatoxinok Psm-mel szembeni antibakteriális hatására [271, 273] A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B, C, D – kezelt rétegek, AA-t (10, 50 illetve 100 mg/100 ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített
Az AA koncentráció függı hatását nemcsak az antioxidáns-prooxidáns aktivitásával, hanem mással is lehet magyarázni, amire szükség is lehet, mivel in vivo kísérletek nem bizonyították az antioxidáns tulajdonság szerepét az AA jótékony hatásában [217]. Bizonyították, hogy az AA jelenlétében a H2O2 szint emelkedik [216], s feltehetı, hogy a HCHO szint csökken [102, 225] a
90
biológiai rendszerekben, mivel az AA megkötheti a HCHO-t (2.10. ábra) [225], illetve redukálhatja is etilén glikollá [102]. E két nagyon kicsi molekula között az élı sejtekben
Baktérium telepek száma
folyamatos a reakció, aminek sebessége befolyásolható pl. a HCHO vagy a H2O2 eliminálásával.
50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0
háttér AFB1 folt
Psm
AA
5.54. ábra A kontroll és az AA-val kezelt rétegek különbözı pontjaiban vett mintákból a táptalajon felszaporított baktérium telepeinek száma
5.55. ábra Az AA-nak (10, 50 illetve 100 mg/100 ml) az AFB1 antibakteriális aktivitására való hatásának denzitometriás értékelése [271, 273] Az 5.53. ábra megfelelı (A-D képig) AFB1 foltjainak negatív denzitogramjai.
91
16. táblázat Az AFB1 gátló zónáiról készült denzitogramok (5.55. ábra) negatív csúcsainak integrált értékei
AFB1 %
Psm (100 %) 4277741 100
+ AA + AA + AA (10 mg/ 100 ml) (50 mg/ 100 ml) (100 mg/ 100 ml) 6949862 3392911 867059 162 79 20
Feltételezhetı, hogy a HCHO csökkenése és a H2O2 generálása kis AA koncentrációnál, azaz az AA két ellentétes hatásának eltolása, prooxidáns hatást eredményez. Míg a nagy dózisú AA védı hatása eredhet a HCHO megfelelı elvonásából, csökkentve az oxidánsok, mint az 1O2 és O3 keletkezésének mértékét. Az AA az OA antibakteriális hatását szintén csökkentette (5.56. ábra) 100 mg/100 ml koncentrációt alkalmazva. A denzitometriás értékelés is alátámasztja ezt (5.57. ábra, 17. táblázat), s a 0,5 µg-os OA foltnál 75 %-os, az 1 µg-os OA gátló zónájánál 68 %-os hatáscsillapodást mutat.
5.56. ábra Az AA hatása az OA Psm-mel szembeni antibakteriális aktivitására A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B – kezelt réteg, AA-t (100 mg/100 ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített
92
A
B
5.57. ábra Az AA-nak az OA antibakteriális aktivitására való hatásának denzitometriás értékelése A negatív denzitogramok az A – 0,5 µg-os és a B – 1 µg-os OA foltokról készültek.
–– a kontroll rétegen található gátló zóna denzitogramja (5.56. ábra A kép) –– a 100 mg/100 ml AA-val kezelt rétegen található gátló zóna denzitogramja (5.56. ábra B kép) 17. táblázat Az OA gátló zónáiról készült denzitogramok negatív csúcsainak (5.57. ábra) integrált értékei
0,5 µg OA 1 µg OA
Psm (100 %) 1785696 3169036
+ AA (100 mg/100 ml) 798226 1028018
% 25 32
A rosszindulatú daganatok megelızésére és alternatív kezelésére az AA nagy dózisban való fogyasztását már 1971-ben ajánlották [294]. Azóta is nagy figyelem kíséri a daganatos betegségek és az AA kapcsolatát, viszont az eredmények eléggé különbözıek. Annak ellenére, hogy az AA az egyik legfontosabb táplálék kiegészítı lett az 1990-es években, a statisztikák a tumoros megbetegedések és a kóros sejtszaporodás különbözı változataiban elhunytak számában jelentıs növekedést mutatnak [13]. Ezért további vizsgálatok kellenek, hogy vajon a nagy mennyiségő AA valóban védı hatású-e, vagy problémákat okoz [216], különös tekintettel arra, hogy az AA csökkenti a fitoalexin (növényi antibiotikum) transz-rezveratrol antibakteriális aktivitását is [271], s így feltételezhetıen, más biológiai aktivitással rendelkezı vegyületek (pl. antibiotikumok) hatását is befolyásolhatja. .
93
5.2.1.4. Se(IV) ionok 0,5 mg Na-szelenitet (0,23 mg Se(IV) ion) oldva 100 ml baktérium sejt szuszpenzióban, a mikotoxinok (5.58. és 5.60. ábra) antibakteriális hatása csökkent, s 1 mg/100 ml koncentrációban szinte teljesen eltőntette az aflatoxinok toxikus aktivitását jelzı gátló zónákat (5.58. ábra). A Se(IV) ionok hatását a mikotoxinok antibakteriális aktivitására a biológiai detektálás utáni denzitometriás értékelés segítségével kvantitatíven igazoltam (5.59. és 5.61. ábra). Az 18. és 19. táblázatban látható, hogy minden toxin esetében a gátló zónák csökkenését tapasztaltam, bár különbözı %-ban, de az megfigyelhetı, hogy 1 mg/100 ml Na-szelenit koncentrációt alkalmazva minden esetben kisebb területet kaptam, mint a 0,5 mg/100 ml-nél. Az elıbbinél az AFB1 49, az AFG1 85 s az OA zónája 27 % -kal csökkent, az AFB2 és AFG2 foltja pedig eltőnt, míg az utóbbinál az AFB1 23, az AFB2 20, az AFG1 38, az AFG2 50 s az OA zónája 13 % -kal csökkent.
5.58. ábra A Se(IV) ionok hatása az aflatoxinok Psm-mel szembeni antibakteriális hatására [268] A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba meritett B, C – kezelt rétegek, Se(IV) ionokat (0,5 illetve 1 mg Na-szelenit/100 ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba meritett
A Se-vegyületeket, mint a Na-szelenitet, metilezi a Pseudomonas syringe baktérium, hogy dimetil-szelenid és/vagy dimetil-diszelenid formájában kipárologtassa [231]. A Se spontán és enzimatikus metilezési reakciója feltételezhetıen HCHO-n keresztül megy végbe [92, 102], így a Se HCHO befogó molekulának tekinthetı. A HCHO s ezáltal reaktív reakciótermékei szintjének csökkenése eredményezheti az aflatoxinok és az OA kisebb, majdnem teljesen eltőnı antimikrobiális hatását.
94
Az AFB1 esetében a Se(IV) koncentráció-függı hatását vizsgálva, nem lineáris hatást tapasztaltam (5.62. ábra), melyet bizonyít az 1 µg-os foltok denzitometriás értékelése (5.62. ábra, 20. táblázat). Kis koncentrációjú (0,1 mg Na-szelenit/100 ml sejt szuszpenzió) Se(IV) ion jelenlétében szélesebb gátló zónát tapasztaltam (48 %-os növekedés), azaz megnıtt az AFB1 antibakteriális-toxikus hatása, mely összhangban van a természetes antioxidánsok esetében gyakran elıforduló prooxidáns hatással [220, 295].
5.59. ábra A Se(IV) ionok hatása az aflatoxinok antibakteriális aktivitására: denzitometriás értékelés
–– a kontroll rétegen található megfelelı aflatoxin folt denzitogramja (5.58. ábra A kép) –– a 0,5 mg/100 ml Na-szelenittel kezelt rétegen található megfelelı aflatoxin folt denzitogramja (5.58. ábra B kép)
–– a 1 mg/100 ml Na-szelenitet tartalmazó baktérium sejt szuszpenzióval kezelt rétegen található megfelelı aflatoxin folt denzitogramja (5.58. ábra C kép)
18. táblázat Az 5.59. ábrán látható denzitogramok negatív csúcsainak integrált értékei
AFB1 AFB2 AFG1 AFG2
Psm + Na-szelenit (100 %) (0,5 mg/100 ml) 4883498 3773790 3716827 2969782 4215664 2610139 2923726 1458693
% 77 80 62 50
+ Na-szelenit (1 mg/ 100 ml) 2483432 650187 -
% 51 15 -
95
5.60. ábra A Se(IV) ionok hatása az OA Psm-mel szembeni antibakteriális hatására [268] A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B, C – kezelt rétegek, Na-szelenitet (0,5 illetve 1 mg/100 ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merítettek
A
B
5.61. ábra A Se(IV) ionok hatása az OA antibakteriális aktivitására; denzitometriás értékelés A negatív denzitogramok az A – 0,5 µg-os és a B – 1 µg-os OA foltokról készültek.
–– a kontroll rétegen található gátló zóna denzitogramja (5.60. ábra A kép) –– a 0,5 mg/100 ml Na-szelenittel kezelt rétegen található gátló zóna denzitogramja (5.60. ábra B kép) –– a 1 mg/100 ml Na-szelenittel kezelt rétegen található gátló zóna denzitogramja (5.60. ábra C kép)
96
19. táblázat Az 5.61. ábrán látható denzitogramok negatív csúcsainak integrált értékei
Psm + Na-szelenit (0,5 mg/ 100 ml) + Na-szelenit (1 mg/ 100 ml)
0,5 µg OA terület % 2755884 100 1919369 70 1606193 58
1 µg OA terület % 4394387 100 2570586 58 2139291 48
5.62. ábra A Se(IV) ionok hatása az AFB1 Psm-mel szembeni antibakteriális aktivitására [268]
A negatív denzitogramok az 1 µg-os AFB1 gátló zónájáról készültek. A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B, C, D – kezelt rétegek, Na-szelenitet (0,1; 0,5 illetve 1 mg/100 ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített
20. táblázat Az 5.62. ábrán látható denzitogramok negatív csúcsainak integrált értékei
Psm + Na-szelenit (0,1 mg/ 100 ml) + Na-szelenit (0,5 mg/ 100 ml) + Na-szelenit (1 mg/ 100 ml)
terület 2855175 4231501 2494117 2080631
% 100 148 87 73
97
5.2.1.5. Dimedon A mesterséges, sejtidegen HCHO-befogó Dim vegyület [84] (2.11. ábra) hatását a toxinok Psm-mel szembeni antibakteriális aktivitására szintén vizsgáltam a BioAréna rendszerben. A baktérium sejt szuszpenzióhoz Dim-et adagolva, a kezelt rétegen az AFB1 (20 mg/100 ml Dim koncentrációnál) és az OA (10 mg/100 ml Dim koncentrációnál) gátló zónái is kisebbek lettek, intenzitásukból vesztettek a kezeletlen réteghez képest (5.63. és 5.65. ábra). Ezt a bioautogramokon szemmel látható változást alátámasztják a gátló zónákról készült negatív denzitogramok (5.64. és 5.66. ábra), melyek csúcsait integrálva (21. és 22. táblázat), az AFB1 esetében 58 %, míg az OA-nál 33-34 % hatáscsökkenést kaptam. Mivel a Dim speciálisan aldehid reagens, irreverzibilisen köti meg a HCHO-t, ezért az eredmények azt a feltételezést vonják maguk után, hogy a HCHO-nak alapvetı szerepe lehet az AFB1, így az aflatoxinok és az OA antibakteriális-toxikus aktivitásában.
5.63. ábra A Dim-nek az AFB1 antibakteriális hatását csökkentı aktivitása [273] A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B – kezelt réteg, Dim-et (20 mg/100 ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített
98
A
B
5.64. ábra A Dim aflatoxinok antibakteriális aktivitását befolyásoló hatásának denzitometriás értékelése. A negatív denzitogramok az A – 0,5 µg-os és a B – 1 µg-os AFB1 foltokról készültek.
–– a kontroll rétegen található AFB1 folt denzitogramja (5.63. ábra A kép) –– az 20 mg/100 ml Dim-mel kezelt rétegen található AFB1 folt denzitogramja (5.63. ábra B kép) 21. táblázat Az AFB1 gátló zónáiról készült denzitogramok negatív csúcsainak (5.64. ábra) integrált értékei Psm +Dim (100 %) (20 mg/100 ml) 1689114 0,5 µg AFB1 4062610 2759984 1 µg AFB1 6578543
% 42 42
5.65. ábra A Dim hatása az OA antibakteriális aktivitására A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B – kezelt réteg, Dim-et (10 mg/100 ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített
99
A
B
5.66. ábra A Dim hatása az OA antibakteriális aktivitására, denzitometriás értékelés A negatív denzitogramok az A – 0,5 µg-os és a B – 1 µg-os OA foltokról készültek.
–– a kontroll rétegen található OA folt denzitogramja (5.65. ábra A kép) –– az 10 mg/100 ml Dim-mel kezelt rétegen található OA folt denzitogramja (5.65. ábra B kép) 22. táblázat Az OA gátló zónáiról készült denzitogramok negatív csúcsainak (5.66. ábra) integrált értékei Psm (100 %) 1 µg OA 2696882 0,5 µg OA 1036319
+Dim (10 mg/100 ml) 1819674 685306
% 67 66
5.2.2. Formaldehid prekurzorok Feltételeztem, hogy a toxinok ölıhatásában szerepet játszik a HCHO, ezért elsısorban a HCHO szint változtatásával akartam befolyásolni az aflatoxinok és az OA aktivitását. Bemutattam, hogy a vizsgált toxinok antibakteriális-toxikus hatása csökkent, mikor megvontam a HCHO-t a rendszerbıl. Felmerült a kérdés, hogy a HCHO szint emelésével növelhetı-e az antimikrobiális hatásuk. Ehhez vizsgáltam a BioAréna rendszerben, hogy a toxinok hatását befolyásolja-e az endogén MMA és MML, melyek N-metilezett vegyületek, így alapjában véve potenciális HCHO elıanyagoknak tekinthetık, mert demetilezıdésük során HCHO keletkezhet [79-81].
100
5.2.2.1. NG-monometil-L-arginin Az MMA (1 mg/ml) mind a 4 aflatoxin és az OA antimikrobiális hatását is növelte. Szemmel láthatóan megnıtt a toxikus hatást jelzı világos foltok területe (5.67. és 5.69. ábra). A denzitometriás értékelés (5.68. és 5.70. ábra, 23. és 24. táblázat) mutatja, hogy a kontrollal összehasonlítva, az AFB1, az AFG1 és az OA gátló zónái kb. 70 %-kal nıttek, míg az AFB2 esetében kb. 20 %-os, s az AFG2-nél pedig kb. 40 %-os növekedést tapasztaltam MMA jelenlétében.
