Polychromatická cytometrie v hemato-onkologii
Tomáš Kalina, Ester Mejstříková, Ondřej Hrušák Klinika dětské hematologie a onkologie Univerzita Karlova, 2. LF a FN Motol - cytometrie
http://clip.lf2.cuni.cz
Úvod: Polychromatická cytometrie • Nová generace cytometrů (Cyan ADP, LSR2, FACS Canto, FACS Aria, CyFlow ML) • 3 lasery (až 7), 8 a více fluorescenčních parametrů (publikováno 17) • Během minuty lze změřit > 1 milión buněk • „single-cell“ měření • (možnost sortování)
8 – parametrů v periferní krvi CD14 / DAPI / CD3 / CD 16,56 / CD45 / CD4 / CD19 / CD8
Lymfocyty
Lymfocyty 19- 3-
T lymfocyty
8 – parametrů v periferní krvi CD14 / DAPI / CD3 / CD 16,56 / CD45 / CD4 / CD19 / CD8 „mrtvé“
„mrtvé“
„mrtvé“
„živé“
„živé“
„živé“
Lymfocyty
T - lymfocyty
Monocyty
NK - buňky
Granulocyty
B - lymfocyty
Výhody polychromatické cytometrie - Rychlost provedení (cca 2h od obdržení vzorku do analýzy) - Schopnost hodnotit komplexní směsi buněk - Nenáročná příprava vzorku - „Single cell“ analýza - Funkční testy na směsi buněk (viabilita, apoptóza, sekrece cytokinů …)
Složitost narůstá …
Malignita či regenerující kostní dřeň?
Malignita či regenerující kostní dřeň? CD19+ buňky:
Polychromatická diagnostika - Euroflow Co je Euroflow projekt EU – STREP Rotterdam (NL) – Salamanca (E) – Lisbon (P) – Kiel (D) – Paris (F) – Leeds (GB) – Praha (CZ) – Zabrze (PL) Cíle Euroflow: - Standardizace diagnostických cytometrických měření - Optimalizované přístupy pro diagnostiku všech hematologických malignit 8 – barevnou cytometrií Oblasti: - Akutní lymfoblastická leukémie - AML a MDS - Mnohočetný myelom a plasmatické buňky - B -NHL - Sledování efektu léčby (MRN) - Softwarové nástroje pro diagnostiku
http://euroflow.org
Reziduální nemoc v kostní dřeni Současné léčebné protokoly pro léčbu ALL jsou velmi intenzivní, jak dosáhnout dostatečné agresivity léčby a přitom nezatěžovat nadbytečnou léčbou? Koncept monitorace minimální reziduální nemoci je potvrzen >10let Kterou metodu zvolit? RQ-PCR
nebo
cytometrii
Ig/TCR přestavby cca 3 týdny
Vyšetření do 2-4 hodin
Citlivost > 10exp-4 (záleží na cíli)
Citlivost > 10exp-4 (záleží na aberaci a na pozadí)
Standardizace pokročilá
Standardizace téměř žádná
Pro pozdější body léčby, metoda první volby
Pro časné body léčby, tam kde chybí Ig/TCR cíl
Reziduální nemoc v kostní dřeni CD19+ buňky:
Reziduální nemoc v kostní dřeni Současné problémy MRN cytometricky ( 4 barevně): Standardizace a kontrola kvality měření Konsenzus na hodnocení citlivosti jednotlivých postupů (různá míra pozadí i citlivosti pro různé typy aberací) Vysoká míra expertní zkušenosti nutná, obtížně předávaná Možná řešení: - Iniciativy Euroflow, ISAC, ESCCA (standardizace, optimalizace, analýza) - Optimalizace protokolů pro 8 barev - Nové přístupy k analýze, pravděpodobnostní analýzy, nové softwary
Polychromatická cytometrie - výzkum B-prekurzorové ALL
CD27 (TNFRSF7)
(%)
(%)
CD44 (Pgp-1)
p<0.0001 TEL/AML1 BCR/ABL MLL Hyperdiploidní Ostatní
TEL/AML1 BCR/ABL MLL Hyperdiploidní Ostatní
TEL/AML1 leukémie jsou CD44neg a CD27poz Vášková et al., Leukemia 2005
Polychromatická cytometrie - výzkum
27 SP
27/44 DP
27/44 DN
44 SP Vášková et al, 2008
Polychromatická cytometrie - výzkum
27/44 DP
CD27
27 SP
27/44 DN
CD44
44 SP
Vášková et al, 2008
Analýza dat Hierarchické gatování - je pracné, nepřehledné a nedovoluje vidět kompletní „obraz“ NIC LEPŠÍHO ZATÍM NEMÁME !! Dílčí nápady nových přístupů - FlowJo (Treestar, Ashland, OR) www.flowjo.com - Infinicyte (Cytognos, Salamanca, E) www.cytognos.com - R-project platform (Bioconductor) www.r-project.org flowClust Clustering for Flow Cytometry flowCore Basic structures for flow cytometry data flowQ Qualitiy control for flow cytometry flowUtils Utilities for flow cytometry flowViz Visualization for flow cytometry - GemStone, WinList (Verity, Topsham, ME) www.vsh.com - FCS3 Express (DeNovo, Los Angeles, CA) www.denovosoftware.com
Polychromatická diagnostika Je upgrade na 6 – 8 barev nezbytný ? - Pro diagnostiku běžných hematologických malignit postačují 3-4 barevné parametry - Pro citlivou detekci MRN je 8-10 barev asi nutností
Co přechod na 8 barevnou cytometrii přináší za problémy? - Nutnost pečlivé QC a QA - Častější technické problémy komplikovaných instrumentů - Nutnost rozsáhlé optimalizace protokolů pro 8 barev - Interakce fluorescence (artefakty kompenzační, zobrazovací), snížení citlivosti, - Dostupnost reagencií - Složitější analýza - Cena reagencií, cena přístrojů
Poděkování Ondřej Hrušák Ester Mejstříková Martina Vášková Veronika Kanderová Martin Kováč Vendula Pelková Daniel Thürner Lucie Gondorčínová Pavel Semerák Klára Pospíšilová Jan Trka Jan Starý GA ČR 301/06/P162, VZ MŠMT MSM0021620813, EC-STREP-018708-“Euroflow“