5.67. ábra Az MMA hatása az aflatoxinok Psm-mel szembeni antibakteriális hatására A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B – kezelt réteg, MMA-t (1 mg/ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített
A háttér intenzitása lényegében nem változott, azaz amelyik baktérium nem érintkezett toxinnal, arra nem hatott látható mértékben az MMA. Ebbıl arra lehet következtetni, hogy az MMA-nak csak a toxin jelenlétében (indukciójára) van hatása, azaz stressz helyzetben, amikor a demetilezési potenciál megnövekszik [85, 115, 117, 118], feltehetıen elısegítve az MMA demetilezıdését is. Feltételezhetı, hogy ezen demetilezési reakció során is HCHO keletkezik, mint a SAM demtilezıdése során is [92], melyet a hisztaminnak jelzett SAM segítségével végzett enzimatikus metilezése során mutattak ki HCHO befogó molekula (Dim) használatával. A mért jelzett formaldemeton mennyisége és a jelzett hisztamin csökkenése között egyenes összefüggés adódott. A SAM enzimatikus reakciója, donor funkciója során Walden inverzióval elıbb metanol keletkezik, majd az oxidálódik tovább HCHO-vá [92]. Ebbıl következik, hogy MMA jelenlétében a kontrollhoz képest nagyobb mennyiségő HCHO szabadulhat fel a toxinok
101
foltjában. Feltételezhetı tehát, hogy az MMA, mint HCHO prekurzor játszik szerepet a nagyobb antibakteriális-toxikus hatásban.
5.68. ábra Az MMA-nak az aflatoxinok antibakteriális aktivitására való hatásának denzitometriás értékelése
–– a kontroll rétegen található megfelelı aflatoxin folt denzitogramja (5.67. ábra A kép) –– az 1 mg/ml MMA-val kezelt rétegen található megfelelı aflatoxin folt denzitogramja (5.67. ábra B kép)
23. táblázat Az 5.68. ábrán látható denzitogramok negatív csúcsainak integrált értékei
AFB1 AFB2 AFG1 AFG2
Psm (100 %) 3485989 1929070 1816838 1094690
+ MMA (1 mg/ml) 4723252 2338862 3232562 1561908
% 164 121 178 143
102
5.69. ábra Az MMA hatása az OA Psm-mel szembeni antibakteriális aktivitására A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B – kezelt réteg, MMA-t (1 mg/ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített
A
B
5.70. ábra Az MMA-nak az OA antibakteriális aktivitására való hatásának denzitometriás értékelése A denzitogramok az A – a 0,5 µg-os B – az 1 µg-os OA foltokról készültek.
–– a kontroll rétegen található OA folt denzitogramja (5.69. ábra A kép) –– a 1 mg/ml MMA-val kezelt rétegen található OA folt denzitogramja (5.69. ábra B kép) 24. táblázat Az 5.70. ábrán látható denzitogramok negatív csúcsainak integrált értékei
1 µg OA 0,5 µg OA
Psm (100 %) 4068336 3358200
+ MMA (1 mg/ml) 7087247 5699180
% 174 170
103
5.2.2.2. Nε-monometil-L-lizin Az MML-t szintén, mint HCHO elıanyagot [113] (2.12. ábra) alkalmaztam a BioAréna rendszerben. Az MMA-hoz hasonlóan növelte a toxinok antibakteriális hatását Psm-mel szemben. Mind a 4 aflatoxin esetében szemmel láthatóan megnıttek a gátló zónák 1 mg/ml MML jelenlétében (5.71. ábra). Az AFB1 (5.72. ábra) és az OA (5.74. ábra) esetében látható, hogy a Psm baktérium sejt szuszpenzióban oldott MML koncentrációjának növelésével folyamatosan nagyobb lett a toxinok által adott világos folt, azaz a toxinok antibakteriális tulajdonságának MML általi erısítı hatása arányos az MML mennyiségével. A megfigyelést a denzitometriás értékelés is alátámasztja (5.73. és 5.75. ábra), koncentráció-függıen 25-87 %-kal való növekedést mutatva (25. és 26. táblázat). A háttérben, úgy ahogy az MMA esetében is, nem tapasztaltam látható változást, mint pl. világosodást, ami jelezné, ha az MML nagy hatással lenne a toxinokkal nem érintkezı baktériumokra is. Ez is azt támasztja alá, hogy az exogén toxinok stressz helyzetet teremtenek, mely során a demetilezıdési potenciál megnövekszik [85, 115, 117, 118], s a HCHO prekurzorokból, mint pl. az MML-bıl (hasonlóan az MMA-hoz) keletkezett HCHO okozhatja a megnövekedett antimikrobiális aktivitást.
5.71. ábra Az MML hatása az aflatoxinok Psm-mel szembeni antibakteriális hatására A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B – kezelt réteg, MML-t (1 mg/ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített
104
5.72. ábra Az MML dózisfüggı hatása az AFB1 Psm-mel szembeni antibakteriális hatására A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B, C, D – kezelt rétegek, MML-t (0,1; 0,5 illetve 1 mg/ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merítettek
5.73. ábra Az MML dózisfüggı hatása az AFB1 antibakteriális aktivitására; denzitometriás értékelés
A –a kontroll rétegen található 1 µg-os AFB1 folt denzitogramja (5.72. ábra A kép) B, C, D –az MML-lel kezelt rétegeken található 1 µg-os AFB1folt denzitogramja (5.72. ábra B, C illetve D kép)
25. táblázat Az AFB1 gátló zónáiról készült denzitogramok negatív csúcsainak (5.73. ábra) integrált értékei
Psm + MML (0,1 mg/ml) + MML (0,5 mg/ml) + MML (1 mg/ml)
terület 2767572 3465415 4021617 4862094
% 100 125 145 176
105
5.74. ábra Az MML dózisfüggı hatása az OA Psm-mel szembeni antibakteriális aktivitására A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B, C, D – kezelt rétegek, MML-t (0,05; 0,1 illetve 0,5 mg/ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merítettek
5.75. ábra Az MML dózisfüggı hatása az OA antibakteriális aktivitására; denzitometriás értékelés
A –a kontroll rétegen található 1 µg-os OA folt denzitogramja (5.74. ábra A kép) B, C, D –az MML-lel kezelt rétegeken található 1 µg-os OA folt denzitogramja (5.74. ábra B, C illetve D kép)
26. táblázat Az OA gátló zónáiról készült denzitogramok negatív csúcsainak (5.75. ábra) integrált értékei
Psm + MML (0,05 mg/ml) + MML (0,1 mg/ml) + MML (0,5 mg/ml)
terület 1988611 2473378 3166358 3723057
% 100 124 159 187
106
5.2.3. A Cu(II) ion, mint formaldehid mobilizáló és szállító anyag A BioArénában végzett kísérletek azt mutatják, hogy a Cu(II) ionok az antimikrobiális hatásukat HCHO-n és reakciótermékein keresztül fejtik ki [296], mivel endogén HCHO-befogók (L-arginin és GSH) csökkentették a Cu(II) ionok gátlását Agrobacterium tumofaciens ellen, azaz a Cu(II) fémionok hatása virtuális. Feltételezhetıen a Cu(II) ionok képesek generálni (mobilizálni) a HCHO molekulákat a mikrobákból vagy a szövetekbıl és megkötik ıket. A HCHO megvonás tekinthetı biológiai szerepük elsı lépésének, ami során réz-hidroximetil koordinációs komplex keletkezik. Második lépésben a labilis hidroximetil csoportokból a patogén vagy a kórosan burjánzó sejtekkel szemben nagy ölı aktivitással rendelkezı reaktív HCHO szabadulhat fel [296]. A H2O2-vel való reakciójából származó reaktív oxigén fajtákon (pl. 1O2, O3) keresztül.
5.76. ábra A Cu(II) ionok hatása az aflatoxinok Psm-mel szembeni antibakteriális aktivitására [268] A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B – kezelt réteg, Cu(II) ionokat (6 mg CuSO4·5H2O /100 ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített C – A megfelelı aflatoxinok gátló zónáinak negatív denzitogramjai
–– A kontroll rétegen található aflatoxin folt negatív denzitogramja –– A Cu(II) ionokkal kezelt rétegen található aflatoxin folt negatív denzitogramja A mikotoxinok nagyobb toxikus hatását CuSO4 (6 mg CuSO4·5H2O (azaz 1,53 mg Cu(II) ion)/100 ml sejt szuszpenzió) jelenlétében a szélesebb gátló zónák jelzik (5.76. és 5.77. ábra). A denzitogramok (5.76. és 5.77. ábra) és az integrálásból kapott számértékek (27. táblázat) bizonyítják a mikotoxinok 150-200 %-kal megnövekedett antibakteriális-toxikus hatását Cu(II) ionok jelenlétében a kontroll Psm-mel szemben. Ez a hatás magyarázható a nagyobb HCHO felszabadulással, mely a Cu(II) ionok HCHO-mobilizáló hatásának tulajdonítható. A nagyobb
107
mennyiségő HCHO jelenléte az adott rendszerben megnöveli a valószínőségét a H2O2-vel való reakciójának, ami során reaktív molekulák keletkeznek, mint H*CHO, 1O2 és O3 [135, 139], melyek képesek közvetlenül károsítani a sejt összetevıket, mint a nukleinsavakat és a fehérjéket, de így elpusztítani pl. a patogéneket is. Tehát e reaktív oxigén fajták által a HCHO képes oxidatív stresszt generálni.
5.77. ábra A Cu(II) ionok hatása az OA Psm-mel szembeni antibakteriális aktivitására [268] A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B – kezelt réteg, Cu(II) ionokat (6 mg CuSO4·5H2O /100 ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített C – az 1 µg-os OA foltokról készült negatív denzitogramok
–– a kontroll rétegen található OA folt denzitogramja –– a Cu(II) ionokkal kezelt rétegen található OA folt denzitogramja 27. táblázat Az 5.76. és 5.77. ábrán látható denzitogramok negatív csúcsainak integrált értékei
AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 1 µg OA
Psm + CuSO4·5H2O (100 %) (6 mg/100 ml) 2859092 7154666 1194696 3815035 1848876 5492659 1425144 3631668 1809051 5219334
% 250 319 297 255 289
108
5.2.4. Ózon eltávolító anyagok Wentworth és mtsai mutatták ki, hogy az antitestek képesek katalizálni a víz molekulák 1O2 általi oxidációját [139]. Megállapították, hogy ez a folyamat alkalmas a baktériumok elpusztítására, s a folyamat során a H2O3 képzıdésén keresztül O3-hoz hasonló kémiai tulajdonságú vegyület is keletkezik [137, 138]. A baktériumok és gombák elleni védelemben nélkülözhetetlen szerepet játszó neutrofilek O3 termelését azzal bizonyították, hogy ezek a sejtek oxidálták az indigókármint izatin-szulfonsavvá [137]. A keletkezı O3 nagy reaktivitással rendelkezik, ezért rövid élettartalmú molekula, így ahol termelıdik, abban a pontban fejti ki ölı aktivitását, ezzel biztosítva a specifikus hatást. A H2O2-nek pedig feltételezhetıen hírvivı, jelzı szerepe van. Megjegyzem, hogy Wentworth és mtsai az 1O2 jelenlétére nem adott magyarázatot, ami például a H2O2 és a HCHO reakciója során képzıdhet [135]. Ezért is irányult a HCHO reaktív oxigén molekulákat generáló feltételezett reakciósorának ezen másik pontjára (5.44. ábra) a figyelmem, vagyis az O3 keletkezésére. Így a mikotoxinok ölı hatásának befolyásolására irányuló törekvésem során kipróbáltam O3-t eltávolító anyagok adagolását is a BioArénában.
5.2.4.1. Indigókármin A
mikotoxinokat
tartalmazó
kifejlesztett
réteglapokat
indigókárminos
Psm
sejt
szuszpenzióval fertızve azt tapasztaltam, hogy a toxinok gátló zónáinak mérete és intenzitása csökkent a kontroll réteglapon megjelenı foltokhoz képest (5.78. és 5.80. ábra). Azaz az aflatoxinok és az OA antibakteriális-toxikus hatása mérséklıdött indigókármin jelenlétében. Az indigókármin védı hatását bizonyítja a bioautogramok denzitometriás értékelése is (5.79. és 5.81. ábra), mely aflatoxinok esetében 29-48 %-os (28. táblázat), OA esetében koncentrációtól függıen, 20 illetve 40 mg/100 ml indigókármin jelenlétében 63 illetve 82 %-os (29. táblázat) csökkenést mutat antimikrobiális hatásukban. Tehát meg tudtuk védeni a sejtek egy részét a pusztulástól. Feltételezhetıen ebben a védı hatásban nagy szerepe van annak, hogy az indigókármin képes reagálni az O3-mal (2.13. ábra), mely pl. a víz 1O2 általi oxidációjából keletkezhet, s részt vehet a toxinok ölı aktivitásában. Ez a megfigyelés azt mutatja, hogy a különösen nagy reakcióképességgel rendelkezı O3 molekula részt vehet az aflatoxinok és az OA antimikrobiális aktivitásában és így természetesen a toxikus hatásukban.
109
5.78. ábra Az indigókármin hatása az aflatoxinok Psm-mel szembeni antibakteriális aktivitására A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B – kezelt réteg, indigókármint (30 mg/ 100 ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített
5.79. ábra Az indigókárminnak az aflatoxinok antibakteriális aktivitására való hatásának denzitometriás értékelése
–– a kontroll rétegen található megfelelı aflatoxin folt denzitogramja (5.78. ábra A kép) –– az indigókárminnal kezelt rétegen található megfelelı aflatoxin folt denzitogramja (5.78. ábra B kép)
110
28. táblázat Az 5.79. ábrán látható denzitogramok negatív csúcsainak integrált értékei
AFB1 AFB2 AFG1 AFG2
Psm (100 %) 5840258 4812329 2358792 2028224
+ Indigókármin (30 mg/100 ml) 3318522 2485262 1388072 1445390
% 57 52 59 71
5.80. ábra Az indigókármin dózisfüggı hatása az OA Psm-mel szembeni antibakteriális aktivitására A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B – kezelt réteg, indigókármint (20 mg/ 100 ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített C – kezelt réteg, indigókármint (40 mg/ 100 ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített
5.81. ábra Az indigókárminnak az OA antibakteriális aktivitására való hatásának denzitometriás értékelése
–– a kontroll rétegen található 1 µg-os OA folt denzitogramja (5.80. ábra A kép) –– az indigókárminnal kezelt rétegen található 1 µg-os OA folt denzitogramja (5.80. ábra B kép) –– az indigókárminnal kezelt rétegen található 1 µg-os OA folt denzitogramja (5.80. ábra C kép) 111
29. táblázat Az 5.81. ábrán látható denzitogramok negatív csúcsainak integrált értékei
OA %
Psm 2372273 100
+ Indigókármin (20 mg/ 100 ml) 871236 37
+ Indigókármin (40 mg/ 100 ml) 420167 18
5.2.4.2. A d-limonén A BioAréna rendszerben, a Lim-et, mint O3-mal reagáló természetes anyagot alkalmaztam [263]. Kis koncentrációban (50 µl/100 ml) adva a Psm sejt szuszpenzióhoz, az aflatoxinok és az OA antibakteriális hatása csökkent a kontrollhoz képest (5.82., 5.83. és 5.85. ábra). Növelve a jelen lévı Lim koncentrációját (250 illetve 500 µl/100 ml), nıtt a toxinok baktérium ölı aktivitása a kis koncentrációjú Lim-es kezeléshez képest, sıt AFB1 esetében nagyobb lett a gátló zóna, mint kezelésmentes esetben (5.83. és 5.85. ábra). Ezt az AFB1 és az OA gátló zónáinak negatív denzitogramjai is alátámasztják (5.84. és 5.86. ábra).
5.82. ábra A Lim hatása az aflatoxinok Psm-mel szembeni antibakteriális hatására A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B – kezelt réteg, Lim-et (50 µl/ 100 ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített
Az AFB1 antibakteriális hatása 32 illetve 28 %-kal csökkent 50 µl/100 ml Lim koncentrációnál a 0,5 és az 1 µg-os felvitt mennyiségnél (30. táblázat). A kontrollhoz képest elhanyagolható különbség volt a 0,5 µg-os folt méretében 250 µl/100 ml koncentrációnál, míg az 1 µg-os foltnál már 14 %-os növekedést tapasztaltam. 500 µl/100 ml koncentrációnál 23 illetve
112
30 %-kal nıtt a 0,5 illetve az 1 µg AFB1 gátló zónája. Az OA esetében a 50 illetve az 250 µl/100 ml Lim koncentrációnál a 0,1 µg-os foltnál 43 illetve 34 %-os csökkenés mutatkozott, a 0,5 µgos folt gátló zónája 12 illetve 6 %-kal csökkent, míg az 1 µg-os foltnál 26 illetve 17 %-kal csökkent az OA antibakteriális hatása (31. táblázat). A Lim telítetlen vegyület, így természetes O3-befogó molekula [263]. Képes elvonni az O3-t a biológiai rendszerbıl, ezzel védı hatást fejtve ki. O3-mal való reakciója során azonban erısen irritáló anyagok keletkezhetnek, mint pl. HCHO és akrolein, melyek csökkentik a Lim védı hatását [264, 266]. A két ellentétes hatás következménye lehet (O3 megvonás, ingerlı anyagok keletkezése), hogy kis koncentrációban csökkenti az általam vizsgált mikotoxinok antibakteriális hatását, míg nagyobb koncentrációnál ez a mérséklés átfordul ölı aktivitást segítı hatássá.
5.83. ábra A Lim dózisfüggı hatása az AFB1 Psm-mel szembeni antibakteriális hatására A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B – kezelt réteg, Lim-et (50 µl/ 100 ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített C – kezelt réteg, Lim-et (250 µl/ 100 ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített D – kezelt réteg, Lim-et (500 µl/ 100 ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített
5.84. ábra A Lim-nek az AFB1 antibakteriális aktivitására való hatásának denzitometriás értékelése A –a kontroll rétegen található 1 µg-os AFB1 folt denzitogramja (5.83. ábra A kép) B –a Lim-mel kezelt rétegen található 1 µg-os AFB1folt denzitogramja (5.83. ábra B kép) C –a Lim-mel kezelt rétegen található 1 µg-os AFB1folt denzitogramja (5.83. ábra C kép) D –a Lim-mel kezelt rétegen található 1 µg-os AFB1folt denzitogramja (5.83. ábra D kép)
113
30. táblázat Az AFB1 gátló zónáiról készült denzitogramok negatív csúcsainak (5.84. ábra) integrált értékei
psm + lim (50 µl/100 ml) + lim (250 µl/100 ml) µ + lim (500 µl/100 ml) µ
0,5 µg AFB1 1947870 1321259 1968468 2389545
% 100 68 101 123
1 µg AFB1 3150442 2264705 3603634 4081097
% 100 72 114 130
5.85. ábra A Lim dózisfüggı hatása az OA Psm-mel szembeni antibakteriális hatására A – kontroll réteg, Psm sejt szuszpenzióba merített B – kezelt réteg, Lim-et (50 µl/ 100 ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített C – kezelt réteg, Lim-et (250 µl/ 100 ml) tartalmazó Psm sejt szuszpenzióba merített
5.86. ábra A Lim-nek az OA antibakteriális aktivitására való hatásának denzitometriás értékelése A denzitogramok az A – a 0,1 µg-os B – a 0,5 µg-os C – az 1 µg-os OA foltokról készültek.
–– a kontroll rétegen található OA folt denzitogramja (5.85. ábra A kép) –– a 50 µl/ 100 ml Lim-mel kezelt rétegen található OA folt denzitogramja (5.85. ábra B kép) –– az 250 µl/ 100 ml Lim-mel kezelt rétegen található OA folt denzitogramja (5.85. ábra C kép)
114
31. táblázat Az 5.86. ábrán látható denzitogramok negatív csúcsainak integrált értékei
psm + lim (50 µl/100 ml) µ + lim (250 µl/100 ml) µ
0,1 µg OA 3942340 2254436 2604059
% 100 57 66
0,5 µg OA 6930384 6078276 6501190
% 100 88 94
1 µg OA 9263111 6840955 7675598
% 100 74 83
6. Az eredmények összegzése, az új tudományos eredmények kiemelése A legegyszerőbb, legreaktívabb alifás aldehid, a HCHO, elıfordul valamennyi biológiai rendszerben, kimutatható s mennyiségileg meghatározható [80, 82]. A sejtekben kötött formákban, elsısorban különbözı kötéserısségő hidroximetil, N-, S- és O-metil csoportokban van jelen [79-81]. Eltérı utakon, pl. metilezés, demetilezés, biológiai oxidáció során szabadul fel, s a legkülönbözıbb spontán s enzimatikus kémiai reakciókban vesz részt befolyásolva a mitotikus és apoptotikus folyamatokat is [205]. Minden biológiai rendszernek van formaldehidomja [124-126], mely magában foglalja az összes HCHO utat, beleértve a HCHO ciklust is [80, 81]. Az élıvilág szintén nélkülözhetetlen összetevıje a H2O2 [134]. A sejten belül és kívül folyamatosan keletkezı két kis molekula, a H2O2 és a HCHO között megvan a reakció lehetısége, hogy nagy energiájú 1O2 és gerjesztett HCHO keletkezzen [135]. Az utóbbi idık eredménye, hogy az antitestek katalizálják a víz 1O2 általi oxidációját, melynek során H2O3-on keresztül O3 képzıdik [136-138]. A HCHO és annak rövid élető reaktív oxidáns reakciótermékei alapvetı szerepet játszanak tehát az élı világban (pl. sejtszaporodás, betegségellenállóság), de ugyanakkor képesek károsítani a sejtösszetevıket, mint a nukleinsavakat, fehérjéket stb. [118, 132, 133, 140], a HCHO szerepet játszhat továbbá a kóros sejtszaporodásban is [141]. Ezen eredményekbıl kiindulva, feltételezhetı, hogy a HCHO-nak és reakciótermékeinek alapvetı szerepe lehet a mikotoxinok káros hatásában (toxikusak, mutagének, karcinogének) [3] is. Ezt támasztja alá, hogy az antibiózisban keletkezı egyes antibiotikumok, mint a fitoalexin transz-rezverátrol [124-126, 171] és az antraciklin vázas antitumor ágensek [144] hatásmechanizmusában szerepet tulajdonítanak a HCHO-nak. Figyelemfelkeltı az is, hogy az általam vizsgált aflatoxinok szerkezetébıl adódóan (O-metil csoport) maguk is HCHO prekurzorok, azaz demetilezıdésük során, metanolon keresztül HCHO keletkezik [21], amihez pl. H2O2 szükséges lehet. Az exogén forrásból származó, biokémiai úttal nem rendelkezı HCHO
115
részt vehet in situ spontán kémiai és/vagy biológiai metilezésben és formilezésben a DNS és RNS kódolásának zavarát okozva [102, 281-283], mely egyik alapja lehet a rosszindulatú daganatok kialakulásának [297]. A mikotoxinok toxikus, azaz ölı aktivitáson alapuló antibakteriális hatását,
a
hatásmechanizmus vizsgálatára különösen alkalmas BioAréna rendszerben [126, 171-175] tanulmányoztam.
Új tudományos eredmények:
1. Egyszerő, gyors OPLC-módszert dolgoztam ki az AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2 elválasztására, melyet eredményesen alkalmaztam az AFB1 és a 4 aflatoxin mennyiségének
meghatározására
piros
paprikában
és
sikeresen
kiterjesztettem
alkalmazását komplex bioautográfiás (BioAréna) vizsgálatokhoz. 2. A BioAréna rendszerben az AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2 valamint az ochratoxin A (OA) gátló hatást mutatott a Psm babkórokozó baktériumokkal szemben. Antibakteriálistoxikus hatásuk erıssége (gátló zónájuk nagysága) arányos volt a rétegre felvitt anyag mennyiségével, melyet mennyiségi denzitometriás meghatározással is bizonyítottam. Hatásuk nagyobb volt rövidebb inkubációs idı, valamint fiatalabb, log fázisban lévı baktériumok alkalmazásával. A kísérletekben az aflatoxinok közül a legkárosabb AFB1 mutatkozott a legerısebb gátlószernek a Psm-mel szemben. 3. A fertızött rétegen a biológiai rendszerekben nélkülözhetetlen HCHO-t kimutattam formaldemetonként (dimedonnal alkotott adduktja) és denzitometriás mennyiségi összehasonlítással azt kaptam, hogy a mikotoxinok (AFB1, AFG2 és OA) foltjaiban nagyobb mennyiségő HCHO volt jelen, mint az azonos területő kontroll foltokban. Ezt magyarázhatja pl., hogy a toxinok jelenléte stressz helyzet a baktériumok számára, mely során a metilezési-demetilezési egyensúly eltolódik a demetilezés irányába, s a sejtekben található kötött HCHO felszabadul. A demetilezési potenciál növekedésébıl adódhat a HCHO exogén forrásból, az O-metil csoportot tartalmazó AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2 potenciális HCHO elıanyagokból, való felszabadulása is. 4. A fertızött rétegen a H2O2 jelenlétét, valamint annak jellemzı fogyását detektáltam 1 illetve 18 óra inkubációs idı elteltével, a mikotoxinok (AFB1, OA) kromatográfiás foltjában. 5. A 4 aflatoxin demetilezési reakciójára számított (izolált molekulákra) egyensúlyi állandók sorrendje: AFG1 >AFG2 >AFB1 >AFB2, ami egyben a HCHO termelés relatív
116
sorrendjét is jelenti. Az aflatoxinok BioArénában való biokémiai demetilezıdésére utal az ex- és in-situ FT-Raman spektroszkópiás kísérletek során kapott eredmény is, ami szerint az AFB1 δCH3 rezgésére jellemzı sáv Psm jelenlétében csökkenı tendenciát mutatott. 6. A BioAréna vizsgálati rendszerben a különbözı típusú HCHO-befogók ill. redukáló (Larginin, redukált glutation, szelenit ionok, dimedon és L(+)-aszkorbinsav) jelenlétében az AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2, valamint az OA antibakteriális-toxikus aktivitása általában az adagolt HCHO-befogó dózisától függıen csökkent. A HCHO elıanyagok (NG-monometil-L-arginin, Nε-monometil-L-lizin) adagolása, valamint a HCHO-t generáló, mobilizáló Cu(II) ionok jelenléte
növelték a vizsgált mikotoxinok gátló
zónáját. E kísérletek különösen megerısítették a HCHO alapvetı szerepét a mikotoxinok antibakteriális-toxikus hatásában. 7. A HCHO H2O2-vel való kölcsönhatási reakciója során keletkezı szingulett oxigén (1O2) hatására oxidálódott vízmolekulákból képzıdı dihidrogén-trioxid (H2O3) bomlásával felszabaduló ózon (O3) eltávolítására alkalmas vegyületek (indigókármin, d-limonén) csökkentették a vizsgált mikotoxinok baktériumellenes hatását. Ezen eredmények alátámasztották és megerısítették azt az eredeti, kiinduló feltételezést, hogy a HCHO-nak és reakciótermékeinek fontos szerepe lehet a mikotoxinok baktériumellenes és így toxikus hatásában.
Elmondható, hogy a BioArénában alkalmazott különbözı adagolt anyagok mind a 4 aflatoxinra hasonló hatással voltak, ami azt jelzi, hogy az antibakteriális-toxikus aktivitásuk mechanizmusának alapja azonos. Az eredmények azt mutatják, hogy a mikotoxinok baktériumgátló hatását, a transzrezveratrolhoz [124-126, 173, 271], a metil-aszkorbigénhez [298], és a Chelidonium majus vizsgált alkaloidjaihoz [174] hasonlóan, nagymértékben befolyásolja a HCHO-t ill. ózont eltávolító reagensek jelenléte. Mint a mikotoxinokat, az antibiotikumokat is mikroorganizmusok termelik, amiket szükség szerint antibiózisban is felhasználnak a másik mikroszervezet elpusztítására, gátlására, így lényegében rokon vegyületek, hatásmechanizmusuk feltételezhetıen hasonló [145]. Tehát a mikotoxinok hatásmechanizmusának általam bemutatott jobb megismerése közelebb segíthet bennünket
az
antibiotikumokkal
szembeni
rezisztencia
problémájának
megértéséhez,
megoldásához is. Ez különösen fontos, ugyanis az utóbbi évek kutatási eredményei azt igazolják, hogy az emberi betegségek nagy része fertızéses eredető, de a rezisztencia kialakulása miatt
117
[299, 300] egyre újabb antibiotikumok izolálására van szükség. Az ismert és a jövı sejtszaporodást gátló, különbözı típusú anyagok meghatározó szerepet játszhatnak a kóros sejtszaporodás okozta súlyos betegségek leküzdésében, a remélt specifikus sejt ölésben Ezen folyamatok alapmechanizmusainak megértéséhez, de az új gátló anyagok izolálásához is új szempontokat adhatnak a mikotoxinokkal kapott
eredményeink. A formaldehid cikluson
alapuló, a formaldehidom rendszerbıl levezethetı HCHO-val és reakciótermékeivel kapott eredményeink az egész rosszindulatú sejtszaporodás témakör új megközelítését is ígérik, elég csak a Helicobacter pylori baktérium toxinjai által keltett különbözı rákformákra utalni [129, 130], hiszen e toxinok „hatásmechanizmusában” is a HCHO-nak és reakciótermékeinek meghatározó szerepe lehet.
118
Összefoglalás A toxikus hatásokat indukáló mikotoxinok penészgombák másodlagos anyagcseretermékei. A becsült 400 mikotoxin közül kevesebb mint 20 rendelkezik komoly egészségügyi kockázattal. Ezek közé tartozik az általam vizsgált teratogén, mutagén és karcinogén tulajdonságokat mutató 4 fı aflatoxin (B1, B2, G1 és G2) és az elsısorban vesekárosító ochratoxin A (OA) is. Ezen mikotoxinok metabolitjait nagyrészt feltérképezték, de hatásuk mechanizmusa, mely segítené az ellenük való védekezést, illetve az ugyancsak másodlagos anyagcsere termék (rokon) antibiotikumok hatásmechanizmusának megértését is, egyértelmően nem tisztázott. A mikotoxinok hatásmechanizmusát a bioautográfián alapuló, azaz rétegrendszerő kromatográfiás elválasztást és azt követı mikrobiológiai detektálást magában foglaló, de kölcsönhatási reakciókat is alkalmazó BioAréna rendszerben vizsgáltam, melynek során Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola (Psm) babkórokozó baktériummal szemben mutatott ölıhatásukat tanulmányoztam. Mivel a formaldehid (HCHO) nélkülözhetetlen sejtösszetevı, elsısorban kötött formában van jelen az élı szervezetben, s metilezési-demetilezési reakciók során keletkezhet, elsısorban a HCHO és reakciótermékeinek szerepét vizsgáltam. A szintén normális sejtösszetevı hidrogén-peroxiddal (H2O2) reakcióba lépve szingulett oxigén (1O2) és gerjesztett HCHO keletkezik, majd az 1O2 oxidálva a vizet, dihidrogén-trioxidon keresztül ózon (O3) képzıdik. Ezen reaktív molekulák (HCHO, 1O2, O3) alapvetı szerepet játszanak a biológiai rendszerekben, de nagymértékő felszabadulásuk káros lehet. A BioAréna rendszerben kimutatható a HCHO és a H2O2 is. A mikotoxinok jelenlétében több HCHO keletkezett, mely a demetilezési potenciál növekedése által a kötött formákból szabadulhatott fel, mint pl. az aflatoxinok O-metil csoportjából is, melyet az FT-Raman spektroszkópiás eredmények is alátámasztanak. A H2O2 mennyisége csökkent a mikotoxinok foltjában, ami feltételezi, hogy részt vett valamilyen reakcióban. A mikotoxinok antibakteriálistoxikus hatása általában az adagolt HCHO-befogók ill. -redukálók (L-arginin, redukált glutation, szelenit ionok, dimedon és L(+)-aszkorbinsav) dózisától függıen csökkent, míg a HCHOprekurzorok (NG-monometil-L-arginin, Nε-monometil-L-lizin), valamint a HCHO-t generáló, mobilizáló Cu(II) ionok adagolásával nıtt. Az O3 eltávolítására alkalmas anyagok jelenlétében szintén csökkent a mikotoxinok baktérium ellenes hatása. Ezen eredmények alátámasztják a HCHO és reakciótermékeinek meghatározó szerepét a négy fı aflatoxin és az OA antibakteriális-toxikus hatásában.
119
Summary Mycotoxins are natural food contaminants all over the world, produced by moulds. Fewer than 20 of estimated 400 mycotoxins have intensive toxic effect to humans, such as the carcinogenic, mutagenic and teratogenic 4 main aflatoxins (B1, B2, G1 and G2) and the nephrotoxic ochratoxin A. Knowledge of the mechanism of action of mycotoxins is required for protection against their harmful effects. The metabolism of these mycotoxins is well-studied, however, the mechanism of their toxic effect is not sufficiently known. The mechanism of effect of mycotoxins was studied in the BioArena, utilizing the displayed killing activity against Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola bean pathogen bacteria. This system is based on direct bioautography that consists of a layer chromatographic separation and a subsequent biological detection, but different interactions are applied, too. Especially the role of formaldehyde (HCHO) and its reaction products was examined. HCHO, in its bounded forms, is a regular and indispensable molecule in all biological systems. It can originate from methylation and demethylation processes, alike. Reaction between HCHO and hydrogen peroxide (H2O2), also natural cellular ingredient, can occur continuously in all living systems, producing excited HCHO and singlet oxygen (1O2). The nascent 1O2 can oxidise water and through H2O3 - among others - ozone (O3) is released. These reactive molecules (HCHO, 1O2, O3) play basic role in the biological systems, but their enhanced liberation can be damaging. Both, HCHO and H2O2 could be detected in the BioArena system. In the presence of mycotoxins higher amount of HCHO was found that could be due to its liberation from bounded forms, i.e. methylated and hydroxymethylated cell ingredients or O-methylated aflatoxins that is supported by the results of FT-Raman spectroscopic experiments. The level of H2O2 was reduced in the spot of mycotoxins that presumes that H2O2 took part in any reaction. The antibacterial-toxic effect of mycotoxins was usually decreased depending on the doses of HCHO-capture and reducer (L-arginine, reduced glutathione, selenite ion, dimedone and L(+)-ascorbic acid), while the addition of the HCHO-precursors (NG-monomethyl-L-arginine, Nε-monomethyl-L-lizin), and HCHO-generator, mobiliser Cu(II) ions enhanced it. In the presence of O3 eliminators, the antibacterial effect of mycotoxins was decreased considerably. These results support the determinant role of HCHO and its reaction products in the antibacterial-toxic effect of the four main aflatoxins and the OA.
120
Irodalomjegyzék 1. Balázs L.: „A bioaktív vegyületek néhány különleges csoportja – antibiotikumok”. A kémia története I-II. Nemzeti Tankönyvkiadó, Budapest, (1996) 802-804. 2. Fleming A.: „On the antibacterial action of cultures of a penicillium, with special reference to their use in the isolation of B. influenzae.” Br. J. Exp. Pathol. 10 (1929) 226236. 3.
„Mycotoxins and Phycotoxins – Development in Chemistry, Toxicology and Food Safety”. // Miraglia M., van Egmod H., Brera C., Gilbert J. (szerk.) Printed in the USA, (1998)
4. „Mycotoxins: Risks in Plant, Animal, and Human Systems”. //Richard J.L., Payne G.A. (szerk.) Task Force Report 139. Council for Agricultural Science and Technology. Ames, Iowa. (2003) 5. Kaplan, N.M., Palmer, B.F., Revankar, S. G.: „Clinical implications of mycotoxins and Stachybotrys, Southwestern”. Am. J. Med. Sci. 325 (2003) 262-274. 6. Móricz Á.M., Fatér Zs., Otta K.H., Tyihák E., Mincsovics E.: „ Overpressured layer chromatographic determination of aflatoxin B1, B2, G1 and G2 in red paprika”. Microchem. J. 85 (2007) 140-144. 7. Drusch S., Ragab W.: „Mycotoxins in fruits, fruit juices, and dried fruits”. J. Food Prot. 65 (2003) 1514-1527. 8. Peraica M., Radic B., Lucic A., Pavlovic M.: „Toxic effects of mycotoxins in Humans”. Bull. World Health Organ. 77 (1999) 754–766. 9. Etzel R.A.: „Mycotoxins”. J. Am. Med. Assoc. 287 (2002) 425–427. 10. Zilinskas R.A.: „Iraq's biological weapons. The past as future?”. JAMA 278 (1997) 418424. 11. Creppy E.: „Update of survey, regulation and toxic effects of mycotoxins in Europe”. Toxicol. Lett. 127 (2002) 19–28. 12. Commission Regulation EC No 472/2002 of 12 March 2002 amending Regulation (EC) No. 466/2001 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs, Official Journal of the European Communities 16.3.2002. 13. Lee K.W., Lee H.J., Surh Y. J., Lee C.Y.: „Vitamin C and cancer chemoprevention: reappraisal1–3”. Am. J. Clin. Nutr. 78 (2003) 1074–1078. 14. McLean M., Dutton M.F.: „Cellular interactions and metabolism of aflatoxin: an update”. Pharmacol. Ther. 65 (1995) 163–192.
121
15. Hussein H.S., Brasel J.M.: „Toxicity, metabolism and impact of mycotoxins on human and animals”. Toxicology 167 (2001) 101–134. 16. Neal G.E.: „Genetic implications in the metabolism and toxicity of mycotoxins”. Toxicol. Lett. 82/83 (1995) 861-867. 17. Wang J.-S., Groopman J.D.: „DNA damage by mycotoxins”. Mutat. Res. 424 (1999) 167–181. 18. Sudakin D.L.: „Dietary aflatoxin exposure and chemoprevention of cancer: a clinical review”. J. Toxicol. Clin. Toxicol. 41 (2003) 195-204. 19. Bedard L.L., Massey T.E.: „Aflatoxin B1-induced DNA damage and its repair”. Cancer Lett. 241 (2006) 174–183. 20. Hayes J.D., Judah D.J., Neal G.E.: „Resistance to aflatoxin B1 is associated with the expression of a novel aldo-keto reductase which has catalytic activity towards a cytotoxic aldehyde-containing metabolite of the toxin”. Cancer Res. 53 (1993) 3887–3894. 21. „The analysis of organic materials. In Analysis of Organic Materials, An International. Series of Monographs”. // Belcher, R., Anderson, D.M.W., (szerk) Academic. Press: London, UK, (1974) 22. Awney H.A., Amara A.A., El-masry M.H., Baghdadi H.H.: „Effect of 12 plant extracts on the hepatic microsomal B(a)p hydroxylation and H2O2 production in mice treated with lindane”. J. Environ. Nutr. Interact. 1 (1997) 129–142. 23. Awney H.A., Attih A.M., Habib S.L., Mostafa M.H.: „Effect of melatonin on the production of microsomal hydrogen peroxide and cytochrome P-450 content in rat treated with aflatoxin B1”. Toxicology 172 (2002) 143–148. 24. Shen H.-M., Ong C.-N., Shi C.-Y.: „Involvement of reactive oxygen species in aflatoxin B1- induced cell injury in cultured rat hepatocytes”. Toxicology 99 (1995) 115- 123. 25. Shen H.M., Shi C.Y., Lee H.P., Ong C.N.: „Aflatoxin B1-induced lipid peroxidation in rat liver”. Toxicol. Appl. Pharmacol. 127 (1994) 145–150. 26. Choudhary A., Verma R.J.: „Ameliorative effects of black tea extract on aflatoxininduced lipid peroxidation in the liver of mice”. Food Chem. Toxicol. 43 (2005) 99–104. 27. Towner R.A., Mason R.P., Reinke L.A.: „In vivo detection of aflatoxin-induced lipid free radicals in rat bile”. Biochim. Biophys. Acta 1573 (2002) 55– 62. 28. Shen H.M., Shi C.Y., Shen Y., Ong C.N.: „Detection of elevated reactive oxygen species level in cultured rat hepatocytes treated with aflatoxin B1”. Free Radic. Biol. Med. 21 (1996) 139-146.
122
29. Park K.-Y., Jung G.-O., Lee K.-T., Choi J., Choi M.-Y., Kime G.-T., Jung H.-J., Park H.J.: „Antimutagenic activity of flavonoids from the heartwood of Rhus verniciflua”. J. Ethnopharmacol. 90 (2004) 73–79. 30. Qian G.-S., Ross R.K., Yu M.C., Yuan J.-M., Gao Y.-T., Henderson B.E., Wogan G.N., Groopman J.D.: „A follow-up study of urinary markers of aflatoxin exposure and liver cancer in Shanghai, Peoples Republic of China”. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 3 (1994) 3–10. 31. Groopman J.D., Zhu J.-Q., Donahue P.R., Pikul A., Zhang L.-S., Chen J.-S., Wogan G.N.: “Molecular dosimetry of urinary aflatoxin-DNA adducts in people living in Guangxi Autonomous Region, People’s Republic of China”. Cancer Res. 52 (1992) 45– 52. 32. Kirby G.M., Wolf C.R., Neal G.E., Judah D.J., Henderson C.J., Srivatanakul P., Wild C.P.: „In vitro metabolism of aflatoxin B1 by normal and tumorous liver tissue from Thailand”. Carcinogenesis 14 (1993) 2613–2620. 33. Dalezios J., Wogan G.N., Weinreb S.M.: „Aflatoxin P1 — a new aflatoxin metabolite in monkeys”. Science 171 (1971) 584–585. 34. Cha C., DeMatteo R.P.: „Molecular mechanisms in hepatocellular carcinoma development”. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 19 (2005) 25–37. 35. Zhang Y.J., Ahsan H., Chen Y., Lunn R.M., Wang L.Y., Chen S.Y., Lee P.H., Chen C.J., Santella R.M.: „High frequency of promoter hypermethylation of the RASSF1A and p16 genes and its relationship to aflatoxin B1-DNA adducts level in human hepatocellular carcinoma”. Mol. Carcinogenesis 35 (2002) 85–92. 36. Zhang Y.J., Chen Y., Ahsan H., Lunn R.M., Lee P.H., Chen C.J., Santella R.M.: „Inactivation of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter hypermethylation and its relationship to aflatoxin B1-DNA adducts and p53 mutations in hepatocellular carcinoma”. Int. J. Cancer 103 (2003) 440–444. 37. Zhang Y.J., Chen Y., Ahsan H., Lunn R.M., Chen S.Y., Lee P.H., Chen C.J., Santella R.M.: „Silencing of glutathione S-transferase P1 by promoter hypermethylation and its relationship to environmental chemical carcinogens in hepatocellular carcinoma”. Cancer Lett. 221 (2005) 135–143. 38. Zhang Y.J., Rossner Jr. P., Chen Y., Agrawal M., Wang Q., Wang L., Ahsan H., Yu M.W., Lee P.H., Santella R.M.: „Aflatoxin B1 and polycyclic aromatic hydrocarbon adducts, p53 mutations and p16 methylation in liver tissue and plasma of hepatocellular carcinoma patients”. Int. J. Cancer: 119 (2006) 985–991.
123
39. Bunge I., Dirheimer G., Roschenthaler R.: „In vivo and in vitro inhibition of protein synthesis in Bacillus stearothermophilus by ochratoxin A”. Biochem. Biophys. Res. Commun. 83 (1978) 398–405. 40. Creppy E.E., Lugnier A.A.J., Fasiolo F., Heller K., Roschenthaler R., Dirheimer G.: „In vitro inhibition of yeast phenylalanyl-tRNA synthetase by ochratoxin A”. Chem. Biol. Interact. 24 (1979) 257–261. 41. Creppy E.E., Baudrimont I., Betbeder A.M.: „Prevention of nephrotoxicity of ochratoxin A, a food contaminant”. Toxicol. Lett. 83 (1995) 869–877. 42. Belmadani A., Betbeder M., Tramu G., Creppy E.E.: „Subchronic effects of ochratoxin A on young adult rat brain and partial prevention by aspartame, a sweetener”. Rev. Med. Vet. Toulouse 149 (1998) 665. In: VIIIth International Congress of Toxicology. 43. Soffritti M., Belpoggi F., Tibaldi E., Esposti D.D., Lauriola M.: „Life-span exposure to low doses of aspartame beginning during prenatal life increases cancer effects in rats” Environ. Health Perspect. 115 (2007) 1293-1297. 44. Calcutt M.W., Gillman I.G., Noftle R.E., Manderville R.A.: „Electrochemical oxidation of ochratoxin A: correlation with 4-chlorophenol”. Chem. Res. Toxicol. 14 (2001) 12661272. 45. Dai J., Wright M.W., Manderville R.A.: „Ochratoxin A forms a carbon-bonded C8deoxyguanosine nucleoside adduct: implications for C8 reactivity by a phenolic radical”. J. Am. Chem. Soc. 125 (2003) 3716-3717. 46. El Adlouni C., Pinelli E., Azemar B., Zaoui D., Beaune P., Pfohl-Leszkowicz A.: „Phenobarbital increases DNA adduct and metabolites formed by ochratoxin A, role of CYP 2C9 and microsomal glutathione-S-transferase”. Environ. Mol. Mutagen. 35 (2000) 123–131. 47. Pfohl-Leszkowicz A., Chakor K., Creppy E.E., Dirhelmer G.: „DNA-adduct formation in mice treated tvith ochratoxin A”. // Castegnaro M., Plestma R., Dirheimer G., Chernozemsky I.V., Bartsch H. (szerk.), Mycotoxin. Endemic nephropathy and urinary tract turnours. IARC Scientific publications No. 115, International Agency for Research on Cancer, Lyon. 1991, pp. 245-253. 48. Pfohl-Leszkowicz A., Grosse Y., Obrecht S., Kane A., Castegnaro M., Creppy E.E., Dirheimer G.: „Preponderance of DNA adducts in kidney after ochratoxin A exposure”. // Creppy E.E., Castegnaro M., Dirheimer G. (szerk.), Human ochratoxicosis and related pathologies. J. Libbey Eurotext. London, colloque INSERM, No 231. (1993) 199-207.
124
49. Pfohl-Leszkowicz A., Grosse Y., Kane A., Creppy E.E., Dirheimer G.: „Differential DNA adduct formation and disappearance in three mice tissues after treatment by the mycotoxin Ochratoxin A”. Mutat. Res. 289 (1993) 265-273. 50. Kampa H.G., Eisenbrand G., Schlatter J., Wurth K., Janzowski C.: „Ochratoxin A: induction of (oxidative) DNA damage, cytotoxicity and apoptosis in mammalian cell lines and primary cells”. Toxicology 206 (2005) 413–425. 51. Dai J., Park G., Wright M.W., Adams M., Akman S.A., Manderville R.A.: „Detection and characterization of a glutathione conjugate of ochratoxin A”. Chem. Res. Toxicol. 15 (2002) 1581-1588. 52. Simarro Doorten A.Y., Bull S., van der Doelen M.A.M., Fink-Gremmels J.: „Metabolismmediated cytotoxicity of ochratoxin A”. Toxicol. in Vitro 18 (2004) 271–277. 53. de Groene E.M., Hassing I.G., Blom M.J., Fink-Gremmels J., Horbach G.J.: „Mutagenicity testing of ochratoxin A using NIH/ 3T3 cell lines stably expressing human cytochrome P450 cDNAs”. // Goll, M., Oldenburg, E., Valenta, H. (szerk.), Mycotoxin Wrokshop. Braunschweig-Völkenrode, Munich, Germany, (1995) 66–69. 54. Mally A., Zepnik H., Wanek P., Eder E., Dingley K., Ihmels H., Volkel W., Dekant W.: „Ochratoxin A: Lack of Formation of Covalent DNA Adducts”. Chem. Res. Toxicol. 17 (2004) 234-242. 55. Creppy E.E., Stormer F.C., Roschenthaler R., Dirheimer G.: „Effects of two metabolites of ochratoxin A, (4R)-4-hydroxyochratoxin A and ochratoxin alpha, on immune response in mice”. Infect. Immun. 39 (1983) 1015–1018. 56. Gautier J., Richoz J., Welti D.H., Markovic J., Gremaud E., Guengerich F.P., Turesky R.J.: „Metabolism of ochratoxin A, absence of formation of genotoxic derivatives by human and rat enzymes”. Chem. Res. Toxicol. 14 (2001) 34–45. 57. Zepnik H., Pahler A., Schauer U., Dekant W.: „Ochratoxin A induced tumor formation. Is there a role of reactive ochratoxin A metabolites?”. Toxicol. Sci. 59 (2001) 59–67. 58. Omar R.F., Gelboin H.V., Rahimtula A.D.: „Effect of cytochrome P450 induction on the metabolism and toxicity of ochratoxin A”. Biochem. Pharmacol. 51 (1996) 207–216. 59. Grosses Y., Baudrimont I., Castegnaro M., Betbeder A.-M., Creppy E.E., Dirheimer G., Pfohl-Leszkowicz A.: „Formation of ochratoxin A metabolites and DNA adducts in monkey kidney cells”. Chem. Biol. Interact. 95 (1995) 175-187. 60. Creppy E., Chakor K., Fischer M.J., Dirheimer G.: „The mycotoxin ochratoxm A is a substrate for phenylalanine hydroxylase in isolated rat hepatocytes and in vivo”. Arch. Toxicol. 64 (1990) 279-284.
125
61. Størmer I.C., Støren 0., Hansen C.H., Pedersen J.I., Aasen A.J.: „Formation of (4R)- and (4S)-4- hydroxyochraroxin A and 10-hydroxyochratoxin A from ochratoxin A by rabbit liver microsomes”. Appl. Environ. Microbial. 45 (1983) 1183-1187. 62. Omar R.F., Hasinoff B.B., Mejilla F., Rahimtula A.D.: „Mechanism of ochratoxin A stimulated lipid peroxidation”. Biochem. Pharmacol. 40 (1990) 1183–1191. 63. Baudrimont I., Betbeder A.M., Gharbi A., Pfohl Leszkowicz A., Dirheimer G., Creppy E.E.: „Effect of superoxide dismutase and catalase on the nephrotoxicity induced by subchronical administration of ochratoxin A in rats”. Toxicology 89 (1994) 101–111. 64. Schaaf G.J., Nijmeijer S.M., Maas R.F., Roestenberg P., de Groene E.M., Fink-Gremmels J.: „The role of oxidative stress in the ochratoxin A-mediated toxicity in proximal tubular cells”. Biochem. Biophys. Acta 1588 (2002) 149–158. 65. Faucet V., Pfohl-Leszkowicz A., Dai J., Castegnaro M., Manderville R.A.: „Evidence for covalent DNA adduction by ochratoxin A following chronic exposure to rat and subacuteexposure to pig”. Chem. Res. Toxicol. 17 (2004) 1289–1296. 66. Simarro Doorten Y., Nijmeijer S., de Nijs-Tjon L., Fink-Gremmels J.: „Metabolismmediated Ochratoxin A genotoxicity in the single-cell gel electrophoresis (Comet) assay”. Food Chem. Toxicol. 44 (2006) 261–270. 67. Mekia A.R.M.A., Hussein A.A.A.: „Melatonin reduces oxidative stress induced by ochratoxin A in rat liver and kidney”. Comp. Biochem. Physiol. C 130 (2001) 305-313. 68. Creppy E.E., Kane A., Dirheimer G., Lafarge-Frayssinet C., Mousset S., Frayssinet C.: „Genotoxicity of ochratoxin A in mice: DNA single-strand break evaluation in spleen liver and kidney”. Toxicol. Lett. 28 (1985) 29-35. 69. Baudrimont I., Ahouandjivo R., Creppy E.E.: „Prevention of lipid peroxidation induced by ochratoxin A in Vero cells in culture by several agents”. Chem. Biol. Interact. 104 (1997) 29-40. 70. Wurgler F.E., Friederich U., Schlatter J.: „Lack of mutagenicity of ochratoxin A and B, citrinin, patulin and cnestine in Salmonella typhimurium TA102”. Mutat Res. 261 (1991) 209-216. 71. Stark A.A., Essigmann J.M., Demain A.L., Skopek T.R., Wogan G.N.: „Aflatoxin B1 mutagenesis, DNA binding, and adduct formation in Salmonella typhimurium”. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76 (1979) 1343-1347. 72. Jorgensen K.V., Clayton J.W., Price R.L.: „Evaluation of aflatoxin B1 mutagenesis: addition of glutathione and glutathione-S-transferase to the Salmonella mutagenicity assay”. Environ. Mutagen. 9 (1987) 411-419.
126
73. Lee L.S., Dunn J.J., DeLucca A.J., Ciegler A.: „Role of lactone ring of aflatoxin B1 in toxicity and mutagenicity”. Experientia 37 (1981) 16-17. 74. Atroshi F, Rizzo A, Westermarck T, Ali-vehmas T.: „Effects of tamoxifen, melatonin, coenzyme Q10, and L-carnitine supplementation on bacterial growth in the presence of mycotoxins”. Pharmacol. Res. 38 (1998) 289-295. 75. Angle J.S., Wagner G.H.: „Aflatoxin B1 effects on effects on soil microorganisms”. Soil Biol. Biochem. 13 (1981) 381-384. 76. Greenberg J.M., Zhao N.S., Hage J.: „Chemical evaluation of interstellar dust, comets and the origins of life”. Ann. Phys. – Paris 14 (1989) 103-131. 77. Internal Agency for Research on Cancer (1995) IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Vol. 62, Wood Dust and Formaldehyde. (World Health Organization, Genova, Switzerland). 78. Walker J. K.: „Formaldehyde”. (Kieger, R. E. Publ. Co.: Huntington, New York) (1964) 79. Kalász H.: “Biological role of formaldehyde, and cycles related to methylation, demethylation and formaldehyde production”. Mini Rev. Med. Chem. 3 (2003) 175-192. 80. Tyihák E., Albert L., Németh Zs. I., Kátay Gy., Király-Véghely Zs., Szende B.: „Formaldehyde cycle and the natural formaldehyde generators and capturers”. Acta Biol. Hung. 49 (1998) 225-238. 81. Tyihák E., Trézl L., Szende B.: „Formaldehyde cycle and the phases of stress syndrome”. Ann. N. Y. Acad. Sci. 851 (1998) 259―270. 82. Tyihák E.: „A formaldehid elıfordulása és szerepe az élıvilágban”. Scientia Kiadó, Budapest (2004) 83. Sárdi E., Tyihák E.: „Relationship between dimedone concentration and formaldehyde captured in plant tissues”. Acta Biol. Hung. 49 (1998) 291-301. 84. Albert L., Németh Zs., Barna T., Varga Sz., Tyihák E.: „Measurement of endogenous formaldehyde in the early development stages of European Turkey oak (Quercus cerris L.)”. Phytochem. Anal. 9 (1998) 227—231 85. Tyihák E., Király Z., Gullner G., Szarvas T.: „Temperature-dependent formaldehyde metabolism in bean plants, the heat shock response”. Plant Sci. 59 (1989) 133-139. 86. Axelrod J.J.: „The enzymatic N-demethylation of narcotic drugs.” Pharm. Exp. Ther. 117 (1956) 322-330. 87. Kalász H., Báthori M., Tyihák E.: „Formaldehyde generation by N-demethylation”. Acta Biol. Hung. 49 (1998) 229-344.
127
88. Lengyel J., Kalász H., Szarvas T., Peltz Cs., Szarkáné-Bolehovszki A.: „HPLC Analysis of Metabolically Produced Formaldehyde”. J. Chromatogr. Sci. 41 (2003) 177-181. 89. Adams R.L.P., Burdon R.H.: „Molecular Biology of DNA Methylation” (1985) (Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo). 90. Manchester J. L., Chemaly S. L.: „S-adenosyl-. methionine and ammonium compounds in biochemistry”. South Afr. J. Sci. 79 (1983) 442-444. 91. Paik W. K., Kim S.: „Protein Methylation”. (Wiley, New York) (1980) 8-25. 92. Huszti S., Tyihák E.: „Formation of formaldehyde from S-adenosyl-L-(methyl3H)methionine during enzymic transmethylation of histamine”. FEBS Lett. 209 (1986) 362―366. 93. Taupp M., Heckel F., Harmsen D., Schreier P.: „Direct trapping of formaldehyde formed via oxidative N-demethylation of N,N-dialkylarylamines by Bacillus megaterium using cysteamine derivatization”. J. Microbiol. Methods 67 (2006) 357–362. 94. Malarczyk E., Pazdzioch-Czochra M.: „Multiple respiratory bursts as a response to veratrate stress in Rhodococcus erythropolis cells”. Cell Biol. Int. 24 (2000) 515-527. 95. Pazdzioch-Czochra M., Malarczyk E., Sielewiesiuk J.: „Relationship of demethylation processes to veratric acid concentration and cell density in cultures of Rhodococcus erythropolis”. Cell Biol. Int. 27 (2003) 325–336. 96. Ribbons D.W.: „Requirement of two protein fractions for O-demethylase activity in Pseudomonas testosteroni”. FEBS Lett. 12 (1971) 161–165. 97. Ribbons D.W.: „Stoichiometry of O-demethylase activity in Pseudomonas aeruginosa”. FEBS Lett. 8 (1970) 101–104. 98. Kobayashi K., Yamamoto T., Taguchi M., Chiba K.: „High-Performance Liquid Chromatography Determination of N- and O-Demethylase, Activities of Chemicals in Human Liver Microsomes: Application of Postcolumn Fluorescence Derivatization Using Nash Reagent”. Anal. Biochem. 284 (2000) 342–347. 99. Feinberg AP.: „Methylation meets genomics”. Nat. Genet. 27 (2001) 9-10. 100. Frigola J., Ribas M., Riques R-A., Peinado MA.: „Methylome profiling of cancer cells by amplification of inter-methylated sites (AIMS)”. Nucleic Acids Res. 30 (2002) e28e28(1) 101. Sedgwick B., Bates P.A., Paik J., Jacobs S.C., Lindahl T.: „Repair of alkylated DNA: Recent advances”. DNA Repair 6 (2007) 429-442.
128
102. Trézl L., Rusznák I., Tyihák E., Szarvas T., Szende B.: „Spontaneous N-epsilonmethylation and N-epsilon-formylation reactions between L-lysine and formaldehyde inhibited by L-ascorbic-acid”. Biochem. J. 214 (1983) 289-292. 103. Tyihák E., Trézl L., Rusznák I.: „Spontaneous N-methylation of L-lysine by formaldehyde”. Pharmazie 35 (1980) 18-20. 104. Trézl L., Hullán L., Jászay Zs.M., Szarvas T., Petneházy I., Szende B., Bocsi J., Takáts Z., Vékey K., Töke L.: „Antagonistic reactions of arginine and lysine against formaldehyde and their relation to cell proliferation, apoptosis, folate cycle and photosynthesis”. Mol. Cell. Biochem. 244 (2003) 167–176. 105. Csiba A., Trézl L., Tyihák E., Graber H., Vári É., Téglás G., Rusznák I.: „Assumed role of L-arginine in mobilization of endogenous formaldehyde”. Acta Physol. Acad. Sci. Hung., 59 (1982) 35-43. 106. Heck H., d'A., Casanova M., Starr T., B.: „Formaldehyde toxicity-new understanding”. Crit. Rev. Toxicol. 20 (1990) 397―426. 107. Gescher A., Raymont C.: „Studies of the metabolism of N-methyl containing antitumour agents”. Biochem. Pharmacol. 30 (1981) 1245-1252. 108. Gidley M.J., Sanders J.K.M., Myers E.R., Allwood M.C.: „The mode of antibacterial action of some “masked” formaldehyde compounds”. FEBS Lett. 127 (1981) 225–227. 109. Tyihák E., Szende B., Lapis K.: „Biological significance of methylated derivatives of lysine and arginine”. Life Sci. 20 (1977) 385-392. 110. Trézl L., Hullán L., Szarvas T., Csiba A., Szende B.: „Determination of endogenous formaldehyde in plants (fruits) bound to L-arginine and its relation to the folate cycle, photo-synthesis and apoptosis”. Acta Biol. Hung. 49 (1998) 253―263. 111. Bocsi J., Nagy K., Tyihák E., Trézl L., Szende B.: „Reduction of apoptosis of in vitro cultured lymphocytes of HIV-positive persons by NG-hydroxy-methylated L-arginine and 1’-methyl-ascorbigen”. Acta Biol. Hung. 49 (1998) 331―337. 112. Szende B., Tyihák E., Trézl L.: „Role of arginine and its methylated derivatives in cancer biology and treatment”. Cancer Cell Int. 1 (2001) 113. Shi Y., Lan F., Matson C., Mulligan P., Whetstine J.R., Cole P.A., Casero R.A., Shi Y.: „Histone Demethylation Mediated by the Nuclear Amine Oxidase Homolog LSD1” Cell 119 (2004) 941–953. 114. Shi Y.J., Matson C., Lan F., Iwase S., Baba T., Shi Y.: „Regulation of LSD1 Histone Demethylase Activity by Its Associated Factors” Mol. Cell 19 (2005) 857–864.
129
115. Tyihák E., Balla J., Gáborjányi R., Balázs E.: „Increased free formaldehyde level in crude extract of virus infected hypersensitive tobaccos”. Acta Phytopath. Entomol. Hung. 13 (1978) 29-31. 116. Szarvas T.B., Pozsár B.I., Simon L.P.: „Detection of endogenous, free formaldehyde in plants and its relationship with photosynthesis”. Acta Agronom. Acad. Sci. Hung. 32 (1983) 313-330. 117. Burgyán J., Szarvas T., Tyihák E.: „Increased formaldehyde production from Lmethionine-(S-14CH3) by crude enzyme of TMV-infected tobacco leaves”. Acta Phytopath. Entomol. Hung. 17 (1982) 11-15. 118. Tyihák E., Rozsnyay S., Sárdi É., Gullner G., Trézl L., Gáborjányi R.: „Possibility of formation of excited formaldehyde and singlet oxigen in biotic and abiotic stress situations”. Acta Biol. Hung. 45 (1994) 3―10. 119. Wang C., Lazarides E., O’Connor C.M., Clarke S.: „Methylation of chicken fibroblast heat shock proteins at lysyl and arginyl residues”. J. Biol. Chem., 257 (1982) 8356-8362. 120. Yu P.H., Zuo D.M.: „FA produced endogenously via deamination of methylamine. A potential risk factor for initiation of endothelial injury”. Atherosclerosis 120 (1996) 189– 197. 121. Yu P.H.: „Increase of formation of methylamine and FA in vivo after administration of nicotine and the potential cytotoxicity”. Neurochem. Res. 23 (1998) 1205–1210. 122. Yu P.H., Deng Y.L.: „Endogenous formaldehyde as a potential factor of vulnerability of atherosclerosis: involvement of SSAO-mediated methylamine turnover”. Atherosclerosis 140 (1998) 357–363. 123. Yu P.H., Lai C.T., Zuo Z.M.: „Formation of formaldehyde from adrenaline in vivo: a potential risk factor for stress angiopathy”. Neurochem. Res. 22 (1997) 615–620. 124. Tyihák E., Király-Véghely Zs., Ott P.G., Móricz Á.M., Kátay Gy.: „Crucial role of formaldehydome in the beneficial effects of stilbenes from grapes and wine”. XXVIIIth World Congress of Vine and Wine, OIV-Congress 2004, 4-9. July, Hofburg, Vienna, Austria, CD-ROM 125. Tyihák E., Móricz Á., Ott P.G., Kátay Gy., Király-Véghely Zs., Billes F.: „Formaldehydome and Special Biological as well as Chemical Reactions of Formaldehyde in Planar Sorbent Bed”. // Nyiredy Sz. (szerk.) Proc. Int. Symp. on Planar Separations. Research Institute for Medicinal Plants, Visegrád (2004) 137-146. 126. Tyihák E., Móricz Á.M., Ott P.G., Kátay Gy., Király-Véghely Zs.: “The potential of BioArena in the study of the formaldehydome”. J. Planar. Chromatogr. 18 (2005) 66-71.
130
127. Bombail V., Moggs J.G., Orphanides G.: „Perturbation of epigenetic status by toxicants”. Toxicol. Lett. 149 (2004) 51-58. 128. Warren R.J., Marshall B.J.: „Unidentified curved bacilli in gastric epithelium in active chronic gastritis”. Lancet 1 (1983) 1273-1275. 129. Lax A.J.: „Opinion: Bacterial toxins and cancer--a case to answer?”. Nat. Rev. Microbiol. 3 (2005) 343-349. 130. Pee R.M., Crabtree J.E.: „Helicobacter infection and gastric neoplasia”. J. Pathol. 208, (2006) 233–248. 131. Maekita T., Nakazawa K., Mihara M., Nakajima T., Yanaoka K., Iguchi M., Arii K., Kaneda A., Tsukamoto T., Tatematsu M., Tamura G., Saito D., Sugimura T., Ichinose M., Ushijima T.: „High Levels of Aberrant DNA Methylation in Helicobacter pylori–Infected Gastric Mucosae and its Possible Association with Gastric Cancer Risk”. Clin. Cancer Res. 12 (2006) 989-995. 132. Shaham J., Bomstein Y., Meltzer A., Kaufman Z., Palma E., Riba, J.: „DNA – protein crosslinks, a biomarker of exposure to FA – in vitro and in vivo studies”. Carcinogenesis 17 (1996) 121–125. 133. Gubisne-Haberle D., Hill W., Kazachkov M., Richardson J.S., Yu P.H.: „Protein crosslinkage induced by FA derived from semicarbazide-sensitive amine oxidase-mediated deamination of methylamine”. J. Pharmacol. Exp. Ther. 310 (2004) 1125–1132. 134. Seaver L.C., Imlay J.A.: „Hydrogen peroxide fluxes and compartmentalization inside growing Escherichia coli”. J. Bacteriol. 183 (2001) 7182-6189. 135. Trézl L., Pipek J.: „Formation of excited formaldehyde in model reactions simulating real biological systems”. J. Mol. Struct. (Theochem.) 170 (1988) 213―223. 136. Wentworth A.D., Jones L.H., Wentworth P.J., Janda K.D., Lerner,R.A.: „Antibodies have the intrinsic capacity to destroy antigens”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 10930–10935. 137. Wentworth P., McDunn J.E., Wentworth A.D., Takeuchi C., Nieva J., Jones T., Bautista C., Ruedi J.M., Gutierrez A., Janda K.D., Babior B.M., Eschenmoser A., Lerner R.A.: „Evidence for antibody-catalyzed ozone formation in bacterial killing and inflammation”. Science 298 (2002) 2195-2199. 138. Nieva J., Wentworth P.: „The antibody-catalyzed water oxidation pathway – a new chemical arm to immune defense?”. Trends Biochem. Sci. 29 (2004) 274-278.
131
139. Wentworth P.J., Jones L.H., Wentworth A.D., Zhu X., Larsen N.A., Wilson I.A., Xu X., Goddard W.A., Janda K.D., Eschenmoser A., Lerner R.A.: „Antibody Catalysis of the Oxidation of Water”. Science 293 (2001) 1806–1811. 140. Lin Z., Luo W., Li H., Zhang Y.: „The effect of endogenous formaldehyde on the rat aorta endothelial cells”. Toxicol. Lett. 159 (2005) 134–143. 141. Tyihák E., Bocsi J., Timár F., Rácz G., Szende B.: „Formaldehyde promotes and inhibits the cell proliferation of cultured tumour and endothelial cells”. Cell Prolif. 34 (2001) 135-141. 142. Tyihák E., Steiner U., Schönbeck F.: „Time- and dose-dependent double immune response of plants to pathogens”. // Dehne és mtsai (szerk.) Modern Fungicides and Antifungal Compounds III, AgroConcept, Bonn (2002) 187―196. 143. Tyihák E.: „Double immune response of plants to pathogens and its biochemical basis”. // Teixeira da Silva J.A. (szerk) Floriculture, ornamental and plant biotechnology: advences and topical issues (1st edition), Global Science Books, London, UK (2006) 380-387. 144. Burke P.J., Koch T.H.: „Doxorubicin-formaldehyde conjugate, doxoform: induction of apoptosis relative to doxorubicin”. Anticancer Res. 21 (2001) 2753-2760. 145. Dehority B.A. and Tirabasso P.A.: „Antibiosis between Ruminal Bacteria and Ruminal Fungi” Appl. Environ. Microbiol. 66 (2000) 2921-2927. 146. Ettre L. S.: „M. S. Cvet and the invention of chromatography”. LC-GC Europe 9 (2003) 2–7. 147. Tyihák E., Mincsovics E.: „Overpressured layer chromatography – from the ultramicro chamber to on-line use”. LC-GC Intern. 4 (1991) 24-33. 148. Martin A.J.P., Synge R.L.M.: „A new form of chromatography employing two liquid phases”. Biochem. J. 35 (1941) 1358-1368. 149. Ismailov N.A., Schraiber M.S.: „A drop-chromatographic method of analysis and its utilization in pharmacy” Farmacija (Sofia) (1938) No. 3,1. 150. Békésy N., Biochem. Z., 312 (1942) 110. 151. Kircher J.G., Miller J.M., Keller G.J.: „Separation and Identification of Some Terpenes by New Chromatographic Technique”. Anal. Chem. 23 (1951) 420. 152. Stahl E., Schröter G., Kraft G., Renz R.: „Thin layer chromatography: The method affecting factor, and a few examples of application”. Pharmazie, 11 (1956) 633-637. 153. Tyihák E., Mincsovics, E., Kalász H.: „New Planar Liquid Chromatographic Technique : Overpressured Thin-Layer Chromatography”. J. Chromatogr. 174 (1979) 75-81.
132
154. Tyihák E., Mincsovics E.: „Forced-Flow Planar Liquid Chromatographic Techniques”. J. Planar Chromatogr. 1 (1988) 6-19. 155. Mincsovics E., Ferenczi-Fodor K., Tyihák E.: „Overpressured Layer Chromatography”. // Sherma J. and Fried B., (szerk.) Handbook of Thin-Layer Chromatography. Marcel Dekker, New York, (1996) 171-203. 156. Mincsovics E., Tyihák E.: „Combination of Off-Line and On-Line Operating Steps in OPLC”. J. Planar Chromatogr. 1 (1988) 309-312. 157. Nyiredy Sz.: „The Bridge between TLC and HPLC: Overpressured Layer Chromatography”. Trends Anal. Chem. 20 (2001) 91-101. 158. Mincsovics E., Garami M., Kecskés L., Tapa B., Végh Z., Kátay Gy., Tyihák E.: „Personal overpressured-layer chromatography (OPLC) basic system 50, flexible tool in analytical and semipreparative work”. J. AOAC Int. 82 (1999) 587–598. 159. Mincsovics E., Tyihák E., Siouffi A.M.: „Comparison of Off-Line and On-Line Overpressured Layer Chromatography (OPLC)”. J. Planar Chromatogr. 1 (1988) 141145. 160. Coma I.: „The use of thin-layer chromatography with direct bioautography for antimicrobial analysis”. LC-GC Europe 11 (2005) 482-288. 161. Botz L., Nagy S., Kocsis B.: „Detection of microbiologically active compounds”. //Nyiredy Sz. (szerk.) Planar Chromatography A Retrospective View for the Third Millennium. Springer, Budapest, (2001) 489-516. ISBN 963699157X 162. Botz L., Kocsis B., Nagy S., „Bioautography”. // P. Worsford, A. Townshed, C. Poole (szerk.) Elsevier Academic Press (2005) 271-277. 163. Rios J.L., Recio M.C., Villar A.: „Screening methods for natural products with antimicrobial activity: a review of the literature”. J. Ethnopharmacol. 23 (1988) 127-149. 164. Goodall R.R., Levi A.A.: „A microchromatographic method for the detection and approximate determination of the different penicillins in a mixture”. Nature 158 (1946) 675-676. 165. Fischer R., Lautner H.: „On the paper chromatographic detection of penicillin preparations”. Arch. Pharm. 294/66 (1961) 1-7. 166. Nicolaus B.J.R., Coronelli C., Binaghi A.: „Applicazione agli antibiotici della cromato-. grafia su strato soltile”. Farmaco (Pavia), Ed. Prat., 16 (1961) 349-370. 167. Begue W.J., Kline R.M.: „The use of tetrazolium salts in bioautographic procedures”. J. Chromatogr. 64 (1972) 182-184.
133
168. Hamburger M.O., Cordell G.A.: „A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity”. J. Nat. Prod. 50 (1987) 19-22. 169. Stowe R., P., Koenig D., W., Mishra S., K., Pierson D., L.: „Nondestructive and continuous spectrophotometric measurement of cell respiration using tetrazoliumformazan micro-emulsion”. J. Microbiol. Methods 22 (1995) 283―292. 170. Poole C.F. J.: „Planar chromatography at the turn of the century”. J. Chromatogr. A 856 (1999) 399-427 171. Tyihák E., Botz L., Ott P., Nagy S., Kocsis B., Király-Véghely Zs., Mincsovics E.: „The combination of the overpressured layer chromatography and bioautography and its applications to the analysis of molecules influencing cell proliferation” Chem. Anal. (Warsaw) 48 (2003) 543-553. 172. Móricz Á., Otta K., H., Ott P., Tyihák E.: „Separation and detection of aflatoxins using overpressured-layer chromatography and bioautography”. J. Planar Chromatogr. 16 (2003) 417―420. 173. Tyihák E., Ott P., Móricz Á., Kátay Gy., Király-Véghely Zs.: „Antibiosis, antibiotics, and the formaldehyde cycle: unique importance of planar chromatographic techniques to progress in this direction”. J. Planar Chromatogr. 17 (2004) 8488. 174. Sárközi Á., Móricz Á.M., Ott P.G., Tyihák E., Kéry Á.: „Chelidonium Alkaloids Investigated by a Complex Bioautographic System”. J. Planar Chromatogr. 19 (2006) 267-272. 175. Mincsovics E., Kátay Gy., Ott P.G., Király-Véghely Zs., Móricz Á.M., Tyihák E.: „Isolation of some antimicrobial compounds of red wine by OPLC flowing eluent wall technique”. Chromatographia 62 (2005) S51-S56 Suppl. S 176. Betina V.: „Thin-layer chromatography of mycotoxins”. J Chromatogr. 334 (1985) 211276. 177. Sherma J.: „Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis”. J. Chromatography A 880 (2000) 129-147. 178. Kátay Gy., Szécsi A., Tyihák E.: „Separation of fumonisins by OPLC”. J. Planar Chromatogr. 14 (2001) 53 – 56. 179. Papp E., Farkas A., Otta K.H., Mincsovics E.: „Validation and robustness testing of an OPLC method for the determination of aflatoxins in wheat”. J. Planar Chromatogr. 13 (2000) 328 – 332. 180. Otta K.H., Papp E., Mincsovics E., Záray Gy.: „Determination of aflatoxins in corn by use of the personal OPLC basic system”. J. Planar Chromatogr. 11 (1998) 370 – 373.
134
181. Papp E., Bagócsi B., Otta K-H., Kovacsics-ács L., Mincsovics E.: „The Role of Overpressured Layer Chromatography among Chromatographic Methods for the Determination of the Aflatoxin Content of Fish”. J. Planar Chromatogr. 12 (1999) 383387. 182. Otta K.H., Papp E., Bagocsi B.: „Determination of aflatoxins in food by overpressuredlayer chromatography”. J. Chromatogr. A. 882 (2000) 11-16. 183. Papp E., Otta K.H., Záray Gy., Mincsovics E.: „Liquid chromatographic determination of Aflatoxins”. Microchem. J. 73 (2002) 39-46. 184. Gulyás H.: „ Determination of aflatoxins B1, B2, G1, G2 and M1 by high pressure thin layer chromatography”. J. Chromatogr. 319 (1985) 105-111. 185. Koshinsky H., Honour S., Khachatourians G.: „ Bioautographic detection of T-2 and HT-2 toxins”. J. Chromatogr. 463 (1989) 457-462. 186. Betina V.: „Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field” J. Chromatogr. 78 (1973) 41-51. 187. Clements N.L.: „Note on a microbiological assay for aflatoxin B1: a rapid confirmatory test by effects on growth of Bacillus megaterium”. J. AOAC Int. 51 (1968) 611-612. 188. Broce, D., Grodner R. M., Killebrew R. L., Bonner F. L.: „ Ochratoxin A and B confirmation by microbiological assay using Bacillus cereus mycoides”. J. AOAC Int. 53 (1970) 616-619. 189. Durackova Z., Betina V., Nemec P.: „Bioautographic detection of mycotoxins on thinlayer chromatograms”. J. Chromatogr. 116 (1976) 155-161. 190. Reiss J.: „ Mycotoxin bioassay, using Bacillus stearothermophilus”. J AOAC Int. 58 (1975) 624-625. 191. Hanss J., Moore G.E.: „Studies of culture media for the growth of human tumour cells”. Exp. Cell Res. 34 (1964) 242-256. 192. Umeda M., Diringer D., Heidelberger C.: „Inhibition of the growth of cultured cells by arginase and soluble proteins from mouse skin”. Israel J. Med. Sci. 4 (1968) 1216-1222. 193. Singh R., Pervin S., Karimi A., Cederbaum S., Chaudhuri G.: „Activity in human breast cancer cell lines: N(omega)-hydroxy-L-Arg selectively inhibits cell proliferation and induces apoptosis in MDA-MB-468 cells”. Cancer Res. 60 (2000) 3305-3312. 194. Wheatley D.N., Scott L., Lamb J., Smith S.: „Single amino acid (Arg) restriction: growth and death of cultured HeLa and human diploid fibroblasts”. Cell Physiol. Biochem. 10 (2000) 37-55.
135
195. Scott L.A.: „Arginine deprivation and tumour cell death: in vitro and in vivo studies. PhD thesis”. University of Aberdeen: Aberdeen, (1999) 196. Storr J.M., Button A.F.: „effects of arginine deficiency on lymphoma cells”. Br. J. Cancer 30 (1974) The50-59. 197. Scott L., Lamb J., Smith S., Wheatley D.N.: „Single amino acid (arginine) deprivation: rapid and selective death of cultured transformed and malignant cells”. Cancer Res. Campaign. 83 (2000) 800-810. 198. Bach S.J., Swaine D.: „The effect of arginase on the retardation of tumour growth”. Br. J. Cancer 19 (1965) 379-386. 199. Ogilvie G.K., Fettman M.J., Mallinckrodt C.H., Walton J.A., Hansen R.A., Davenport D.J., Gross K.L., Richardson K.L., Rogers Q., Hand M.S.: „Effect of fish oil, arginine, and doxorubicin chemotherapy on remission and survival time for dogs with lymphoma: A doubleblind, randomised placebo-controlled study”. Cancer 88 (2000) 1916-1928. 200. Weisburger J.H., Yamamoto R.S., Glass R.M., Frankel H.H.: „Prevention by arginine glutamate of the carcinogenicity of acidamide in rats”. Toxicol. Appl. Pharmacol. 14 (1969) 163-175. 201. Brittenden J., Heys S.D., Eremin O.: „L-arginine and malignant disease: a potential therapeutic role?”. Eur. J. Surg. Oncol. 20 (1994) 189-192. 202. Tyihák E., Szende B., Trézl L.: „Biological effects of methylated amino acids”. //Paik. WK, Kim S (szerk.) Protein Methylation. (1990) 363-388. 203. Mori M., Gotoh T.: „Regulation of nitric oxide production by arginine metabolic enzymes”. Biochem. Biophys. Res. Comm. 274 (2000) 715–719. 204. Patel R.P., McAndrew J., Sellak H., White C.R., Jo H., Freeman B.A., Darley-Usmar V. M.: „Biological aspects of reactive nitrogen species”. Biochim. Biophys. Acta 1411 (1999) 385–400. 205. Szende B., Tyihák E., Trézl L., Szöke É., László I., Kátay GY., Király-Véghely ZS.: „Formaldehyde generators and capturers as influencing factors of mitotic and apoptotic processes”. Acta Biol. Hung. 49 (1998) 323-329. 206. Locigno R., Castronovo V.: „Reduced glutathione system: role in cancer development, prevention and treatment”. Int. J. Oncol. 19 (2001) 221-236. 207. Rahman I., Biswas S.K., Jimenez L.A., Torres M., Forman H.J.: „Glutathione, stress responses, and redox signaling in lung inflammation”. Antioxid. Redox Signal. 7 (2005) 42-59.
136
208. Li Y., Maher P., Schubert D.: „A role for 12-lipoxygenase in nerve cell death caused by glutathione depletion”. Neuron 19 (1997) 453–463. 209. Wüllner U., Seyfried J., Groscurth P., Beinroth S., Winter S., Gleichmann M., Heneka M., Löschmann P., Schulz J.B., Weller M., Klockgether T.: „Glutathione depletion and neuronal cell death: the role of reactive oxygen intermediates and mitochondrial function”. Brain Res. 826 (1999) 53–62. 210. Seyfried J., Soldner F., Schulz J.B., Klockgether T., Kovar K.A., Wüllner U.: „Differential effects of L-buthionine sulfoximine and ethacrynic acid on glutathione levels and mitochondrial function in PC12 cells”. Neurosci. Lett. 264 (1999) 1–4. 211. Meki A.R., Abdel-Ghaffar S.K., El-Gibaly I.: „Aflatoxin B1 induces apoptosis in rat liver: protective effect of melatonin”. Neuro Endocrinol. Lett. 22 (2001) 417-426. 212. Liu J., Yang C.F., Lee B.L., Shen H.M., Ang S.G., Ong C.N.: „Effect of Salvia miltiorrhiza on aflatoxin B1-induced oxidative stress in cultured rat hepatocytes.” Free Radic. Res. 31 (1999) 559-568. 213. Gross-Steinmeyer K.,Weymann J., Hege H.G., Metzler M.: „Metabolism and lack of DNA reactivity of the mycotoxin ochratoxin a in cultured rat and human primary hepatocytes”. J. Agric. Food Chem. 50 (2002) 938–945. 214. Atroshi F., Biese I., Saloniemi H.: „Significance of apoptosis and its relationship to antioxidants after ochratoxin A administration in mice”. J. Pharmacol. Pharmaceut. Sci. 3 (2000) 281–291. 215. Haslam R., Rust S., Pallett K., Cole D., Coleman J.: „Cloning and characterisation of Sformylglutathione hydrolase from Arabidopsis thaliana: a pathway for formaldehyde detoxification”. Plant Physiol. Biochem. 40 (2002) 281-288. 216. Gonzalez M.J., Miranda-Massari J.R., Mora E.M., Guzman A., Riordan N.H., Riordan H.D., Casciari J.J., Jackson J.A., Roman-Franco A.: „Orthomolecular oncology review: ascorbic acid and cancer 25 years later”. Integr. Cancer Ther. 4 (2005) 32-44. 217. Padayatty S.J., Katz A., Wang Y., Eck P., Kwon O., Lee J.H., Chen S., Corpe C., Dutta A., Dutta S.K., Levine M.: „Vitamin C as an Antioxidant: Evaluation of Its Role in Disease Prevention”. J. Am. Coll. Nutr. 22 (2003) 18–35. 218. Rees S., Slater T.F.: „Ascorbic-acid and lipid-peroxidation – the crossover effect”. Acta Biochim. Biophys. 22 (1987) 241-249. 219. Buettner G.R., Jurkiewicz B.A.: „Catalytic metals, ascorbate and free radicals: combinations to avoid”. Radiat. Res. 145 (1996) 532-541.
137
220. Olas B., Wachowicz B., Buczynski A.: „Vitamin C suppresses the cisplatin toxicity on blood platelets”. Anticancer Drugs 11 (2000) 487-93. 221. Jun H.S., Kim S.E., Sung M.K.: „Protective effect of soybean saponins and major antioxidants against aflatoxin B1-induced mutagenicity and DNA-adduct formation”. J. Med. Food 5 (2002) 235-240. 222. Verma R.J., Shukla R.S., Mehta D.N.: „Interaction of aflatoxin with L-ascorbic acid: a kinetic and mechanistic approach”. Nat. Toxins 7 (1999) 25-29. 223. Nyandieka H.S., Wakhisi J., Kilonzo M.: „Inhibition of AFB1-induced liver cancer and induction of increased microsomal enzyme activity by dietary constituents”. E. Afr. Med. J. 66 (1989) 796-803. 224. Domngang F., Emerole G.: „Metabolism of aflatoxin B1 (AFB1), aflatoxin G1 (AFG1) and vitamin C intake by guinea pig liver preparation in vitro”. Biochem. Pharmacol. 31 (1982) 2327-2330. 225. Trézl L., Pipek J.: „Quantum chemical interpretation of the reaction between L-ascorbic acid and formaldehyde and its biological significance”. Per. Pol. Chem. Eng. 35 (1991) 207-219. 226. Rotruck J.T., Pope A.L., Ganther H.E., Swanson A.B., Hafeman D.G., Hoekstra W.G.: „Selenium: biochemical role as a component of glutathione peroxidase”. Science 73 (1973) 588-90. 227. Vinceti M., Wei E.T., Malagoli C., Bergomi M., Vivoli G.: „Adverse health effects of selenium in humans”. Rev. Environ. Health 16 (2001) 233-51. 228. Whanger P.D.: „Selenocompounds in plants and animals and their biological significance”. J. Am. Coll. Nutr. 3 (2002) 223-232. 229. Lü J., Jiang C.: „Selenium and Cancer Chemoprevention: Hypotheses Integrating the Actions of Selenoproteins and Selenium Metabolites in Epithelial and Non-Epithelial Target Cells”. Antioxid. Redox Signal. 7 (2005) 1715–1727. 230. Davis C.D., Uthus E.O.: „DNA Methylation, Cancer Susceptibility, and Nutrient interactions”. Exp. Biol. Med. 229 (2004) 988-995. 231. Ranjard L., Prigent-Combaret C., Favre-Bonte S., Monnez C., Nazaret S., Cournoyer B.: „Characterization of a novel selenium methyltransferase from freshwater bacteria showing strong similarities with the calicheamicin methyltransferase”. Biochim. Biophys. Acta. 1679 (2004) 80-85. 232. Paik W. K., Kim S.: „Enzymatic Methylation of Protein Fractions from Calf Thymus Nuclei”. Biochem. Biophys. Res. Commun. 29 (1967) 14–20.
138
233. Gary J.D., Clarke S.: „RNA and Protein Interactions Modulated by Protein Arginine Methylation”. Progr. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 61 (1998) 65–131. 234. McBride A.E., Silver P.A.: „State of the Arg: Protein Methylation at Arginine Comes of Age”. Cell 106 (2001) 5–8. 235. Boisvert F.M., Chenard C.A., Richard S.: „Protein interfaces in signaling regulated by arginine methylation”. Sci STKE. 271 (2005) re2-re2. 236. Palmer R.M.J., Ashton D.S., Moncada S.: „Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine”. Nature 333 (1988) 664–666. 237. Gullner G., Tyihak E.: „Hydrogen peroxide dependent N-demethylase activity in the leaves of normal and heatshocked bean plants”. Plant Sci. 52 (1987) 21-27. 238. Kim S., Benoiton L., Paik W.K.: „ε−Alkyllysinase”. J. Biol. Chem. 239 (1964) 148– 154. 239. Tsukada Y., Fang J., Erdjument-Bromage H., Warren M.E., Borchers C.H., Tempst P., Zhang Y.: „Histone demethylation by a family of JmjC domain-containing proteins”. Nature 439 (2006) 811–816. 240. Bannister A.J., Schneider R., Kouzarides T.: „Histone modificaiton: dynamic or static?”. Cell 109 (2002) 801–806. 241. Tsukada Y, Zhang Y.: „Purification of histone demethylases from HeLa cells”. Methods 40 (2006) 318-326. 242. Suba Zs., Szende, B., Lapis K., Takacs J., Elek G.: „epsilon-N-trimethyl-lysine: a natural cell component with mitogenic activity”. Neoplasma 27 (1980) 11-23. 243. Szende B., Lapis K., Simon K.: „Combined effect of cytostatic drugs and ε-N-Ltrimethyllysine in healthy and transplantable tumor bearing mice”. Neoplasma 29 (1982) 427-439. 244. Theophanides T., Anastassopoulou J.: „Copper and carcinogenesis”. Crit. Rev. In Oncol./Hematol. 42 (2002) 57-64. 245. Harless W., Crowell E., Abraham J.: „Anemia and neutropenia associated with copper deficiency of unclear etiology”. Am. J. Hematol. 81 (2006) 546-549. 246. Halliwell B., Gutteridge J.M.: „Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease”. Biochem. J. 219 (1984) 1-14. 247. Halliwell B., GutteridgeJ.M.: „Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an overview”. Methods Enzymol. 186 (1990) 1-85. 248. Burkitt M.J.: „Copper-DNA adducts”. Methods Enzymol. 234 (1994) 66-79.
139
249. Seffner W., Schiller F., Lippold U., Dieter H.H., Hoffmann A.:. „Experimental induction of liver fibrosis in young guinea pigs by combined application of copper sulphate and aflatoxin B1”. Toxicol. Lett. 92 (1997) 161-72. 250. Schiller F., Lippold U., Heinze R., Hoffmann A., Seffner W.: „Liver fibrosis in guinea pigs experimentally induced by combined copper and aflatoxin application”. Exp. Toxicol. Pathol. 50 (1998) 519-527. 251. Francis A.R., Shetty T.K., Bhattacharya R.K.: „Modifying role of dietary factors on the mutagenicity of aflatoxin B : In vitro effect of trace elements”. Mutat. Res. 199 (1988) 1
85-93. 252. Manderville R.A., Calcutt M.W., Dai J., Park G., Gillman I.G., Noftle R.E., Mohammed A.K., Dizdaroglu M., Rodriguez H., Akman S.A.: „Stoichiometric preference in copperpromoted oxidative DNA damage by ochratoxin A”. J. Inorg. Biochem. 95 (2003) 87-96. 253. Sondossi M., Riha V., Rossmoore H.: „The Potentiation of Industrial Biocide Activity with Cu+2. I. Synergistic Effect of Cu+2 with Formaldehyde”. Intern. Biodeterior. 26 (1990) 51-61. 254. Grosjean D., Hisham M.W.M.: „A passive sampler for atmospheric ozone”. J. Air Waste Manage. Assoc. 42 (1992) 169–173. 255. Takeuchi K., Ibusuki T.: „Quantitative determination of aqueous-phase ozone by chemiluminescence using indigo-5,5'-disulfonate”. Anal. Chem. 61 (1989) 619-23. 256. Kettle A.J., Clark B.M., Winterbourn C.C.: „Superoxide Converts Indigo Carmine to Isatin Sulfonic Acid”. J. Biol. Chem. 279 (2004) 18521–18525. 257. Harriram A., Govender V., Jonnalagadda S. B.: „Oxidative degradation of indigocarmine by hypochlorite--a tool for determination of hypochlorite in commercial samples”. J. Environ. Sci. Health A 38 (2003) 1055–1064. 258. Crowell P.L., Gould M.N.: „Chemoprevention and Therapy of Cancer by d-limonene”. Crit. Rev. Oncog. 5 (1994) 1-22. 259. Del Toro-Arreola S., Flores-Torales E., Torres-Lozano C., Del Toro-Arreola A., Tostado-Pelayo K., Guadalupe Ramirez-Duenas M., Daneri-Navarro A.: „Effect of dlimonene
on
immune
response
in
BALB/c
mice
with
lymphoma”.
Int.
Immunopharmacol. 5 (2005) 829–838. 260. Lu X.G., Zhan L.B., Feng B.A., Qu M.Y., Yu L.H., Xie J.H.: „Inhibition of growth and metastasis of human gastric cancer implanted in nude mice by d-limonene”. World J. Gastroenterol. 10 (2004) 2140-2144.
140
261. Raphael T.J., Kuttan G.: „Effect of naturally occurring monoterpenes carvone, limonene and perillic acid in the inhibition of experimental lung metastasis induced by B16F-10 melanoma cells”. J Exp. Clin. Cancer Res. 22 (2003) 419-24. 262. Keinan E., Alt A., Amir G., Bentur L., Bibi H., Shoseyov D.: „Natural ozone scavenger prevents asthma in sensitized rats”. Bioorg. Med. Chem. 13 (2005) 557–562. 263. Criegee R.: „Mechanism of ozonolysis”. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 14 (1975) 745752. 264. Leungsakul S., Jaoui M., Kamens R.M.: „Kinetic mechanism for predicting secondary organic aerosol formation from the reaction of d-limonene with ozone”. Environ. Sci. Technol. 39 (2005) 9583-9594. 265. Griesbaum K., Miclaus V., Jung I.C.: „Isolation of ozonides from gas-phase ozonolyses of terpenes”. Environ. Sci. Technol. 32 (1998) 647-649. 266. Clausen P.A., Wilkins C.K., Wolkoff P., Nielsen G.D.: „Chemical and biological evaluation of a reaction mixture of R-(+)-limonene/ozone: formation of strong airway irritants”. Environ. Int. 26 (2001) 511-522. 267. Wilkins C.K., Wolkoff PClausen., P.A., Hammer M., Nielsen G.D.: „Upper airway irritation of terpene/ozone oxidation products (TOPS). Dependence on reaction time, relative humidity and initial ozone concentration”. Toxicol. Letters 143 (2003) 109-114. 268. Móricz Á.M., Ott P.G., Szilágyi M., Otta K.H., Tyihák E.: „Opposite effect of Cu(II) and Se(IV) ions on the antibacterial-toxic action of mycotoxins”. Acta Biol. Hung. 58 (2007) 301-310. 269. Móricz Á., Otta K.H., Ott P.G., Tyihák E.: „New horizon in the characterization of the action of mycotoxins separated by TLC or OPLC”. // Nyiredy Sz. (szerk.) Proc. Int. Symp. on Planar Chromatography. Research Institute for Medicinal Plants, Visegrád (2004) 473-485. 270. Móricz Á.M., Ott P.G., Billes F., Otta K.H., Tyihák E.: „Influence of trace elements on antibacterial activity of aflatoxins”. 5th. Int. symp. on trace elements in human: new perspectives Athens – Greece (2005) CD-ROM of Proceedings 271. Móricz Á.M., Király-Véghely Zs., Ott P.G., Otta K.H., Tyihák E.: „The influence of Lascorbic acid on the antibacterial activity of aflatoxins and trans-resveratrol on sorbent layer”. // Nyiredy Sz. (szerk.) Proc. Int. Symp. on Planar Separations. Research Institute for Medicinal Plants, Siófok (2005) 477-489. 272. King E.O., Ward M.K., Raney D.E.: „Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescein”.” J. Lab. Clin. Med. 44 (1954) 301-307.
141
273. Móricz Á.M., Ott P.G., Billes F., Otta K.H., Tyihák E.: „The influence of L-ascorbic acid on the antibacterial - toxic activity of aflatoxins on adsorbent layer” J. Appl. Microbiol. (online megjelent doi:10.1111/j.1365-2672.2007.03505.x) 274. Adányiné Kisbocskói Nóra: Szelektív biokatalitikus érzékelık és analitikai reaktorok fejlesztése élelmiszeripari és biotechnológiai alkalmazásra (egyetemi doktori értekezés), BME (1993) 275. Adányi N., Váradi M.: „Catalase-based thin-layer enzyme cell used in organic-phase FIA system for determination of moisture in oily foods”. Eur. Food Res. Technol. 219 (2004) 432-437. 276. Móricz Á.M., Horváth E., Ott P.G., Tyihák E.: „Raman spectroscopic evaluation of the influence of Pseudomonas bacteria on aflatoxin B1 in the BioArena complex bioautographic system”. (elıkészületben) 277. Lee P.C., Meisel D.: „Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold sols”. J. Phys. Chem. 86 (1982) 3391-3395. 278. Frisch M.J., Trucks G.W., Schlegel H.B., Scuseria G.E., Robb M.A., Cheeseman J.R., Zakrzewski V.G., Montgomery Jr.
J.A., Stratmann R.E., Burant J.C., Dapprich S.,
Millam J.M., Daniels A.D., Kudin K.N., Strain M.C., Farkas O., Tomasi J., Barone V., Cossi M., Cammi R., Mennucci B., Pomelli C., Adamo C., Clifford S., Ochterski J., Petersson G.A., Ayala P.Y., Cui Q., Morokuma K., Malick D.K., Rabuck A.D., Raghavachari K., Foresman J.B., Cioslowski J., Ortiz J.V., Baboul A.G., Stefanov B.B., Liu G., Liashenko A., Piskorz P., Komaromi I., Gomperts R., Martin R.L., Fox D.J., Keith T., Al-Laham M.A., Peng C.Y., Nanayakkara A., Gonzalez C., Challacombe M., Gill P.M.W., Johnson B., Chen W., Wong M.W., Andres J.L., Gonzalez C., Head-Gordon M., Replogle E.S., Pople J.A., 1998. Gaussian 98, Revision A. 7, Gaussian, Inc., Pittsburgh, PA 279. Billes F., Móricz Á.M., Tyihák E., Mikosch H.: „Simulated vibrational spectra of aflatoxins and their demethylated products and the estimation of the energies of the demethylation reactions”. Spectrochim. Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 64 (2006) 600622. 280. Blunden G., Carpenter B.G., Adrian-Romero M., Yang M.H., Tyihak E.: „Formaldehyde in the plant kingdom”. Acta Biol. Hung. 49 (1998) 239-246. 281. Ashby J., Lefevre P.A.: „Formaldehyde generators: relationship between stability, lipophilicity and carcinogenic potency”. Carcinogenesis 3 (1982) 1273–1276.
142
282. Alderson T.: „Mechanism of formaldehyde induced mutagenesis”. Nature 187 (1960) 485–489. 283. Trézl L., Tyihák E., Lotlikar P.B.: „Nonenzymatic protein methylation and its biological significance”. // Paik W., K., Kim S. (szerk.) Protein methylation. CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida (1990) ch. 22. 284. Storz G., Imlay J.A.: „Oxidative stress”. Curr. Opin. Microbiol. 2 (1999) 188–194. 285. Seaver L.C., Imlay J.A.: „Alkyl hydroperoxide reductase is theprimary scavenger of endogenous hydrogen peroxide in Escherichia coli”. J. Bacteriol. 183 (2001) 7173–7181. 286. Messner K.R., Imlay J.A.: „The identification of primary sites of superoxide and hydrogen peroxide formation in the aerobic respiratory chain and sulfite reductase complex of Escherichia coli”. J. Biol. Chem. 274 (1999) 10119–10128. 287. Grow A.E., Wood L.L., Claycomb J.L., Thompson P.A.: „New biochip technology for label-free detection of pathogens and their toxins”. J. Microbiol. Methods 53 (2003) 221– 233. 288. Somsen G.W., Coulter S.K., Gooijer C., Velthorst N.H., Brinkman U.A.Th.: „Coupling of column liquid chromatography and surface-enhanced resonance Raman spectroscopy via a thin-layer chromatographic plate”. Anal. Chim. Acta 349 (1997) 189-197. 289. István K., Keresztury G., Szép A.: „Normal Raman and surface enhanced Raman spectroscopic experiments with thin layer chromatography spots of essential amino acids using different laser excitation sources”. Spectrochim. Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 59 (2003) 1709-1723 290. Horváth E., Kocsis L., Frost R.L., Hren B., Szabó L.P.: „Investigation of Enantiomer Bonding on a Chiral Stationary Phase by FT-Raman Spectrometry. Analylical Chemistry”. Anal. Chem. 70 (1998) 2766-2770. 291. Kocsis L., Horváth E., Kristóf J., Frost R.L., Rédey Á ., Mink J.: „Effect of the preparation conditions on the surface-enhanced Raman-spectrometric identification of thin-layer-chromatographic Spots”. J. Chromatogr. A 845 (1999) 197–202. 292. Socrates G.: „Infrared and Raman Characteristic Group Frequencies, Tables and Charts” 3rd edition, J.Wiley and Sons, LTD, West Sussex PO19 1UD, England, (2001) ISBN 0 471 85298 8 293. Bernhard D., Schwaiger W., Crazzola R., Tinhofer I., Kofler R., Csordás A.: „Enhanced MTT-reducing activity under growth inhibition by resveratrol in CEM-C7H2 lymphocytic leukemia cells”. Cancer Lett. 195 (2003) 193-199.
143
294. Cameron, E., Pauling, L.: „Vitamin C and cancer”. Int. J. Environ. Stud. 10 (1977) 303-305. 295. Lapidot, T., Walker, M.D., Kanner, J.: „Antioxidant and prooxidant effects of phenolics on pancreatic β-Cells in Vitro”. J. Agric. Food Chem. 50 (2002) 7220-7225. 296. Tyihák, E., Móricz, Á., Ott, P.G.: „Role of formaldehydome in antibiotic effect: new approach to mechanism, of antibiotic action of some metal ions”. // Cser M.A., Sziklai László I., Étienne J.C., Maynard Y., Centeno J., Khassanova I., Collery Ph. (szerk.) Metal Ions in Biology and Medicine: vol. 8. (2004) John Libbey Eurotext, Paris, 131134. 297. Heck H. d’A., Casanova M.: „Pharmacodynamics of formaldehyde: applications of a model for the arrest of DNA replication by DNA–protein cross-links”. Toxicol. Appl. Pharmacol. 160 (1999) 86–100. 298. Kátay Gy., Ott P., Tyihák E.: „Study of the antibacterial effect of 1'-methylascorbigen (a derivative of bound vitamin C) in OPLC-BioArena”. // Nyiredy Sz. (szerk.) Proc. Int. Symp. on Planar Separations. Research Institute for Medicinal Plants, Visegrád (2004) 405―414. 299. Neu H.C.: „The crisis in antibiotic resistance”. Science 257 (1992) 1064-1073. 300. Hellinger W.C.: „Confronting the problem of increasing antibiotic resistance”. South Med. J. 93 (2000) 842-848.
144
Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akik valamilyen módon hozzájárultak munkám sikeréhez és dolgozatom elkészüléséhez. Elsısorban és mindenekfelett köszönettel tartozom témavezetıimnek. Horváthné Otta Klárának, aki mindvégig figyelemmel kísérte munkám, tanácsaival támogatott, bátorított, útmutatásokkal látott el, melyekkel jelentısen hozzájárult munkám sikeréhez. Tyihák Ernınek, aki emberi és szakmai hozzáállásával, szemléletével követendı példát mutatott számomra, elváró, inspiráló támogatással ösztönözte munkám, s értékes segítséget nyújtott a dolgozat elkészítésében is. Köszönetet szeretnék mondani Záray Gyula és Horváth István Tamás tanszékvezetıknek, hogy nyugodt, eredményes munkámhoz nélkülözhetetlen légkört biztosítottak számomra az ELTE Kémiai Technológia és Környezeti Kémia Tanszékén. Az MTA NKI dolgozóinak, hogy az eredményességet nagyban elısegítı baráti légkörben, jó szellemiségben végezhettem doktori munkám. Külön köszönet Ott Péternek példamutató precíz munkájáért és a kritikus szemléletért, valamint az angol nyelvő közlemények lektorálásában nyújtott segítségéért. Király-Véghely Zsuzsának és Harsányiné Dobos Editnek a mindennapi segítségért, mely hozzájárult a kísérletek gördülékeny elvégzéséhez. Köszönetem szeretném kifejezni Horváth Erzsébetnek (Pannon Egyetem Környezetmérnöki és Kémiai Technológia Intézeti Tanszék), Kristóf Jánosnak és munkatársaiknak (Pannon Egyetem, Analitikai Kémia Intézeti Tanszék) a Fourier transzformációs Raman spektroszkópiás mérések elvégzésében, s a spektrumok értelmezésében nyújtott segítségért. A Pannon Egyetemen eltöltött idım során segítettek, emberileg támogattak, nagymértékben hozzájárulva doktori értekezésem megírásához. Köszönet illeti Billes Ferencet (Budapesti Mőszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Fizikai Kémia és Anyagtudományi Tanszék) a kvantumkémiai számítások elvégzéséért. Köszönöm Adányiné Kisbocskói Nórának, amiért lehetıséget biztosított, hogy a hidrogénperoxid mérést a Központi Élelmiszer-tudományi Kutatóintézet Analitikai Osztályának laboratóriumában elvégezhessem. Végül köszönöm családomnak és barátaimnak támogatásukat és türelmüket!
145
